CN113563442B - 抗旱相关蛋白IbSPB1及其编码基因与应用 - Google Patents
抗旱相关蛋白IbSPB1及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质IbSPB1在调控植物抗旱性中的应用。本发明首先公开了一种蛋白质在提高植物耐盐抗旱性中的应用；所述蛋白质为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。本发明进一步公开了上述蛋白相关生物材料及其应用。本发明发现了IbSPB1蛋白及其编码基因，并将IbSPB1蛋白的编码基因导入甘薯中，得到IbSPB1的转基因甘薯植株。将转基因植株进行干旱胁迫处理，其抗旱性增强，在植物抗干旱的过程中起着重要的作用，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗旱相关蛋白IbSPB1及其编码基因与应用。
背景技术
随着全球气候的变化异常、生态平衡的破坏以及人口数量的急剧增长，水资源匮乏也已成为当今农业生产发展面临的最严峻的挑战之一。FAO调查结果显示，干旱胁迫是造成发展中国家粮食安全最主要的原因，对粮食生产造成的影响远远超过洪涝、地震、台风、泥石流等自然灾害。由于全球气候变化异常、降雨年际变化大以及降雨时空分布不均匀等因素的影响，我国农业生产受干旱灾害的影响越来越严重，粮食安全面临严峻挑战。
甘薯虽然是耐旱作物，但缺水时，同其它作物一样，生长发育和产量均会受到影响。通过对植物耐盐抗旱机理的深入研究，挖掘耐盐抗旱基因资源，培育耐盐抗旱甘薯新品种是利用盐碱地、干旱半干旱资源最经济、有效的措施之一。
因此，通过基因工程手段克隆、鉴定得到具有抗旱、耐盐功能基因，将其转入植物体内提高植物抗旱、耐盐的能力具有重要的研究和应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物抗旱性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供一种蛋白质，所述蛋白质为如下A1)或A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗旱功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
进一步地，所述蛋白质来源于甘薯。
其中，SEQ ID No.1由333个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本文中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
本文中，所述同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码上述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
其中，B1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
进一步地，所述的生物材料中B1)所述核酸分子可为如下G1)或G2)的基因：
G1)编码链的编码序列如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子；
G2)编码链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子。
其中，SEQ ID No.2由1002个核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端起第1位-第1002位，编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白。
上述相关生物材料中，B2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质IbSPB1的DNA，该DNA不但可包括启动IbSPB1基因转录的启动子，还可包括终止IbSPB1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(1985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述相关生物材料中，B3)所述重组载体可含有SEQ ID No.2所示的用于编码蛋白质IbSPB1的DNA分子。
可用植物表达载体构建含有所述IbSPB1编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1300-35S、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用IbSPB1构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
上述相关生物材料中，B4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述相关生物材料中，B6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，B7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。
本发明还提供提高植物抗旱性的方法，所述方法包括向受体植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到抗旱性高于所述受体植物的目的植物。
进一步地，上述方法中所述编码基因为下述G1)或G2)：
G1)编码链的编码序列是如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子；
G2)编码链的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子。
上述方法中，将上述蛋白质编码基因导入目的植物可通过携带有本发明所述蛋白质编码基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明所述蛋白质编码基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
在本发明具体的实施方式中，所述重组载体为重组质粒pCB-IbSPB1。所述重组质粒pCB-IbSPB1是利用限制性内切酶Kpn I和BamH I将SEQ ID No.2所示的DNA分子插入至载体pCAMBIA1300-35S的Kpn I和BamHI的酶切识别位点之间，且保持载体pCAMBIA1300-35S其它序列不变得到的重组载体。
重组载体pCB-IbSPB1中，启动IbSPB1基因转录的启动子是位于载体pCAMBIA1300-35S的35S启动子。
本发明还提供上述蛋白质和/或上述生物材料的应用，所述应用为下述任一种：
P1)提高植物抗旱性；
P2)制备提高植物抗旱性的产品；
P3)提高干旱胁迫条件下植物的生根情况；
P4)制备提高干旱胁迫条件下植物的生根情况的产品；
P5)提高干旱胁迫条件下植物的长势；
P6)制备干旱胁迫条件下植物的长势的产品；
P7)降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量；
P8)制备降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量的产品；
P9)植物育种；
P10)甘薯育种。
具体地，上述育种为抗旱育种。
上述植物可为双子叶植物，所述双子叶植物可为管状花目植物。所述管状花目植物可为旋花科植物。所述旋花科植物可为番薯属植物。所述番薯属植物可为甘薯。
上述所述长势可通过植物的根长和植株重量体现。
本发明提供了IbSPB1蛋白及其编码基因，并将IbSPB1蛋白的编码基因导入甘薯中，得到IbSPB1的转基因甘薯植株。将转基因植株进行干旱胁迫处理，与对照相比，转基因株系抗旱性增强，具体体现在长势增强、H2O2含量降低。因此，本发明所提供的IbSPB1基因及其所编码的蛋白在植物抗旱的过程中起着重要的作用，在提高植物抗旱研究中具有重要的应用价值，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为转基因甘薯植株的PCR检测检测结果；其中，M为Maker；W为水；P为阳性质粒；WT为野生型甘薯植株；L1-L6为转基因植株。
图2为IbSPB1在转基因甘薯中的表达分析。其中，WT为野生型甘薯植株；L1-L5为转基因植株。
图3为过表达IbSPB1转基因甘薯植株和野生型甘薯抗旱性鉴定；其中，WT为野生型甘薯；L1、L2和L3为过表达IbSPB1转基因甘薯株系。对照表示在正常培养基中培养4周的鲜重和根长，干旱表示在胁迫培养基中培养4周的鲜重和根长。
图4为过表达IbSPB1转基因甘薯植株和野生型对照的H2O2含量测定；其中，WT为野生型甘薯；L1、L2和L3为过表达IbSPB1转基因甘薯株系。对照表示在正常培养基中培养4周，干旱表示在胁迫培养基中培养4周。
具体实施方式
甘薯品种鲁薯3号在文献“翟红,商丽丽,刘庆昌.甘薯茎线虫诱导抑制差减杂交cDNA文库的构建及表达序列标签分析.农业生物技术学报，2010,18(1)：141–148.”中公开，公众经作者同意后，可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
甘薯品种栗子香在文献“Yu B,Zhai H,Wang YP,Zang N,He SZ,LiuQC.Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation usingembryogenic suspension cultures in sweetpotato,Ipomoea batatas(L.)Lam.2007,Plant Cell,Tissue&Organ Culture，90(3):265-273).”中公开(文献中名称为Lizixiang)，公众经作者同意后，可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
pMD19-T载体购自北京泽平科技有限责任公司，产品目录号为A1360。
载体pCAMBIA1300-35购自武汉转导生物实验室有限公司，产品目录号为VT4004。
根癌农杆菌EHA105购自北京拜尔迪生物技术有限公司。
大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)
下述实施例采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与提高甘薯抗旱相关蛋白质IbSPB1及其编码基因的获得
1.1、甘薯(Ipomoea batatas)IbSPB1基因cDNA的克隆
实验材料：甘薯品种鲁薯3号
1.1.1、甘薯总RNA提取
取0.1g甘薯幼嫩叶片在液氮中研磨成粉状，加入2mL离心管，用TIANGEN的RNApreppure植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP432)提取甘薯总RNA，试剂盒中包括：裂解液RL，去蛋白液RW1，漂洗液RW，RNase-Free ddH2O，RNase-Free吸附柱CR3，RNase-Free过滤柱CS，DNase I，缓冲液RDD，RNase-Free离心管，RNase-Free收集管。取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260nm)和纯度(OD260nm/OD280nm)，提取的鲁薯3号总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5-2︰1，表明总RNA没有降解，所得mRNA符合实验要求，可用于IbSBP1蛋白cDNA全长的克隆。
1.1.2、IbSPB1基因cDNA的全长克隆
设计引物进行IbSPB1 cDNA的全长克隆。
引物序列如下：
引物1：5′-ATGGCTTTTCCTCAGCAG-3'
引物2：5′-TTACATATAAACCTCTATACCTATAT-3'
以上述步骤1提取的总RNA经QuantScript RT Kit(TIANGEN，Beijing)反转录为模板DNA，用高保真的LA酶，进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1002bp长度的扩增片段。
经过测序，该PCR产物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，将该序列所示的基因命名为IbSPB1基因，该基因的编码区为SEQ ID No.2自5′端第1-1002位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为IbSPB1蛋白或蛋白质IbSPB1，氨基酸序列为SEQ ID No.1，由333个氨基酸残基组成。
1.2、植物表达载体的构建
根据甘薯IbSPB1基因cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物(引物3和引物4)分别引入Kpn I和BamH I酶切位点，引物序列如下：
引物3：5'-CGGGGTACCCCGATGGCTTTTCCTCAGCAGA-3'(下划线部分为Kpn I酶切位点序列)，
引物4：5'-CGCGGATCCGCGTTACATATAAACCTCTATACCTATAT-3'(下划线部分为BamH I酶切位点)。
以人工合成的SEQ ID No.2为模板，PCR扩增获得产物备用。
用Kpn I和BamH I酶切载体pCAMBIA1300-35S(武汉转导生物实验室有限公司，产品目录号为VT4004)，回收载体大片段，同时，用Kpn I和BamH I酶切上述PCR产物，回收约1.0kb中间片段，将回收的载体大片段与约1.0kb中间片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，在载体pCAMBIA1300-35S的Kpn I和BamH I识别位点间插入了SEQ ID No.2自5′端第1位-第1002位所示的序列，载体pCAMBIA1300-35S的其他核苷酸序列保持不变，说明重组载体构建正确，将重组载体命名为pCB-IbSPB1。pCB-IbSPB1中，启动IbSPB1基因转录的启动子是位于载体pCAMBIA1300-35S的35S启动子。
1.3、植物表达载体转化农杆菌
(1)从-80℃低温冰箱中取出200μL根癌农杆菌EHA105感受态细胞，置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pCB-IbSBP1，混匀。
(2)液氮冷冻1min，37℃温育5min。
(3)加入800μL LB液体培养基，28℃培养2-6h。
(4)取100μL菌液至LB固体培养基上(含100μg/mL利福平(Rif)、25μg/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d。
(5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落，接种到含有100μg/mL Rif、25μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到导入pCAMBIA1300-IbSPB1的农杆菌菌液(含目的基因的农杆菌菌液)。
实施例2、甘薯的遗传转化及再生
2.1、外植体制备
将消毒后的栗子香茎尖在显微镜下剥离，利用解剖刀切取0.1mm大小的茎尖分化组织细胞接种于含有2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上，在暗培养条件下培养。待细胞生成胚状体后，将小块的胚状体均匀放入含有2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中，震荡培养，7天继代一次(具体方法参照Yu等，2007)。
2.2、用农杆菌介导的方法将IbSPB1 cDNA的编码序列导入到甘薯品种栗子香中。具体方法如下：
将制备好的含目的基因的农杆菌菌液加入甘薯品种栗子香胚性悬浮细胞团中，静止5-8mins后，将悬浮细胞团均匀放置在含有2.0mg/L 2,4-D及30mg/L AS的MS固体培养基上，进行共培养，27±1℃，暗培养3d。随后，将胚性细胞团培养在含有2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中进行延迟培养。7-10d后，将细胞团放在铺有滤纸并含有2.0mg/L 2,4-D，0.25mg/L潮霉素的固体MS培养基上筛选培养，27±1℃，暗培养10d后；陆续将生长状态良好的愈伤组织转移到铺有一层滤纸并含有2.0mg/L 2,4-D，0.5mg/L潮霉素的MS固体培养基上选择培养，27±1℃，暗培养，每2周更换一次培养基；8周后将存活下来的抗性愈伤组织小心的转移到含有1.0mg/L ABA固体MS培养基上进行诱导，27±1℃，每日13h、3000lux的光照。2-4周后，将变绿的体细胞胚转移到固体MS培养基上，27±1℃，每日13h、3000lux的光照。4-8w之后，生长成完整的再生植株，获得拟转基因植株。
转基因植株的鉴定使用PCR检测和qRT-PCR检测相结合的方法。
A、PCR检测
用CTAB法提取拟转基因植株和野生型甘薯植株(甘薯品种栗子香)的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的IbSPB1基因引物为：
引物5：5’-TTCTTCACTTCATTGCCATCC-3’
引物6：5’-GGAAGGTGGCTCCTACAAA-3’。
在0.2ml Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μl、4dNTP(10mol/L)1μl、引物(10μmol/l)均为1μl、模板DNA(50ng/ul)2μl、Taq DNA聚合酶1ul，加H2O至总体积20μl。反应程序为94℃变性4mins，57℃复性1.5mins，72℃延伸1min30s，共36个循环。使用pCB-IbSPB1载体质粒为阳性对照，水和野生型甘薯植株为阴性对照，然后进行电泳检测。
结果见图1，从图中可见，拟转基因植株L1-L6和阳性对照扩增出约1000bp的目标条带，表明IbSPB1基因已经整合到甘薯的基因组中，并证明拟转基因植株L1-L6这些植株为转基因植株，以下又称转基因甘薯阳性植株；水和野生型甘薯植株没有扩增出目标条带。
B、qRT-PCR
提取转基因甘薯阳性植株的RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以野生型甘薯植株为对照。
以甘薯肌动蛋白(Actin)基因为内参，引物序列为：
IbActin-F：5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′
IbActin-R：5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′
IbSPB1引物序列为：
引物7：5’-ACTTCTTGCAGCCACGATCA-3’
引物8：5’-ACGCCAATCGCCCATTATCA-3’
qRT-PCR结果如图2所示，结果表明IbSPB1基因在转基因植株中得到不同程度的表达。选取转基因甘薯植株植株L1、L2、L3进行组织培养扩繁，得到过表达IbSPB1转基因甘薯株系L1、L2、L3，进行后续试验。
实施例3、转基因植株的抗旱性鉴定
3.1表型鉴定
将实施例2的过表达IbSPB1转基因甘薯株系L1、L2、L3和野生型甘薯(甘薯品种栗子香)分别培养于MS培养基(正常培养基)和含聚乙二醇(浓度为20％)的MS培养基上(向MS培养基中添加聚乙二醇使聚乙二醇的含量为20％得到的固体培养基，胁迫培养基)，每个株系每种培养基各3株植株。培养条件均为27±1℃，每天13h、3000lux光照，培养4周后，对其生长状态和生根情况进行观察和测量。
分别测量胁迫处理前后各个植株的鲜重(包括根和地上部分的整个植株的鲜重)和根长(主根的长度)。
结果如图3所示，野生型甘薯(WT)在聚乙二醇(浓度为20％)的MS培养基上长势较弱，生根困难；3个过表达转基因甘薯株系的生长状态和生根情况不同程度优于野生型对照，结果说明过表达IbSPB1提高了转基因甘薯植株的抗旱性。
3.2、H2O2含量测定
过氧化氢(H2O2)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：H2O2-2-Y)来测定甘薯植株的H2O2含量。
将过表达IbSPB1转基因甘薯株系L1、L2、L3的植株和野生型甘薯(甘薯品种栗子香)分别继代于含有聚乙二醇(浓度为20％)的MS固体培养基(胁迫培养基)和MS固体培养基(正常培养基)上进行培养，每个株系每种培养基3个植株。培养条件均为温度为27±1℃，每天13h、3000lux光照，培养4周后，取其叶片进行H2O2含量测定，重复3次。
过表达IbSPB1转基因甘薯株系L1、L2、L3的植株和野生型对照的H2O2含量测定结果见图4，结果显示，在含有聚乙二醇(浓度为20％)的MS培养基上3个转基因株系的H2O2含量均显著低于野生型甘薯植株。
上述转基因甘薯植株H2O2含量的测定结果表明，同野生型甘薯植株相比，过表达IbSPB1的转基因甘薯植株的抗旱性显著提高，说明蛋白质IbSPB1及其编码基因可用来调控植物耐逆性，尤其是提高植物抗旱性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 抗旱相关蛋白IbSPB1及其编码基因与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 333
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 1
Met Ala Phe Pro Gln Gln Lys His Phe Gln Gln Pro Pro Pro Gln Pro
1 5 10 15
His Gln Gln Ser Lys Ala Phe Arg Asp Leu Tyr Asn Val Glu Gly Gln
20 25 30
Ile Ser Gln Pro Val Ala Tyr Phe Asn Gly Pro Asn Leu Pro Asp Gln
35 40 45
Ser Gln His Pro Pro Tyr Ile Pro Pro Phe Gln Val Ala Gly Leu Ala
50 55 60
Pro Gly Thr Val Glu Glu Ser Gly Gln Asp Leu Gln Trp Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Leu Glu Pro Lys Lys Lys Arg Pro Lys Glu Gln Asp Phe Leu Glu Asn
85 90 95
Asn Ser Pro Ile Ser Ser Leu Asp Phe Leu Gln Pro Arg Ser Val Ser
100 105 110
Thr Gly Leu Gly Leu Ser Leu Asp Asn Gly Arg Leu Ala Ser Ser Gly
115 120 125
Asp Ser Ser Phe Leu Gly Leu Ser Gly Asp Asp Ile Glu Arg Glu Leu
130 135 140
Gln Arg Gln Asp Ala Glu Ile Asp Arg Tyr Ile Lys Val Gln Gly Asp
145 150 155 160
Arg Leu Arg Gln Ala Ile Leu Glu Lys Val Gln Ala Asn Gln Leu His
165 170 175
Thr Ile Ser Tyr Phe Glu Glu Lys Val Ile Gln Lys Leu Arg Glu Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Val Glu Asn Ile Asn Lys Lys Asn Val Asp Leu Glu Met
195 200 205
Gln Met Glu Gln Leu Ala Leu Glu Ala Asn Ala Trp Gln Gln Arg Ala
210 215 220
Lys Tyr Asn Glu Ser Leu Ile Asn Thr Leu Lys Phe Asn Leu Gln Gln
225 230 235 240
Val Tyr Ala Gln Ser Lys Asp Ser Lys Glu Gly Cys Gly Asp Ser Glu
245 250 255
Val Asp Asp Thr Ala Ser Cys Cys Asn Gly Arg Ala Ile Asp Phe His
260 265 270
Leu Leu Cys Arg Asp Gly Asn Glu Val Lys Lys Leu Met Thr Cys Lys
275 280 285
Val Cys Arg Val Asn Thr Val Cys Met Leu Leu Leu Pro Cys Lys His
290 295 300
Leu Cys Leu Cys Lys Glu Cys Glu Ser Lys His Ser Thr Cys Pro Leu
305 310 315 320
Cys Gln Ser Thr Lys Tyr Ile Gly Ile Glu Val Tyr Met
325 330
<210> 2
<211> 1002
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 2
atggcttttc ctcagcagaa acacttccag caaccgccgc ctcaaccaca ccaacaatcc 60
aaagctttca gagatttata taacgtggag ggtcagattt cacagcctgt ggcttacttc 120
aacggtccta atcttcccga tcagtctcag catcctcctt atattcctcc ttttcaagtg 180
gctggattag ctcctggtac tgtggaagaa agtgggcagg atttgcagtg gaattatggg 240
ttggagccga agaagaagag gccaaaggag caagattttc tggagaataa ttctccgata 300
tcttctctag acttcttgca gccacgatca gtgtctactg gcctcggatt gtcccttgat 360
aatgggcgat tggcgtcatc tggggactcc tcctttctgg gtctttctgg ggatgacatt 420
gaacgcgagc tgcagagaca ggatgctgag attgataggt acatcaaagt tcagggtgac 480
cgtttgaggc aagctatttt agagaaggtt caagcgaatc aactacatac tatatcctat 540
tttgaagaaa aggtcattca aaagctacgc gagagagagg ctgaggttga aaacatcaac 600
aagaaaaatg tcgaccttga gatgcaaatg gaacaattag ctctggaagc caatgcttgg 660
caacagcgag ccaaatacaa tgaaagcctg attaacacac tcaaattcaa cttacaacag 720
gtttatgctc aaagcaaaga tagtaaggaa ggatgtggtg acagtgaggt ggatgataca 780
gcatcttgtt gtaatgggcg tgccattgat tttcacctgc tttgcaggga tggcaatgaa 840
gtgaagaagt tgatgacttg taaggtttgt agagtcaaca cagtatgcat gctactgtta 900
ccatgtaagc atctctgtct gtgtaaagaa tgtgaaagta agcatagtac ttgcccattg 960
tgtcagtcta caaagtatat aggtatagag gtttatatgt aa 1002
Claims (5)
1.提高植物抗旱性的方法，其特征在于，包括提高目的植物中氨基酸序列是SEQ IDNo.1的蛋白质的编码基因的表达量，从而提高目的植物的抗旱性；所述植物为甘薯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码基因为编码链的编码序列是如SEQ ID No.2所示的DNA分子。
3. 氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质或其相关生物材料在提高植物抗旱性中的应用；
其中，所述生物材料为下述B1）至B4）中的任一种：
B1）编码所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
所述植物为甘薯。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗旱性表现为下述任一种：
P1）提高干旱胁迫条件下植物的生根情况；
P2）提高干旱胁迫条件下植物的长势；
P3）降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，B1）所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
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| GR01 | Patent grant | ||
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