CN110294795B

CN110294795B - 大豆蛋白质GmDISS2及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

Info

Publication number: CN110294795B
Application number: CN201810235382.4A
Authority: CN
Inventors: 陈受宜; 张劲松; 盖钧镒; 陶建军; 王宇峰; 张万科; 马彪; 林晴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: CN110294795A

Abstract

本发明公开了大豆蛋白质GmDISS2及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。本发明提供的大豆蛋白质GmDISS2为如下A1)或A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的大豆蛋白质GmDISS2及其编码基因可以调控植物的耐逆性，对培育耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

Description

大豆蛋白质GmDISS2及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中，大豆蛋白质GmDISS2及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化,例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫。

大豆是重要的油料作物，是植物蛋白质的主要来源，研究其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一个来源于大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)的蛋白质在调控植物耐逆性中的应用；所述蛋白质名称为GmDISS2，为如下A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；

A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的GmDISS2蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的GmDISS2蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的GmDISS2蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的GmDISS2蛋白质。

本发明还提供了与GmDISS2蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用；所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：

B1)编码GmDISS2蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

B12)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B15)降低GmDISS2蛋白质表达的核酸分子；

B16)含有B15)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)、b2)或b3)：

b1)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmDISS2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmDISS2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

B15)所述核酸分子可为序列表中序列2的第2241-2799位或第3239-3754位所示的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmDISS2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmDISS2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmDISS2蛋白质且具有GmDISS2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码GmDISS2蛋白质的核酸分子的表达盒(GmDISS2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmDISS2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmDISS2基因转录的启动子，还可包括终止GmDISS2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GmDISS2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为表达载体pROKII。

B3)所述重组载体具体可为pROKII-GmDISS2，所述pROKII-GmDISS2为将序列表中序列1所示的DNA分子连接至pROKII载体中，且保持pROKII载体的其他序列不变得到的载体，所述pROKII-GmDISS2能表达序列2所示的GmDISS2。

B15)所述重组载体具体可为pZH01-GmDISS2-RNAi-1或pZH01-GmDISS2-RNAi-2，所述pZH01-GmDISS2-RNAi-1为在Sac I与Kpn I的识别序列间插入序列2的第2241-2799位所示的DNA片段，并在Xba I与Sal I的识别序列间反向插入在序列2的第2241-2799位的两端添加Sac I与Kpn I的识别序列后得到的DNA片段而得到的重组载体；所述pZH01-GmDISS2-RNAi-2为在Sac I与Kpn I的识别序列间插入序列2的第3239-3754位所示的DNA片段，并在Xba I与Sal I的识别序列间反向插入在序列2的第3239-3754位的两端添加Sac I与Kpn I的识别序列后得到的DNA片段而得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌K599。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了GmDISS2蛋白质或所述生物材料的下述任一应用：

C1)在提高植物耐逆性中的应用；

C2)在制备提高植物耐逆性产品中的应用；

C3)在培育耐逆性增强植物中的应用；

C4)在制备培育耐逆性增强植物产品中的应用；

C5)在植物育种中的应用。

本发明还提供了提高植物耐逆性产品，所述产品含有GmDISS2蛋白质或所述生物材料。

所述产品可以GmDISS2蛋白质或所述生物材料作为其活性成分，还可以将GmDISS2蛋白质或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

本发明还提供了下述X1)或X2)的方法：

X1)一种培育耐逆植物的方法，包括：提高目的植物中GmDISS2蛋白质的活性和/或含量，或，促进GmDISS2蛋白质的编码基因的表达，得到与所述目的植物相比耐逆增强的耐逆植物；

X2)一种培育不耐逆植物的方法，包括：降低目的植物中GmDISS2蛋白质的活性和/或含量，或，降低GmDISS2蛋白质的编码基因的表达，得到与所述目的植物相比耐逆降低的不耐逆植物。

上述方法中，所述耐逆植物可为通过向所述目的植物中导入GmDISS2蛋白质的编码基因得到的与所述目的植物相比GmDISS2蛋白质表达升高的转基因植物；

所述不耐逆植物可为通过向所述目的植物中导入B15)所述核酸分子及其反向核酸分子得到的与所述目的植物相比GmDISS2蛋白质表达降低的转基因植物。

上述方法中，所述GmDISS2蛋白质的编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述GmDISS2的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据目的植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmDISS2的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述GmDISS2的编码基因可利用含有所述GmDISS2的编码基因的重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体具体可为所述pROKII-GmDISS2。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。

所述耐逆植物和所述不所述耐逆植物理解为不仅包含第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗冷植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明中，所述植物可为m1)或m2)或m3)：

m1)双子叶植物或单子叶植物；

m2)豆科植物；

m3)大豆；

所述目的植物可为m1)或m2)或m3)：

m1)双子叶植物或单子叶植物；

m2)豆科植物；

m3)大豆。

本发明中，所述耐逆可为耐盐。所述耐盐具体可体现在对100mM NaCl水溶液的耐性上。

实验证明，向植物中转入本发明的GmDISS2编码基因得到的GmDISS2表达升高的植物耐盐性提高，而GmDISS2表达降低则降低了植物的耐盐性，表明GmDISS2蛋白质及其编码基因与植物耐盐相关，能显著提高植物的耐盐性。本发明的耐盐相关蛋白GmDISS2及其编码基因对培育耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

附图说明

图1为GmDISS2基因在大豆耐盐品种南农1138-2和盐敏品种科丰1号中的表达情况。其中，KF表示科丰1号，1138表示南农1138-2。

图2为盐胁迫下GmDISS2基因在大豆耐盐品种南农1138-2的表达情况。其中，横坐标中0、3、6和9的单位为小时。

图3为重组载体构建示意图。

图4为转基因植株中GmDISS2基因表达量分析。其中，对照为转GmDISS2空载体对照，OE为转K599/pROKⅡ-GmDISS2毛状根，RNAi-1为转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1毛状根，RNAi-2为转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2毛状根。

图5为盐胁迫下各植株的表型。其中，未处理表示在水中进行的处理；对照为转GmDISS2空载体对照，OE为转K599/pROKⅡ-GmDISS2植株，RNAi-1为转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1植株，RNAi-2为转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2植株。

图6为存活率统计结果。其中，对照为转GmDISS2空载体对照，OE为转K599/pROKⅡ-GmDISS2植株，RNAi-1为转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1植株，RNAi-2为转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

大豆[Glycine max(L.)Merr]南农1138-2，来源于南京农业大学国家大豆改良中心种质库，由南京农业大学国家大豆改良中心提供，记载在如下文献中：盖钧镒等，大豆品种南农493-1和南农1138-2与其衍生新品种的亲缘关系及其育种价值分析，南京农业大学学报，1997年01。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

大豆科丰1号(Glycine max L.Merr.Kefeng 1)记载在如下文献中：W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTL mapping of tenagronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)genetic map and theirassociation with EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pROKII载体(双元表达载体)记载在记载在如下文献中：D.C.Baulcombe,G.R.Saunders,M.W.Bevan,M.A.Mayo and B.D.Harrison,Expression of biologicallyactive viral satellite RNA from the nuclear genome of transformedplants.Nature 321(1986),pp.446–449。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pZH01载体，Stratagene公司产品，记载在如下文献中：Han Xiao,etal.Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 by RNAinterference,Plant Molecular Biology,2003,52,957-966。

发根农杆菌K599记载在如下文献中：Attila Kereszt,et al.,Agrobacteriumrhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology,NatureProtocols,2007,2(4),549-552)中，公众可从Peter M Gressnon教授(The University ofQueensland,St Lucia,Queensland 4072,Australia)处获得，也可经Peter M Gressnon教授同意(书面同意书)后从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、大豆GmDISS2及其表达模式

本发明提供了一个来源于大豆南农1138-2的蛋白质——GmDISS2，其氨基酸序列为序列表中序列2，在南农1138-2中GmDISS2的编码基因为序列表中序列1。

1、在正常条件下，检测GmDISS2基因在耐盐和盐敏大豆品种中的表达特性：将大豆耐盐品种南农1138-2和盐敏品种科丰1号种子分别种在盆中，光照培养，生长2个星期后检测GmDISS2基因的在各品种的根、茎和叶中的表达情况。

所用引物为：

QRT-F2-1：5′-CATAGTCCCACGACCGAGAATT-3′；

QRT-R2-1：5′-GTTCTCCCGTCGCTGGATT-3′。

利用大豆Tublin基因为内标，内标引物为Primer-TF：5′-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3′，Primer-TR：5′-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3′。

结果如图1所示，结果显示，GmDISS2基因主要在根中表达，耐盐亲本南农1138-2根中，该基因的表达量明显高于盐敏亲本科丰1，说明其在耐盐和盐敏亲本的根和叶中表达有明显差异。

2、在盐胁迫条件下，检测GmDISS2基因的表达特性：将大豆南农1138-2种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗将豆苗根部小心的吸去水分，置于1％(质量百分比)NaCl溶液中进行盐胁迫处理，于盐胁迫0、3、6、9小时检测GmDISS2基因在根和叶中的表达情况，方法同步骤1。

结果如图2所示，在南农1138-2中，与未处理对照(0小时)比较，在根和叶中GmDISS2基因的表达水平在盐胁迫处理3小时时，迅速上升，在根中，不断上升，于处理6小时时到达峰值，9小时略下降，但仍远高于0时，在叶中，GmDISS2也明显受盐胁迫诱导，但表达量低于根中。

实施例2、转大豆GmDISS2基因的植株具有抗盐胁迫能力

一、重组载体的构建

1、GmDISS2基因植物表达载体的构建

提取南农1138-2幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。

用DISS2-pROK2F1和DISS2-pROK2R1引物对cDNA进行PCR，得到含有GmDISS2编码基因的PCR产物。

DISS2-pROK2F1：AGAACACGGGGGACTCTAGAATGGAGGGTGGGGGTAGTAGT

DISS2-pROK2R1：GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAACGCCGTTGGAAATTGAAC

pROKII载体用BamH1和KpnI双酶切，得到骨架载体。将PCR产物与骨架载体采用CloneSmarter无缝克隆试剂盒将GmDISS2编码基因重组连入pROKII载体，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为pROKII-GmDISS2。pROKII-GmDISS2的部分结构如图3所示，pROKII-GmDISS2能表达序列2所示的蛋白质。

2、GmDISS2 RNAi载体的构建

pZH01-GmDISS2-RNAi载体的构建方法如下：

以南农1138-2的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用pZH01-GmDISS2-RNAi-1引物进行PCR扩增，将得到的DNA片段记为DNA片段1。利用Sac I与Kpn I对DNA片段1进行双酶切，得到酶切产物1-1，利用Sac I与Kpn I对pZH01载体进行双酶切，得到载体骨架，连接该载体骨架与酶切产物1-1得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体记为中间载体1；利用Xba I与Sal I对DNA片段1进行双酶切，得到酶切产物1-2，利用Xba I与Sal I对中间载体1进行双酶切，得到载体骨架，连接该载体骨架与酶切产物1-2得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体记为pZH01-GmDISS2-RNAi-1。pZH01-GmDISS2-RNAi-1为在Sac I与Kpn I的识别序列间插入序列2的第2241-2799位所示的DNA片段，并在Xba I与Sal I的识别序列间反向插入在序列2的第2241-2799位的两端添加Sac I与Kpn I的识别序列后得到的DNA片段而得到的重组载体。pZH01-GmDISS2-RNAi-1引物：

DISS2Ri-F1：TGCTCTAGAGAGCTCAGGTGTTGGGGCTTTGATTG(下划线处分别为Xba I和Sac I的识别序列)；

DISS2Ri-R1：ACGCGTCGACGGTACCTCCAGAAATCCGTGCAAATG(下划线处分别为Sal I和Kpn I的识别序列)。

以南农1138-2的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用pZH01-GmDISS2-RNAi-2引物进行PCR扩增，将得到的DNA片段记为DNA片段2。利用Sac I与Kpn I对DNA片段2进行双酶切，得到酶切产物2-1，利用Sac I与Kpn I对pZH01载体进行双酶切，得到载体骨架，连接该载体骨架与酶切产物2-1得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体记为中间载体2；利用Xba I与Sal I对DNA片段2进行双酶切，得到酶切产物2-2，利用Xba I与Sal I对中间载体2进行双酶切，得到载体骨架，连接该载体骨架与酶切产物2-2得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体记为pZH01-GmDISS2-RNAi-2。pZH01-GmDISS2-RNAi-2为在Sac I与Kpn I的识别序列间插入序列2的第3239-3754位所示的DNA片段，并在Xba I与Sal I的识别序列间反向插入在序列2的第3239-3754位的两端添加Sac I与Kpn I的识别序列后得到的DNA片段而得到的重组载体。pZH01-GmDISS2-RNAi-2引物：

DISS2Ri-F2：TGCTCTAGAGAGCTCGGCCACTTGGACATCATTCTT(下划线处分别为Xba I和Sac I的识别序列)；

DISS2Ri-R2：ACGCGTCGACGGTACCTTCGCTCAACAGCAACCACT(下划线处分别为Sal I和Kpn I的识别序列)。

pZH01-GmDISS2-RNAi-1和pZH01-GmDISS2-RNAi-2的构建示意图如图3所示。

二、转基因大豆毛状根的制备

发根农杆菌侵染法根据Attila Kereszt等方法(Attila Kereszt,et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of rootbiology,Nature Protocols,2007,2(4),549-552)略加改进，可参考Wang,Fang；Chen,Hao-Wei；Li,Qing-Tian；Wei,Wei；Li,Wei；Zhang,Wan-Ke；Ma,Biao；Bi,Ying-Dong；Lai,Yong-Cai；Liu,xin-Lei；Man,Wei-Qun；Zhang,Jin-Song；Chen,Shou-Yi,GmWRKY27interactswith GmMYB174 to reduce expression of GmNAC29 for stress tolerance in soybeanplants,2015,The Plant Journal,83,224–236,或陈受宜等授权专利，植物耐逆性相关转录因子GmWRKY78及其编码基因与应用，授权号：ZL2011 1 0053083.7,授权日2013.10.09。具体方法如下：

1)重组农杆菌的获得

将上述得到的重组表达载体pROKⅡ-GmDISS2、pZH01-GmDISS2-RNAi-1和pZH01-GmDISS2-RNAi-2分别导入发根农杆菌K599，得到重组农杆菌。将含有上述质粒的重组农杆菌分别命名为K599/pROKⅡ-GmDISS2、K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1和K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2。

2)毛状根转化

大豆科丰1号种子播种于蛭石中，待长出2片真叶待用。

用注射器分别将上述重组农杆菌K599/pROKⅡ-GmDISS2、K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1和K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2接种生长6天含两片真叶的大豆科丰1号幼苗(6天苗龄，在距离蛭石表面1-2cm处注射重组农杆菌)，保湿生长：光照16小时，温度25℃，湿度50％。2周后，长出的毛状根即为转基因毛状根。分别获得101、123和111个转K599/pROKⅡ-GmDISS2、K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1和K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2的转基因植株，可进一步作转基因鉴定和耐逆性检测。

以相同的方法将含空载体pROKⅡ的发根农杆菌K599/pROKⅡ和含有空载体pZH01载体的发根农杆菌K599/pZH01分别转入大豆科丰1号幼苗，得到两种转空载体毛状根根系，分别作为转GmDISS2空载体对照和RNAi空载体对照。

3)转基因毛状根的分子鉴定

提取转基因毛状根和转空载体毛状根总RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，用QRT-DISS2F1和QRT-DISS2R1进行GmDISS2基因表达量分析。以大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。实验重复三次，结果取平均值±标准差。引物序列如下：

QRT-F2-1：5′-CATAGTCCCACGACCGAGAATT-3′；

QRT-R2-1：5′-GTTCTCCCGTCGCTGGATT-3′。

结果如图4所示，结果显示，将GmDISS2基因在转空载体毛状根对照中的表达量设为1(两种转空载体对照植株中GmDISS2基因的表达无显著差异)，在转K599/pROKⅡ-GmDISS2毛状根(OE)中的表达量约为13.8，明显高于转空载体毛状根，而在两个K599/pROKⅡ-GmDISS2-RNAi毛状根(RNAi-1和RNAi-2)中分别约为0.7和0.4，则显著低于对照。

三、转GmDISS2和GmDISS2-RNAi毛状根的耐盐性鉴定

实验样本为：转GmDISS2空载体对照，RNAi空载体对照，转K599/pROKⅡ-GmDISS2嵌合体植株，转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1嵌合体植株，转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2嵌合体植株。

1)耐盐性鉴定：

将上述三种转基因植株和两种转空载体植株分成2组，每组每种植株均为10个。将第一组经100mM NaCl水溶液处理10天，即将毛状根浸入100mM NaCl溶液中，浸泡温度为25℃；将第二组的毛状根浸入水中作为对照处理。实验重复三次，结果取平均值±标准差。

100mM NaCl水溶液处理10天后，拍照观察。结果(图5)显示，对照处理下各植株的表型均无显著差异；在100mM NaCl处理下，转GmDISS2空载体对照和RNAi空载体对照的表型无显著差异，转K599/pROKⅡ-GmDISS2嵌合体植株及其叶(OE)萎蔫程度显著低于转GmDISS2空载体对照的植株和叶，而转转K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-1和K599/pZH01-GmDISS2-RNAi-2的嵌合体植株及其叶(RNAi-1和RNAi-2)则萎蔫程度明显高于RNAi空载体对照，有显著差异。植株存活率统计结果示于图6。

图6显示，在100mM NaCl处理10天后，转GmDISS2空载体对照和RNAi空载体对照的存活率无显著差异，转GmDISS2空载体对照、OE、RNAi-1和RNAi-2的嵌合体植株存活率分别约为48％、69％、31％和24％，OE、RNAi-1和RNAi-2的存活率与转GmDISS2空载体对照具有极显著差异。表明，向大豆中转入GmDISS2基因提高了植株的耐盐性，而其降低表达量则植株的耐盐性也相应下降。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 大豆蛋白质GmDISS2及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4338

<212> DNA

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 1

atggagggtg ggggtagtag ttttaggatt ggaagttcat ccatttggag gaacagcgac 60

gcggcggaga tcttctcaaa ctctttccac caagagaatg atgaagaggc tcttaaatgg 120

gctgccattc agaaacttcc tacagttgcg cgtttgagga aagctttgat cacttcaccc 180

gatggcgagt ccaatgagat cgatgtaaag aaacttgggt tgcaagaaaa gaaagctttg 240

cttgaaagac tggtgaaaac tgctcaagag gacaatgaga agtttttgct caagctcaag 300

gacagaattg atagagttgg aattgatctt cctaccatag aggttcggtt tgagaacctg 360

agcatcgaag cagaagctcg tgcaggaact agagctttgc ctacattcac taacttcatc 420

gttaatatac tggagggctt gttgaactct cttcatgtac ttccaaacag aaaacaacat 480

ttaaacattc tagaggatgt tagcggaata ataaagcctg gaagaatgac attgctttta 540

ggccctccaa gttctgggaa aaccacactc ctactagcct tggctggaaa acttgatcca 600

aaattaaagt tctctggaaa ggtaacttat aatggtcacg ggatgaatga gtttgtaccc 660

caaaggactg ctgcttatgt caatcaaaat gatcttcacg ttgcagaatt gacggtcaga 720

gaaaccttgg ccttctcagc cagggtccaa ggagttggac ctcgttacga cttgctggcg 780

gaattgtcca gaagagaaaa agaggcaaat atcaagcctg atccagatat tgatgcctat 840

atgaaggctg tagcatctga aggacagaag gcaaatatga taacagatta tatcctgagg 900

attttgggac tagaggtttg tgctgatact gttgtaggaa atgcaatgtt aagaggtatc 960

tctggtggac aaaggaaacg tgttacaaca ggggagatgc tagttggacc agctaaagct 1020

cttttcatgg atgaaatatc cactggtttg gatagctcaa cgacttttca gattgtgaat 1080

tcactaaagc aatatgtcca cattctcaaa ggaaccacag tcatctcact cctgcagcca 1140

gcaccagaga cttacaatct ttttgatgac atcattctac tctctgatag tcacattgtg 1200

tatcagggtc ctcgtgaaca cgtgcttgaa tttttcgaat taatgggttt taaatgtccc 1260

cagaggaaag gtgtggcaga ctttttgcaa gaagttacat caaggaaaga tcaggagcag 1320

tactgggcac acaaagatca gccttataga tttgtcacag ccaaagagtt ctcggaggca 1380

cataagtcat ttcatattgg gagaagtctt ggtgaagaac ttgctactga atttgacaag 1440

tctaagagcc acccagccgc attgacaacc aaaatgtatg gagtgggaaa atgggagctg 1500

ttaaaagctt gcttatcgag ggaatattta cttatgaagc gcaattcatt cgtctacacc 1560

ttcaaacttt gccaacttgc tgtattagca attattgcca tgaccatttt cctccggacc 1620

gagatgcaca gagattcagt gactcatgga ggcatatatg tgggtgcatt gttctatggt 1680

gttgttgtga ttatgttcaa tggattggct gaactttcca tggtcgtttc acggcttcct 1740

gttttctaca agcaaaggga ctatctcttc ttcccttcat gggtatatgc acttcctgca 1800

tggatcctaa aaatcccctt gacttttgtg gaagtgggtg tttgggtatt cctcacctac 1860

tatgccattg gttttgatcc atatgttgga agattgttta ggcaatacct tgttcttgta 1920

ctagtaaatc aaatggcatc ggcattgttc cgattagttg cagcagttgg gagggaaatg 1980

acagtggctc taacacttgg gtcgtttaca ctggccatcc tatttgctat gagtggtttt 2040

gtcctatcaa aagaaaatat taaaaaatgg tggctatggg gcttctggat ctcacctatg 2100

atgtatggac aaaatgccat ggtaaataat gagttccttg ggaagagatg gagacatttt 2160

ctacctaact caaccgaggc actaggagtt gaaattttga aatcccgtgg attcttcact 2220

cagtcatact ggtactggat aggtgttggg gctttgattg gatatacatt acttttcaac 2280

tttggctaca tccttgctct cacatactta aatccacttg ggaaacatca agctgttata 2340

tcagaggaac ctcaaatcaa tgaccagagt ggtgatagta aaaagggaac taatgtgttg 2400

aagaacatac aacgtagctt ctctcagcac tcaaatagag tgagaaatgg caaaagttta 2460

agtggaagca cctctcccga gacaaaccat aacaggacaa gaggaatgat tcttccttct 2520

gaacctcatt ccatcacctt tgatgatgta acatattctg tcgacatgcc tgtggaaatg 2580

aggaatagag gtgttgttga ggataaattg gctctattga agggtgtcag tggagctttc 2640

aggccaggtg ttctcactgc tctaatgggt gtcacaggtg caggcaaaac aactctgatg 2700

gatgtactcg ctggtagaaa aactggggga tatattgggg ggaatatcac aatctctggt 2760

tatccaaaga agcaagaaac atttgcacgg atttctggat actgcgagca aaatgatatc 2820

cactctcctc atgttactgt atatgaatct ttgctttact cagcatggct tcgactgtcc 2880

ccagaaatca atgctgacac caggaagatg ttcatcgagg aagttatgga acttgtggaa 2940

ctgaaagcac taaggaacgc attagttgga ttgcctggta ttaatggtct ctcaacagag 3000

caacgcaaaa ggttgactat tgcagttgaa cttgtggcaa atccttctat aatatttatg 3060

gatgagccaa cttctgggct agatgcaaga gctgctgcta ttgtcatgag aacagttagg 3120

aacacagtag acaccggaag aacagttgtc tgtaccatcc atcagccaag catagacata 3180

tttgaatctt ttgatgagct tttgctaatg aagcaaggag gccaagaaat atatgtgggg 3240

ccacttggac atcattcttc ccatttaatt aattactttg agggaatcca aggtgtcaat 3300

aagattaaag atggctataa tccggcaaca tggatgctgg aagtctcgac ttcagcaaaa 3360

gaaatggaat tggggattga ttttgctgag gtgtacaaaa attcagagtt atacaggaga 3420

aacaaagcac ttattaaaga attgagtact ccagctcctg gttcaaaaga cctttatttc 3480

ccatcacagt actcaacctc cttcctcact caatgcatgg cttgcttatg gaaacaacat 3540

tggtcttact ggcgcaatcc tctatacact gctataagat ttctttactc aactgctgta 3600

gctgctgtgc ttggtagcat gttctgggac cttggctcca aaattgacaa acaacaagat 3660

cttttcaatg ccatgggctc catgtatgct gctgttctcc ttattggcat taagaatgct 3720

aatgcagtgc agccagtggt tgctgttgag cgaacagtct tttataggga aaaagcagcc 3780

ggaatgtatt cagctttacc gtatgctttt gctcaggttc taattgagct cccatatgtt 3840

ctagtacaag ctgtggtata tggcattata atttatgcca tgattggttt tgagtggact 3900

gtaactaaag ttttctggta cctattcttc atgtacttca ccttcctgac cttcacctac 3960

tatggcatga tgtcagtagc agtgacccca aaccaacaca tttcttctat agtttcctct 4020

gcattctatg cagtgtggaa tctcttctca ggattcatag tcccacgacc gagaattcca 4080

gtgtggtgga gatggtacag ttgggcaaat cctgtagcat ggagtttgta tggattggtg 4140

gcttcacaat atggagatat aaagcaaagc atggaatcca gcgacgggag aacgacagta 4200

gaaggctttg taagaagcta ctttggtttc aagcatgatt ttctgggagt ggttgcagct 4260

gtgattgttg cattcccagt agtctttgca ttggtctttg ccatatcagt gaagatgttc 4320

aatttccaac ggcgttaa 4338

<210> 2

<211> 1445

<212> PRT

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 2

Met Glu Gly Gly Gly Ser Ser Phe Arg Ile Gly Ser Ser Ser Ile Trp

1 5 10 15

Arg Asn Ser Asp Ala Ala Glu Ile Phe Ser Asn Ser Phe His Gln Glu

20 25 30

Asn Asp Glu Glu Ala Leu Lys Trp Ala Ala Ile Gln Lys Leu Pro Thr

35 40 45

Val Ala Arg Leu Arg Lys Ala Leu Ile Thr Ser Pro Asp Gly Glu Ser

50 55 60

Asn Glu Ile Asp Val Lys Lys Leu Gly Leu Gln Glu Lys Lys Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Arg Leu Val Lys Thr Ala Gln Glu Asp Asn Glu Lys Phe Leu

85 90 95

Leu Lys Leu Lys Asp Arg Ile Asp Arg Val Gly Ile Asp Leu Pro Thr

100 105 110

Ile Glu Val Arg Phe Glu Asn Leu Ser Ile Glu Ala Glu Ala Arg Ala

115 120 125

Gly Thr Arg Ala Leu Pro Thr Phe Thr Asn Phe Ile Val Asn Ile Leu

130 135 140

Glu Gly Leu Leu Asn Ser Leu His Val Leu Pro Asn Arg Lys Gln His

145 150 155 160

Leu Asn Ile Leu Glu Asp Val Ser Gly Ile Ile Lys Pro Gly Arg Met

165 170 175

Thr Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Leu

180 185 190

Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Pro Lys Leu Lys Phe Ser Gly Lys Val

195 200 205

Thr Tyr Asn Gly His Gly Met Asn Glu Phe Val Pro Gln Arg Thr Ala

210 215 220

Ala Tyr Val Asn Gln Asn Asp Leu His Val Ala Glu Leu Thr Val Arg

225 230 235 240

Glu Thr Leu Ala Phe Ser Ala Arg Val Gln Gly Val Gly Pro Arg Tyr

245 250 255

Asp Leu Leu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Glu Lys Glu Ala Asn Ile Lys

260 265 270

Pro Asp Pro Asp Ile Asp Ala Tyr Met Lys Ala Val Ala Ser Glu Gly

275 280 285

Gln Lys Ala Asn Met Ile Thr Asp Tyr Ile Leu Arg Ile Leu Gly Leu

290 295 300

Glu Val Cys Ala Asp Thr Val Val Gly Asn Ala Met Leu Arg Gly Ile

305 310 315 320

Ser Gly Gly Gln Arg Lys Arg Val Thr Thr Gly Glu Met Leu Val Gly

325 330 335

Pro Ala Lys Ala Leu Phe Met Asp Glu Ile Ser Thr Gly Leu Asp Ser

340 345 350

Ser Thr Thr Phe Gln Ile Val Asn Ser Leu Lys Gln Tyr Val His Ile

355 360 365

Leu Lys Gly Thr Thr Val Ile Ser Leu Leu Gln Pro Ala Pro Glu Thr

370 375 380

Tyr Asn Leu Phe Asp Asp Ile Ile Leu Leu Ser Asp Ser His Ile Val

385 390 395 400

Tyr Gln Gly Pro Arg Glu His Val Leu Glu Phe Phe Glu Leu Met Gly

405 410 415

Phe Lys Cys Pro Gln Arg Lys Gly Val Ala Asp Phe Leu Gln Glu Val

420 425 430

Thr Ser Arg Lys Asp Gln Glu Gln Tyr Trp Ala His Lys Asp Gln Pro

435 440 445

Tyr Arg Phe Val Thr Ala Lys Glu Phe Ser Glu Ala His Lys Ser Phe

450 455 460

His Ile Gly Arg Ser Leu Gly Glu Glu Leu Ala Thr Glu Phe Asp Lys

465 470 475 480

Ser Lys Ser His Pro Ala Ala Leu Thr Thr Lys Met Tyr Gly Val Gly

485 490 495

Lys Trp Glu Leu Leu Lys Ala Cys Leu Ser Arg Glu Tyr Leu Leu Met

500 505 510

Lys Arg Asn Ser Phe Val Tyr Thr Phe Lys Leu Cys Gln Leu Ala Val

515 520 525

Leu Ala Ile Ile Ala Met Thr Ile Phe Leu Arg Thr Glu Met His Arg

530 535 540

Asp Ser Val Thr His Gly Gly Ile Tyr Val Gly Ala Leu Phe Tyr Gly

545 550 555 560

Val Val Val Ile Met Phe Asn Gly Leu Ala Glu Leu Ser Met Val Val

565 570 575

Ser Arg Leu Pro Val Phe Tyr Lys Gln Arg Asp Tyr Leu Phe Phe Pro

580 585 590

Ser Trp Val Tyr Ala Leu Pro Ala Trp Ile Leu Lys Ile Pro Leu Thr

595 600 605

Phe Val Glu Val Gly Val Trp Val Phe Leu Thr Tyr Tyr Ala Ile Gly

610 615 620

Phe Asp Pro Tyr Val Gly Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Leu Val Leu Val

625 630 635 640

Leu Val Asn Gln Met Ala Ser Ala Leu Phe Arg Leu Val Ala Ala Val

645 650 655

Gly Arg Glu Met Thr Val Ala Leu Thr Leu Gly Ser Phe Thr Leu Ala

660 665 670

Ile Leu Phe Ala Met Ser Gly Phe Val Leu Ser Lys Glu Asn Ile Lys

675 680 685

Lys Trp Trp Leu Trp Gly Phe Trp Ile Ser Pro Met Met Tyr Gly Gln

690 695 700

Asn Ala Met Val Asn Asn Glu Phe Leu Gly Lys Arg Trp Arg His Phe

705 710 715 720

Leu Pro Asn Ser Thr Glu Ala Leu Gly Val Glu Ile Leu Lys Ser Arg

725 730 735

Gly Phe Phe Thr Gln Ser Tyr Trp Tyr Trp Ile Gly Val Gly Ala Leu

740 745 750

Ile Gly Tyr Thr Leu Leu Phe Asn Phe Gly Tyr Ile Leu Ala Leu Thr

755 760 765

Tyr Leu Asn Pro Leu Gly Lys His Gln Ala Val Ile Ser Glu Glu Pro

770 775 780

Gln Ile Asn Asp Gln Ser Gly Asp Ser Lys Lys Gly Thr Asn Val Leu

785 790 795 800

Lys Asn Ile Gln Arg Ser Phe Ser Gln His Ser Asn Arg Val Arg Asn

805 810 815

Gly Lys Ser Leu Ser Gly Ser Thr Ser Pro Glu Thr Asn His Asn Arg

820 825 830

Thr Arg Gly Met Ile Leu Pro Ser Glu Pro His Ser Ile Thr Phe Asp

835 840 845

Asp Val Thr Tyr Ser Val Asp Met Pro Val Glu Met Arg Asn Arg Gly

850 855 860

Val Val Glu Asp Lys Leu Ala Leu Leu Lys Gly Val Ser Gly Ala Phe

865 870 875 880

Arg Pro Gly Val Leu Thr Ala Leu Met Gly Val Thr Gly Ala Gly Lys

885 890 895

Thr Thr Leu Met Asp Val Leu Ala Gly Arg Lys Thr Gly Gly Tyr Ile

900 905 910

Gly Gly Asn Ile Thr Ile Ser Gly Tyr Pro Lys Lys Gln Glu Thr Phe

915 920 925

Ala Arg Ile Ser Gly Tyr Cys Glu Gln Asn Asp Ile His Ser Pro His

930 935 940

Val Thr Val Tyr Glu Ser Leu Leu Tyr Ser Ala Trp Leu Arg Leu Ser

945 950 955 960

Pro Glu Ile Asn Ala Asp Thr Arg Lys Met Phe Ile Glu Glu Val Met

965 970 975

Glu Leu Val Glu Leu Lys Ala Leu Arg Asn Ala Leu Val Gly Leu Pro

980 985 990

Gly Ile Asn Gly Leu Ser Thr Glu Gln Arg Lys Arg Leu Thr Ile Ala

995 1000 1005

Val Glu Leu Val Ala Asn Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Pro

1010 1015 1020

Thr Ser Gly Leu Asp Ala Arg Ala Ala Ala Ile Val Met Arg Thr

1025 1030 1035

Val Arg Asn Thr Val Asp Thr Gly Arg Thr Val Val Cys Thr Ile

1040 1045 1050

His Gln Pro Ser Ile Asp Ile Phe Glu Ser Phe Asp Glu Leu Leu

1055 1060 1065

Leu Met Lys Gln Gly Gly Gln Glu Ile Tyr Val Gly Pro Leu Gly

1070 1075 1080

His His Ser Ser His Leu Ile Asn Tyr Phe Glu Gly Ile Gln Gly

1085 1090 1095

Val Asn Lys Ile Lys Asp Gly Tyr Asn Pro Ala Thr Trp Met Leu

1100 1105 1110

Glu Val Ser Thr Ser Ala Lys Glu Met Glu Leu Gly Ile Asp Phe

1115 1120 1125

Ala Glu Val Tyr Lys Asn Ser Glu Leu Tyr Arg Arg Asn Lys Ala

1130 1135 1140

Leu Ile Lys Glu Leu Ser Thr Pro Ala Pro Gly Ser Lys Asp Leu

1145 1150 1155

Tyr Phe Pro Ser Gln Tyr Ser Thr Ser Phe Leu Thr Gln Cys Met

1160 1165 1170

Ala Cys Leu Trp Lys Gln His Trp Ser Tyr Trp Arg Asn Pro Leu

1175 1180 1185

Tyr Thr Ala Ile Arg Phe Leu Tyr Ser Thr Ala Val Ala Ala Val

1190 1195 1200

Leu Gly Ser Met Phe Trp Asp Leu Gly Ser Lys Ile Asp Lys Gln

1205 1210 1215

Gln Asp Leu Phe Asn Ala Met Gly Ser Met Tyr Ala Ala Val Leu

1220 1225 1230

Leu Ile Gly Ile Lys Asn Ala Asn Ala Val Gln Pro Val Val Ala

1235 1240 1245

Val Glu Arg Thr Val Phe Tyr Arg Glu Lys Ala Ala Gly Met Tyr

1250 1255 1260

Ser Ala Leu Pro Tyr Ala Phe Ala Gln Val Leu Ile Glu Leu Pro

1265 1270 1275

Tyr Val Leu Val Gln Ala Val Val Tyr Gly Ile Ile Ile Tyr Ala

1280 1285 1290

Met Ile Gly Phe Glu Trp Thr Val Thr Lys Val Phe Trp Tyr Leu

1295 1300 1305

Phe Phe Met Tyr Phe Thr Phe Leu Thr Phe Thr Tyr Tyr Gly Met

1310 1315 1320

Met Ser Val Ala Val Thr Pro Asn Gln His Ile Ser Ser Ile Val

1325 1330 1335

Ser Ser Ala Phe Tyr Ala Val Trp Asn Leu Phe Ser Gly Phe Ile

1340 1345 1350

Val Pro Arg Pro Arg Ile Pro Val Trp Trp Arg Trp Tyr Ser Trp

1355 1360 1365

Ala Asn Pro Val Ala Trp Ser Leu Tyr Gly Leu Val Ala Ser Gln

1370 1375 1380

Tyr Gly Asp Ile Lys Gln Ser Met Glu Ser Ser Asp Gly Arg Thr

1385 1390 1395

Thr Val Glu Gly Phe Val Arg Ser Tyr Phe Gly Phe Lys His Asp

1400 1405 1410

Phe Leu Gly Val Val Ala Ala Val Ile Val Ala Phe Pro Val Val

1415 1420 1425

Phe Ala Leu Val Phe Ala Ile Ser Val Lys Met Phe Asn Phe Gln

1430 1435 1440

Arg Arg

　　1445

Claims

1.蛋白质在提高大豆耐盐性中的应用；所述蛋白质为如下A1）或A2）：

A1）氨基酸序列为序列2的蛋白质；

A2）在A1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在提高大豆耐盐性中的应用；所述生物材料为下述B1）至B14）中的任一种：

B1）编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B9）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10）含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织；

B12）含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B13）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官；

B14）含有B2）所述表达盒的转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）：

b1）编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b2）与b1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1中所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料在培育耐盐性增强大豆中的应用。

5.一种培育耐盐性提高大豆的方法，包括：提高目的大豆中权利要求1中所述蛋白质的含量，或，促进权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达，得到与所述目的大豆相比耐盐增强的耐盐大豆。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述耐盐大豆为通过向所述目的大豆中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因得到的与所述目的大豆相比所述蛋白质表达升高的转基因大豆。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求1中所述蛋白质的编码基因为权利要求3中B1）所述核酸分子。