CN106674339B

CN106674339B - 蛋白质在调控植物抗逆性中的应用

Info

Publication number: CN106674339B
Application number: CN201510757191.0A
Authority: CN
Inventors: 沈世华; 彭献军; 王琪
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Zhongke chuanggou (Beijing) Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2035-11-09
Also published as: CN106674339A

Abstract

本发明公开了蛋白质在调控植物抗逆性中的应用。本发明所提供的应用中，蛋白质为如下A1)或A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的抗低温相关蛋白基因的转录水平受逆境的诱导，抗低温相关蛋白及其编码基因可以提高植物对低温的耐受性，可以用于培育抗逆性提高的麻风树及其他植物新品种，也可以用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

蛋白质在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中蛋白质在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

植物的生长和发育与植物的生存环境息息相关，其生长、发育过程无时无刻不受到外界环境的影响。非生物胁迫指对植物产生伤害的各种环境因素，包括低温胁迫、干旱胁迫、盐碱胁迫等。各种逆境会打破植物正常的生理过程，通过改变植物的细胞膜结构、光合系统及代谢途径等对植物造成伤害，进而影响植物的生长发育和产量。

植物在长期进化过程中，形成了对逆境应答的完整机制。植物对逆境响应的基因可分为两大类：一类为调控基因，如编码产生蛋白激酶，转录因子及一些钙调蛋白等的基因。这些基因处于信号通路的上游，通过调控下游基因的表达来发挥作用。另一类为效应基因，处在信号通路的下游，通过编码产生一些渗透调节物质及分子伴侣蛋白等效应分子快速对逆境作出应答。基因表达在转录水平上的调控是基因表达调控中最普遍也是研究得最为深入的调控过程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性，尤其是如何调控植物的抗低温性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗低温相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用。

本发明所提供的抗低温相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中，所述抗低温相关蛋白的名称为LTRRP，是如下A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；

A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，序列1由166个氨基酸组成。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签

残基

序列

Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的LTRRP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的LTRRP的编码基因可通过将序列表中序列2的第118-618位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

本发明所提供的与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述生物材料，为下述B1)至B14)中的任一种：

B1)编码LTRRP的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B1)所述核酸分子的转基因动物组织；

B12)含有B2)所述表达盒的转基因动物组织；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因动物器官；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因动物器官。

上述与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的基因：

b1)核苷酸序列是序列表中序列2的第118-618位的cDNA分子或DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b3)与b1)或b2)或限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码LTRRP的cDNA分子或基因组DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码LTRRP的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列2由902个核苷酸组成，序列2的第118-618位所示的DNA分子编码序列1所示的LTRRP。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码LTRRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的LTRRP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码LTRRP且具有LTRRP功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码LTRRP所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，B2)所述的含有编码LTRRP的核酸分子的表达盒(LTRRP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达LTRRP的DNA，该DNA不但可包括启动LTRRP基因转录的启动子，还可包括终止LTRRP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述LTRRP基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、

pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCAMBIA1302或p3301-121。

上述与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述农杆菌可为农杆菌EHA105。

上述与LTRRP相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

LTRRP的编码基因可通过含有LTRRP的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌EHA105中得到重组微生物。在本发明的一个实施方式中，所述重组载体为将pCAMBIA1302的NcoI和BglⅡ识别序列间的DNA片段替换为序列2的第118-618位所示的DNA片段，得到的重组载体。在本发明的另一个实施方式中，所述重组载体为将载体p3301-121的XbaI和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列2的第118-618位所示的DNA片段，得到的重组载体。

为解决上述技术问题，本发明还提供了LTRRP或所述生物材料在培育抗逆性增强植物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗逆性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的一种培育抗逆性增强的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入LTRRP的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗逆性增强。

上述方法中，所述LTRRP的编码基因可为B1)所述核酸分子。

在本发明的实施例中，所述LTRRP的编码基因(即序列2的第118-618位所示的DNA分子)通过含有LTRRP的编码基因表达盒的LTRRP基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述LTRRP的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述LTRRP的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述LTRRP的编码基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述LTRRP的编码基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述LTRRP或所述生物材料。

本发明中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为麻风树、拟南芥、烟草、大豆、黄瓜、番茄、棉花、杨树或苜宿。所述单子叶植物可为小麦、水稻或玉米。

本发明中，所述抗逆性可为抗寒性、抗旱性、抗盐性或抗生物胁迫性。所述抗寒性可为抗低温环境，如-10℃的低温环境。所述抗旱性具体可体现在所述植物在PEG模拟的干旱环境中的抗旱性，如PEG6000模拟的干旱环境。所述抗盐性具体可体现在所述植物在NaCl模拟的高盐环境中的抗盐性，如200mM NaCl水溶液模拟的高盐环境。所述抗逆性还可体现在抗ABA、MeJA模拟的逆境。

实验证明，本发明的LTRRP及其编码基因可以提高植物的抗逆性：将LTRRP编码基因通过转化拟南芥得到的转基因植株经低温处理后能够恢复生长，平均存活率为85％；而转空载体的对照拟南芥幼苗的部分叶片死亡，平均存活率为10％，经低温处理后，转LTRRP基因的拟南芥阳性苗的存活率为转空载体的拟南芥幼苗的8.5倍。实验证明，本发明的LTRRP定位于细胞核中，其转录水平受逆境的诱导，低温处理1小时LTRRP基因的表达达到最大值，之后的表达量逐渐降低；在干旱、ABA、MeJA和高盐诱导下，LTRRP基因的表达也表现出逆境诱导表达的特性，LTRRP基因可以参与麻风树对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。LTRRP及其编码基因对于培育抗逆性提高的麻风树及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。本发明在农业和经济能源作物领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为经低温处理的麻风树幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为3’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3为5’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图4为PCR扩增LTRRP基因全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图5为LTRRP基因在MeJA、ABA、干旱、低温和高盐等胁迫条件下的表达结果。其中，A为低温下LTRRP基因的表达变化，B为茉莉酸甲酯处理下LTRRP基因的表达变化，C为脱落酸处理下LTRRP基因的表达变化，D为PEG6000模拟的干旱环境下LTRRP基因的表达变化，E为NaCl模拟的高盐环境中LTRRP基因的表达变化。

图6为LTRRP基因的亚细胞定位结果。

图7为转LTRRP基因拟南芥的抗低温检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

下述实施例中的载体PMD-18T为Takara公司产品，产品目录号为D103A。

实施例1、麻风树抗低温相关蛋白基因全长cDNA序列的获得

本发明所提供的抗低温相关蛋白基因(简称为LTRRP基因)来源于麻风树(Jatropha curcas)，其序列如序列表中序列2的第118-618位所示，LTRRP基因编码序列1所示的蛋白质LTRRP。

一、LTRRP基因3’端序列的克隆

1、植物材料处理及总RNA的提取

以麻风树幼苗为材料，4℃处理6小时后提取其总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。结果表明，所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28SRNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、LTRRP基因3’端序列的克隆

以上述步骤1提取的经低温处理的麻风树幼苗的总RNA为模板，用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesized Kit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书的要求，反转合成其第一链cDNA。反应体系及反应条件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1μl，Total RNA(≤1μg)2μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)1.0μl，5×Buffer 4.0μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScript RTase(200U/μl)0.5μl，RNase-free distilled water 11μl；65℃5min,42℃45min,70℃15min。将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。

再以获得的第一链cDNA为模板，引物LC1与引物OligodT-adaptor 5′-GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′配对进行PCR扩增；PCR反应体系为：cDNA模板、LC1引物与OligodT-adaptor各1μl，10×Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)2μl，Taq酶0.25μl，ddH₂O 12.25μl；反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃60s，共36个循环；最后72℃延伸10min。LC1引物序列为：5′-GACTTATGAAGATGGCTGGTGCAGTTCG-3′。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为TRANS2000 DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为3’RACE PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为700bp的目的片段。回收并纯化3’RACE产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，得到含有序列2的第191-902位所示DNA片段的重组载体，序列2的第191-902位所示DNA片段为LTRRP基因的3’端序列。

二、LTRRP基因5’端序列的克隆

根据上述步骤一获得的LTRRP基因3’端cDNA序列设计引物：R:5′-CCAGCAACAAGCTCTGGGACCTCATC-3′，以步骤一提取的经低温处理的麻风树幼苗的总RNA为模板，采用Promega公司的5’RACE试剂盒并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。反应体系及条件如下：1μl RNA，1μl 5'-CDS primer A，1μl SMART II Aoligo，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl MMLV ReverseTranscriptase，2μl 5X First-StrandBuffer，2μl sterile H₂O；70℃2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃7min。

以获得的第一链cDNA为模板，引物R与引物UPM(Promega公司：Long(0.4μM):5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，Short(2μM):5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3')配对进行PCR扩增；PCR反应体系为：1μl 50X Advantage 2Polymerase Mix，34.5μl PCR-Grade Water，5μl 10X Advantage 2 PCR Buffer，1μl dNTPMix(10mM)，1μl 50X Advantage 2 Polymerase Mix，5μlUPM，1μl引物R，2.5μlcDNA模板；反应条件为：先94℃30s，然后68℃30s，70℃60s，共40个循环；最后70℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。其中，泳道M为TRANS2000 DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为5’RACE PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为500bp的目的片段。回收并纯化5’RACE产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，得到含有序列2的第1-557位所示DNA片段的重组载体，序列2的第1-557位所示DNA片段为LTRRP基因的5’端序列。

三、LTRRP基因全长cDNA序列的获得及PCR检测

利用上述步骤一和步骤二获得的长度为712bp和557bp片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的LTRRP基因的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由902个碱基组成，自5’端第118-618位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质(即LTRRP)。序列表中序列1由189个氨基酸残基组成。根据LTRRP基因全长cDNA序列设计如下引物：

引物1：5′-GCAAATAAAGGGCATCCAGAGCGCCGCTTGAGA-3′,

引物2：5′-TGAGAGCAAGATCCAACAATGTTATATGCTG-3′。

以上述步骤一提取的经低温处理的麻风树幼苗的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。其中，泳道M为TRANS2000 DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物。结果表明，经PCR扩增获得了长度约为900bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物序列如序列2所示，表明成功克隆到LTRRP基因的全长cDNA。

利用DNAMAN和OMIGA软件对LTRRP基因的全长cDNA序列进行生物信息学分析，该序列全长902bp(序列2)，自5’端第118位-第618位为ORF(即LTRRP基因)，编码由166个氨基酸残基(序列1)组成的蛋白质LTRRP。

实施例2、LTRRP基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

对麻风树分别进行低温、干旱、高盐、脱落酸及茉莉酸甲酯的胁迫处理，分析LTRRP基因在非生物胁迫下的表达情况。

将麻风树的种子种在培养基中，生长至8周后，对幼苗分别进行低温、高盐、干旱、脱落酸和茉莉酸甲酯处理，具体方法如下：

低温处理：将麻风树幼苗置于4℃培养箱中，分别在培养0、1、3、6、12和24小时后取样。

高盐处理：将麻风树幼苗的根系置于200mM NaCl水溶液中，分别在培养0、1、3、6、12和24小时后取样。

干旱处理：将麻风幼苗的根系置于20％(质量百分比浓度)PEG6000水溶液中，分别在培养0、1、3、6、12和24小时后取样。

脱落酸处理：将麻风幼苗的根系置于100μM ABA水溶液中，分别在培养0、1、3、6、12和24小时后取样。

茉莉酸甲酯处理：将麻风树幼苗的根系置于10％(质量百分比浓度)MeJA水溶液中，分别在培养0、1、3、6、12和24小时后取样。

分别提取上述不同处理的麻风树幼苗的总RNA，定量PCR方法分析LTRRP基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式。

用麻风树Actin基因作为反应的内参，Actin基因的引物为：

Actin-Up5′-CCACTAAGCCCTAAAGCCAAC-3′，

Actin-Down5′-CACCATCACCAGAATCCAGCAC-3′。

根据LTRRP基因的cDNA序列设计其特异性引物，引物如下：

Q1：5′-AGCAGATACAGAAGCAGGCACC-3′

Q2：5′-TTCCTTAGGAGCAGCATTACCCTCCT-3′。

反应体系为：SYBR Green Mix 10μL，Q1 0.4μL，Q20.4μL，dd H2O7.2μL，cDNA模板2μL(将反转录产物稀释10倍后作为模板)总体积：20μL。实时定量PCR反应采用两步法完成，其反应程序为：95℃60s；95℃15s,65℃45s；40个循环。所得数据及Ct值的分析用Mx3000p软件进行。

结果如图5所示。结果表明，LTRRP基因的转录水平明显受低温胁迫的诱导，在处理1小时LTRRP基因的表达达到最大值，之后的表达量逐渐降低；在干旱、ABA、MeJA和高盐诱导下，LTRRP基因的表达量增加缓慢，但是也表现出诱导表达的特性。

实施例3、LTRRP的亚细胞定位

将载体pCAMBIA1302(北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司)的NcoI和BglⅡ识别序列间的DNA片段替换为序列2的第118-618位所示的DNA片段(即LTRRP基因)，保持其他序列不变，将得到的重组表达载体命名为p1302-LTRRP。p1302-LTRRP表达LTRRP与GFP的融合蛋白。

将p1302-LTRRP导入农杆菌(EHA105)，得到重组菌EHA105-p1302-LTRRP。将载体pCAMBIA1302导入农杆菌(EHA105)，得到重组菌EHA105-p1302。

按照沾花浸染法(Clough SJ,Bent AF(1998)Floral dip:a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJournal 16:735-743.)，利用重组菌EHA105-p1302-LTRRP转化哥伦比亚型拟南芥，得到转LTRRP基因的拟南芥。按照沾花浸染法，利用重组菌EHA105-p1302转化哥伦比亚型拟南芥，得到转空载体的拟南芥。

分别在筛选培养基(筛选培养基为向MS培养基中加入潮霉素得到的潮霉素浓度为30mg/L的固体培养基)上对上述转LTRRP基因的拟南芥的T1代种子和转空载体的拟南芥的T1代种子进行筛选。所有的转空载体的拟南芥幼苗都白化严重，根无法伸长，植株无法正常生长。而转LTRRP基因的拟南芥阳性幼苗能变绿，有较长的根，可以在筛选培养基上正常生长。

利用实施例2步骤三中的引物1和引物2在基因组水平上对上述转LTRRP基因的拟南芥阳性苗进行鉴定，结果表明，转LTRRP基因的拟南芥阳性苗均含有LTRRP基因。

将阳性植株在激光共聚焦扫描显微镜(Bio-Rad MRC 1024)下观察并照相，结果如图6所示。其中，图6中A和D为转LTRRP基因的拟南芥植株细胞在荧光通道下的形态，图6中B和E为明视场下的形态，图6中C和F为两个视场的叠加。从图6中可以看出，转入空载体p1302的细胞中表达的蛋白分布在整个细胞内，如图6中A和C；而转入LTRRP基因的细胞中表达的蛋白则定位于细胞核内，如如图6中D和F。结果表明，LTRRP定位于细胞核内。

实施例4、LTRRP基因可以提高植物对低温的耐受性

将载体p3301-121(Sun J,Peng X,Fan W,Tang M,Liu J,Shen S:Functionalanalysis of BpDREB2 gene involved in salt and drought response from a woodyplant Broussonetia papyrifera.Gene 2013,535(2):140-149.)的XbaI和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列2的第118-618位所示的DNA片段(即LTRRP基因)，保持其他序列不变，将得到的重组表达载体命名为p3301-121-LTRRP。p3301-121-LTRRP表达序列1所示的LTRRP。

将p3301-121-LTRRP导入农杆菌(EHA105)，得到重组菌EHA105-p3301-121-LTRRP。将载体p3301-121导入农杆菌(EHA105)，得到重组菌EHA105-p3301-121。

按照沾花浸染法(Clough SJ,Bent AF(1998)Floral dip:a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJournal 16:735-743.)，利用重组菌EHA105-p3301-121-LTRRP转化哥伦比亚型拟南芥，得到转LTRRP基因的拟南芥。按照沾花浸染法，利用重组菌EHA105-p3301-121转化哥伦比亚型拟南芥，得到转空载体的拟南芥。

分别在草甘膦筛选培养基(该草甘膦筛选培养基为向MS培养基中加入草甘膦得到的草甘膦浓度为10mg/L的固体培养基)上对上述转LTRRP基因的拟南芥的T1代种子和转空载体的拟南芥的T1代种子进行筛选。所有的转空载体的拟南芥幼苗都白化严重，根无法伸长，植株无法正常生长。而转LTRRP基因的拟南芥阳性苗能变绿，有较长的根，可以在草甘膦筛选培养基上正常生长。

利用实施例2步骤三中的引物1和引物2在基因组水平上对上述转LTRRP基因的拟南芥阳性苗进行鉴定，结果表明，转LTRRP基因的拟南芥阳性苗均含有LTRRP基因。利用实施例2中的LTRRP基因的cDNA序列的特异性引物Q1和Q2在RNA水平上鉴定上述转LTRRP基因的拟南芥阳性苗中LTRRP基因的表达，利用Actin基因作为反应的内参，Actin基因的引物为实施例2中的Actin-Up与Actin-Down，利用转空载体的拟南芥作为对照。结果表明，转LTRRP基因的拟南芥阳性苗中LTRRP基因得到了表达。

在幼苗4片真叶时，分别将转LTRRP基因的拟南芥阳性苗与转空载体的拟南芥幼苗分别在-10℃下处理20小时后在23℃下恢复培养3天，实验重复三次，结果显示，转LTRRP基因的拟南芥阳性苗能够恢复生长，平均存活率为85％；而转空载体的拟南芥幼苗的部分叶片死亡(图7)，平均存活率为10％，经低温处理后，转LTRRP基因的拟南芥阳性苗的存活率为转空载体的拟南芥幼苗的8.5倍，说明LTRRP基因可以提高植物对低温的耐受性。

Claims

1.蛋白质在调控双子叶植物抗寒性中的应用；所述蛋白质为氨基酸序列为序列1的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为麻风树或拟南芥。

3.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在调控双子叶植物抗寒性中的应用；

所述生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：

b2)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为麻风树或拟南芥。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求3或4所述生物材料在培育抗寒性增强双子叶植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为麻风树或拟南芥。

8.一种培育抗寒性增强的转基因双子叶植物的方法，包括向受体植物中导入蛋白质的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗寒性增强；所述蛋白质为基酸序列为序列1的蛋白质。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下b1)或b2)所示的基因：

b2)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为麻风树或拟南芥。