CN110747196A

CN110747196A - 一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子及其应用

Info

Publication number: CN110747196A
Application number: CN201910982284.1A
Authority: CN
Inventors: 陶彦彬; 徐增富; 王静娴; 明新
Original assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Current assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2019-10-16
Publication date: 2020-02-04

Abstract

本发明提供了一种在植物花中驱使基因表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子及其应用，属于转基因植物和植物基因编辑技术领域。在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了一种含所述JcTM6基因启动子的重组载体。基于JcTM6基因启动子的活性强且具有在花中特异性表达的特点，本发明提供了组织特异性启动子JcTM6基因启动子、重组载体或所述引物在构建转基因植物或植物花、果实和种子性状改良中的应用。同时JcTM6基因启动子可作为花特异性启动子驱使功能基因表达，用于改良小桐子繁殖器官性状，实现种子产量的提高。

Description

一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于转基因植物和植物基因编辑技术领域，具体涉及一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子及其应用。

背景技术

小桐子(Jatropha curcas.L)是大戟科麻疯树属的多年生木本植物，具有较强的抗旱能力，能在十分贫瘠的荒地生长，种子直播或枝条扦插均可繁殖。作为油料植物，小桐子种子含油量约达30％～40％。过去很长一段时间小桐子油作为灯油用于照明需求；经过改良加工后，现已制成生物柴油和航空燃油予以应用，因而多个国家将小桐子作为一种能源植物进行大规模种植。虽然小桐子具有各种优良特性，但小桐子营养生长旺盛，且雌花少，导致种子产量低，限制了其作为能源植物的发展前景，因而必须通过各种途径对小桐子的花性状进行优化改良从而提高小桐子的产量以满足生产的需求。

小桐子的遗传多样性低，通过传统育种途径很难大幅度提高产量。而目前，植物转基因技术在作物农艺性状改良方面应用得十分广泛。这一技术得以应用的先决条件就是建立一个稳定的植物遗传转化体系，而小桐子的遗传转化体系已日趋稳定(Joshi M,et al.,Efficient genetic transformation of Jatropha curcas L.by microprojectilebombardment using embryo axes.Ind Crop Prod,2011,33(1):67-77；Kumar N,et al.,Stable genetic transformation of Jatropha curcas via Agrobacteriumtumefaciens-mediated gene transfer using leaf explants.Ind Crop Prod,2010,32(1):41-47；Pan J,et al.,Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation ofbiofuel plant Jatropha curcas using kanamycin selection.Afr J Biotechnol,2010,9(39):6477-6481；Fu Q,et al.,An efficient protocol for Agrobacterium-mediated transformation ofthe biofuel plant Jatropha curcas by optimizingkanamycin concentration and duration of delayed selection.Plant BiotechnologyReports,2015,9(6):405-416)，因此通过转基因育种对小桐子性状进行改良是一个行之有效的途径。除了稳定的遗传转化体系，功能基因能否在小桐子体内精准表达对于育种的成败也是至关重要的。

启动子是位于基因上游直接调控功能基因的表达的一段DNA序列，包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。其中组织特异性启动子可使功能基因在特定的组织部位或发育阶段表达，可对植物的性状进行定向改良，因而人们对组织特异性启动子的研究越来越多，以满足植物基因工程实用化的需要。目前，已报道的用于小桐子遗传转化的组织特异性启动子仅有在种子中表达的7S启动子和JcSDP1启动子(Qu J et al.，Development ofmarker-free transgenic Jatropha plants with increased levelsofseed oleic acid.Biotechnol Biofuels,2012,5:10；Kim MJ et al.,Gene silencingof Sugar-dependent 1(JcSDP1),encoding a patatin-domain triacylglycerollipase,enhances seed oil accumulation in Jatropha curcas.Biotechnol Biofuels,2014,7:36)，这对小桐子转基因育种是远远不够的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种来源于小桐子的新型组织特异性启动子--JcTM6基因启动子，在花中具有较高的表达活性，用于驱使功能基因改良小桐子花性状，用于转基因植物或提高小桐子种子的产量。

本发明提供了一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子，所述JcTM6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了一种含所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的重组载体。

优选的，所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子插入在基础载体的XbaI/BamHI多克隆位点处。

优选的，所述重组载体还包括目标功能基因；所述目标功能基因位于所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的3'端。

本发明提供了一组用于扩增所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

本发明提供了所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、所述重组载体或所述引物在构建转基因植物和/或植物基因编辑中的应用。

优选的，所述转基因植物包括转基因小桐子和转基因拟南芥。

本发明提供了所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、所述重组载体或所述引物在植物花、果实和种子性状改良中的应用。

本发明提供了所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、所述重组载体或所述引物在提高小桐子种子产量中的应用。

本发明提供了一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子，所述JcTM6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子来源于植物小桐子，采用实时荧光定量PCR测定JcTM6基因在小桐子中的表达情况，结果发现JcTM6主要在小桐子的雌花和雄花中表达，且雄花中的表达量是雌花中的3倍，而其它的组织部位除了花序芽和果皮(42DAP)有少量表达外，几乎都没有表达，由此可得到JcTM6基因是花特异性表达的基因。为了验证JcTM6的活性，从转基因小桐子的5个株系取根、茎、幼叶、成熟叶、茎尖、花序芽、雌花、雄花、授粉后12天的果实、授粉后25天的果皮和种子进行β-glucuronidase(GUS)荧光活性定量检测，结果表明，雌花中的GUS活性非常高，在其它组织部位中仅在花序芽、雄花、授粉后12天的果实和授粉后25天的种子里有少量表达；对不同发育时期的雌花进行GUS活性检测结果表明，在雌花发育过程中GUS染色都十分明显，说明JcTM6启动子是一个在小桐子雌花中高表达的启动子；另外，通过对转基因拟南芥进行GUS染色，仅在发育后期的花中检测到GUS活性，说明JcTM6启动子是一个在拟南芥花中特异性表达的启动子。

本发明提供了所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、所述重组载体或所述引物在构建转基因植物或植物花性状改良中的应用。所述启动子JcTM6基因启动子作为花特异性启动子驱使功能基因改良小桐子花性状从而提高种子产量。所述启动子的分离克隆为小桐子基因工程育种奠定了一定的基础。

附图说明

图1为JcTM6基因启动子在小桐子中的表达谱分析结果，其中根(R)、茎(S)、幼叶(YL)、成熟叶(ML)、花序芽(If)、雌花(FF)、雄花(MF)、授粉后42天的果皮(Pp 42d)、种子(Sd42d)、雄花的萼片(MS)、花瓣(MP)和雄蕊(St)，雌花的萼片(FS)、花瓣(FP)和雌蕊(Pi)；

图2为JcTM6启动子序列及其表达载体构建，其中图2-A为JcTM6启动子的核苷酸序列及顺式调控元件的位置，起始密码子ATG(粗体加框)的A作为+1；序列上的顺式调控元件以粗体加下划线为标识；图2-B为JcTM6:GUS表达载体的T-DNA示意图；

图3为JcTM6:GUS转基因拟南芥的GUS染色结果，图3-A:花序芽GUS染色结果，图3-B:为花GUS染色结果，花器官包括萼片(Se)、花瓣(Pe)和雄蕊(St)；

图4为JcTM6:GUS转基因小桐子的GUS染色结果，器官包括根(R)、茎(St)、幼叶(YL)、成熟叶(ML)、茎尖(SA)、花序芽(If)、雌花(FF)、雄花(MF)、授粉后12天的果实(Ft)和授粉后25天的种子(Sd)；

图5为JcTM6:GUS转基因小桐子各个组织部位的GUS荧光活性定量检测结果；根(R)、茎(St)、幼叶(YL)、成熟叶(ML)、茎尖(SA)、花序芽(IF)、雌花(FF)、雄花(MF)、授粉后12天的果实(Ft)、授粉后25天的果皮(Pp)和种子(Sd)；

图6为JcTM6:GUS转基因小桐子雌花的GUS染色结果，左：发育早期的雌花，中：发育中期的雌花，右：发育成熟的雌花，花器官包括萼片(Se)、花瓣(Pe)、柱头(Sa)、子房(Oy)、胚珠(Oe)和蜜腺(Ne)；

图7为用JcTM6基因启动子驱动细胞分裂素合成酶基因Arabidopsis ATP/ADPisopentenyltransferase 4(AtIPT4)基因在拟南芥中表达的表型图，图7-A为野生型(WT)和JcTM6pro:AtIPT4转基因植株，图7-B为野生型(WT)和JcTM6pro:AtIPT4转基因植株的花。

具体实施方式

本发明提供了一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子，所述JcTM6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。JcTM6基因启动子的长度为1820bp。本发明从小桐子中克隆了一个组织特异性的启动子TOMATO MADS BOX GENE6(TM6)基因启动子。TM6基因属于MADS box家族，是花器官发育ABC模型中的B类基因，主要参与调控第二轮和第三轮花器官的发育。TM6基因与euAP3基因一同由paleoAP3基因演化而来，但与euAP3基因仅在花瓣和雄蕊中的表达不同，TM6基因还会在雌蕊中表达。所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子主要在花中表达。

对JcTM6基因启动子进行顺式元件分析。分析结果表明，该启动子序列含有两个MADS-box蛋白的DNA结合位点CArGbox，它是MADS-box基因的重要调控元件。另外，该启动子上还含有多个花粉特异表达的元件，包括8个POLLEN1LELAT52 motif(AGAAA)、5个GTGANTG10 motif(GTGA)和1个Q-element(见图2-A)。POLLEN1LELAT52 motif和GTGANTG10motif分别对番茄LAT52基因和烟草g10基因在花粉中的特异性表达十分重要。Q-element能增强ZM13基因在玉米花粉中的特异性表达。

所述JcTM6基因启动子具有较高的启动活性，以GUS基因荧光活性定量检测结果说明，雌花中的GUS活性非常高，在其它组织部位中仅在花序芽、雄花、授粉后12天的果实和授粉后25天的种子里有少量表达。同时通过检测不同发育时期的雌花中GUS活性检测结果表明，在雌花发育过程中GUS染色都十分明显，说明JcTM6基因启动子的启动功能基因表达的功能不受雌花发育阶段的限制，是一个理想的转基因领域的组织特异性启动子。本发明对所述JcTM6基因启动子的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的常见方法获得，例如根据所述JcTM6基因启动子的核苷酸序列人工合成或者通过常规PCR扩增方法获得。

本发明提供了一组用于扩增所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12(5'-tgctctagaaatagctataaaatcaatt-3')所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13(5'-cgcggatccttttcctttcttcttgata-3')所示。所述引物能特异性扩增JcTM6基因启动子。所述PCR扩增方法的扩增体系：2μl 10×HiFi Taq酶缓冲液，1μl 10mM dNTP，10mM上下游引物各0.5μl，10ng基因组DNA，1U HiFi Taq酶，ddH₂O补至20μl；扩增程序优选如下：94℃预变性3min，30个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s)，72℃延伸8min。

本发明提供了一种含所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的重组载体。本发明对所述重组载体所用的基础载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物表达载体即可。所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子优选插入在基础载体的XbaI/BamHI多克隆位点处。所述基础载体优选包括pBI101载体。所述重组载体优选还包括目标功能基因；所述目标功能基因位于所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的3'端。在本发明中，所述重组载体的构建方法优选包括用内切酶XbaI和BamHI酶切含JcTM6基因启动子和pBI101载体，用T4 DNA连接酶(Promega)将切下的JcTM6基因启动子与酶切后的pBI101载体相连，使JcTM6基因启动子插入pBI101载体上的GUS基因之前，从而构建得到JcTM6pro:GUS植物表达载体。

基于在转基因小桐子和拟南芥中，JcTM6基因启动子在花中的表达活性非常高，因此，本发明提供了所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、所述重组载体或所述引物在构建转基因植物和/或植物基因编辑中的应用。在本发明中，所述构建转基因植物的方法优选为将构建重组载体以农杆菌介导转化植物，得到含有JcTM6基因启动子的转基因植物。本发明对转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可，例如可参照现有技术文章(Clough and Bent(1998),Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana，Plant Journal16:735-743.)。本发明对所述转基因植物的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物作为转化对象即可，为了说明JcTM6基因启动子的生物学特性，本发明以构建转基因小桐子和转基因拟南芥为了加以说明，但不应该理解为对本发明保护范围的限制。

基于在转基因小桐子和拟南芥中，JcTM6基因启动子在花中的表达活性非常高。本发明提供了所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、所述重组载体或所述引物在植物花、果实和/或种子性状改良中的应用。在所述应用中，将JcTM6基因启动子转入到用于改良植物花性状的功能基因的5'端，用于启动功能基因的高效转录。本发明对所述改良植物花性状的功能基因的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的改良植物花性状的功能基因的种类即可，例如包括细胞分裂素合成酶基因isopentenyltransferase(IPT)基因和LONELYGUY(LOG)基因。本发明对所述植物花性状改良的具体方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的操作方案即可。

基于在转基因小桐子中，JcTM6基因启动子在雌花中的表达活性非常高，在花序芽、雄花、果和种子里仅有少量表达。因此，JcTM6基因启动子可作为雌花特异性启动子驱使功能基因改良小桐子花性状从而提高种子产量。因此，本发明提供了所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、所述重组载体或所述引物在提高小桐子种子产量中的应用。在所述应用中，将JcTM6基因启动子转入到用于提高种子产量的功能基因的5'端，用于启动功能基因的高效转录。本发明对所述提高种子产量的功能基因的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的提高种子产量的功能基因的种类即可，例如包括细胞分裂素合成酶基因IPT基因和LOG基因。本发明对所述植物花性状改良的具体方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的操作方案即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实例中所用药品和试剂均可通过市售购买获得。

本发明实例中所用的植物材料，拟南芥(Col-0生态型)和小桐子均来源于中国科学院西双版纳热带植物园。

实施例1

JcTM6基因在小桐子中的表达

1、小桐子RNA的提取

在2ml离心管中加入400μl RNA提取液和100μlβ-巯基乙醇，充分混匀；取小桐子新鲜材料，液氮研磨至粉状，装100mg粉末至上述2ml离心管中，充分混匀，然后加入300μl的水饱和酚，振荡混匀；室温放置5min后，加入300μl氯仿/异戊醇(24:1)和200μl 3M NaAc(pH4.0)溶液，振荡混匀；4℃，12000rpm离心10min；取上清至1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀后，4℃，12000rpm离心10min；小心吸取上层水相至1.5ml离心管中，加入200μl无水乙醇和25μl硅胶，充分混匀，室温放置5min后，室温，12000rpm离心30s；倒去液体，用75％乙醇漂洗硅胶两次；硅胶经真空干燥后加50μl DEPC处理的去离子水(ddH₂O)充分悬浮硅胶；室温，12000rpm离心10min，小心吸取上清至新的离心管中，-80℃保存备用。

2、cDNA第一链的合成

使用含gDNAEraser的RT reagent试剂盒(TAKARA)，按照试剂盒说明书进行操作。于离心管中依次加入2μl 5×gDNAEraser Buffer、1μl gDNAEraser和1μg制备好的RNA，补RNase dH₂O至10μl，混匀后于42℃温育2min；将温育后的离心管放置冰上，然后依次向离心管中加入4μl 5×PrimeScript Buffer、1μl PrimeScript RT Enzyme、1μlRT Primer Mix和4μl RNase Free ddH₂O，反应总体积20μl，混匀后于37℃温育15min；然后于85℃放置5s即完成反应，合成的cDNA于-20℃保存。

3、实时荧光定量PCR

通过实时荧光定量PCR检测JcTM6基因在小桐子中的表达。采用PremixEx Taq^TMII试剂盒(TAKARA)，按照试剂盒说明书进行操作。扩增体系：1μl cDNA，0.5μl上游引物(10μM)，0.5μl下游引物(10μM)，10μl

Premix Ex Taq^TMII，加去离子水至反应总体积为20μl。扩增程序：95℃预变性5s；95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s，42个循环。JcTM6基因上游引物为5'tatctcttcggttttgtagtagtggg 3'(SEQ ID NO.2)，下游引物为5'tctcttggaataagtaacctgtctgt 3'(SEQ ID NO.3)。用小桐子GAPDH基因作为内参基因，其上游引物为5'gctgctaaggctgttgggaa 3'(SEQ ID NO.4)，下游引物为5'gacatagcccaatattcccttcag 3'(SEQ ID NO.5)。

荧光定量PCR结果显示(图1)，JcTM6基因主要在小桐子的雌花和雄花中表达，且雄花中的表达量是雌花中的3倍，而其它的组织部位除了花序芽和果皮(42DAP)有少量表达外，几乎都没有表达，由此可推断JcTM6基因是花特异性表达基因。接着对这该基因在各个花器官中的表达进行检测。结果显示，在雄花中，JcTM6基因主要在花瓣和雄蕊中表达，是萼片中表达量的20多倍。在雌花中，JcTM6基因在花瓣中的表达最高，在雌蕊中也有一定的表达，在萼片中的表达量非常低。

实施例2

JcTM6基因启动子的克隆

1、小桐子基因组DNA的提取

取0.1g新鲜植物材料用液氮研磨成粉置于1.5ml离心管中，立即加入500μl 65℃预热的2×CTAB提取液，混匀后65℃水浴30min，其间翻转离心管2-3次使材料充分裂解；水浴后，4℃，12000rpm离心15min；吸取上清液置于新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀后，4℃，12000rpm离心10min；取上清液置于新的离心管，然后加入1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)溶液和等体积的异丙醇，混匀后若出现絮状物则进入下一步操作，若暂无絮状沉淀出现可将混合物于-20℃沉淀1h；沉淀后，10000rpm离心10min；去上清，加入200μl 70％乙醇漂洗沉淀两次，8000rpm离心5min；去上清，沉淀经过真空干燥后加入TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

2、Genome Walking扩增JcTM6基因5'上游序列

基因组DNA酶切：分别用5种平末端内切酶DraI、EcoRV、HpaI、PvuII、StuI酶切基因组DNA，于1.5ml离心管内加入2μg基因组DNA，10μl 10×内切酶缓冲液和80units内切酶，加ddH₂O至反应总体积100μl，37℃酶切过夜；

酶切产物的纯化：用等体积的酚和氯仿分步抽提上述5个酶切产物，然后加入预冷的两倍体积的95％乙醇、1/10体积的3M NaAc(pH 4.5)溶液和20μg glycogen进行沉淀，用预冷的80％乙醇漂洗沉淀，待沉淀干燥后溶于20μl TE中；

接头的制备：将接头长链5'gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtcgacggcccgggctggt 3'(SEQ ID NO.6)和短链5'PO₄-accagccc-NH23'(SEQ ID NO.7)分别溶于75mM Tris-HCl(pH 8.8)，配成100μM，等体积混合两引物使其各自的终浓度都为25μM，再将混合引物放置于装有500ml水(95℃)的烧杯中，5min后停止加热烧杯中的水，使其自然冷却至室温，制备好的接头-20℃保存；

酶切产物与接头连接：连接反应体系包括4μl已纯化的酶切产物、1.9μl接头、1μl10×连接缓冲液和0.5μl T4 DNA连接酶，16℃连接过夜，然后于70℃加热5min以终止反应，每个连接产物加入72μl TE，制备好的5个酶切库即为基因步移PCR扩增的模板，-20℃保存；

基因步移PCR扩增：

第一轮扩增，扩增体系：1μl链接产物，5μl 10×LATaq酶缓冲液，1μl10mM dNTP，1μl 10μMAP15'gtaatacgactcactatagggc 3'(SEQ ID NO.8)，1μl10μM GSP15'ctcttggaataagtaacctgtctgttgg 3'(SEQ ID NO.9)，5U LATaq酶，ddH₂O补至50μl；扩增程序：7cycles(94℃25s,70℃3min)，32个循环(94℃25s,65℃3min)，65℃7min，扩增结束。

第二轮扩增，扩增体系：1μl模版(第一轮扩增产物稀释50倍)，5μl 10×LATaq酶缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μMAP25'actatagggcacgcgtggt3'(SEQ ID NO.10)，1μl 10μMGSP25'caaaacccactactacaaaaccgaaga 3'(SEQ ID NO.11)，5U LA Taq酶，ddH₂O补至50μl；扩增程序：5个循环(94℃25s,70℃ 3min)，20个循环(94℃25s,65℃3min)，65℃7min，扩增结束。

3、JcTM6基因启动子的扩增

经过两次基因步移后，将通过扩增获得的扩增序列进行拼接，以拼接序列为模板设计引物进行扩增，上游引物为5'tgctctagaaatagctataaaatcaatt 3'(SEQ ID NO.12)，下游引物为5'cgcggatccttttcctttcttcttgata 3'(SEQ ID NO.13)。扩增体系：2μl 10×HiFiTaq酶缓冲液，1μl 10mM dNTP，10mM上下游引物各0.5μl，10ng基因组DNA，1U HiFi Taq酶，ddH₂O补至20μl；扩增程序：预变性94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃延伸8min。将扩增产物进行电泳、凝胶回收，将回收片段连接到pGEM-TEasy载体(Promega)，然后通过热激法将载体转入大肠杆菌，经测序验证后，结果显示扩增的JcTM6基因启动子长为1820bp，如SEQ ID NO.1所示。

实施例3

JcTM6基因启动子序列分析

本发明通过PLACE数据库(Higo K et al.,Plant cis-acting regulatory DNAelements(PLACE)database.Nucleic Acids Res,1999,27:297-300)对JcTM6基因启动子进行顺式元件分析。分析结果表明(图2-A)，该启动子序列含有两个MADS-box蛋白的DNA结合位点CArG box，它是MADS-box基因的重要调控元件。另外，该启动子上还含有多个花粉特异表达的元件，包括8个POLLEN1LELAT52 motif(AGAAA)、5个GTGANTG10 motif(GTGA)和1个Q-element。POLLEN1LELAT52 motif和GTGANTG10 motif分别对番茄LAT52基因和烟草g10基因在花粉中的特异性表达十分重要。Q-element能增强ZM13基因在玉米花粉中的特异性表达。

实施例4

JcTM6pro:GUS植物表达载体的构建及农杆菌转化

本发明用内切酶XbaI和BamHI酶切含JcTM6基因启动子的pGEM-T Easy载体和pBI101载体，然后用T4 DNA连接酶(Promega)将切下的JcTM6基因启动子与酶切后的pBI101载体相连，使JcTM6基因启动子插入pBI101载体上的GUS基因之前，从而构建了JcTM6pro:GUS植物表达载体(图2-B)；接着通过电激法将构建好的植物表达载体转入农杆菌菌株LBA4404。

实施例5

拟南芥的遗传转化及转基因株的获得

转化方法参照Clough and Bent(1998),Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana，Plant Journal16:735-743。

将含有表达载体JcTM6pro:GUS的农杆菌LBA4404于YEB固体培养基(Kan 100mg/l,Str 25mg/l)上划板培养，从平板上挑取农杆菌单菌落接入1ml YEB液体培养基(Kan100mg/l,Str 25mg/l)中，28℃，200rpm振荡培养过夜，次日取上述活化的菌液0.5ml接入50mlYEB液体培养基(Kan 100mg/l,Str 25mg/l)中，28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8～1；将活化后的50ml菌液于4℃，6000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用50ml 5％蔗糖溶液(w/v)悬浮菌体；将AS加入悬浮液至终浓度为150μM，充分混匀后静置1～2h；

将silwet-77加入静置后的悬浮液至终浓度为0.02％(v/v)，充分混匀；将整个花序浸泡到悬浮液中约10～20s(植株浸泡前应先剪去已长出的角果)；避光保湿放置16～24h，然后置于长光照(16-h-light/8-h-dark)下生长，每隔5d转化一次，共转化3次，收取成熟种子。

抗性植株的筛选：将收取的种子用20％漂白水消毒种子20min，短暂离心后弃消毒液，用灭菌水漂洗种子2～3次；加入灭菌的0.1％Agarose适量，悬浮种子，并涂布在1/2MS培养基(Kan 50mg/l)平板上；4℃放置2d，然后于22℃及长光照下生长7d，长出的幼苗为绿色则是抗性苗，移载到土壤中待长大后进行分子检测。

转化株检测：对移栽存活的植株进行PCR检测，能扩增出GUS基因的植株则为转基因植株，而未进行转化的植株以及非转基因植株则不能扩增出GUS基因。

实施例6

JcTM6基因启动子在转基因拟南芥中的活性检测

本发明通过检测GUS活性(参见Jefferson RA,et al.,GUS fusion:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in plants.EMBOJ,1987,6(13):3901-3907)来分析JcTM6基因启动子在转基因拟南芥中的活性。

对转基因拟南芥的各个组织部位进行GUS组织化学染色检测。将根、茎、叶、花序芽、花、角果浸入GUS染色液[50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，0.5mM K₃Fe(CN)₆，0.5mM K₄Fe(CN)₆·3H₂O，0.5％Triton X-100和1mM X-Gluc]中，抽真空30min，于37℃反应过夜，然后将材料置于脱色液中脱色。染色结果显示(图3)，JcTM6启动子在发育后期的花中表达，在前期花芽和花序芽中均没有表达活性。

实施例7

小桐子的遗传转化及转基因株的获得

转化：转化方法参照Fu et al.(2015),An efficient protocol forAgrobacterium-mediated transformation of the biofuel plant Jatropha curcas byoptimizing kanamycin concentration and duration of delayed selection，PlantBiotechnology Reports 9,405-416。

将含有表达载体JcTM6pro:GUS的农杆菌LBA4404于YEB固体培养基(Kan 100mg/l,Str 25mg/l)上划板培养，从平板上挑取农杆菌单菌落接入1ml YEB液体培养基(Kan100mg/l,Str 25mg/l)中，28℃，200rpm振荡培养过夜，次日取上述活化的菌液0.5ml接入50mlYEB液体培养基(Kan 100mg/l,Str 25mg/l)中，28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；将活化后的50ml菌液于4℃下5000rpm离心5min，收集的菌体用50ml MS液体培养基重悬至OD₆₀₀＝0.3～0.5，加入AS至终浓度为50μM，静置1h；选取饱满小桐子种子，剥去种壳后在水中浸泡10小时左右，用75％酒精消毒30s，无菌水漂洗3次，然后用10％次氯酸钠溶液(加入4-5滴Tween-20)消毒20min，期间摇动2～3次，无菌水漂洗4次；剥出种子胚后，切除胚轴端约1/4长度的子叶，剩余子叶部分则作为转化外植体浸入农杆菌悬浮液中，28℃，150rpm振荡培养20min；将浸染过的子叶置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，接着将子叶接种于共培养基(MS-Jc1+100μMAS)中，暗培养2天；

恢复培养：暗培养后的子叶用无菌水(含Timentin 100mg/l+头孢霉素300mg/l)漂洗4～5次，于滤纸上吸去液体，然后接种在不含筛选剂的恢复培养基(MS-Jc1+Timentin100mg/l+头孢霉素300mg/l)中培养10天；

筛选培养：将恢复培养后的子叶转接至筛选培养基(MS-Jc1+Kan 40mg/l+Timentin 100mg/l+头孢霉素300mg/l)上进行抗性筛选培养，三周继代一次；

生根培养：将再生的小芽(1.5～2cm)从愈伤上切下转接至生根培养基上生长；

转化株检测：待植株在生根培养基上长出1～3条根则将其移栽至土壤；对移栽存活的植株进行PCR检测，能扩增出GUS基因的植株则为转基因植株，而未进行转化的植株以及非转基因植株则不能扩增出GUS基因。

实施例8

JcTM6基因启动子在转基因小桐子中的活性检测

本发明通过检测GUS活性(参考方法同实施例6)来分析JcTM6基因启动子在转基因小桐子中的活性。

首先对转基因小桐子的各个组织部位进行GUS组织化学染色检测。将根、茎、幼叶、成熟叶、茎尖、花序芽、雌花、雄花、授粉后12天的果实和授粉后25天的种子浸入GUS染色液(配置同实施例6)中，抽真空30min，于37℃反应过夜，然后将材料置于脱色液中脱色。染色结果显示(图4)，在雌花、雄花、授粉后12天的果实和授粉后25天的种子(25DAP)中都能观察到较为明显的GUS染色；在花序芽和较嫩的茎中的GUS染色较弱；而在根、幼叶、成熟叶和茎尖中几乎观察不到GUS染色。

接着分别从转基因小桐子的5个株系取根、茎、幼叶、成熟叶、茎尖、花序芽、雌花、雄花、授粉后12天的果实、授粉后25天的果皮和种子进行GUS荧光活性定量检测。通过定量检测可以精确获知启动子在各个组织部位的活性强度。先提取各个组织的蛋白，接着采用Bradford法测定蛋白浓度，然后进行GUS酶反应，将酶反应过程中测得的反应产物4-MU的积累速度除以对应的蛋白量则为GUS酶活力。

结果显示(图5)，雌花中的GUS活性非常高，在其它组织部位中仅在花序芽、雄花、授粉后12天的果实和授粉后25天的种子里有少量表达。接着又对不同发育时期的雌花进行GUS活性检测，即把雌花纵剖后进行GUS染色。结果显示(图6)，在雌花发育过程中GUS染色都十分明显。以上结果表明，JcTM6启动子是一个在小桐子雌花中高表达的启动子。

实施例9

JcTM6基因启动子的应用

用JcTM6基因启动子驱动细胞分裂素合成酶基因AtIPT4在拟南芥中表达。

用内切酶XmaI和SacI酶切实施例4中已构建的JcTM6pro:GUS表达载体以去掉GUS基因，并用同样的酶来酶切含有AtIPT4基因的pGEM-T Easy载体，然后通过T4 DNA连接酶(Promega)将AtIPT4基因连入酶切后的载体，获得JcTM6pro:AtIPT4表达载体；接着通过电激法将构建好的植物表达载体转入农杆菌菌株LBA4404；然后将含JcTM6pro:AtIPT4表达载体的农杆菌转化拟南芥并获得转基因植株(方法同实例5)。

表型分析显示(图7)，与野生型植株(WT)相比，JcTM6pro:AtIPT4转基因植株的花显著增大，其他组织器官没有发生变化。

由上述实施例可知，小桐子TM6(JcTM6)基因主要在花中表达，然后克隆了该基因的启动子，并用该启动子驱使GUS报告基因在拟南芥和小桐子中表达。结果显示，在转基因拟南芥中，JcTM6基因启动子在花中特异性表达；在转基因小桐子中，JcTM6基因启动子在雌花中的表达活性非常高，在花序芽、雄花、果和种子里仅有少量表达。因此，JcTM6基因启动子可作为花特异性启动子驱使功能基因改良小桐子花性状从而提高种子产量。该启动子的分离克隆为小桐子基因工程育种奠定了一定的基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进或调整，这些改进或调整也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院西双版纳热带植物园

<120> 一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1820

<212> DNA

<213> Jatropha curcas．L

<400> 1

aatagctata aaatcaattt tcaaaatgcg gaacacaacc aaggaacctt ttttgtgagg 60

cagatcagac tatgctgcaa ccacagtgaa tacttagtaa ccttagcgct gataccaact 120

gttgtggaaa ttgggcttct tccaccaaat taaaaacaat ttgtgaatta ctgtactaag 180

taactacacc aggtaaattc ccagataagc ggaagagtca caggtctcac ttaaaatcca 240

cttgcctaga cagaatttac atagacatgc aattaatcag acaataacca ccaaaagtat 300

tttgcccaac aacagctatt aaataaataa aaacaaaagc aataaataaa agagaagacc 360

agaattttaa cgaggttcgg ccaatttttc ctacgtcctc ggacattacc aaatttatat 420

ttcactaaag aaatatacaa attgatagag cagagaaact tgtctaacct attaagtgtt 480

gaaagacaag ttgagacatc taaaattgaa ggaggtaggc tccttatata gaagagaggc 540

caccctctcc cttgctaaaa tcccgatgtg ggattgagcc accaaaccaa cggatcaaac 600

tcagctaaaa cacaaaatat atttttgaga ttaagaatta ccaccattta agggattaaa 660

gactcctatg attctggtga ctaaaacctt attatcctca taaacattcg agctaaaagt 720

aatgcccgac ttctcaaaat ttacaacttg acctgaggcc tcctcatagc agcttttcac 780

ctttaattaa ttagtttatt tagattcctt atattttcca tgaagcatac tttagactga 840

ttcgcttaca gaatttgcga gtttgcaagc ttcgagtctt cacattcttg atcgcatcat 900

gataatataa tcatagctca tgcatgatgc ggctaggata ctatccaaat ggtgtagtag 960

ctagtctttt tctttttttg tttgcatatt ataaaaataa ataaataaac aaacaaagaa 1020

aatttgcaaa ttattcactg aatacttcca ttaatgactc atgtaaactc atgaacttca 1080

cttgaatgtg agaaatatag aaaccttagc caaaatatct ctaaccaaaa ctaaacgatt 1140

ttcccattag tcttttctat aaataaacta atgctttccc catttctata accgtgtaaa 1200

ctatctttac tctctattaa caataatata aatcttgcga aaaaaagcag tacaaaagta 1260

taacattgcc atttcaagct tttcactgat aataagattg atttgtcctt attaggcttt 1320

tgagcatcac tgtgttatct ttctcactaa attaaagatt aaacccataa cataacgaca 1380

agaattattt tcttagttta ttatattcct tcatgtataa aatgttctca tcatattaca 1440

tccatttagt tttacctaac ataattgttt acttaaagag gtttaaggaa aggccttgtc 1500

aatcgcatag cacaaattgt actttgtaac aatgtcctgt cttcttcatt gcacttccca 1560

acatgacacg ttactgctat taaccctatc ttgaaactct cactttcaca aatttagcag 1620

gtattcttag ttacacaaca acccactttt gctttacctc tcctgaaata gaaactagtc 1680

tttttcttta ttttcttgct tttctttctg ctctgttatc ttcaagaatc aagaaaagcc 1740

tatgctccat acacaaaaca gttatccata tctcttcggt tttgtagtag tgggttttga 1800

ttatcaagaa gaaaggaaaa 1820

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatctcttcg gttttgtagt agtggg 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctcttggaa taagtaacct gtctgt 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgctaagg ctgttgggaa 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacatagccc aatattccct tcag 24

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtaatacgac tcactatagg gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggt 48

<210> 7

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accagccc 8

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcttggaat aagtaacctg tctgttgg 28

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actatagggc acgcgtggt 19

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caaaacccac tactacaaaa ccgaaga 27

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgctctagaa atagctataa aatcaatt 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcggatcct tttcctttct tcttgata 28

Claims

1.一种在植物花中表达的组织特异性启动子JcTM6基因启动子，所述JcTM6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种含权利要求1所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的重组载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子插入在基础载体的XbaI/BamHI多克隆位点处。

4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括目标功能基因；所述目标功能基因位于所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的3'端。

5.一组用于扩增权利要求1所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子的引物，包括正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

6.权利要求1所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、权利要求2～4任意一项所述重组载体或权利要求5所述引物在构建转基因植物和/或植物基因编辑中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述转基因植物包括转基因小桐子和转基因拟南芥。

8.权利要求1所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、权利要求2～4任意一项所述重组载体或权利要求5所述引物在植物花、果实和/或种子性状改良中的应用。

9.权利要求1所述组织特异性启动子JcTM6基因启动子、权利要求2～4任意一项所述重组载体或权利要求5所述引物在提高小桐子种子产量中的应用。