KR20110080617A

KR20110080617A - 식물의 특이적 발현을 유도하는 배추 개화조절 ＢｒＦＬＣ 유전자군의 프로모터

Info

Publication number: KR20110080617A
Application number: KR1020100000936A
Authority: KR
Inventors: 이연희; 홍준기; 김수윤; 김정선; 김진아
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2010-01-06
Filing date: 2010-01-06
Publication date: 2011-07-13
Also published as: KR101166762B1

Abstract

본 발명은 식물의 특이적 발현을 유도하는 유전자군의 프로모터 및 이를 이용하여 목적 유전자를 식물체내에서 특이적으로 발현시키는 방법에 관한 것으로, 특히 식물의 특이적 발현을 유도하는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터에 관한 것이다. 본 발명에서는, 식물의 특이적 발현을 유도하는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 신규 프로모터와 이를 포함하는 발현벡터 및 형질전환 식물체가 제공된다. 또한, 본 발명에서는 상기 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 식물체의 특이적 영역에서 발현시키는 방법이 제공된다. 본 발명은 다양한 목적의 형질전환 식물체 개발 등에 활용될 수 있다.

Description

식물의 특이적 발현을 유도하는 배추 개화조절 ＢｒＦＬＣ 유전자군의 프로모터 {Specific expression of BrFLC family gene promoters in plant}

본 발명은 식물의 특이적 발현을 유도하는 유전자군의 프로모터 및 이를 이용하여 목적 유전자를 식물체내에서 특이적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.

생물체내에서의 유전자 발현은 언제, 어느 곳에서, 얼마만큼 발현할 것인가를 조절하는 기능을 갖는 유전자 조절영역의 일종인 프로모터의 활성에 의존한다. 최근 유전공학 기술의 발달로 식물의 형질이 개량되고 있다. 이러한 형질전환 식물체를 만들기 위해서는 목적 유전자를 도입하여 식물체의 특이적 영역에서 발현시켜야 하는데, 이때 유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 연구 및 개발은 매우 중요하며 특수한 기능을 가지는 여러 종류의 프로모터들이 보고 되고 있다.

이전에 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터, 시기 및 조직 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터들로 구분할 수 있는데 보다 상세히 살펴보면 다음과 같다.

1) 전신발현 및 발현양을 최대화하는 프로모터

목적 유전자의 전신발현 유도와 발현양을 최대화 하는데 사용되는 프로모터로서 초기에 많이 개발되었다. 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터와 외떡잎식물용 프로모터로서 벼의 액틴 (actin) 유전자 프로모터 및 옥수수 유비퀴틴 (ubiquitin) 유전자 프로모터들이 이용되어 왔다. 최근에는 국내연구진에 의해 애기장대 포스파타제 2A 유전자의 프로모터 (대한민국 특허등록번호 제 10-0803391) 및 벼 시토크롬 C 유전자 (OsOc1)의 프로모터 (대한민국 특허등록번호 제 10-0429335)가 개발되어 사용 중이거나 사용 예정에 있다. 이들은 식물 형질전환 시 선발 마커로 사용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 이용되고 있으며, 목적 유전자의 식물체내에서의 기능을 연구하는데 우선적으로 사용되는 프로모터들이다.

2) 발현시기를 제한하는 프로모터

목적하는 외래 유전자가 식물의 발달 단계 중 특별한 시기에만 발현할 수 있도록 유도하는 프로모터에 대한 많은 예들이 보고 되고 있다. 식물의 발생과 발달 단계의 특정 시기에만 발현하는 유전자의 프로모터 (예를 들어, 개화 관련 프로모터는 개화시기에만 유전자를 발현시킨다) 및 각종 생물학적 (biotic)이거나 비생물학적 (abiotic) 자극에 의해 유도되는 유전자의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.

3) 발현조직을 제한하는 조직 특이적 프로모터

목적하는 외래 유전자를 식물체의 특이한 조직에 국한시켜 발현시키는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 다양한 목적에 따라서 식물체 각 조직에 대하여 많은 수가 보고 되고 있다. 조직 특이적 발현을 유도하는 프로모터는 식물체내에서 발현되는 조직에 따라 다음과 같이 분류하고 있다.

첫째, 종자 특이 발현 프로모터로 식물체에서 대표적인 영양물질의 저장고로서 유용물질축적의 극대화를 위하여 여러 가지 종자 특이 프로모터들이 개발되었다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀 (golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린 (glutelin) 프로모터가 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 사용되고 있다. 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는, 콩 유래 렉틴 (lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀 (napin) 프로모터, 들깨 유래 올레오신 (oleosin) 프로모터 (대한민국 특허등록번호 제 10-0685520) 등을 예로 들 수 있다.

둘째, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용될 수 있는 프로모터들이 연구되었다. 아직 상용화된 사례는 없으나, 고구마 유래의 매즈 유전자 (ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제 (ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자의 프로모터가 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하였으며, 애기장대 유래 익스텐신 유전자 AtLRX와 뉴클레오사이드 포스파타제 유전자 AtNP의 프로모터가 (대한민국 특허등록번호 제 10-0790809호, 제 10-0803390호) 뿌리 특이적으로 발현하였다.

셋째, 잎 등의 기타 조직 특이 발현 프로모터로 잎 등의 광합성 조직에서만 강력하게 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비시에스 (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신 (oleosin) 프로모터, 꽃의 웅성기관 약의 융단조직 특이 BcA9 프로모터 (대한민국 특허등록번호 제 10-0435143) 등을 예로 들 수 있다.

그 외에도 여러 가지 목적에 따라서 도입유전자의 발현 양, 시기, 조직 특이적 발현을 유도하기 위한, 식물체 내재 특이적 발현을 하는 유전자들의 프로모터들에 대해서 계속적으로 개발 중이거나 보고 되고 있다. 그러나 이런 다양한 프로모터들이 개발되고 있음에도 불구하고, 실제 상용화된 프로모터의 수는 많지 않으며, 그 이용도 부진한 편이다. 따라서 개발자의 의도에 따른 목적 유전자의 정밀한 발현 조절을 위하여, 새롭고 유용한 프로모터들에 대한 계속적인 연구 개발이 필요하다.

본 발명에서는 식물체에서 목적하는 외래 유전자를 발현시키고자 할 때 식물체의 발달 단계 중 언제, 어떤 조직에서 얼마만한 양으로 발현시킬 것인가를 조절하고 결정하는 프로모터를 제공하고자 한다. 특히 본 발명은, 목적 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터를 규명하고, 상기 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 식물체의 특이적 영역에서 발현시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 상기 프로모터를 포함하는 발현벡터 및 형질전환 식물체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

기타 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시에 의해 더 잘 알게 될 것이다.

본 발명에서는, 우리나라를 비롯한 중국, 일본 등 동북아시아에서 널리 재배되고 있는 주요 채소작물인 배추로부터 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터를 분리하고, 기능검정을 통하여 식물의 특이적 발현을 유도하는 신규 프로모터를 제공한다.

배추 전체 게놈 염기서열이 현재까지 계속적으로 동정되고 있고 이를 바탕으로 전체 유전자 탐색 및 조절 연구가 시도되고 있으며, 유용한 유전자들의 프로모터 기능 검증을 통한 고유 프로모터 확보가 가능하게 되었다. 애기장대 개화조절 유전자 AtFLC의 경우 1개의 유전자만이 존재하는 반면 배추에서는 개화조절 BrFLC 유전자가 게놈상에 4-5copy가 존재하는 것을 Southern 분석으로 확인하였다. 배추 지부에서 제작한 HindIII BAC 클론의 염기서열 (GeneBank수탁번호 AC155344, AC155341, AC155342)을 이용하여 서로 다른 3종류의 BrFLC 유전자 ( BrFLC1 , BrFLC2 , BrFLC3 )를 분리하는데 성공하였고 역전사 증폭반응 (RT-PCR)을 통해 이들 개화조절 유전자들의 식물 특이적 발현을 확인하였다. 본 발명에서는 배추 개화 조절 BrFLC유전자군의 프로모터를 분리 후 프로모터 영역(코딩부위 상위 약2.1kb)이 유전자의 특이적 발현을 유도할 가능성을 바탕으로 신규 식물 특이적 발현 유도 프로모터를 개발하였다.

본 발명의 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터는, 서열번호 1, 2, 3 중 어느 하나의 DNA서열을 갖는다.

또한, 본 발명에서는, 상기 프로모터의 DNA단편을 증폭하기 위한, 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9 중 어느 한 쌍의 DNA서열을 갖는 게이트웨이 벡터 재조합용 프라이머가 제공된다.

또한, 본 발명에서는, 상기 프로모터를 포함하는 발현벡터 및 형질전환 식물체가 제공된다.

또한, 본 발명에서는, 상기 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 식물체의 특이적 영역에서 발현시키는 방법을 제공한다. 서열번호 1의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환 시키면 식물체 내에서 유묘 발달 후 하배축, 암술머리 및 꽃가루에서 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있다. 또, 서열번호 2의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환 시키면 식물체 내에서 뿌리, 암술머리의 돌기 및 꼬투리 탈리대에서 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있다. 또한, 서열번호 3의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환 시키면 식물체 내에서 전신발현, 꽃실 및 꼬투리 탈리대에서 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있다.

본 발명에서는, 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 영역에서 BrFLC1 프로모터는 유묘 발달 후 하배축, 암술머리 및 꽃가루에서, BrFLC2 프로모터는 뿌리, 암술머리의 돌기 및 꼬투리 탈리대에서, BrFLC3 프로모터는 전신발현, 꽃실 및 꼬투리 탈리대에서 조직 특이적 발현을 유도하는 기능을 가진다는 것을 확인하였다. 이러한 프로모터들은 식물체에서 목적 유전자를 발현시킬 때 식물체의 발달단계 중 언제, 어느 조직에서, 얼마만한 양으로 발현시킬 것인가를 조절함으로써 다양한 목적의 형질전환 식물체의 개발 등에 활용될 수 있다. 본 발명의 프로모터들은 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 특이성이 우수하므로 고부가가치 식물체를 생산하는데도 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a 내지 1c는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군 프로모터 영역의 서열과 프로모터에 존재하는 작용위치요소들 (cis-acting elements)을 나타낸 것으로서, 도 1a는 BrFLC1의 프로모터, 도 1b는 BrFLC2의 프로모터, 도 1c는 BrFLC3의 프로모터를 나타낸 것이다.
도 2는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터들과 애기장대 개화조절 AtFLC 유전자 프로모터에 포함된 작용위치요소들의 종류와 위치를 비교한 그림이다.
도 3은 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 분석을 위하여 리포터 유전자 GUS를 포함하고 있는 식물 형질전환 벡터의 모식도이다.
도 4는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대 식물체의 종자 발아 및 유묘 발달과정 중 조직별 GUS 청색발색 반응을 관찰한 것이다.
도 5는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대 식물체의 성장 중 조직별 GUS 청색발색 반응을 관찰한 것이다.
도 6은 발아 후 1주 및 2주째 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대 식물체를 30분간 GUS염색 후에 조직별 청색발색 반응을 관찰한 것이다.
도 7은 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대 식물체의 생식생장기에서 (발아 후 35일) 조직별 GUS 청색발색 반응을 관찰한 것이다. (A)는 성숙식물체의 근생엽과 경생옆, 뿌리와 줄기에서 청색발색 반응을 비교한 것이고, (B)는 화아, 꽃, 꼬투리의 생식기관에서의 청색발색 반응을 비교한 것이다.

본 발명에서는 식물의 생장과 발달동안에 특이적 유전자 발현을 유도할 수 있는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 부위를 분리하고, 이의 염기서열 (염기서열 1, 2, 3, 도 1a, 1b, 1c 참조) 및 작용위치요소 (cis-acting elements)들을 확인하였다 (도 2 참조).

배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 영역을 분리하여 벨기에의 겐트대학으로부터 게이트웨이 운반체 pBGWS7을 구입하여 이 운반체에 Egfp와 Gus 유전자가 연결된 형태로 내재된 리포터 시스템 (Egfp : gus)을 사용하여 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 기능 분석용 식물형질전환 운반체를 제작하였다 (도 3 참조). 이 식물형질전환 운반체가 도입된 아그로박테리움 GV3101 균주를 십자화과의 모델식물인 애기장대의 꽃 조직과 공동 배양하는 방법을 통해 애기장대 식물체에 도입하였다. 형질전환 식물체들에서 BrFLC 유전자군 프로모터들의 특이적 발현 유도성은 형질전환 식물체에서 리포터 GUS 유전자 발현에 의한 청색발색 반응 분석을 통해 검증하였다.

그 결과, 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터들에 의한 GUS 발현은 생장, 개화 및 종자 성숙 등의 발달 단계에서 특이적 양상을 나타내었다. BrFLC1 프로모터는 유묘 발달 후 하배축, 암술머리 및 꽃가루에서, BrFLC2 프로모터는 뿌리, 암술머리의 돌기 및 꼬투리 탈리대에서, BrFLC3 프로모터는 전신발현, 꽃실 및 꼬투리 탈리대에서 식물 특이적 발현을 유도하는 프로모터로 판명되었다 (도 4, 도 5, 도 6, 도 7 참조). 이것은, 배추 개화조절 BrFLC 유전자 프로모터들이 식물의 생장, 개화 및 종자성숙 등 특정 발달단계에서 목적 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 신규 프로모터들임을 의미한다. 본 발명의 프로모터들은 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 특이성이 우수하기 때문에 고부가가치 식물체를 생산하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하고 이 재조합 벡터를 식물세포 내로 도입시키기 위하여, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다.

[ 실시예 ]

본 발명은 하기 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 하기 실시예들에서 일반적으로 사용된 DNA 실험방법들은 Sambrook 과 Russell의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, third edition, 2001"를 참조하였다.

[ 실시예 1]

배추로부터 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 부위 규명

본 발명자들은 배추 개화조절 BrFLC 유전자군을 포함하고 있는 배추 지부에서 제작한 HindIII BAC 클론의 염기서열 (GenBank수탁번호 AC155344, AC155341, AC155342)을 이용하여 서로 다른 3종류의 BrFLC 유전자 ( BrFLC1 , BrFLC2 , BrFLC3 ) 개시 코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2.1kb의 프로모터 부분이라 예상되는 영역을 검색하였고 (도 1 참조), 애기장대 개화조절 AtFLC 유전자의 프로모터영역과 비교하였으며(도 2 참조), 유전자 특이적 프라이머를 제작하여 BAC 클론으로부터 PCR을 수행하여 프로모터 영역을 분리하였다. 이때, 상기 PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후 94℃에서 1분, 57℃에서 1분 및 72℃에서 2분간 반응을 1 사이클로 하여 35회 실시한 다음, 72℃에서 10분간 반응하였다. 이후 상기 PCR 반응에서 획득한 DNA의 염기서열을 확인 하였다.

5'-AACCATGTCGTACATTCACC-3' : BrFLC1 프로모터 정방향 프라이머

5'-GGCTTCTGTCTCCAACAGT-3' : BrFLC1 프로모터 역방향 프라이머

5'-TCGAACGTGAAGGTGAGA-3' : BrFLC2 프로모터 정방향 프라이머

5'-GGCTTCTGTCTCCGAGAA-3' : BrFLC2 프로모터 역방향 프라이머

5'-CTTCACAAGCGTCATCCTC-3' : BrFLC3 프로모터 정방향 프라이머

5'-GGTTTCTGTCTCCAAGTGG-3' : BrFLC3 프로모터 역방향 프라이머

그 결과 BAC클론의 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 예상부위의 서열과 100% 일치했으며, 이들 프로모터를 서열번호 1, 2, 3으로 나타내었다.

이들 배추 BrFLC 유전자군과 애기장대 AtFLC 유전자 프로모터 (2.1kb) 영역의 염기서열 상동성을 비교 분석해 본 결과 40.1-51.9%의 낮은 상동성을 나타냈으며, 또한 애기장대와도 낮은 상동성을 보여주였다. 분석결과를 아래 표 1에 나타내었다.

또한 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 영역에 존재하는 작용위치요소들 (cis-acting elements)은 프로모터에 있는 작용위치요소들의 종류와 위치를 예측할 수 있는 프로그램을 제공하는 홈페이지인 PLACE (Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements, http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)와 PlantCARE (Plant Cis-Acting Regulatory Element, http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)를 이용하여 비교 분석 하였다. (도 1a, 1b, 1c, 도 2 참조)

그 결과, 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터와 애기장대 AtFLC 유전자의 프로모터에는 식물 호르몬이나 각종 생물학적 (biotic), 비생물학적 (abiotic) 자극에 의해 반응하는 다양한 작용위치요소들이 존재하고 있었다. 그러나 프로모터들 내에 같은 종류의 작용위치요소들이 존재하고 있지만 이들은 프로모터의 다른 위치에 존재하고 있었다. 또한 각각의 프로모터에 서로 다른 종류의 작용위치요소들이 일부 내재되어있다는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 배추 개화조절 BrFLC 유전자군 프로모터의 염기서열 특성 조사 결과로부터 프로모터 영역의 특이적 발현 가능성이 예상되므로, 약 2.1kb 프로모터 영역의 기능 분석을 수행하였다.

[ 실시예 2]

식물 형질전환용 운반체 제작

상기 실시예 1에서 분리한 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터를 애기장대에 형질 전환시키기 위하여 이들 프로모터들을 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하였다. 이를 위해 먼저, 벨기에의 겐트대학으로부터 구입한 게이트웨이 벡터인 pBGWFS7에 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 삽입된 재조합 벡터를 제작하였다. 즉, 상기 실시예 1에서 확보한 PCR 산물을 박테리아가 박테리오파지에 의해 감염될 때 박테리아 측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 프라이머 어댑터 프라이머 B1과 B2 (서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9)를 이용하여 다시 유전자 증폭반응 (PCR: polymerase chain reaction)을 통해 약 2.1kb의 프로모터 부위 (서열번호 1, 2, 3)를 분리하였다.

서열번호 4: BrFLC1 프로모터 어댑터 프라이머 B1

5'-AAAAAGCAGGCTAACCATGTCGTACATTCACC-3'

서열번호 5: BrFLC1 프로모터 어댑터 프라이머 B2

5'-AGAAAGCTGGGTGGCTTCTGTCTCCAACAGT-3'

서열번호 6: BrFLC2 프로모터 어댑터 프라이머 B1

5'-AAAAAGCAGGCTTCGAACGTGAAGGTGAGA-3'

서열번호 7: BrFLC2 프로모터 어댑터 프라이머 B2

5'-AGAAAGCTGGGTGGCTTCTGTCTCCGAGAA-3'

서열번호 8: BrFLC3 프로모터 어댑터 프라이머 B1

5'-AAAAAGCAGGCTCTTCACAAGCGTCATCCTC-3'

서열번호 9: BrFLC3 프로모터 어댑터 프라이머 B2

5'-AGAAAGCTGGGTGGTTTCTGTCTCCAAGTGG-3'

상기 증폭된 PCR 산물들을 박테리아가 박테리오파지에 의해 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터 (인비트로젠 생명 기술사, 미국)와 BP 재조합 반응(BP 반응 버퍼, 상기 PCR 산물 200ng, pDONR221 벡터 150ng 및 게이트웨이 BP 클로나제 (clonase)효소 혼합액 등을 잘 섞은 뒤 25℃에서 24시간 동안 반응)을 하여 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 삽입된 중간 클로닝 벡터인 pDONR-BrFLC들을 제작하였다. 이후 최종적으로 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터를 포함하는 식물 형질전환 재조합 발현벡터를 제작하기 위하여 상기 제작된 pDONR-BrFLC 벡터들을 리포터 유전자 녹색형광단백질 Egfp 및 청색발색 GUS를 포함하고 있는 pBGWFS7 벡터와 LR 재조합 반응을 시켜 식물 형질전환 발현벡터인 pBGWFS7-BrFLC를 제작하였다. 상기와 같은 방법에 의해 제조된 본 발명의 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터 부위를 포함하는 재조합 발현벡터인 pBGWFS7-BrFLC들은 pPBrF1, pPBrF2, pPBrF3로 명명하였으며 지도는 도 3에 나타내었다.

[ 실시예 3]

애기장대 형질전환 및 형질전환체 선발

상기 실시예 2에서 제조한 재조합 발현벡터인 pPBrF1, pPBrF2, pPBrF3를 액체질소를 이용한 형질전환 방법으로 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 균주에 형질전환 시킨 후 알카라인 라이시스 방법 (alkaline lysis)에 근거한 아그로박테리아 급속 선발 (quick-screen)을 이용하여 GV3101 균주내 운반체 도입을 확인하였다. 형질전환된 GV3101 균주를 이용하여 야생형 애기장대 Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 23℃ 생장상 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시킨다. 4주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도한다. pPBrF1, pPBrF2, pPBrF3 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 균주를 항생제가 포함된 5㎖의 LB배지에서 36-48시간 동안 배양한 후 5% sucrose와 0.05% silwet L-77이 함유된 용액에 O.D 0.8 정도로 희석하여 현탁액을 제조한다. 상기 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 상기와 동일한 방법으로 형질전환을 반복한다. 이 후, 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리 (silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 파종하여 생육 2주째 1차, 4주째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 형질전환체를 선발하여 같은 조건으로 생육시킨 후 후대종자를 확보하였다. 상기 형질전환 애기장대 종자를 30㎍/㎖ 포스피노트로신 (DL-phophinothricin)이 포함된 MS배지에 파종하여 멘델의 유전법칙에 의한 잡종 제 2대의 분리비가 약 3 (항생제 저항): 1 (항생제 민감)로 나타나는 T-DNA가 애기장대 게놈 내에 삽입된 식물체를 선발하여 다음의 실험에 사용하였다.

[ 실시예 4]

형질전환 식물체의 유묘 및 성장 발달단계에서 GUS 발현 분석

배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 식물체 내에서 유전자 발현을 특이적으로 유도하는지 확인하기 위하여 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 애기장대의 각 조직에서 GUS 유전자 발현 양상을 분석하였다. 즉, 상기 실시예 3에서 형질전환된 애기장대로부터 수확한 T2 종자를 일부는 MS배지에서 발아시켜 유묘의 발달단계에서 GUS (청색 발색 유전자) 발현 양상을 관찰하였고, 일부는 상토에 파종하여 생육 10일과 20일째 식물체에서 잎, 줄기, 뿌리들의 여러 조직에서 생육 단계별로 GUS 유전자 발현 양상을 관찰하였다. 상기 발아시킨 유묘를 GUS-어세이 버퍼 (X-gluc (cyslohexyl ammonium salt) 20mM, NaH₂PO4 H₂O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5)에 침지하고 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올로 클로로필 (chlorophyll)을 완전히 제거하여 GUS 유전자 발현 양상을 실체현미경 (Olympus, SZX12)을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, BrFLC1 프로모터에 의한 GUS 발현은 종자 발아 후 유묘 성장 7일째 까지 서서히 감소되고 있음을 확인할 수 있었고, BrFLC2 프로모터에 의한 GUS 발현은 유묘 발달동안 계속적으로 뿌리에서 강하게 발현되고 있으나 떡잎 (cotyledon)에서는 GUS 발현정도가 감소하고 있었다. 반면, BrFLC3 프로모터에 의한 GUS 발현은 종자 발아 후 유묘 성장 7일째 까지 발현이 서서히 증가하고 있음을 확인할 수 있었다 (도 4 참조). 또한, 상토에 파종한 형질전환 애기장대에서 BrFLC1 프로모터에 의한 GUS 발현은 하배축 (hypocotyl)에서만 관찰되고 있으며, BrFLC2 프로모터의 경우 GUS 발현은 발아 후 10일째 잎에서 감소하다가 20일째의 잎에서 증가하고 있으며, 또한 잎의 모용에서도 발현이 나타나는 특이적 발현양상을 보였으며, 뿌리에서의 발현은 잎의 발현 양상과는 다르게 지속적으로 강하게 나타나고 있었다. BrFLC3 프로모터에 의한 GUS 발현은 잎에서 모용의 기저부와 잎맥에서 강하게 발현되었으며, 또한 전신에서 GUS가 발현하고 있어 전신발현 프로모터라는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과로부터 본 발명의 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터는 발아 후 유묘의 발달단계와 식물체의 생육에서 조직 특이적으로 유전자의 발현을 유도하는 프로모터임을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5]

배추 개화조절 BrFLC 유전자군 프로모터의 뿌리 발현 양상 분석

상기 실시예 4를 통해 본 발명의 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터들 중 BrFCL2 프로모터는 뿌리에서 특이적으로 GUS 유전자의 발현을 강하게 유도함을 확인하였다. 본 발명자들은 이를 재확인하기 위하여 발아 후 1주와 2주째 형질전환 애기장대를 상기 실시예 4에서 사용한 GUS-어세이 방법을 변경하여 GUS-어세이 버퍼에 조직의 침지시간을 37℃에서 30분 동안 짧게 처리한 후, 70% 에탄올을 사용하여 클로로필 (chlorophyll)을 완전히 제거시켰다.

그 결과, BrFLC1과 BrFLC3 의 프로모터들에 의한 GUS 발현은 30분 동안의 반응에서 어떤 조직에서도 관찰할 수 없었으나, BrFLC2 프로모터 의한 GUS 유전자는 뿌리에서만 발현되었으며 뿌리에서도 세포 분열조직을 제외한 뿌리 연장 및 성숙 부분에서만 발현되는 뿌리 조직 특이적 발현을 유도하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 6 참조). 따라서 상기의 결과로, BrFLC2 프로모터는 뿌리에서 강하게 발현되는 뿌리 특이적 프로모터임을 알 수 있었다.

[ 실시예 6]

형질전환 식물체의 개화 및 종자 성숙 등의 발달 단계에서 발현 분석

마지막으로, 본 발명자들은 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터가 식물체의 개화 및 종자 성숙 등의 발달 단계에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는지를 확인하기 위하여 상토에서 35일째 배양된 형질전환 애기장대에서 화아 (flower bud), 꽃, 꼬투리 조직 (silique)을 포함한 각 조직에서의 GUS 발현 양상을 분석하였다.

그 결과, BrFLC1 프로모터에 의한 GUS 발현은 상기예 4에서 나타난 결과와 같이 하배축 (hypocotyl)에서만 관찰되었고, 근생엽 (rosette leaf), 경생옆 (cauline leaf), 뿌리와 줄기에서는 발현이 되지 않았다. BrFLC2의 프로모터에 의한 GUS 발현은 뿌리에서 강하게 관찰되었고, 근생엽 (rosette leaf)과 모용 (trichome)에서는 발현이 약하게 나타났으며, 경생옆 (cauline leaf)과 줄기의 절단면에서는 GUS 발현이 관찰되지 않았다. 그리고 BrFLC3 프로모터의 경우에는 근생엽 (rosette leaf)과 모용 (trichome) 및 줄기의 절단면에서 GUS 발현을 확인할 수 있었고, 경생옆 (cauline leaf)에서는 미약한 GUS 발현을 관찰할 수 있었다 (도 7A 참조). 또한, 생식기관인 화아 (flower bud), 꽃 (flower), 꼬투리 (silique)에서는 BrFLC1 프로모터에 의해 암술머리 (stigma) 및 꽃가루 (pollen grain)에서 GUS 발현을 관찰할 수 있었고, BrFLC2 프로모터는 암술머리의 돌기 (stigma papilla), 꼬투리 머리 및 탈리대 (silique-abscission zone)에서 GUS발현을 유도한다는 것을 확인하였다. BrFLC3 프로모터에 의해서는 암술대 (style), 암술머리의 돌기, 꽃실 (filament), 꼬투리 머리대 및 탈리대에서 GUS가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 7B 참조).

따라서 상기 결과로부터 본 발명의 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터는 식물의 생장과 발달동안에 특이적 발현을 유도하는 프로모터임을 확인할 수 있다.

본 발명은, 배추에서 분리된 개화조절 BrFLC 유전자군 프로모터들이 리포터 유전자를 식물체 내에서 특이적으로 발현시키는 것을 실험적으로 입증한 자료를 제공함으로써 식물체에 목적 유전자를 도입하여 특이적 발현을 유도하여 그 기능과 가치를 향상시키고자 할 때 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 프로모터들은 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 특이성이 우수하기 때문에 고부가가치 식물체를 생산하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

<도 1a 내지 1c>
5UTR Py-rich : 높은 전사 유도 작용위치요소
A-box : 전사조절 작용위치요소
ABRE : 엡시스산 반응에 포한된 작용위치요소
ARE : 혐기적 반응에 포함된 작용위치요소
Box-W1 : fungal elicitor 반응 요소
Box III : 단백질 결합 부분
CAAT-box : 전사인자 결합 부분
CAT-box : 분열조직에서 발현을 조절하는 작용위치조절요소
CCAAT-box : MYBHv1 결합부위
CCGTCC-box : 분열조직 특이적 발현을 조절하는 작용위치조절요소
CGTCA-motif : MeJA-반응에 포함된 작용위치조절요소
Circadian : 생체리듬 조절 작용위치요소
ERE : 에틸렌 반응 요소
GC-motif : 산소결핍 특이반응에 포함된 조절요소
GCN4_motif : 배젖 발현에 포함된 조절요소
HD-Zip 1 : 엽육세포 분화에 포함된 조절요소
HSE : 더위 스트레스 반응에 포함된 작용위치요소
MBS : 건조 유도반응에 포함된 MYB 결합부위
MSAL : 세포주기 조절에 포함된 작용위치요소
OBPS : 작용위치조절요소
Skn-1_motif : 배젖 발현에 포함된 조절요소
TATA-box : 호그니스 박스
TC-rich repeats : 방어 및 스트레스 반응 조절요소
TCA-element : 살리실산 반응 조절에 포함된 작용위치요소
TGACG-motif : MeJA-반응에 포함된 작용위치조절요소
<도 3>
LB : 좌측면 (Left border)
Bar: 제초제 저항성 유전자
attB1 : 게이트웨이 클로닝에 사용된 어댑터
BrFLC1-pro : BrFLC1 프로모터
BrFLC2-pro : BrFLC2 프로모터
BrFLC3-pro : BrFLC3 프로모터
attB2 : 게이트웨이 클로닝에 사용된 어댑터
Egfp : 녹색형광단백질 (Enhanced green fluorescent protein) 유전자
GUS : 청색발색 (β-glucuronidase) 유전자
T35S : 35S 터미네이터
RB: 우측면 (Right border)
<도 4>
PBrF1 : BrFLC1 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF2 : BrFLC2 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF3 : BrFLC3 프로모터가 삽입된 형질전환체
0d : 형질전환 애기장대 식물체의 종자 발아 전
1d : 형질전환 애기장대 식물체의 종자 발아 후 1일째 유묘
3d : 형질전환 애기장대 식물체의 발아 후 3일째 유묘
5d : 형질전환 애기장대 식물체의 발아 후 5일째 유묘
7d : 형질전환 애기장대 식물체의 발아 후 7일째 유묘
<도 5>
PBrF1 : BrFLC1 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF2 : BrFLC2 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF3 : BrFLC3 프로모터가 삽입된 형질전환체
10d : 형질전환 애기장대 식물체의 종자 발아 후 10일째
20d : 형질전환 애기장대 식물체의 종자 발아 후 20일째
HC : 발아 후 20일째 형질전환 애기장대 식물체의 하배축 (Hypocotyl)
RL : 발아 20일 후 형질전환 애기장대 식물체의 근생엽 (Rosette leaf)
TC : 발아 20일 후 형질전환 애기장대 식물체의 모용 (Trichome)
R : 발아 20일 후 형질전환 애기장대 식물체의 뿌리 (Root)
RT : 발아 20일 후 형질전환 애기장대 식물체의 근단 (root tip)
<도 6>
PBrF1 : BrFLC1 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF2 : BrFLC2 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF3 : BrFLC3 프로모터가 삽입된 형질전환체
1w : 형질전환 애기장대 식물체의 발아 후 1주째
2w : 형질전환 애기장대 식물체의 발아 후 2주째
2w-RL: 발아 후 2주째 형질전환 애기장대 식물체의 근생엽 (Rosette leaf)
2w-R : 발아 후 2주째 형질전환 애기장대 식물체의 뿌리 (Root)
2w-RT : 발아 후 2주째 형질전환 애기장대 식물체의 근단 (Root tip)
<도 7>
PBrF1 : BrFLC1 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF2 : BrFLC2 프로모터가 삽입된 형질전환체
PBrF3 : BrFLC3 프로모터가 삽입된 형질전환체
35d : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물의 성숙체
R : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 뿌리 (Root)
RL : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 근생엽 (Rosette leaf)
TC : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 모용 (Trichome)
CL : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 경생옆 (Cauline leaf)
WD : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체 줄기의 절단면에서 청색발색반응
FB : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 화아 (Flower bud)
F : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 꽃 (Flower)
S : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 암술머리 (Stigma)
A : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 화분 (Anther)
Si : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 꼬투리 (Silique)
Si-S : 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체의 꼬투리 머리부분 (Silique-stigma)
Si-Az: 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물체 꼬투리의 탈리대 (Silique-abscission zone)

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific expression of BrFLC family gene promoters in plant <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2133 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 aaccatgtcg tacattcacc aatcgatatc gtaaaagtac ttttcgcatt aagttctaaa 60 agaacaaatg tcgtattttc ttgccacaaa attactatta gtatttagta tggtttttaa 120 cctttccgta ggcttaccaa aacattttcc tactacacgc ttttttttac tactgtccac 180 gttcttttta ccgtctatta aaataaaata attagcaact aacattcccc cgtttataga 240 aaatattatc atggacttta tgcaaatttc tgttttaaaa ggttccaaca tttttgtcat 300 gtaaaaaaaa aaaagagaaa ggttccaact ttgtaagact taatgatttt gataaaataa 360 aaatggttcc ttttcttttc gtttgggtaa acttacaaca tcatctgatt taaaatatct 420 caatacgcac cgaacaaaaa tatggtgtcg acctttagta tctagcacaa acgtatacta 480 ttgttcaaaa gaatttctca tgactcttat tggtgtttat caagattgga ctcaaacgtc 540 ttttggggat agtttgtcaa cattcgtgtg atatataata ttgaccaatt taaagtcttt 600 gtaaggtaag taactcgggt gagttcagta caaaaacttt gggtcagaac agtagtatat 660 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agtgcaatag tatttaatgc tacaagtggt 1320 cgatgcagta aatggcaatg aattctatta atggactaga tactgctttt tattatcgga 1380 aatatatttg ctccacttgg aaatggaaaa aaaaaatcta tgaatcgaat tgcaatatca 1440 taaatgacta gagttgaaag ttctataaac aatttataca atttttattt caccaaaaaa 1500 aaaaatacaa ttttgatagt ataaatttaa aaacatataa gatgcatcta aagagaagga 1560 taattgacat atccagaata tggatgattg gatataaagc gcgccgtaca ttcacccatc 1620 gattagtata cgtacttttc tcattattta tatcatattt tcctctgcca caaaattaat 1680 agtatagctt gtattatatc ctatagtgga atcgaaggaa cgttccatag ggttaaataa 1740 acatctctca tgagtcacgg gccatattag aaggcaagca tgcggtacac atggctgtct 1800 tgtcgtcaaa acgcaccgtt ttcactttgt tattttattt tcatctctct tttacccaaa 1860 acaaacaaaa aaacattgcc gaggaaaagt agagacacac aaaaaaggaa agaaataaaa 1920 gaaaaaaaga gcataaaacg ctttagtatc tccggccact tgaaccgaac ctctggatca 1980 aattagggca cagagaccac ttggagacag aaacc 2015 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PBrF1-B1 <400> 4 aaaaagcagg ctgccttaat cttgtctgc 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PBrF1-B2 <400> 5 agaaagctgg gtcctaatgg aaggaggag 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PBrF2-B1 <400> 6 aaaaagcagg cttcgaacgt gaaggtgaga 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PBrF2-B2 <400> 7 agaaagctgg gtggcttctg tctccgagaa 30 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PBrF3-B1 <400> 8 aaaaagcagg ctcttcacaa gcgtcatcct c 31 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PBrF3-B2 <400> 9 agaaagctgg gtggtttctg tctccaagtg g 31

Claims

서열번호 1, 2, 3 중 어느 하나의 DNA서열을 갖는 배추 개화조절 BrFLC 유전자군의 프로모터.
서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9 중 어느 한 쌍의 DNA서열을 갖는 게이트웨이 벡터 재조합용 프라이머.
서열번호 1, 2, 3 중 어느 하나의 DNA서열을 갖는 프로모터를 포함하는 유전자 발현용 벡터.
서열번호 1, 2, 3 중 어느 하나의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 식물체.
서열번호 1의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 식물체 내에서 유묘 발달 후 하배축, 암술머리 및 꽃가루에서 유전자를 발현시키는 방법.
서열번호 2의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 식물체 내에서 뿌리, 암술머리의 돌기 및 꼬투리 탈리대에서 유전자를 발현시키는 방법.
서열번호 3의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 식물체 내에서 전신발현, 꽃실 및 꼬투리 탈리대에서 유전자를 발현시키는 방법.