CN101952431A - 生长促进的转化植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定参与植物生长的基因并由此提供利用所述基因促进生长的转化植物。

Description

生长促进的转化植物
技术领域
本发明涉及其生长被促进的转化植物和用于产生所述植物的方法。
背景技术
植物根部起着重要作用，例如吸收营养和固定植物体使其向上。然而，对这类生理现象相关的许多因素尚不了解。
最近，开发出一种称为FOX搜寻系统(FOX hunting system)的方法，通过所述方法可以全面分析那些DNA序列已测定、但功能尚不了解的基因(日本专利公开第2003-018808A号)。在该系统中，将全长cDNA与高度表达的载体连接，再将由此获得的载体引入拟南芥(Arabidopsis thaliana)，由此产生高度表达全长cDNA的拟南芥。上述FOX搜寻系统可用于各种遗传分析。
另一方面，涉及植物生长的一些专利申请已经提交，其实例包括涉及基因控制的植物根部伸长的那些(日本专利公开第2004-187564A号)，用于促进植物生长的方法(日本专利公开第2004-305051A号)，和用于增加植物生长和作物产量的方法(日本专利公开第2002-531083A号)。日本专利公开第2004-187564A号公开了使用拟南芥T-DNA标记品系，鉴定在根尖中特异性表达的拟南芥基因(AtGCN20-3)。日本专利公开第2004-305051A号公开了由植物衍生的细胞周期蛋白B2基因的过量表达促进生长器官例如根的伸长。日本专利公开第2002-531083A号公开了用与调节序列连接的细胞周期蛋白编码核酸来转化植物，产生显示出根和芽的生长增加的转化植物。
发明内容
本发明涉及鉴定参与植物生长的基因，并涉及提供利用所述基因促进生长的转化植物和产生所述植物的方法。
本发明人进行了彻底研究，以达到上述目标。结果，我们产生了拟南芥品系，其各自都能高度表达一种水稻全长cDNA(称为水稻FOX品系)，并且进行了根弯曲测定(root bending assay)，以分离与野生型植物相比在伸根上表现出变化的拟南芥，并对由此分离的拟南芥中引入的水稻全长cDNA进行测序，鉴定参与植物生长的DNA，由此完成了本发明。
本发明概述如下。
[1]包含引入其中的以下(a)至(g)的任何DNA的转化植物：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7核苷酸序列的DNA；
(b)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7核苷酸序列的DNA，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加；并且所述DNA编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(c)DNA，所述DNA包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(d)DNA，所述DNA在严格条件下杂交于包含与具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA互补的核苷酸序列的DNA，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(e)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(f)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述序列中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性；和
(g)编码蛋白质的DNA，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性。
[2]第[1]项的转化植物，其中所述促进植物生长的活性是促进根伸长的活性。
[3]第[1]或[2]项的转化植物，其中所述促进植物生长的活性是增加叶面积的活性。
[4]第[1]-[3]项中任一项的转化植物，所述转化植物是单子叶植物或双子叶植物。
[5]第[1]-[4]项中任一项的转化植物，所述转化植物是植物体、植物体的一部分、培养的植物细胞或种子。
[6]包含以下(a)至(g)中任何DNA的重组载体：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7核苷酸序列的DNA；
(b)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7核苷酸序列的DNA，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加；并且所述DNA编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(c)DNA，所述DNA包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(d)DNA，所述DNA在严格条件下杂交于包含与具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA互补的核苷酸序列的DNA，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(e)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(f)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述序列中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性；和
(g)编码蛋白质的DNA，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性。
[7]一种产生转化植物的方法，所述方法包括将以下(a)至(g)的任何DNA引入植物细胞中并培养所述植物：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7核苷酸序列的DNA；
(b)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7核苷酸序列的DNA，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加；并且所述DNA编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(c)DNA，所述DNA包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(d)DNA，所述DNA在严格条件下杂交于包含与具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA互补的核苷酸序列的DNA，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(e)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(f)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述序列中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性；和
(g)编码蛋白质的DNA，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性。
[8]第[7]项的方法，其中使用第[6]项的重组载体引入所述DNA。
本说明书涵盖日本专利申请第2007-315953号中所述的说明书和/或附图的内容，根据所述专利申请，本申请要求优先权。
附图简述
图1表示根弯曲测定的概述。
图2表示再次转化的水稻FOX品系的根伸长。图A表示水稻FOX品系1(SEQ ID NO：1和2)，图B表示水稻FOX品系2(SEQ ID NO：3和4)。
图3表示再次转化的水稻FOX品系的根伸长。图C表示水稻FOX品系3(SEQ ID NO：5和6)，图D表示水稻FOX品系4(SEQ ID NO：7和8)。
图4表示再次转化的水稻FOX品系的叶面积的增加。图A表示水稻FOX品系1(SEQ ID NO：1和2)，图B表示水稻FOX品系2(SEQID NO：3和4)。
实施本发明的最佳方式
(1)参与促进植物生长的DNA
用于本发明的参与促进植物生长的DNA是SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的DNA，由所述DNA编码的氨基酸分别是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：8。上述序列信息已经报告至国家生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)。对应于SEQ ID NO：1-8的NCBI登记号如下所示。
表1
  水稻FOX品系   登记号
  1(SEQ ID NO：1，2)   AK069726
  2(SEQ ID NO：3，4)   AK070346
  3(SEQ ID NO：5，6)   AK067987
  4(SEQ ID NO：7，8)   AK066897
使用FOX搜寻系统和根弯曲测定对水稻基因进行搜寻，结果发现了上述参与促进植物生长的DNA。
FOX搜寻系统(全长cDNA过量表达子基因搜寻系统(Full-length cDNA Over-expressor Gene Hunting System))是根据引入植物的全长cDNA过量表达而导致的性状变化来阐明DNA功能的一种方法(参见日本专利公开第2003-018808A号)。在本发明中，水稻全长cDNA用作引入植物的全长cDNA，而拟南芥用作引入全长cDNA的植物。
具体地讲，将约13,000种水稻全长cDNA制备成库(pool)，所述库具有相等比率的cDNA(称为标准化)，并将cDNA整合到具有调节区例如启动子、增强子和终止子以及选择标记例如抗药基因的T-DNA载体中。将所得T-DNA载体引入到土壤杆菌(Agrobacterium)中，因而产生水稻全长cDNA表达文库(称为水稻FOX文库)。通过花序浸渍法(floral dipping method)，使用所述土壤杆菌来转化拟南芥，产生拟南芥转化体品系(水稻FOX品系)。在FOX搜寻系统中，因为每个植物中仅引入一个或两个克隆，甚至当用上亿个克隆组成的文库来感染植物时，所以可以产生这样的转化体品系：其中每个植物都具有引入其中的不同克隆。从上述转化的拟南芥中采集T1种子并播种，然后收集T2代种子。对T2种子进行根弯曲测定，用于筛选。
根弯曲测定是以下文献中描述的一种方法：Britt等人(1993)，AUV-sensitive mutant of Arabidopsis defective in the repair of pyrimidine-pyrimidinone(6-4)dimers.Science 261：，1571-1574，所述方法在本发明中具体实施如下。
将水稻FOX品系的T2种子和野生型种子播种在MS琼脂培养基上，并经历暗处理和春化处理。随后，使培养基保持垂直，让种子在连续白光下生长，使根沿着琼脂培养基表面伸长。然后，将琼脂培养基水平放置并在黑暗中用UV-B照射。随后，使培养板保持垂直并旋转90度，以改变根伸长方向，并让根在连续白光下再次生长。然后，比较野生型植物与水稻FOX品系的T2植物在UV-B照射后根伸长的长度，将伸根长度比野生型更长的品系分离出来，作为候选UV-B-抗性品系。
对于由此分离的候选UV-B-抗性水稻FOX品系，对所引入的水稻全长cDNA进行测序，用水稻全长cDNA再次转化拟南芥，并证实在所得再次转化植物中是否可重现促进根伸长的表型(参见图1)。
具体地讲，所鉴定的DNA是分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的核苷酸序列组成的DNA。
上述DNA编码具有促进植物生长活性的蛋白质。在本文中，“促进植物生长的活性”并未具体限定，只要是与野生型相比能促进植物生长的活性，其实例包括促进根伸长的活性和/或增加叶面积的活性。促进植物生长的程度没有限定，只要是植物生长与野生型相比具有统计学显著性。例如，与野生型根的长度相比，本发明转化植物的根长度优选长5％以上，10％以上，15％以上，20％以上，25％以上，30％以上，35％以上，40％以上，45％以上和50％以上。此外，与野生型的叶面积相比，本发明转化植物的叶面积优选大5％以上，10％以上，15％以上，20％以上，25％以上，30％以上，35％以上，40％以上，45％以上和50％以上。
用于本发明的DNA可以是由上述SEQ ID NO的核苷酸序列组成的DNA，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加，只要所述DNA编码的蛋白质具有促进植物生长的活性即可。
在本说明书中，“SEQ ID NO：1的核苷酸序列，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加”是指例如1-10个核苷酸、优选1-5个核苷酸可以从SEQ ID NO：1的核苷酸序列中缺失，或者1-10个核苷酸、优选1-5个核苷酸可以添加到SEQ ID NO：1的核苷酸序列中，或者SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的1-10个核苷酸、优选1-5个核苷酸可以被其它核苷酸取代。
此外，用于本发明的DNA可以是由与上述SEQ ID NO的核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列组成的DNA，只要所述DNA编码的蛋白质具有促进植物生长的活性即可。
在本说明书中，在“与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列”中的“同一性”为90％以上，优选95％以上，更优选98％以上，和甚至更优选99％以上。
本文所用的核苷酸序列的“同一性”，在两个核苷酸序列的比对中，是指当按照使相同核苷酸数最大化的方式比对两个序列时，所观察到的序列之间的一致性程度。具体地讲，它表示为核苷酸总数中相同核苷酸数所占的百分比(％)。可使用已知的算法例如BLAST和FASTA求出同一性％。当引入空位时，例如，当使用FASTA时，空位数也加入到核苷酸总数中。
此外，用于本发明的DNA可以是这样的DNA：所述DNA在严格条件下杂交于由与上述SEQ ID NO核苷酸序列所组成的DNA互补的核苷酸序列组成的DNA，只要所述DNA编码的蛋白质具有促进植物生长的活性即可。
在本说明书中，“严格条件”是指这样的条件：在所述条件下形成所谓特异性杂交体，而基本上不形成非特异性杂交体。这类条件的实例包括这样的条件：在所述条件下，具有高度同一性的核酸，也就是说，由与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上和甚至更优选99％以上同一性的核苷酸序列组成的DNA的互补链发生杂交，而同一性小于上述的核酸的互补链则不发生杂交。更具体地讲，这类条件是指以下条件：钠盐浓度为15-750mM，优选50-750mM，和更优选300-750mM，温度为25-70℃，优选50-70℃，和更优选55-65℃，甲酰胺浓度为0-50％，优选20-50％，和更优选35-45％。此外，在严格条件下，用于杂交后洗涤滤器的条件通常是以下条件：氯化钠浓度为15-600mM，优选50-600mM，和更优选300-600mM，温度为50-70℃，优选55-70℃，和更优选60-65℃。
或者，严格条件可以是以下条件：在2-6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC，1×SSC含有150nM氯化钠和15mM柠檬酸钠，pH 7.0)中，在室温至40℃下进行杂交，然后用0.1-1×SSC(优选0.1-0.2×SSC)和0.1％SDS，在50-68℃洗涤一次或多次。
此外，用于本发明的DNA可以是编码以下蛋白质的DNA，所述蛋白质由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列组成。由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列组成的蛋白质分别被由SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列组成的DNA编码。
此外，用于本发明的DNA可以是编码由上述SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA，所述序列中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加，只要所述DNA编码的蛋白质具有促进植物生长的活性即可。
同样，氨基酸序列可含有保守氨基酸取代。这类取代发生在例如共享类似结构或带电性质的氨基酸之间。这类氨基酸的组别包括(1)酸性氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(3)非极性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；(4)不带电荷的极性氨基酸：甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；和(5)芳族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
在本说明书中，“SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加”是指例如，1-10个氨基酸、优选1-5个氨基酸可从SEQ ID NO：2的氨基酸序列中缺失，或者1-10个氨基酸、优选1-5个氨基酸可添加到SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，或者SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的1-10个氨基酸、优选1-5个氨基酸可以被其它氨基酸取代。
此外，用于本发明的DNA可以是编码蛋白质的DNA，所述蛋白质由与上述SEQ ID NO的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列组成，只要所述DNA编码的蛋白质具有促进植物生长的活性即可。
在本说明书中，在“与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列”中的“同一性”为90％以上，优选95％以上，更优选98％以上，和甚至更优选99％以上。
本文所用的氨基酸序列的“同一性”，在两个氨基酸序列(或核苷酸序列)的比对中，是指当按照使相同氨基酸残基数最大化的方式比对两个序列时，所观察到的序列之间的一致性程度。具体地讲，它表示为氨基酸残基总数中相同氨基酸残基数所占的百分比(％)。可使用已知的算法例如BLAST和FASTA求出同一性％。当引入空位时，例如，当使用FASTA时，空位数也加到氨基酸残基总数中。
可通过PCR扩增以核酸片段的形式获得用于本发明的DNA，使用来自cDNA文库或基因组DNA文库等的核酸作为模板，并使用根据SEQ ID NO：1-8的任一序列而设计的引物。此外，可通过进行杂交以核酸片段的形式获得所述DNA，使用来自上述文库等的核酸作为模板，并使用为所述DNA一部分的DNA片段作为探针。或者，可通过各种核酸序列合成方法例如本领域已知的化学合成方法以核酸片段的形式合成所述DNA。
可通过本领域已知的技术来修饰编码上述蛋白质的DNA，对上述DNA或氨基酸进行缺失、添加和取代。可通过例如Kunkel方法或缺口双链体方法在DNA中引入突变，并且使用利用位点特异性诱变方法的突变引入试剂盒(Mutan-K(Takara Bio Inc.)和LA PCR体外诱变试剂盒(Takara Bio Inc.))等引入突变。
诸如上述PCR、杂交和重组等常规技术描述于例如Sambrook，J.等(1989)，Molecular Cloning：Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press和Ausubel等(1995)，Short Protocols In Molecular Biology，第3版，John Wiley & Sons，Inc.。
(2)重组载体
可通过将上述(a)至(g)的任何DNA引入合适载体，构建用于植物转化的本发明重组载体。作为载体，优选使用基于pBI的载体、基于pPZP的载体、基于pSMA的载体等，所述载体允许将靶DNA通过土壤杆菌引入植物。具体地讲，优选使用基于pBI的二元载体或中间载体，其实例包括pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3和pBIG2113。二元载体是在大肠杆菌(Escherichia coli)和土壤杆菌中可复制的穿梭载体。当用含有二元载体的土壤杆菌感染植物时，在载体上位于由LB序列和RB序列组成的边界序列之间的DNA整合到植物的核DNA上。此外，其它载体的实例包括能允许将DNA直接引入植物的基于pUC的载体，例如pUC18、pUC19和pUC9。此外，其它载体的实例包括植物病毒载体例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、豆金色花叶病毒(BGMV)和烟草花叶病毒(TMV)。
当使用基于二元载体的质粒时，将靶DNA插入到上述二元载体的边界序列之间(LB和RB之间)，由此得到的重组载体在大肠杆菌中增殖。然后，通过电穿孔等，将由此增殖的重组载体引入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101、C58、LBA4404、EHA101和EHA105中或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)LBA1334等中，使用由此获得的土壤杆菌将靶DNA引入植物中。
为了将靶DNA插入载体中，采用以下方法等：即用合适的限制酶切割纯化DNA，然后通过将所得DNA插入合适载体DNA的限制位点或多克隆位点中，使所述DNA与载体连接。
此外，有必要将靶DNA整合到载体上，其整合方式使得所述DNA可发挥其作用。在这一点上，当使用基于二元载体的质粒时，需要启动子、增强子、终止子、复制起点(例如源自Ti质粒或Ri质粒的复制起点)，可将选择标记基因等连接在靶DNA的上游、内部或下游。
启动子不一定是来自植物的，只要其为能在植物细胞中起作用并在特定组织内或在植物的特定发育时期诱导表达的DNA即可。其具体实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱-合酶基因启动子、玉米泛蛋白启动子、水稻肌动蛋白启动子和烟草PR蛋白启动子。
增强子的实例包括含有CaMV 35S启动子上游序列的增强子区、转录增强子E12和Ω序列，所有这些都用于提高靶DNA的表达效率。
终止子可以是能终止由启动子驱动的DNA转录的序列，其实例包括胭脂碱-合酶(NOS)基因的终止子、章鱼碱-合酶(OCS)基因的终止子和CaMV 35S RNA基因的终止子。
选择标记基因的实例包括潮霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、双丙氨磷抗性基因和二氢叶酸还原酶基因。
(3)转化植物和产生植物的方法
可通过将上述(a)至(g)的任何DNA或上述重组载体引入靶植物，产生本发明的转化植物。在本发明中，“DNA的引入”是指通过例如已知的基因工程方法将靶DNA引入上述宿主植物细胞，其方式使得所述DNA可表达。由此引入的DNA可整合在宿主植物基因组DNA中或存在于外源载体内。
可通过已知方法引入DNA或重组载体，其实例包括土壤杆菌方法、PEG-磷酸钙方法、电穿孔、基因枪方法和显微注射方法。土壤杆菌方法包括使用原生质体的方法，使用组织片段的方法和使用完整植株的方法(植物体法(in planta method))。使用原生质体的方法可通过以下两种方法进行：将原生质体与含有Ti质粒或Ri质粒的土壤杆菌(分别是根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌)共培养，以及将原生质体与土壤杆菌的原生质球融合(原生质球方法)。使用组织片段的方法可通过以下方法进行：感染目标植物的无菌培养的叶圆片或感染愈伤组织(未分化的培养细胞)等。此外，通过用土壤杆菌直接处理吸涨种子、幼小植物(幼苗)、盆栽植物等，使用种子或植物体的植物体法是可行的。可以按照以下文献的描述，实施上述植物转化方法：″Shinpan Modelshokubutu no jikken protocol，Idengakutekishuho kara genome kaiseki made(文字翻译：New edition Experimental protocol for model plant，From genetic technique to genome analysis)(Supervised by SHIMAMOTO，Ko and OKADA，Kiyotaka，Shujunsha Co.，Ltd.，2001)″等。
可通过PCR、DNA杂交、RNA杂交等证实DNA是否整合到植物体中。例如，从转化植物制备DNA，设计靶DNA特异性引物，进行PCR。随后，扩增产物进行琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，再用溴化乙啶、SYBR Green溶液等染色，使扩增产物显示出单一条带，由此可证实转化。此外，可使用提前用荧光染料等标记的引物来进行PCR，然后就可检测扩增产物。此外，通过将扩增产物与固相例如微量培养板结合，然后再通过荧光或酶促反应等证实的方法，也可证实转化。
或者，也可通过如下方式来证实转化，即通过产生具有连接在靶DNA下游的不同报道基因的载体，并用具有引入其中的上述载体的土壤杆菌来转化植物，然后测定报道基因的表达，从而证实转化；所述报道基因例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)等的基因。
用于本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，其实例包括但不限于属于以下科属的植物：十字花科(Brassicaceae)(包括拟南芥、卷心菜和油菜籽)、禾本科(Poaceae)(包括水稻、玉米、大麦和小麦)和茄科(Solanaceae)(包括茄子、烟草和马铃薯)。
在本发明中，经历转化的植物材料可以是任何植物器官和组织，例如茎、叶、种子、胚、胚珠、子房、芽、花药和花粉；上述植物器官和组织的片段；未分化的愈伤组织；和培养的植物细胞，例如经酶处理以除去愈伤组织的细胞壁而得到的原生质体。此外，当使用植物体法时，可使用吸涨种子和完整植物体。
当培养的植物细胞接受转化时，为了从所得转化细胞再生转化体，可通过已知的组织培养方法再生器官或生物体。本领域技术人员可采用从植物细胞再生出植物体的众所周知的方法，容易地进行如上所述的再生。例如，从植物细胞到植物体的再生可以进行如下。
当植物组织或原生质体用作进行转化的植物材料时，将植物材料或原生质体培养在愈伤组织形成培养基中，所述培养基是通过添加无机元素、维生素、碳源、作为能源的糖、植物生长调节物(植物激素，例如生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯和油菜素类固醇)而配制的，然后再灭菌。然后让植物组织或原生质体形成去分化愈伤组织，其将会增殖为无定形团块(在下文称为“愈伤组织诱导”)。将由此形成的愈伤组织移至含有植物生长调节物例如生长素的新鲜培养基中，让其进一步增殖(继代培养)。
当在固体培养基例如琼脂上进行愈伤组织诱导并通过例如液体培养进行继代培养时，每种培养都可大量有效进行。然后，将通过继代培养而增殖的愈伤组织培养在合适条件下，以诱导器官再分化(以下称为“再分化诱导”)，最终再生出完整植物体。可通过适当设定培养基成分组成(例如植物生长调节物包括生长素和碳源)、其数量、光照、温度等，进行再分化诱导。形成不定胚、不定根、不定芽、不定茎、不定叶等，通过上述再分化诱导，使这些不定器官生长成为完整植物体。或者，可将这些不定器官贮存起来，直到要将它们培育成为完整植物体(例如以包衣的人工种子、干燥胚、以及冻干细胞和组织的形式)。
本发明的转化植物包括具有引入其中的上述(a)至(g)的任何DNA的任何完整植物体、植物体的一部分(例如叶、花瓣、茎、根和花粉)、培养的植物细胞(例如愈伤组织和原生质体)和种子。此外，它还包括所述植物体、所述植物体的一部分、培养细胞经有性或无性繁殖而得到的后代植物体和后代植物体的种子。可通过从转化植物获取可繁殖材料例如种子和原生质体，并栽培或培养所述可繁殖材料，而大量产生本发明的转化植物。
可通过上述(a)至(g)的任何DNA的过量表达，来促进以上获取的转化植物的生长、尤其是伸根长和/或叶面积的增加。结果，根将会伸入地下，因此可增加抗倒伏性和耐旱性并且在不良营养下也可能栽培所述植物。此外，因为也可促进叶生长并促进光合作用活性，所以最终可促进完整植株生长。
                        实施例1
根据以下实施例进一步具体描述本发明；然而，本发明并不限于这些实施例。
(1)通过FOX搜寻系统产生水稻FOX品系
在本实施例中，使用将SfiI克隆位点引入组成型表达载体pBIG2113N而获得的pBIG2113SF，筛选水稻全长cDNA(Taji，T.等，Plant J.，2002.24(4)：第417-426页和Becker，D.等，Nucleic Acid Res.，1990.18(1)：第203页)。
(i)标准化水稻全长cDNA混合物的产生
通过帽子捕获法(CAP trapper method)，从水稻中制备全长cDNA。将所得cDNA克隆到Lambda ZAP或Lambda pLC-1-B的SfiI限制位点之间的位点中(参考文献：Seki M.等.Plant J.，15，707-720(1998))。用载体序列在5′端和3′端处对序列进行测序，将cDNA分组并鉴定了20,000个独立克隆(参考文献：Seki M.等.Plant Physiol.Biochem.39，211-220(2001))。然后，取出0.5μl由每个克隆制备的50ng/μl等分试样，并将所有等分试样混合在一个试管中。从所述混合物中取出1μl等分试样，用它来转化20μl电感受态细胞DH10B(Gibco BRL)。然后，将生长在含有Amp的琼脂培养基上的约200,000个独立菌落混合在一起，从中收集质粒。提供由此获得的质粒，作为标准化的水稻全长cDNA混合物。
(ii)水稻FOX文库的产生
将标准化的水稻全长cDNA混合物(2μg)和700μg pBIG2113SF混合在一起，并同时用SfiI完全切割。切割后，通过异丙醇沉淀来浓缩所切产物。将浓缩产物溶于8μl水中，将1μl 10×缓冲液和1μl T4连接酶与其混合，让反应在16℃进行一整天。将反应液(2μl)与40μl电感受态细胞DH10B混合并进行转化。
然后，将生长在含有卡那霉素(Km)的琼脂培养基上的约150,000个独立菌落混合在一起，从中收集质粒。将由此收集的质粒溶液(2μl)与40μl电感受态土壤杆菌细胞GV3101混合并进行转化。将生长在含有Km的琼脂培养基上的约150,000个独立菌落悬浮在LB液体培养基中，向其中加入甘油，制备15％甘油溶液，将其贮存于-80℃。提供由此所得的甘油溶液作为水稻FOX文库。
(iii)水稻FOX品系的产生
将上述水稻FOX文库的约200,000个菌落培养并悬浮于浸渍溶液中，用所述溶液进行野生型拟南芥(生态型：哥伦比亚型(Colombia))的花序浸渍(floral dipping)。收获种子(T1种子)并让其在含有潮霉素的营养不足的培养基BAM上发芽，然后仅将潮霉素抗性植株(约23,000个品系)移栽到土壤中。
(2)用根弯曲测定筛选水稻FOX品系的T2代
从上述(1)(iii)的移栽到土壤的植物中收获种子(T2种子)。对T2种子和野生型种子进行消毒并播种在1.2％琼脂培养基(含有维生素B5的MS培养基)中。然后，通过用铝箔包住培养基，对种子进行暗处理，再通过将培养基放在4℃过约1周而进行春化处理。随后，使培养基保持垂直，这样根将会沿着琼脂培养基表面伸长，让种子在连续白光下在22℃生长3天。将具有已生长的根的琼脂培养基水平放置，并在黑暗中用约2.3Wm-2UV-B照射(约8kJm-2)。随后，使培养板保持垂直并旋转90度，以改变根伸长方向，并让根在22℃中在连续白光下再次生长3天(图1)。
评价UV-B照射后3天根伸长的长度。用图像分析软件(Image J，National Institute for Health，USA)，通过定量测定根长度来判断UV-B抗性。结果，从接受根弯曲测定的7034个水稻FOX品系中分离出49个品系，作为候选UV-B抗性品系。
(3)cDNA的再次克隆和插入水稻FOX品系中的水稻全长cDNA的测序
从上述(2)选出的每个候选水稻FOX品系中采集约2片莲座叶(约200mgfw)，从中提取基因组DNA。对所述DNA进行PCR反应。PCR反应液的组成示意如下，反应条件如下：40个循环，94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，72℃4分钟。
反应液组成：
引物(100pM)  2×0.25μl
dNTP(200μM) 4μl
缓冲液(×2)  25μl
聚合酶       0.5μl
基因组DNA    10μl
蒸馏水       10μl
共计         50μl
用于PCR的引物如下：
GTACGTATTTTTACAACAATTACCAACAAC(SEQ ID NO：9)
GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAA(SEQ ID NO：10)
从琼脂糖凝胶中收集PCR产物，再与pBIG2113SF混合。将所得物用SfiI完全切割，再通过异丙醇沉淀，接着用T4连接酶处理。然后，用所得混合物转化大肠杆菌。选择插入PCR片段的质粒，用上述引物鉴定插入的cDNA片段的核苷酸序列。
(4)促进根伸长的表型的证实
将拟南芥转化体的T2种子(其中再次引入上述(3)所获得的水稻全长cDNA)和野生型种子，各约20粒种子，经过消毒，然后播种在1.2％琼脂培养基上。然后，通过用铝箔包住培养基，对种子进行暗处理，再通过将培养基放在4℃过约1周而进行春化处理。随后，使培养基保持垂直，这样根将会沿着琼脂培养基表面伸长，让种子在连续白光下在22℃生长7天。随后，拍摄植物体图像，用上述图像分析软件测定下胚轴和根到根尖之间边界的长度。
在再次转化体中重现了促进根伸长的表型。水稻FOX品系1-4的根长度图像和图表见图2和图3。在图2的图A中，野生型的根长度是15.49mm(平均值)，而水稻FOX品系1的根长度是18.36mm(平均值)。在图2的图B中，野生型的根长度是13.37mm(平均值)，而水稻FOX品系2的根长度是18.76mm(平均值)。在图3的图C中，野生型的根长度是16.98mm(平均值)，而水稻FOX品系3的根长度是22.25mm(平均值)。在图3的图D中，野生型的根长度是13.97mm(平均值)，而水稻FOX品系4的根长度是16.78mm(平均值)。
引入上述水稻FOX品系的水稻全长cDNA的序列是SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7，其氨基酸序列是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。
(5)叶面积增加的表型的证实
将拟南芥转化体的T2种子(其中再次引入上述(3)所获得的水稻全长cDNA)和野生型种子，各约20-30粒种子，播种在耕种土壤中，并通过在4℃放置4天进行春化处理。然后，种子在22℃培养，用16小时光周期。在光条件下培养开始后15天，拍摄植物体图像，用上述图像分析软件测定叶面积。
在再次转化体中重现了叶面积增加的表型。水稻FOX品系1和2的叶面积图像和图表见图4。在图4的图A中，野生型的叶面积是3.30mm2(平均值)，而水稻FOX品系1的叶面积是5.22mm2(平均值)。在图4的图B中，野生型的叶面积是3.31mm2(平均值)，而水稻FOX品系2的叶面积是5.11mm2(平均值)。
工业实用性
其功能按照本发明来阐明的基因涉及植物生长，尤其是根伸长。在植物中的所述基因过量表达可增加植物吸收营养的能力，使植物能在营养不足的条件下耕种，并能增加抗倒伏和耐旱性。具体地讲，通过增大主要部分为根的农产品例如根类蔬菜的可食用部分，可增加所述农产品作为食用作物的商业价值。
此外，所述基因也涉及叶面积的增加。在植物中，所述基因的过量表达可促进地上部分的生长。具体地讲，通过增加地上组织量而增加叶菜类蔬菜的可食用部分，可增加叶菜类蔬菜作为食用植物的商业价值。
如上所述，通过转化使涉及伸根长和叶面积增加的基因过量表达，可最终产生其生长整体促进的植物。本发明适用于任何已经建立起转化技术的植物。
本说明书所引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用全部结合到本文中。
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Claims (8)

1.一种包含引入其中的以下(a)至(g)的任何DNA的转化植物：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA；
(b)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加；并且所述DNA编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(c)DNA，所述DNA包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(d)DNA，所述DNA在严格条件下杂交于包含与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA互补的核苷酸序列的DNA，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(e)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(f)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述序列中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性；和
(g)编码蛋白质的DNA，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性。
2.权利要求1的转化植物，其中所述促进植物生长的活性是促进根伸长的活性。
3.权利要求1或2的转化植物，其中所述促进植物生长的活性是增加叶面积的活性。
4.权利要求1-3中任一项的转化植物，所述转化植物是单子叶植物或双子叶植物。
5.权利要求1-4中任一项的转化植物，所述转化植物是植物体、植物体的一部分、培养的植物细胞或种子。
6.一种包含以下(a)至(g)中任何DNA的重组载体：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA；
(b)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加；并且所述DNA编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(c)DNA，所述DNA包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(d)DNA，所述DNA在严格条件下杂交于包含与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA互补的核苷酸序列的DNA，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(e)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(f)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述序列中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性；和
(g)编码蛋白质的DNA，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性。
7.一种产生转化植物的方法，所述方法包括将以下(a)至(g)的任何DNA引入植物细胞中并培养所述植物：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA；
(b)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA，所述序列中有一个或若干个核苷酸缺失、取代或添加；并且所述DNA编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(c)DNA，所述DNA包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(d)DNA，所述DNA在严格条件下杂交于包含与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA互补的核苷酸序列的DNA，并且编码具有促进植物生长活性的蛋白质；
(e)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(f)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述序列中有一个或若干个氨基酸缺失、取代或添加，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性；和
(g)编码蛋白质的DNA，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有促进植物生长的活性。
8.权利要求7的方法，其中使用权利要求6的重组载体引入所述DNA。
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