CN116218896A - 利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法，所述方法包括利用Cas12i和gRNA在大豆中进行基因编辑的步骤，所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆的GmFAD2‑1A基因和GmFAD2‑1B基因。

Description

利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及在大豆中进行基因编辑的方法，尤其涉及利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法。
背景技术
大豆是人类主要油脂和蛋白质的来源，是世界最重要的经济作物之一，也是人类植物油和植物性蛋白的主要来源。随着生活水平的提高以及饮食结构的改善，人们对优质大豆油的需求日益增长，培育高品质大豆成为大豆育种的重要目标之一。
CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3’-NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑。该技术不仅对基因功能的研究提供了新思路，更广泛的应用于生物医药的研发和农作物的遗传改良等领域。目前，CRISPR/Cas9系统已经成功应用在拟南芥、水稻、玉米、小麦、大豆等植物中。
CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5’-TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5’-TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
Cas12i也属于V型CRISPR/Cas系统，中国专利(CN111757889B，公告日期：20210525)公开了一种V型Cas酶(Cas12f.4)，在本发明中，将Cas12f.4定义为Cas12i。如CN111757889B记载可知，该Cas酶(Cas12f.4)对于单子叶植物玉米表现出了一定的编辑活性，但是，大豆不同于玉米，属于双子叶植物。发明人研究该酶在双子叶植物(例如，拟南芥、大豆等植物)的编辑活性时，发现该酶针对双子叶植物的编辑效率较低，甚至在某些位点无法体现出编辑活性。
发明内容
本发明目的是提供一种利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法。
一方面，本发明提供了利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法，所述方法包括利用Cas12i和gRNA在大豆中进行基因编辑的步骤，所述gRNA靶向区域大豆的GmFAD2-1A基因和GmFAD2-1B基因。
在一个实施方式中，所述Cas12i的氨基酸序列选自以下I-III任一种：
I、Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且基本保留了SEQ ID No.1的生物学功能；
II、Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)，并且基本保留了SEQ ID No.1的生物学功能；
III、Cas12i包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或Cas12i的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
在一个实施方式中，所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变；优选的，第369位氨基酸突变为精氨酸(Arg，R)，第433位氨基酸突变为精氨酸(Arg，R)。上述Cas12i为突变的Cas12i，其为SEQ ID No.1第369位氨基酸和第433位氨基酸同时发生突变(均突变为R)的突变蛋白，上述突变的Cas12i蛋白与SEQ ID No.1所示的野生型Cas12i相比，显著的提高了编辑活性。
在一个实施方式中，所述gRNA包括第一区段和第二区段；所述第一区段又称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复(Direct Repeat)序列”；所述第二区段又称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”，或者“靶向靶序列的引导序列”。
所述gRNA的第一区段、“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复序列”能够与本发明的Cas12i蛋白相互作用，从而使Cas12i蛋白和gRNA形成复合物。本发明gRNA经过靶向核酸的靶向序列的作用将其相互作用的Cas12i蛋白引导至靶核酸内的特异性核苷酸序列。
本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列。换言之，本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段经过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可改变，或可被修饰以杂交靶核酸内的任何希望的序列。
优选的，所述gRNA从5’至3’方向包含第一区段和第二区段。
本发明中，所述第二区段还可以理解为与靶序列杂交的引导序列。
在一个实施方式中，所述gRNA中靶向靶序列的引导序列为ccucauugcauggccaaucuauu(SEQ ID No.2)；所述gRNA中的同向重复序列为agagaaugugugcauagucacac(SEQ ID No.3)或cucugaccac cugagagaau gugugcauag ucacacgguauaacaacuuc gacgagcucu(SEQ ID No.4)。
在其他的实施方式中，所述gRNA的同向重复序列在SEQ ID No.3的基础上，还可以具有碱基缺失、取代或添加，只要其能保证与Cas12i的结合能力即可，例如，中国专利申请(CN113337502A)中记载的“agagaaugugugcauagucaacac”、“agagaaugugugcauagucuacac”、“agagaaugugugcauaguccacac”或“agagaaugugugcauagucgacac”。
在一个实施方式中，本发明的基因编辑的方法包括向大豆植物细胞、大豆种子、大豆植物、大豆植物组织或大豆植物部分中递送Cas12i和gRNA的步骤。
上述递送可采用本领域已知的任何方法进行递送。此类方法包括但不限于，转化、转染、电穿孔、脂转染、显微注射、声孔效应、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状转染、热激转染、核转染、磁转染、脂转染、穿刺转染、光学转染、试剂增强性核酸摄取、以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒、载体、病毒载体、人工病毒体等的递送。
在一些实施方式中，使用一种或多种AAV载体、慢病毒载体、纳米颗粒或其组合递送Cas12i和gRNA中的一种或多种组分。
在一个实施方式中，通过农杆菌转化将Cas12i和gRNA递送到大豆植物细胞、大豆种子、大豆植物、大豆植物组织或大豆植物部分中。
另一方面，本发明提供了一种工程化的非天然存在的载体系统，或者是CRISPR-Cas系统，该系统包括Cas12i蛋白或编码所述Cas12i蛋白的核酸序列以及编码上述指导RNA(gRNA)的核酸。
在一种实施方式中，所述编码所述Cas12i蛋白的核酸序列和编码指导RNA的核酸是人工合成的。
上述gRNA在大豆细胞中靶向GmFAD2-1A基因和GmFAD2-1B基因。并且引导Cas12i蛋白到达所述基因组座位部位，对靶序列进行修饰、编辑或切割，由此该GmFAD2-1A基因和GmFAD2-1B基因的表达被改变或修饰。
本发明还提供了一种工程化的非天然存在的载体系统，该载体系统可以包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：
a)第一调控元件和上述gRNA，第一调控元件可操作地与gRNA连接，
b)第二调控元件和上述Cas12i，第二调控元件可操作地与所述Cas12i蛋白连接；
其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。
所述第一和第二调控元件包括启动子(例如，组成型启动子或诱导型启动子)、增强子(例如35S promoter或35S enhanced promoter)、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。
在一些实施方案中，所述系统中的载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体)，还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施例中，本文提供的系统处于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统是纳米颗粒，脂质体，外体，微泡和基因枪。
在一个实施方式中，所述Cas12i蛋白连接有一个或多个NLS序列。在一个实施方式中，所述NLS序列连接至所述蛋白的N端和/或C端。
另一方面，本发明涉及一种工程化的CRISPR系统，所述系统包含上述Cas12i蛋白以及上述指导RNA。
另一方面，本发明提供了一种复合物或者组合物，其包含：
(i)蛋白组分，其为上述Cas12i蛋白；和
(ii)核酸组分，其为上述gRNA。
所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。
另一方面，本发明提供了上述载体系统、CRISPR系统、上述复合物或者组合物在对大豆进行基因编辑中或在制备高油酸大豆植株的应用。
另一方面，本发明还提供了一种制备高油酸大豆植株的方法，所述方法包括利用上述Cas12i和gRNA在大豆植物细胞、大豆种子、大豆植物、大豆植物组织或大豆植物部分中进行基因编辑，从而得到经编辑的高油酸大豆植株的步骤。
进一步的，所述基因编辑为对大豆的GmFAD2-1A基因和GmFAD2-1B基因进行基因编辑。
在一个实施方式中，经编辑之后的GmFAD2-1A基因的核酸序列如SEQIDNo.5所示；经编辑之后的GmFAD2-1B基因的核酸序列如SEQIDNo.6所示。
另一方面，本发明还提供了一种高油酸大豆植株，所述高油酸大豆植株是采用上述基因编辑方法或制备高油酸大豆植株的方法制备得到的。
另一方面，本发明还提供了一种制备高油酸大豆种子的方法，所述方法包括利用上述高油酸大豆植株制备高油酸大豆种子的步骤。
另一方面，本发明还提供了一种高油酸大豆种子，所述高油酸大豆种子是采用上述制备高油酸大豆种子的方法制备得到的。
本发明所述的高油酸大豆，是指编辑之后的大豆种子的油酸在总脂肪酸的含量为至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
本发明编辑之后的大豆种子的油酸在总脂肪酸中的含量与野生型大豆种子相比，提高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。
另一方面，本发明还提供了一种制备大豆植物的方法，所述方法包括利用上述高油酸大豆种子或高油酸大豆植株与其他的大豆进行杂交从而制备大豆植物的步骤。
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。
术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。
如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。
术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。
在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。
如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。
在某些情况下，引导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。本发明涉及的序列如下：
序列号(SEQ ID No.) 序列描述
1 Cas12i野生型氨基酸序列
2 gRNA引导序列
3 gRNA同向重复序列
4 gRNA同向重复序列
5 编辑之后的GmFAD2-1A基因序列
6 编辑之后的GmFAD2-1B基因序列
7 Cas12i野生型DNA序列
本发明的主要优点：
本发明通过基于Cas12i的CRISPR基因编辑技术，在大豆中成功实现了大豆中GmFAD2-1A/B基因编辑，并且编辑后的大豆种子中的油酸含量得到显著性提高。
附图说明
图1.包含Cas12i和gRNA的载体示意图。
图2.编辑植株和野生型对照大豆油酸种子油酸含量对照图。
图3.Cas12i蛋白编辑效率的验证，其中，1为野生型Cas12i，2为N369R和S433R组合突变的Cas12i蛋白。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、通过基于Cas12i的CRISPR基因编辑技术在大豆中进行基因编辑
1、基因编辑载体构建
本实施方式中采用Cas12i(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)在大豆中进行基因编辑。
根据大豆中GmFAD2-1A、GmFAD2-1B以及GmFT5α基因的编码序列设计针对Cas12i的gRNA，设计的gRNA序列如下：
gRNA gRNA的引导序列(5’至3’) PAM 所靶向的靶基因
gRNA 1 cuguaccaauacacgcccuucuc ttc GmFAD2-1A/B
gRNA 2 ccucauugcauggccaaucuauu ttc GmFAD2-1A/B
gRNA 3 ucuccacagugccuuguaaaaug ttc GmFAD2-1A/B
gRNA 4 caaacacaaagccaccauucacu ttc GmFAD2-1A/B
gRNA 5 uggacggauugcauucauag tta GmFT5α
上述gRNA的同向重复序列为agagaaugugugcauagucacac(5’至3’)。上述gRNA1-gRNA5从5’至3’依次包括上述同向重复序列以及各自的引导序列。
根据靶点设计退火引物，以gRNA2为例：上游引物5’至3’为acacgaatgcttccaagatctcca，下游引物5’至3’为ggcctggagatcttggaagcattc。引物退火后，通过Golden Gate法连接基因编辑骨架载体，得到基因编辑载体，载体示意图如图1所示。所述基因编辑载体上包含Cas12i蛋白以及上述gRNA，其中，启动Cas12i蛋白的启动子为EF1α启动子，gRNA的启动子为U6启动子。
2、重组菌获得
1)转化大肠杆菌
将步骤1中的基因编辑载体转化大肠杆菌，对转化的大肠杆菌进行菌液PCR，选择PCR条带大小正确的扩增产物测序，测序结果正确的大肠杆菌即含有基因编辑载体的重组大肠杆菌。
2)转化农杆菌
将步骤1)含有基因编辑载体的重组大肠杆菌进行培养后提质粒DNA，加入到农杆菌感受态细胞中，冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰上放置5min；
取出离心管，加入700μl培养液(无抗生素)，28℃振荡培养2～4h；
取出菌液与含相应抗生素的培养基平板上涂板，在培养箱中倒置培养，2天左右菌落可见，对菌落按步骤1)中的方法进行PCR，并对扩增产物进行测序，测序结果正确的农杆菌即含有基因编辑载体的重组农杆菌。
3、植物遗传转化
1)大豆种子灭菌：
将挑选好的大豆种子放在干燥器中的培养皿里，向干燥器中装有150ml次氯酸钠的烧杯中贴壁缓慢加入10ml浓盐酸，迅速关闭干燥器的盖子。用次氯酸钠和浓盐酸产生的氯气灭菌16h。
2)种子发芽：
将步骤1)已灭菌种子种化向下插进MS培养基，插入培养基的深度占种子宽度的1/3～1/2，于25℃暗培养或光下培养过夜。
3)农杆菌菌液制备：
取储藏在-80℃冰箱中的菌液，在含有抗生素的YEP平板上划菌(步骤2的2)中含有基因编辑载体的重组农杆菌)，28℃培养2天，挑取菌落接种于50ml离心管中的5ml YEP液体培养基中，28℃振荡过夜；取300μl菌液，加到250ml YEP液体培养基中，过夜培养至OD600＝0.6左右，4000rpm离心10min，用侵染液重新稀释至OD600＝0.6左右备用。
4)子叶节划伤、侵染和共培养：
步骤2)的种子发芽1天后，在下胚轴靠近子叶节3～5mm处，横切一刀，然后沿着两片子叶中间纵切，不要伤到子叶，将下胚轴纵向切开，去掉顶芽，在子叶节部位分别纵向轻划1～5刀，迅速放入步骤3)中事先制备的农杆菌侵染液中，侵染1～4小时左右，取出放到铺有滤纸的共培养培养基上，于22℃共培养3～5天。
5)恢复培养：
将共培养之后的外植体插到恢复培养基中，培养皿用3M的透气胶带封口后放置在光下，25℃左右恢复培养5～7天。
6)筛选培养：
将恢复之后的外植体伤口处插入筛选培养基，25℃左右光下筛选，每10天继代一次，继代3～5次。
7)芽伸长培养：
将筛选后的外植体，切掉子叶，带丛生芽的部分移到芽伸长培养基，每10天继代一次，光照和温度同筛选培养。
8)生根和移苗：
当芽伸长培养基中的植株伸长到3cm上(或有两个三出复叶)后，沿基部切下插入灭菌的营养土中，浇生根培养液生根。当根长出后，移到事先浇透水的土壤中，覆盖塑料薄膜，一周后剪开塑料薄膜炼苗，两周后如果有新叶长出，完全去掉塑料薄膜，得到E0代转化苗。
4、大豆转化株检测及表型观察
在E0代转化苗中通过PCR和测序检测并筛选编辑苗，在气候室种植，并以野生型为对照，观察其表型变化。经过2-3代自交扩繁，增加突变类型群体，以获得纯合的无外源基因插入的编辑苗。
5、结果
针对上述gRNA1-gRNA5分别检测大豆编辑植株的情况，结果显示，gRNA1、gRNA3、gRNA4和gRNA5在大豆中没有检测到编辑事件，只有靶向GmFAD2-1A/B的gRNA2检测到了编辑事件，编辑效率在1％-2％。
gRNA2编辑的大豆编辑植株的GmFAD2-1A/B的基因类型为：
所述编辑植株的GmFAD2-1A基因与野生型GmFAD2-1A基因相比，缺失了第262-288位的碱基，编辑植株的GmFAD2-1A的基因序列如SEQ ID No.5所示。
所述编辑植株的GmFAD2-1B基因与野生型GmFAD2-1B基因相比，在第258-286位缺失了部分碱基并插入了部分碱基，编辑植株的GmFAD2-1B的基因序列如SEQ ID No.6所示。
对上述大豆编辑植株的表型鉴定：
取E1代上述编辑植株的大豆种子2g粉碎后采用气相色谱检测油酸含量，结果如图2所示，上述编辑植株的大豆种子中的油酸占总脂肪酸的比例达到80％以上，而野生型植株的大豆种子的油酸占总脂肪酸的比例只有20％左右。
实施例2、利用优化的Cas12i在大豆中进行基因编辑
实施例1中的Cas12i虽然可以在gRNA2检测到编辑事件，但其编辑效率在1％-2％左右，编辑效率并不高。申请人通过生物信息学方法对潜在的Cas12i3与目标序列相互结合的氨基酸进行定点突变，野生型Cas12i的核酸序列如SEQ ID No.7所示。定点突变的方法参照本领域常用的方法，本实施例中通过基于PCR的定点诱变产生Cas蛋白的变体。具体的方法是以突变的位点为中心将Cas12i3蛋白的DNA序列设计分成两部分，设计两对引物分别扩增这两部分DNA序列，同时引物上引入需要突变的序列，最后通过Gibson克隆的方式将两个片段装载到pcDNA3.3-eGFP载体上。突变体的组合则通过将Cas12i3蛋白的DNA拆分成多段，使用PCR、Gibson clone实现构建。片段扩增试剂盒：TransStart FastPfu DNA Polymerase(含2.5mM dNTPs)，具体实验流程详见说明书。胶回收试剂盒：
Figure BDA0003731932190000111
Gel DNAExtraction Mini Kit，具体实验流程详见说明书。载体构建所用试剂盒：pEASY-BasicSeamless Cloning and Assembly Kit(CU201-03)，具体实验流程详见说明书。本实施方式中所涉及的突变氨基酸位点以及所采用的引物序列如下表所示：
Figure BDA0003731932190000121
本实施方式中，通过定点突变，获得了N369R和S433R同时发生突变的Cas12i的突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，第369位的N突变为R，第433位的S突变为R。
针对上述突变的Cas12i蛋白在动物细胞中验证其基因编辑的活性，针对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)FUT8基因设计靶点，FUT8-Cas-XX-g3：
Figure BDA0003731932190000122
CAGCCAAGGTTGTGGACGGATCA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。载体pcDNA3.3经改造后带有EGFP荧光蛋白及PuroR抗性基因。经酶切位点XbaI和PstI插入SV40 NLS-Cas-XX融合蛋白；经酶切位点Mfe1插入U6启动子及gRNA序列。CMV启动子启动融合蛋白SV40 NLS-Cas-XX-NLS-GFP表达。蛋白Cas-XX-NLS与蛋白GFP用连接肽T2A进行连接。启动子EF-1α启动嘌呤霉素抗性基因表达。铺板：CHO细胞融合度至70-80％进行铺板，12孔板中接种细胞数为8*10^4细胞/孔。转染：铺板24h进行转染，100μl opti-MEM中加入6.25μlHieff TransTM脂质体核酸转染试剂，混匀；100μlopti-MEM中加入2.5ug质粒，混匀。稀释好的Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂与稀释后的质粒混合均匀，室温孵育20min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。加嘌呤霉素筛选：转染24h加嘌呤霉素，终浓度10μg/ml。嘌呤霉素处理24h更换成正常培养基继续培养24h。
提DNA、PCR扩增编辑区附近、送hiTOM测序：细胞经胰酶消化处理后进行收集，经细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(百泰克)进行基因组DNA提取。对基因组DNA扩增靶点附近区域。PCR产物进行hiTOM测序。测序数据分析，统计靶点位置上游15nt、下游10nt范围内的序列种类及比例，统计序列中SNV频率大于/等于1％或非SNV的突变频率大于/等于0.06％的序列，得到Cas-XX蛋白对靶点位置的编辑效率。CHO细胞FUT8基因靶点序列：FUT8-Cas-XX-g3：
Figure BDA0003731932190000131
CAGCCAAGGTTGTGGACGGATCA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。gRNA序列为：AGAGAAUGUGUGCAUAGUCAaCAC CAGCCAAGGUUGUGGACGGAUCA，下划线区域为靶向区，其他区域为DR(同向重复序列)区。
结果如图3所示，N369R和S433R组合突变的Cas12i蛋白与野生型Cas12i蛋白相比，编辑效率有显著的提高，提高了近1倍，针对目标基因编辑的类型包括碱基缺失、碱基插入以及碱基替换等。
利用上述突变的Cas12i蛋白(N369R和S433R)在大豆中进行基因编辑，编辑的靶点为实施例1中的gRNA2，具体的操作方法与实施例1相同，只是将Cas12i蛋白替换为N369R和S433R发生突变的Cas12i蛋白。结果显示，利用突变的Cas12i蛋白在靶向GmFAD2-1A/B的gRNA2中检测到了编辑事件，编辑效率在11％左右，编辑类型包括碱基缺失、碱基插入以及碱基替换等；与野生型的Cas12i蛋白相比，上述突变的Cas12i蛋白可以显著的提高在大豆中的编辑效率。并且，采用突变的Cas12i蛋白所编辑的大豆植株中大豆种子的油酸含量也显著的提高，与实施例1的效果类似，油酸占总脂肪酸的比例达到80％以上。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括利用Cas12i和gRNA在大豆中进行基因编辑的步骤，所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆中的GmFAD2-1A基因和GmFAD2-1B基因；所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第369位氨基酸突变为R，所述第433位氨基酸突变为R。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述gRNA中与靶序列杂交的引导序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括向大豆植物细胞、大豆种子、大豆植物、大豆植物组织或大豆植物部分中递送所述Cas12i和gRNA的步骤。
5.一种载体系统，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：
a)第一调控元件和权利要求1-4任一权利要求中的gRNA，所述第一调控元件可操作地与所述gRNA连接，
b)第二调控元件和权利要求1-4任一权利要求中的Cas12i，所述第二调控元件可操作地与所述Cas12i连接；
其中，组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。
6.一种复合物或者组合物，其包含：
(i)蛋白组分，其为权利要求1-4任一权利要求中的Cas12i蛋白；和
(ii)核酸组分，其为权利要求1-4任一权利要求中的gRNA。
7.一种制备高油酸大豆植株的方法，所述方法包括利用权利要求1-4任一权利要求中的Cas12i和gRNA在大豆植物细胞、大豆种子、大豆植物、大豆植物组织或大豆植物部分中进行基因编辑、从而得到经编辑的高油酸大豆植株的步骤。
8.一种制备高油酸大豆种子的方法，所述方法包括利用权利要求7所述的方法制备得到的高油酸大豆植株制备所述高油酸大豆种子的步骤。
9.一种制备大豆植物的方法，所述方法包括利用权利要求7所述的方法制备得到的高油酸大豆植株与其他的大豆植株进行杂交从而制备所述大豆植物的步骤。
10.权利要求5所述的载体系统，或权利要求6所述的复合物或者组合物在对大豆进行基因编辑中的应用，或在制备高油酸大豆植株中的应用。
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