JP2019523011A - 植物における塩基編集のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
効率的に作物を改良するための必要条件は、現代の品種に容易に導入されてよい新規の遺伝子変異の利用能である。遺伝子研究、特にそのゲノム全体に関する研究は、1ヌクレオチドの変化が、作物における形質の差異についての主な理由であることを示す。1ヌクレオチドの変動は、アミノ酸置換を導き、それにより良好なアレル及び形質を導きうる。ゲノム編集の出現前に、Targeting Induced Local Lesions In Genomes(TILLING)を、作物の改良において多く要求される変異を生み出すための方法として使用できる。しかしながら、TILLINGスクリーニングは、時間を消費し、かつ費用が高く、同定された点変異は、数及びレパートリーの双方においてしばしば制限される。ゲノム編集技術、特にCRISPR/Cas9系に基づくゲノム編集技術は、相同組換え(HR)によって媒介されるDNA修復により特異的なゲノム部位において特定の塩基置換を導入することを可能にする。しかし今日まで、この方法の成功した使用は非常に限られており、それは、おそらく植物における低頻度のHR媒介二本鎖切断修復のためである。さらに、DNA修復のために十分な鋳型を効率的に提供することも困難な作業である。これらの問題は、植物におけるHRを介して効率的かつ容易に標的化点変異を得ることを大きな課題としている。したがって、植物ゲノムにおける標的化点変異を得る新たな方法に対する技術的な強い要求が依然としてある。
第一の態様において、本発明は、以下の(i)〜(v)の少なくとも1つを含む、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを提供する:
i)塩基編集融合タンパク質、及びガイドRNA、
ii)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA、
iii)塩基編集融合タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
iv)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
v)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Cas9ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドRNAは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化できる。
1.定義
本発明において、特に明記されない限り、本明細書において使用される科学的及び技術的用語は、当業者に通常理解される意味を示す。また、本明細書において使用される用語及び実験法は、タンパク質及びヌクレオチド化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学、専門用語に属する全て、及び当該技術分野において一般に使用される慣用的な方法に関する。例えば、本明細書において使用される標準DNA組換え及び分子クローニング技術は、当業者に周知であり、かつ以下の文献において詳細に記載されている:Sambrook, J.、Fritsch, E. F.及びManiatis, T.、Molecular Cloning: ALaboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989(以下「Sambrookら」と示す)。その一方で、関連する専門用語について本発明、定義及び実施例をより良く理解するために、以下を提供する。
本発明は、以下の(i)〜(v)の少なくとも1つを含む、植物のゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを提供する:
i)塩基編集融合タンパク質、及びガイドRNA、
ii)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA、
iii)塩基編集融合タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
iv)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
v)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Cas9ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドRNAは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化できる。
他の態様において、本発明は、本発明の植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを植物中に導入し、それにより、塩基編集融合タンパク質を、ガイドRNAによって前記植物ゲノムにおける標的配列に標的化させ、前記標的配列における1つ以上のCからTへの置換をもたらすことを含む、遺伝子改変植物を製造する方法を提供する。
CENH3は、動物及び植物におけるセントロメアの通常の機能化に必須であるセントロメアヒストンをコードする。TILLING研究は、アラビドプシスCENH3(AtCENH3)のC末端領域におけるいくつかの残基のアミノ酸置換が、作物育種を加速するために有利である一倍体誘導をもたらすことができることを示している。植物CENH3タンパク質のCENP−Aターゲティングドメイン(CATD、図2d)における高保存ロイシン残基のフェニルアラニン(F)での置換は、アラビドプシスにおいて一倍体誘導をもたらすが、一方でオオムギにおいて、セントロメア中へのCENH3の導入は損なわれているが、一倍体誘導は起こらない。本発明は、本発明の塩基編集方法によるZmCENH3におけるCATDドメインの変異、特に保存ロイシン残基の変異を、トウモロコシ一倍体の誘導のために使用することができ、かつトウモロコシ変種の改良において広く使用できることを見出した。
本発明は、本発明の塩基編集方法によってトウモロコシ植物においてZmALS遺伝子(アセト乳酸シンターゼをコードする)を改変し、ZmALSにおいて1つ以上のアミノ酸置換をもたらすことを含む除草剤耐性トウモロコシ植物を製造するための方法であって、1つ以上のアミノ酸置換が除草剤耐性をトウモロコシ植物に付与する方法を提供する。
材料及び方法
pn/dCas9−PBE発現ベクターの構築
APOBEC1、XTEN、nCas9(D10A)、dCas9及びUGI配列を、コムギについてコドン最適化し(配列番号1〜5)、そしてGenScript(Nanjing)から整列した。完全長n/dCas9断片を、AflII−F(AflII制限酵素部位を有する)及びMluI−R(MluI制限酵素部位を有する)のプライマーセットを使用して増幅させた。そのPCR産物を、AflII及びMluIで消化し、そして双方の酵素で消化したpUC57−APOBEC1−XTEN−UGIベクター(ベクターの配列を配列番号10に示す)に挿入して、融合クローニングベクターpUC57−APOBECI−XTEN−n/dCas9−UGIを生成した。そして、BamHI−F及びBsp1047I−Rのプライマーセットを使用して、APOBECI−XTEN−n/dCas9−UGIの断片を増幅させた。その産物を、BamHI及びBsp1047Iで消化し、そしてさらにBamHI及びBsp1047Iで消化したpUbi−GFP(ベクターの配列を配列番号8に示す)に挿入して、融合発現ベクターpn/dCas9−PBEを生成した。
この実験にけるsgRNA標的配列を以下の表1において示す:
pTaU6−BFP−sgRNA、pOsU3−BFP−sgRNA、pZmU3−BFP−sgRNA、pTaU6−LOX2−S1−sgRNA、pTaU6−LOX2−S2−sgRNA、pTaU6−LOX2−S3−sgRNA、pOsU3−CDC48−sgRNA、pOsU3−NRT1.1−sgRNA、pOsU3−SPL14−sgRNA、及びpZmU3−CENH3−sgRNA。
pUbi−BFPmの配列を、配列番号9において示す。BFPのアミノ酸配列を、配列番号17において示す。
APOBECI−XTEN−d/nCas9−UGI断片を、Gibsonクローニング法によりGibson−F及びGibson−RのプライマーセットでStuI及びSacIで消化したpHUE411(Addgen #62203)に融合させ、sgRNA標的部位を有さないベクターpHUE411−APOBECI−XTEN−d/nCas9−UGIを生成した。OsCDC48標的配列を含む一対のオリゴヌクレオチド(oligos)を合成し、アニールし、そしてBsaIで消化したpHUN411ベクターにクローニングして、pHUE411−sgRNA−CDC48を得た。そして、PmeI及びAvrIIでのpHUE411−sgRNA−CDC48の消化から得られた断片を、これもPmeI及びAvrIIで消化したpHUE411−APOBECI−XTEN−d/nCas9−UGIに挿入し、最終的にアグロバクテリウム媒介形質転換ベクターpAG−n/dCas9−PBE−CDC48−sgRNAを得た。
コムギBobwhite変種、イネNipponbare及びトウモロコシ近交系変種Zong31をこの研究において使用した。プロトプラスト形質転換を以下のように実施した。平均形質転換効率は55〜70%であった。形質転換を、PEG媒介形質転換によりそれぞれのプラスミド10μgで実施した。プロトプラストを48時間後に採取し、DNAをT7E1及びPCR−REアッセイのために抽出した。
1)コムギ(トウモロコシ)の柔らかい葉の中間部位を、幅0.5〜1mmの細片に切断した。その細片を、0.6Mマンニトール溶液中に10分間置き、濾過し、そして20〜25℃の酵素溶液50ml中で暗所で、穏やかに撹拌(10rpm)しながら5時間置いた。
2)W5 10mlを添加して、酵素分解産物を希釈し、その産物を75μmナイロンフィルターで丸底遠心管(50ml)中で濾過した。
3)3分間23℃で100g遠心分離し、その上清を棄てた。
4)その産物をW5 10mlで穏やかに懸濁し、氷上に30分間置いて、プロトプラストを徐々に沈降させ、そしてその上清を棄てた。
5)プロトプラストを、適量のMMGを添加することにより懸濁し、形質転換まで氷上に置いた。
6)プラスミド10〜20μg、プロトプラスト200μl(約4×105細胞)、新鮮なPGE溶液220μlを、2mlの遠心管に添加し、混合し、そして暗所で10〜20分間室温に置いて形質転換を誘導した。
7)形質転換の誘導後に、W5溶液880μlをゆっくりと添加し、そしてその管を混合のために穏やかに上下をひっくり返し、3分間100gで水平遠心分離し、そしてその上清を棄てた。
8)その産物をW5溶液2ml中に再懸濁させ、6ウェルプレートに移し、室温(又は25℃)で暗所で培養した。プロトプラストゲノムDNA抽出のために、その産物は48時間培養する必要がある。
1)実生の葉鞘を、プロトプラスト単離のために使用し、鋭利な刃で幅約0.5mmに切断した。
2)切開直後に、0.6Mマンニトール溶液に移し、そして暗所に10分間置いた。
3)マンニトール溶液を濾過により取り出し、そしてその産物を酵素分解溶液中に移して、30分間排除した。
4)酵素分解を、5〜6時間暗所で穏やかに撹拌しながら(脱色撹拌機、速度10)実施した。
5)酵素分解の完了後に、W5の等量を添加し、10秒間水平撹拌してプロトプラストを放出させた。
6)プロトプラストを、40μmナイロン膜を有する50ml丸底遠心管で濾過し、そしてW5溶液で洗浄した。
7)3分間250g水平遠心分離して、プロトプラストを沈澱させ、そしてその上清を棄てた。
8)プロトプラストを、W5 10mlを添加することにより再懸濁し、そして3分間250gで遠心分離し、その上清を棄てた。
9)適量のMMG溶液を添加して、2×106/mlの濃度にプロトプラストを再懸濁した。
注:全ての前記ステップを室温で実施した。
10)プラスミド10〜20μg、プロトプラスト200μl(約4×105細胞)、及び新鮮なPGE溶液220μlを、2mlの遠心管に添加し、混合し、そして暗所で10〜20分間室温に置いて形質転換を誘導した。
11)形質転換の完了後に、W5溶液880μlをゆっくりと添加し、そしてその管を混合のために穏やかに上下をひっくり返し、3分間250gで水平遠心分離し、そしてその上清を棄てた。
12)その産物をWI溶液2ml中に再懸濁させ、6ウェルプレートに移し、室温(又は25℃)で暗所で培養した。プロトプラストゲノムDNA抽出のために、その産物は48時間培養する必要がある。
プラスミドDNA(pnCas9−PBE及びpTaU6−LOX2−S1−sgRNA)を使用して、Bobwhite未成熟胚を照射した。微粒子銃形質転換を、前記(Zhang, K., Liu, J., Zhang, Y., Yang, Z. &Gao, C. Biolistic genetic transformation of a wide range of Chinese elite wheat (Triticum aestivum L. ) varieties. J. Genet Genomics 42, 39-42 (2015))のように実施した。照射後に、胚を文献に従って処理したが、組織培養中に選択剤を使用しなかった。
pAG−n/dCas9−PBE−CDC48−sgRNAバイナリーベクターを、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウムAGL1株に形質転換した。アグロバクテリウム媒介形質転換、組織培養、及びイネNipponbareの再生を、Shanら(Shan, Q. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31, 686-688 (2013))に従って実施した。ハイグロマイシン(50μg/ml)をスクリーニングのために全ての続く組織培養プロセスにおいて使用した。
個々のイネ植物からのDNAを抽出して、T7E1アッセイによる変異を検出し、そして変異をSanger配列により確認した。コムギにおいて、費用及び労力を省くために、3〜4個の植物を群としてランダムに選択し、T7E1及びPCR/REによる変異を検出した。ある群が陽性の結果を示した場合に、その群における全ての植物をT7E1及びPCR/REによってさらに試験し、そしてその結果をSanger配列決定によって確認した。
1)ゲノムDNAを植物から抽出し、PCRによって増幅させ、そして電気泳動により検出した。
2)PCR産物を、以下のT7E1緩衝液に添加した:
4)以下のT7E1エンドヌクレアーゼを添加した:
1)植物ゲノムDNAを抽出した。
2)350〜1000bpの長さである標的部位を含む断片を、合成遺伝子特異的プライマーで増幅させた:
4)PCR産物を、以下の制限エンドヌクレアーゼで消化した:
6)PCR産物における未切断の変異体バンドを回収し、精製し、そして以下のようにTAクローニングした:
それぞれpnCas9−PBE、pdCas9−PBE及びpwCas9と組み合わせた異なるsgRNA発現ベクターを、コムギ、イネ又はトウモロコシのプロトプラストに48時間形質転換させた。その後、プロトプラストを採取し、そしてDNAを徹底的なシーケンシングのために抽出した。一巡目のPCRにおいて、標的領域を部位特異的プライマー(表5)で増幅した。二巡目のPCRにおいて、フォワードタグ及びリバースタグを、ライブラリー構築のためにPCR産物の末端に付加した(表5)。等量の異なるPCR産物を貯蔵した。そしてその試料を、Beijing Genomics InstituteのIllumina High−Seq 4000でシーケンシングした。
nCas9−PBE融合タンパク質において、N末端からC末端は、それぞれNLD(配列番号30)、APOBEC1(配列番号11)、XTENリンカー(配列番号12)、Cas9ニッカーゼ(nCas9、配列番号13)、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI、配列番号15)及びNLS(配列番号31)であり、一方で、dCas9−PBE融合タンパク質においては、それぞれN末端からC末端は、NLS、APOBEC1、XTENリンカー、触媒不活性化Cas9(dCas9、配列番号14)、UGI及びNLSである。作物における効率的な発現のためのコドン最適化融合タンパク質をコードする配列を、プラスミド構築物pnCas9−PBE及びpdCas9−PBEにおけるユビキチン−1遺伝子プロモーターUbi−1の下流に置いた(図1a)。
この実施例において、コムギ、イネ及びトウモロコシの内在性遺伝子に対するpnCas9−PBE又はpdCas9−PBEの活性をさらに研究した。挿入欠失の導入のための対照として、構築物pwCas9(Addgene ID53064)を発現する野生型Cas9もこの実験において使用した。
この実施例では、さらに、nCas9−PBEとdCas9−PBEとの間の機能的差異を調査し、そして変異体植物を分析することによるnCas9−PBEの機能的特性を試験した。
シード配列としてAtALS (AT3G48560.1)を使用して、2つのZmALS相同遺伝子を、トウモロコシデータベース(https: //phytozome. jgi. doe.gov)におけるBLASTNアライメント分析によって得て、2つのZmALS相同遺伝子を、ZmALS1(Locus Name:GRMZM2G143357)及びZmALS2(Locus Name:GRMZM2G143008)と名付けた。ZmALS1及びZmALS2は、93.84%の配列同一性を有する。通常のsgRNA標的配列を、CAGGTGCCGCGACGCATGATTGGであるZmALS1(配列番号26)及びZmALS2(配列番号28)(Svitashevら、Plant Physiol., 2015)の保存領域に設計した。塩基編集システムを、前記したように構築し、そして微粒子銃法によってトウモロコシ変種Zong31に形質転換した。PCR/RE検出後に、ZmALS1及びZmALS2に対してC7からT7への置換を有する植物を得た(図5)。
Claims (23)
- 以下の(i)〜(v)の少なくとも1つを含む、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステム:
i)塩基編集融合タンパク質、及びガイドRNA、
ii)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA、
iii)塩基編集融合タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
iv)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
v)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Cas9ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドRNAは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化できる。 - 前記デアミナーゼが、シチジンデアミナーゼ、例えばアポリポタンパク質B−mRNA編集複合体(APOBEC)ファミリーデアミナーゼである、請求項1に記載のシステム。
- 前記シチジンデアミナーゼが、APOBEC1デアミナーゼ又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)であり、例えば前記シチジンデアミナーゼが、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のシステム。
- 前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9が、野生型Cas9と比較してD10A及び/又はH840Aのアミノ酸置換を含み、例えば前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9が、配列番号13又は14に示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記デアミナーゼドメインを、前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9ドメインのN末端に融合させるか、又は前記デアミナーゼドメインを、前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9ドメインのC末端に融合させる、請求項1に記載のシステム。
- 前記デアミナーゼドメイン及び前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9ドメインを、リンカーによって融合させ、例えば前記リンカーが、配列番号12において示したXTENリンカーである、請求項1に記載のシステム。
- 前記塩基編集融合タンパク質が、さらに、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI)を含み、例えば前記ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤が、配列番号15において示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記塩基編集融合タンパク質が、さらに、核局在化配列(NLS)を含み、例えば前記NLSが、配列番号30又は31において示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記塩基編集融合タンパク質が、配列番号22又は23において示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、塩基編集するために植物についてコドン最適化し、例えば前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号19又は20において示す、請求項1に記載のシステム。
- 前記ガイドRNAが、一本鎖ガイドRNA(sgRNA)である、請求項1に記載のシステム。
- 前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び/又は前記ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を、植物のための発現調節エレメントに操作可能に連結する、請求項1に記載のシステム。
- 前記発現調節エレメントが、プロモーター、例えば35Sプロモーター、トウモロコシUbi−1プロモーター、コムギU6プロモーター、イネU3プロモーター、又はトウモロコシU3プロモーターである、請求項12に記載のシステム。
- 請求項1から13までのいずれか1項に記載のシステムを植物に導入し、それによりガイドRNAが、塩基編集融合タンパク質を前記植物のゲノムにおける標的配列に標的化し、前記標的配列における1つ以上のCからTへの置換をもたらすことを含む、遺伝子改変植物を製造するための方法であって、好ましくは前記導入が任意の選択圧の非存在下で実施される、遺伝子改変植物を製造するための方法。
- 前記標的配列中の3〜9位における1つ以上のCをTに置換する、請求項14に記載の方法。
- さらに、所望のヌクレオチド置換で植物についてスクリーニングすることを含む、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記植物が、単子葉植物及び双子葉植物から選択される、請求項14から16までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物が、作物、例えばコムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、モロコシ、ナタネ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、キビ、サトウキビ、トマト、タバコ、キャッサバ、又はジャガイモである、請求項17に記載の方法。
- 前記標的配列を、植物形質、例えば農学的形質と関連付け、それにより前記塩基編集が、野生型植物と比較して植物における形質の変化をもたらす、請求項14から18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記システムが、微粒子銃、PEG媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、花粉管アプローチ、及び子房注入アプローチから選択される方法によって前記植物に導入される、請求項14から19までのいずれか1項に記載の方法。
- さらに、遺伝子改変植物の子孫を得ることを含む、請求項14から20までのいずれか1項に記載の方法。
- 請求項14から21までのいずれか1項に記載の方法によって得られる、遺伝子改変植物又はそれらの子孫又はそれらの部位。
- 請求項14から21までのいずれか1項に記載の方法によって遺伝子改変した第一の植物と、前記遺伝子改変を含まない第二の植物とを交雑させて、前記第二の植物中に前記遺伝子改変を導入することを含む、植物の育種方法。
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