CN109652440A - VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用 - Google Patents
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了VQRn‑Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用。本发明公开的VQRn‑Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统由VQRn‑Cas9、PmCDA1、UGI和如式I所示的sgRNA组成；靶点序列转录的RNA‑sgRNA骨架(式I)，sgRNA骨架为将序列1的第571‑646位或序列7中的T替换为U得到的RNA。本发明的VQRn‑Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统，在植物中实现了靶点序列的编辑，尤其是靶点序列中由C到T的替换，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用。
背景技术
CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。
2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rAPOBEC1(rat APOBEC1)和PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率。具体为dead Cas9(dCas9)或the Cas9nickase(Cas9n)连带着rAPOBEC1或PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，rAPOBEC1或PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(Uracil，U)，通过DNA的修复使得U与腺嘌呤(Adenine，A)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。在所测试的编辑器中，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI))的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)催化清除DNA中U，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。
目前，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统已被广泛应用到水稻中，实现C到T的转换，但编辑的靶点主要局限在PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG的序列，大大限制了可编辑的C的范围。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何将生物体或生物细胞中PAM序列为NGA的靶点序列中的C突变为T。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂(为VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统)，所述成套试剂由M1、M2、M3和M4组成：
M1、VQRn-Cas9或与所述VQRn-Cas9相关的生物材料；
M2、PmCDA1或与所述PmCDA1相关的生物材料；
M3、UGI或与所述UGI相关的生物材料；
M4、如式I所示的sgRNA或与式I所示sgRNA相关的生物材料；
靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架(式I)
所述sgRNA骨架为将序列1的第571-646位或序列7中的T替换为U得到的RNA；
与式I所示sgRNA相关的生物材料，为下述G1)至G5)中的任一种：
G1)转录式I所示的sgRNA的核酸分子；G2)含有G1)所述核酸分子的表达盒；
G3)含有G1)所述核酸分子的重组载体、或含有G2)所述表达盒的重组载体；
G4)含有G1)所述核酸分子的重组微生物、或含有G2)所述表达盒的重组微生物、或含有G3)所述重组载体的重组微生物；
G5)含有G1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有G2)所述表达盒的转基因细胞系。
上述成套试剂中，所述VQRn-Cas9可为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述VQRn-Cas9相关的生物材料，可为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述VQRn-Cas9的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
所述PmCDA1可为如下C1)、C2)或C3)：
C1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；
C2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述PmCDA1相关的生物材料，可为下述D1)至D5)中的任一种：
D1)编码所述PmCDA1的核酸分子；D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因细胞系；
所述UGI可为如下E1)、E2)或E3)：
E1)氨基酸序列是序列5的蛋白质；
E2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述UGI相关的生物材料，可为下述F1)至F5)中的任一种：
F1)编码所述UGI的核酸分子；F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；
F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；
F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；
F5)含有F1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因细胞系。
为了使A1)、C1)或E1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3或序列4或序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述A2)、C2)或E2)中的蛋白质，为与序列3或序列4或序列5所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)、C2)或E2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)、C2)或E2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1的第3529-7797位、第8083-8706位或第8728-9024位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表所示的标签的编码序列得到。序列1的第3529-7797位、第8083-8706位和第8728-9024位分别编码序列3、序列4和序列5所示的蛋白质。
上述成套试剂中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)序列表中序列1的第3529-7797位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述VQRn-Cas9的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述VQRn-Cas9的cDNA分子或DNA分子；
D1)所述核酸分子可为如下d1)或d2)或d3)：
d1)序列表中序列1的第8083-8706位所示的cDNA分子或DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；
F1)所述核酸分子可为如下f1)或f2)或f3)：
f1)序列表中序列1的第8728-9024位所示的cDNA分子或DNA分子；
f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述UGI的cDNA分子或DNA分子；
f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述UGI的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述VQRn-Cas9、所述PmCDA1或所述UGI的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述VQRn-Cas9、所述PmCDA1或所述UGI的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述VQRn-Cas9、所述PmCDA1或所述UGI且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3、4或5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
B2)所述的含有编码VQRn-Cas9蛋白质的核酸分子的表达盒(VQRn-Cas9基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达VQRn-Cas9蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动VQRn-Cas9基因转录的启动子，还可包括终止VQRn-Cas9基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述VQRn-Cas9基因表达盒的重组载体。
D2)所述的含有编码PmCDA1蛋白质的核酸分子的表达盒(PmCDA1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PmCDA1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PmCDA1基因转录的启动子，还可包括终止PmCDA1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述PmCDA1基因表达盒的重组载体。
F2)所述的含有编码UGI蛋白质的核酸分子的表达盒(UGI基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达UGI蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动UGI基因转录的启动子，还可包括终止UGI基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述UGI基因表达盒的重组载体。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
所述重组载体具体可为VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-5或VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-6。
所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3的序列可为序列1。所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3转录靶向OsWaxy基因的六个靶点的六个sgRNA。
所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1为将序列表中序列1的第131-1802位替换为序列表中序列2得到的载体。所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体转录靶向OsWaxy基因和OsALS基因的五个靶点的五个sgRNA。
所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4为将所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3中OsWaxy基因的六个靶点序列分别替换为OsWaxy基因的另六个靶点序列得到的载体。
所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2为将所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1中OsWaxy基因和OsALS基因的五个靶点序列分别替换为OsWaxy基因的另两个靶点序列以及OsALS基因的另三个靶点序列得到的载体。
所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-5为将所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3中序列1的第571-646位、第744-819位、第917-992位、第1090-1165位、第1263-1338位和第1436-1511位所示的转录六个sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列表中序列7得到的载体。
所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-6为将所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4中序列1的第571-646位、第744-819位、第917-992位、第1090-1165位、第1263-1338位和第1436-1511位所示的转录六个sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列表中序列7得到的载体。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌LBA4404。
所述转基因细胞系不包括繁殖材料。
所述成套试剂具有如下任一用途：
X1)生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑；X2)制备生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑产品；X3)将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T；X4)制备将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T产品。
式I所示的sgRNA或与式I所示的sgRNA相关的生物材料，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了基因组靶点序列的编辑方法，所述方法包括：将所述VQRn-Cas9的编码基因、转录式I所示的sgRNA的DNA分子、所述PmCDA1的编码基因和所述UGI的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述VQRn-Cas9、式I所示的sgRNA、所述PmCDA1和所述UGI的编码基因均得到表达，实现所述生物体或所述生物细胞内基因组靶点序列的编辑；式I所示的sgRNA靶向所述靶点序列。
本发明还提供了生物突变体的制备方法，所述方法包括：按照所述基因组靶点序列的编辑方法对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体。
所述基因组靶点序列的编辑具体可为将所述靶点序列中的C突变为T。
所述方法具体可包括：将含有所述VQRn-Cas9的编码基因的表达盒、转录式I所示的sgRNA的DNA分子的表达盒、所述PmCDA1的编码基因的表达盒和所述UGI的编码基因的表达盒导入所述生物体或所述生物细胞中实现所述生物体或所述生物细胞内基因组靶点序列的编辑。
在本发明的实施例中，所述方法是通过将所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1，所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2，所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3，所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4，所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-5或所述VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-6导入所述生物体或所述生物细胞内实现基因组靶点序列的编辑的。
本发明还提供了所述成套试剂，或式I所示的sgRNA或与式I所示的sgRNA相关的生物材料的下述任一应用：
X1)生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑；X2)制备生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑产品；X3)将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T；X4)制备将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T产品。
上文中，所述靶点序列的PAM序列可为m1)或m2)：
m1)NGA；m2)NGAG、NGAT或NGAC；N为A、T、C或G。
所述PAM序列为与所述靶点序列3′端相连的一段DNA序列。所述PAM序列中的N与所述靶点序列3′端相连。
所述生物体可为n1)或n2)或n3)或n4)：
n1)植物或动物；n2)单子叶植物或双子叶植物；n3)禾本科植物；n4)水稻。
所述生物细胞可为o1)或o2)或o3)或o4)：
o1)植物细胞或动物细胞；o2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；o3)禾本科植物细胞；o4)水稻细胞。
本发明中，所述将生物体内或所述生物细胞内靶点序列中的C突变为T可为将所述靶点序列的非PAM端始的第1-7位间的C突变为T。所述靶点序列的长度可为20bp。
本发明利用VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统，在植物中实现了靶点序列的编辑，尤其是靶点序列中由C到T的替换，如PAM序列为NGAG、NGAT和NGAC的靶点序列，扩展了PmCDA1介导的碱基替换系统的编辑范围。另外，本发明将改造的sgRNA(其骨架序列由序列7转录)用于PmCDA1介导的碱基编辑系统，并实现了碱基编辑效率的提高。本发明的VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统以及改造后的sgRNA具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统对水稻T0苗中OsWaxy基因上可编辑靶点单位点C的C·T碱基替换效率分析结果。横坐标C后的数字表示从靶点中的非PAM序列一端(即5′端)的第一位核苷酸开始计数时C所处的核苷酸位数。
图2为VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统对水稻T0苗中OsALS基因上可编辑靶点单位点C的C·T碱基替换效率分析结果。横坐标C后的数字表示从靶点中的非PAM序列一端(即5′端)的第一位核苷酸开始计数时C所处的核苷酸位数。
图3为sgRNA(modified)对VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统C·T碱基替换效率影响的结果分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
引物对Waxy-R1由引物Waxy-R1-F：5’-gctgaccgtcgtcgtcttc-3’和引物Waxy-R1-R：5’-acggatggtcgatgaacacac-3’组成，用于扩增靶点Waxy-R1。
引物对Waxy-R2&3由引物Waxy-R2&3-F：5’-tggagaaggtggagtcatcatta-3’和引物Waxy-R2&3-R：5’-ggtaggagatgttgtggatgc-3’组成，用于扩增靶点Waxy-R2和Waxy-R3。
引物对Waxy-R4&5由引物Waxy-R4&5-F：5’-ctactgtccatcgttcaaatcc-3’和引物Waxy-R4&5-R：5’-gtcactcattcttgccttgtcag-3’组成，用于扩增靶点Waxy-R4和Waxy-R5。
引物对ALS-R1&2&3由引物ALS-R1&2&3-F：5’-cgtaagaaccaccagcgacaccac-3’和引物ALS-R1&2&3-R：5’-atggagcgggtgacctcgac-3’组成，用于扩增靶点ALS-R1、ALS-R2和ALS-R3。
引物对ALS-R4&5&6由引物ALS-R4&5&6-F：5’-tatgccattcaggtgctgg-3’和引物ALS-R4&5&6-R：5’-ggtgctttgccaacatacag-3’组成，用于扩增靶点ALS-R4、ALS-R5和ALS-R6。
引物对Waxy-T1&3由引物Waxy-T1&3-F：5’-gtcgtcgtcttcaactgttcttg-3’和引物Waxy-T1&3-R：5’-cgcatctggttgtctttgtaatc-3’组成，用于扩增靶点Waxy-T1和Waxy-T3。
引物对Waxy-T2&4由引物Waxy-T2&4-F：5’-gatcgattagctttagatgatttg-3’和引物Waxy-T2&4-R：5’-ttcttcaggtagctcgccag-3’组成，用于扩增靶点Waxy-T2和Waxy-T4。
引物对Waxy-T5&6由引物Waxy-T5&6-F：5’-catggtgatctctcctcggtac-3’和引物Waxy-T5&6-R：5’-gcagacgaacacaacatcctc-3’组成，用于扩增靶点Waxy-T5、Waxy-T6、Waxy-T13、Waxy-T14、Waxy-T15和Waxy-T16。
引物对Waxy-T7&8由引物Waxy-T7&8-F：5’-taagcacacacaaacttcgatc-3’和引物Waxy-T7&8-R：5’-caggtagcatcaatacacgaattag-3’组成，用于扩增靶点Waxy-T7、Waxy-T8、Waxy-T9、Waxy-T10、Waxy-T11和Waxy-T12。
引物对ALS-T1&2&3由引物ALS-T1&2&3-F：5’-tacacctacaagcggccac-3’和引物ALS-T1&2&3-R：5’-agtcctgccatcaccatcc-3’组成，用于扩增靶点ALS-T1、ALS-T2和ALS-T3。
引物对ALS-T4&5&6由引物ALS-T4&5&6-F：5’-aagaccggccgtaagaacc-3’和引物ALS-T4&5&6-R：5’-taccctggtagattcatcgagg-3’组成，用于扩增靶点ALS-T4、ALS-T5和ALS-T6。
以下实施例中，C·T碱基替换是指靶点序列中任何位置的C突变为T。
C·T碱基替换效率＝发生C·T碱基替换的阳性抗性愈伤数(或阳性T0苗数)/分析的总阳性抗性愈伤数(或总阳性T0苗数)×100％。
Indel率＝发生C·T碱基替换的阳性T0苗中同时产生Indel(即靶点及靶点上下游各10bp内至少一个碱基插入或缺失)的苗数/发生C·T碱基替换的阳性T0苗数×100％。
单位点C的C·T碱基替换效率＝目标单位点发生C·T碱基替换的阳性T0苗数/总阳性T0苗数×100％。
纯合基因型定义为所有发生C·T碱基替换的位点均为纯合突变。反之则为杂合基因型。
日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。
恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。
筛选培养基：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。
分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。
生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。
实施例1、VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统可以将水稻基因组中C突变为T
一、重组表达载体的构建
人工合成如下重组载体，各载体均为环状质粒：
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4，以及VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-1和VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-2。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体序列为序列表中序列1。序列1的第131-467位为OsU3启动子序列，第474-550位、第647-723位、第820-896位、第993-1069位、第1166-1242位和第1339-1415位均为转录pre-tRNA的DNA序列，第551-646位、第724-819位、第897-992位、第1070-1165位、第1243-1338位、第1416-1511位分别为转录靶向OsWaxy基因的六个sgRNA的DNA序列，这六个sgRNA的共同sgRNA骨架核苷酸序列(记为sgRNA骨架1)为序列1的第571-646位，第1512-1802位为OsU3终止子序列；序列1的第1809-3522位为OsUbq3启动子序列，第3529-7797位为VQRn-Cas9蛋白质的编码序列，编码序列3所示的VQRn-Cas9蛋白质；序列1的第8083-8706位为PmCDA1蛋白质的编码序列，编码序列4所示的PmCDA1蛋白质；序列1的第8728-9024位为UGI蛋白质的编码序列，编码序列5所示的UGI蛋白质；序列1的第9031-9225位为35S终止子序列。VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体中OsWaxy基因的六个靶点序列见表1，靶点分别为Waxy-T13、Waxy-T14、Waxy-T15、Waxy-T16、Waxy-T5和Waxy-T6。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体序列为将序列表中序列1的第131-1802位替换为序列表中序列2得到的序列。序列2的第1-337位为OsU3启动子序列，第344-420位、第517-593位、第690-766位、第863-939位和第1036-1112位均为转录pre-tRNA的DNA序列，第421-516位、第594-689位、第767-862位、第940-1035位、第1113-1208位分别为转录靶向OsWaxy基因和OsALS基因的五个sgRNA的DNA序列，第1209-1499位为OsU3终止子序列。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体中OsWaxy基因和OsALS基因的五个靶点序列见表1，靶点分别为Waxy-T1和Waxy-T3以及ALS-T1、ALS-T2和ALS-T3。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体序列为将VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体序列中OsWaxy基因的六个靶点序列分别替换为OsWaxy基因的另六个靶点序列得到的序列，这六个靶点为Waxy-T7、Waxy-T8、Waxy-T10、Waxy-T11、Waxy-T12和Waxy-T9，序列见表1。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体能转录靶向Waxy-T7、Waxy-T8、Waxy-T9、Waxy-T10、Waxy-T11和Waxy-T12的六个sgRNA。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体序列为将VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体序列中OsWaxy基因和OsALS基因的五个靶点序列分别替换为OsWaxy基因的另两个靶点序列以及OsALS基因的另三个靶点序列得到的序列，这五个靶点为Waxy-T4、Waxy-T2、ALS-T4、ALS-T5和ALS-T6，序列见表1。VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体能转录靶向Waxy-T2、Waxy-T4、ALS-T4、ALS-T5和ALS-T6的五个sgRNA。
各载体所转录sgRNA的靶点序列及相应的PAM序列如表1所示。
表1
VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体序列为将VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体序列中OsWaxy基因和OsALS基因的五个靶点序列分别替换为OsWaxy基因的另五个靶点序列、并将VQRn-Cas9蛋白质的编码序列替换为序列表中序列6所示的VRERn-Cas9蛋白质编码序列得到的序列，这五个靶点分别为Waxy-R1、Waxy-R2、Waxy-R3、Waxy-R4和Waxy-R5，序列见表2。
VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体能转录靶向Waxy-R1、Waxy-R2、Waxy-R3、Waxy-R4和Waxy-R5的五个sgRNA。
VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体序列为将VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体序列中OsWaxy基因的六个靶点序列分别替换为OsALS基因的六个靶点序列、并将VQRn-Cas9蛋白质的编码序列替换为序列表中序列6所示的VRERn-Cas9蛋白质编码序列得到的序列，这六个靶点为ALS-R1、ALS-R2、ALS-R3、ALS-R4、ALS-R5和ALS-R6，序列见表2。VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体能转录靶向ALS-R1、ALS-R2、ALS-R3、ALS-R4、ALS-R5和ALS-R6的六个sgRNA。
各载体所转录sgRNA的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列如表2所示。
表2
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4，以及VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-1和VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-2所转录的sgRNA的共同序列均为sgRNA骨架1。
二、水稻阳性抗性愈伤的获得
将步骤一获得的VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体，VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体和VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体分别按照如下步骤1-8进行操作：
1、将载体导入农杆菌LBA4404(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#为AC1030)，得到重组农杆菌。
2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD600为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD600为0.2，得到农杆菌侵染液。
3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。
4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。
5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。
6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。
7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。
8、分别提取20-25块水稻抗性愈伤的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-attatgtagcttgtgcgtttcg-3’)和引物R(5’-gatgaagagcttatcgacgt-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约1150bp的DNA片段，则相应的水稻抗性愈伤为水稻阳性抗性愈伤；如果PCR扩增产物中不含有约1150bp的DNA片段，则相应的水稻抗性愈伤不为水稻阳性抗性愈伤。
三、水稻阳性T0苗的获得
1、将步骤一获得的VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体和VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体分别按照步骤二的1-7进行操作，得到水稻抗性愈伤。
2、取步骤1得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻T0苗。
3、分别提取水稻T0苗的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-attatgtagcttgtgcgtttcg-3’)和引物R(5’-gatgaagagcttatcgacgt-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约1150bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为水稻阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约1150bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗不为水稻阳性T0苗。
四、结果分析
一)、水稻愈伤中对OsWaxy基因上靶点的编辑
1、每载体分别取步骤二所获得的15或20块水稻阳性抗性愈伤的基因组DNA作为模板，对于VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体，采用引物对Waxy-R1、引物对Waxy-R2&3或引物对Waxy-R4&5进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体，采用引物对Waxy-T1&3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，采用引物对Waxy-T2&4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体，采用引物对Waxy-T5&6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体，采用引物对Waxy-T7&8进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。
测序结果只针对各靶点区进行分析。
分别统计靶点Waxy-R1、Waxy-R2、Waxy-R3、Waxy-R4、Waxy-R5、Waxy-T1、Waxy-T2、Waxy-T3、Waxy-T4、Waxy-T5、Waxy-T6、Waxy-T7、Waxy-T8、Waxy-T9、Waxy-T10、Waxy-T11、Waxy-T12、Waxy-T13、Waxy-T14、Waxy-T15和Waxy-T16的发生C·T碱基替换的水稻阳性抗性愈伤数,计算得出C·T碱基替换效率，结果见表3。
结果表明，VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统不工作，不能对OsWaxy基因上所选的5个靶点进行C·T碱基替换。而VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在水稻中实现了对OsWaxy基因上6个靶点的C·T碱基替换，扩展了PmCDA1介导的碱基替换系统的编辑范围。靶点选择的PAM偏好性表现为NGAG>NGAT>NGAC>NGAA，具体表现为约75％(3/4)PAM为NGAG和50％(2/4)PAM为NGAT的靶点被编辑，而只有约25％(1/4)PAM为NGAC的靶点被编辑，100％(4/4)PAM为NGAA的靶点均未被编辑。
表3
二)、水稻愈伤中对OsALS基因上靶点的编辑
1、对于VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，取步骤二所获得的15块水稻阳性抗性愈伤的基因组DNA作为模板，采用引物对ALS-R1&2&3或引物对ALS-R4&5&6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，取步骤二中VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体所得到的水稻阳性抗性愈伤的基因组DNA作为模板，采用引物对ALS-T4&5&6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤1和2得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。
测序结果只针对各靶点区进行分析。
分别统计靶点ALS-R1、ALS-R2、ALS-R3、ALS-R4、ALS-R5、ALS-R6、ALS-T4、ALS-T5和ALS-T6的发生C·T碱基替换的水稻阳性抗性愈伤数,计算得出C·T碱基替换效率，结果见表4。结果表明，VRERn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统不工作，不能对OsALS基因上所选的6个靶点进行碱基编辑。而VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在水稻中实现了对OsALS基因上2个靶点的C·T碱基替换。
表4
三)、水稻植株中对OsWaxy基因上靶点的编辑
1、分别取步骤三所获得的VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体和VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体，采用引物对Waxy-T1&3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体，采用引物对Waxy-T2&4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体，采用引物对Waxy-T5&6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体，采用引物对Waxy-T7&8进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。
测序结果只针对各靶点区进行分析。
分别统计Waxy-T1、Waxy-T2、Waxy-T3、Waxy-T4、Waxy-T5、Waxy-T6、Waxy-T7、Waxy-T8、Waxy-T9、Waxy-T10、Waxy-T11、Waxy-T12、Waxy-T13、Waxy-T14、Waxy-T15和Waxy-T16的发生C·T碱基替换及产生Indel的阳性T0苗数，计算得出C·T碱基替换效率和Indel率，且同时统计突变基因型及对应T0苗数，结果见表5。
结果表明，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI系统在水稻植株中实现了对OsWaxy基因上7个靶点的编辑，即实现了对约43.8％(7/16)的PAM为NGA的靶点的C·T碱基替换，扩展了PmCDA1介导的碱基替换系统的编辑范围。所产生的C·T突变类型主要为靶点内单个C和两个C的突变，而且对于C·T碱基替换效率较高的三个靶点(Waxy-T2，Waxy-T3和Waxy-T9)，也获得了T0纯合突变体。Indel也主要存在于C·T碱基替换效率较高的靶点中。靶点选择的PAM偏好性表现为NGAG＝NGAT>NGAC>NGAA，具体表现为约75％(6/8)PAM为NGAG和NGAT的靶点发生C·T碱基替换，而只有约25％(1/4)PAM为NGAC的靶点发生C·T碱基替换，100％(4/4)PAM为NGAA的靶点均未发生C·T碱基替换。C·T碱基替换效率表现为NGAG>NGAT。
表5
注：表5中，“突变基因型及对应T0苗数”列中，括号内数字表示T0苗数，C和T后面的数字表示发生C·T碱基替换的C所处的核苷酸位数(自靶点中的非PAM序列一端(即5′端)的第一位核苷酸开始计数)，“>”表示替换为。
进一步对可编辑靶点的单位点C的C·T碱基替换效率进行分析，结果见图1，结果表明VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI系统的活性窗口(即可发生C·T碱基替换的碱基的位置)主要为靶点序列内1-7bp(即靶点自5′端(即非PAM端)始的第1-7位核苷酸)，编辑效率最高的C主要发生在C3(即靶点自5′端(即非PAM端)的第3位核苷酸)或C3附近位置。
四)、水稻植株中对OsALS基因上靶点的编辑
1、对上述步骤三)中VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-1载体所使用的水稻阳性T0苗DNA，采用引物对ALS-T1&2&3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、对上述步骤三)中VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-2载体所使用的水稻阳性T0苗DNA，采用引物对ALS-T4&5&6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤1和2得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。
测序结果只针对各靶点区进行分析。
分别统计ALS-T1、ALS-T2、ALS-T3、ALS-T4、ALS-T5和ALS-T6的发生C·T碱基替换及产生Indel的阳性T0苗数，计算得出C·T碱基替换效率和Indel率，且同时统计突变基因型及对应T0苗数，结果见表6。
结果表明，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI系统在水稻植株中实现了对OsALS基因上5个靶点的编辑，即实现了对约83.3％(5/6)的PAM为NGAG的靶点的C·T碱基替换。所产生的C向T的突变类型也主要为单个C和两个C的突变，而且对于C·T碱基替换效率较高的两个靶点(ALS-T3和ALS-T6)，也获得了T0纯合突变体，Indel也主要存在于C·T碱基替换效率较高的这两个靶点中。进一步对所有可编辑靶点的单位点C的C·T碱基替换效率进行分析，结果见图2，结果表明VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI系统的活性窗口主要为靶点序列内1-7bp，编辑效率最高的C主要发生在C3或C3附近位置。
表6
实施例2、改造的sgRNA(sgRNA(modified))对VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统的增效
本实施例提供了一种sgRNA骨架，其名称为sgRNA骨架2(sgRNA(modified))，该sgRNA骨架可以提高VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统的效率。转录sgRNA骨架2的序列为序列表中序列7。
一、重组表达载体的构建
人工合成如下重组载体，各载体均为环状质粒：VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-5，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-6。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-5载体的序列为将VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-3载体序列中六个sgRNA骨架1的序列均替换为序列表中序列7得到的序列。
VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-6载体的序列为将VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-4载体序列中六个sgRNA骨架1的序列均替换为序列表中序列7得到的序列。
二、水稻植株中对OsWaxy基因上靶点的编辑
1、将步骤一构建的VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-5载体和VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-6载体分别按照实施例1中步骤三的1-3进行操作，得到水稻阳性T0苗及基因组DNA。
2、各载体分别取步骤1所获得的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-5载体，采用引物对Waxy-T5&6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI-6载体，采用引物对Waxy-T7&8进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。
测序结果针对各靶点区进行分析。分别统计Waxy-T5、Waxy-T6、Waxy-T7、Waxy-T8、Waxy-T9、Waxy-T10、Waxy-T11、Waxy-T12、Waxy-T13、Waxy-T14、Waxy-T15和Waxy-T16的发生C·T碱基替换的阳性T0苗数，计算得出C·T碱基替换效率，并与实施例1所得到的这些靶点的C·T碱基替换效率结果进行对比，结果见图3。结果表明，对于PAM为NGAA的靶点，sgRNA(modified)没有增效作用，均未实现编辑。对于PAM为NGAT的靶点，大部分靶点表现为与实施例1的VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统C·T碱基替换效率相当，一个靶点(Waxy-T6)增效2.8倍。对于PAM为NGAC的靶点，一个靶点(Waxy-T9)增效1.5倍，另一个靶点(Waxy-T11)成功被编辑。综上，对于VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统，sgRNA(modified)的C·T碱基替换效率总体趋势上表现为一定的增效，尤其对PAM为NGAC和NGAT的靶点。
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ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60
ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120
ttaaggtacc gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 180
tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 240
gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt 300
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ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc 420
acatagatca aagctgattt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcgga tccaacaaag 480
caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 540
ggctggtgca acaacaaccc atacttcaaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 600
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcaaca aagcaccagt 660
ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt 720
gcatctgcaa ccttgatctg caagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 780
gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgca acaaagcacc agtggtctag 840
tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcagact 900
ccacgcttgt agcaatgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 960
atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga 1020
atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg gctggtgcac accggtcttt 1080
ccccaaaccg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 1140
tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac 1200
cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg catacggacc tgacactgga 1260
gtgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 1320
gtggcaccga gtcggtgcaa caaagcacca gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca 1380
cggtacagac ccgggttcga ttcccggctg gtgcactcgt acctgtctgc aacctgtttt 1440
agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 1500
cgagtcggtg cttttttttt tcgttttgca ttgagttttc tccgtcgcat gtttgcagtt 1560
ttattttccg ttttgcattg aaatttctcc gtctcatgtt tgcagcgtgt tcaaaaagta 1620
cgcagctgta tttcacttat ttacggcgcc acattttcat gccgtttgtg ccaactatcc 1680
cgagctagtg aatacagctt ggcttcacac aacactggtg acccgctgac ctgctcgtac 1740
ctcgtaccgt cgtacggcac agcatttgga attaaagggt gtgatcgata ctgcttgctg 1800
ctaagcttac aaattcgggt caaggcggaa gccagcgcgc caccccacgt cagcaaatac 1860
ggaggcgcgg ggttgacggc gtcacccggt cctaacggcg accaacaaac cagccagaag 1920
aaattacagt aaaaaaaaag taaattgcac tttgatccac cttttattac ctaagtctca 1980
atttggatca cccttaaacc tatcttttca atttgggccg ggttgtggtt tggactacca 2040
tgaacaactt ttcgtcatgt ctaacttccc tttcagcaaa catatgaacc atatatagag 2100
gagatcggcc gtatactaga gctgatgtgt ttaaggtcgt tgattgcacg agaaaaaaaa 2160
atccaaatcg caacaatagc aaatttatct ggttcaaagt gaaaagatat gtttaaaggt 2220
agtccaaagt aaaacttata gataataaaa tgtggtccaa agcgtaattc actcaaaaaa 2280
aatcaacgag acgtgtacca aacggagaca aacggcatct tctcgaaatt tcccaaccgc 2340
tcgctcgccc gcctcgtctt cccggaaacc gcggtggttt cagcgtggcg gattctccaa 2400
gcagacggag acgtcacggc acgggactcc tcccaccacc caaccgccat aaataccagc 2460
cccctcatct cctctcctcg catcagctcc acccccgaaa aatttctccc caatctcgcg 2520
aggctctcgt cgtcgaatcg aatcctctcg cgtcctcaag gtacgctgct tctcctctcc 2580
tcgcttcgtt tcgattcgat ttcggacggg tgaggttgtt ttgttgctag atccgattgg 2640
tggttagggt tgtcgatgtg attatcgtga gatgtttagg ggttgtagat ctgatggttg 2700
tgatttgggc acggttggtt cgataggtgg aatcgtggtt aggttttggg attggatgtt 2760
ggttctgatg attgggggga atttttacgg ttagatgaat tgttggatga ttcgattggg 2820
gaaatcggtg tagatctgtt ggggaattgt ggaactagtc atgcctgagt gattggtgcg 2880
atttgtagcg tgttccatct tgtaggcctt gttgcgagca tgttcagatc tactgttccg 2940
ctcttgattg agttattggt gccatgggtt ggtgcaaaca caggctttaa tatgttatat 3000
ctgttttgtg tttgatgtag atctgtaggg tagttcttct tagacatggt tcaattatgt 3060
agcttgtgcg tttcgatttg atttcatatg ttcacagatt agataatgat gaactctttt 3120
aattaattgt caatggtaaa taggaagtct tgtcgctata tctgtcataa tgatctcatg 3180
ttactatctg ccagtaattt atgctaagaa ctatattaga atatcatgtt acaatctgta 3240
gtaatatcat gttacaatct gtagttcatc tatataatct attgtggtaa tttcttttta 3300
ctatctgtgt gaagattatt gccactagtt cattctactt atttctgaag ttcaggatac 3360
gtgtgctgtt actacctatc tgaatacatg tgtgatgtgc ctgttactat ctttttgaat 3420
acatgtatgt tctgttggaa tatgtttgct gtttgatccg ttgttgtgtc cttaatcttg 3480
tgctagttct taccctatct gtttggtgat tatttcttgc agtacgtaat ggactacaag 3540
gaccacgacg gggattacaa agaccacgac atagactaca aggatgacga tgacaaaatg 3600
gcaccgaaga aaaaaaggaa ggtcggaatc catggcgttc cagctgccga taagaaatat 3660
tccatcggac tcgccattgg cacgaatagc gtcggatggg ctgttattac tgatgagtac 3720
aaagttccgt ctaagaagtt caaggtgctg ggcaacacag accgccacag cataaagaaa 3780
aatctcatcg gtgcactcct tttcgatagt ggggagactg cagaagcgac aagattgaaa 3840
aggactgcga gaaggcgcta tacacggcgt aagaatagaa tctgctacct tcaggagatt 3900
ttctctaacg aaatggctaa ggtcgatgac agtttctttc atagacttga ggaatcgttc 3960
ttggttgagg aggataagaa acatgagagg cacccgatat ttggaaacat cgtggatgag 4020
gtcgcatatc atgaaaagta ccccacaatc taccacctga gaaagaaact cgttgattcc 4080
accgacaaag cggatttgag actcatctac ctcgctcttg cccatatgat aaagttccgc 4140
ggacactttc tgatcgaggg cgacctcaac cctgataata gcgacgtcga taagctcttc 4200
atccagttgg ttcaaaccta caatcagctc tttgaggaaa acccaattaa tgctagtgga 4260
gtggatgcaa aagcgatact gtcggccaga ctctccaaga gcagaaggtt ggagaacctg 4320
atcgctcaac ttcctggaga aaagaaaaac ggtctttttg ggaatttgat tgccttgtct 4380
ctgggcctca caccaaactt caagtcaaat tttgacctcg ctgaggatgc caaacttcag 4440
ttgtctaagg atacctatga tgacgatctt gacaatttgc tggcacaaat tggcgaccag 4500
tacgcggatc tgttcctcgc agcgaagaat ctgagtgatg ctattctcct ttcggacata 4560
ctcagggtta acactgagat cacaaaagca cctttgagtg cgtcgatgat taagcgctat 4620
gatgaacatc accaagacct cactttgctg aaggcccttg tgcggcagca attgccagag 4680
aagtacaaag aaatcttctt tgaccaatct aagaacggat acgctggcta tattgatgga 4740
ggagcttctc aggaggaatt ctataagttt atcaaaccta tacttgagaa gatggatggt 4800
acagaggaac tccttgttaa attgaacaga gaagatttgc tgcgcaagca acggaccttt 4860
gacaacggat caattccgca tcagatacac ctcggcgagc ttcatgccat ccttcgccgg 4920
caggaagatt tctacccctt tttgaaggac aaccgcgaga agatagaaaa aatccttacg 4980
ttccggattc cttactatgt gggtccattg gcaaggggga attcccgctt tgcgtggatg 5040
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gcttctgccc aatcattcat tgagaggatg actaacttcg ataagaacct gccgaacgag 5160
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aaagcgattg ttgatttgct gtttaaaact aatcgcaagg tgacagtcaa gcagctcaaa 5340
gaggattatt tcaagaaaat tgaatgtttc gactctgtgg agatatcagg agtcgaagat 5400
aggtttaacg cttcccttgg cacataccat gacctcctta agatcattaa ggacaaagat 5460
ttcctggata acgaggaaaa tgaggacatc ctcgaagata ttgttcttac cttgacgctg 5520
tttgaggatc gcgaaatgat cgaggaacgg cttaagacgt atgctcactt gttcgacgat 5580
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gacggattcg ccaacagaaa ttttatgcag ctgattcatg acgatagtct caccttcaaa 5760
gaggacatac agaaggctca agtgagtggt caaggggatt cgctgcatga acacatcgca 5820
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gagttggtta aagtgatggg taggcacaag cccgaaaaca tagtgatcga gatggctcgc 5940
gaaaatcaga ctacacaaaa agggcagaag aactctcgcg agcggatgaa aaggattgag 6000
gaaggaatca aggaactggg ctcacagatt ctcaaagagc atccagtcga aaacacacag 6060
ctgcaaaatg agaagctcta tctttactat ctccaaaatg gccgggacat gtatgttgat 6120
caggagcttg acatcaaccg tttgtccgac tatgatgtgg accacattgt cccgcaatct 6180
ttccttaagg acgattcaat cgataataag gtgttgaccc ggagcgataa aaaccgtgga 6240
aagtctgaca atgtcccttc agaggaagtg gttaagaaga tgaagaacta ctggagacaa 6300
ttgctgaatg caaaactgat cacacagaga aagttcgaca acctcaccaa agcagagaga 6360
ggtgggctca gtgaacttga taaagcgggc ttcattaagc gtcagctcgt tgagactaga 6420
cagatcacga agcatgtcgc gcagattttg gattcgcgga tgaacacgaa gtacgacgag 6480
aatgataaac tgatacgtga agtcaaggtt atcactctta agtccaaatt ggtgagcgat 6540
ttcagaaagg acttccaatt ctataaggtc agggagatca acaattatca tcacgctcac 6600
gatgcctacc ttaatgctgt tgtggggacc gcccttatta agaaataccc taaattggag 6660
tctgaattcg tttacgggga ttataaggtc tacgacgtta ggaaaatgat agctaagagt 6720
gagcaggaga tcggtaaagc aactgcgaag tatttctttt actcgaacat catgaatttc 6780
tttaagaccg agataacgct ggcaaatggc gaaattagaa agaggcctct catagagact 6840
aacggtgaga caggggaaat cgtctgggat aagggtaggg actttgcgac agtgcgcaag 6900
gtcctctcta tgccgcaagt taatattgtg aagaaaaccg aggtgcagac gggaggcttc 6960
tccaaggaaa gcatacttcc caaacggaac tctgataagt tgatcgctcg taagaaagat 7020
tgggacccta agaaatatgg tgggttcgtt tccccaactg ttgcttacag cgtgctggtc 7080
gttgccaagg tcgagaaggg taaatccaag aaactcaaaa gcgttaagga actccttggg 7140
attactatca tggagagatc ttcattcgaa aagaatccta tcgactttct tgaggccaaa 7200
ggatataagg aagttaagaa agatctgata atcaaactcc caaagtactc attgtttgag 7260
ctggaaaacg gcaggaagcg catgcttgct tccgccggag agttgcagaa agggaacgag 7320
ttggctctgc cttctaagta tgttaacttc ctctatcttg cctctcatta cgagaagctc 7380
aaaggctcac cagaggacaa cgaacagaaa caactttttg tcgagcaaca taagcactat 7440
ttggatgaga ttatagaaca gatcagtgaa ttctcgaaaa gggttatcct tgcagatgcg 7500
aatcttgaca aggtgttgtc tgcatacaac aaacatagag ataagccgat cagggagcaa 7560
gcggaaaata tcattcacct cttcactctt acaaacttgg gtgctcccgc tgccttcaag 7620
tattttgata ccacgattga ccggaaacaa tacagatcaa cgaaggaggt gctggatgcc 7680
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ggcggggata aaagaccagc agcgacgaaa aaggcaggac aggctaagaa gaagaaagga 7800
ggaggaggca cgggaggagg aggctccgcc gagtatgtgc gcgcgctctt cgacttcaac 7860
ggcaatgacg aggaggatct ccctttcaag aagggcgaca tcctccgcat ccgcgataag 7920
ccggaggagc agtggtggaa cgcagaggac tccgagggca agcggggcat gatcctggtg 7980
ccatacgtcg agaagtacag cggcgattac aaggaccacg atggcgacta caaggatcat 8040
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gtgcgcatcc acgagaagct cgatatctac accttcaaga agcagttctt caacaataag 8160
aagtcggtgt cccatcggtg ctacgtcctc ttcgagctga agcgcagggg agagcgccgc 8220
gcctgcttct ggggctacgc ggtgaataag ccgcagtcag gcacagagcg cggcatccac 8280
gccgagatct tctcgatccg gaaggtcgag gagtacctcc gcgacaaccc aggccagttc 8340
acgatcaatt ggtactccag ctggtcccct tgcgcagatt gcgcagagaa gatcctcgag 8400
tggtacaacc aggagctgag gggcaatggc cataccctca agatctgggc ctgcaagctg 8460
tactacgaga agaacgcgag gaatcagatc ggcctctgga acctgcggga taatggcgtg 8520
ggcctcaacg tgatggtgtc cgagcactac cagtgctgcc gcaagatctt catccagtcc 8580
tcccacaatc agctgaacga gaataggtgg ctcgaaaaga ccctgaagcg cgccgagaag 8640
tggaggagcg agctgtctat catgatccag gtcaagatcc tgcacaccac aaagtcaccg 8700
gcggtgggcg gcggcggcag cgaattctcc ggcggcagca cgaacctcag cgacatcatc 8760
gagaaggaga caggcaagca gctcgtgatc caggagtcta tcctcatgct gcctgaggag 8820
gtggaggagg tcatcggcaa caagccggag tccgatatcc tcgtgcacac cgcctacgac 8880
gagtcgacag atgagaatgt catgctcctg acctccgacg caccagagta caagccatgg 8940
gcgctcgtga tccaggattc caacggcgag aataagatca agatgctgtc tggcggctcc 9000
ccgaagaaga agcgcaaggt ctagactagt ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct 9060
atctctctct ataataatgt gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcttatagg 9120
gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata 9180
cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtggggcgc ccgacctgta 9240
ctcgcgaagg ttaacttaca gagagtgtcc gggcgcgcct ggtggatcgt ccgcctaggc 9300
tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa 9360
gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat 9420
ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat 9480
atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag 9540
tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt 9600
tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg 9660
tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta 9720
gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata atttagatat 9780
aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa 9840
actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac 9900
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ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 10200
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tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 10380
tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 10440
tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 10500
atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 10560
gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 10620
tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 10680
agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 10740
gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 10800
ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 10860
gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 10920
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ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 11100
ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 11160
gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 11220
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cctaagagaa aagagcgttt attagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta 12780
tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact 12840
ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct 12900
tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt 12960
tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac 13020
cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc 13080
agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc 13140
aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg 13200
cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc 13260
agcacccgcg acctactgga cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt 13320
agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg 13380
ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc 13440
gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag 13500
atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca 13560
ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg 13620
cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc 13680
ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc 13740
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tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact 14040
taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca 14100
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ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga 14220
ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc 14280
ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc 14340
aagcccttac gacatatggg ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga 14400
ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg 14460
catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg 14520
tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc 14580
agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa 14640
actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc 14700
ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca 14760
gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac 14820
gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca 14880
gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat 14940
ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg 15000
cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc 15060
caagcccgag gaatcggcgt gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg 15120
cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca 15180
tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag 15240
aatcccggca accgccggca gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg 15300
agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca 15360
tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc 15420
gctacgagct tccagacggg cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg 15480
tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat 15540
accgggaagg gaagggagac aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac 15600
tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca 15660
ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc 15720
tggtgacggt atccgagggt gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa 15780
ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag 15840
aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca 15900
tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt 15960
tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca 16020
ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg 16080
ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg 16140
ccggttccta atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc 16200
gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga 16260
accggaaccc gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag 16320
tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta 16380
aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc 16440
tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc 16500
ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc 16560
gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc 16620
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 16680
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 16740
ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 16800
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 16860
cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 16920
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 16980
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 17040
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 17100
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 17160
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 17220
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 17280
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 17340
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 17400
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 17460
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 17520
ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 17580
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 17640
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 17700
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtactaaa 17760
acaattcatc cagtaaaata taatatttta ttttctccca atcaggcttg atccccagta 17820
agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc 17880
agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca ataaagccac 17940
ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa 18000
gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg 18060
gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag atcgttattc agtaagtaat 18120
ccaattcggc taagcggctg tctaagctat tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg 18180
agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat 18240
cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact catgagcaga ttgctccagc 18300
catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc agccatagca 18360
tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt 18420
ttaaatatag gttttcattt tctcccacca gcttatatac cttagcagga gacattcctt 18480
ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt caattccggt gatattctca 18540
ttttagccat ttattatttc cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc 18600
taattataac aagacgaact ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca 18660
gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc 18720
gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc 18780
taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat 18840
agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc 18900
cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc 18960
tgttggctgg ct 18972
<210> 2
<211> 1499
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg 60
gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga 120
acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt aggagaaaag 180
catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt 240
acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca 300
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tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt gcaccagcgt 600
tgtggctgag gtagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 660
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gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 1200
gtcggtgctt ttttttttcg ttttgcattg agttttctcc gtcgcatgtt tgcagtttta 1260
ttttccgttt tgcattgaaa tttctccgtc tcatgtttgc agcgtgttca aaaagtacgc 1320
agctgtattt cacttattta cggcgccaca ttttcatgcc gtttgtgcca actatcccga 1380
gctagtgaat acagcttggc ttcacacaac actggtgacc cgctgacctg ctcgtacctc 1440
gtaccgtcgt acggcacagc atttggaatt aaagggtgtg atcgatactg cttgctgct 1499
<210> 3
<211> 1423
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu
35 40 45
Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr
50 55 60
Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
65 70 75 80
Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
85 90 95
Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
100 105 110
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
115 120 125
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
130 135 140
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
145 150 155 160
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
165 170 175
Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
195 200 205
Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
210 215 220
Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
225 230 235 240
Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
245 250 255
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
260 265 270
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
275 280 285
Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
290 295 300
Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
325 330 335
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
340 345 350
Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
355 360 365
Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu
370 375 380
Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
405 410 415
Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu
420 425 430
Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser
435 440 445
Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg
450 455 460
Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu
465 470 475 480
Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg
485 490 495
Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile
500 505 510
Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln
515 520 525
Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu
530 535 540
Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr
545 550 555 560
Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro
565 570 575
Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
580 585 590
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe
595 600 605
Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
610 615 620
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile
625 630 635 640
Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
645 650 655
Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu
660 665 670
Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys
675 680 685
Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys
690 695 700
Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp
705 710 715 720
Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile
725 730 735
His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val
740 745 750
Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly
755 760 765
Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp
770 775 780
Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile
785 790 795 800
Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser
805 810 815
Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
820 825 830
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
835 840 845
Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
850 855 860
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
865 870 875 880
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
885 890 895
Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu
900 905 910
Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala
915 920 925
Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg
930 935 940
Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu
945 950 955 960
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser
965 970 975
Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val
980 985 990
Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp
995 1000 1005
Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala
1010 1015 1020
His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys
1025 1030 1035
Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys
1040 1045 1050
Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile
1055 1060 1065
Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn
1070 1075 1080
Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys
1085 1090 1095
Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp
1100 1105 1110
Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met
1115 1120 1125
Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1130 1135 1140
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1145 1150 1155
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe
1160 1165 1170
Val Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val
1175 1180 1185
Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu
1190 1195 1200
Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile
1205 1210 1215
Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu
1220 1225 1230
Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly
1235 1240 1245
Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn
1250 1255 1260
Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala
1265 1270 1275
Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln
1280 1285 1290
Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile
1295 1300 1305
Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp
1310 1315 1320
Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp
1325 1330 1335
Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr
1340 1345 1350
Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
1355 1360 1365
Thr Ile Asp Arg Lys Gln Tyr Arg Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1370 1375 1380
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1385 1390 1395
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr
1400 1405 1410
Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1415 1420
<210> 4
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Thr Asp Ala Glu Tyr Val Arg Ile His Glu Lys Leu Asp Ile Tyr
1 5 10 15
Thr Phe Lys Lys Gln Phe Phe Asn Asn Lys Lys Ser Val Ser His Arg
20 25 30
Cys Tyr Val Leu Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Arg Arg Ala Cys
35 40 45
Phe Trp Gly Tyr Ala Val Asn Lys Pro Gln Ser Gly Thr Glu Arg Gly
50 55 60
Ile His Ala Glu Ile Phe Ser Ile Arg Lys Val Glu Glu Tyr Leu Arg
65 70 75 80
Asp Asn Pro Gly Gln Phe Thr Ile Asn Trp Tyr Ser Ser Trp Ser Pro
85 90 95
Cys Ala Asp Cys Ala Glu Lys Ile Leu Glu Trp Tyr Asn Gln Glu Leu
100 105 110
Arg Gly Asn Gly His Thr Leu Lys Ile Trp Ala Cys Lys Leu Tyr Tyr
115 120 125
Glu Lys Asn Ala Arg Asn Gln Ile Gly Leu Trp Asn Leu Arg Asp Asn
130 135 140
Gly Val Gly Leu Asn Val Met Val Ser Glu His Tyr Gln Cys Cys Arg
145 150 155 160
Lys Ile Phe Ile Gln Ser Ser His Asn Gln Leu Asn Glu Asn Arg Trp
165 170 175
Leu Glu Lys Thr Leu Lys Arg Ala Glu Lys Trp Arg Ser Glu Leu Ser
180 185 190
Ile Met Ile Gln Val Lys Ile Leu His Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val
195 200 205
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ser Gly Gly Ser Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly
1 5 10 15
Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val
20 25 30
Glu Glu Val Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr
35 40 45
Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp
50 55 60
Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly
65 70 75 80
Glu Asn Lys Ile Lys Met Leu Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg
85 90 95
Lys Val
<210> 6
<211> 4269
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggactaca aggaccacga cggggattac aaagaccacg acatagacta caaggatgac 60
gatgacaaaa tggcaccgaa gaaaaaaagg aaggtcggaa tccatggcgt tccagctgcc 120
gataagaaat attccatcgg actcgccatt ggcacgaata gcgtcggatg ggctgttatt 180
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agcataaaga aaaatctcat cggtgcactc cttttcgata gtggggagac tgcagaagcg 300
acaagattga aaaggactgc gagaaggcgc tatacacggc gtaagaatag aatctgctac 360
cttcaggaga ttttctctaa cgaaatggct aaggtcgatg acagtttctt tcatagactt 420
gaggaatcgt tcttggttga ggaggataag aaacatgaga ggcacccgat atttggaaac 480
atcgtggatg aggtcgcata tcatgaaaag taccccacaa tctaccacct gagaaagaaa 540
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ataaagttcc gcggacactt tctgatcgag ggcgacctca accctgataa tagcgacgtc 660
gataagctct tcatccagtt ggttcaaacc tacaatcagc tctttgagga aaacccaatt 720
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attgccttgt ctctgggcct cacaccaaac ttcaagtcaa attttgacct cgctgaggat 900
gccaaacttc agttgtctaa ggatacctat gatgacgatc ttgacaattt gctggcacaa 960
attggcgacc agtacgcgga tctgttcctc gcagcgaaga atctgagtga tgctattctc 1020
ctttcggaca tactcagggt taacactgag atcacaaaag cacctttgag tgcgtcgatg 1080
attaagcgct atgatgaaca tcaccaagac ctcactttgc tgaaggccct tgtgcggcag 1140
caattgccag agaagtacaa agaaatcttc tttgaccaat ctaagaacgg atacgctggc 1200
tatattgatg gaggagcttc tcaggaggaa ttctataagt ttatcaaacc tatacttgag 1260
aagatggatg gtacagagga actccttgtt aaattgaaca gagaagattt gctgcgcaag 1320
caacggacct ttgacaacgg atcaattccg catcagatac acctcggcga gcttcatgcc 1380
atccttcgcc ggcaggaaga tttctacccc tttttgaagg acaaccgcga gaagatagaa 1440
aaaatcctta cgttccggat tccttactat gtgggtccat tggcaagggg gaattcccgc 1500
tttgcgtgga tgactcggaa aagcgaggaa actatcacac cgtggaactt cgaggaagtt 1560
gtggacaagg gagcttctgc ccaatcattc attgagagga tgactaactt cgataagaac 1620
ctgccgaacg agaaagttct ccccaagcac tccctccttt acgagtattt caccgtgtat 1680
aacgaactta cgaaggttaa atacgtgact gagggtatga ggaagccagc attcttgagc 1740
ggggaacaaa agaaagcgat tgttgatttg ctgtttaaaa ctaatcgcaa ggtgacagtc 1800
aagcagctca aagaggatta tttcaagaaa attgaatgtt tcgactctgt ggagatatca 1860
ggagtcgaag ataggtttaa cgcttccctt ggcacatacc atgacctcct taagatcatt 1920
aaggacaaag atttcctgga taacgaggaa aatgaggaca tcctcgaaga tattgttctt 1980
accttgacgc tgtttgagga tcgcgaaatg atcgaggaac ggcttaagac gtatgctcac 2040
ttgttcgacg ataaggttat gaagcagctc aagcgtagaa ggtacactgg atggggccgt 2100
ctgtctagaa agctcatcaa cggaatacgt gataaacaaa gtggcaagac aattttggat 2160
tttctgaagt cggacggatt cgccaacaga aattttatgc agctgattca tgacgatagt 2220
ctcaccttca aagaggacat acagaaggct caagtgagtg gtcaagggga ttcgctgcat 2280
gaacacatcg caaacctcgc gggttcaccg gccataaaga aaggaatcct tcaaactgtt 2340
aaggtcgttg atgagttggt taaagtgatg ggtaggcaca agcccgaaaa catagtgatc 2400
gagatggctc gcgaaaatca gactacacaa aaagggcaga agaactctcg cgagcggatg 2460
aaaaggattg aggaaggaat caaggaactg ggctcacaga ttctcaaaga gcatccagtc 2520
gaaaacacac agctgcaaaa tgagaagctc tatctttact atctccaaaa tggccgggac 2580
atgtatgttg atcaggagct tgacatcaac cgtttgtccg actatgatgt ggaccacatt 2640
gtcccgcaat ctttccttaa ggacgattca atcgataata aggtgttgac ccggagcgat 2700
aaaaaccgtg gaaagtctga caatgtccct tcagaggaag tggttaagaa gatgaagaac 2760
tactggagac aattgctgaa tgcaaaactg atcacacaga gaaagttcga caacctcacc 2820
aaagcagaga gaggtgggct cagtgaactt gataaagcgg gcttcattaa gcgtcagctc 2880
gttgagacta gacagatcac gaagcatgtc gcgcagattt tggattcgcg gatgaacacg 2940
aagtacgacg agaatgataa actgatacgt gaagtcaagg ttatcactct taagtccaaa 3000
ttggtgagcg atttcagaaa ggacttccaa ttctataagg tcagggagat caacaattat 3060
catcacgctc acgatgccta ccttaatgct gttgtgggga ccgcccttat taagaaatac 3120
cctaaattgg agtctgaatt cgtttacggg gattataagg tctacgacgt taggaaaatg 3180
atagctaaga gtgagcagga gatcggtaaa gcaactgcga agtatttctt ttactcgaac 3240
atcatgaatt tctttaagac cgagataacg ctggcaaatg gcgaaattag aaagaggcct 3300
ctcatagaga ctaacggtga gacaggggaa atcgtctggg ataagggtag ggactttgcg 3360
acagtgcgca aggtcctctc tatgccgcaa gttaatattg tgaagaaaac cgaggtgcag 3420
acgggaggct tctccaagga aagcatactt cccaaacgga actctgataa gttgatcgct 3480
cgtaagaaag attgggaccc taagaaatat ggtgggttcg tttccccaac tgttgcttac 3540
agcgtgctgg tcgttgccaa ggtcgagaag ggtaaatcca agaaactcaa aagcgttaag 3600
gaactccttg ggattactat catggagaga tcttcattcg aaaagaatcc tatcgacttt 3660
cttgaggcca aaggatataa ggaagttaag aaagatctga taatcaaact cccaaagtac 3720
tcattgtttg agctggaaaa cggcaggaag cgcatgcttg cttccgcccg tgagttgcag 3780
aaagggaacg agttggctct gccttctaag tatgttaact tcctctatct tgcctctcat 3840
tacgagaagc tcaaaggctc accagaggac aacgaacaga aacaactttt tgtcgagcaa 3900
cataagcact atttggatga gattatagaa cagatcagtg aattctcgaa aagggttatc 3960
cttgcagatg cgaatcttga caaggtgttg tctgcataca acaaacatag agataagccg 4020
atcagggagc aagcggaaaa tatcattcac ctcttcactc ttacaaactt gggtgctccc 4080
gctgccttca agtattttga taccacgatt gaccggaaag agtacagatc aacgaaggag 4140
gtgctggatg ccaccctcat ccaccaatct attaccggac tctacgagac tagaatcgat 4200
ctctcacagc tcggcgggga taaaagacca gcagcgacga aaaaggcagg acaggctaag 4260
aagaagaaa 4269
<210> 7
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac 60
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 86
Claims (10)
1.成套试剂，由M1、M2、M3和M4组成：
M1、VQRn-Cas9或与所述VQRn-Cas9相关的生物材料；
M2、PmCDA1或与所述PmCDA1相关的生物材料；
M3、UGI或与所述UGI相关的生物材料；
M4、如式I所示的sgRNA或与式I所示sgRNA相关的生物材料；
靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架
(式I)
所述sgRNA骨架为将序列1的第571-646位或序列7中的T替换为U得到的RNA；
与式I所示sgRNA相关的生物材料，为下述G1)至G5)中的任一种：
G1)转录式I所示的sgRNA的核酸分子；
G2)含有G1)所述核酸分子的表达盒；
G3)含有G1)所述核酸分子的重组载体、或含有G2)所述表达盒的重组载体；
G4)含有G1)所述核酸分子的重组微生物、或含有G2)所述表达盒的重组微生物、或含有G3)所述重组载体的重组微生物；
G5)含有G1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有G2)所述表达盒的转基因细胞系。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：
所述VQRn-Cas9为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述VQRn-Cas9相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述VQRn-Cas9的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
所述PmCDA1为如下C1)、C2)或C3)：
C1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；
C2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述PmCDA1相关的生物材料，为下述D1)至D5)中的任一种：
D1)编码所述PmCDA1的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因细胞系；
所述UGI为如下E1)、E2)或E3)：
E1)氨基酸序列是序列5的蛋白质；
E2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述UGI相关的生物材料，为下述F1)至F5)中的任一种：
F1)编码所述UGI的核酸分子；
F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；
F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；
F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；
F5)含有F1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因细胞系。
3.根据权利要求2所述的成套试剂，其特征在于：
B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)：
b1)序列表中序列1的第3529-7797位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述VQRn-Cas9的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述VQRn-Cas9的cDNA分子或DNA分子；
D1)所述核酸分子为如下d1)或d2)或d3)：
d1)序列表中序列1的第8083-8706位所示的cDNA分子或DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；
F1)所述核酸分子为如下f1)或f2)或f3)：
f1)序列表中序列1的第8728-9024位所示的cDNA分子或DNA分子；
f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述UGI的cDNA分子或DNA分子；
f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述UGI的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂具有如下任一用途：
X1)生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑；
X2)制备生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑产品；
X3)将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T；
X4)制备将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T产品。
5.根据权利要求4所述的成套试剂，其特征在于：所述靶点序列的PAM序列为m1)或m2)：
m1)NGA；
m2)NGAG、NGAT或NGAC；
N为A、T、C或G；
和/或，所述生物体为n1)或n2)或n3)或n4)：
n1)植物或动物；
n2)单子叶植物或双子叶植物；
n3)禾本科植物；
n4)水稻；
和/或，所述生物细胞为o1)或o2)或o3)或o4)：
o1)植物细胞或动物细胞；
o2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；
o3)禾本科植物细胞；
o4)水稻细胞。
6.权利要求1-3中任一所述式I所示的sgRNA或与式I所示的sgRNA相关的生物材料。
7.下述Y1)或Y2)的方法：
Y1)基因组靶点序列的编辑方法，包括：将权利要求1或2中所述VQRn-Cas9的编码基因、转录式I所示的sgRNA的DNA分子、所述PmCDA1的编码基因和所述UGI的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述VQRn-Cas9、式I所示的sgRNA、所述PmCDA1和所述UGI的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑；式I所示的sgRNA靶向所述靶点序列；
Y2)生物突变体的制备方法，包括：按照Y1)的方法对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述基因组靶点序列的编辑为将所述靶点序列中的C突变为T。
9.权利要求1-3中任一所述的成套试剂，或权利要求1-3中任一所述式I所示的sgRNA或与式I所示的sgRNA相关的生物材料的下述任一应用：
X1)生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑；
X2)制备生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑产品；
X3)将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T；
X4)制备将生物体或生物细胞靶点序列中的C突变为T产品。
10.根据权利要求7或8所述的方法或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述靶点序列的PAM序列为m1)或m2)：
m1)NGA；
m2)NGAG、NGAT或NGAC；
N为A、T、C或G；
和/或，所述生物体为n1)或n2)或n3)或n4)：
n1)植物或动物；n2)单子叶植物或双子叶植物；n3)禾本科植物；n4)水稻；
和/或，所述生物细胞为o1)或o2)或o3)或o4)：
o1)植物细胞或动物细胞；o2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；o3)禾本科植物细胞；o4)水稻细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190419 |
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