WO2022210464A1 - ストレス耐性植物 - Google Patents

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WO2022210464A1
WO2022210464A1 PCT/JP2022/014797 JP2022014797W WO2022210464A1 WO 2022210464 A1 WO2022210464 A1 WO 2022210464A1 JP 2022014797 W JP2022014797 W JP 2022014797W WO 2022210464 A1 WO2022210464 A1 WO 2022210464A1
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WO
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gene
plant
ros
seq
resistance
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/014797
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English (en)
French (fr)
Inventor
拓見 田畑
剣 中原
陽子 渡邉
孝彦 早川
Original Assignee
三菱ケミカルグループ株式会社
株式会社ちとせ研究所
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Filing date
Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H7/00—Gymnosperms, e.g. conifers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present specification includes the contents described in the specification of Japanese Patent Application No. 2021-56055 (filed on March 29, 2021), which is the basis of priority of the present application.
  • Technical field: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a gene involved in plant reactive oxygen species (ROS) tolerance, a plant cell having ROS tolerance using the gene, a plant composed of the plant cell and having an increased amount of CO 2 fixation, and the like.
  • ROS reactive oxygen species
  • Non-Patent Documents 1 and 2 In order to increase the efficiency of CO2 fixation by plants, it is considered necessary to improve the efficiency of photosynthesis. ), and these environmental stresses are known to reduce photosynthetic efficiency via reactive oxygen species (ROS) (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • ROS reactive oxygen species
  • Non-Patent Documents 3 and 4 disclose biomass productivity (CO 2 fixation amount)
  • An object of the present invention is to provide a new means for improving the CO 2 fixation efficiency of plants by increasing their ROS tolerance.
  • a plant cell having reactive oxygen species (ROS) resistance wherein at least one of the following endogenous genes of (a) to (c) contains a modification that reduces the function of the gene , said plant cell: (a) a gene comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8; (b) a gene comprising a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and whose decreased function leads to ROS resistance in plants; (c) A gene that hybridizes under stringent conditions with a gene containing a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and whose decreased function results in ROS resistance in plants.
  • ROS reactive oxygen species
  • [2] The plant cell of [1], wherein the modification that results in loss of function of the endogenous gene is a mutation in a genome sequence that results in loss of function of the endogenous gene.
  • the plant cell of [1], wherein the modification that results in decreased function of the endogenous gene is a mutation that reduces or disrupts the expression of the endogenous gene.
  • the plant cell of [1], wherein the modification that results in decreased function of the endogenous gene is one or more indels in the ORF region of the endogenous gene.
  • the part of the plant body is any selected from the group consisting of callus, plant tissue, plant tissue culture, seed, fruit, leaf, stem, stem, root, and flower, according to [5] plants or parts thereof.
  • ROS reactive oxygen species
  • a method for producing a plant with an increased amount of CO 2 fixation comprising: obtaining a plant cell containing a modification that reduces the function of at least one reactive oxygen species (ROS) resistance-related gene; characterized by generating a plant body from The method, wherein the ROS resistance-related gene is any of the following (a) to (c): (a) a gene comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8; (b) a gene comprising a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and whose decreased function leads to ROS resistance in plants; (c) A gene that hybridizes under stringent conditions with a gene containing a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and whose decreased function results in ROS resistance in plants.
  • ROS reactive oxygen species
  • [11] A method for increasing the amount of CO 2 fixation in a plant, characterized in that at least one of the ROS resistance-related genes is modified to reduce its function, and the plant is generated from the plant cell.
  • the ROS resistance-related gene is any of the following (a) to (c): (a) a gene comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8; (b) a gene comprising a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and whose decreased function leads to ROS resistance in plants; (c) A gene that hybridizes under stringent conditions with a gene containing a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and whose decreased function results in ROS resistance in plants.
  • the ROS tolerance of plants can be increased, thereby increasing the amount of CO2 fixation of plants.
  • increasing the amount of CO 2 fixed in Japanese cedar, which is the most abundant domestic forest resource, is useful for environmental problems such as global warming.
  • the method of the present invention differs from conventional mutation breeding in which plant bodies are grown for judgment, and by modifying the genome of cultured cells (callus), the process from screening to evaluation of ROS resistance-related genes can be performed in a short period of time. can be done.
  • FIG. 1 shows the structure of the genome editing vector (pGECj).
  • FIG. 2 shows the results of confirming the sequence mutation of the #SR10 strain.
  • M 100bp Ladder Marker
  • Lane 1 #SR10 strain (SR10 gene target region PCR product) "restriction enzyme untreated”
  • Lane 2 Parent strain (SR10 gene target region PCR product) "restriction enzyme untreated”
  • Lane 3 # SR10 strain (SR10 gene target region PCR product) "restriction enzyme (TaqI) treatment”
  • Lane 4 Parent strain (SR10 gene target region PCR product) "restriction enzyme (TaqI) treatment”
  • FIG. 3 shows the result of confirming the sequence mutation of the #SR11 strain.
  • FIG. 4 shows the results of confirming the sequence mutation of the #SR13 strain.
  • FIG. 5 shows the results of confirming the sequence mutation of the #SR14 strain.
  • FIG. 6 shows the results of confirming the sequence mutation of the #SR15 strain.
  • FIG. 7 shows the results of confirming the sequence mutation of the #SR17 strain.
  • FIG. 8 shows the results of confirming the sequence mutation of the #SR24 strain.
  • FIG. 9 shows the results of confirming the sequence mutation of the #SR25 strain.
  • FIG. 10 shows the results of growth response in various media.
  • FIG. 11 shows redifferentiated individuals obtained by redifferentiation treatment of genome-edited callus and parent strain callus. In all genome edited plants, germination and individual formation can be confirmed, and the germination and rooting rates are at a level comparable to that of the parent strain.
  • the present invention relates to plant cells with reactive oxygen species (ROS) resistance.
  • the plant cell of the present invention is characterized in that at least one of the following endogenous genes (a) to (c) is modified to reduce the function of the gene.
  • ROS reactive oxygen species
  • plant cells are not particularly limited, but are preferably cells of woody plants (trees), Cupressaceae, Pinaceae, Myrtaceae, or Betulaceae. are more preferred.
  • Plants of the Cupressaceae family include, for example, the following plants (Gadek et al., 2000). Among them, plants belonging to the subfamily Sugiracea are preferred, and Japanese cedar is more preferred. Cypress subfamily: Hinoki genus (Japanese cypress, Japanese sawara, etc.), Asunaro genus (Hiva, Asunaro, etc.), Nezuko genus (Nezuko, Nioihiba, etc.), Juniper genus (Juniperus, etc.), Fukkenhiba genus (Fukkenhiba, etc.), Cypress genus (Italian cypress) Etc.), genus Pleurotus genus, genus Pleurotus spp.
  • Callitridae genus Actinostrobus (A. acuminatus), genus Austrocedrus (A. chiliensis), genus Callitris (C. rhomboidea), genus Diselma (D. archeri), genus Fitzroya (F. aupressoides), genus Libocedrus (L. bidwillii) ), Neocallitropsis (genus N. araucarioides), Papuacedrus genus (P. papuana), Pilgerodendron genus (P. uviferum), Widdringtonia genus (W.
  • Plants of the Pinaceae family include, for example, the following plants. Among them, plants of the subfamily Pinaceae and Spruce are preferred, and Japanese red pine, Scotch pine and European spruce are more preferred.
  • Pine subfamily Pinus (Switzerland pine, lodgepole pine, red pine, red pine, red pine, Ryukyu pine, giant pine, Japanese pine, northern pine, creeping pine, radiata pine, rigid pine, Scotch pine (also known as red pine), lobe pine, black pine, etc.
  • Spruce subfamily Spruce genus (European spruce (also known as Spruce spruce, German spruce, European spruce), Engelmann spruce, Red spruce, Ezo spruce, etc.); Larix subfamily: Larix genus (European larch, Japanese red pine, Japanese larch, Takane larch, etc.), Ginseng genus, Togasawara genus (Douglas fir etc.); Fir subfamily: Fir genus (fir, American fir, Urajiro fir, Miyama balsam fir, Eurasian fir, Nordman fir, Sakhalin fir, Shirabiso, etc.), Cedar genus, Yusan genus, Nototsuga genus, Larix spp. ).
  • Examples of plants of Myrtaceae include the following plants. Among them, plants belonging to the subfamily Leptospermoideae are preferred, and eucalyptus is more preferred.
  • Leptospermoideae subfamily Callistemon genus (Callistemon, etc.), Eucalyptus genus (Eucalyptus, etc.), Callistemon genus (Carpenter spp., etc.), Callistemon genus (Tea tree, etc.);
  • Subfamily Myrtoideae genus Eugenia (Pitanga, etc.), genus Ogasawarafutomomo (Muninfutomomo, pohutukawa, Hawaiian myrt, etc., rata, southern rata, etc.), genus Rhododendron (camcam, etc.), genus myrtle (myrtle, etc.), genus Pimenta (allspice, etc.) , Banjir
  • Betulaceae family examples include the following plants. Among them, Birch subfamily is preferable, and white birch is more preferable. Betulaceae: alder genus, birch genus (white birch, etc.); Corylus subfamily: Carpinus (carpinus, hornbeam, red hornbeam, etc.), Corylus (Corylus, Horn Coryl, Corylus avellana, etc.), Asada (Asada, etc.).
  • the plant cell of the present invention contains at least one modification that reduces the function of the "ROS resistance-related gene" described in detail later in this specification.
  • “decreased function” means inhibition, reduction, or loss of the biological function borne by the ROS resistance-related gene.
  • inhibition, reduction, or loss of the expression of a ROS resistance-related gene inhibition, reduction, or loss of the biological function carried by the gene, and inhibition, reduction, or loss of the expression of a protein that is a translation product of the ROS resistance-related gene. It includes all of the inhibition, reduction, or loss of the biological function carried by the gene caused by loss, structural change or functional suppression of the protein.
  • Modifications that result in decreased function of ROS resistance-related genes are artificial modifications and do not include natural mutations.
  • the "modification” includes modification (mutation, modification) of the ROS resistance-related gene itself, modification (mutation, modification) of the region involved in transcriptional control of the ROS resistance-related gene, introduction of a foreign gene or foreign substance. good.
  • the "modification" is a mutation in the genome sequence that results in decreased function or loss of function of the ROS resistance-related gene, more preferably loss of function, and more preferably mutation that disrupts the expression of the ROS resistance-related gene.
  • Mutations that disrupt expression of ROS resistance-associated genes include, for example, one or more indels in the ORF regions of ROS resistance-associated genes.
  • Methods for introducing the above-mentioned "modification" into plant cells include, for example, genome editing using site-specific nucleases and deaminase, oligonucleotide-directed mutagenesis, RNA interference, use of antisense and ribozymes, and the like. It is not limited to this within the scope of the invention. Genome editing using a site-specific nuclease is preferable from the viewpoint of efficiency of breeding and accuracy of modification.
  • Site-specific nuclease can be used to introduce a mutation that changes the expression level or structure of a ROS resistance-related gene.
  • Site-specific nucleases include zinc finger nucleases (ZFNs), transactivator-like effector nucleases (TALENs), Cas9, Cas3, Cas12a, and Cas nickase (Cpf1) of the CRISPR/Cas system.
  • PPR pentatricpeptide repeat
  • PPR pentatricpeptide repeat
  • RNA can be specifically cleaved or a specific base can be substituted.
  • ODN Oligonucleotide Directed Mutagenesis
  • Nucleotide Rewriting This is a method of inducing point mutations by rewriting nucleotides using deaminase. When combined with a CRISPR system or the like, genome editing by introducing site-specific point mutations is also possible.
  • RNAi method A 21 to 23 bp short double-stranded RNA (siRNA: small interfering RNA) or long-chain double-stranded RNA (dsRNA: double-strand RNA) is introduced and expressed to generate a transcript of the target gene. Gene expression can be suppressed by cleaving the homologous portion of (mRNA).
  • RNA complementary to the mRNA of the target gene By expressing RNA complementary to the mRNA of the target gene, double-stranded RNA can be produced to inhibit transcription of the mRNA, or decompose the mRNA to suppress gene expression.
  • RNA ribozyme
  • d) gene targeting (homologous recombination) It is a method of modifying an endogenous gene using homologous recombination. Although there are few successful examples in plants, target gene regions can be replaced with mutated genes or deleted.
  • RNA-dependent DNA methylation This is a technique for controlling the expression of a gene by methylating some bases in the region involved in the expression of the gene.
  • a DNA fragment homologous to a partial sequence (target sequence) of the promoter region of a gene whose expression is to be suppressed is introduced into cells, some bases of the target sequence are methylated via mRNA, which is a transcription product of the DNA.
  • Gene expression is suppressed (inactivated). Even after the DNA fragment disappears, the methylation state of the promoter is inherited by progeny for at least several generations. Expression of a specific endogenous gene can be suppressed without altering the base sequence information on the genome.
  • the plant cells of the present invention have higher ROS resistance than wild-type cells due to the modification that causes the function of the ROS resistance-related gene to be reduced.
  • ROS-tolerant plant body or part thereof The present invention also provides a plant body or a part thereof composed of the plant cells described above.
  • the term "part of a plant” is not particularly limited, and includes callus, plant tissue, plant tissue culture, seed, fruit, leaf, stem, stem, root, flower, and the like.
  • the plant body of the present invention has higher ROS tolerance than the wild type. Conferring ROS tolerance confers resistance to environmental stress to the plant body, mitigates the decrease in photosynthetic efficiency, and consequently increases the amount of CO2 fixation.
  • ROS resistance-related gene of the present invention is a gene identified as an endogenous gene whose decreased function confers ROS resistance to plants.
  • ROS resistance-related gene of the present invention can be identified by screening, for example, by the following two-step test.
  • a mutation library can be constructed according to methods known in the art.
  • the method of introducing mutation is not particularly limited, and treatment with alkylating agents such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine and ethylmethanesulfonic acid, and treatment with nucleobase analogues such as 5-bromouracil and 2-aminopurine.
  • alkylating agents such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine and ethylmethanesulfonic acid
  • nucleobase analogues such as 5-bromouracil and 2-aminopurine.
  • ⁇ -rays, X-rays, heavy ion beams and other energy ray irradiation, and mutation treatments such as genetic manipulation using transposons and T-DNA may be applied to plant cells.
  • plant cells the plant cells described in "1. Plant cells having reactive oxygen species (ROS) resistance" can be used. be able to.
  • ROS reactive oxygen species
  • step 2 selection of ROS-resistant cell lines can be performed by culturing the mutant cell library in a selective medium (ROS stressing) and selecting ROS-resistant mutant strains from surviving colonies.
  • the selective medium is not particularly limited as long as it is suitable for the growth of the plant cells used, but is preferably a solid medium, and the method of imparting ROS stress includes direct addition of a ROS source such as hydrogen peroxide, paraquat, and the like.
  • addition of ROS-generating agents addition of drugs such as hydroxyurea and aminooxyacetic acid that inhibit ROS-removal metabolism by cells, and the like.
  • Those with improved ROS resistance compared to the parent strain are selected as ROS resistant strains. If necessary, cells may be exposed to multiple different stress conditions, the degree of ROS resistance may be evaluated, and strains exhibiting stronger ROS resistance under various ROS stress environments may be selected.
  • extraction of candidate genes from ROS-resistant strains can be performed using, for example, RNA-Seq analysis.
  • Analysis includes expression analysis (extraction of genes whose expression level is suppressed compared to the parent strain) and mutation analysis (extraction of genes that are likely to have lost function due to mutation). are preferably implemented in combination.
  • the "modification” that results in decreased function of the endogenous gene may be any of the “modifications” described in "1. Plant cells resistant to reactive oxygen species (ROS)".
  • the "modification” is a mutation in the genomic sequence that results in a loss of function of the endogenous gene, more preferably a mutation that disrupts the expression of the endogenous gene, e.g. or two or more indels.
  • ROS-resistant plant cells can also be used as the method for introducing the above-mentioned “modification” into plant cells.
  • ROS reactive oxygen species
  • examples thereof include genome editing using site-specific nucleases and deaminase, oligonucleotide-directed mutagenesis, RNA interference, use of antisense and ribozymes, and the like.
  • genome editing with a site-specific nuclease, particularly introduction of indels in the ORF region of the target gene is preferable from the point of view of convenience and efficiency.
  • ROS resistance-related gene examples include genes containing the nucleotide sequence (cDNA sequence) shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8. .
  • the "ROS resistance-related gene” of the present invention is not limited to the above sequence, and any gene having a nucleotide sequence having high sequence identity with the nucleotide sequence can also be used in the present invention, as long as its decreased function confers ROS resistance to plants. Included in "ROS resistance associated gene”.
  • Stringent conditions include, for example, DNA-immobilized nylon membranes, 6 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC is 8.76 g of sodium chloride and 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water), 1% SDS, Hybridization can be performed by incubating with the probe for 20 hours at 65°C in a solution containing 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, and 0.1% Ficoll. is not limited to A person skilled in the art would be able to set hybridization conditions by taking into consideration other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. in addition to conditions such as buffer salt concentration and temperature. can be done.
  • Washing conditions after hybridization include, for example, "2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42° C.” and "1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37° C.”; more stringent conditions include, for example, “1 ⁇ SSC , 0.1% SDS, 65°C”, and “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 50°C”.
  • the "ROS resistance-related gene” is preferably a gene derived from any plant belonging to the family Cupressaceae, Pinaceae, Myrtaceae, or Birchaceae.
  • the putative ORFs of the "ROS resistance-associated gene" of the present invention are shown in SEQ ID NOs: 9-16 and encode the putative amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 17-24, respectively.
  • the "ROS resistance-related gene” of the present invention includes genes encoding amino acid sequences highly homologous to SEQ ID NOS: 17 to 24, as long as their functional decline confers ROS resistance to plants. related genes".
  • a gene that encodes an amino acid sequence with a homology of 10% or more and whose decreased function confers ROS resistance to a plant is also included in the "ROS resistance-associated gene" of the present invention.
  • the cDNA sequences of the ROS resistance-related genes shown in SEQ ID NOS: 1-8, the nucleotide sequences of the putative ORFs of the ROS resistance-related genes shown in SEQ ID NOS: 9-16, and the RNA sequences corresponding to the sequences are part of can be used as primers for amplifying ROS resistance-related genes and as guide RNA sequences for genome editing.
  • RNA containing 17 to 25 contiguous bases in any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 8 or SEQ ID NOs: 9 to 16, or a base sequence complementary to said sequence is the genome of the ROS resistance-related gene. It can be used as a guide RNA for editing (provided that T is replaced with U in the above sequence numbers). Examples of such guide RNAs are shown in SEQ ID NOs: 25-32 (where T is replaced with U in said SEQ ID NOS).
  • DNA containing 17 to 25 consecutive bases in any of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 8 or SEQ ID NOs: 9 to 16, or a nucleotide sequence complementary to the above sequence is specific for a ROS resistance-related gene. It can be used as a primer for targeted amplification. Examples of such primers are shown in SEQ ID NOs:33-48.
  • the present invention provides a method for increasing the amount of CO 2 fixation in a plant and a method for producing a plant with an increased amount of CO 2 fixation by using the ROS resistance-related gene.
  • a method for increasing the amount of CO 2 fixation in a plant according to the present invention is characterized by modifying at least one of the ROS resistance-related genes to reduce its function, and generating a plant from the plant cell. do.
  • a method for producing a plant having an increased amount of CO 2 fixation comprises obtaining a plant cell containing a modification that reduces the function of at least one ROS resistance-related gene, and producing a plant body from the plant cell. It is characterized by
  • ROS resistance-related gene to be used is not particularly limited as long as it is identified by the method defined in 3.1 above.
  • Preferable examples of ROS resistance-related genes are the genes described in 3.2 above, such as the following genes (a) or (b): (a) a gene comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8; (b) A gene comprising a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, the functional impairment of which causes reactive oxygen species (ROS) resistance in plants.
  • ROS reactive oxygen species
  • a plant with an increased amount of CO 2 fixation produced by the method of the present invention is useful for environmental problems such as global warming.
  • the method of the present invention which performs screening and evaluation of ROS resistance-related genes by modifying the genome of cultured cells (callus), is different from conventional mutation breeding in which plants are grown and judged, and the desired target can be achieved in a short period of time. ROS tolerant plants can be bred.
  • Reference Example 1 Identification of ROS resistance-related genes 1. Extraction of Candidate Gene by RNA-seq Analysis We induced ROS-resistant mutant strains, and extracted candidate genes related to resistance by RNA-seq analysis for mutant strains with particularly high ROS-resistant ability.
  • Mutation treatment was performed on cultured cells (callus) of Japanese cedar (Cryptomeria Japonica), and a mutant cell library was obtained in which mutations were introduced at random.
  • ROS-resistant mutant strains were selected from the library by coating the library on a selective medium and culturing with ROS stress.
  • SR11, SR13, SR14, and SR17 were found to have known genes with 90.7-100% identical base sequences, but information on knockout/knockdown of these genes and their relationship with ROS resistance were found.
  • the nucleotide sequence of SR11 has 99.7% sequence identity with the gene registered in GenBank AK408222.1.
  • the nucleotide sequence of SR13 is registered in GenBank: KY010969.1.
  • the SR14 nucleotide sequence has 100% sequence identity with the gene registered in GenBank: AK414819.1
  • the SR17 nucleotide sequence is GenBank: AK413080.1 and GenBank: 100% sequence identity with the gene registered in AK416259.1).
  • SR10, SR15, SR24, SR25 no genes with similar base sequences (identity of 80% or more) were found.
  • Example 1 Generation of plants with ROS tolerance1. Cultivation of Sugi Callus (Somatic Embryogenic Cells) In this example, Cryptomeria Japonica callus having somatic embryogenic ability (hereinafter referred to as Sugi callus) was used.
  • Sugi callus Cryptomeria Japonica callus having somatic embryogenic ability
  • Cedar callus is cultured in 1/2MD medium, and the composition of 1/2MD medium is as follows. 1.315g/L Murashige & Skoog Medium Mod. No.3B [manufactured by Duchefa Biochemie], 30g/L sucrose, 2 ⁇ M 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 0.5g/L glutamine, 1g/L casein hydrolyzate [Casamino Acid,Vitamin Assay/manufactured by Difco]. The medium was adjusted to pH 5.6 to 5.8, and 4 g/L Gelrite or 10 g/L Agar was added to the solid medium. Cultivation was performed aseptically at a culture temperature of 25°C. Sugi callus was subcultured on a solid medium and subcultured once every 1 to 2 weeks.
  • CRISPR/Cas9 system Overview of target gene disruption method by genome editing
  • the CRISPR/Cas9 system was used for target gene disruption.
  • a vector that expresses a guide RNA (gRNA) containing a 20-base sequence (guide sequence) that is complementary to SpCas9 derived from Streptococcus pyogenes and a specific site of the target gene is introduced into Sugi callus. and induced repair errors (base deletions, insertions, etc.) that occur in the DNA repair process that occurs after the double-stranded DNA at the target site is cleaved by the Cas9 protein.
  • gRNA guide RNA
  • induced repair errors base deletions, insertions, etc.
  • the 20 bases upstream of the 5' side of the protospacer adjacent motif (PAM) sequence (5'-NGG-3'; N is an arbitrary base) in the cDNA sequence of each target gene was used as the guide sequence. . Furthermore, a sequence having a restriction enzyme site on the Cas9 cleavage site was selected as a guide sequence. Table 1 summarizes the guide sequence set for each gene, the position of the guide sequence on the cDNA, and the restriction enzyme site associated with the assumed cleavage site by Cas9.
  • the cDNA is a complementary DNA obtained by reverse transcription of mRNA, and the cDNA sequence corresponds to the mRNA sequence.
  • pGECj contains a CRISPR/Cas9 unit expressed in Japanese cedar, a kanamycin resistance marker for plants, an origin of replication for E. coli, an origin of replication for Agrobacterium, a spectinomycin resistance marker for E. coli/Agrobacterium, and a marker for integrating the cassette onto the plant chromosome.
  • T-DNA border sequences (LB, RB) are loaded. The guide sequence of each target gene shown in Table 2 was inserted into the "Guide sequence" portion shown in FIG.
  • the genome editing vector into which the guide sequence (SEQ ID NO: 25) for the SR10 gene was inserted was designated as pGECj-SR10
  • the genome editing vector into which the guide sequence for the SR11 gene (SEQ ID NO: 26) was inserted was designated as pGECj-SR11 and the guide for the SR13 gene.
  • pGECj-SR13 for the genome editing vector with the inserted sequence (SEQ ID NO: 27), pGECj-SR14 for the genome editing vector with the inserted guide sequence (SEQ ID NO: 28) for the SR14 gene, and pGECj-SR14 for the guide sequence (SEQ ID NO: 29) for the SR15 gene pGECj-SR15
  • pGECj-SR17 the genome editing vector with the guide sequence (SEQ ID NO: 31) for the SR24 gene inserted was pGECj-SR24
  • pGECj-SR25 was a genome editing vector in which the guide sequence (SEQ ID NO: 32) for the SR25 gene was inserted.
  • 1 g of Sugi callus was added and suspended in 20 mL of the suspension.
  • the suspension was shaken at 25°C and 120 rpm for 20 minutes.
  • 10 mL of the shaken suspension was collected (using a vacuum pump) on sterile filter paper set in a Buchner funnel.
  • the filter paper containing the collected cells was placed on a sterilized filter paper (three sheets stacked) to which 5.5 mL of co-culture medium was added, and cultured (co-cultured) at 28°C in the dark.
  • Sugi callus after co-cultivation was suspended in 40 mL of 1/2 MD liquid medium together with the filter paper, and Sugi callus (1 g) was collected as a suspension. Using a centrifuge, the recovered callus was washed three times with 40 mL of 1/2MD liquid medium (150 xg, 1 minute, 25°C).
  • Sugi callus after washing was suspended in 40 mL of 1/2MD medium containing 10 mg/L meropenem (hereinafter referred to as sterilized medium), and 10 mL of the suspension was collected on sterile filter paper set in a Buchner funnel (using a vacuum pump). )did.
  • the filter paper from which the cedar callus was recovered was placed on a solid sterile medium, cultured at 25°C for 3 days, then transferred together with the filter paper to a new solid sterile medium, and cultured again at 25°C for 2 weeks.
  • the Sugi callus was transplanted together with the filter paper onto a 1/2 MD medium containing 50 mg/L kanamycin and 10 mg/L meropenem (hereinafter referred to as selective medium).
  • selective medium a 1/2 MD medium containing 50 mg/L kanamycin and 10 mg/L meropenem
  • the transformants were cultured on a selective medium until they formed colonies, and were subcultured to fresh selective medium at intervals of 2 weeks during the culture period. Transformants grown on the selective medium were picked up and used as transformed callus.
  • Transformed callus was suspended in 1/2 MD liquid medium so that individual cells were separated as much as possible, and adjusted to 50-100 mg-cells/10 mL. 10 mL of suspension was collected (using a vacuum pump) onto a sterile filter paper set in a Buchner funnel. The filter paper from which the transformed callus was recovered was placed on a 1/2MD solid medium supplemented with 2 mM hydrogen peroxide, 30 ⁇ M menadione, or 1 ⁇ M paraquat, and cultured at 25°C. Clones grown by the culture were picked up and used as candidate strains for genome editing.
  • PCR was performed using a primer set (Table 3) designed to sandwich the guide sequence region of each target gene.
  • a primer set (Table 3) designed to sandwich the guide sequence region of each target gene.
  • MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 manufactured by Takara Bio Inc. was used as the DNA polymerase for PCR, the denaturation temperature and elongation temperature were set according to the conditions of the kit, and the annealing temperature was set according to the Tm value of each primer.
  • DNA fragments derived from parent strains are cleaved by restriction enzymes at the restriction enzyme cleavage sites designed in the guide sequence of each gene, but clones subjected to genome editing have sequence mutations at the restriction enzyme cleavage sites on the guide sequences. The site should not be cut by the restriction enzyme. Therefore, it can be determined that a clone in which the restriction enzyme cleavage pattern of target region DNA amplified by PCR is different from that of the parent strain is a clone in which sequence mutation of the target region has occurred due to genome editing.
  • Restriction enzyme TaqI (manufactured by Takara Bio Inc.] was used to determine the presence or absence of sequence mutations in the target regions of the SR10 and SR25 genes, and restriction enzyme treatment was performed at 65°C for 3 hours.
  • the restriction enzyme Hpy188I (manufactured by New England Biolabs] was used to determine the presence or absence of sequence mutations in the target regions of the SR13 and SR14 genes, and restriction enzyme treatment was performed at 37°C for 3 hours.
  • the restriction enzyme HaeIII (manufactured by New England Biolabs] was used to determine the presence or absence of sequence mutations in the target regions of the SR11 and SR17 genes, and restriction enzyme treatment was performed at 37°C for 3 hours.
  • Restriction enzyme NlaIII [manufactured by New England Biolabs] was used to determine the presence or absence of sequence mutation in the target region of the SR15 gene, and restriction enzyme treatment was performed at 37°C for 3 hours.
  • the restriction enzyme AluI (manufactured by Takara Bio Inc.) was used to determine the presence or absence of sequence mutation in the target region of the SR24 gene, and restriction enzyme treatment was performed at 37° C. for 3 hours.
  • the PCR product of the target region and the PCR product after restriction enzyme treatment were confirmed by agarose gel electrophoresis using TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA).
  • Genome-edited strains with sequence mutations in the SR10 gene are #SR10
  • genome-edited strains with sequence mutations in the SR11 gene are #.
  • the genome-edited strain with sequence mutations in the SR11 and SR13 genes is #SR13
  • the genome-edited strain with sequence mutations in the SR14 gene is #SR14
  • the genome-edited strain with sequence mutations in the SR15 gene is #SR15
  • a genome-edited strain with a sequence mutation in the SR17 gene was designated as #SR17
  • a genome-edited strain with a sequence mutation in the SR25 gene is #SR25.
  • ROS stress resistance of genome-edited strains was made by comparing the degree of growth when exposed to ROS stress with that of the parent strain. Hydrogen peroxide was used as a direct ROS source, and paraquat and menadione were used as ROS generators for stress tolerance determination.
  • a 1/2MD solid medium supplemented with hydrogen peroxide (2 mM), menadione (30 ⁇ M), or paraquat (1 ⁇ M) at a concentration that completely inhibits the growth of the parent strain, and a ROS source were added.
  • the genome-edited strain and the parent strain were placed on a normal 1/2 MD medium (hereinafter referred to as Control section), and cultured at 25°C for 2 weeks to compare the growth rates.
  • Fig. 10 shows the results of growth response in various media.
  • the parental strain grew normally in the control section (Fig. 10-A), whereas the growth was completely inhibited in the test sections (Fig. 10-B, C, and D) in which ROS stress was applied.
  • the genome-edited strains showed growth even in the test plots with ROS stress (Fig. 10-B, C, D). All of the SR14 strain, #SR15 strain, #SR17 strain, #SR24 strain, and #SR25 strain can be judged to have improved ROS stress resistance performance.
  • Fig. 11 shows the appearance of redifferentiated individuals obtained by regeneration treatment of genome-edited callus and parent strain callus. Generation of redifferentiated individuals was confirmed in #SR10, #SR11, #SR14, #SR15, #SR17, #SR24, and #SR25.
  • the ROS tolerance of plants can be improved and their CO 2 fixation can be increased. Therefore, the present invention is useful for solving global environment and energy problems.
  • SEQ ID NO: 25 Guide sequence (SR10) SEQ ID NO: 26: Guide sequence (SR11) SEQ ID NO: 27: Guide sequence (SR13) SEQ ID NO: 28: Guide sequence (SR14) SEQ ID NO: 29: Guide sequence (SR15) SEQ ID NO: 30: Guide sequence (SR17) SEQ ID NO: 31: Guide sequence (SR24) SEQ ID NO: 32: Guide sequence (SR25) SEQ ID NO: 33: Forward primer (SR10) SEQ ID NO: 34: Reverse primer (SR10) SEQ ID NO: 35: Forward primer (SR11) SEQ ID NO: 36: Reverse primer (SR11) SEQ ID NO: 37: Forward primer (SR13) SEQ ID NO: 38: Reverse primer (SR13) SEQ ID NO: 39: Forward primer (SR14) SEQ ID NO: 40: Reverse primer (SR14) SEQ ID NO: 41: Forward primer (SR15) SEQ ID NO: 42: Reverse primer (SR15) SEQ ID NO: 43: Forward primer (SR17) SEQ ID NO: 44

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Abstract

本発明は、植物の活性酸素種（ＲＯＳ）耐性に関わる遺伝子、及び前記遺伝子を利用したＲＯＳ耐性を有する植物細胞、前記植物細胞から構成されるＣＯ２固定量の増大した植物等に関する。より詳細には、本発明の植物細胞は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの内因性遺伝子の少なくとも１つについて、当該遺伝子の機能低下をもたらす改変を含み、活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞である：（ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、（ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、（ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる遺伝子。

Description

ストレス耐性植物
関連出願：
　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０２１－５６０５５（２０２１年３月２９日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野：
　本発明は、植物の活性酸素種（ＲＯＳ）耐性に関わる遺伝子、及び前記遺伝子を利用したＲＯＳ耐性を有する植物細胞、前記植物細胞から構成されるＣＯ２固定量の増大した植物等に関する。
　産業革命以降、人類の活動に伴う化石燃料の燃焼等によるＣＯ２の排出による大気中ＣＯ２濃度の上昇が進んでおり、ＣＯ２の排出削減が世界的な課題となっている。その一方で、植物は光合成によりＣＯ２固定を行っており、植物のＣＯ２固定量を高めることで環境中のＣＯ２濃度上昇を抑えられる可能性がある。
　植物によるＣＯ２固定効率を高めるためには光合成効率の向上が必要だと考えられるが、植物は日常的に外界からのストレス（強光、低温、高温、乾燥、塩、大気汚染ガス、病原菌等）を受け続けており、これらの環境ストレスが活性酸素種（ＲＯＳ）を介して光合成効率を低下させていることが知られている（非特許文献1及び２）。
　従って、植物のＲＯＳ耐性能あるいはＲＯＳ除去能を高めることで光合成効率の低下を防ぐことが期待でき、特定の遺伝子を発現させるあるいは特定の物質を植物に作用させるなどして植物のストレス耐性能を高め、バイオマス生産性（ＣＯ２固定量）を改善する研究が進められている（非特許文献３及び４）。
　地上における光合成による炭素固定の大部分は樹木（森林）によるものであり、樹木によるＣＯ２固定効率を改善できればＣＯ２問題解決により大きな貢献ができるものと考えられる。
Choudhury et al., Plant Signaling & Behavior, 8:4, e23681, 2013 Frontiers in Plant Science, Vol 7, article 187, 2016, doi: 10.3389/fpls.2016.00187 Kudo et al., The Plant Journal, Vol 97, 240-256, 2019 Yoshida et al., Applied Microbiology and Biotechnology 60, 665-670, 2003
　本発明の課題は、植物のＲＯＳ耐性能を高めることで、そのＣＯ２固定効率を改善させるための新たな手段を提供することにある。
　発明者らは、国内森林資源の中で最も多いスギについて研究を行い、遺伝子破壊によってＲＯＳ耐性能が付与されるような遺伝子に着目し、効果の検証を行った。そして、植物のＲＯＳ耐性に関与する遺伝子を特定し、その破壊によって、植物のＲＯＳ耐性が向上することを確認した。
　本発明は、上記研究結果に基づくものであり、以下の［１］～［１２］に関する。
［１］　活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞であって、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの内因性遺伝子の少なくとも１つについて、当該遺伝子の機能低下をもたらす改変を含む、前記植物細胞：
（ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
（ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
［２］　前記内因性遺伝子の機能低下をもたらす改変が、前記内因性遺伝子の機能喪失をもたらすゲノム配列上の変異である、［１］に記載の植物細胞。
［３］　前記内因性遺伝子の機能低下をもたらす改変が、前記内因性遺伝子の発現を低下させるか、又は発現を破壊する変異である、［１］に記載の植物細胞。
［４］　前記内因性遺伝子の機能低下をもたらす改変が、前記内因性遺伝子のＯＲＦ領域における１又は２以上のインデルである、［１］に記載の植物細胞。
［５］　請求項［１］～［４］のいずれかに記載の植物細胞で構成される植物体又はその一部。
［６］　植物体の一部が、カルス、植物組織、植物組織培養物、種子、果実、葉、茎、幹、根、及び花からなる群より選ばれるいずれかである、［５］に記載の植物体又はその一部。
［７］　植物体のＣＯ２固定量が増大している、［５］又は［６］に記載の植物体又はその一部。
［８］　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの遺伝子：
（ａ）配列番号１、３、５、７及び８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号１、３、５、７及び８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物の活性酸素種（ＲＯＳ）耐性をもたらす遺伝子、
（ｃ）配列番号１、３、５、７及び８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
［９］　植物が、ヒノキ科、マツ科、フトモモ科、及びカバノキ科から選ばれるいずれかの植物である、［１］～［４］のいずれかに記載の植物細胞、［５］～［７］のいずれかに記載の植物体又はその一部、あるいは［８］に記載の遺伝子。
［１０］　ＣＯ２固定量が増大した植物の作製方法であって、活性酸素種（ＲＯＳ）耐性関連遺伝子の少なくとも１つについて、その機能低下をもたらす改変を含む植物細胞を取得し、前記植物細胞から植物体を生成させることを特徴とし、
　前記ＲＯＳ耐性関連遺伝子が、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかである、前記方法：
（ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
（ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
［１１］　植物体のＣＯ２固定量を増大させる方法であって、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の少なくとも１つについて、その機能低下をもたらす改変を行い、前記植物細胞から植物体を生成させることを特徴とし、
　前記ＲＯＳ耐性関連遺伝子が、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかである、前記方法：
（ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
（ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
［１２］　植物が、ヒノキ科、マツ科、フトモモ科、及びカバノキ科から選ばれるいずれかの植物である、［１０］又は［１１］に記載の方法。
　本発明によれば、植物のＲＯＳ耐性を高め、これにより植物のＣＯ２固定量を増大させることができる。とくに、国内森林資源の中で最も多いスギについてそのＣＯ２固定量を増大させることは、地球温暖化等の環境問題にとって有用である。
　本発明の方法は、植物体まで育てて判断する従来の突然変異育種とは異なり、培養細胞（カルス）のゲノムを改変することにより、ＲＯＳ耐性関連遺伝子のスクリーニングから評価までを短期間で行うことができる。
図１は、ゲノム編集用ベクター（pGECj）の構造を示す。 図２は、#SR10株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR10株（SR10遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR10遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR10株（SR10遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（TaqI）処理」、レーン 4：親株（SR10遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（TaqI）処理」 図３は、#SR11株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR11株（SR11遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR11遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR11株（SR11遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（HaeIII）処理」、レーン 4：親株（SR11遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（HaeIII）処理」 図４は、#SR13株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR13株（SR13遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR13遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR13株（SR13遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（Hpy188I）処理」、レーン 4：親株（SR13遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（Hpy188I）処理」 図５は、#SR14株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR14株（SR14遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR14遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR14株（SR14遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（Hpy188I）処理」、レーン 4：親株（SR14遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（Hpy188I）処理」 図６は、#SR15株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR15株（SR15遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR15遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR15株（SR15遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（NlaIII）処理」、レーン 4：親株（SR15遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（NlaIII）処理」 図７は、#SR17株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR17株（SR17遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR17遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR17株（SR17遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（HaeIII）処理」、レーン 4：親株（SR17遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（HaeIII）処理」 図８は、#SR24株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR24株（SR24遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR24遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR24株（SR24遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（AluI）処理」、レーン 4：親株（SR24遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（AluI）処理」 図９は、#SR25株の配列変異を確認した結果を示す。　M：100bp Ladder Marker、レーン 1：#SR25株（SR25遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 2：親株（SR25遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素未処理」、レーン 3：#SR25株（SR25遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（TaqI）処理」、レーン 4：親株（SR25遺伝子ターゲット領域PCR産物）「制限酵素（TaqI）処理」 図１０は、各種培地での生育応答の結果を示す。　A：コントロール、B:2mM メナジオン、C:30μM メナジオン、D:1μM パラコート；生育評価時の各クローンの配置は図１０右に示す（上段左から#SR10、#SR11、#SR13、#SR14、中段左から#SR15、#SR17、#SR24、#SR25、下段中央が親株） 図１１は、ゲノム編集カルスおよび親株カルスの再分化処理によって得られた再分化個体を示す。いずれのゲノム編集体も発芽個体形成を確認でき、発芽・発根率も親株と遜色ないレベルである。
１．活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞
　本発明は、活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞に関する。本発明の植物細胞は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの内因性遺伝子の少なくとも１つについて、当該遺伝子の機能低下をもたらす改変を含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
（ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子
　本明細書において、「活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｓｐｅｃｉｅｓ）」とは、酸素分子（Ｏ２）に由来する反応性に富んだ一群の分子群の総称であり、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２ －）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）、一重項酸素等が含まれる。植物細胞において、環境ストレスの多くはＲＯＳを生じさせ、植物の生育や生産性に影響を与える。
（ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
（ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子
　本明細書において、「植物細胞」は特に限定されないが、木本植物（樹木）の細胞が好ましく、ヒノキ科（Cupressaceae）、マツ科（Pinaceae）、フトモモ科（Myrtaceae）、又はカバノキ科（Betulaceae）の植物の細胞がより好ましい。
　ヒノキ科の植物としては、例えば、下記の植物を挙げることができる（Gadek et al., 2000）。なかでも、スギ亜科の植物が好ましく、スギがより好ましい。
　ヒノキ亜科：ヒノキ属（ヒノキ、サワラ等）、アスナロ属（ヒバ、アスナロ等）、ネズコ属（ネズコ、ニオイヒバ等）、ビャクシン属（ビャクシン等）、フッケンヒバ属（フッケンヒバ等）、イトスギ属（イタリアサイプレス等）、コノテガシワ属（コノテガシワ）、オニヒバ属（ショウナンボク等）、マオウヒバ属（マオウヒバ等）、ウスリーヒバ属（ウスリーヒバ等）；
　カリトリス亜科：Actinostrobus 属（A. acuminatus）、Austrocedrus 属（A. chiliensis）、Callitris 属（C. rhomboidea）、Diselma 属（D. archeri）、Fitzroya 属（F. aupressoides）、Libocedrus 属（L. bidwillii）、Neocallitropsis（属 N. araucarioides）、Papuacedrus 属（P. papuana）、Pilgerodendron属（P. uviferum）、Widdringtonia属（W. schwartzii）；
　スギ亜科：スギ属（スギ）、ラクウショウ属（ラクウショウ等）、スイショウ属（スイショウ）；
　セコイア亜科：セコイア属（セコイア）、セコイアデンドロン属（セコイアデンドロン）、メタセコイア属（メタセコイア）；
　タスマニアスギ亜科：タスマニアスギ属（タスマニアスギ等）；
　タイワンスギ亜科：タイワンスギ属（タイワンスギ等）；
　コウヨウザン亜科：コウヨウザン属（コウヨウザン等）。
　マツ科の植物としては、例えば、下記の植物を挙げることができる。なかでもマツ亜科、トウヒ亜科の植物が好ましく、アカマツ、スコッチ・パインおよびヨーロッパトウヒがより好ましい。
　マツ亜科： マツ属（スイスマツ、ロッジポールパイン、アカマツ、タギョウショウ、リュウキュウマツ、ダイオウショウ、ゴヨウマツ、キタゴヨウ、ハイマツ、ラジアータ・パイン、リギダマツ、スコッチ・パイン（別名オウシュウアカマツ）、テーダマツ、クロマツ等）；
　トウヒ亜科：トウヒ属（ヨーロッパトウヒ（別名オウシュウトウヒ、ドイツトウヒ、ヨーロッパスプルース）、エンゲルマントウヒ、アカエゾマツ、エゾマツ等）；
カラマツ亜科：カラマツ属（ヨーロッパカラマツ、ダイマツ、カラマツ、タカネカラマツ等）、ギンサン属、トガサワラ属（ベイマツ等）；
　モミ亜科：モミ属（モミ、アメリカオオモミ、ウラジロモミ、ミヤマバルサムモミ、オオシラビソ、ノルドマンモミ、トドマツ、シラビソ等）、ヒマラヤスギ属、ユサン属、ノトツガ属、イヌカラマツ属、ツガ属（コメツガ、ツガ等）。
　フトモモ科の植物としては、例えば、下記の植物を挙げることができる。なかでもLeptospermoideae亜科の植物が好ましく、ユーカリがより好ましい。
　Leptospermoideae亜科：ブラシノキ属（ブラシノキ等）、ユーカリ属（ユーカリ等）、ギョリュウバイ属（ギョリュウバイ等）、コバノブラシノキ属（ティーツリー等）；
　Myrtoideae亜科：エウゲニア属（ピタンガ等）、オガサワラフトモモ属（ムニンフトモモ、ポフトゥカワ、ハワイフトモモ、ラタ、サザンラタ等）、キブドウ属（カムカム等）、ギンバイカ属（ギンバイカ等）、ピメンタ属（オールスパイス等）、バンジロウ属（グァバ等）、テンニンカ属（テンニンカ等）、フトモモ属（フトモモ、チョウジ、アデク、ヒメフトモモ、レンブ等）。
　カバノキ科の植物としては、例えば、下記の植物を挙げることができる。なかでも、カバノキ亜科が好ましく、シラカバがより好ましい。
　カバノキ亜科：ハンノキ属、カバノキ属（シラカバ等）；
　ハシバミ亜科：クマシデ属（クマシデ、イヌシデ、アカシデ等）、ハシバミ属（ハシバミ、ツノハシバミ、セイヨウハシバミ等）、アサダ属（アサダ等）。
　本発明の植物細胞は、本明細書の後の章で詳述する「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」について、少なくとも１つの当該遺伝子の機能低下をもたらす改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。
　ここで、「機能低下」とは、ＲＯＳ耐性関連遺伝子が担う生物学的機能の阻害、低下又は喪失を意味する。例えば、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の発現の阻害、低下、又は喪失による当該遺伝子が担う生物学的機能の阻害、低下又は喪失、及び、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の翻訳産物であるタンパクの発現の阻害、低下又は喪失、前記タンパクの構造変化や機能抑制によりもたらされる前記遺伝子が担う生物学的機能の阻害、低下又は喪失のすべてを含む。
　ＲＯＳ耐性関連遺伝子の機能低下をもたらす「改変」は、人為的改変であって、自然の突然変異は含まない。前記「改変」は、ＲＯＳ耐性関連遺伝子自体の改変（変異、修飾）のほか、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の転写制御に関わる領域の改変（変異、修飾）、外来遺伝子や外来物質の導入であってもよい。
　好ましくは、「改変」は、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の機能低下や機能喪失、より好ましくは機能喪失をもたらすゲノム配列上の変異であり、さらに好ましくは、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の発現を破壊する変異である。ＲＯＳ耐性関連遺伝子の発現を破壊する変異は、例えば、ＲＯＳ耐性関連遺伝子のＯＲＦ領域における１又は２以上のインデルが挙げられる。
　前記「改変」を植物細胞に導入する方法としては、例えば、部位特異的ヌクレアーゼやデアミナーゼなどによるゲノム編集、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入、ＲＮＡ干渉、アンチセンスやリボザイムの利用などが挙げられるが、本発明の趣旨を超えない範囲でこれに限定されるものではない。育種の効率や改変の確度の点からは、部位特異的ヌクレアーゼによるゲノム編集が好ましい。
［ゲノム編集］
ａ）部位特異的ヌクレア―ゼ
　部位特異的ヌクレア―ゼを利用して、ＲＯＳ耐性関連遺伝子に、その発現量や構造変化をもたらす変異を導入することができる。部位特異的ヌクレア―ゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、トランスアクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１２ａ、及びＣａｓニッカーゼ（Ｃｐｆ１）等を挙げることができる。
ｂ）ＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ）
　ＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ）は、植物細胞で発見された３５アミノ酸の繰り返し構造からなるタンパク質で、ＲＮＡ塩基配列特異的に結合する核酸結合タンパク質である。このＰＰＲを利用して、ＲＮＡを特異的に切断したり、特定の塩基を置換することができる。
ｃ）オリゴヌクレオチド誘発突然変異導入技術（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ＯＤＮ）
　ゲノム上の標的となる塩基配列に相同的かつ１塩基程度の変異を有する、オリゴヌクレオチド又は短い１本鎖ＤＮＡ断片（２０～３０塩基長程度）を合成し、パーティクルガン法等で直接細胞中に導入することで、特定の遺伝子の配列に変異を導入することができる。
ｄ）ヌクレオチドの書き換え
　デアミナーゼを利用してヌクレオチドを書き換えることで、点変異を誘導する手法である。ＣＲＩＳＰＲシステムなどと組み合わせれば、部位特異的な点変異導入によるゲノム編集も可能である。
［遺伝子組み換え］
ａ）ＲＮＡｉ法
　２１～２３ｂｐの短鎖二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ)又は長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ＲＮＡ）を導入し、発現させることで、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を切断することにより、遺伝子発現を抑制することができる。
ｂ）アンチセンス法
　目的遺伝子のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡを発現させることで二重鎖ＲＮＡを作り、ｍＲＮＡの転写を阻害、又は、ｍＲＮＡを分解して遺伝子発現を抑制することができる。
ｃ）リボザイムの利用
　触媒として働くＲＮＡ（リボザイム）を導入し、発現させることで、転写後のＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を制御することができる。
ｄ）遺伝子ターゲッティング（相同組換え）
　相同組換えを利用して内在性遺伝子を改変する手法である。植物では成功例は少ないものの、目的遺伝子領域を変異の入った遺伝子と置換したり、削除することができる。
ｅ）Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｅの導入
　変異を導入して機能をなくした遺伝子を導入し、大量に発現させることにより、機能のある遺伝子の働きを抑える手法である。例えば、制御遺伝子がＤＮＡに結合するような場合、その領域を機能のない遺伝子が占有すること（発現量が多いので）で制御遺伝子の機能を抑制できる。
［その他］
ａ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡメチレーション
　遺伝子の発現に関わる領域の一部塩基をメチル化することにより、当該遺伝子の発現を制御する技術である。発現を抑制したい遺伝子のプロモーター領域の一部配列（標的配列）に相同的なＤＮＡ断片を細胞内に導入すると、当該ＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡを介して標的配列の一部塩基がメチル化され遺伝子の発現が抑制（不活化）される。ＤＮＡ断片の消失後も、プロモーターのメチル化状態は、少なくとも数世代にわたり後代に引き継がれるため、当該ＲＮＡ産生遺伝子を標的の生物のゲノムに組み込まない場合又は、組み込んだ後に除去した場合、生物が元々有するゲノム上の塩基配列情報を変更することなく、特定の内在性遺伝子の発現を抑制することができる。
ｂ）プロモーター領域のインデル
　標的遺伝子のプロモーター領域に、ＤＮＡの挿入又は欠失を導入することで、その転写機能を抑制、削除し、特定の内因性遺伝子の発現を抑制することができる。
　本発明の植物細胞は、上記したＲＯＳ耐性関連遺伝子の機能低下をもたらす改変により、野生型細胞よりも高いＲＯＳ耐性を有する。
２．ＲＯＳ耐性を有する植物体又はその一部
　本発明は、上記植物細胞で構成される植物体又はその一部も提供する。本明細書において、「植物体の一部」は、特に限定されず、カルス、植物組織、植物組織培養物、種子、果実、葉、茎、幹、根、及び花などを挙げることができる。
　本発明の植物体は、野生型よりも高いＲＯＳ耐性を有する。ＲＯＳ耐性の付与は、植物体に環境ストレスに対する耐性を与え、光合成効率の低減を緩和し、結果としてＣＯ２固定量を増加させる。
３．ＲＯＳ耐性関連遺伝子
　本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」とは、その機能低下が植物にＲＯＳ耐性を付与する内因性遺伝子として特定された遺伝子である。
３．１　ＲＯＳ耐性関連遺伝子の特定
　本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」は、例えば、以下の２段階の試験によってスクリーニングし、特定することができる。
［第１の試験：候補遺伝子の抽出］
１）植物細胞を変異処理して、ランダムに変異を導入して変異細胞ライブラリーを作製する工程
２）前記変異細胞ライブラリーからＲＯＳ耐性を有する細胞株を選択する工程
３）選択された細胞株と野生株の配列を比較し、野生株に対して有意に発現が抑制されている内因性遺伝子、又は、選択された細胞株において変異を有する内因性遺伝子を抽出する工程
　工程１において、変異ライブラリーは、当該分野で公知の方法にしたがって構築できる。変異の導入方法は特に限定されず、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジンやエチルメタンスルホン酸などのアルキル化剤処理、５－ブロモウラシルや２－アミノプリンなどの核酸塩基アナログ処理、γ線やＸ線、重イオンビームなどのエネルギー線照射、トランスポゾンやＴ－ＤＮＡを用いる遺伝子操作などの変異処理を植物細胞に施せばよい。植物細胞としては、「１．活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞」に記載した植物細胞を用いることができ、例えば、実施例に記載するスギの不定胚形成能を有するカルスを使用することができる。
　工程２において、ＲＯＳ耐性を有する細胞株の選択は、変異細胞ライブラリーを選択培地（ＲＯＳストレス付与）で培養し、生存コロニーからＲＯＳ耐性変異株を選抜することにより実施できる。選択培地は、使用する植物細胞の生育に適した培地であれば特に限定されないが、固形培地が好ましく、ＲＯＳストレスを付与する方法としては過酸化水素等の直接的なＲＯＳ源の添加、パラコートなどのＲＯＳ発生剤の添加、ヒドロキシウレアやアミノオキシ酢酸などの細胞によるＲＯＳ除去代謝を阻害する薬剤の添加等が挙げられる。親株と比較してＲＯＳ耐性が向上しているものをＲＯＳ耐性株として選択する。必要に応じて、複数の異なるストレス条件に細胞を暴露し、ＲＯＳ耐性の程度を評価し、様々なＲＯＳストレス環境下においてより強いＲＯＳ耐性を示す株を選択してもよい。
　工程３において、ＲＯＳ耐性株からの候補遺伝子の抽出は、例えばＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を用いて行うことができる。解析は、発現解析（親株に比して発現量が抑制されている遺伝子の抽出）と変異解析（変異によって機能喪失している可能性が高い遺伝子の抽出）
を組み合わせて実施することが好ましい。
［第２の試験：機能評価］
１）第１の試験で抽出された内因性遺伝子のいずれか１つを標的として、当該遺伝子の機能低下をもたらす改変を導入した植物細胞を作製する工程
２）前記植物細胞のＲＯＳ耐性を評価し、前記改変がＲＯＳ耐性をもたらす内因性遺伝子をＲＯＳ耐性関連遺伝子として特定する工程
　工程１において、内因性遺伝子の機能低下をもたらす「改変」は、「１．活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞」で説明した、いずれの「改変」でもよい。好ましくは、「改変」は、内因性遺伝子の機能喪失をもたらすゲノム配列上の変異であり、より好ましくは、内因性遺伝子の発現を破壊する変異であり、例えば、内因性遺伝子のＯＲＦ領域における１又は２以上のインデルである。
　前記「改変」を植物細胞に導入する方法も、「１．活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞」で説明した方法を使用することができる。例えば、部位特異的ヌクレアーゼやデアミナーゼなどによるゲノム編集、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入、ＲＮＡ干渉、アンチセンスやリボザイムの利用などが挙げられる。なかでも、簡便さと効率の点から、部位特異的ヌクレアーゼによるゲノム編集、とくに標的遺伝子のＯＲＦ領域におけるインデルの導入が好ましい。
３．２　ＲＯＳ耐性関連遺伝子の塩基配列
　本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」の好適な例として、配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列（ｃＤＮＡ配列）を含む遺伝子を挙げることができる。本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」は前記配列に限定されず、当該塩基配列と高い配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子も、その機能低下が植物にＲＯＳ耐性を付与する限り、本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」に包含される。
　例えば、配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有し、かつ、その機能低下が植物にＲＯＳ耐性を付与する遺伝子もまた、本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」に包含される。
　配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列を含む（好ましくは、からなる）遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる遺伝子も、その機能低下が植物にＲＯＳ耐性を付与する遺伝子もまた、本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」に包含される。
　ストリンジェントな条件としては、例えば、DNAを固定したナイロン膜を、6×SSC（1×SSCは塩化ナトリウム8.76g、クエン酸ナトリウム4.41gを1リットルの水に溶かしたもの）、1％SDS、100μg/mlサケ精子DNA、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコールを含む溶液中で65℃にて20時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「1×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、50℃」等の条件を挙げることができる。
　「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」は、好ましくは、ヒノキ科、マツ科、フトモモ科、又はカバノキ科のいずれかの植物由来の遺伝子である。
　本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」の推定ＯＲＦは、配列番号９～１６に示され、それぞれ配列番号１７～２４に示される推定アミノ酸配列をコードする。本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」には、配列番号１７～２４と高い相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子も、その機能低下が植物にＲＯＳ耐性を付与する限り、本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」に包含される。
　例えば、配列番号１７～２４に示されるいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ、その機能低下が植物にＲＯＳ耐性を付与する遺伝子もまた、本発明の「ＲＯＳ耐性関連遺伝子」に包含される。
　配列番号１～８に示されるＲＯＳ耐性関連遺伝子のｃＤＮＡ配列、及び、配列番号９～１６に示されるＲＯＳ耐性関連遺伝子の推定ＯＲＦの塩基配列、ならびに前記配列に対応したＲＮＡ配列は、その一部を、ＲＯＳ耐性関連遺伝子を増幅するためのプライマーや、ゲノム編集のためのガイドＲＮＡ配列として利用することができる。
　例えば、配列番号１～８もしくは配列番号９～１６に示されるいずれかの塩基配列、又は前記配列に相補的な塩基配列中の連続した１７～２５塩基を含むＲＮＡは、ＲＯＳ耐性関連遺伝子のゲノム編集のためのガイドＲＮＡとして利用できる（但し、前記配列番号中、ＴはＵと読み替える）。そのようなガイドＲＮＡの一例は、配列番号２５～３２に示される（但し、前記配列番号中、ＴはＵと読み替える）。
　また、配列番号１～８もしくは配列番号９～１６に示されるいずれかの塩基配列、又は前記配列に相補的な塩基配列中の連続した１７～２５塩基を含むＤＮＡは、ＲＯＳ耐性関連遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーとして利用できる。そのようなプライマーの一例は、配列番号３３～４８に示される。
４．植物におけるＣＯ２固定量の増大
　前述のとおり、環境ストレスの多くは、ＲＯＳを介して、植物の光合成効率を低下させる要因となっている。植物のＲＯＳ耐性の向上は、環境ストレスによる光合成効率の低下を防止し、これにより、ＣＯ２固定量の増大をもたらす。本発明は、前記ＲＯＳ耐性関連遺伝子を利用することで、植物体のＣＯ２固定量を増大させる方法、及び、ＣＯ２固定量が増大した植物の作製方法を提供する。
　本発明にかかる、植物体のＣＯ２固定量を増大させる方法は、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の少なくとも１つについて、その機能低下をもたらす改変を行い、前記植物細胞から植物体を生成させることを特徴とする。
　本発明にかかる、ＣＯ２固定量が増大した植物の作製方法は、ＲＯＳ耐性関連遺伝子の少なくとも１つについて、その機能低下をもたらす改変を含む植物細胞を取得し、前記植物細胞から植物体を生成させることを特徴とする。
　使用するＲＯＳ耐性関連遺伝子は、上記３．１に規定した方法で特定されたものであれば、特に限定されない。ＲＯＳ耐性関連遺伝子の好適な例は、上記３．２に記載した遺伝子であり、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を挙げることができる：
（ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物の活性酸素種（ＲＯＳ）耐性をもたらす遺伝子。
　「機能低下をもたらす改変」や、「改変」の方法については、「１．活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞」に記載したとおりである。
　本発明の方法で作製されたＣＯ２固定量が増大した植物は、地球温暖化等の環境問題にとって有用である。また、培養細胞（カルス）のゲノム改変により、ＲＯＳ耐性関連遺伝子のスクリーニングから評価を行う本発明の方法は、植物体まで育てて判断する従来の突然変異育種とは異なり、短期間で目的とするＲＯＳ耐性植物を育種することができる。
　以下、参考例及び実施例を用いて、本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１：ROS耐性関連遺伝子の特定
１．RNA-seq解析による候補遺伝子の抽出
　ROS耐性変異株を誘導し、特にROS耐性能の高い変異株について、RNA-seq解析により耐性に関連する遺伝子候補を抽出した。
　スギ（Cryptomeria Japonica）の培養細胞（カルス）に変異処理を行い、ランダムに変異を導入した変異細胞ライブラリーを取得した。ライブラリーを選択培地に塗布し、ROSストレスを付与して培養を行うことで、ROS耐性変異株をライブラリーより選抜した。
　ROS耐性株と親株の配列をRNA-seqにより比較し、ROSストレスに対して負の制御応答を行う転写因子、又は親株に比べて有意に発現抑制されている転写因子を抽出した（61遺伝子抽出）。さらに、ROS耐性変異株の変異箇所を特定し、変異の確認された遺伝子の中から機能損失を伴う可能性が高い変異が導入された遺伝子を抽出した（21遺伝子抽出）。抽出された遺伝子のなかからより確度が高いと思われる31遺伝子を選択し、次の段階のターゲットに設定した。
２．ノックアウトによるROS耐性関連遺伝子の特定
　RNA-seq解析で抽出された31遺伝子をゲノム編集によりノックアウトすることで、スギカルスのROSストレス耐性能が向上する遺伝子（SR10、SR11、SR13、SR14、SR15、SR17、SR24、SR25）を特定した。特定した8遺伝子の配列情報を下表及び配列表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　8遺伝子のうちSR11、SR13、SR14、SR17の4遺伝子については、塩基配列が90.7-100％一致する公知遺伝子が見出されたが、当該遺伝子のノックアウト／ノックダウンに関する情報やROS耐性との関連を示す報告は見出されなかった（SR11の塩基配列は、GenBank AK408222.1で登録されている遺伝子と99.7％の配列同一性を有する。SR13の塩基配列は、GenBank: KY010969.1で登録されている遺伝子と90.7％の配列同一性を有する。SR14の塩基配列は、GenBank: AK414819.1で登録されている遺伝子と100％の配列同一性を有する。SR17の塩基配列はGenBank: AK413080.1及びGenBank: AK416259.1で登録されている遺伝子と100％の配列同一性を有する）。他の4つの遺伝子（SR10、SR15、SR24、SR25）については、塩基配列が類似する（同一性80％以上の）遺伝子は見出されなかった。
実施例１： ROS耐性を有する植物の作製
１．スギカルス（不定胚形成細胞）の培養
　本実施例においては、Cryptomeria Japonicaの不定胚形成能を有するカルス（以下、スギカルス）を使用した。
　スギカルスの培養は1/2MD培地で行い、1/2MD培地の組成は下記の通りである。1.315g/L Murashige & Skoog Medium Mod. No.3B[Duchefa Biochemie社製]、30g/Lショ糖、2μM 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、0.5g/L グルタミン、1g/L カゼイン加水分解物[Casamino Acid,Vitamin Assay /Difco社製]。なお、培地はpH5.6~5.8に調整し、固形培地には4g/L ゲルライトもしくは10g/L Agarを添加した。培養は無菌的に行い、培養温度は25℃とした。スギカルスの継代培養は固形培地にて行い、1～2週間に一度の頻度で継代を行った。
２．ゲノム編集（CRISPR/Cas9システム）を用いたターゲット遺伝子の破壊
・ゲノム編集によるターゲット遺伝子破壊法の概要
　ターゲット遺伝子の破壊にはCRISPR/Cas9システムを使用した。具体的には、Streptococcus pyogenes由来のSpCas9とターゲット遺伝子の特定部位に対して相補的な20塩基の塩基配列（以下、ガイド配列）を含むガイドRNA（以下、gRNA）を発現するベクターをスギカルスに導入し、Cas9タンパクによるターゲット部位の二本鎖DNAの切断後に起こるDNA修復過程で生ずる修復エラー（塩基の欠失、挿入等）を誘導した。
・ガイド配列の設計
　各ターゲット遺伝子におけるcDNA配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列（5’-NGG-3’；Nは任意の塩基）の5’側上流側の20塩基をガイド配列とした。さらに、Cas9による切断部位上に制限酵素サイトが存在する配列をガイド配列として選定した。各遺伝子に対して設定したガイド配列及びガイド配列のcDNA上における位置及びCas9による想定切断部位にかかる制限酵素サイトを表1にまとめた。なお、cDNAとはmRNAを逆転写することで得られる相補的DNAであり、cDNA配列がmRNA配列に対応するものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
・ゲノム編集用ベクターの構造
　ゲノム編集用ベクターとしてpGECj（図1）を使用した。pGECjにはスギで発現するCRISPR/Cas9ユニット、植物用カナマイシン耐性マーカー、大腸菌用複製起点、アグロバクテリウム用複製起点、大腸菌/アグロバクテリウム用スペクチノマイシン耐性マーカー、植物染色体上にカセットを組み込むためのT-DNAのボーダー配列（LB,RB）が搭載されている。なお、図１に示される「Guide sequence」部分に表2に示される各ターゲット遺伝子のガイド配列を挿入した。
　SR10遺伝子用のガイド配列（配列番号25）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR10とし、SR11遺伝子用のガイド配列（配列番号26）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR11、SR13遺伝子用のガイド配列（配列番号27）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR13、SR14遺伝子用のガイド配列（配列番号28）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR14、SR15遺伝子用のガイド配列（配列番号29）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR15、SR17遺伝子用のガイド配列（配列番号30）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR17、SR24遺伝子用のガイド配列（配列番号31）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR24、SR25遺伝子用のガイド配列（配列番号32）を挿入したゲノム編集ベクターをpGECj-SR25とした。
・アグロバクテリウムへのゲノム編集用ベクターの導入
　形質転換用のアグロバクテリウムとしてRhizobium radiobacter GV3101株を使用し、GV3101株のElectro-competent cell [lifeasible社製]に対して、エレクトロポレーション法によりpGECj（-SR10,-SR11,-SR13,-SR14,-SR15,-SR17,-SR24,-SR25）を導入した。なお、GV3101株の培養にはリファンピシン25μg/mL 及びゲンタマイシン25μg/mLを添加したYEB培地（5g/L ペプトン、1g/L Yeast Extract、5g/L Beef Extract、5g/L ショ糖、0.5g/L 硫酸マグネシウム七水和物）を使用した。pGECj導入株の培養には100μg/mLのスペクチノマイシンも添加した。GV3101株及びその形質転換体はいずれも28℃、暗所にて培養した。
・アグロバクテリウム法によるスギカルスへのゲノム編集カセットの導入
　アグロバクテリウムを用いたスギカルスの形質転換手順は「形質転換プロトコール[植物編]（化学同人）P.291-292」に従った。
　まず、1/2MD培地に50μMアセトシリンゴンを添加した培地（以下、共存培養培地とする）にpGECjベクターを保有するGV3101株をOD600＝0.15となるように懸濁した。上記懸濁液20mLに対して1gのスギカルスを添加・懸濁した。本懸濁液を25℃、120rpmにて20分間振とうした。振とう後の懸濁液10mLをブフナー漏斗にセットした滅菌ろ紙上に回収（真空ポンプを使用）した。回収細胞を含む上記ろ紙を、共存培養培地5.5mLを添加した滅菌済みろ紙（3枚重ね）上に乗せて28℃、暗所にて培養（共存培養）した。
　共存培養後のスギカルスを40mLの1/2MD液体培地にろ紙ごと懸濁し、スギカルス（1g分）を懸濁液として回収した。遠心分離機を用いて、回収したカルスを40mLの1/2MD液体培地にて3回洗浄した（150×g、1分、25℃）。
　上記洗浄後のスギカルスを10mg/Lメロペネムを含む1/2MD培地（以下、除菌培地）40mLに懸濁した後、懸濁液10mLをブフナー漏斗にセットした滅菌ろ紙上に回収（真空ポンプを使用）した。上記スギカルスを回収したろ紙を固形除菌培地に置床し、25℃で3日間培養後、ろ紙ごと新たな固形除菌培地に移植し、再び25℃にて2週間培養した。
　その後、上記スギカルスを50mg/L カナマイシン及び10mg/Lメロペネムを含む1/2MD培地（以下、選抜培地）にろ紙ごと移植した。移植後、形質転換体がコロニーを形成するまで選抜培地で培養し、培養期間中は2週間間隔で新鮮な選抜培地に継代した。
　選抜培地で生育してきた形質転換体をピックアップし、これを形質転換済カルスとした。
３．形質転換済カルスの純化及びスクリーニング
　形質転換済カルスをできるだけひとつひとつの細胞が分離するように1/2MD液体培地で懸濁後、50～100mg-cells/10mLとなるように調整した。懸濁液10mLをブフナー漏斗にセットした滅菌ろ紙上に回収（真空ポンプを使用）した。上記形質転換済みカルスを回収したろ紙を過酸化水素2mMもしくはメナジオン30μMもしくはパラコート1μMを添加した1/2MD固形培地に置床し、25℃で培養を行った。培養によって生育してきたクローンをピックアップし、これをゲノム編集候補株とした。
４．ゲノム編集候補株のターゲット遺伝子配列変異の確認
・カルスからのゲノムDNAの抽出
　ゲノム編集候補株カルス及び親株カルスの細胞破砕及びゲノムDNAの抽出にはBioMasherII[ニッピ社製]及びKANEKA Easy DNA Extraction Kit version 2[カネカ社製]を用いた。KANEKA Easy DNA Extraction Kit version 2に付属のSolution A 100μLとSolutionAと同程度の容量のカルスを懸濁後、バイオマッシャーにて10～20秒程度破砕を行い、その後のDNA抽出ステップはKANEKA Easy DNA Extraction Kit version 2に従った。
・PCRによるターゲット領域の増幅
　抽出したゲノムDNAを鋳型として、各ターゲット遺伝子のガイド配列領域を挟み込むように設計したプライマーセット（表3）を用いてPCRを行った。PCR時のDNAポリメラーゼとしてMightyAmp DNA Polymerase Ver.3[タカラバイオ社製]を使用し、変性温度や伸長温度はキットの条件に従い、アニーリング温度は各プライマーのTm値に応じて設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
・制限酵素を用いたターゲット領域の配列変異の有無判定
　上記プライマーセットを用いたPCRにより増幅されたDNA断片に対して制限酵素処理を行うことでゲノム編集に伴うターゲット遺伝子上の配列変異の有無の検出を行った。親株由来のDNA断片は各遺伝子のガイド配列部分に設計した制限酵素切断部位で制限酵素による切断を受けるが、ゲノム編集を受けたクローンはガイド配列上の制限酵素切断部位に配列変異が生じるために該当部位が制限酵素による切断を受けなくなるはずである。従って、PCRによって増幅されたターゲット領域DNAの制限酵素による切断パターンが親株と異なるクローンはゲノム編集に伴うターゲット領域の配列変異が生じたクローンであると判断できる。
　SR10及びSR25遺伝子のターゲット領域の配列変異有無の判定には制限酵素TaqI[タカラバイオ社製]を使用し、65℃で3時間制限酵素処理を行った。SR13及びSR14遺伝子のターゲット領域の配列変異有無の判定には制限酵素Hpy188I[New England Biolabs社製]を使用し、37℃で3時間制限酵素処理を行った。SR11及びSR17遺伝子のターゲット領域の配列変異有無の判定には制限酵素HaeIII[New England Biolabs社製]を使用し、37℃で3時間制限酵素処理を行った。SR15遺伝子のターゲット領域の配列変異有無の判定には制限酵素NlaIII[New England Biolabs社製]を使用し、37℃で3時間制限酵素処理を行った。SR24遺伝子のターゲット領域の配列変異有無の判定には制限酵素AluI[タカラバイオ社製]を使用し、37℃で3時間制限酵素処理を行った。なお、ターゲット領域のPCR産物及び制限酵素処理後のPCR産物の確認は、TAEバッファー（40mM Tris-acetate,1mM EDTA）を用いたアガロースゲル電気泳動にて行った。
　ターゲット遺伝子のガイド配列上に配列変異の認められたクローンをゲノム編集株とし、SR10遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR10、SR11遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR11、SR13遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR13、SR14遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR14、SR15遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR15、SR17遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR17、SR24遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR24、SR25遺伝子に配列変異が認められたゲノム編集株を#SR25と称した。
　各ゲノム編集株の配列変異を確認した結果を図2（#SR10）、図3（#SR11）、図4（#SR13）、図5（#SR14）、図6（#SR15）、図7（#SR17）、図8（#SR24）、図9（#SR25）に示した。いずれの遺伝子のゲノム編集体も制限酵素処理後のPCR産物の電気泳動パターンが親株と異なっており、各遺伝子のターゲット領域に配列変異が生じていることが確認できた。
５．ゲノム編集株のROSストレス耐性評価
　ゲノム編集株のROSストレス耐性度の評価は、ROSストレスにさらした時の生育度を親株と比較することで判定した。ストレス耐性度判定のために直接的なROS源として過酸化水素を使用し、ROS発生剤としてパラコート及びメナジオンを使用した。
　具体的な評価方法としては、親株の生育が完全に阻止される濃度の過酸化水素（2mM）もしくはメナジオン（30μM）もしくはパラコート（1μM）を添加した1/2MD固形培地及びROS源を添加していない通常の1/2MD培地（以下、Control区）にゲノム編集株及び親株を置床し、25℃にて2週間培養を行ったときの生育度を比較した。
　各種培地での生育応答の結果を図10に示した。親株はControl区（図10-A）では正常に生育するのに対して、ROSストレスを加えた試験区（図10-B,C,D）においては完全に生育が阻害されていた。一方で、ゲノム編集株は親株とは異なりROSストレスを加えた試験区（図10-B,C,D）においても生育を示したことから、#SR10株、#SR11株、#SR13株、#SR14株、#SR15株、#SR17株、#SR24株、#SR25株いずれもROSストレス耐性能が向上したと判断できる。
６．スギカルスの再分化方法
・スギカルスからの不定胚誘導
　直径5mm程度のサイズに取り分けたスギカルス塊をCOM培地に置床し、25℃、暗所にて6～8週間程度培養した。なお、COM培地の組成は表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
・不定胚からの植物体再生
　ピンセットで不定胚をつまみ取りGD培地（20mm厚シャーレ）に置床した。GD培地に置床後、25℃、16時間日長、照度約2,000luxにて培養を行った。約6～8週間程度培養後に得られた発芽個体を、GR培地の入った培養瓶に移植し、2～3cmもしくはそれ以上のサイズの植物体になるまで25℃、16時間日長、照度約2,000luxにて培養を行った。
なお、GD培地を表５に、GR培地の組成は表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ゲノム編集カルスおよび親株カルスの再分化処理によって得られた再分化個体の様子を図11に示した。#SR10、#SR11、#SR14、#SR15、#SR17、#SR24、#SR25において再分化個体の発生を確認できた。
・ポット培養への馴化
　培養瓶（GR培地）で育成した植物体を瓶から取り出した後、植物体についた培地を洗い流し、古い根を消毒したハサミで切除した。定植後の発根を促すため、根と茎の境界付近が漬かるように原液のオキシベロン [バイエルクロップサイエンス社製]で10秒処理した。オキシベロン処理後の植物体をココピート：もみ殻：もみ殻燻炭＝80：20：3で配合した用土が入ったポットに定植し、用土を十分に湿らせた後、ポットをチャック付き袋に入れて乾燥防止処理を行った。定植した苗は、チャック付き袋に入れた状態で25℃、16時間日長、照度約2,000～5,000lux程度の条件下で約3週間育成することでポット培養に馴化させた。
　本発明によれば、植物のＲＯＳ耐性を向上させ、そのＣＯ２固定量を増大させることができる。従って、本発明は、地球環境やエネルギー問題の解決に有用である。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
配列番号２５：ガイド配列（SR10）
配列番号２６：ガイド配列（SR11）
配列番号２７：ガイド配列（SR13）
配列番号２８：ガイド配列（SR14）
配列番号２９：ガイド配列（SR15）
配列番号３０：ガイド配列（SR17）
配列番号３１：ガイド配列（SR24）
配列番号３２：ガイド配列（SR25）
配列番号３３：フォワードプライマー（SR10）
配列番号３４：リバースプライマー（SR10）
配列番号３５：フォワードプライマー（SR11）
配列番号３６：リバースプライマー（SR11）
配列番号３７：フォワードプライマー（SR13）
配列番号３８：リバースプライマー（SR13）
配列番号３９：フォワードプライマー（SR14）
配列番号４０：リバースプライマー（SR14）
配列番号４１：フォワードプライマー（SR15）
配列番号４２：リバースプライマー（SR15）
配列番号４３：フォワードプライマー（SR17）
配列番号４４：リバースプライマー（SR17）
配列番号４５：フォワードプライマー（SR24）
配列番号４６：リバースプライマー（SR24）
配列番号４７：フォワードプライマー（SR25）
配列番号４８：リバースプライマー（SR25）
 

Claims (12)

  1. 　活性酸素種（ＲＯＳ）耐性を有する植物細胞であって、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの内因性遺伝子の少なくとも１つについて、当該遺伝子の機能低下をもたらす改変を含む、前記植物細胞：
    （ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
    （ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
    （ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
  2. 　前記内因性遺伝子の機能低下をもたらす改変が、前記内因性遺伝子の機能喪失をもたらすゲノム配列上の変異である、請求項１に記載の植物細胞。
  3. 　前記内因性遺伝子の機能低下をもたらす改変が、前記内因性遺伝子の発現を低下させるか、又は発現を破壊する変異である、請求項１に記載の植物細胞。
  4. 　前記内因性遺伝子の機能低下をもたらす改変が、前記内因性遺伝子のＯＲＦ領域における１又は２以上のインデルである、請求項１に記載の植物細胞。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の植物細胞で構成される植物体又はその一部。
  6. 　植物体の一部が、カルス、植物組織、植物組織培養物、種子、果実、葉、茎、幹、根、及び花からなる群より選ばれるいずれかである、請求項５に記載の植物体又はその一部。
  7. 　植物体のＣＯ２固定量が増大している、請求項５又は６に記載の植物体又はその一部。
  8. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの遺伝子：
    （ａ）配列番号１、３、５、７及び８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
    （ｂ）配列番号１、３、５、７及び８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物の活性酸素種（ＲＯＳ）耐性をもたらす遺伝子、
    （ｃ）配列番号１、３、５、７及び８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
  9. 　植物が、ヒノキ科、マツ科、フトモモ科、及びカバノキ科から選ばれるいずれかの植物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の植物細胞、請求項５～７のいずれか１項に記載の植物体又はその一部、あるいは請求項８に記載の遺伝子。
  10. 　ＣＯ２固定量が増大した植物の作製方法であって、活性酸素種（ＲＯＳ）耐性関連遺伝子の少なくとも１つについて、その機能低下をもたらす改変を含む植物細胞を取得し、前記植物細胞から植物体を生成させることを特徴とし、
    　前記ＲＯＳ耐性関連遺伝子が、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかである、前記方法：
    （ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
    （ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
    （ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
  11. 　植物体のＣＯ２固定量を増大させる方法であって、活性酸素種（ＲＯＳ）耐性関連遺伝子の少なくとも１つについて、その機能低下をもたらす改変を行い、前記植物細胞から植物体を生成させることを特徴とし、
    　前記ＲＯＳ耐性関連遺伝子が、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかである、前記方法：
    （ａ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子、
    （ｂ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子、
    （ｃ）配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その機能低下が植物のＲＯＳ耐性をもたらす遺伝子。
  12. 　植物が、ヒノキ科、マツ科、フトモモ科、及びカバノキ科から選ばれるいずれかの植物である、請求項１０又は１１に記載の方法。
     
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Non-Patent Citations (10)

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