CN110088284A - 高水平蒂巴因罂粟及其生产的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及具有高水平的蒂巴因的罂粟植物的生产。更具体地，本公开涉及通过同时降低编码蒂巴因6‑O‑脱甲基酶(T6ODM)和可待因3‑O‑脱甲基酶(CODM)的基因的表达来生产具有高水平的蒂巴因的罂粟。

Description

高水平蒂巴因罂粟及其生产的方法
技术领域
本公开涉及具有高水平蒂巴因的罂粟的生产。更具体地，本公开涉及通过同时降低蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的表达/活性生产具有高水平的蒂巴因的罂粟。
背景技术
阿片类药物是源自罂粟(Papaver somniferum)或其合成类似物的精神活性物质。阿片类药物有可能引起物质依赖，其特点是强烈需要服用阿片类药物，难以控制对阿片类药物的使用，尽管有害仍然持续使用阿片类药物，阿片类药物的使用优先于其他活动和义务，耐受性增加及阿片类药物停用后的身体停药反应。
截至2014年，估计有1700万人患有阿片类药物依赖(即阿片类药物成瘾)。大多数依赖阿片类药物的人使用非法种植和制造的海洛因。由于它们的药理作用，高剂量的阿片类药物可引起呼吸抑制和死亡。截至2014年，全球每年约有69 000人因阿片类药物过量而死亡。
在2016年世界毒品报告中，联合国毒品和犯罪问题办公室表示鉴于前几年鸦片产量较高，最近鸦片产量下降不会导致全球海洛因市场严重短缺。因此，可能需要一段时间的鸦片生产持续下降才能在海洛因市场上产生影响。最好有一种通过关闭田间生产精神活性生物碱所必需的罂粟植物基因来破坏鸦片生产的方法。
羟基吗啡酮，例如羟考酮，纳洛酮，纳曲酮，纳布啡和纳美芬是重要的阿片衍生物，因为它们可用作有效的镇痛药和/或麻醉剂拮抗剂。制备这些药物的最实用的合成途径使用生物碱，蒂巴因作为起始原料。其他重要的阿片衍生物如环-C桥联化合物丁丙诺啡和埃托啡实际上也是从蒂巴因制备的。
不幸的是，蒂巴因由于其有限的可用性而成本较高。全合成较困难，并且在罂粟植物中，蒂巴因通常积累到罂粟总生物碱的0.5至2％的低水平。参考图1，蒂巴因存在于吗啡生物合成的分支点，是两种竞争酶的底物。蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)将蒂巴因转化为东罂粟碱，可待因3-O-脱甲基酶(CODM)将蒂巴因转化为诺匹酮。
已经报道了罂粟突变体积累蒂巴因和东罂粟碱而不是吗啡和可待因，包括通过化学诱变得到的TOP1品种(Millgate等人，2004)。虽然TOP1中的代谢阻滞被认为是由于催化蒂巴因和东罂粟碱的6-O-去甲基化的酶的缺陷所致，但是没有确定表型的生化基础。此外，使用微阵列鉴定在TOP1中表达不足的10个基因，该列表不包括理论上能够进行O-去甲基化的任何酶。在2008年3月20日，含有TOP1突变的植物系以ATCC专利保藏号PTA-9110在布达佩斯条约与美国典型培养物保藏中心保藏。WO2009/109012公开了对命名为PTA-9110的系进行诱变以产生另外的累积高水平的蒂巴因的系，其在2008年3月20日以专利保藏号PTA-9109。在布达佩斯条约与美国典型培养物保藏中心保藏。然而，没有探索表型的生化基础。
几年来，研究人员一直对利用分子方法设计罂粟来生产阿片类药物感兴趣，但结果有时出乎意料并令人沮丧。例如，Allen等人(Nature Biotechnology 22：1559-1556)使用RNA干扰(RNAi)沉默编码吗啡生物合成的倒数第二个酶，即可待因酮还原酶(COR)的基因。COR将可待因酮转化为可待因。然而，COR活性的消除导致网脉番荔枝碱的积累，即在COR之前的七个酶促步骤，而非导致可待因酮的积累。网脉番荔枝碱的惊人积累表明阻止中间体从一般的苄基异喹啉合成进入吗啡特异性分支的反馈机制。
发明内容
本公开涉及具有高水平蒂巴因的罂粟的生产。更具体地，本公开涉及通过同时降低蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的表达/活性生产具有高水平的蒂巴因的罂粟。
本公开的各个方面涉及增加罂粟植物中蒂巴因的积累的方法，该方法包括遗传修饰植物以同时降低罂粟植物中蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的活性。野生型T6ODM可具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。野生型CODM可具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在一些实施例中，同时降低T6ODM的活性的遗传修饰所述植物(geneticallymodifying the plant)包括引入减少来自编码T6ODM的内源基因的转录物的积累的表达构建体。在一些实施例中，降低来自编码T6ODM的内源基因的转录物的积累的表达构建体的序列包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。在一些实施例中，同时降低T6ODM活性的遗传修饰植物包括在编码T6ODM的内源基因中引入功能缺失突变。
在一些实施例中，同时降低CODM的活性的遗传修饰所述植物包括引入降低来自编码CODM的内源基因的转录物的积累的表达构建体。在一些实施例中，降低来自编码CODM的内源基因的转录物的积累的表达构建体的序列包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。在一些实施例中，同时降低CODM活性的遗传修饰植物包括在编码CODM的内源基因中引入功能缺失突变。
本公开的各个方面涉及一种生产相对于野生型植物具有增加的蒂巴因水平的罂粟植物的方法，该方法包括：使具有至少一个编码蒂巴因6-O-脱甲基酶基因的功能缺失等位基因的第一亲本与具有至少一个编码可待因3-O-脱甲基酶基因的功能缺失等位基因的第二亲本杂交；并允许具有编码蒂巴因6-O-脱甲基酶基因的功能缺失突变等位基因和编码可待因3-O-脱甲基酶基因的功能缺失等位基因的后代自花授粉以产生对于编码蒂巴因6-O-脱甲基酶基因的功能缺失突变等位基因是纯合的，且对于编码可待因3-O-脱甲基酶基因的功能缺失等位基因是纯合的植物。
本公开的各个方面涉及用于生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；并且降低编码植物中可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达。在一些实施例中，降低编码T6ODM的内源基因的表达包括在编码T6ODM的内源基因中引入或产生功能缺失等位基因。在一些实施例中，降低编码CODM的内源基因的表达包括在编码CODM的内源基因中引入或产生功能缺失等位基因。
在一些实施例中，降低编码T6ODM的内源基因的表达包括表达与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的第一异源核酸分子，其中第一异源核酸分子降低编码T6ODM的内源基因的表达。在一些实施例中，降低编码CODM的内源基因的表达包括在编码CODM的内源基因中引入或产生功能缺失等位基因。在一些实施例中，降低编码CODM的内源基因的表达包括表达与编码CODM的内源基因的一部分同源的第二异源核酸分子，其中第二异源核酸分子降低编码CODM的内源基因的表达。
在一些实施例中，降低编码CODM的内源基因的表达包括表达与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，其中异源核酸分子降低编码CODM的内源基因的表达。在一些实施例中，降低T6ODM活性包括在编码T6ODM的内源基因中引入或产生功能缺失等位基因。
在一些实施例中，功能缺失等位基因包括基因中破坏或点突变。破坏可以是缺失或插入。插入可以是T-DNA或转座因子。
在一些实施例中，第一异源核酸分子通过RNA干扰降低编码T6ODM的内源基因的表达。
在一些实施例中，第二异源核酸分子通过RNA干扰降低编码CODM的内源基因的表达。
在一些实施例中，异源核酸分子通过RNA干扰降低编码CODM的内源基因的表达。
在一些实施例中，异源核酸分子包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。在一些实施例中，异源核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。在一些实施例中，异源核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
在一些实施例中，T6ODM具有与SEQ ID NO：1至少95％同一性的氨基酸序列，且CODM具有与SEQ ID NO：3至少95％同一性的氨基酸序列。
本公开的各个方面涉及一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的第一植物；ii)建立所述第一植物与编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物的杂交；iii)允许杂交后代自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
在一些实施例中，编码T6ODM的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物利用分子方法鉴定。在一些实施例中，编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因通过第二植物或其亲本的遗传修饰产生。在一些实施例中，具有编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因的第二植物是作为ATCC PTA-9110保藏的品系的植物。
本公开的各个方面涉及一种生产相对于野生型罂粟植物具有蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的第一植物；ii)建立所述第一植物与编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物的杂交；iii)允许杂交后代自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。在一些实施例中，编码CODM的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物利用分子方法鉴定。在一些实施例中，编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因通过第二植物或其亲本的遗传修饰产生。在一些实施例中，具有编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因的第二植物是作为ATCC PTA-9109保藏的品系的植物。
本公开的各个方面涉及一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)遗传修饰所述植物以在编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中引入功能缺失等位基因；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
本公开的各个方面涉及一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)通过遗传修饰方法遗传修饰植物中编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中引入功能缺失等位基因的植物；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
本公开的各个方面涉及一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)遗传修饰所述植物以降低编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因和具有降低的编码CODM的内源基因的表达是纯合的植物。在一些实施例中，为了降低编码CODM的内源基因的表达对植物进行的遗传修饰包括引入表达编码CODM的内源基因的靶向发夹RNA的表达构建体。
本公开的各个方面涉及一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)遗传修饰所述植物以降低编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和具有降低的编码T6ODM的内源基因的表达是纯合的植物。在一些实施例中，为了降低编码T6ODM的内源基因的表达对植物进行的遗传修饰包括引入表达编码T6ODM的内源基因的靶向发夹RNA的表达构建体。
在一些实施例中，所述分子方法包括定向诱导基因组局部突变(TILLING)方法。
本公开的各个方面涉及通过如上所述的方法生产的罂粟植物。
本公开内容的各个方面涉及相对于野生型植物具有降低的蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)活性的遗传修饰的罂粟植物或植物细胞，其中罂粟植物被遗传修饰以具有降低的T6ODM和CODM或两者的表达。
在一些实施例中，所述植物包含用于降低T6ODM表达的第一表达构建体和用于降低CODM表达的第二表达构建体。在一些实施例中，第一表达构建体包含编码第一发夹RNA的第一核酸分子，所述第一发夹RNA用于降低编码T6ODM的内源基因的表达。在一些实施例中，编码T6ODM的内源基因编码包含具有SEQ ID NO：15序列的mRNA。在一些实施例中，编码第一发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：2的一部分。
在一些实施例中，所述第二表达构建体包含编码第二发夹RNA的第二核酸分子，所述第二发夹RNA用于降低编码CODM的内源基因的表达。在一些实施例中，编码CODM的内源基因编码包含具有SEQ ID NO：16序列的mRNA。在一些实施例中，编码第二发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：4的一部分。
在一些实施例中，植物或植物细胞包括表达构建体，所述表达构建体包含用于降低T6ODM和CODM表达的核酸分子。在一些实施例中，所述核酸分子编码用于降低编码CODM的内源基因的表达的发夹RNA。在一些实施例中，所述核酸分子编码用于降低编码T6ODM的内源基因的表达的发夹RNA。在一些实施例中，所述核酸分子编码足以降低编码T6ODM和CODM的内源基因的表达的单个发夹RNA。在一些实施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：4或两者的一部分。
在一些实施例中，所述表达构建体包含编码用于降低编码T6ODM的内源基因的表达的第一发夹RNA的第一核酸分子和编码用于降低编码CODM的内源基因的表达的第二发夹RNA的第二核酸分子。在一些实施例中，编码T6ODM的内源基因编码包含具有SEQ ID NO：15序列的mRNA。在一些实施例中，编码T6ODM的内源基因编码具有SEQ ID NO 1序列的多肽。在一些实施例中，编码CODM的内源基因编码包含具有SEQ ID NO：16序列的mRNA。在一些实施例中，编码T6ODM的内源基因编码具有SEQ ID NO 3序列的多肽。在一些实施例中，第一核酸分子和所述第二核酸分子中均包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或二者兼有的一部分。
在一些实施例中，编码发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。在一些实施例中，编码发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
在一些实施例中，第一核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。在一些实施例中，第一核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
在一些实施例中，第二核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。在一些实施例中，第二核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
在一些实施例中，所述植物或植物细胞经遗传修饰具有降低的T6ODM活性，且其中CODM的活性降低是由编码CODM的内源基因的突变引起的，该突变不是通过植物或植物细胞的遗传修饰引入。在一些实施例中，编码CODM的内源基因中不是通过植物或植物细胞的遗传修饰引入的突变是按照专利保藏号PTA-9109保藏的植物种子中的突变。
在一些实施例中，所述植物经遗传修饰以具有降低的CODM活性，且其中T6ODM的活性降低是由编码T6ODM的内源基因的突变引起的，该突变不是通过植物或植物细胞的遗传修饰引入。在一些实施例中，编码T6ODM的内源基因中不是通过植物或植物细胞的遗传修饰引入的突变是按照专利保藏号PTA-9110保藏的植物种子中的突变。
本公开的各个方面涉及具有降低的编码6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达的遗传修饰的罂粟植物或植物细胞，所述遗传修饰的植物包含：降低植物或植物细胞中编码T6ODM的内源基因的表达的转基因表达构建体；和降低植物或植物细胞中编码CODM的内源基因的表达的转基因表达构建体。
本公开的各个方面涉及如上所述的罂粟植物的种子。
本公开的各个方面涉及如上所述的植物在生产蒂巴因中的应用。
本公开的各个方面涉及从如上所述的植物获得的罂粟草。
本公开的各个方面涉及从如上定义的植物分离的乳胶。
本公开的各个方面涉及生产蒂巴因的方法，所述方法包括从如上所述的植物中收获的乳胶或罂粟秆中分离蒂巴因。
本公开的各个方面涉及分离的核酸分子，其中核酸分子的序列包含SEQ ID NO：7的一部分。
本公开的各个方面涉及用于同时降低罂粟植物中编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达的表达载体，该表达载体包括包含SEQ ID NO：7的一部分的核酸分子。
本公开的各个方面涉及具有包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的部分序列的多核苷酸分子的一部分在同时降低罂粟植物中编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶的内源基因的表达中的应用。
通过以下结合附图对本发明具体实施例的描述的论述，本发明的其他方面和特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。
本发明公开的方法可用于生产具有增加的蒂巴因：吗啡比例的罂粟植物。
本公开的具体方面涉及增加蒂巴因在罂粟植物或植物细胞中积累的方法，
该方法包括对植物或植物细胞的基因组进行遗传修饰，以包括同时降低罂粟植物或植物细胞中蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的活性的一种或多种稳定的遗传修饰。
本公开的具体方面涉及遗传修饰的罂粟植物或植物细胞，其相对于野生型植物或植物细胞具有降低的蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)活性，其中遗传修饰的罂粟植物或植物细胞包含一种或多种降低T6ODM或CODM或两者的表达的稳定的遗传修饰。
本公开的具体方面涉及生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：(a)降低植物中编码内源蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，其中降低编码T6ODM的内源基因的表达包括遗传修饰所述植物以在编码T6ODM的内源基因中具有功能缺失等位基因。
本公开的具体方面涉及生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：(a)降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，其中降低编码T6ODM的内源基因的表达包括表达与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，其中异源核酸分子的表达降低所述编码T6ODM的内源基因的表达。
本公开的具体方面涉及生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：(a)降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，其中降低编码CODM的内源基因的表达包括遗传修饰所述植物以在编码CODM的内源基因中具有功能缺失等位基因。
本公开的具体方面涉及生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：(a)降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，其中降低编码CODM的内源基因的表达包括表达与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，其中异源核酸分子的表达降低所述编码CODM的内源基因的表达。
本公开的具体方面涉及遗传修饰的罂粟植物或植物细胞，其具有降低的编码6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，该遗传修饰植物包含：用于降低植物或植物细胞中编码T6ODM的内源基因的表达的稳定遗传的转基因表达构建体；和用于降低植物或植物细胞中编码CODM的内源基因的表达的稳定遗传的转基因表达构建体。
本公开的具体方面涉及一种产生相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的第一植株；ii)建立所述第一植株与编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植株的杂交；iii)允许杂交后代自花授粉；和iv)从自花授粉植株中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植株。
本公开的具体方面涉及一种产生相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的第一植物；ii)建立所述第一植物与编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物的杂交；iii)允许杂交后代自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
本公开的具体方面涉及一种产生相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)遗传修饰所述植物以在编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中引入功能缺失等位基因；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
本公开的具体方面涉及一种产生相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)通过遗传修饰对所述植物进行遗传修饰以在编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中引入功能缺失等位基因；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
本公开的具体方面涉及一种产生相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)遗传修饰所述植物以降低编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因和具有降低的编码CODM的内源基因的表达是纯合的植物。
本公开的具体方面涉及一种产生相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；ii)遗传修饰所述植物以降低编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；iii)允许植物自花授粉；和iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和具有降低的编码T6ODM的内源基因的表达是纯合的植物。
本公开的具体方面涉及分离的核酸分子，其中核酸分子的序列包含SEQ ID NO：7。
本公开的具体方面涉及具有包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的部分序列的多核苷酸分子的用途，其用于同时降低罂粟植物中编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶的内源基因的表达。
本公开的具体方面涉及如权利要求所述的从植物或植物细胞收获的罂粟秆。
本公开的具体方面涉及如权利要求所述的从植物或植物细胞收获的乳胶。
附图说明
在说明本发明的实施例的附图中
图1是罂粟中吗啡生物合成途径的示意图，显示了从蒂巴因到吗啡的两种途径。
图2是用于表达包含同时降低编码CODM和T6ODM的基因的表达的T6ODM序列的发夹RNA的发夹RNA表达盒的示意图。
图3是编码CODM和T6ODM的cDNA序列的比对结果。下划线部分鉴定T6ODM序列，所述T6ODM序列用于创建降低编码CODM的内源基因和编码T6ODM的内源基因的表达的发夹RNA表达构建体。下划线部分内的T6ODM和CODM编码序列之间的差异以黑色突出显示。
图4是显示在表达构建体瞬时表达后编码CODM和T6ODM的内源基因的表达的柱状图。
图5是显示转基因株系AM1、AM2和AM3中表达构建体表达的柱状图。
图6是显示在AM1、AM2和AM3株系中降低编码(A)T6ODM和(B)CODM的内源基因的表达的柱状图。
图7是显示相对于不具有表达构建体的株系(D)AM10、株系(A)AM1、(B)AM2和(C)AM3中蒂巴因的累积的色谱图。
具体实施方式
本公开涉及遗传修饰的罂粟植物、种子、细胞、秆及其后代或其产生的胶乳，由于在阿片生物合成时蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的酶的活性综合降低，该遗传修饰的植物产生相对于野生型植物具有增加的蒂巴因水平的乳胶。本公开还涉及获得此类遗传修饰的罂粟植物的方法。
定义
本发明所用的“鸦片罂粟植物”或“罂粟植物”是指罂粟(Papaver Somniferum)物种的植物。
本发明所用的植物的“田间”是指紧密接近一起栽培的多种鸦片植物。
本发明所用的“活性”是指植物细胞中特定的酶的功能水平。在本公开的上下文中，降低T6ODM活性是指第6位的O-去甲基化活性的降低，而降低CODM活性是指第3位的O-去甲基化活性的降低。活性的降低可以是由于如突变导致的蛋白质功能性降低，或由于如翻译的减少导致蛋白质表达降低的结果。
本发明所用的“遗传修饰”广泛地指用现代生物技术获得的任何遗传物质的新组合。遗传修饰包括但不限于遗传物质通过外源遗传物质的插入而改变的“转基因”。然而，遗传修饰还包括用如下所述的如CRISPR/Cas9，TALENS等技术以靶向方式引入的内源基因的改变(例如插入，缺失或取代)。然而，出于本公开的目的，“遗传修饰”并不旨在包括由传统繁殖方法之后的传统随机诱变方法产生的突变导致的遗传物质的新组合。
本发明所用的“转基因”是指通过基因工程技术将重组基因或遗传物质转移到植物细胞中。本发明所用的“转基因植物”或“转化植物”是指将外源核酸序列或DNA片段掺入或整合到植物细胞中的植物。转基因可包括与编码目的RNA或多肽的DNA分子可操作地连接的同源或异源启动子。
“可操作连接”是指一个启动子和第二DNA序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导对应于第二DNA序列的DNA序列的转录。通常，可操作连接是指连接的核酸序列是连续的。
本发明所用的“遗传修饰”植物或植物细胞广泛地指具有如本发明定义的遗传修饰的任何植物或植物细胞。
本发明所用的术语“多肽”包括天然或非天然存在的氨基酸(D-或L-氨基酸)的任何链，无论长度(如至少5，6，8，10，12，14，16，18，20，25，30，40，50，100或更多个氨基酸)或翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)或存在与肽共价连接的如一个或多个非氨基酰基(如糖、脂质等)，包括例如天然蛋白质，合成或重组多肽和肽，杂合分子，拟肽，肽模拟物等。本发明所用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用。
本发明所用的“核苷酸序列”，“多核苷酸序列”，“核酸”或“核酸分子”是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链并且任选地含有可并入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸序列”或“核酸分子”包括由基因编码的基因、cDNA、DNA和RNA。核酸、核酸序列、多核苷酸序列和核酸分子可包含至少3个、至少10个、至少100个、至少1000个、至少5000个、或至少10000个核苷酸或碱基对。
本发明所用的“片段”、“其片段”、“基因片段”或“其基因片段”是指
是指可能仍然会降低编码CODM和/或T6ODM的基因的表达的“核苷酸序列”、“多核苷酸序列”、“核酸”或“核酸分子”的一部分。在一个实施方案中，片段包含至少20、至少40、至少60、至少80、至少100、至少150、至少200、至少150、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个连续核苷酸。
本发明所用的“非天然变体”是指生物体天然的核酸序列，但包含通过诱变引入的一个或多个核苷酸的修饰。
本发明所用的“等位基因”或“等位基因变体”是指在基因组的特定位置处的相同基因的替代形式。
本发明所用的“野生型”是指未用如本发明所述的核酸分子或构建体转化、遗传修饰或以其他方式突变的植物或植物材料。“野生型”也可以指其中T6ODM活性和CODM活性未降低的植物或植物材料。
本发明所用的术语“同一性”是指两个多肽或多核苷酸分子之间的序列相似性。可以通过比较比对序列中的每个位置来确定同一性。氨基酸或核酸序列之间的同一性程度是序列共有的位置上如特定区域的相同或匹配的氨基酸或核酸的数量的函数。用于同一性比较序列的最佳比对可以使用本领域已知的各种算法进行，包括可在http://clustalw.genome.ad.jp获得的Clustal WTM程序，Smith和Waterman(1981,Adv.Appl.Math2:482)的本地同源性算法，Needleman和Wunsch(1970,J.Mol.Biol.48:443)的同源性比对算法，Pearson和Lipman(1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)的寻找相似性方法，以及这些算法的计算机化实现(如威斯康星遗传学软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，Madison，Wis.，美国)。序列同一性也可以使用BLAST算法(例如BLASTn和BLASTp)确定，如Altschul等(1990,J.Mol.Biol.215:403-10)所述(使用发布的默认设置)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(通过因特网http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。例如，可以使用BLASTn算法在以下默认设置下确定两个核酸序列之间的序列同一性：期望阈值10；字长11；匹配/不匹配分数2，-3；存在的间隔成本5，延伸2。可以使用BLASTp算法在以下默认设置下确定两个氨基酸序列之间的序列同一性：期望阈值10；字长3；矩阵BLOSUM 62；存在的间隔成本11，延伸1。在另一个实施方案中，本领域技术人员可通过视觉检查容易且适当地比对任何给定的序列并推断序列同一性/同源性。
如发明所用的“异源的”、“外来的”和“外源的”DNA和RNA可互换使用，指的是作为植物基因组的一部分非天然存在的，或存在于某一位置，或基因组中与自然界中出现的位置不同的DNA或RNA。因此，异源或外来的DNA或RNA是通常不在相同的环境的宿主基因组中发现的核酸(即与相同的5'和3'序列连接)。一方面，异源DNA可以与宿主DNA相同但引入宿主基因组中的不同位置和/或已经通过本领域已知的方法修饰，其中修饰包括但不限于插入载体，与外源启动子和/或其他调节元件连接，或以多个拷贝重复。另一方面，异源DNA作为宿主DNA可以来自不同的生物、不同的物种、不同的属或不同的界。此外，异源DNA可以是转基因。本发明所用的“转基因”是指含有已从一种生物体中分离并引入不同的生物体中的基因序列的DNA片段。在本公开的上下文中，核酸分子可包含与CODM和T6ODM活性降低的植物异源的核酸。
本发明所用的“表达”或“表达”是指基因的信息用于合成功能性基因产物的过程，并且可涉及任何由基因编码的可检测水平的产物或产物活性的产生。可在许多水平上调节(即启动，增加，降低，终止，维持或阻止)基因表达，包括转录，RNA加工，翻译，翻译后修饰，蛋白质降解。基因表达也可通过引入影响基因产物活性的突变来调节，如基因产物转变底物的能力。在本公开的上下文中，通过降低编码CODM和/或T6ODM内源基因的转录，通过降低编码CODM和/或T6ODM的mRNA转录物的翻译，或通过引入阻止功能性多肽的翻译或导致具有降低转变底物的能力的多肽的翻译的突变，影响编码CODM和/或T6ODM的内源基因的降低表达，或CODM和/或T6ODM多肽的降低表达。内源基因的这种降低的表达可由包含被设计用于降低内源基因的表达的表达构建体的转基因的表达引起。
本发明所用的“罂粟秆”是指由成熟的罂粟蒴果脱粒产生的秸秆材料和除去种子的罂粟壳。
本发明所用的“胶乳”是指来自成熟、未成熟罂粟壳的风干乳状渗出物。
本发明所用术语“增加的蒂巴因含量”或“增加的蒂巴因水平”是指与相应的野生型植物中的蒂巴因水平相比，一种或多种组织中蒂巴因的水平显著增加。术语“增加”还包括与野生型植物的相同组织相比在一种或多种组织中显著增加的蒂巴因水平，而野生型水平的蒂巴因在植物的其他地方持续存在。
本发明所用术语“降低的吗啡含量”是指与相应的野生型植物中的吗啡水平相比，一种或多种组织中吗啡的水平显著降低。术语“减少”还包括与野生型植物的相同组织相比在一种或多种组织中显著减少的吗啡水平，而野生型水平的吗啡在植物的其他地方持续存在。
“降低表达”、“降低活性”、“减少表达”和“减少活性”旨在包括关于表达和活性的众所周知的等同术语，例如“抑制”、“下调”、“敲除”、“沉默“等。
当提及生物碱含量时，“基本上没有”是指特定生物碱或生物碱的组合构成以罂粟秆、罂粟秆或鸦片浓缩物的生物碱组合的重量计小于0.6wt％，优选小于0.5wt％，更优选小于0.4wt％，或小于0.2wt％。
本发明所用的“表达构建体”是指包含部分或全部能够被转录的核酸编码序列编码基因产物的核酸的任何类型的遗传构建体。转录本可以但不一定翻译成蛋白质。在某些实施方案中，表达包括基因的转录和将mRNA翻译成基因产物。在其他实施方案中，表达仅包括将编码目的基因的核酸转录成例如siRNA。
本公开的核酸分子的表达构建体可以进一步包含启动子和其他调节元件，例如增强子，沉默子，多腺苷酸化位点，转录终止子，选择标记或可筛选标记。
本发明所用的“载体”或“构建体”可以指任何重组多核苷酸分子，例如衍生自任何来源的质粒、粘粒、病毒、载体、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子。除了编码目的基因或基因片段的核苷酸序列之外，“载体”或“构建体”可以包含启动子、多腺苷酸化位点、增强子或沉默子和转录终止子。本发明所用的“转化载体”可指用于将DNA转化或导入细胞、植物或植物材料中的载体。
本发明所用的“启动子”是指指导编码序列的启动和转录速率的核苷酸序列(综述在Roeder，Trends Biochem Sci，16：402，1991)。启动子含有RNA聚合酶结合的位点，还含有其他调节元件(如转录因子)结合的位点。启动子可以是天然存在的或合成的(参见Datla等人，Biotech Ann.Rev 3：269，1997，关于植物启动子的综述)。此外，启动子可以是物种特异性的(例如，仅在欧洲油菜中有活性)；组织特异性(例如油菜籽蛋白、菜豆蛋白、玉米醇溶蛋白、球蛋白、dlec2、γ-kafirin种子特异性启动子)；具有发育特异性(例如，仅在胚胎发生期间有活性)；组成型(例如玉米泛素，水稻泛素，水稻肌动蛋白，拟南芥肌动蛋白，甘蔗杆状病毒，CsVMV和CaMV 35S，拟南芥多聚泛蛋白，Solanum bulbocastanum多聚泛蛋白，根癌农杆菌来源的胭脂碱合酶、章鱼碱合酶和甘露碱合酶基因启动子)；或诱导型(例如二苯乙烯合成酶启动子和由光、热、冷、干旱、伤害、激素、胁迫和化学物质诱导的启动子)。启动子包括由TATA盒或Inr元件组成的短DNA序列的最小启动子，以及用于指定转录起始位点的其他序列，其中添加了调节元件以控制表达。启动子还可以指包括最小启动子和调节编码序列表达的DNA元件的核苷酸序列，例如增强子和沉默子。因此，一方面，可以通过选择物种特异性，组织特异性，发育特异性或诱导型启动子来调节本公开的构建体的表达。
本发明所用的“组成型启动子”是指在多种或所有组织中驱动下游定位编码区表达的启动子，而与环境或发育因素无关。
技术人员将理解，使用有效指导构建体在合成蒂巴因的组织中表达的启动子是重要的。例如，可以使用内源性T6ODM或CODM启动子。或者，可以使用在适当条件下有用的组成型、组织特异性或诱导型启动子，以指导在阿片类物质生物合成期间引入的表达构建体的高水平表达。
增强子和沉默子是分别影响连接的启动子正或负的转录的DNA元件(综述在Blackwood和Kadonaga，Science，281：61，1998)。
多腺苷酸化位点是指向RNA转录机制发信号以在多腺苷酸化位点下游约30bp处添加一系列核苷酸A的DNA序列。
转录终止子是指示转录终止的DNA序列。转录终止子是本领域已知的。转录终止子可以源自根癌土壤杆菌，例如那些从嗜碱性合成酶、甘露碱合酶、章鱼碱合酶基因和来自Ti质粒的其他开放阅读框分离的终止子。其他终止子可以包括但不限于从CaMV和其他DNA病毒中，dlec2，玉米醇溶蛋白，菜豆蛋白，脂肪酶，渗透压素，过氧化物酶，PinII和泛素基因中分离的，例如来自马铃薯。
在本公开的上下文中，核酸构建体可进一步包含选择性标记。选择标记可用于选择含有外源遗传物质的植物或植物细胞。外源遗传物质可包括但不限于赋予对诸如除草剂或抗生素的试剂的抗性的酶，或报告构建体存在的蛋白质。
许多植物选择标记系统是本领域已知的并且与本发明一致。以下综述文章阐述了这些众所周知的系统：Miki and McHugh；Journal of Biotechnology 107:193-232；Selectable marker genes in transgenic plants:applications,alternatives andbiosafety(2004)。
选择标记的实例包括但不限于neo基因，其编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素，NptII，G418，hpt等筛选；用抗生素氨苄青霉素筛选的amp抗性基因；潮霉素抗性的潮霉素R基因；编码双丙氨膦抗性的BAR基因(编码草胺膦乙酰转移酶)，包括WO/2008/070845中所描述的那些；突变的EPSP合酶基因aadA，其编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈的抗性；突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性，ALS和甲氨蝶呤抗性DHFR基因。
此外，可用于本发明上下文的可筛选标记包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其编码已知各种生色底物的酶，绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(LUX)。
罂粟中的生物碱的产生
图1是描绘来自蒂巴因的两种吗啡生物合成途径的示意图。蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)催化6位(C环)的蒂巴因O-去甲基化，而可待因O-脱甲基酶(CODM)催化3位(A环)的可待因O-去甲基化。因此，蒂巴因可以在6位或3位进行O-去甲基化，分别产生neopinone或罂粟碱(oripavine)。neopinone自发地转化为可待因酮(codeinone)，然后通过可待因酮还原酶(COR)将其还原为可待因。可待因在3位被CODM去甲基化产生吗啡。T6ODM将6位罂粟碱去甲基化产生吗啡酮(morphinone)，然后通过COR将吗啡酮还原成吗啡。
本发明的发明人假设有可能通过同时降低T6ODM和CODM酶的活性产生相比亲本植株含有升高水平的蒂巴因和降低水平的可待因和吗啡的植物。
T6ODM和CODM酶的野生型氨基酸序列分别在SEQ ID NO：1和3中给出。对应于编码T6ODM酶的内源基因的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示，对应于编码CODM酶的内源基因的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示。然而，技术人员将容易理解，T6ODM和CODM基因中天然存在的变异可存在于品种之间，具有略微不同的编码相同功能蛋白的核酸序列。
降低CODM和T6ODM活性或表达
通过导致植物中这些酶活性降低的任何方法，可以降低本发明的遗传修饰植物中的CODM和T60DM表达和/或活性。这可通过例如改变DNA，mRNA和/或蛋白质水平的CODM和T60DM活性。本发明所用的“活性”是指酶与其同源底物的生物化学反应。在本发明的上下文中，降低的T6ODM(或CODM)活性可能是由于T6ODM(或CODM)酶的蛋白质水平降低和/或T6ODM(或CODM)酶催化其与蒂巴因反应的速率降低所致。
突变编码CODM和T6ODM的内源基因
一方面，本公开涉及靶向编码CODM和T6ODM的内源基因以改变CODM和T6ODM表达和/或活性的遗传修饰。内源性CODM和T6ODM基因可以通过且不限于敲除CODM和T6ODM基因而改变；或敲入异源DNA以破坏CODM和T6ODM基因。技术人员将理解，这些方法可以应用于编码序列，启动子或基因转录所必需的其他调节元件。例如，诸如CRISPR/Cas9和TALENS的技术可用于在编码CODM和T6ODM的内源基因中引入功能缺失突变。然后使具有包含这种功能丧失突变的每个基因的至少一个等位基因的植株自体受精，以产生编码CODM和T6ODM的基因中功能缺失等位基因的纯合子代。在一些实施方案中，编码CODM(或T6ODM)酶的内源基因的遗传修饰导致多肽在序列上通过一个或多个氨基酸插入、缺失或取代而不同，并且具有降低的或没有CODM(或T6ODM)活性。
缺失涉及缺少内源蛋白质的一个或多个残基。出于本公开的目的，缺失变体包括其中没有翻译内源蛋白质的氨基酸的实施方案，例如，其中最初的“起始”甲硫氨酸被取代或删除。
插入突变通常涉及在多肽的非末端点添加原料，但可包括包含氨基末端和羧基末端添加的融合蛋白。取代变体通常涉及在蛋白质内的一个或多个位点处将一个氨基酸取代为另一个氨基酸，并且可以设计为调节多肽的一种或多种性质。在一些实施方案中，这种取代可以是保守的，即其中一个氨基酸被替换为具有相似形状、大小、电荷、疏水性、亲水性等的氨基酸。保守取代是本领域熟知的，包括例如丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；蛋氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸，亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。
因此，CODM酶可具有与SEQ ID NO:1的序列同一性至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。因此，T6ODM酶可具有与SEQ ID NO:2的序列同一性至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
靶向内源基因的转基因的表达
另一方面，本公开涉及通过靶向其各自的mRNA转录物来降低CODM和T6ODM的表达和/或活性。在这方面，可以通过本领域已知的方法降低CODM和T6ODM T mRNA转录物的水平，包括但不限于共抑制、反义表达、小发夹(shRNA)表达、干扰RNA(RNAi)表达、双链(dsRNA)表达、反向重复dsRNA表达、微干扰RNA(miRNA)、正义和反义序列的同时表达或其组合。
在一个实施方案中，本公开涉及与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示的至少一部分分子互补或基本上互补的核酸分子的用途。“互补”的核酸分子是能够根据标准Watson-Crick互补规则进行碱基配对的核酸分子。本发明所用术语“互补序列”意指基本上互补的核酸序列，如可通过上文所述的相同核苷酸比较评估，或定义为在如本文所述的那些相对严格的条件下能够与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的核酸区段杂交。如果两个序列在中等严格条件或优选严格条件下彼此杂交，则核酸分子可以基本上互补(或者是同源物/具有同一性)。在中等严格条件下与滤膜结合序列的杂交可以例如在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，65℃的1mM EDTA，并在0.2×SSC/0.1％SDS中42℃下洗涤(参见Ausubel,et al.(eds),1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Green PublishingAssociates,Inc.,and John Wiley&Sons,Inc.,New York,at p.2.10.3)。或者，在严格条件下与滤膜结合序列的杂交可以，例如，在65℃下0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中进行，并在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(参见Ausubel,et al.(eds),1989,，同上)。可根据目的序列依照已知方法更改杂交条件(参见Tijssen,1993,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays”,Elsevier,N.Y.)。通常，严格条件选择为在特定离子强度和pH下比特定序列的热熔点低约5℃。
植物中共抑制的现象涉及引入基因的转基因拷贝，导致转基因以及内源基因的表达降低。观察到的效果取决于转基因和内源基因之间的序列同一性。
术语“RNA干扰”(RNAi)是指用于下调或沉默宿主植物中天然存在的基因表达的众所周知的方法。RNAi使用双链RNA分子或短发夹RNA来改变与其共享基本或完全同源性核酸序列的表达。如需审核，参阅例如Agrawal,N.et al(2003)Microbiol Mol Biol Rev.67(4):657-685。RNA既是该过程的发起者又是靶标。该机制靶向来自病毒和转座子的RNA，并且还在调节发育和基因组维持中起作用。简而言之，双链RNA被酶切剂切割，产生21-23bp的短片段(siRNA)。将每个片段的两条链中的一条掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。RISC相关RNA链与mRNA配对并诱导mRNA的切割。或者，RISC相关RNA链与基因组DNA配对，导致影响基因转录的表观遗传变化。微RNA(miRNA)是一种从基因组本身转录的RNA，并以类似的方式起作用。类似地，shRNA可以被切割酶切割并与RISC结合导致mRNA切割。
已报道了利用RNAi方法在罂粟中基因沉默的具体实例。2008年，Allen等人报道在罂粟中抑制编码吗啡烷途径酶salutaridinol 7-O-乙酰转移酶(SalAT)的基因。发夹RNA介导的SalAT抑制导致salutaridine积累到总生物碱的23％。如上面在相关领域描述中所讨论的，Allen等人(2004)使用嵌合发夹RNA构建体沉默罂粟中的可待因酮还原酶(COR)，该构建体旨在通过RNAi沉默多基因COR家族的所有成员。
基因表达的反义抑制不涉及mRNA降解的催化作用，而是涉及与mRNA结合并阻断蛋白质翻译的单链RNA片段。
反义和正义抑制均由RNA依赖性RNA聚合酶产生的正义-反义杂合体或双链RNA(dsRNA)产生的沉默RNAs(sRNAs)介导。主要类型的sRNA包括其生物合成不同的短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。
通过Dicer-Like复合体处理dsRNA前体产生21-核苷酸siRNA和miRNA指导RNA诱导的沉默复合物(RISC)内的靶转录物的切割。
T6ODM和CODM表达可以使用合成基因或含有约21bp区域或更长的与T6ODM和CODM的内源编码序列高度同源(优选100％同源性)的无关基因来抑制。
参见，例如，Jorgensen R A,Doetsch N,Muller A,Que Q,Gendler,K and NapoliC A(2006)A paragenetic perspective on integration of RNA silencing into theepigenome and in the biology of higher plants.Cold SpringHarb.Symp.Quant.Biol.71:481-485。有关进一步的综述，参见例如Ossowski S,Schwab Rand Weigel D(2008)Gene silencing in plants using artificial microRNAs andother small RNAs.The Plant Journal 53:674-690。
与CODM和T6ODM的内源编码序列的部分基本相同的核酸分子也可用于本公开的上下文中。如本发明所用，如果两个分子具有至少60％、至少70％、至少80％、至少82.5％、至少85％、至少87.5％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，则一个核酸分子可与另一个核酸分子“基本相同”。因此，核酸序列包含至少60％、至少65％、至少70％、少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的同一性的核酸序列可适用于本公开的上下文中。在一个实施方案中，两个核酸分子各自包含至少20个相同的连续核苷酸。
可以使用编码CODM或T6ODM的核酸序列的片段。此类片段根据具体情况，可具有长度至少20、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300或至少400个编码CODM或T6ODM的核酸序列的连续核苷酸。或者，根据具体情况，此类片段可具有至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、或至少50个连续核苷酸的最小长度，并且最大长度小于3000、小于2000、小于1750、小于1500、小于1250，小于1000、小于750或小于500个连续核苷酸或编码CODM或T6ODM的核酸序列的这种最小和最大长度的任何组合。
在一个实施方案中，本公开的遗传修饰罂粟植物包含稳定整合于其基因组的与植物异源的第一核酸分子。第一核酸分子编码RNA，如发夹RNA，用于降低CODM酶的表达。遗传修饰的罂粟植物还包含与植物异源的第二核酸分子。第二核酸分子编码RNA，如发夹RNA，用于降低T6ODM酶的表达。
第一和第二核酸分子可存在于单个遗传构建体中或多个构建体中。在一个实施方案中，第一和/或第二核酸分子可以相对于启动子以正义方向排列。在另一个实施方案中，第一和/或第二核酸分子可以相对于启动子以反义方向排列。在另一个实施方案中，相对于启动子，遗传构建体可包含正义和反义方向的至少两个核酸分子。包含正义和反义方向的核酸的遗传构建体可产生能够形成茎-环(发夹)结构的mRNA转录物。
核酸分子中的一个或两个可以在相同启动子的转录控制下。
在一些实施例中，第一和第二异源核酸分子分别包含：
具有与SEQ ID NO：4所示的核酸序列至少80％、至少90％或100％的序列同一性的核酸序列的至少20、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300或至少400个连续核苷酸；
具有与SEQ ID NO：2所示的核酸序列至少80％、至少90％或100％的序列同一性的核酸序列的至少20、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300或至少400个连续核苷酸。
在一些实施例中，第一和第二核酸分子分别包含：
具有与SEQ ID NO：4所示的核酸序列至少80％、至少90％或100％的序列同一性的核酸序列的最小长度为至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、或至少50个连续核苷酸且最大长度小于1750、小于1500、小于1250、小于1000、小于750或小于500个连续核苷酸或这种最小和最大长度的核酸序列的任何组合的核酸分子；和
具有与SEQ ID NO：2所示的核酸序列至少80％、至少90％或100％的序列同一性的核酸序列的最小长度为至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、或至少50个连续核苷酸且最大长度小于1750、小于1500、小于1250、小于1000、小于750或小于500个连续核苷酸或这种最小和最大长度的核酸序列的任何组合的核酸分子。
技术人员还将理解，CODM和T6ODM活性的降低可能不受引入植物或植物细胞中的不同核酸分子数量的限制。在一个实施方案中，一种核酸分子可以靶向编码酶的一种或两种内源基因。因此，在另一个实施方案中，本公开内容的遗传修饰的罂粟植物包含稳定整合到其基因组中的与植物异源的核酸分子。核酸分子编码包含用于降低CODM酶表达的RNA(如发夹RNA)和用于降低T6ODM酶表达的RNA(如发夹RNA)的单个转录物。在本公开中具体示例的可行实施方案中，核酸分子编码包含用于降低CODM酶和T6ODM酶的表达的单个发夹RNA的单个转录物。
一方面，核酸分子可包含CODM编码序列的一部分(SEQ ID NO：4)；T6ODM(SEQ IDNO：2)；其等位基因变体；其非天然变体；一个片段；或其任何组合。
在一个实施方案中，T6ODM(SEQ ID NO：2)的编码序列的片段适合于产生编码RNAi发夹的表达构建体，所述RNAi发夹靶向CODM和T6ODM的内源编码序列的表达。在本公开中具体示例的可行实施方案中，此类片段包含SEQ ID NO：7。在本公开中具体示例的可行实施方案中，此类表达构建体包含SEQ ID NO：5。在本公开中具体示例的可行实施方案中，RNAi发夹由包含SEQ ID NO：6的核酸编码。
包含相对于启动子的两个方向的核酸的表达构建体可以进一步包括分开正义方向的核酸分子和反义方向的核酸分子的间隔。如本发明所用，“间隔”可包含至少2个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、或至少200个核苷酸。
技术人员还将容易理解，尽管在前述说明性实施例中，建议部分CODM和T6ODM编码序列用于构建CODM和T6ODM构建体，而完整的CODM和T6ODM编码序列，可供选择的CODM和/或T6ODM编码序列，5'UTR和/或3′UTR，或这些序列的突变衍生物也可以使用。可以在本发明的上下文中使用的核酸分子的最大数目可以仅受采用给定转化方法递送至目标植物或植物细胞的构建体的最大尺寸的限制。
在各种实施方案中，本公开的遗传修饰的植物可以进一步包含与植物异源的第三核酸分子。第三核酸分子用于增加Cyp80B3的表达以增加吗啡烷的总水平。
靶向内源性CODM和T6ODM多肽的转基因的表达
另一方面，本公开涉及在蛋白质水平上靶向CODM和T6ODM来降低CODM和/或T6ODM活性。例如，可以通过影响酶的翻译后修饰来降低CODM(或T6ODM)活性；或者通过引入可表达与野生型酶结合并改变其活性或者与野生型酶竞争底物而不能转变底物的异源蛋白质(例如，突变形式的CODM或(T6ODM)；或者与CODM(或T6ODM)酶特异性结合的抗体。
技术人员还将理解，包含CODM或T6ODM基因启动子和/或其他调节元件的序列的核酸分子可用于本发明的上下文中。在一个实施方案中，包含CODM(或T6ODM，根据具体情况而定)基因启动子和/或调节元件的序列的异源核酸分子可用于影响细胞机器偏离内源性CODM(或T6ODM，根据具体情况而定)基因启动子因此导致CODM(或T6ODM)表达降低。
核酸构建体或其元件的大小或长度不限于本发明所述的具体实施方案。例如，技术人员将理解，转基因元件的大小可以通过转基因元件功能来定义；且可以确定启动子元件能够以足够水平和在所需组织中驱动转录的启动子元件。类似地，由本发明的核酸构建体转录的mRNA形成的茎环结构可包含许多长度可变的基因区段。例如，除了间隔(例如内含子(126bp加内含子))之外，茎环可以包含每个约21-30个碱基对的3个基因区段。
技术人员将理解，基因区段的大小可以通过组合的元件大小的总和来确定，并且可取决于用于将转基因递送到靶生物中的转化方法。例如，每种转化方法(农杆菌，基因枪，基于VIGS的递送系统)可以限制理论最大转基因大小。
植物转化
通过农杆菌介导的转移将DNA引入植物细胞是本领域技术人员熟知的。例如，如果Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，至少是右边界，尽管更常见的是Ti或Ri质粒中含有的T-DNA的右边界和左边界必须与作为侧翼区插入的基因相连。
如果农杆菌用于转化，则必须将待整合的DNA克隆到特定质粒中，特别是克隆到中间载体或二元载体中。通过序列的同源重组，中间载体可以整合到农杆菌的Ti或Ri质粒中，所述序列与T-DNA中的序列同源。这也包含vir区域，其是T-DNA转移所必需的。中间载体不能在农杆菌中复制。可以通过辅助质粒(结合)将中间载体转移到根癌农杆菌中。二元载体能够在大肠杆菌以及农杆菌中复制。它们含有选择标记基因和由右和左T-DNA边界区构成的接头或多接头。它们可以直接转化进入农杆菌。作为宿主细胞的农杆菌应含有携带vir区的质粒。vir区域是将T-DNA转移到植物细胞中所必需的。可能存在额外的T-DNA。这种转化的农杆菌用于转化植物细胞。已经深入研究了T-DNA转化植物细胞的用途，并且已经在标准综述文章和植物转化指南中充分描述。为此目的用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌培养的植物外植体可用于将DNA转移到植物细胞中。
土壤杆菌转化可用于转化罂粟植物(Chitty等人(Meth.Molec.Biol，344：383-391；Chitty等人(Functional Plant Biol，30：1045-1058)；Facchini等人(Plant CellRep.，27(4)：719-727))。Facchini等人(2008)公开了根癌农杆菌介导的遗传转化方案，通过体细胞胚胎发生生产可育的抗除草剂的罂粟植物。转化使用pCAMBIA3301介导，其为一种含有由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的草胺膦乙酰转移酶(pat)基因和由CaMV35S启动子驱动的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的转化载体。外植体与根癌农杆菌在50 1MATP和50 1M MgCl2存在下共同培养。在愈伤组织诱导培养基上预培养的根外植体用于转化。在含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(BA)的培养基上从外植体获得抗除草剂、增殖的愈伤组织。通过从培养基中除去BA诱导球形胚愈伤组织，并将其置于无激素培养基上以形成体细胞胚。将体细胞胚在特定培养条件下转化为小植株并转移到土壤中。植物成熟并结种子。在测定的转基因株系中检测到PAT和GUS转录物和酶活性。
然而，本发明不限于用于转化植物细胞的任何特定方法，并且技术人员将容易理解可以使用任何其他合适的DNA转移到植物中的方法。
将核酸引入细胞的方法(也指本发明中的“转化”)在本领域中是已知的并且包括但不限于：病毒方法(Clapp.Clin Perinatol,20:155-168,1993；Lu et al.J Exp Med,178:2089-2096,1993；Eglitis and Anderson.Biotechniques,6:608-614,1988；Eglitiset al,Avd Exp Med Biol,241:19-27,1988)；物理方法如显微注射(Capecchi.Cell,22:479-488,1980)，电穿孔(Wong and Neumann.Biochim Biophys Res Commun,107:584-587,1982；Fromm et al,Proc Natl Acad Sci USA,82:5824-5828,1985；U.S.Pat.No.5,384,253)和基因枪(Johnston and Tang.Methods Cell Biol,43:353-365,1994；Fynan etal.Proc Natl Acad Sci USA,90:11478-11482,1993)；化学方法(Graham and van derEb.Virology,54:536-539,1973；Zatloukal et al.Ann NY Acad Sci,660:136-153,1992)；和受体介导的方法(Curiel et al.Proc Natl Acad Sci USA,88:8850-8854,1991；Curiel et al.Hum Gen Ther,3:147-154,1992；Wagner et al.Proc Natl Acad Sci USA,89:6099-6103,1992)。
将DNA导入植物细胞的另一种方法是通过基因枪。该方法涉及用涂有DNA的微观颗粒(例如金或钨颗粒)轰击植物细胞。通常通过气体或放电，颗粒快速加速通过细胞壁和膜，由此DNA被释放到细胞中并掺入细胞的基因组中。该方法用于转化许多作物，包括玉米、小麦、大麦、水稻、木本树种及其他作物。已经证明基因枪轰击在转染多种动物组织以及真核和原核微生物，线粒体以及微生物和植物叶绿体中是有效的(Johnston.Nature,346:776-777,1990；Klein et al.Bio/Technol,10:286-291,1992；Pecorino and Lo.Curr Biol,2:30-32,1992；Jiao et al,Bio/Technol,11:497-502,1993)。
将DNA导入植物细胞的另一种方法是通过电穿孔。该方法涉及施加于原生质体/细胞/组织的高电压脉冲导致质膜中的瞬时孔隙，其促进外来DNA的摄入。外来DNA通过孔进入细胞质，然后进入细胞核。
可以通过脂质体介导的基因转移来转化植物细胞。该方法涉及使用具有水性内部的环状脂质分子的脂质体，以将核酸递送到细胞中。脂质体包裹DNA片段然后粘附到细胞膜上并与它们融合以转移DNA片段。因此，DNA进入细胞然后进入细胞核。
用于转化与本发明一致的植物细胞的其他公知方法包括但不限于花粉转化(参见托莱多大学,1993,美国专利号5,177,010)；晶须技术(参见美国专利号5,464,765和5,302,523)。
可以将本发明的核酸构建体引入植物原生质体中。植物原生质体是使用机械或酶促方法完全或部分除去其细胞壁的细胞，并且可以用已知方法转化，包括基于磷酸钙的沉淀，聚乙二醇处理和电穿孔(参见例如Potrykus et al.,Mol.Gen.Genet.,199:183,1985；Marcotte et al.,Nature,335:454,1988)。聚乙二醇(PEG)是环氧乙烷的聚合物。它被广泛用作聚合物基因载体以诱导DNA摄入植物原生质体。PEG可以与二价阳离子结合使用以沉淀DNA并影响摄入细胞。或者，PEG可以与其他聚合物络合，例如聚(亚乙基亚胺)和聚L赖氨酸。
本发明的核酸分子也可以通过许多方法靶向植物细胞的基因组，包括但不限于靶向重组，同源重组和位点特异性重组(参见综述Baszcynski et al.Transgenic Plants,157:157-178,2003 for review of site-specific recombination systems inplants)。本领域公知的植物中(在Reiss.International Review of Cytology,228:85-139,2003中的综述)和哺乳动物细胞(参见Sorrell and Kolb.Biotechnology Advances,23:431-469,2005中的综述)的同源重组和基因靶向。
本发明所用的“靶向重组”是指核酸构建体整合到基因组上的位点，其中通过包含对应于整合位点的序列的构建体促进整合。
同源重组依赖于引入细胞的DNA片段与细胞基因组之间的序列同一性。同源重组在高等真核生物中是极为罕见的事件。然而，可以通过涉及引入DNA双链断裂，三链形成寡核苷酸或腺相关病毒的策略来增加同源重组的频率。
本发明所用的“位点特异性重组”是指当至少两个不连续的DNA序列相互作用以在酶存在下组合成单个核酸序列时发生的酶促重组。位点特异性重组依赖于酶，例如重组酶、转座酶和整合酶，其催化仅具有有限序列同源性的DNA分子之间的DNA链交换。位点特异性重组的机制是本领域已知的(Grindley et al.Annu Rev Biochem,75:567-605,2006中的综述)。位点特异性重组酶的识别位点(例如Cre和att位点)通常为30-50bp。发生重组的成对的位点通常是相同的，但也有例外，如λ整合酶的attP和attB位点(Landy.Ann RevBiochem,58:913-949,1989)。
可以从最近几年开发的方法和组合物中选择另外的方法，以通过位点特异性核酸酶例如锌指核酸酶、ZFNs、大范围核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶靶向和切割基因组DNA，诱导靶向诱变的具有改造的crRNA/tracr RNA的TALENS和成簇的、规律间隔的短回文重复/CRISPR相关核酸酶(CRISPR/Cas)诱导靶向细胞DNA序列的缺失，并促进外源供体DNA多核苷酸在预定基因组基因座内的靶向重组。目前用于靶向插入外源DNA的方法通常涉及植物组织与含有至少一种转基因和位点特异性核酸酶(例如ZFN)的供体DNA多核苷酸的共转化，该方法设计用于结合和切割活跃转录的编码序列的特定基因组基因座。这引起供体DNA多核苷酸稳定地插入到切割的基因组基因座内，导致在包含活跃转录的编码序列的特定基因组基因座处的靶基因的加入。
本发明所用术语“锌指”，定义DNA结合蛋白结合结构域内氨基酸序列的区域，其结构通过锌离子的配位而稳定。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白质，或较大蛋白质中的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，所述锌指是结合结构域内氨基酸序列的区域，其结构通过锌离子的配位稳定化。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。锌指结合结构域可以“改造”以结合预定的核苷酸序列。用于改造锌指蛋白的方法的非限制性实例被设计和选择。设计的锌指蛋白是一种在自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要来自合理的标准。设计的合理标准包括应用替换规则和计算机化算法用于处理存储现有ZFP设计和绑定数据信息的数据库中的信息。(美国专利号6453，242；还参见WO 98/53058)。
“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单个“重复单元”，也指一个“重复”，通常长度为33-35个氨基酸，并且与天然存在的TALE蛋白质内的其他TALE重复序列表现出至少一些序列同源性(美国专利公开号2011/0301073)。
CRISPR(成簇的、规律间隔的短回文重复)/Cas(CRISPR相关)核酸酶系统。简而言之，“CRISPR DNA结合结构域”是短链RNA分子，其与CAS酶协同作用可以选择性地识别、结合和切割基因组DNA。对CRISPR/Cas系统进行改造以在基因组中的期望靶标处产生双链断裂(DSB)，并且通过使用修复抑制剂影响DSB的修复以引起易错修复的增加。(Jinek et al(2012)Science 337,p.816-821)。
锌指、CRISPR和TALE结合结构域可被“改造”以结合预定的核苷酸序列，例如通过改造天然存在的锌指的识别螺旋区(改变一个或多个氨基酸)。类似地，TALE可被“改造”以结合预定的核苷酸序列，例如通过涉及DNA结合(重复可变的diasidue或RVD区域)的氨基酸。因此，改造的DNA结合蛋白(锌指或TALEs)是非天然存在的蛋白质。用于改造DNA结合蛋白的方法的非限制性实例被设计和选择。被设计的DNA结合蛋白是一种在自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要来自合理的标准。设计的合理标准包括应用替换规则和计算机化算法用于处理存储现有ZFP和/或TALE设计和绑定数据的信息的数据库中的信息。(美国专利号6453242；还参见WO 98/53058；和美国公开号2011/0301073)。
“选择的”锌指蛋白、CRISPR或TALE是在自然界中未发现的蛋白质，其产生主要来自经验过程，例如噬菌体展示、相互作用捕获或杂交选择。
在一个实施方案中，多核苷酸编码锌指蛋白，其与编码T6ODM或CODM多肽的基因结合，导致基因表达降低。在特定的实施方案中，锌指蛋白结合编码T6ODM或CODM的基因的调控区。在其他实施方案中，锌指蛋白与编码T6ODM或CODM多肽的信使RNA结合并阻止其翻译。例如，在美国专利6，453，242中描述了通过锌指蛋白靶向选择位点的方法，及例如在美国专利2003/0037355中描述了使用锌指蛋白抑制植物中基因表达的方法，每一个通过引用并入本申请。在例如Moscou MJ,Bogdanove AJ,2009,A simple cipher governs DNArecognition by TAL effectors.Science 326:1501中描述了通过TALE蛋白靶向选择位点的方法。
核酸分子变得稳定地整合到植物基因组中，使得它对子细胞是可遗传的，以便连续几代植物细胞具有降低的CODM和T6ODM表达。这可包括将本发明的核酸分子整合，例如随机整合到植物细胞基因组中。或者，本发明的核酸分子保留可遗传给子细胞的外源的自我复制DNA。如本发明所用，可遗传给子细胞的外源的自我复制DNA也被认为“稳定整合到植物基因组中”。
测定CODM和T6ODM的活性或表达的降低
编码CODM和T6ODM的内源基因的破坏，它们的表达，或CODM和T6ODM酶活性可以通过分子生物学领域中已知的方法来证实。例如，可以通过PCR然后进行Southern印迹分析来评估内源基因的破坏。CODM和T6ODM mRNA水平可以例如通过实时PCR、RT-PCR、Northern印迹分析、微阵列基因分析和RNA酶保护来测定。CODM和T6ODM蛋白质水平可以但不限于通过酶活实验、ELISA和Western印迹分析来测定。CODM和T6ODM表达或其缺乏可用作增加的蒂巴因累积的预测因子。可以在生物化学上或功能上评估CODM和/或T6ODM酶活性。
例如，CODM(和/或T6ODM)活性可以通过本领域已知的方法进行生物化学测定，包括但不限于在任何数量的异源底物存在下检测由酶形成的产物，如蒂巴因。CODM(和/或T6ODM)活性也可在功能上测定，例如，通过评估罂粟组织中的蒂巴因水平。
本公开的经遗传修饰的罂粟植物可导致所述植物或其种子、幼苗、杆、蒴果或其子代中的CODM和/或T6ODM活性相对于野生型的种子、幼苗、杆、蒴果或其子代降低至少57％、至少60％、至少65％，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。
靶向筛选获得CODM和/或T6ODM的功能缺失突变
本公开进一步涉及生产具有高水平的蒂巴因的罂粟植物的方法，该方法涉及靶向筛选获得编码CODM和/或T6ODM的内源基因中的功能缺失突变以及随后的植物育种以组合突变获得对于两个基因座的功能缺失突变是纯合的植株。罂粟种植者在改良品种的开发中使用了多种选择技术。然而，最成功的育种方法涉及具有多种不同所需特征的亲本杂交。这种方法已成功用于增加蒴果数量、种子和鸦片产量、吗啡含量和抗倒伏性。
术语“T-DNA插入”是指利用转移DNA(T-DNA)通过插入诱变破坏基因的方法。因此，可以通过T-DNA诱变实现在罂粟植物中下调或沉默编码CODM和/或T6ODM的内源基因的表达，其中T-DNA用于随机插入植物基因组中以引入突变。随后，植物可以通过PCR筛选编码CODM和/或T6ODM的基因中的T-DNA插入，使用包含一个T-DNA的特异性引物和一个编码CODM(或T6ODM，根据具体情况)基因的特异性引物的引物对，或其他高通量技术。关于T-DNA作为插入诱变剂的综述，参见例如Krysan,P.J.et al.(1999)Plant Cell,11:2283-2290。也可以使用转座子的插入诱变。
突变(包括缺失、插入和点突变)也可以通过各种形式的诱变随机引入植物细胞的基因组中以产生非天然变体。如WO2009109012中所述，用于诱变植物材料，包括种子以及随后筛选或选择所需表型的方法是公知的。诱变的植物和植物细胞也可以特异性地筛选编码CODM和/或T6ODM的基因中的突变，例如通过TILLING(靶向诱导的基因组中局部病变)。通过EcoTILLING可以鉴定天然植物种群中存在的功能缺失突变。
一旦鉴定出编码CODM和T6ODM的内源基因中的功能缺失突变，它们可以通过传统育种过程组合以产生两个基因座中功能缺失突变的纯合植物。或者，在编码CODM的内源基因中鉴定的功能丧失突变可以与通过遗传修饰引入的编码T6ODM的内源基因中的突变组合，反之亦然。或者，在编码CODM的内源基因中鉴定的功能丧失突变可以与包含设计用于如上所述降低T6ODM表达的表达构建体的遗传修饰组合，反之亦然。
生物碱收集和分析
罂粟种植和鸦片收获传统上涉及手动切割种子蒴果和收集乳液的过程。然而，从罂粟杆中提取吗啡和相关化合物的方法绕过了传统技术，并且可以同时获得高质量的种子和药学上有价值的原料。从罂粟杆或罂粟植物的乳液中回收蒂巴因在本领域是公知的，如WO2009109012中所讨论的。除了以下描述的特定方法之外，在WO2009109012中还讨论了从罂粟秆或乳液中分析生物碱提取物的方法。
实施例
参考附图2，发明人使用靶向编码CODM和T6ODM酶的基因的单个发夹构建体来测试这样的假设：与亲本植株相比，含有高水平的蒂巴因的(可待因和吗啡的水平降低)植物可以通过同时降低T6ODM和CODM酶的活性产生。
参考附图3，CODM和T6ODM基因的编码序列具有非常高的同一性水平。因此，发明人创造了单一表达构建体，以通过RNAi靶向编码CODM的内源基因和编码来自T6ODM编码序列的一部分的T6ODM的内源基因。图2中描述的RNAi基因构建体的正义和反义部分的T6ODM编码序列的部分在图3中用下划线标出。使用引物AAAGGCGCGCCCCTTGTCCTCAACCAAATAAAATTTAAATTCCACTTTTAAACAAAGC)从罂粟植物材料分离的cDNA扩增342个碱基对正义片段。使用引物AAAACTAGTCCTTGTCCTCAACCAAAT)和OPP026(AAAGGATCCTCCACTTTTAAACAAAGC)从罂粟植物材料中分离的cDNA扩增342碱基对反义片段。这两个片段用于产生核苷酸分子，其中这些片段插入来自β-葡糖醛酸糖苷酶的序列。
待转录产生发夹RNA的核酸分子的序列如SEQ ID NO：6所示。T6ODM序列标有下划线，而T6ODM序列之间介入的“发夹”序列来源于β-葡萄糖醛酸酶的编码序列。
将包含SEQ ID NO：6的完整表达构建体与花椰菜花叶病毒35S启动子和来自章鱼碱合酶的转录和翻译终止序列克隆到TDNA转移载体中。载体的左侧和右侧边界之间的序列如SEQ ID NO：5所提供。第一个下划线区域的5'序列(即“正义”T6ODM特异性序列)包含35S启动子序列，而第二下划线区域的3'序列(即“反义”T6ODM特异性序列)包含来自章鱼碱合酶的转录和翻译终止序列。
虽然该表达构建体是使用传统聚合酶链式反应(PCR)和克隆技术(例如用限制酶和连接)的组合产生的，但技术人员将理解可以使用各种常规技术来产生构建体，包括重叠延伸PCR克隆或直接合成。
从右边界到左边界的包含SEQ ID NO：6的整个T-DNA的序列由SEQ ID NO：4提供。
病毒诱导的基因沉默(VIGS)用于瞬时测定基因盒沉默编码T6ODM和CODM的内源基因的能力。VIGS是植物RNA沉默技术，其使用携带目的基因片段的病毒载体产生双链RNA，启动靶基因的沉默。pTRV1(辅助质粒)和pTRV2(二元载体)基于TRV的VIGS载体表达表达构建体。在浸润后48小时、72小时、5天、7天和2周取组织。如图4a和4b所示，表达构建体的瞬时表达导致转化后48小时来自编码CODM和T6ODM的内源基因的转录物显著下调(上述的图3a和3b中右起第一个柱)。
然后根据以下方案然后产生用表达构建体稳定转化的植物。
转化方案
罂粟胚轴/根的转化
媒介要求：
LB
农杆菌悬浮培养基
B5盐和维生素含20g/l蔗糖，pH-5.6-5.8±0.2。
发芽培养基
半强度Murashige和Skoog基础培养基，补充20g/l蔗糖，8g/l琼脂。pH-5.8±0.2。
初级愈伤组织诱导培养基
B5培养基含有30g/l蔗糖，2.0mg/l NAA和0.1mg/l BAP，8g/l琼脂。
体细胞胚诱导培养基
B5培养基含有1.0mg/l NAA，0.5mg/l BAP，50mg/l巴龙霉素，300mg/l特美汀和8g/l琼脂。
胚胎诱导培养基
Murashige和Skoog基础培养基，补充有30g/l蔗糖，0.25g/l MES，0.2g/l肌醇，1mg/l 2,4-D，2.5mg/l AgNO 3，8g/l琼脂。pH-5.6±0.2。(加抗生素-特美汀300mg/l)。
胚胎成熟和萌发
Murashige和Skoog基础培养基，补充30g/l蔗糖，0.25g/l MES，0.2g/l肌醇，1mg/l苄基腺嘌呤，1g/l玉米素，2.5mg/l AgNO3，8g/l琼脂。pH-5.6±0.2。(加抗生素-特美汀300mg/l)。
不含植物激素的植物再生培养基
B5培养基含有50mg/L的巴龙霉素，300mg/L的特美汀和8g/L的琼脂。
芽伸长培养基
Murashige和Skoog基础培养基补充有30g/l蔗糖，0.25g/lMES，0.2g/l肌醇，0.5mg/l苄基腺嘌呤，2.5mg/l AgNO3，8g/l琼脂。pH-5.6±0.2。(加抗生素-特美汀300mg/l)。
生根培养基
Murashige和Skoog基础培养基补充有30g/l蔗糖，0.25g/l MES，0.2g/l肌醇，2.5mg/l AgNO3，8g/l琼脂。pH-5.6±0.2。(加抗生素-特美汀300mg/l)。
种子消毒和发芽
将种子用70％(vv-1)乙醇30秒和1％(vv-1)次氯酸钠溶液2分钟进行表面消毒，每次3分钟，然后在无菌水中漂洗5次。将大约50粒种子置于罐中的25ml琼脂固化的培养基上。基础培养基由补充有30g/l蔗糖的1/2Murashige和Skoog基础培养基(Gamborg等人，1968)组成，并用0.8％(wv-1)琼脂固化。在加入琼脂之前将培养基调节至pH 5.6-5.8，然后通过高压灭菌进行灭菌。种子在25℃的生长室中在标准冷白色荧光管和16小时光周期下发芽。
根癌农杆菌的制备
通过电穿孔在根癌农杆菌菌株EHA105中调动二元载体pORE::ALM-MIR MAC。根癌农杆菌培养物在28℃下，在旋转振荡器上以180rpm，在含有50mg/l卡那霉素和利福平100mg/l的液体Luria-Bertani培养基[1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％NaCl，pH7.0]中生长至A600＝0.8。通过在4000rpm下离心10分钟收集细菌细胞，并在液体接种培养基(B5盐和维生素含20g/l蔗糖)中以A600＝0.5的细胞密度重悬浮。
转基因植物的产生
通过下胚轴的纵向二等分分离来自12日龄幼苗，第118株系的切除的子叶。将下胚轴浸入液体接种培养基中的根癌农杆菌培养物中15分钟，在无菌滤纸上吸干，并在25℃下在原代愈伤组织诱导培养基上在黑暗中培养。与根癌农杆菌共培养2天后，将下胚轴转移到含有50mg/L帕莫西霉素和300mg/L特美汀的新鲜原代愈伤组织诱导培养基中。孵育4-5周后，将原代愈伤组织在体细胞胚诱导培养基上传代培养。在诱导培养基上培养3周后，将体细胞胚转移到不含植物激素的植物再生培养基中。将成熟胚置于无植物激素的培养基上，将未成熟胚转移至胚胎成熟和萌发培养基中。然后，当第一个子叶出现时，将它们移植到芽伸长培养基上。最后，当芽约0.5-1厘米时，将它们放在生根培养基上。将再生的推定转基因小植株在25℃的生长室中在标准冷白条件和16小时光周期下生长。然后将生根的小植物转移到含有高压灭菌土壤的盆中，用聚乙烯袋覆盖1周以维持高湿度，并在将植物转移到温室之前在25℃下在生长室中维持1-2周。
方法：
1.在土壤杆菌中挑取所需构建体的单个菌落，并将其接种于含有适当抗生素的2ml LB液体培养基中；在28℃下培养过夜以制备起始培养物。
2.用起始培养物接种含有适当抗生素的100ml LB液体培养基，并在28℃下孵育过夜。孵育细胞直至达到所需的OD 600＝0.5-0.8。
3.通过以4000rpm离心10分钟使细胞沉淀。
4.将细胞重悬于农杆菌悬浮培养基中至最终OD 600＝0.5。
5.将来自12日龄幼苗的根和下胚轴片段切成约5mm片段，同时浸入农杆菌悬浮液中。
6.将培养皿中的根和下胚轴区段在土壤杆菌悬浮液中孵育15分钟，偶尔旋转。
7.在无菌滤纸上印迹干燥根和下胚轴片段，并转移到含有初级愈伤组织诱导培养基的平板上。将板在22±2℃下在生长箱中在黑暗下(用铝箔覆盖)孵育2天。
8.共培养2天后，用无菌蒸馏水洗涤根和下胚轴片段，在无菌滤纸上吸干并转移到含有初级愈伤组织诱导培养基的平板上(加入抗生素巴龙霉素)。
9.将培养板在标准条件下(16/8小时光周期)在黑暗中(用铝箔覆盖)在生长室中孵育约4-5周。
10.孵育4-5周后，将原代愈伤组织在体细胞胚诱导培养基上进行传代培养(加入抗生素巴龙霉素)。
11.在诱导培养基上培养3周后，将成熟的体细胞胚转移到无植物激素的培养基(无抗生素)中。将未成熟胚置于胚胎成熟和萌发培养基(无抗生素)的另一轮筛选中，并在生长箱中在16/8小时光周期下在22±2℃温育直至胚胎成熟并开始发芽。
12.将发芽胚胎转移到含有芽伸长培养基的平板上，直到芽出现，然后转移到生根培养基中。
13.将～0.5-1.0cm的芽转移到生根培养基上。
14.在自来水下洗涤生根的小植物以除去整个粘附的琼脂，然后转移到小盆中的无菌土壤中，用保鲜膜覆盖并在生长箱中孵育以适应环境。
15.分析获得的推定转化体的转基因存在和表达。
注意事项：生根培养基中无抗生素。
化学药品
1.50mg/ml巴龙霉素原液：通过将粉末溶解在水中并通过过滤灭菌，等分试样并在-20℃下储存来制备。
2.50mg/ml卡那霉素原液：通过将粉末溶解在水中并通过过滤灭菌，等分试样并在-20℃下储存来制备。
3.100mg/ml利福平原液：通过将粉末溶解在DMSO中，等分试样并在-20℃下储存来制备。
4.300mg/ml特美汀原液：通过将粉末溶解在水中并通过过滤灭菌，等分试样并在-20℃下储存来制备。
5.2.0mg/ml NAA原液：通过将粉末溶解在1N NaOH中，用水调节体积并通过过滤灭菌，等分试样并在-20℃下储存来制备。
6.2.0mg/ml BAP原液：通过将粉末溶解在1N NaOH中，用水调节体积并通过过滤灭菌，等分试样并在-20℃下储存来制备。
7.5mg/ml AgNO3原液：通过将粉末溶解在水中并通过过滤灭菌来制备，并储存在+4℃。
8.1.0mg/ml玉米素原液：通过将粉末溶解在1N NaOH中，用水调节体积并通过过滤灭菌，等分试样并在-20℃下储存来制备。
9.一旦冷却至约50℃，将用于培养基的所有化学品加入高压灭菌的培养基中。在倒入90x 25毫米培养皿之前，旋转以彻底混合培养基。
再生转基因植物的表征
包含表达构建体的T-DNA包括nptII基因，其赋予对巴龙霉素的抗性。鉴定出六株小植株(AM1至AM6)对巴龙霉素具有抗性，表明这些植株转化了表达构建体。使用对发夹表达构建体特异的引物(SEQ ID NO：9，TAACCGACTTGCTGCCCCGA；SEQ ID NO：10，AAATAGAGATGCTTGCAGAAGATCCCG)对从这些小植株分离的基因组DNA进行聚合酶链反应，显示植株AM1，AM2和AM3含有来自基因组DNA的扩增。肌动蛋白引物(SEQ ID NO：11，CGTTTGAATCTTGCTGGCCGTGAT；SEQ ID NO：12，TAGACGAGCTGCCTTTGGAAGTGT)用作阳性对照以证实样品含有来自罂粟的基因组DNA。
参考图4，使用发夹特异性引物(SEQ ID NO：9，TAACCGACTTGCTGCCCCGA；SEQ IDNO：10，AAATAGAGATGCTTGCAGAAGATCCCG)对来自植株AM1至AM6的RNA提取物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，并证明表达构建体在植株AM1、AM2和AM3中表达。
使用对编码CODM和T6ODM的内源转录物特异性引物对来自植株AM1至AM6的RNA提取物进行RT-PCR。参考附图5，表达构建体的表达似乎足以下调编码T6ODM的内源基因相对于不表达表达构建体的植株的表达。参考附图6，表达构建体的表达似乎足以下调编码CODM的内源基因相对于不表达表达构建体的植株的表达。
生物碱分析
酸提取：将0.100g研磨蒴果或茎(来自罂粟)与5ml 10％乙酸，10％水和80％甲醇的溶液混合，然后搅拌30分钟，然后过滤。将滤液直接注入HPLC。
所有样品在HPLC梯度系统上运行，所述HPLC梯度系统具有Kinetex 2.6um C18，50×2.1mm柱，具有2微升注射体积，在280nm下45℃的温度和0.8ml/min的流速下操作。洗脱液A是10mM乙酸铵缓冲液，pH5.5，而洗脱液B是乙腈(100％)。梯度曲线如下
报告的数字是干燥原料的重量百分比。
参照图7A至7D，与不存在表达构建体且具有野生型水平的T6ODM和CODM表达的植物相比，AM1的蒴果和AM2及AM3的叶的生物碱分析表明，
蒂巴因的积累增加并且吗啡的积累减少。随后对AM2和AM3植株蒴果中生物碱的分析表明，蒂巴因在AM2蒴果中累积至4.82％的生物碱，在AM3蒴果中累积至3.13％的总生物碱。在AM1、AM2和AM3植株中基本上没有检测到吗啡。
表1.每100mg干燥蒴果中转基因植物中生物碱的浓度。
自花授粉的AM1、AM2和AM3转化体的后代几乎以3：1分离，表明转基因是稳定整合和遗传的。
携带表达构建体的六个另外的单个转化体被分离(AM12、AM13、AM16、AM17和AM19)，其不能检测到内源性CODM和T6ODM转录物。在这些另外的植株的蒴果中的分析显示，蒂巴因在蒴果中累积至多达8.28％的生物碱(参见表2)。
表2.每100mg干燥蒴果中转基因植株中蒂巴因的浓度。
蒂巴因(浓度.wt％)
来自含有表达构建体的AM1的后代种子的植株被种植。表3中提供了携带表达构建体的六个AM1后代的罂粟秆中吗啡、东罂粟碱(oripavine)、可待因和吗啡的浓度。
表3.在AM1后代的罂粟秆中的蒂巴因、可待因、东罂粟碱和吗啡的浓度。
操作
虽然已经描述和说明了本发明的特定实施例，但是这些实施例应该仅被认为是对本发明的说明，而不是对根据所附权利要求解释的本发明的限制。
该描述包含以ASCII文本格式的电子形式的序列表。序列表中的序列在下表中再现。
序列表
<110> API实验室有限公司.
<120> 高水平蒂巴因罂粟及其生产的方法
<130> 16272-10
<140> CA 2941315
<141> 2016-09-07
<150> US 62/374,682
<151> 2016-08-12
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 364
<212> PRT
<213> T6ODM蛋白 罂粟(Papaver somniferumL.)
<400> 1
Met Glu Lys Ala Lys Leu Met Lys Leu Gly Asn Gly Met Glu Ile Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu Ile Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Val Cys Ala Asn Glu Asn Leu Leu Leu Pro Met Gly Ala Ser Val
35 40 45
Ile Asn Asp His Glu Thr Ile Pro Val Ile Asp Ile Glu Asn Leu Leu
50 55 60
Ser Pro Glu Pro Ile Ile Gly Lys Leu Glu Leu Asp Arg Leu His Phe
65 70 75 80
Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp
85 90 95
Ala Ser Leu Val Asp Ser Val Lys Ser Glu Ile Gln Gly Phe Phe Asn
100 105 110
Leu Ser Met Asp Glu Lys Thr Lys Tyr Glu Gln Glu Asp Gly Asp Val
115 120 125
Glu Gly Phe Gly Gln Gly Phe Ile Glu Ser Glu Asp Gln Thr Leu Asp
130 135 140
Trp Ala Asp Ile Phe Met Met Phe Thr Leu Pro Leu His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Pro His Leu Phe Ser Lys Leu Pro Val Pro Leu Arg Glu Thr Ile Glu
165 170 175
Ser Tyr Ser Ser Glu Met Lys Lys Leu Ser Met Val Leu Phe Asn Lys
180 185 190
Met Glu Lys Ala Leu Gln Val Gln Ala Ala Glu Ile Lys Gly Met Ser
195 200 205
Glu Val Phe Ile Asp Gly Thr Gln Ala Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Gln Pro Asn Leu Ala Ile Gly Leu Thr Ser His Ser Asp
225 230 235 240
Phe Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Ile Asn Glu Val Glu Gly Leu
245 250 255
Gln Ile Lys Arg Glu Gly Thr Trp Ile Ser Val Lys Pro Leu Pro Asn
260 265 270
Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly
275 280 285
Ile Tyr His Ser Val Asp His Arg Ala Val Val Asn Ser Thr Asn Glu
290 295 300
Arg Leu Ser Ile Ala Thr Phe His Asp Pro Ser Leu Glu Ser Val Ile
305 310 315 320
Gly Pro Ile Ser Ser Leu Ile Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Lys
325 330 335
Ser Gly Ser Thr Tyr Gly Asp Leu Val Glu Glu Cys Lys Thr Arg Lys
340 345 350
Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp Ser Met Arg Ile
355 360
<210> 2
<211> 1386
<212> DNA
<213> T6ODM 罂粟(Papaver somniferumL.)
<400> 2
gttcttaatt cattaattaa tttagaaaaa tcatggagaa agcaaaactt atgaagctag 60
gtaatggtat ggaaatacca agtgttcaag aattggctaa actcacgctt gccgaaattc 120
catctcgata cgtatgcgcc aatgaaaacc ttttgttgcc tatgggtgca tctgtcataa 180
atgatcatga aaccattcct gtcatcgata tagaaaattt attatctcca gaaccaataa 240
tcggaaagtt agaattagat aggcttcatt ttgcttgcaa agaatggggt ttttttcagg 300
tagtgaacca tggagtcgac gcttcattgg tggatagtgt aaaatcagaa attcaaggtt 360
tctttaacct ttctatggat gagaaaacta aatatgaaca ggaagatgga gatgtggaag 420
gatttggaca aggctttatt gaatcagagg accaaacact tgattgggca gatatattta 480
tgatgttcac tcttccactc catttaagga agcctcactt attttcaaaa ctcccagtgc 540
ctctcaggga gacaatcgaa tcctactcat cagaaatgaa aaagttatcc atggttctct 600
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tgtttataga tgggacacaa gcaatgagga tgaactatta tcccccttgt cctcaaccaa 720
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<213> CODM 罂粟(Papaver somniferumL.)
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Tyr Glu Asp Ile Leu Lys Glu Asn Leu Ser Arg Lys Leu Asp Gly Lys
340 345 350
Ser Phe Leu Asp Tyr Met Arg Met
355 360
<210> 4
<211> 1452
<212> DNA
<213> CODM 罂粟(Papaver somniferumL.)
<400> 4
gtaaagattg atatatgatc tgaagatctg acaagaaagt tcatcaaata tagagttcat 60
ggagacacca atacttatca agctaggcaa tggtttgtca ataccaagtg ttcaggaatt 120
ggctaaactc acgcttgcag aaattccatc tcgatacaca tgcaccggtg aaagcccgtt 180
gaataatatt ggtgcgtctg taacagatga tgaaacagtt cctgtcatcg atttgcaaaa 240
tttactatct ccagaacccg tagttggaaa gttagaattg gataagcttc attctgcttg 300
caaagaatgg ggtttctttc agctggttaa ccatggagtc gacgctttac tgatggacaa 360
tataaaatca gaaattaaag gtttctttaa ccttccaatg aatgagaaaa ctaaatacgg 420
acagcaagat ggagattttg aaggatttgg acaaccctat attgaatcgg aggaccaaag 480
acttgattgg actgaagtgt ttagcatgtt aagtcttcct ctccatttaa ggaagcctca 540
tttgtttcca gaactccctc tgcctttcag ggagacactg gaatcctacc tatcaaaaat 600
gaaaaaacta tcaacggttg tctttgagat gttggaaaaa tctctacaat tagttgagat 660
taaaggtatg acagacttat ttgaagatgg gttgcaaaca atgaggatga actattatcc 720
tccttgtcct cgaccagagc ttgtacttgg tcttacgtca cactcggatt ttagcggttt 780
gacaattctc cttcaactta atgaagttga aggattacaa ataagaaaag aagagaggtg 840
gatttcaatc aaacctctac ctgatgcgtt catagtgaat gttggagaca ttttggagat 900
aatgactaat gggatttacc gtagcgtcga gcaccgggca gtagtaaact caacaaagga 960
gaggctctca atcgcgacat ttcatgactc taaactagag tcagaaatag gcccaatttc 1020
gagcttggtc acaccagaga cacctgcttt gttcaaaaga ggtaggtatg aggatatttt 1080
gaaggaaaat ctttcaagga agcttgatgg aaaatcattt ctcgactaca tgaggatgtg 1140
agaaagtgtg aacatatatt atactccaca ttgtgtttaa tatatgatga aataagttgc 1200
ttttgaagta tgatgaaata agttggtttt gaagaattca tattgtgctt aaatttcgtg 1260
gatgactgag agatttatta tgtaataata atgtattggt ttgaagattc tcgtctcact 1320
atatgtaaga ctctgtttgg gtcaagtgat gtaatcacgg ttgaaataag ttgcttttga 1380
agaattcata tggtgcttaa tattatgtaa taaataatgt attggattga aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aa 1452
<210> 5
<211> 8688
<212> DNA
<213> TDNA序列(人工序列)
<400> 5
tcctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga cgaacggata aaccttttca cgccctttta 60
aatatccgat tattctaata aacgctcttt tctcttaggt ttacccgcca atatatcctg 120
tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgctagtg gatctcccag 180
tcacgacgtt gtaaaacggg cgccccgcgg aaagcttgct agccaattgg ggcccaacgt 240
tctcgagaac gtggatactt ggcagtggtt acttggcttt tcctttattt tcttttggac 300
ggaagcggtg gttactttgt cacacattta aaaaaacacg tgtttctcac ttttttctat 360
tcccgtcaca aacaatttta agaaagatcc atctatcgtg atctttctat caaacaaaag 420
aaaaaaggtc ttcatagtaa cgctacaaca tcaaatatgt ggttgctctg acatcagtcg 480
ggaaaataag gatatggcgg cattggccac atctattggg gtcccaactt cctttcacaa 540
aaaaattaaa ttgggtgtcc caacttttat ctttgatata gtgacatgag tatcgggagc 600
attggacaat ggataaaatg agaactaaaa aaattctggt taatttttga tcattgttat 660
ttaaaaggtt attttatcta taatctaccc atattgatca gttttattta aatttgttta 720
gctaccgctc cacgagagag atcctcatct taaaaatgga atatggaaat tacacacgac 780
cccaaaagta tattttttct ctggagaatg ctatttagag ctttgactat atggtctgaa 840
ttagaaagac gggaaataaa atctgctaag tgatataagc tctaagtagg cgatgtgtga 900
tggagaacac cttttcttta acagtcttca tgttttacag attcgcgaac ttcgaatatc 960
cctatacggt ctgtctaacc ctcgtgtgtc ttttgagtcc aagataaagg ccattattga 1020
gtaacataga catgctggaa tccaaccatt gaagtcacaa ctgtccatgt agattctttg 1080
gagaatctga aaagtcttaa taaaggtggt gtttcaaaga aaacaaaaca aatgagttaa 1140
gaaaaaaaaa tatcatgtag tggtcgagta ttatgttatt tattgtgtag ctaccaatct 1200
ttattcttta aatctgacat aaaatgctac aaacttttta cctcgtctat agccccaaaa 1260
aacctaacca cggttctaaa accacacaca gtgattttgg ttgacgacaa tgcctctcct 1320
tcctcaaaac gatttattta cattttttaa atcaaatgtt acattttata ccataattaa 1380
gtctttttac agaatactta gatggaagag atgtataaaa aaggaggaaa ttgtaaaaaa 1440
catatttcga tcaattaaac caggattcat aaaaatataa gtatatatat aaatgatgtt 1500
tcgtttagcg atgaacttca ctcatatgat aatacttaac aatataagta cataaaaaat 1560
aaaataaaat taattgttta cgaaaagtct acaaatactg catgtataat taatgttctc 1620
tttatttatt tatttatacc ttaccaagat atatctataa ccgcatagaa atagaaggcg 1680
aagagataat ttccaaaaac aagaaaaacc tctaagctca aaagtctaga aggccttgga 1740
tccacccatg gaggttgtca cagtatcact tgtagcagtt gtgatcacta ctttcttata 1800
cttaatcttc agagattcaa gtcctaaagg tttgccacca ggtccaaaac cctggccaat 1860
agttggaaac cttcttcaac ttggtgagaa acctcattct cagtttgctc agcttgctga 1920
aacctatggt gatctctttt cactgaaact aggaagtgaa acggttgttg tagcttcaac 1980
tccattagca gctagcgaga ttctaaagac gcatgatcgt gttctctctg gtcgatacgt 2040
gtttcaaagt ttccgggtaa aggaacatgt ggagaactct attgtgtggt ctgaatgtaa 2100
tgaaacatgg aagaaactgc ggaaagtttg tagaacggaa ctttttacgc agaagatgat 2160
tgaaagtcaa gctgaagtta gagaaagtaa ggctatggaa atggtggagt atttgaagaa 2220
aaatgtagga aatgaagtga aaattgctga agttgtattt gggacgttgg tgaatatatt 2280
cggtaacttg atattttcac aaaatatttt caagttgggt gatgaaagta gtggaagtgt 2340
agaaatgaaa gaacatctat ggagaatgct ggaattgggg aactcgacaa atccagctga 2400
ttattttcca tttttgggta aattcgattt gtttggacaa agaaaagatg ttgctgattg 2460
tctgcaaggg atttatagtg tttggggtgc tatgctcaaa gaaagaaaaa tagccaagca 2520
gcataacaac agcaagaaga atgattttgt tgagattttg ctcgattccg gactcgatga 2580
ccagcagatt aatgccttgc tcatggaaat atttggtgcg ggaacagaga caagtgcatc 2640
tacaatagaa tgggcgttgt ctgagctcac aaaaaaccct caagtaacag ccaatatgcg 2700
gttggaattg ttatctgtgg tagggaagag gccggttaag gaatccgaca taccaaacat 2760
gccttatctt caagcttttg ttaaagaaac tctacggctt catccagcaa ctcctctgct 2820
gcttccacgt cgagcacttg agacctgcaa agttttgaac tatacgatcc cgaaagagtg 2880
tcagattatg gtgaacgcct ggggcattgg tcgggatcca aaaaggtgga ctgatccatt 2940
gaagttttca ccagagaggt tcttgaattc gagcattgat ttcaaaggga acgacttcga 3000
gttgatacca tttggtgcag ggagaaggat atgtcctggt gtgcccttgg caactcaatt 3060
tattagtctt attgtgtcta gtttggtaca gaattttgat tggggattac cgaagggaat 3120
ggatcctagc caactgatca tggaagagaa atttgggtga cactgcaaaa ggaaccacct 3180
ctgtatattg ttcctaaaac tcgggattaa gggagaattc gtcgactttg cggccgcatc 3240
gatactgcag gagctcggta ccttttacta gtgatatccc tgtgtgaaat tgttatccgc 3300
tacgcgtgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 3360
tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat 3420
gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat 3480
ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt 3540
gtcatctatg ttactagatc ccatgggaag ttcctattcc gaagttccta ttctctgaaa 3600
agtataggaa cttcagcgat cgctccaatc ccacaaaaat ctgagcttaa cagcacagtt 3660
gctcctctca gagcagaatc gggtattcaa caccctcata tcaactacta cgttgtgtat 3720
aacggtccac atgccggtat atacgatgac tggggttgta caaaggcggc aacaaacggc 3780
gttcccggag ttgcacacaa gaaatttgcc actattacag aggcaagagc agcagctgac 3840
gcgtacacaa caagtcagca aacagacagg ttgaacttca tccccaaagg agaagctcaa 3900
ctcaagccca agagctttgc taaggcccta acaagcccac caaagcaaaa agcccactgg 3960
ctcacgctag gaaccaaaag gcccagcagt gatccagccc caaaagagac tcctttgccc 4020
cggagattac aatggacgat ttcctctatc tttacgatct aggaaggaag ttcgaaggtg 4080
aaggtgacga cactatgttc accactgata atgagaaggt tagcctcttc aatttcagaa 4140
agaatgctga cccacagatg gttagagagg cctacgcagc aggtctcatc aagacgatct 4200
acccgagtaa caatctccag gagatcaaat accttcccaa gaaggttaaa gatgcagtca 4260
aaagattcag gactaattgc atcaagaaca cagagaaaga catatttctc aagatcagaa 4320
gtactattcc agtatggacg attcaaggct tgcttcataa accaaggcaa gtaatagaga 4380
ttggagtctc taaaaaggta gttcctactg aatctaaggc catgcatgga gtctaagatt 4440
caaatcgagg atctaacaga actcgccgtg aagactggcg aacagttcat acagagtctt 4500
ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg tggagcacga cactctggtc 4560
tactccaaaa atgtcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggctattga gacttttcaa 4620
caaaggataa tttcgggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc 4680
gaaaggacag tagaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag 4740
gctatcattc aagatctctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg 4800
agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgac 4860
atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct 4920
atataaggaa gttcatttca tttggagagg acacgctcga gtataagagc tctattttta 4980
caacaattac caacaacaac aaacaacaaa caacattaca attacattta caattaccat 5040
ggggcgcgcc ccttgtcctc aaccaaatct cgccatcggt cttacgtcgc actcggattt 5100
tggcggtttg acaatcctcc ttcaaatcaa cgaagtggaa ggattacaga taaaaagaga 5160
ggggacatgg atttcagtca aacctctacc taatgcgttc gtagtgaatg ttggagatat 5220
tttggagata atgactaatg gaatttacca tagtgtcgat caccgggcag tagtaaactc 5280
aacaaatgag aggctctcaa tcgcaacatt tcatgaccct agtctagagt cggtaatagg 5340
cccaatatca agcttgatta ctccagagac acctgctttg tttaaaagtg gaatttaaat 5400
ccccagatga acatggcatc gtggtgattg atgaaactgc tgctgtcggc tttaacctct 5460
ctttaggcat tggtttcgaa gcgggcaaca agccgaaaga actgtacagc gaagaggcag 5520
tcaacgggga aactcagcaa gcgcacttac aggcgattaa agagctgata gcgcgtgaca 5580
aaaaccaccc aagcgtggtg atgtggagta ttgccaacga accggatacc cgtccgcaag 5640
gtgcacggga atatttcgcg ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac ccgacgcgtc 5700
cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac cgataccatc agcgatctct 5760
ttgatgggga tcctccactt ttaaacaaag caggtgtctc tggagtaatc aagcttgata 5820
ttgggcctat taccgactct agactagggt catgaaatgt tgcgattgag agcctctcat 5880
ttgttgagtt tactactgcc cggtgatcga cactatggta aattccatta gtcattatct 5940
ccaaaatatc tccaacattc actacgaacg cattaggtag aggtttgact gaaatccatg 6000
tcccctctct ttttatctgt aatccttcca cttcgttgat ttgaaggagg attgtcaaac 6060
cgccaaaatc cgagtgcgac gtaagaccga tggcgagatt tggttgagga caaggactag 6120
tccctagagt cctgctttaa tgagatatgc gagacgccta tgatcgcatg atatttgctt 6180
tcaattctgt tgtgcacgtt gtaaaaaacc tgagcatgtg tagctcagat ccttaccgcc 6240
ggtttcggtt cattctaatg aatgaatata tcacccgtta ctatcgtatt tttatgaata 6300
atattctccg ttcaatttac tgattgtacc ctactactta tatgtacaat attaaaatga 6360
aaacaatata ttgtgctgaa taggtttata gcgacatcta tgatagagcg ccacaataac 6420
aaacaattgc gttttattat tacaaatcca attttaaaaa aagcggcaga accggtcaaa 6480
cctaaaagac tgattacata aatcttattc aaatttcaaa agtgccccag gggctagtat 6540
ctacgacaca ccgagcggcg aactaataac gctcactgaa gggaactccg gttccccgcc 6600
ggcgcgcatg ggtgagattc cttgaagttg agtattggcc gtccgctcta ccgaaagtta 6660
cgggcaccat tcaacccggt ccagcacggc ggccgggtaa ccgacttgct gccccgagaa 6720
ttatgcagca tttttttggt gtatgtgggc cccaaatgaa gtgcaggtca aaccttgaca 6780
gtgacgacaa atcgttgggc gggtccaggg cgaattttgc gacaacatgt cgaggctcag 6840
cagggcgatc gcagacgtcg ggatcttctg caagcatctc tatttcctga aggtctaacc 6900
tcgaagattt aagatttaat tacgtttata attacaaaat tgattctagt atctttaatt 6960
taatgcttat acattattaa ttaatttagt actttcaatt tgttttcaga aattatttta 7020
ctatttttta taaaataaaa gggagaaaat ggctatttaa atactagcct attttatttc 7080
aattttagct taaaatcagc cccaattagc cccaatttca aattcaaatg gtccagccca 7140
attcctaaat aacccacccc taacccgccc ggtttcccct tttgatccat gcagtcaacg 7200
cccagaattt ccctatataa ttttttaatt cccaaacacc cctaactcta tcccatttct 7260
caccaaccgc cacatagatc tatcctctta tctctcaaac tctctcgaac cttcccctaa 7320
ccctagcagc ctctcatcat cctcacctca aaacccaccg gggccggcca tgattgaaca 7380
agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 7440
ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggag 7500
gccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaacttc aagacgaggc 7560
agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 7620
cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 7680
atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 7740
tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 7800
acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 7860
gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct 7920
cgtcgtgact catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 7980
tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 8040
tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 8100
cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 8160
ctgaggcgcg ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 8220
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 8280
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 8340
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 8400
gcggtgtcat ctatgttact agatccctag ggaagttcct attccgaagt tcctattctc 8460
tgaaaagtat aggaacttct ttgcgtattg ggcgctcttg gcctttttgg ccaccggtcg 8520
tacggttaaa accaccccag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta agttgtctaa 8580
gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag ctccccgacc 8640
ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagtcc 8688
<210> 6
<211> 3238
<212> DNA
<213> 包含启动子的表达盒(人工序列)
<400> 6
gcgatcgctc caatcccaca aaaatctgag cttaacagca cagttgctcc tctcagagca 60
gaatcgggta ttcaacaccc tcatatcaac tactacgttg tgtataacgg tccacatgcc 120
ggtatatacg atgactgggg ttgtacaaag gcggcaacaa acggcgttcc cggagttgca 180
cacaagaaat ttgccactat tacagaggca agagcagcag ctgacgcgta cacaacaagt 240
cagcaaacag acaggttgaa cttcatcccc aaaggagaag ctcaactcaa gcccaagagc 300
tttgctaagg ccctaacaag cccaccaaag caaaaagccc actggctcac gctaggaacc 360
aaaaggccca gcagtgatcc agccccaaaa gagactcctt tgccccggag attacaatgg 420
acgatttcct ctatctttac gatctaggaa ggaagttcga aggtgaaggt gacgacacta 480
tgttcaccac tgataatgag aaggttagcc tcttcaattt cagaaagaat gctgacccac 540
agatggttag agaggcctac gcagcaggtc tcatcaagac gatctacccg agtaacaatc 600
tccaggagat caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc agtcaaaaga ttcaggacta 660
attgcatcaa gaacacagag aaagacatat ttctcaagat cagaagtact attccagtat 720
ggacgattca aggcttgctt cataaaccaa ggcaagtaat agagattgga gtctctaaaa 780
aggtagttcc tactgaatct aaggccatgc atggagtcta agattcaaat cgaggatcta 840
acagaactcg ccgtgaagac tggcgaacag ttcatacaga gtcttttacg actcaatgac 900
aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacactc tggtctactc caaaaatgtc 960
aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag gataatttcg 1020
ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag gacagtagaa 1080
aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cattcaagat 1140
ctctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 1200
gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc cactgacgta 1260
agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca 1320
tttcatttgg agaggacacg ctcgagtata agagctctat ttttacaaca attaccaaca 1380
acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac atttacaatt accatggggc gcgccccttg 1440
tcctcaacca aatctcgcca tcggtcttac gtcgcactcg gattttggcg gtttgacaat 1500
cctccttcaa atcaacgaag tggaaggatt acagataaaa agagagggga catggatttc 1560
agtcaaacct ctacctaatg cgttcgtagt gaatgttgga gatattttgg agataatgac 1620
taatggaatt taccatagtg tcgatcaccg ggcagtagta aactcaacaa atgagaggct 1680
ctcaatcgca acatttcatg accctagtct agagtcggta ataggcccaa tatcaagctt 1740
gattactcca gagacacctg ctttgtttaa aagtggaatt taaatcccca gatgaacatg 1800
gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt 1860
tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc 1920
agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg 1980
tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt 2040
tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca 2100
atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat ggggatcctc 2160
cacttttaaa caaagcaggt gtctctggag taatcaagct tgatattggg cctattaccg 2220
actctagact agggtcatga aatgttgcga ttgagagcct ctcatttgtt gagtttacta 2280
ctgcccggtg atcgacacta tggtaaattc cattagtcat tatctccaaa atatctccaa 2340
cattcactac gaacgcatta ggtagaggtt tgactgaaat ccatgtcccc tctcttttta 2400
tctgtaatcc ttccacttcg ttgatttgaa ggaggattgt caaaccgcca aaatccgagt 2460
gcgacgtaag accgatggcg agatttggtt gaggacaagg actagtccct agagtcctgc 2520
tttaatgaga tatgcgagac gcctatgatc gcatgatatt tgctttcaat tctgttgtgc 2580
acgttgtaaa aaacctgagc atgtgtagct cagatcctta ccgccggttt cggttcattc 2640
taatgaatga atatatcacc cgttactatc gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa 2700
tttactgatt gtaccctact acttatatgt acaatattaa aatgaaaaca atatattgtg 2760
ctgaataggt ttatagcgac atctatgata gagcgccaca ataacaaaca attgcgtttt 2820
attattacaa atccaatttt aaaaaaagcg gcagaaccgg tcaaacctaa aagactgatt 2880
acataaatct tattcaaatt tcaaaagtgc cccaggggct agtatctacg acacaccgag 2940
cggcgaacta ataacgctca ctgaagggaa ctccggttcc ccgccggcgc gcatgggtga 3000
gattccttga agttgagtat tggccgtccg ctctaccgaa agttacgggc accattcaac 3060
ccggtccagc acggcggccg ggtaaccgac ttgctgcccc gagaattatg cagcattttt 3120
ttggtgtatg tgggccccaa atgaagtgca ggtcaaacct tgacagtgac gacaaatcgt 3180
tgggcgggtc cagggcgaat tttgcgacaa catgtcgagg ctcagcaggg cgatcgca 3238
<210> 7
<211> 1067
<212> DNA
<213> 发夹构建体(人工序列)
<400> 7
ccccttgtcc tcaaccaaat ctcgccatcg gtcttacgtc gcactcggat tttggcggtt 60
tgacaatcct ccttcaaatc aacgaagtgg aaggattaca gataaaaaga gaggggacat 120
ggatttcagt caaacctcta cctaatgcgt tcgtagtgaa tgttggagat attttggaga 180
taatgactaa tggaatttac catagtgtcg atcaccgggc agtagtaaac tcaacaaatg 240
agaggctctc aatcgcaaca tttcatgacc ctagtctaga gtcggtaata ggcccaatat 300
caagcttgat tactccagag acacctgctt tgtttaaaag tggaatttaa atccccagat 360
gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg gctttaacct ctctttaggc 420
attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg 480
gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac 540
ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg 600
gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc 660
tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca tcagcgatct ctttgatggg 720
gatcctccac ttttaaacaa agcaggtgtc tctggagtaa tcaagcttga tattgggcct 780
attaccgact ctagactagg gtcatgaaat gttgcgattg agagcctctc atttgttgag 840
tttactactg cccggtgatc gacactatgg taaattccat tagtcattat ctccaaaata 900
tctccaacat tcactacgaa cgcattaggt agaggtttga ctgaaatcca tgtcccctct 960
ctttttatct gtaatccttc cacttcgttg atttgaagga ggattgtcaa accgccaaaa 1020
tccgagtgcg acgtaagacc gatggcgaga tttggttgag gacaagg 1067
<210> 8
<211> 342
<212> DNA
<213> 发夹构建体的正义链(人工序列)
<400> 8
ccttgtcctc aaccaaatct cgccatcggt cttacgtcgc actcggattt tggcggtttg 60
acaatcctcc ttcaaatcaa cgaagtggaa ggattacaga taaaaagaga ggggacatgg 120
atttcagtca aacctctacc taatgcgttc gtagtgaatg ttggagatat tttggagata 180
atgactaatg gaatttacca tagtgtcgat caccgggcag tagtaaactc aacaaatgag 240
aggctctcaa tcgcaacatt tcatgaccct agtctagagt cggtaatagg cccaatatca 300
agcttgatta ctccagagac acctgctttg tttaaaagtg ga 342
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成引物(人工序列)
<400> 9
taaccgactt gctgccccga 20
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成引物(人工序列)
<400> 10
aaatagagat gcttgcagaa gatcccg 27
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成引物(人工序列)
<400> 11
cgtttgaatc ttgctggccg tgat 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成引物(人工序列)
<400> 12
tagacgagct gcctttggaa gtgt 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成引物(人工序列)
<400> 13
cgtcttgcgc actgatttga a 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成引物(人工序列)
<400> 14
cgtttgaatc ttgctggccg tgat 24
<210> 15
<211> 1386
<212> RNA
<213> T6ODM RNA 转录本 罂粟(Papaver somniferumL.)
<400> 15
guucuuaauu cauuaauuaa uuuagaaaaa ucauggagaa agcaaaacuu augaagcuag 60
guaaugguau ggaaauacca aguguucaag aauuggcuaa acucacgcuu gccgaaauuc 120
caucucgaua cguaugcgcc aaugaaaacc uuuuguugcc uaugggugca ucugucauaa 180
augaucauga aaccauuccu gucaucgaua uagaaaauuu auuaucucca gaaccaauaa 240
ucggaaaguu agaauuagau aggcuucauu uugcuugcaa agaauggggu uuuuuucagg 300
uagugaacca uggagucgac gcuucauugg uggauagugu aaaaucagaa auucaagguu 360
ucuuuaaccu uucuauggau gagaaaacua aauaugaaca ggaagaugga gauguggaag 420
gauuuggaca aggcuuuauu gaaucagagg accaaacacu ugauugggca gauauauuua 480
ugauguucac ucuuccacuc cauuuaagga agccucacuu auuuucaaaa cucccagugc 540
cucucaggga gacaaucgaa uccuacucau cagaaaugaa aaaguuaucc augguucucu 600
uuaauaagau ggaaaaagcu cuacaaguac aagcagccga gauuaagggu augucagagg 660
uguuuauaga ugggacacaa gcaaugagga ugaacuauua ucccccuugu ccucaaccaa 720
aucucgccau cggucuuacg ucgcacucgg auuuuggcgg uuugacaauc cuccuucaaa 780
ucaacgaagu ggaaggauua cagauaaaaa gagaggggac auggauuuca gucaaaccuc 840
uaccuaaugc guucguagug aauguuggag auauuuugga gauaaugacu aauggaauuu 900
accauagugu cgaucaccgg gcaguaguaa acucaacaaa ugagaggcuc ucaaucgcaa 960
cauuucauga cccuagucua gagucgguaa uaggcccaau aucaagcuug auuacuccag 1020
agacaccugc uuuguuuaaa aguggaucua cauaugggga ucuuguggag gaauguaaaa 1080
caaggaagcu cgauggaaaa ucauuucuug acuccaugag gauuugaaaa cucaagaaaa 1140
aauaauacga cgugauugca ugucagauuc aacuauccuu uugucguuuu uuggugcucg 1200
aguccuuaau uguuuugauc auugcuuuug auucuaauua auaagacuuu ucucaagaac 1260
cacauguaau guaccuuuac uuucagaaaa uaaaaaguau ugaggcacaa augagaaaau 1320
ugagagagug cuugagaagu guaauuucuc gaaagugcgu uguguuugaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaa 1386
<210> 16
<211> 1452
<212> RNA
<213> CODM RNA 转录本罂粟(Papaver somniferumL.)
<400> 16
guaaagauug auauaugauc ugaagaucug acaagaaagu ucaucaaaua uagaguucau 60
ggagacacca auacuuauca agcuaggcaa ugguuuguca auaccaagug uucaggaauu 120
ggcuaaacuc acgcuugcag aaauuccauc ucgauacaca ugcaccggug aaagcccguu 180
gaauaauauu ggugcgucug uaacagauga ugaaacaguu ccugucaucg auuugcaaaa 240
uuuacuaucu ccagaacccg uaguuggaaa guuagaauug gauaagcuuc auucugcuug 300
caaagaaugg gguuucuuuc agcugguuaa ccauggaguc gacgcuuuac ugauggacaa 360
uauaaaauca gaaauuaaag guuucuuuaa ccuuccaaug aaugagaaaa cuaaauacgg 420
acagcaagau ggagauuuug aaggauuugg acaacccuau auugaaucgg aggaccaaag 480
acuugauugg acugaagugu uuagcauguu aagucuuccu cuccauuuaa ggaagccuca 540
uuuguuucca gaacucccuc ugccuuucag ggagacacug gaauccuacc uaucaaaaau 600
gaaaaaacua ucaacgguug ucuuugagau guuggaaaaa ucucuacaau uaguugagau 660
uaaagguaug acagacuuau uugaagaugg guugcaaaca augaggauga acuauuaucc 720
uccuuguccu cgaccagagc uuguacuugg ucuuacguca cacucggauu uuagcgguuu 780
gacaauucuc cuucaacuua augaaguuga aggauuacaa auaagaaaag aagagaggug 840
gauuucaauc aaaccucuac cugaugcguu cauagugaau guuggagaca uuuuggagau 900
aaugacuaau gggauuuacc guagcgucga gcaccgggca guaguaaacu caacaaagga 960
gaggcucuca aucgcgacau uucaugacuc uaaacuagag ucagaaauag gcccaauuuc 1020
gagcuugguc acaccagaga caccugcuuu guucaaaaga gguagguaug aggauauuuu 1080
gaaggaaaau cuuucaagga agcuugaugg aaaaucauuu cucgacuaca ugaggaugug 1140
agaaagugug aacauauauu auacuccaca uuguguuuaa uauaugauga aauaaguugc 1200
uuuugaagua ugaugaaaua aguugguuuu gaagaauuca uauugugcuu aaauuucgug 1260
gaugacugag agauuuauua uguaauaaua auguauuggu uugaagauuc ucgucucacu 1320
auauguaaga cucuguuugg gucaagugau guaaucacgg uugaaauaag uugcuuuuga 1380
agaauucaua uggugcuuaa uauuauguaa uaaauaaugu auuggauuga aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aa 1452

Claims (101)

1.一种增加罂粟植物中蒂巴因积累的方法，该方法包括对所述植物的基因组进行遗传修饰，以包括一种或多种稳定的遗传修饰，从而同时降低所述罂粟植物中蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，T6ODM具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，CODM具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，同时降低T6ODM和CODM的活性的对所述植物的遗传修饰包括引入降低来自编码T6ODM的内源基因的转录物的积累的表达构建体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，降低来自编码T6ODM的内源基因的转录物的积累的所述表达构建体的序列包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，遗传修饰所述植物包括在编码T6ODM的内源基因中引入功能缺失突变。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，同时降低CODM和T6ODM的活性的遗传修饰所述植物包括引入降低来自编码CODM的内源基因的转录物的积累的表达构建体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，降低来自编码CODM的内源基因的转录物的积累的所述表达构建体的序列包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，遗传修饰所述植物包括在编码CODM的内源基因中引入功能缺失突变。
10.一种遗传修饰罂粟植物细胞，其相对于野生型植物细胞具有降低的蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的活性，其特征在于，所述遗传修饰罂粟植物细胞包括降低T6ODM或CODM或两者的表达的一种或多种稳定的遗传修饰。
11.根据权利要求10所述的植物细胞，其包括用于降低T6ODM表达的第一表达构建体和用于降低CODM表达的第二表达构建体。
12.根据权利要求11所述的植物细胞，其特征在于，所述第一表达构建体包含编码第一发夹RNA的第一核酸分子，所述第一发夹RNA用于降低编码T6ODM的内源基因的表达。
13.根据权利要求12所述的植物细胞，其特征在于，所述编码T6ODM的内源基因编码包含SEQ ID NO：15序列的mRNA。
14.根据权利要求12或13所述的植物细胞，其特征在于，所述编码第一发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：2的一部分。
15.根据权利要求11-14中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述第二表达构建体包含编码第二发夹RNA的第二核酸分子，所述第二发夹RNA用于降低编码CODM的内源基因的表达。
16.根据权利要求15所述的植物细胞，其特征在于，所述编码CODM的内源基因编码包含SEQ ID NO：16序列的mRNA。
17.根据权利要求15或16所述的植物细胞，其特征在于，所述编码第二发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：4的一部分。
18.根据权利要求10所述的植物细胞，其包含表达构建体，所述表达构建体包含用于降低T6ODM和CODM的表达的核酸分子。
19.根据权利要求18所述的植物细胞，其特征在于，所述核酸分子编码用于降低编码CODM的内源基因的表达的发夹RNA。
20.根据权利要求18或19所述的植物细胞，其特征在于，所述核酸分子编码用于降低编码T6ODM的内源基因的表达的发夹RNA。
21.根据权利要求18所述的植物细胞，其特征在于，所述核酸分子编码足以降低编码T6ODM和CODM的内源基因的表达的单个发夹RNA。
22.根据权利要求19、20或21所述的植物细胞，其特征在于，所述核酸分子包含SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4或两者的一部分。
23.根据权利要求18所述的植物细胞，其特征在于，所述表达构建体包含编码用于降低编码T6ODM的内源基因的表达的第一发夹RNA的第一核酸分子和编码用于降低编码CODM的内源基因的表达的第二发夹RNA的第二核酸分子。
24.根据权利要求23所述的植物细胞，其特征在于，所述编码T6ODM的内源基因编码包含SEQ ID NO：15序列的mRNA。
25.根据权利要求23或24所述的植物细胞，其特征在于，所述编码T6ODM的内源基因编码具有SEQ ID NO1序列的多肽。
26.根据权利要求23、24或25所述的植物细胞，其特征在于，所述编码CODM的内源基因编码包含SEQ ID NO：16序列的mRNA。
27.根据权利要求23-26中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述编码CODM的内源基因编码具有SEQ ID NO3序列的多肽。
28.根据权利要求23-27中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子均包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或二者的一部分。
29.根据权利要求19-22中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述编码发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
30.根据权利要求19-22中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述编码发夹RNA的核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
31.根据权利要求12-17及23-28中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
32.根据权利要求12-17及23-28中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述第一核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
33.根据权利要求15-17及23-28中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述第二核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
34.根据权利要求15-17及23-28中任意一项所述的植物细胞，其特征在于，所述第二核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
35.根据权利要求10所述的植物细胞，其特征在于，所述植物细胞经遗传修饰具有降低的T6ODM活性，且其中CODM的活性降低是由编码CODM的内源基因的突变引起的，所述编码CODM的内源基因的突变不是通过植物细胞的遗传修饰引入的。
36.根据权利要求35所述的植物细胞，其特征在于，所述编码CODM的内源基因中未通过植物细胞的遗传修饰引入的突变是存在于按照专利保藏号PTA-9109保藏的植物种子中的突变。
37.根据权利要求10所述的植物细胞，其特征在于，植物细胞经遗传修饰以具有降低的CODM活性，且其中T6ODM的活性降低是由编码T6ODM的内源基因的突变引起的，所述编码T6ODM的内源基因的突变不是通过植物细胞的遗传修饰引入的。
38.根据权利要求37所述的植物细胞，其特征在于，所述编码T6ODM的内源基因中未通过植物细胞的遗传修饰引入的突变是存在于按照专利保藏号PTA-9110保藏的植物种子中的突变。
39.一种生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
(a)降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和
(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，
其中，降低编码T6ODM的内源基因的表达包括遗传修饰所述植物以在编码T6ODM的内源基因中具有功能缺失等位基因。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，编码T6ODM的内源基因中所述功能缺失等位基因包含编码T6ODM的基因中的破坏或点突变。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述破坏为缺失或插入。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述插入是T-DNA或转座因子。
43.一种生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
(a)降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和
(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，
其中，降低编码T6ODM的内源基因的表达包括表达与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，其中所述异源核酸分子的表达降低所述编码T6ODM的内源基因的表达。
44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子通过RNA干扰降低所述编码T6ODM的内源基因的表达。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。
46.根据权利要求43或44所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
47.根据权利要求43或44所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
48.根据权利要求39-47中任意一项所述的方法，其特征在于，降低编码CODM的内源基因的表达包括遗传修饰所述植物以在编码CODM的内源基因中具有功能缺失等位基因或表达与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，其中所述与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子降低所述编码CODM的内源基因的表达。
49.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因包含编码T6ODM的基因中的破坏或点突变。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所述破坏是编码CODM的基因中的缺失或插入。
51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述编码CODM的基因中的插入是T-DNA或转座因子。
52.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子通过RNA干扰降低所述编码CODM的内源基因的表达。
53.根据权利要求48或52所述的方法，其特征在于，所述与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。
54.根据权利要求43-47中任意一项所述的方法，其特征在于，降低编码CODM的内源基因的表达包括表达与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，其中与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子降低编码CODM的内源基因的表达，其中与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子和与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子是单个的核酸分子。
55.根据权利要求48、52或53所述的方法，其特征在于，与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
56.根据权利要求48、52或53所述的方法，其特征在于，与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
57.根据权利要求39-56中任意一项所述的方法，其特征在于，所述T6ODM具有与SEQ IDNO：1至少95％同一性的氨基酸序列，且所述CODM具有与SEQ ID NO：3至少95％同一性的氨基酸序列。
58.一种生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
(a)降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和
(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，
其中，降低编码CODM的内源基因的表达包括遗传修饰所述植物以在编码CODM的内源基因中具有功能缺失等位基因。
59.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，所述功能缺失等位基因包括基因的破坏或点突变。
60.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述破坏为缺失或插入。
61.根据权利要求60所述的方法，其特征在于，所述插入是T-DNA或转座因子。
62.一种生产具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
(a)降低植物中编码内源性蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；和
(b)降低植物中编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，
其中，降低编码CODM的内源基因的表达包括表达与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，所述异源核酸分子的表达降低所述编码CODM的内源基因的表达。
63.根据权利要求62所述的方法，其特征在于，所述与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子通过RNA干扰降低所述编码CODM的内源基因的表达。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其特征在于，所述与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。
65.根据权利要求62或63所述的方法，其特征在于，所述与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
66.根据权利要求62或63所述的方法，其特征在于，所述与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
67.根据权利要求58-66中任意一项所述的方法，其特征在于，降低编码T6ODM的内源基因的表达包括遗传修饰所述植物以在编码T6ODM的内源基因中具有功能缺失等位基因，或表达与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子降低所述编码T6ODM的内源基因的表达。
68.根据权利要求67所述的方法，其特征在于，编码T6ODM的内源基因的功能缺失等位基因包括编码T6ODM的基因中的破坏或点突变。
69.根据权利要求68所述的方法，其特征在于，所述破坏是编码T6ODM的基因中的缺失或插入。
70.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述插入是编码T6ODM的基因中的T-DNA或转座因子。
71.根据权利要求67所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子通过RNA干扰降低所述编码T6ODM的内源基因的表达。
72.根据权利要求67或71所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分。
73.根据权利要求62-66中任意一项所述的方法，其特征在于，降低编码T6ODM的内源基因的表达包括表达与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子，其中所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子降低所述编码T6ODM的内源基因的表达，其中所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子及与编码CODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子是单个的核酸分子。
74.根据权利要求67、71或72所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：7的一部分。
75.根据权利要求67、71或72所述的方法，其特征在于，所述与编码T6ODM的内源基因的一部分同源的异源核酸分子包含SEQ ID NO：8的一部分。
76.根据权利要求62-75中任意一项所述的方法，其特征在于，所述T6ODM具有与SEQ IDNO：1至少95％同一性的氨基酸序列。
77.一种遗传修饰的罂粟植物细胞，其具有降低的编码6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达，所述遗传修饰的植物细胞包括：
用于降低植物细胞中编码T6ODM的内源基因的表达的稳定遗传的转基因表达构建体；和
用于降低植物细胞中编码CODM的内源基因的表达的稳定遗传的转基因表达构建体。
78.一种通过权利要求39-76中任意一项所述的方法产生的遗传修饰的植物细胞。
79.一种生产蒂巴因的方法，所述方法包括从权利要求10-38及权利要求78中任意一项所述的植物细胞中收获的乳胶或罂粟草中分离蒂巴因。
80.一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的第一植物；
ii)建立所述第一植物与编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物的杂交；
iii)允许杂交后代自花授粉；和
iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
81.根据权利要求80所述的方法，其特征在于，所述编码T6ODM的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物利用分子方法鉴定。
82.根据权利要求80所述的方法，其特征在于，所述编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因通过第二植物或其亲本的遗传修饰产生。
83.根据权利要求80所述的方法，其特征在于，具有编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因的第二植物是作为ATCC PTA-9110保藏的品系的植物。
84.一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的第一植物；
ii)建立所述第一植物与编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物的杂交；
iii)允许杂交后代自花授粉；和
iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
85.根据权利要求84所述的方法，其特征在于，所述编码CODM的内源基因中具有功能缺失等位基因的第二植物利用分子方法鉴定。
86.根据权利要求84所述的方法，其特征在于，所述编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因通过第二植物或其亲本的遗传修饰产生。
87.根据权利要求84所述的方法，其特征在于，具有编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因的第二植物是作为ATCC PTA-9109保藏的品系的植物。
88.一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；
ii)遗传修饰所述植物以在编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中引入功能缺失等位基因；
iii)允许所述植物自花授粉；和
iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
89.一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；
ii)遗传修饰所述植物以在编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中引入功能缺失等位基因；
iii)允许所述植物自花授粉；和
iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因是纯合的植物。
90.一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
i)利用分子方法鉴定编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；
ii)遗传修饰所述植物以降低编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达；
iii)允许植物自花授粉；和
iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码T6ODM的内源基因中功能缺失等位基因和具有降低的编码CODM的内源基因的表达是纯合的植物。
91.根据权利要求90所述的方法，其特征在于，遗传修饰植物以减少编码CODM的内源基因的表达包括引入表达编码CODM的内源基因的靶向发夹RNA的表达构建体。
92.一种生产相对于野生型罂粟植物具有增加的蒂巴因含量的罂粟植物的方法，该方法包括：
i)利用分子方法鉴定编码可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因中包含功能缺失等位基因的植物；
ii)遗传修饰所述植物以降低编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)的内源基因的表达；
iii)允许所述植物自花授粉；和
iv)从自花授粉植物中筛选后代获得对于编码CODM的内源基因中功能缺失等位基因和具有降低的编码T6ODM的内源基因的表达是纯合的植物。
93.根据权利要求92所述的方法，其特征在于，降低编码T6ODM的内源基因的表达的遗传修饰所述植物包括引入表达编码T6ODM的内源基因的靶向发夹RNA的表达构建体。
94.根据权利要求80-93中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分子方法包括定向诱导基因组局部突变(TILLING)方法。
95.根据权利要求80-94中任意一项所述的方法生产的罂粟植物细胞。
96.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO：7。
97.一种用于同时降低罂粟植物中编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶(CODM)的内源基因的表达的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求96所述的分离的核酸。
98.具有包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一部分的序列的多核苷酸分子用于同时降低罂粟植物中编码蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)和可待因3-O-脱甲基酶的内源基因的表达的用途。
99.包含权利要求10-38、77、78及95中任意一项所述的植物细胞的植物用于产生蒂巴因的用途。
100.从包含权利要求10-38、77、78及95中任意一项所述的植物细胞的植物中获得的罂粟草。
101.从权利要求10至38、77、78和95中任意一项所述的植物细胞中获得的乳胶。
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