CN117511975A - LecRK27基因在提高果实均一性和产量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了LecRK27基因在提高果实均一性和产量中的应用，涉及基因工程技术领域，具体体现为在提高番茄植株果实大小、重量、产量以及果实均一性中的应用。在番茄中过表达LecRLK27基因的具体步骤如下：首先通过构建含LecRLK27基因的植物重组过表达载体，然后将该载体转入番茄后得到较非转基因植株有显著表达的LecRLK27转基因阳性番茄植株。转基因番茄植株明显比野生型植株更加健壮，果实一致性显著增加，单株果实产量显著增加。本发明高效并可稳定遗传地提高了番茄果实的一致性和产量，为番茄果实均一性改良做出了积极的探索，有效解决了传统育种方法周期长且效果不确定的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及到LecRK27基因在提高果实均一性和产量中的应用。
背景技术
番茄富含抗氧化物质、维生素和多种矿物质，具有丰富的营养价值，是世界上种植最广泛的园艺作物之一，也是广受大众所喜爱的重要蔬菜和水果。番茄果实的均一性影响番茄的产量，而产量则是番茄商品价值的关键因素，但传统的育种方法周期长且效果不确定。近年来，随着基因工程的迅速发展和技术的日臻完善，转基因技术在培育优良作物品种方面展示了巨大的潜力。分子标记辅助育种、转基因育种、基因编辑育种等现代分子育种方法的引入为提高番茄的育种效率提供了有效途径。番茄果实的大小和产量均是数量性状遗传，被多个数量性状位点或者基因调控。在目前的研究中，已经鉴定出一些影响番茄果实大小的基因，但影响番茄果实均一性的基因报道较少。本研究通过基因工程的方法，增加了LecRLK27基因在番茄中的表达，获得了基因过表达型的转基因番茄，同时通过基因编辑的方法获得了LecRLK27基因的突变体番茄，过表达型和突变型番茄的果实的均一性发生了显著变化，果实大小、单株果实的数目均发生了显著改变，进而影响了番茄的产量。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了LecRK27基因在提高果实均一性和产量中的应用，利用凝集素类受体样蛋白激酶基因LecRLK27协调番茄果实大小进而影响果实产量，LecRLK27基因过表达番茄植株更高、果实一致性更好，果实产量显著提高，有效解决了产量和果实均一性育种中育种周期长且效果不确定的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提高LecRLK27基因在番茄中的表达量，增强番茄果实大小的均一性，提高番茄的产量。
LecRLK27基因作为正调控基因在如下(1)-(6)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实大小；
(2)提高番茄单果重量；
(3)提高番茄单株果实的数目；
(4)提高番茄单株果实产量；
(5)提高番茄果实大小和重量的均一性；
(6)培育高果实均一性和高产番茄品种。
上述LecRLK27基因的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示，以及除SEQ ID NO.1以外的编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。
上述LecRLK27基因所调控的番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK27作为正调控因子在如下(1)-(6)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实大小；
(2)提高番茄单果重量；
(3)提高番茄单株果实的数目；
(4)提高番茄单株果实产量；
(5)提高番茄果实大小和重量的均一性；
(6)培育高果实均一性和高产番茄品种。
上述番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK27的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
含有LecRLK27基因的重组表达载体、转基因细胞系或者工程菌在如下(1)-(6)项中的应用：
(1)提高番茄果实大小；
(2)提高番茄单果重量；
(3)提高番茄单株果实的数目；
(4)提高番茄单株果实产量；
(5)提高番茄果实大小和重量的均一性；
(6)培育高果实均一性和高产番茄品种。
上述含有LecRLK27基因的重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种利用LecRLK27基因同时提高番茄果实大小均一性和产量的方法，使番茄中LecRLK27基因过量表达。
进一步，使LecRLK27基因过表达的具体步骤包括：外源转入LecRLK27基因；或者上调番茄基因组中原有的LecRLK27基因的表达。
一种利用LecRLK27基因培育高果实大小均一性和高产番茄品种的方法，包括以下步骤：将LecRLK27基因转入番茄野生型植株中，获得LecRLK27基因过量表达且稳定遗传的番茄，即番茄转基因植株。
上述番茄转基因植株与番茄野生型植株相比具有如下(1)-(6)至少一项特点：
(1)转基因番茄果实的大小显著高于野生型番茄；
(2)转基因番茄果实的重量显著高于野生型番茄；
(3)转基因番茄果实的单株果实数目显著高于野生型番茄；
(4)转基因番茄果实的单株果实产量显著高于野生型番茄；
(5)转基因番茄果实大小和重量的均一性显著高于野生型番茄；
(6)转基因番茄果实的均一性和产量同时显著高于野生型番茄；
进一步，上述将LecRLK27基因转入野生型番茄中的方法为聚乙二醇法、农杆菌浸染法或基因枪法。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过在番茄中过表达凝集素类受体蛋白激酶LecRLK27基因，并构建含LecRLK27基因的植物重组表达载体，将该载体转入番茄后所得转基因番茄植株中LecRLK27基因较野生型植株有显著更高的表达。转基因番茄植物相比于野生型番茄果实大小和重量的一致性显著增加，单株果实的数目和单株果实产量显著增加，转基因番茄果实的均一性和产量同时显著增加。
2、与传统育种方法相比，本发明采用基因工程技术，高效并可稳定遗传地提高了番茄果实的一致性和产量，为番茄果实均一性和产量的改良做出了积极的探索，具有良好的市场前景和经济价值。
附图说明
图1为LecRLK27基因过表达株系和突变体株系的相对基因表达量；
图2为LecRLK27基因过表达株系和突变体株系；
图3为过表达转基因株系和突变体株系不正常花序出现的频率；
图4为过表达转基因株系和突变体株系的单株果实产量；
图5为过表达转基因株系和突变体株系的单株果实数目；
图6为过表达转基因株系和突变体株系的果实直径；
图7为过表达转基因番茄和突变体番茄果实；
图8为过表达转基因番茄和突变体番茄果实均一性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行进一步的说明，但并不构成对本发明的限定。
本发明实施例中使用的番茄品种为“Solanum lycopersicum L.cv.Micro Tom”，为实验室留种。8GWN中间载体、K303载体、CRISPR-Cas9VL载体为实验室改造，大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101由本实验室保存；RNA提取试剂盒(Reagent)由索莱宝公司提供；Taq DNA聚合酶由重庆葆光生物科技有限公司提供；cDNA合成试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、限制性内切酶、PrimeSTAR高保真DNA聚合酶均购自TaKaRa公司；同源重组酶(/>IIOne Step Cloning Kit-C112)由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供；Gateway LR Clanase酶购买自赛默飞世尔科技公司；DNA提取和纯化试剂盒(离心柱型)为OMEGA公司产品；其余试剂均为分析纯试剂。
实施例1LecRLK27基因的全长序列克隆
(1)设计引物：根据番茄(Solanum lycopersicum L.)凝集素类受体蛋白激酶LecRLK27(Solyc03g078370.1.1)的cDNA序列为模板，设计引物克隆番茄LecRLK27基因的全长CDS序列，同时根据中间载体8GWN在引物的两端引入同源重组片段，引物分别为RLK27-F和RLK27-R，序列如下：
RLK27-F：5'-atacttccaactagtgcggcc accatgttaacagttagaac-3'(SEQ IDNo.4)；
RLK27-R：5'-atggtcatcccgggacctgcagg actactgggacttggacatg-3'(SEQ IDNo.5)；
(2)PCR反应：使用RNA提取试剂盒(Reagent)提取番茄叶片总RNA，再根据cDNA合成试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)的使用说明合成cDNA，再以cDNA为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物，扩增带有同源片段的LecRLK27基因全长CDS序列。PCR反应体系如表1所示。
表1PCR反应体系
PCR反应程序为：98℃预变性3分钟；然后98℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃后延伸5分钟。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，扩增获得约2400bp的目的条带，然后将扩增产物采用DNA纯化试剂盒进行回收纯化。
(3)制备重组质粒8GWN::35S-LecRLK27-GFP：将纯化的LecRLK27基因全长片段与8GWN载体通过同源重组酶(IIOne Step Cloning Kit-C112)进行连接，获得重组质粒8GWN::35S-LecRLK27-GFP。将上述质粒转化DH5α大肠杆菌后，鉴定阳性克隆，并委托生工生物工程股份有限公司进行测序。结果显示，LecRLK27基因全长为2370bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2构建LecRLK27基因的重组表达载体
使用Gateway重组克隆技术将8GWN::35S-LecRLK27-GFP质粒与K303空质粒进行LR克隆，反应体系如下：
20uL的反应体系中，加入8GWN::35S-LecRLK27-GFP质粒150ng、K303空质粒150ng、5×LR Clonase Reaction Buffer 4uL、LR Clonase enzyme mix 4uL、TE buffer加至20uL，混匀后于25℃保持60min，完成后加入2uL Proteinase K solution于37℃保持10min终止反应。然后取5uL反应产物转化DH5α大肠杆菌后，鉴定阳性克隆，并挑选单菌落扩大培养后提取质粒，委托生工生物工程股份有限公司进行测序，如果序列正确即证明K303::35S-LecRLK27-GFP载体构建成功。
实施例3构建CRISPR-Ca9基因编辑载体
使用CRISPR-P 2.0设计工具(http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/)分析LecRLK27基因的靶向位点并设计sgRNA，并将其与CRISPR-Cas9VL载体连接，然后导入DH5α大肠杆菌中。
sgRNA序列如下：
RLK27-F：5'-tcggcttttatccacaagga-3'(SEQ ID No.6)
RLK27-R：5'-tccttgtggataaaagccga-3'(SEQ ID No.7)。
实施例4将CRISPR-Ca9基因编辑载体和重组质粒载体K303::35S-LecRLK 27-GFP转化番茄子叶
(1)构建重组表达菌株：取5uL实施2和5uL实例3中的质粒转入根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，在含有质量分数为1.5％的琼脂、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基(pH7.2)中涂板，28±1℃黑暗条件下倒置培养2～3天至长出单菌落，挑取3-5个单菌落做菌落PCR。K303::35S-LecRLK 27-GFP载体用K303F、SC14R引物检测，CRISPR-Ca9基因编辑载体用Cas-F和Cas-R引物检测。
K303::35S-LecRLK27-GFP质粒的检测引物序列如下：
K303F：5'-cgtcttgcgcactgatttga-3'(SEQ ID No.8)
SC14R：5'-gcatcacaatcgcagtcctccaa-3'(SEQ ID No.9)
CRISPR-Ca9基因编辑载体检测引物序列如下：
Cas-F：5'-tggaggaggataaaaagcacgag-3'(SEQ ID No.10)
Cas-R：5'-cgataagattaccaaacaggccg-3'(SEQ ID No.11)
反应体系如表2所示。
表2反应体系
反应条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环数为25个，72℃终延伸5min。
选择阳性菌落用含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基(pH7.2)，在28±1℃、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD600为1.8-2.0，然后28±1℃离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有3wt％的蔗糖、pH为5.8的MS培养基100mL重悬，制得农杆菌工程菌液。
(2)转化番茄子叶：用体积分数为75％的酒精浸泡番茄种子1min，无菌水冲洗6次；再用1％(有效氯浓度)的NaClO水溶液浸泡种子10min，无菌水冲洗7次；无菌水浸泡种子4h，播种于MS固体培养基上，光照培养箱27℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)培养直至子叶展平，切取已展平的子叶即得番茄外植体。
将番茄外植体的子叶切下，放置在含有3wt％的蔗糖、0.8wt％的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，25℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)预培养1d后置于农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，再放回上述MS固体培养基中，在28±1℃黑暗条件下共培养48小时，再转入含有3wt％的蔗糖、1wt％的琼脂、1.0mg/L吲哚乙酸、1mg/L玉米素、200mg/L替卡西林钠克拉维酸钾、120mg/L阿莫西林钠克拉维酸钾和100mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1℃、光周期16h/d、光照强度3000～5000lx条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽；将长3～4cm的抗性芽切下，转入含有3wt％的蔗糖、1wt％的琼脂、200mg/L替卡西林钠克拉维酸钾、120mg/L阿莫西林钠克拉维酸钾和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1℃、光周期16h/d、光照强度3000～5000lx条件下培养至生根，即得转基因番茄植株。
实施例5过表达转基因番茄和突变体番茄的筛选
1.过表达转基因番茄阳性植株筛选
提取转基因番茄和野生型番茄的基因组DNA，通过PCR检测LecRLK27基因是否转入番茄植株中。根据载体K303::35S-LecRLK27-GFP中的基因序列，设计如下特异检测引物：
c35SF：5'-atgacgcacaatcccactatccttc-3'(SEQ ID No.12)；
cSC14R：5'-gcatcacaatcgcagtcctccaa-3'(SEQ ID No.9)。
20μL的PCR反应体系为：PCR Mix 10μL、5μM的上、下游引物各1μL、模板1.0μL，加ddH2O至20μL。反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环数为35个，72℃终延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，阳性转基因番茄植株的PCR产物在818bp位置出现目标条带。
2.LecRLK27纯合突变体番茄筛选
分别取突变体番茄植株和野生型番茄植株，提取基因组DNA。先用CRISPR-Ca9基因编辑载体检测载体是否已经转入番茄中，检测引物序列如下：
Cas-F：5'-tggaggaggataaaaagcacgag-3'(SEQ ID No.10)
Cas-R：5'-cgataagattaccaaacaggccg-3'(SEQ ID No.11)
检测方法同实施实例4中CRISPR-Ca9基因编辑载体检测的方法。
再根据LecRLK27基因序列，设计如下番茄突变位点检测引物，检测基因编辑阳性植株番茄LecRLK27基因是否发生突变：
TCRLK27-F：5'-tcaggatgatgacttagtga-3'(SEQ ID No.13)；
TCRLK27-R：5'-atgatttgtggaggagtaac-3'(SEQ ID No.14)。
PCR反应体系为：2x Taq PCR Mix 250uL、10uM引物各5uL、基因组模板10ng，用无菌水调至50uL体积。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环数为35个，72℃终延伸5min，PCR产物片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，出现700bp左右目标条带，然后将PCR产物送测序，检测LecRLK27基因组序列是否发生改变。若发生改变，再重新设计引物扩增突变位点的序列后连接到8GWN载体上进行单克隆测序(方法如实施例1中所述)，再次确认突变发生的类型。再将杂合突变番茄植株经过2代筛选，即可得纯合不含CRISPR-Cas9外源载体的纯合突变体番茄。
3.qPCR检测LecRLK27基因在转基因番茄阳性植株中的表达
根据LecRLK27基因序列和番茄内参基因SlActin序列，设计如下引物：
qRKC27-F：5'-ttggaggactgcgattgtgatgc-3(SEQ ID No.15)；
qRKC27-R：5'-tggtggcttcactgaatccgttgt-3'(SEQ ID No.16)；
qActin-F：5'-tgggtgtgcctttctgaatg-3'(SEQ ID No.17)；
qActin-R：5'-gctaagaacgatggacctaatg-3'(SEQ ID No.18)。
分别取转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株的幼叶，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以qRKC27-F和qRKC27-R，qActin-F和qActin-R为引物进行qPCR，检测LecRLK27基因在转基因番茄阳性植株中的相对表达量，结果如图1所示。
由图1可知，过表达转基因番茄植株(OE-63、OE-71)中LecRLK27基因表达量发生了显著改变。
实施例6突变体和过表达转基因番茄阳性植株的表型分析
将上述筛选出的突变体番茄、转基因番茄阳性植株和野生型番茄植株按常规方法培育，观察分析转基因番茄阳性植株的表型特征，结果如图2-8所示。
由图3可知，过表达转基因番茄(OE-63、OE-71)不正常花序(即第一个或者前两个果实正常膨大，其余果实发育迟缓)出现的概率显著降低，而突变体番茄(RK27-1、RK27-2)不正常花序出现的概率显著增大，表明LecRLK27基因显著影响了番茄果实的一致性。
由图4-8可知，由于果实发育受到影响，过表达转基因番茄(OE-63、OE-71)与野生型番茄的果实大小、单株果实数目和单株果实产量均有显著差别，过表达LecRLK27基因能够显著提高蕃茄果实大小、单株果实数目和单株果实产量。
由以上表型鉴定结果可知，本发明获得的LecRLK27基因过表达转基因番茄果实的均一性和产量均具有显著提升，对番茄生产具有重要的经济价值。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.LecRLK27基因作为正调控基因在如下(1)-(6)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实大小；
(2)提高番茄单果重量；
(3)提高番茄单株果实的数目；
(4)提高番茄单株果实产量；
(5)提高番茄果实大小和重量的均一性；
(6)培育高果实均一性和高产番茄品种。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LecRLK27基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，以及除SEQ ID NO.1以外的编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LecRLK27基因所调控的番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK27作为正调控因子在如下(1)-(6)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实大小；
(2)提高番茄单果重量；
(3)提高番茄单株果实的数目；
(4)提高番茄单株果实产量；
(5)提高番茄果实大小和重量的均一性；
(6)培育高果实均一性和高产番茄品种。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK27的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
5.含有权利要求1所述的LecRLK27基因的重组表达载体、转基因细胞系或者工程菌在如下(1)-(6)项中的应用：
(1)提高番茄果实大小；
(2)提高番茄单果重量；
(3)提高番茄单株果实的数目；
(4)提高番茄单株果实产量；
(5)提高番茄果实大小和重量的均一性；
(6)培育高果实均一性和高产番茄品种。
6.如权利要求5所述的含有LecRLK27基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.一种利用权利要求1所述的LecRLK27基因同时提高番茄果实均一性和产量的方法，其特征在于，使LecRLK27基因在番茄中过量表达。
8.如权利要求7所述的利用LecRLK27基因同时提高番茄果实均一性和产量的方法，其特征在于，所述使LecRLK27基因过表达的具体步骤包括：外源转入番茄LecRLK27基因；或者上调番茄基因组中原有的LecRLK27基因的表达。
9.一种利用权利要求1所述的LecRLK27基因培育高果实均一性和高产番茄品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：将LecRLK27基因转入番茄野生型植株中，获得LecRLK27基因过量表达且稳定遗传的番茄。
10.如权利要求9所述的利用LecRLK27基因培育高果实均一性和高产番茄品种的方法，其特征在于，所述将LecRLK27基因转入野生型番茄中的方法为聚乙二醇法、农杆菌浸染法或基因枪法。
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