CN116004570B - 一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用，所述基因OsCTR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中的OsCTR1基因突变后，在整个水稻生长期内的叶片叶绿素含量明显降低，在苗期，表型更为明显，遗传分析表明该性状为隐性性状，因此能够利用此性状作为指示标记在杂交制种过程中去除假杂种，应用于杂交育种，提高种子纯度。

Description

一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用。

背景技术

水稻作为我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，也是单子叶植物的模式生物。叶片是水稻进行光合作用的主要器官，其性状的优劣直接影响到水稻产量的高低。

光合作用是作物产量形成的物质基础，植物超过90％的干重来自光合产物。叶绿素是植物进行光合作用最主要的色素，起到捕获光能以及传递光能的作用。一般认为，水稻植株中叶绿素的合成相对过多，以建立尽量大尺寸的天线色素，捕获和吸收比光合作用所需更多的光能。叶绿素调控相关的突变体是研究叶绿素生物合成、光合作用机制和叶绿体功能的重要材料。近年来，人们在叶绿素代谢相关的调控机制方面的研究取得了一定进展，但各种突变机制各有不同。因此，深入揭示叶绿素含量调控的分子机理，不仅能提高水稻的生产能力，而且增强对光合作用机理的理解，也有助于作物品种改良。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用，所述基因为OsCTR1基因，OsCTR1基因突变后，在整个水稻生长期内的叶片叶绿素含量明显降低。

本发明提供了一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1，所述基因OsCTR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述基因OsCTR1的同源性序列，包括与SEQ ID NO.1至少具有70％同源性的基因序列，还包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还提供了所述基因OsCTR1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了所述基因OsCTR1编码的蛋白质的同源性序列，包括与SEQ IDNO.2所示序列至少具有60％的同源性的氨基酸序列，还包括在SEQ ID NO.2序列中进行氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还提供了所述基因OsCTR1发生突变获得的突变体ctr1，其特征在于，所述突变体ctr1的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，突变体ctr1编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，所述突变体ctr1的培育过程为：由沈农9816经化学诱变剂诱变后，在大田中进行多代的自交后得到的叶色表型可以稳定遗传的叶绿素含量调控相关的纯合突变体ctr1。

进一步的，所述化学诱变剂为甲基磺酸乙酯。

进一步的，所述的突变体基因ctr1定位于A5和A6之间，物理距离约为53.9kb。

进一步的，所述突变体ctr1是由OsCTR1基因的第4120位碱基由“G”突变为“A”，并导致其编码蛋白的第229位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸获得的本发明还提供了所述基因OsCTR1在调控水稻光合作用中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明利用图位克隆技术在水稻叶色突变体中克隆了调控叶绿素含量的基因OsCTR1，功能互补实验证明OsCTR1是控制水稻叶绿素含量的基因。OsCTR1基因影响水稻叶绿素含量的变化，整个生育期均呈现不同程度浅绿色，光合电子传递效率明显升高，光合气体交换参数升高。

2、本发明的OsCTR1基因突变性状可以作为遗传标记用于生产实践，也可以用于观赏稻遗传育种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中水稻叶片叶绿素含量突变基因OsCTR1的遗传和物理图谱；

其中，A表示初定位区间在第1染色体标记A1和A2间；

B表示将基因精细定位在标记A5与A6间；

C表示所在区域的大小为53.9Kb，共包含7个开放阅读框；

D表示突变体的候选基因的结构及突变位置；

图2为本发明中水稻叶绿素含量突变基因OsCTR1的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定；其中，第一泳道表示DL2000 DNA Marker，第二泳道表示野生型沈农9816的PCR产物，第三表示泳道为突变体OsCTR1的PCR产物；

图3为本发明中水稻叶绿素含量调控相关基因OSCTR1的氨基酸序列结构域分析；

图4为本发明中OsCTR1基因编码蛋白的进化树分析；

图5为本发明中植株表型；其中，WT为野生型沈农9816，ctr1为叶绿素含量相关突变体，ctr1-c1和ctr1-c2为叶绿素含量调控相关突变体转野生型沈农9816基因阳性植株；

其中，图A为野生型沈农9816和突变体ctr1的分蘖期表型；

图B为野生型沈农9816和突变体ctr1的拔节期表型；

图C为野生型沈农9816和突变体ctr1的齐穗期表型；

图D为野生型沈农9816、突变体ctr1和功能互补植株的苗期表型。

图6为本发明中用于基因功能验证的载体图谱。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料沈农9816(WT)和叶绿素含量调控相关突变体(ctr1)均由本实验室培育；高保真酶KOD FX购自TOYOBO公司；Taq DNA聚合酶、RNA提取试剂盒、M-MLV反转录酶、DL2000DNA Marker、限制性内切酶、质粒小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自TAKARA公司；无缝克隆试剂盒购自诺唯赞公司；卡那霉素(kan)、氨苄青霉素(amp)购自中科瑞泰公司；其它化学试剂购自索莱宝公司；引物合成和DNA测序由北京华大基因公司完成；大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌EHA105、pCAMBIA1300s载体均由本实验室保存。

一、水稻叶绿素含量调控相关突变体ctr1的获得和表型观察

本实施例所用的叶绿素含量调控相关突变体ctr1是沈农9816经化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯)诱变获得，具体步骤如下：首先，将干净的沈农9816的种子浸泡于1％浓度的EMS中，12小时后取出种子，并用流水将残留的EMS清洗干净，注意保存清洗液并与EMS废弃液进行无害化处理。之后将诱变种子播种在育秧盘中，待长4.5叶期时移栽至大田，成熟后按单株编号进行收获，M1代根据编号种植成株系。通过表型观察，在M1代发现1个叶色突变的株系，经过4个生长季调查，获得叶色表型可以稳定遗传的叶绿素含量调控相关的纯合突变体ctr1。

如图1所示，在正常的田间条件下，与野生型相比，突变体OsCTR1从苗期开始整个植株呈现出浅绿的叶色表型，分蘖期至抽穗期表型最明显，肉眼观察时差异更显著；到了籽粒的灌浆期，突变体ctr1的植株逐渐开始转绿，但仍比野生型沈农9816的叶色浅。对植株形态和产量性状调查表明，突变体的农艺性状和产量性状与野生型相比均没有显著变化，这说明基因突变影响了叶片中叶绿素的含量，对产量性状没有影响。

二、OsCTR1基因的遗传分析与基因定位

以突变体ctr1为母本，籼稻栽培种kasalath为父本进行杂交，获得的F1代叶片均表现正常的绿色，F2代植株叶色出现正常绿色与浅绿叶性状分离，正常绿色叶片植株645个，浅绿叶植株217个，其比例符合孟德尔分离定律，表明该性状由一对隐形核基因控制。

初步定位：分别取ctr1与kasalath杂交衍生的F2群体中正常表型和突变表型的15个单株并提取DNA，利用课题组的232对标记对野生型和突变体进行多态性筛选，发现位于第1号染色体上的标记A1至A4(引物序列见表1)与OsCTR1基因连锁。用94个F2群体中的突变表型单株检验这四个标记是否与目标性状连锁，发现这四个标记的交换单株分别为28、9、20和38，所以判断调控叶绿素含量表型的基因位于第1号染色体的标记A1和A2之间。具体PCR反应体系和程序见表2和表3。

精细定位：根据日本晴和9311的参考序列开发标记，再扩大群体至217个单株进行精细定位，最后将该基因OsCTR1定位于A5和A6之间(引物序列见表1)，物理距离约为53.9kb。

上述标记的引物如下：

表1A1-A6的引物信息

表2PCR反应体系

表3PCR反应程序

通过对53.9kb区间内的7个开放阅读框(ORFs)测序，发现OsCTR1基因的第4120位碱基由“G”突变为“A”，并导致其编码蛋白的第229位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸。

三、OsCTR1基因的克隆

分别取2g野生型沈农9816和突变体ctr1的幼苗叶片，放入液氮中急速冷冻，并按照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA。然后按照M-MLV反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，利用互补引物对(BF、BR)和KOD FX高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应条件如下：95℃预变性5min；98℃变性30秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共循环35次；最后68℃延伸10分钟。

BF，SEQ ID NO.5：

TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATGTCGCTTGCCGTGGCC

BR，SEQ ID NO.6：

CTCGAGCTTGCATGCCTGCAGTCAAACACTGTGGAACTTGTACTTCT G

将PCR产物用1.0％(g/mL)琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图2所示，野生型沈农9816和突变体ctr1的PCR产物均在约750bp处显示出单一的明亮条带，与GenBank注释的基因大小一致。因此，将野生型沈农9816的PCR产物命名为OSCTR1基因，突变体ctr1的PCR产物命名为OsCTR1突变基因(OSCTR1’)。

利用DNA凝胶回收试剂盒将野生型和突变体的PCR产物进行切胶回收，并利用无缝克隆试剂盒将纯化的OsCTR1基因和OsCTR1突变基因与pCAMBIA1300s进行连接。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，并将菌液送测序公司进行测序，OSCTR1基因和OSCTR1突变基因的开放阅读框均为780bp，与野生型OSCTR1相比，OSCTR1突变基因cDNA的第686位碱基由“G”突变为“A”，并导致其编码蛋白的第229位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸。

四、基因OsCTR1的生物信息学分析

从NCBI查找糜子(Panicum miliaceum)RLN23182.1、谷子(Setaria italica)XP004968049.1、高粱(Sorghum bicolor)XP 002457428.1、玉米(Zea mays)NP 001104963.2、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)XP 010230412.1、山羊草(Aegilops tauschii)XP020146189.1和小麦(Triticum aestivum)CDM80775.1的基因序列，再利用软件MEGA4进行氨基酸序列的比对及进化树分析，经过如图4所示。OSCTR1基因与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)XP010230412.1、山羊草(Aegilops tauschii)XP020146189.1和小麦(Triticum aestivum)CDM80775.1亲缘关系较近。

利用NCBI网站对OSCTR1基因编码蛋白的氨基酸序列进行结构域分析，结果如图3所示，OSCTR1仅包含一个肽基-tRNA水解酶(PTH)结构域，突变位点位于PTH结构域内。

五、OsCTR1基因的功能验证

为了验证突变体ctr1的表型是由于OsCTR1基因的突变引起的，我们将扩增的OsCTR1编码区序列(序列如SEQ ID NO.19所示)插入载体pCAMBIA1300s的PstⅠ和SalⅠ酶切位点之间，获得了重组表达载体pCAMBIA1300s-OsCTR1，其结构如图6所示。将重组载体通过农杆菌EHA105介导的遗传转化导入突变体的愈伤组织中。获得了转基因植株，对植株的表型进行连续观察，发现与野生型沈农9816相比，叶色正常(如图5所示)。因此，可以证明OsCTR1基因就是叶绿素含量的突变体ctr1的调控基因。

叶片叶色是理想的标记性状，本发明水稻叶绿素含量调控相关基因OsCTR1的突变获得的突变体ctr1的千粒重为23.1克，与野生型沈农9816千粒重(22.6克)，没有显著差异，说明本发明水稻叶绿素含量调控相关基因OsCTR1的突变不会对水稻产量造成影响，说明本发明提供的OsCTR1基因是水稻分子育种的重要基因资源。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.一种基因OsCTR1发生突变获得的突变体ctr1，其特征在于，所述突变体ctr1的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，突变体ctr1编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1在调控水稻光合作用中的应用，其特征在于，所述基因OsCTR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。