CN110964730B - 水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用 - Google Patents

水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过图位克隆技术从水稻叶片白化突变体oslcd1中克隆获得基因OsLCD1；并利用基因编辑系统敲除水稻不育系中的OsLCD1基因，获得叶片携带白化性状的不育系；该基因OsLCD1可应用于植物育种领域，对假杂种去除及不育系种子纯度鉴定具有重要意义。

Description

水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程和水稻分子育种技术领域，尤其涉及水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用。
背景技术
叶片是植物进行光合作用最主要的器官，是水稻等主要农作物的重要源器官(Okita等，Increasing rice productivity and yield by manipulation of starchsynthesis.Novartis Found Symp，2001，236:135-146；Julius等，Sugar transporters inplants:new insights and discoveries.Plant Cell Physiol，2017，58:1442-1460)。叶片白化是一类最为常见的植物叶色突变体，其主要原因在于一定条件下叶片内叶绿体往往不能正常发育，叶绿素含量极低甚至没有(Chent等，Physiological character and genemapping in a new green revertible albino mutant rice.J Genet Genomics,2007,34:331-338)。
根据水稻后期叶片白化性状是否转绿，将白化突变体可以分为白化致死突变体和白化转绿突变体。迄今为止，利用自然突变或人工物理化学诱变以及转基因T-DNA插入突变，已获得大量叶片白化突变体，其中已有超过30多白化基因被克隆，如编码三角状五肽重复区蛋白的基因OsPPR1(Gothandam等，OsPPR1,a pentatricopeptide repeat protein ofrice is essential for the chloroplast biogenesis.Plant Mol Biol.2005，58:421-33)和OsPPR6(Tang等，OsPPR6,a pentatricopeptide repeat protein involved inediting and splicing chloroplast RNA,is required for chloroplast biogenesisin rice.Plant Mol Biol.2017，95:345-357)。
叶色突变体及其相关基因的分离克隆，在基础研究方面，将为深入研究高等植物光合作用机制、叶绿体发育、叶绿体结构与功能以及光合色素生物合成与降解等方面分子生理机理奠定基础。在生产应用方面，尤其在标记光温敏两系不育系方面，在杂种鉴定上具有很高的应用价值(Su等，Disruption of a rice pentatricopeptide repeat proteincauses a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhanceseed purity in hybrid rice production.Plant Physiol.2012，159:227-38)。利用水稻叶色，如白色性状标记不育系，一旦不育系自交结实，而不是异交形成杂种，则在后代鉴定中由于叶色的直观、可靠以及简单易行等优点，极易确定真假杂种。
目前，通过突变或杂交转育等方法培育出叶色白化的不育系，如云丰66A(李小林等，水稻苗期白化转绿型叶色标记籼型不育系"云丰66A"的选育.西南农业学报，2011，24：410-413)、NHR111S(吴伟等，携带白化转绿型叶色标记两系杂交水稻不育系NHR111S.核农学报，2006，20：103-105)、白丰A(沈圣泉等，实用转绿型叶色标记不育系白丰A的应用研究.中国水稻科学，2004，18：34-38)、玉兔S(赵海军等，携带白化转绿型叶色标记光温敏核不育系玉兔S的选育及其特征特性.中国水稻科学，2004，18：515-521)、云丰88A(李小林等，水稻叶缘白化叶色标记三系不育系云丰88A的选育.种子，2011,30:109-111)、楠丰8S(卢华金等，幼苗期带白化转绿叶色标记的水稻光温敏核不育系楠丰8S的选育.杂交水稻，2012，27：16-18)等。
但是，具有优异育种价值的水稻叶片白化材料依旧非常匮乏，因此急需利用现代分子育种手段培育新的叶片白化材料。
发明内容
本发明不仅提供了水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的用途，并提供了一种水稻叶片白化性状突变基因oslcd1，该基因能够用于水稻叶色性状的分子育种。
具体技术方案如下：
本发明提供了水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，本发明提供了水稻叶片白化性状基因OsLCD1在参与水稻叶色性状的分子育种中的应用。
进一步地，本发明提供了水稻叶片白化性状基因OsLCD1在杂交水稻F1代杂种纯度鉴定和/或不育系自交种子纯度鉴定中的应用。
水稻叶片白化性状基因OsLCD1是2-酮戊二酸依赖的双加氧酶(2-oxoglutarate-de pendent dioxygenase)野生型基因，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明先通过EMS诱变籼稻恢复系，从后代中筛选出叶片白化突变体oslcd1，再通过精细定位，发现了调控水稻叶片白化性状基因OsLCD1；最后，经遗传互补验证和OsLCD1基因敲除载体的构建，确定OsLCD1基因被编辑、干扰或敲除后获得的突变植株的叶片出现白化性状。所述编辑是指利用基因编辑技术，如CRISRP/Cas9技术在野生型基因的编码核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的等位基因。
本发明还提供了一种水稻叶片白化性状突变基因oslcd1，其基因组序列如SEQ IDNO.2所示。
水稻叶片白化性状突变基因oslcd1是OsLCD1基因的突变基因，即2-酮戊二酸依赖的双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase)基因的突变基因，其基因组序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了所述的水稻叶片白化性状突变基因oslcd1在水稻叶色性状的分子育种中的应用。
本发明还提供了所述的水稻叶片白化性状突变基因oslcd1在杂交水稻F1代杂种纯度鉴定和/或不育系自交种子纯度鉴定中的应用。
本发明还提供了一种杂交育种去除假杂种的方法，包括如下步骤：
(1)构建水稻叶片白化性状基因OsLCD1被编辑、干扰或敲除的突变体植株；水稻叶片白化性状基因OsLCD1的基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)将所述突变体植株与正常叶色的水稻恢复系，杂交制种获得F1杂种；
若F1单株出现白化表型则为不育系自交的假杂种，去除该假杂种。
作为优选，步骤(1)中，创制含有如所述的水稻叶片白化性状突变基因oslcd1的突变体植株。
本发明的杂交育种去除假杂种的方法适用于三系、两系杂交品种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过图位克隆技术从水稻叶片白化突变体oslcd1中克隆获得OsLCD1基因；并利用基因编辑系统敲除水稻两系不育系中的OsLCD1基因，获得携带叶片白化性状的两系不育系；该基因OsLCD1可应用于水稻育种领域，对假杂种去除及不育系种子纯度鉴定具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中不同温度条件下叶片白化突变体oslcd1及其野生型对照的表型和叶绿素含量；
其中，A为20℃条件下的植株表型；B为20℃条件下叶片叶绿素含量；C为28℃条件下的植株表型；D为28℃条件下叶片叶绿素含量。
图2为实施例2中图位克隆OsLCD1基因的结果；
其中，A为OsLCD1基因的紧密连锁分子标记；B为精细定位区间BAC克隆；C为OsLCD1基因的结构；D为OsLCD1基因的突变位点测序分析；E为OsLCD1基因的dCAPS标记分析；F为互补表达载体示意图；G为互补转基因后代的田间表型；H为转基因后代的HPH基因分析；I为转基因后代外源目的基因分析；J为转基因后代的dCAPS分析。
图3为两系白化不育系oslcd1-2的创制；
其中，A为OsLCD1基因突变位点的测序分析；B为两系白化不育系oslcd1-2的田间表型；C为两系白化不育系oslcd1-2的叶绿素含量分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,3rd ED.等文献均有详细的说明。实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。
实施例1突变体的分离与遗传分析
通过EMS诱变籼稻恢复系华占，从后代中筛选出叶片白化突变体oslcd1，经杭州和海南连续多代回交和自交，获得突变性状稳定的株系。
在不同温度(20℃和28℃)条件下种植突变体，结果发现突变体oslcd1对低温敏感，即20℃条件表现出明显的白化性状(图1A)，其总叶绿素含量仅为野生型对照的24.67％(图1B)；而在28℃条件下突变体叶色基本正常(图1C)，且叶绿素含量与野生型对照基本一致(图1D)。
以oslcd1为母本，分别与华占和常规粳稻02428进行杂交获得F1，F1植株表现正常；F1自交获得的F2后代，则出现野生型和突变体表型，其分离比例野生型：突变体＝3：1，从而说明衰老性状受隐性单基因控制。
实施例2叶片白化基因OsLCD1的精细定位
选择分布于水稻12条染色体上的500对SSR标记和50对InDel标记，分析每个标记在突变体oslcd1与02428之间的多态性，获得均匀分布于12条染色体的多态性分子标记。利用BSA法确定与目标基因OsLCD1连锁的分子标记，结果发现水稻第6号染色体短臂上的SSR标记RM19385和RM1163，以及InDel标记R6M14与基因OsLCD1紧密连锁。而后，用这3个分子标记分析oslcd1/02428F2种的50个隐性极端单株的基因型，同时结合每个分子标记在染色体中的位置，确定了3个标记与OsLCD1基因在6号染色体的物理排列，即RM19385-OsLCD1-RM1163-R6M14(图2A)。
为了进一步精细定位OsLCD1基因，于是在RM19385和RM1163之间设计20对SSR标记或InDel标记，其中4对标记在亲本间有多态性，利用这4对标记对F2叶片白化群体进行基因型分析，最终将OsLCD1基因定位在SSR标记RM225与InDel标记R6M37之间，其间物理距离约为600kb，横跨AP002864、AP002071、AP002854、AP002069和AP003019等5个BAC(图2B)。
实施例3白化突变候选基因预测
根据实施例2的定位结果，在线(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/build 5/)分析该区间的基因，结果发现有16个注释基因在叶中有表达。因此，对这16个基因的ORFs进行PCR扩增并测序，结果发现在候选基因LOC_Os06g08060的ORF区域发生了两个碱基(GG突变成TT)的缺失，进而形成一个终止密码子，导致蛋白提前终止(图2C-D)。
为了进一步验证该突变位点是否存在，我们对野生型进行测序，结果不存在该突变位点(图2D)。为了证实该突变位点，进一步设计dCAPS标记(表1)进行验证，结果表明突变位点确实仅在含有突变性状的单株中存在(图2E)。
表1基于SNP位点开发的dCAPS标记
Figure BDA0002311941020000051
实施例4突变体oslcd1的遗传互补验证
基因互补载体的构建：根据GenBank中的OsLCD1基因的全长cDNA(TIGR Lo cus:LOC_Os06g08060)的序列设计一对引物：
上游引物：OsLCD1F：5′-CCGATCGAACAAGTTCCAATG-3′；
下游引物：OsLCD1R：5′-CAGTCCCGGGACTCTTTGCGGTTACCCTTCG-3′(含有SmaI的酶切位点)；
利用RT-PCR技术从华占总RNA中扩增获得OsLCD1基因的cDNA，并电泳纯化获得OsLCD1-cDNA片段；
同时借助高保真酶PrimerSTAR(Takara)，用以下引物：
OsLCD1PF：5′-CAGTCCCGGGCTAATAACTAGATGAAACCCC-3′(含有SmaI的酶切位点)
OsLCD1PR：5′-CATTGGAACTTGTTCGATCGG-3′
PCR反应体系：
Figure BDA0002311941020000052
反应条件参数：98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分30秒，共35个循环。72℃延伸5分钟。
以华占基因组为模板扩增获得OsLCD1基因的启动子，纯化获得OsLCD1-Promoter片段；再利用融合PCR技术，将OsLCD1-cDNA片段与OsLCD1-Promoter片段融合，并利用引物OsLCD1PF和OsLCD1R进行扩展，最终获得含有启动子和cDNA的OsLCD1片段，用SmaI对纯化后的PCR产物进行酶切，连入农杆菌质粒pCAMBI A1300-Nos形成pOsLCD1(图2F)，选择插入正确的质粒进行测序以确定正确的插入片段。
利用农杆菌介导法转化农杆菌EHA105，并用于转化突变体oslcd1。
结果显示，转pOsLCD1的转基因后代叶色恢复正常，未出现白化现象(图2G-J)。
实施例5两系白化不育系创建
步骤1OsLCD1基因敲除载体构建
基于基因组(SEQ ID NO.1)序列，在线(http://crispr.dbcls.jp/)查找特异的靶标序列，选定靶标序列“AGGTCTTGCAGGTACCGGCT，”根据该靶标序列合成互补引物：
上游引物：5’-GGCAGGTCTTGCAGGTACCGGCT-3’；
下游引物：5’-AAACAGCCGGTACCTGCAAGACC-3’；
在PCR仪中将上述引物融合，获得含有靶标序列的融合片段。
用BsaI限制性内切酶酶切载体pHun4c12，凝胶回收获得线性化载体。将上述融合片段连入线性化的pHun4c12(Xu等，2014，Gene targeting using the Agrobacteriumtumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice.Rice 7:5)，酶切鉴定获得正确载体并进一步测序证实靶标序列已导入载体，正确载体命名为pLCD1。同时利用电转化法将pLCD1导入农杆菌菌株EHA105中，用于后续遗传转化。
步骤2两系不育系水稻的遗传转化
水稻遗传转化参考Pan等(2006)的方法并稍作改变。
简述如下：消毒后的两系不育系5S种子接种到含2.5mg L-1 2,4-D的N6培养基，于32℃连续光照条件下诱导愈伤7-10天；取约40μL含有pLCD1质粒的EHA105农杆菌菌液加入含25mg L-1Rif和50mg L-1Kan的20mLLB液体培养基中，28℃过夜震荡培养后离心收集菌体，10mM MgSO4将重悬菌液并离心，去上清后用含200μM AS的AA液体培养基重悬至菌液OD600＝0.1～0.2；将上述愈伤组织于菌液中侵染30min后，将愈伤组织转入灭菌滤纸上吸干多余菌液；将愈伤转入CC-AS培养基上共培养基上，28℃暗培养55～60h后转入含250mg L-1Cef的N6培养基；28℃暗培养7d后将愈伤转至含250mg L-1Cef和50mg L-1Hyg的N6培养基上继续筛选培养并获得抗性愈伤；抗性愈伤经再生培养获得T0转基因幼苗并种植于田间，直至收获T1。
步骤3转基因水稻的分子鉴定及表型鉴定
将T0代转基因水稻生长至3-4叶期选取幼叶，CTAB法提取基因组DNA，利用LCD1特异引物(上游引物：5’-CTTGCCTAGTGCAAGCGTGC-3’；下游引物：5’-GATGAGAAGCTCACCAGGAAG-3’)扩增转基因水稻内源OsLCD1基因，测序验证PCR产物。
结果显示，OsLCD1基因已发生两个碱基缺失，即获得OsLCD1基因功能缺失的转基因纯系，命名为oslcd1-2(图3A)。田间结果表明，该不育系叶片表现为白化(图3B)，其叶绿素总含量仅有对照的31.78％。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2332
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
atggctgacg agccatggag gctgccaaac atagtgcaag aactggccgc cggcgtgcag 60
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gaggctgcca agctgcggtc ggctctgcag aactggggcc tcttcctggt gagcttctca 240
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aaattcaaac tttacgctga actaaacaca gcctaaacct atttttttgt cggagtatat 420
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ggtttagaat attttcataa gattattgta ggaatcgaat ccttagaaat ttttttccct 540
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atcactactg ccagattcaa ctactactct ccttgtccaa gacctgatct tgtgttaggc 1680
ctgaagcctc actctgacct ctgtgctctc accgttcttc tcactgacaa agaagtcggt 1740
ggcctgcaag ttcttagaga tggaacatgg tacagtgttc cagctgtgcg agattactct 1800
cttctgatta acattggtgt tacactggag gtaactatat tacatgagaa attttatgat 1860
cctcggaaaa gtacctcgag attttttttt tacctagaga taccaaattt tatactagaa 1920
ggtataatac atcccggaat ttttttaagg atgataaaat tacccatatt acatacatga 1980
acacctaagc aaaattctca ctttgcattt ttgatgaaaa aaagatgtgt gatgtggtca 2040
aatatgttca tggttaattt gtgtttgccc attgtttttg ttgcagataa tgaccaatgg 2100
gaccttcagg gctccattgc atagggtggt gacaaatgca gagagggaga gaatgtcggt 2160
ggccatgttc tacgctgtgg atggcgagaa ggagatagag ccggtggctg agctgctggg 2220
gctgaagcaa caatcagcac ggtacagggg aatcaagggc aaggacttgt tgattggaca 2280
ctatgaacat ttctctcgtg gtggtagagt tgtcgattca ttgaagatct aa 2332
<210> 2
<211> 2332
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
atggctgacg agccatggag gctgccaaac atagtgcaag aactggccgc cggcgtgcat 60
tagccaccga gccggtacct gcaagacctc gccggcggtg accagctcgc cggcgccgag 120
ataccggagc ccatcccgac catcgatctc ggccggctgt caggatcgga cggtgccgac 180
gaggctgcca agctgcggtc ggctctgcag aactggggcc tcttcctggt gagcttctca 240
tctttcattc taaggctgtg tttagatcca aagtttggat ccaaacttca gtcctttttc 300
atcacatcaa cctgtcatac atacataact tttcagtcat atcatctcta attttaacca 360
aaattcaaac tttacgctga actaaacaca gcctaaacct atttttttgt cggagtatat 420
gatgattttg aactagtgat gggttaaaaa aaacttgcac ttgcacctta gggctcattc 480
ggtttagaat attttcataa gattattgta ggaatcgaat ccttagaaat ttttttccct 540
atattcatct ttcgttttat aggaatggat tctaccatat tcctaaggat tgtagtctta 600
caagttaatt ccatggaatt tttagcatga ggtgagatct cgagaaaaaa ttcctaagga 660
atggagtgca tgtgacatct tattcaaaat cctataaacg gaataagctc ttattctttt 720
tgtgacgagt aattaacagt ctcttccatc ttaatatact ctgtcggctg tttgccgacc 780
cggcgaaaaa aagtaattaa cagtctgtgt gattaggttt ctaaccatgg cgttgagacc 840
tcactgatcg atgctgtgat cgaggctgcg agggaatttt ttcggcagcc agttgaagag 900
aagaagaaac tgagcaacct gattgatggc aagcgttttc agatagaagg gtatggaaat 960
gatcctgtgc aaaccaaaga tcagatcctg gattggtctg atcggctgca tctcaaggtt 1020
gagccagagt gtgacagaaa tctagccttt tggcccacac atcccaaatc ttttaggtaa 1080
atcatctcga gtatttttac ggtgttcttt actaatcgta ttatactagc aagatataaa 1140
ccgttcattt atgagttcta ctaccagtag aaaaaagtaa ttctactacc actaattgat 1200
gtggtagtat atataaataa atatgattta ttgaattgga aaaaaatgaa tattctagat 1260
tggtttcact accagtagag cactgtaaaa caccccaatc atcttacaaa ttcacaatta 1320
tgcatatatg tgctcactga aaaatatttc gctctgttgt caatttgcaa aacataattc 1380
atctacttct gtgcctgctc aagcagaatt tcaggtttca gaaatttcac actcttttca 1440
ctccaaaaag aagttaaaaa agtcggtttc actgaattac ttgagagcta tatttgcagg 1500
gatattctac atgagtacac actgaagatc aagacggtca aaaacgatat cctcctcgca 1560
ttggccaagc tcttggagct tgatgaggat tgcctcctca accagttcag cgacagggcc 1620
atcactactg ccagattcaa ctactactct ccttgtccaa gacctgatct tgtgttaggc 1680
ctgaagcctc actctgacct ctgtgctctc accgttcttc tcactgacaa agaagtcggt 1740
ggcctgcaag ttcttagaga tggaacatgg tacagtgttc cagctgtgcg agattactct 1800
cttctgatta acattggtgt tacactggag gtaactatat tacatgagaa attttatgat 1860
cctcggaaaa gtacctcgag attttttttt tacctagaga taccaaattt tatactagaa 1920
ggtataatac atcccggaat ttttttaagg atgataaaat tacccatatt acatacatga 1980
acacctaagc aaaattctca ctttgcattt ttgatgaaaa aaagatgtgt gatgtggtca 2040
aatatgttca tggttaattt gtgtttgccc attgtttttg ttgcagataa tgaccaatgg 2100
gaccttcagg gctccattgc atagggtggt gacaaatgca gagagggaga gaatgtcggt 2160
ggccatgttc tacgctgtgg atggcgagaa ggagatagag ccggtggctg agctgctggg 2220
gctgaagcaa caatcagcac ggtacagggg aatcaagggc aaggacttgt tgattggaca 2280
ctatgaacat ttctctcgtg gtggtagagt tgtcgattca ttgaagatct aa 2332
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
caagaactgg ccgccggcct g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ccgtccgatc ctgacagccg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ccgatcgaac aagttccaat g 21
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cagtcccggg actctttgcg gttacccttc g 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
cagtcccggg ctaataacta gatgaaaccc c 31
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cattggaact tgttcgatcg g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
aggtcttgca ggtaccggct 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ggcaggtctt gcaggtaccg gct 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
aaacagccgg tacctgcaag acc 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cttgcctagt gcaagcgtgc 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
gatgagaagc tcaccaggaa g 21

Claims (8)

1.水稻叶片白化性状基因OsLCD1在调控水稻叶色性状中的应用，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.水稻叶片白化性状基因OsLCD1在参与水稻叶色性状的分子育种中的应用，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.水稻叶片白化性状基因OsLCD1在杂交水稻F1代杂种纯度鉴定和/或不育系自交种子纯度鉴定中的应用，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种水稻叶片白化性状突变基因oslcd1，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求4所述的水稻叶片白化性状突变基因oslcd1在水稻叶色性状的分子育种中的应用。
6.如权利要求4所述的水稻叶片白化性状突变基因oslcd1在杂交水稻F1代杂种纯度鉴定和/或不育系自交种子纯度鉴定中的应用。
7.一种杂交育种去除假杂种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建水稻叶片白化性状基因OsLCD1被干扰或敲除的突变体植株；水稻叶片白化性状基因OsLCD1的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）将所述突变体不育系与正常叶色的水稻恢复系，杂交制种获得F1杂种；
若F1单株出现白化表型则为不育系自交的假杂种，去除该假杂种。
8.如权利要求7所述的杂交育种去除假杂种的方法，其特征在于，步骤（1）中，创制含有如权利要求4所述的水稻叶片白化性状突变基因oslcd1的突变体不育系。
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