CN103290027B

CN103290027B - 一种调控叶绿体发育蛋白质及其基因和应用

Info

Publication number: CN103290027B
Application number: CN201310151873.8A
Authority: CN
Inventors: 胡培松; 魏祥进; 宋建; 唐绍清; 邵高能; 谢黎虹; 焦桂爱; 圣忠华; 陈代波
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2033-04-27
Also published as: CN103290027A

Abstract

一种调控叶绿体发育蛋白质及其基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明公开了一种编码叶绿体发育蛋白质的基因核苷酸序列及该蛋白的氨基酸序列；提供了含该基因的转基因细胞系和转基因重组均；并提供了该基因的应用。本发明中编码叶绿体发育蛋白质的基因发生突变可导致幼叶低温白化以及幼穗白化，敲除该基因可导致叶绿体发育受阻，苗期即白化致死。将其应用于植物遗传改良等工作，是重要的指示基因，可作为目的基因应用于杂交水稻制种，可以方便检测杂交后代的纯度。应用于常规制种中，由于其纯合致死特点，可以防止后代的非法留种和制种有效保护品种拥有者的知识产权。

Description

一种调控叶绿体发育蛋白质及其基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控叶绿体发育蛋白质及其基因和应用。

背景技术

叶片是植物进行光合作用的主要器官，水稻籽粒中2/3以上的干物质是开花后通过光合作用获得的，光合作用的效率与叶绿体结构和功能是否完整、光合作用复合体的稳定性、叶绿素含量的高低都有着复杂的关系。近年来，叶色的应用价值备受关注，叶色变异可以作为标记性状，在水稻杂交育种和良种繁育发挥重要作用，不但可以用于苗期剔除受外源花粉污染的种子和假杂种，还可以用于测定种子纯度。另外，叶色突变体的研究对有效利用基因工程提高水稻的光合能力，培育高光效水稻，增加水稻产量具有重要的理论意义和应用价值。

目前，利用水稻叶色突变体，已经克隆出多个参与或调控叶绿素代谢和叶绿体发育的基因，通过分析基因功能、表达模式、基因间互作以及核-质信号传导，初步了解了水稻叶色形成及调控机理。目前为止，在拟南芥叶绿素合成过程中的关键酶都已鉴定出来，但在水稻中只有少数基因被鉴定出来，其他基因还有待进一步发现。此外，叶绿素降解的调控机制尚未明朗，核-质互作的机理尚不清晰，有待深入进一步研究。

植物PRP（plastid ribosome protein）基因是一类超级基因家族，其成员编码的蛋白质在叶绿体或线粒体中分别构成核糖体的大小亚基进而构成完整的核糖体行使其翻译功能，与原核生物的核糖体结构和功能都十分相似。目前，叶绿体中的核糖体蛋白都已被鉴定出来，大亚基中含有33种蛋白质，其中有25种是核基因编码，小亚基含有25种蛋白质，13种是核基因编码。但对其功能的研究在水稻中还未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种调控叶绿体发育蛋白质及其基因和应用的技术方案。

所述的一种编码调控叶绿体发育蛋白质的基因，其特征在于是下列核苷酸序列之一：

1）其是SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；

2）其是编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述的一种调控叶绿体发育蛋白质，其特征在于该蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

所述的一种转基因细胞系，其特征在于含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

所述的一种转基因重组菌，其特征在于含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

所述的编码调控叶绿体发育蛋白质的基因在培育叶绿体发育状况变化的转基因植物中的应用。

所述的编码调控叶绿体发育蛋白质的基因在培育苗期叶片白化的转基因植株中的应用。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻苗期温度敏感突变体wlp1的分离和遗传分析

本研究突变体wlp1来源于组织培养后代，田间表型观察发现该突变体的主要特征是：苗期叶色白化，至4叶期叶色转绿，其后恢复正常生长，至抽穗期幼穗表现为白化，生育期、株高与野生型略有差异，其它农艺性状正常（图1）。进一步研究发现，该突变体属于温度敏感突变体，23℃条件下，突变体2，3幼叶表现白化，从第4叶开始恢复正常绿色，而在30℃条件下，突变体与野生型无明显差异（图2）。叶绿素测定结果与表型观察结果一致。利用透射电镜（TEM）观察23℃条件下野生型和wlp1的转绿前叶片叶绿体超微结构，发现野生型的叶绿体含有正常的片层结构，而wlp1含有较少且类似前质体结构的囊泡状叶绿体，对抽穗期的幼穗叶绿体观察发现突变体较野生型的片层堆积较少（图3）。用突变体分别与水稻品种93-11和NanJing 11进行正反交，得到的F₁后代均表现为正常绿化，在其自交F₂群体中正常植株与突变植株分离比接近3：1（表1），表明此性状由一对隐性核基因控制。

表1.突变植株与正常植株在不同F₂群体中的分离

二、图位克隆WLP1基因

1. WLP1基因的分子定位：

为了分离WLP1基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的F2定位群体，由籼稻品种NanJing 11为父本，突变体wlp1为母本，挂牌收获单株鉴定后代基因型，对获得的F2群体中有表型分离的群体选取其中的隐性个体进行基因定位，利用SSR分子标记对WLP1位点进行初步定位，将其初步定位在第1染色体的长臂上，并介于RM1095和RM3285两SSR标记之间。然后通过对RM1095和RM3285两标记之间的BAC序列进行分析，发展了新的Indel标记，将WLP1精确定位于BAC克隆P0481E12的In12和In15之间17kb的范围之内，并且与In13共分离（图4），通过分析此区段开放阅读框（ORF）推测候选基因并基因测序分析，寻找突变位点。

2. WLP1基因的鉴定和功能分析

根据精细定位的结果，在17kb范围内根据RiceGAAS(Rice Automat ed Systrm,http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和TIGR（http://rice.plantbiology.msu.edu/）的预测，发现在此区间内共有3个候选基因，我们设计了各基因的测序引物，采用PCR的方法分别从wlp1突变体和野生型品种基因组中扩增出所有候选基因进行测序分析。发现其中1个基因的DNA片段中，突变体扩增的产物与野生型品种比较发生了单碱基突变，造成氨基酸的突变。野生型品种扩增的基因序列为SEQ ID NO.1,命名为WLP1基因。为了确证突变体表型是由WLP1基因突变引起的，我们对突变体进行了转基因恢复验证和RNAi实验。转基因恢复验证主要是将野生型WLP1基因全长基因组序列克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA2300的多克隆位点构建到BamHI/Sal1位点，得到恢复载体。将构建好的恢复载体通过农杆菌介导的遗传转化系统转化突变体愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。转化了外源WLP1基因的突变体（即转基因阳性株系）幼穗颜色复绿，WLP1表达量明显增高。图5为两个T0转基因恢复株系及对照的表形。转基因恢复试验确证了突变体表型是由WLP1基因突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。RNAi实验主要是将编码区一段约500bp的片段克隆到pCUbi1390-△FAD2载体中，然后遗传转化野生型和日本晴愈伤。结果表明，阳性植株均表现为类似突变体低温下苗期的白化表型，且土壤培养致死。图6为两个T0阳性干扰植株及其对照。

为了观察WLP1蛋白（SEQ ID NO.2）的亚细胞定位功能，将WLP1基因的CDS序列（SEQ ID NO.1）构建到PAN580-GFP 表达载体内，得到融合表达载体，然后用水稻原生质体瞬时表达系统观察WLP1(SEQ ID NO.2的蛋白表达)。首先，提取融合表达载体及无基因融合空载体PAN580-GFP的质粒，用PEG介导法导入水稻原生质体细胞。暗环境下培养16小时后，激光共聚焦显微镜下观察。结果表明，无基因融合的对照载体的绿色荧光均匀地表达于整个水稻原生质体细胞，而融合蛋白则特异性地分布于叶绿体内（图7）。

本发明利用水稻苗期温度敏感突变体，通过图位克隆法克隆到了WLP1基因，该基因编码定位于叶绿体的PRPL13蛋白。通过转基因互补实验鉴定了WLP1基因的功能。因而本发明能调节水稻叶绿体发育获得苗期白化致死表型。为该基因的进一步利用打下基础。

本发明中编码叶绿体发育蛋白质的基因发生突变可导致幼叶低温白化以及幼穗白化，敲除该基因可导致叶绿体发育受阻，苗期即白化致死。将其应用于植物遗传改良等工作，是重要的指示基因，可作为目的基因应用于杂交水稻制种，可以方便检测杂交后代的纯度。应用于常规制种中，由于其纯合致死特点，可以防止后代的非法留种和制种有效保护品种拥有者的知识产权。

附图说明

图1.是粳稻品种Asominori野生型和苗期温度敏感突变体wlp1田间各时期表型；

图2.为野生型和突变体的透射电镜观察图，A为野生型3叶期叶片，B为突变体3叶期叶片，C为野生型幼穗；

图3.是苗期野生型和突变体在各温度下的表型；

图4.为WLP1基因在水稻第1染色体上的精细定位；

图5.是功能互补实验，T0转基因水稻的表型，左图是wlp1突变体对照，右图为wlp1突变体阳性互补植株；

图6.是RNAi干扰实验，T0转基因水稻的表型，左图为野生型对照，右图为阳性干扰植株；

图7.是WLP1:GFP融合蛋白在水稻前质体细胞中瞬时表达结果图，上行为GFP空载体的定位结果，下行为35S::WLP1::GFP融合载体的定位结果，左边为白光图，中间为GFP荧光图，右边为前二者的融合图。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。

实施例1：WLP1基因的克隆

a）水稻材料

水稻（Oryza sativa L）突变体wlp1(white leaf and panicle 1),原始野生型材料为粳稻品种Asominori。

b）电镜观察

利用透射电镜（TEM）观察23℃条件下野生型和wlp1第三片叶的叶绿体超微结构，发现野生型的叶绿体含有正常的片层结构，而wlp1含有较少且类似前质体结构的囊泡状叶绿体，对抽穗期的幼穗叶绿体观察发现突变体较野生型的片层堆积较少（图3）。

c）遗传分析和定位群体

利用正反杂交确定wlp1为隐性突变体，选取突变体和NanJing 11进行杂交，F1代自交，单株收种种植F2群体，从有分离的群体中选出1100个隐性个体（2，3叶白色）作为定位群体。在三叶期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA进行基因定位。

d）WLP1基因的初步定位和精细定位

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA,该DNA抽提的方法为SDS法（Dellaporta SL,Wood J,Hicks JB(1983)A plant DNA minipreparation:version Ⅱ. Plant Mol Biol Rep 1:19-21）。取大约100mg水稻叶片剪碎后放入2ml 离心管，加入钢珠经液氮冷冻后，在磨样机上粉碎，然后提取DNA,获得的DNA沉淀溶解于400μL超纯水中，每一个PCR反应用1μLDNA样品。在WLP1基因的初步定位中，用由30个具有突变表型的F2个体进行SSR分析。首先根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各染色体上的SSR引物进行PCR扩增（反应体系如下）。通过8%的聚丙烯酰胺凝胶（凝胶配置方法如下）电泳分离，通过检测条带的多态性，将基因初步定位到第1染色体的长臂上，并介于RM1095和RM3285两SSR标记之间。

PCR反应体系：

8%聚丙烯酰胺凝胶配方：

聚丙烯酰胺凝胶显色液配方：

注：甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。

然后通过对RM1095和RM3285两标记之间的BAC序列进行分析，发展了新的Indel标记，最后将F2定位群体扩大到1100个进行精细定位，将WLP1精确定位于BAC克隆P0481E12的In12和In15之间17kb的范围之内，并且与In13共分离（图3），通过分析此区段开放阅读框（ORF）推测候选基因并基因测序分析，寻找突变位点。

Indel标记引物序列：

In12-F ：TGCATGGCAAGTCGCTTCG (SEQ ID NO.4)

In12-R：CCCACGCAGCAGAAAGAAAC (SEQ ID NO.5)

In13-F ：GAGTAGATCCCGGAGTGGC (SEQ ID NO.6)

In13-R：TTCTTCAGTTGTTCAGGTGGG (SEQ ID NO.7)

In15-F：GCTCGTGGTGGATGGCAGTG (SEQ ID NO.8)

In15-R：AGATCGGCGGAGGTGGATT (SEQ ID NO.9)

e）基因预测和比较分析

根据精细定位的结果，在17kb范围内根据RiceGAAS(Rice Automat ed Systrm,http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和TIGR（http://rice.plantbiology.msu.edu/）的预测，发现在此区间内共有3个候选基因，我们设计了各基因的测序的扩增引物（P-ORF1，P-ORF2，P-ORF3），

各基因的测序扩增引物序列：

P-ORF1F: AAGCCAGACGGACAAGACT (SEQ ID NO.14)

P-ORF1R: CCTCTTTTCCTTTTGTGGG (SEQ ID NO.15)

P-ORF2F: CCCCACCTGAACAACTGA （SEQ ID NO.16)

P-ORF2R: CAATGGACCAAAGATGAATG（SEQ ID NO.17)

P-ORF3F: AAAACCTCCATTTCCTCC （SEQ ID NO.18)

P-ORF3R: TACATTCACTTGCCTTCC（SEQ ID NO.19)

然后采用PCR的方法分别从wlp1突变体和野生型品种基因组中扩增出所有候选基因进行测序分析。发现其中1个基因的DNA片段中，突变体扩增的产物与野生型品种比较发生了单碱基突变，造成氨基酸的突变。野生型品种扩增的基因序列为SEQ ID NO.1，命名为WLP1基因，其编码的蛋白质测序得到的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2：转基因实验

1）载体构建

设计一对完全覆盖整个WLP1基因ORF的引物，并在引物上分别设计酶切位点BamHI和Sal1位点，PCR扩增野生型基因组DNA，电泳检测切胶回收，回收产物用BamHI和Sal1酶切，连接至同样酶切的pCAMBIA2300 载体上，测序确认没有发生碱基突变，构建后的载体结构图为pCAMBIA-WLP1(图4)，把构建好的载体通过电击的方法转入农杆菌（A grobacterium tumefaciens）菌株中。

扩增ORF序列的引物序列为：

SJg-BamHI:5’-TTTGGATCCCAAGCCAGACGGACAAGAC-3’ (SEQ ID NO.10)

SJg-SalI: 5’-TTTGTCGACTGAGATTGTTGTGTCTTTCTTAGTC-3’ (SEQ ID NO.11)

2）遗传转化：

（1）转化受体的选择

将wlp1种子成熟胚诱导愈伤组织，经过诱导培养基诱导2周后将胚芽剪下，继续培养1周，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。

（2）遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T(1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA The Plant Journal 6:271-282 ), 将pCAMBIA2300空载体和pCAMBIA2300-WLP1载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有120mg/L G418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有120mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现转空载体的转基因植株表型与wlp1相比不发生变化，即2，3叶期及幼穗表现白化，而pCAMBIA2300-WLP1载体的阳性转基因植株与野生型表现一致，即恢复了wlp1的突变表型，见图6。

实施例3：WLP1（SEQ ID NO.2）的叶绿体亚细胞定位实验

根据WLP1的全长CDS序列（SEQ ID NO.3）设计含BamHI的酶切识别位点，设计重组引物，其序列为：

SJGFP-F：CGGTCCCGGGGGATCCATGGCTACGGCCATCGC (SEQ ID NO.12)

SJGFP-R：TGCTCACCATGGATCCCTTCTCAGACTTCTGTATTCTTTTA (SEQ ID NO.13)

以野生型cDNA为模板，用PrimeSTAR高保真酶扩增出WLP1基因的CDS序列（SEQ ID NO.3）, 扩增产物经测序验证序列正确后，与PAN580-GFP载体连接，得到融合表达载体35S::WLP1:GFP。提取构建好融合表达载体35S::WLP1:GFP的质粒及无基因融合的35S::GFP对照质粒，利用PEG介导法导入水稻原生质体细胞。导入后的水稻原生质体细胞至于高渗培养基中暗培养16小时，然后置于荧光显微镜观察，WLP1:GFP融合蛋白定位在叶绿体内，而空载体GFP在整个细胞表达（图4）。该结果证明了WLP1(SEQ ID NO.2)的功能，它是一个叶绿体定位蛋白。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种调控叶绿体发育蛋白质及其基因和应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2402

<212> DNA

<213> （水稻） Oryza sativa

<400> 1

atccccttct tatccgctct gctctctcca cctcgcctcc ccgaaacgaa atggcagtgg 60

cgttccactg aaccaggcca agccagacgg acaagacttc gccgcagccg cgtcctcctc 120

accgcgccgc cgtcgcaatg gctacggcca tcgcagcctc cgcgttcctc tcctccgcct 180

tcgccaggga caggccgctc ccccgccagc ggcgcgcggc gaggcccgcg acccgccgcg 240

ccgccgcggg gggcctgtcg gtgcggtgcg agcagagcga gaagcagaag aggcagccgc 300

tctccgcgct cgtcccccgc gagcagcgat tcatgttcga aggcgacgag ctctgcggcc 360

ccgtactaac cctcacctct ctttctctct cccgtataca ttcttctctt tctcagttca 420

gaaaatgaat agtaatgcta cattccttgg ataaagggaa attttaccgt gatttaggat 480

tgccgcttat ttaggaaagc tcaagattag tcccattcat ttctaaatcc gtaagtcact 540

tcatcttgct ctattgggtc aaatcctttc tttacatgaa taatgttagg gaaaatacac 600

aatgttttta catgttacta taccgtatag accaccatct tattttattt aaagttatct 660

agttgtaatt tattacgaaa gaggattcca taaaatgaac tgaaaataac atggagggaa 720

cgttggtctt tctgaattgg tcgctaacat tgtgttgtat tactcaacag tgttcgcacc 780

tacatgacta ccatatcttt ttatctgtgg atgtttaggt ttgtgaagtt agaattcagt 840

acggatacca ttcttgtgtt ctttctctct tttctgtgca acctgttctg tgtagtgatc 900

ggaccaagga atttaatttg caggacatat ggaacacaac atggtaccct aaggctgcag 960

atcatgtaac tactgagaag acatggtatg ttgttgatgc aacagacaag attctaggta 1020

ggcttgcatc caccattgca gtacacatca gaggaaagaa tgaggccaca tacactccaa 1080

gtgtggacat gggggctttt gttgttgtgg tatgtatgtt tcttgaaatt aatttataaa 1140

gttaaatagt gcacacaata agatcctctg tagtcccaca aaaggaaaag aggtttagca 1200

gcacatacaa ataagcacca aaaggtatct ggaagctgag gtccacctga aggcattttg 1260

aagctgattt catgtatata tatttatgtt actgtgtgct tttaatacta atgcatctct 1320

gaagagtaat tgctacgcat atactattgt aagttcctga actaccatgc tgaactctat 1380

gttcacatag gttaatgcag agaaggttgc tgtttctggc aaaaagcggt cacagaagct 1440

ctacaggagg cactctggac ggcctggtgg aatgaaagaa gaaacttttg atcagcttca 1500

gaaaaggatt ccggagagaa ttattgaaca tgcagtgcgt ggcatgcttc ctaagggcag 1560

agtaagacat catctcttag agctcttatc tagtcagttt catcaagtct ttttgacctt 1620

aagtcagcct acctgggtat acatatgctc ttatccttat ttttggtcaa tttctaatac 1680

atatctgaaa atgggtatcc tcgttctgtt ccattatact tcattattgt gtataattcc 1740

ccaactttat ataccctgtt catggaaata ttcgctctaa ttgaatgccg aaacggcgtg 1800

ggctaacgaa gtactagatg tattctccca aaactcctat gttgcctgta agacatctta 1860

tgattgccta aagcctttta cttatgccta agttcattta taaaaaaaaa aaacgtttac 1920

tatgtcaacc tctcaagttc tcatatgtta gtgacactga cacatgtaat ccgaccaact 1980

acagcggttg tacgtgctct atgtagcctt ctcaacattt tgaacatttt gcagctggga 2040

agaagactgt ttacccacct caaggtgtac aagggagcag aacatcccca tgaggctcaa 2100

aaacctgttc cactgcctat caaggataaa agaatacaga agtctgagaa gtagataatt 2160

cctgtggaga ctaagaaaga cacaacaatc tcacgtaaat tcctcccctc gagattttgt 2220

ccaatctttg gaatgtgatg catctgtctg tttggggaat ggagtgtaaa attttttgta 2280

atttacttcc tccaaaagtt tgtgtttcta agtcatagtt cttgttgatt acatatcatg 2340

tacctaatac cgtacgattt taagcaatcc gatatttcca tatccaattg agtagtgcaa 2400

tt 2402

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> （水稻）Oryza sativa

<400> 2

Met Ala Thr Ala Ile Ala Ala Ser Ala Phe Leu Ser Ser Ala Phe Ala

1 5 10 15

Arg Asp Arg Pro Leu Pro Arg Gln Arg Arg Ala Ala Arg Pro Ala Thr

20 25 30

Arg Arg Ala Ala Ala Gly Gly Leu Ser Val Arg Cys Glu Gln Ser Glu

35 40 45

Lys Gln Lys Arg Gln Pro Leu Ser Ala Leu Val Pro Arg Glu Gln Arg

50 55 60

Phe Met Phe Glu Gly Asp Glu Leu Cys Gly Pro Asp Ile Trp Asn Thr

65 70 75 80

Thr Trp Tyr Pro Lys Ala Ala Asp His Val Thr Thr Glu Lys Thr Trp

85 90 95

Tyr Val Val Asp Ala Thr Asp Lys Ile Leu Gly Arg Leu Ala Ser Thr

100 105 110

Ile Ala Val His Ile Arg Gly Lys Asn Glu Ala Thr Tyr Thr Pro Ser

115 120 125

Val Asp Met Gly Ala Phe Val Val Val Val Asn Ala Glu Lys Val Ala

130 135 140

Val Ser Gly Lys Lys Arg Ser Gln Lys Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly

145 150 155 160

Arg Pro Gly Gly Met Lys Glu Glu Thr Phe Asp Gln Leu Gln Lys Arg

165 170 175

Ile Pro Glu Arg Ile Ile Glu His Ala Val Arg Gly Met Leu Pro Lys

180 185 190

Gly Arg Leu Gly Arg Arg Leu Phe Thr His Leu Lys Val Tyr Lys Gly

195 200 205

Ala Glu His Pro His Glu Ala Gln Lys Pro Val Pro Leu Pro Ile Lys

210 215 220

Asp Lys Arg Ile Gln Lys Ser Glu Lys

225 230

<210> 3

<211> 702

<212> DNA

<213> （水稻）Oryza sativa

<400> 3

atggctacgg ccatcgcagc ctccgcgttc ctctcctccg ccttcgccag ggacaggccg 60

ctcccccgcc agcggcgcgc ggcgaggccc gcgacccgcc gcgccgccgc ggggggcctg 120

tcggtgcggt gcgagcagag cgagaagcag aagaggcagc cgctctccgc gctcgtcccc 180

cgcgagcagc gattcatgtt cgaaggcgac gagctctgcg gccccgacat atggaacaca 240

acatggtacc ctaaggctgc agatcatgta actactgaga agacatggta tgttgttgat 300

gcaacagaca agattctagg taggcttgca tccaccattg cagtacacat cagaggaaag 360

aatgaggcca catacactcc aagtgtggac atgggggctt ttgttgttgt ggttaatgca 420

gagaaggttg ctgtttctgg caaaaagcgg tcacagaagc tctacaggag gcactctgga 480

cggcctggtg gaatgaaaga agaaactttt gatcagcttc agaaaaggat tccggagaga 540

attattgaac atgcagtgcg tggcatgctt cctaagggca gactgggaag aagactgttt 600

acccacctca aggtgtacaa gggagcagaa catccccatg aggctcaaaa acctgttcca 660

ctgcctatca aggataaaag aatacagaag tctgagaagt ag 702

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcatggcaa gtcgcttcg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccacgcagc agaaagaaac 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagtagatcc cggagtggc 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttcttcagtt gttcaggtgg g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctcgtggtg gatggcagtg 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agatcggcgg aggtggatt 19

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttggatccc aagccagacg gacaagac 28

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttgtcgact gagattgttg tgtctttctt agtc 34

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cggtcccggg ggatccatgg ctacggccat cgc 33

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgctcaccat ggatcccttc tcagacttct gtattctttt a 41

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aagccagacg gacaagac 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctcttttcc ttttgtggg 19

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccccacctga acaactga 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caatggacca aagatgaatg 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaaacctcca tttcctcc 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tacattcact tgccttcc 18

Claims

1.编码调控叶绿体发育蛋白质的基因在培育叶绿体发育状况变化的转基因植物中的应用，所述的编码调控叶绿体发育蛋白质的基因是SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

2.编码调控叶绿体发育蛋白质的基因在培育苗期叶片白化的转基因植株中的应用，所述的编码调控叶绿体发育蛋白质的基因是SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

3.编码调控叶绿体发育蛋白质的基因在编码调控叶绿体发育蛋白质中的应用，所述的编码调控叶绿体发育蛋白质的基因是SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。