CN105925587B

CN105925587B - 一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN105925587B
Application number: CN201610409565.4A
Authority: CN
Inventors: 吴兰兰; 吴军; 刘艳霞; 林冬枝; 董彦君
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2036-06-13
Also published as: CN105925587A

Abstract

本发明公开了一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和应用，该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。以dCAPs特异性引物(SEQ ID No.5)(SEQ ID No.6)对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后，经MboⅡ酶切进行鉴定，能快速检测到含有该基因水稻的植株，其检测准确性高，操作简单。携带该基因的水稻在低温条件下早期水稻植株黄化，高温条件下恢复正常绿色。通过本发明得到的低温响应水稻温敏感叶色突变体在研究植物的叶绿体发育、叶绿素的生物合成以及其温度响应等分子机制具有重要意义，同时也可以作为标记性状提高杂交水稻的种子纯度，可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度。

Description

一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及农业和植物生物技术等领域，特别是在分子水平上进行水稻遗传育种以及生理、基因功能等基础研究。

背景技术

叶片是植物进行光合作用的主要器官，类型丰富且易于鉴别，叶色变异是辨别植物突变最直观的性状之一。叶绿体是植物进行光合作用的场所，而叶绿体的发育受到一系列的核质互作基因的控制。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受阻，进而使植物叶色发生异常，使光合作用效率下降，甚至植株死亡。目前，人们利用物理、化学、生物等诱变已得到水稻叶色突变体，将其应用于水稻的遗传育种、生理及其相关基因的克隆和功能研究。本研究利用经物理诱变得到的低温条件下水稻早期苗色突变体并通过图位克隆技术定位到一个受低温响应叶绿体发育的基因，至今尚未有与此水稻基因相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因、该基因编码的蛋白质及这个基因的检测方法和应用。

携带该基因的水稻在低温条件下早期水稻植株黄化，高温恢复绿色。

这种低温响应早期水稻叶绿体发育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

该基因序列所编码的蛋白质，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。优选的，该氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一对用于检测受低温响应水稻叶绿体发育基因的特异性dCAPs PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列：

上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3'

下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3'

即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列。

检测这种控制早期受低温响应水稻叶绿体发育基因的方法为，采用上述特异性dCAPs PCR引物对水稻植株所提取的DNA进行PCR扩增反应，由普通水稻（如嘉花1号）DNA扩增所得到的125bp片段，如SEQ ID No.3所示，能被MboⅡ酶切成33bp和92bp的两个特异性片段，而由携带该低温响应的叶绿体发育基因的水稻的DNA扩增得到的124bp长度，如SEQ IDNo.4所示序列，不被MboⅡ酶切断，根据DNA能否被MboⅡ酶切可快速检测到是否含有此基因的水稻品种。

水稻低温度响应叶色突变体材料是由粳稻“嘉花1号”经⁶⁰Coγ射线辐照而来，经海南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。发明人在研究中将此突变品系与籼稻“广占63S”配制杂交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将控制叶绿体发育的基因定位在水稻的第10号染色体。

本发明控制低温响应叶绿体发育的基因本研究首先利用RNA干扰(RNAi)法验证水稻叶绿体发育相关基因的功能，通过构建pTCK303二元载体，转入农杆菌，再侵染野生型水稻嘉花1号的愈伤经分化获得突变体基因的RNAi苗，来验证基因功能，其RNAi植株叶色变黄（如图4），同样，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术也验证了普通水稻（野生型）中的该等位基因的被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻，使植株黄化。

本发明得到的控制低温响应早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水稻制种，该基因导入杂交水稻不育系可提高不育系自身以及由它配制杂交水稻的纯度。

附图说明

图1 为20℃条件下含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻与野生型水稻对照图，其中左侧为含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻，右侧为野生型水稻。

图2 为32℃条件下含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻与野生型水稻对照图，其中左侧为含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻，右侧为野生型水稻。

图3为本发明对PCR扩增产物进行MboⅡ酶切检测结果。T1代表野生型水稻酶切检测结果;T2代表含有低温响应叶绿体发育的基因酶切检测结果。

图4为野生型、RNAi的T1代苗与苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻对比图，其中左侧为野生型水稻、中间为RNAi的T1代苗期水稻，右侧为苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻。

图5为野生型与CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除的苗对比图，其中左侧为野生型水稻，右侧为CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除的苗期水稻。

具体实施方式：

实施例1：水稻DNA提取（CTAB法提取模板DNA）

1．取1.0g水稻叶片，然后加液态N₂研磨成粉末状，迅速转移到2.0 ml Eppendorf管中，再加入600 μl已预热的2×CTAB缓冲液(60℃)，混合均匀；

2．将步骤1得到的溶液放置60℃水浴40分钟，每隔10min轻轻震荡4~6次，冷却至室温后，12000 r/min离心5min；

3．小心吸取上清液600ul倒入新的2.0 ml Eppendorf管，再加入相同体积的异戊醇：氯仿(1:24)溶液，充分混匀，12000 r/min离心5min；

4．小心吸取上清加入1.5 ml Eppendorf管，加入三分之二体积的异戊醇混匀，12000 r/min离心5min；

5．弃上清，加入70%乙醇清洗DNA约1-2次，12000 r/min离心5min；

6．弃上清，室温晾干或者40℃恒温箱烘干，加ddH₂O溶解，4℃保存备用。

实施例2：PCR扩增和基因检测

总体积为50ul的PCR反应体系：

再使用Eppendorf PCR扩增仪进行扩增。PCR反应程序：

实施例3：检测获得低温响应早期水稻叶绿体发育的基因

1、 25 μL PCR反应体系如下：100mM Tris-HCl pH9.0；100mM KCl; 20mM MgSO₄；80mM (NH₄)₂SO₄；2.5 mM dNTP; 10μM 引物，5U/μl Taq酶，1μl模板DNA/10μl。

引物序列为：

上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3'

下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3'

2、酶切反应体系：22.5μl无菌水；20μl的PCR产物；5μl的10×MboⅡbuffer；2.5μl的MboⅡ酶。

3、将酶切反应体系混匀后，放入37℃恒温水浴中，温浴3小时，每管加入3μl的10×Loading buffer终止酶切反应。将酶切产物上样与1%琼脂糖凝胶上并进行电泳，最后经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，结果如图3。

实施例4：基因功能验证

水稻低温响应叶色突变体材料tcd10来源于粳稻嘉花1号经 ⁶⁰Coγ射线诱变产生。经测序发现，突变型基因（TCD10）（SEQ No. 1）中的碱基A缺失，RNA表达水平降低，tcd10突变体在低温条件下早期植株黄化。另外，RNAi技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术实验结果，都表明普通水稻中的该等位基因（TCD10）的突变体后代都能使水稻叶色呈低温条件下黄化表型。

1、利用SSR和InDel分子标记进行突变基因的定位，通过测序和利用实时荧光定量PCR技术(Real Time qPCR)对叶绿体发育、叶绿素合成以及光合作用相关基因进行RNA水平的表达量的分析，其RNA水平的表达量下降，这说明该基因影响低温条件下质体早期发育相关基因的表达，导致质体发育受阻，进而影响了叶绿体发育和光合色素的累积。

2、本发明主要利用RNA干扰(RNAi)法验证一个水稻叶绿体发育相关基因的功能，通过构建pTCK303二元载体，转入农杆菌，再侵染野生型水稻嘉花1号的愈伤经分化获得突变体基因的RNAi苗，来验证基因功能。

3、本发明利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术即由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术对普通水稻中的该等位基因进行了敲除，得到了T1代低温白化植株（如图5），也证实普通水稻（野生型）中的该等位基因（TCD10）的被破坏即可导致低温条件早期水稻叶绿体发育受阻，使植株黄化。

5、携带该基因的水稻在低温条件下苗期叶色呈黄化表型，高温下又恢复正常，因此可以通过此表型变化来鉴别水稻品种真伪，提高纯度。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 上海师范大学

<120> 一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和应用

<130> none

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3789

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

1 AAAAAAAATA TCTCCCGTCT CCACTCCACT CCTTGCGCCA TCTCGCGGCT GAACAGGGGA

61 GTGGAGGGGA GGGCCGCCTA TCTCCATCTG GCGAGCAGAG CAAGAGCAAG GGAGGGGATC

121 CTGGTGTGGT GAGCATCCAC ATCCTCTTCC TGATTCATCT CTCTCTCTCC CACCGGGACT

181 ACTTTTGCCT GGAATTTGCT TTGCTTTCGT TAAGCTCCTC TCTTAATTTC CGATACTTAA

241 CCTTAATACA AGTAGTAACA GTTTGTTTGT TCGTCTCAAG TTGGATTCTC GCTGATGTTT

301 CTTGAAATTC TCTCAGTTTC TTGGTGCTTC TTGGGAATTT TTCAGGTGTT GTTGTTGTCG

361 TTGTTGCTCG CCGGATGTTG GAGGTCTGCT GCTGCTCCGG CGTCCTCGGC GGGTCGCCGC

421 CGTCGTCGAG GACTGCGGGG GTTTCCTCAC CTGGACTATC GCCGTCTCGG CCCAGTAAGC

481 GGCGAATCGG CCGCGCCCGG GTGCAGCCGC GCGCGCCGCC GCCGTGCGAC GAGCGGAGGG

541 CGGCGGAGGA CGTCATCCAC GCGCTCAGGT CGGCGGATGG CCCCGCCGAG GCGCTTGAGC

601 GGTTCAGGTC GGCGGCGCGG AAGCCCAGGG TGGCCCACAC GACCGCGTCG TGCAACTACA

661 TGCTCGAGCT CATGCGCGGC CATGGCCGGG TCGGGGACAT GGCCGAGGTG TTCGACGTAA

721 TGCAGAGGCA GATCGTCAAG GCGAACGTGG GCACGTTCGC GGCGATCTTC GGAGGGCTTG

781 GTGTGGAGGG GGGACTCCGG AGCGCGCCGG TGGCGCTGCC GGTCATGAAG GAGGCCGGGA

841 TTGTCTTGAA CGCGTACACG TATAATGGCC TGGTTTATTT CCTTGTGAAG TCCGGGTTTG

901 ATAGGGAGGC GTTGGAGGTT TATAGGGTGA TGATGGTGGA TGGTGTTGTG CCTAGTGTGA

961 GAACCTACTC TGTGCTGATG GTGGCGTTCG GGAAGAGGAG GGATGTCGAG ACGGTTCTTT

1021 GGTTGTTGCG TGAAATGGAG GCTCATGGCG TGAAGCCGAA TGTGTATAGC TACACCATCT

1081 GTATTCGAGT TCTTGGACAA GCCAAAAGAT TCGATGAAGC TTATCGGATA CTTGCGAAAT

1141 GGAGAATGAA GGGTGTAAGC CGGATGTCAT TACCCATACC GTGCTTATAC AGGTTCTTTG

1201 CGATGCTGGC CGTATCAGTG ATGCCAAGGA TGTTTTTTGG AAGATGAAGA AGAGTGATCA

1261 AAAACCTGAT CGAGTGACCT ACATTACTCT GTTAGATAAG TTTGGTGACA ATGGTGACTC

1321 GCAATCAGTG ATGGAAATCT GGAATGCAAT GAAAGCTGAT GGGTACAATG ACAATGTTGT

1381 TGCTTATACA GCAGTTATTG ATGCATTGTG CCAAGTTGGG AGGGTCTTTG AAGCTTTGGA

1441 AATGTTTGAT GAGATGAAAC AAAAGGGTAT AGTGCCTGAG CAGTATTCAT ACAACTCGCT

1501 GATATCGGGG TTTCTTAAAG CTGATAGATT TGGTGATGCC TTAGAGCTGT TTAAACATAT

1561 GGATATTCAT GGACCTAAAC CAAATGGTTA CACACATGTT CTTTTCATAA ATTACTATGG

1621 AAAATCTGGT GAATCTATAA AGGCAATACA GAGATATGAA CTAATGAAGA GCAAAGGGAT

1681 TGTGCCAGAT GTTGTTGCTG GTAATGCTGT TTTGTTTGGT CTTGCCAAAT CTGGTAGACT

1741 TGGCATGGCA AAAAGGGTAT TTCATGAATT AAAAGCTATG GGGGTTTCTC CGGATACTAT

1801 CACCTACACT ATGATGATCA AGTGTTGCAG CAAGGCATCA AAATTTGATG AAGCTGTGAA

1861 GATTTTCTAT GATATGATTG AAAATAATTG TGTTCCTGAT GTTCTTGCCG TGAATTCTTT

1921 GATTGATACA CTCTACAAGG CAGGCAGGGG TGATGAAGCC TGGCGGATCT TTTATCAACT

1981 AAAAGAAATG AATCTAGAGC CAACAGATGG GACTTACAAT ACACTTTTGG CAGGATTGGG

2041 AAGGGAAGGT AAAGTCAAGG AGGTAATGCA TCTGCTTGAA GAAATGTACC ACAGTAATTA

2101 TCCTCCTAAT TTGATAACAT ACAATACGAT TCTTGACTGT CTCTGCAAGA ACGGGGCAGT

2161 TAATGATGCA CTTGATATGC TATACAGTAT GACTACGAAA GGATGCATAC CTGATCTTTC

2221 GTCTTACAAC ACTGTTATAT ATGGCCTTGT TAAAGAAGAA AGATATAATG AGGCATTCAG

2281 TATTTTTTGT CAGATGAAGA AGGTTCTTAT TCCAGATTAT GCAACACTGT GTACTATCCT

2341 CCCAAGTTTT GTGAAAATTG GACTGATGAA GGAAGCTCTG CATATTATCA AGGACTACTT

2401 CCTCCAACCT GGCTCCAAAA CAGATAGGTC TTCATGCCAT TCACTAATGG AAGGGATACT

2461 GAAGAAGGCT GGCATCGAAA AGTCAATTGA GTTTGCTGAA ATCATAGCAT CAAGTGGTAT

2521 TACCTTGGAT GATTTCTTTT TGTGCCCATT AATTAAGCAT CTCTGTAAGC AGAAGAAAGC

2581 TCTTGAAGCA CATGAACTTG TCAAAAAGTT CAAGAGCTTT GGAGTTTCAC TAAAAACTGG

2641 ATTATATAAT TCTTTGATTT GTGGGCTTGT TGATGAAAAC CTAATAGATA TTGCTGAAGG

2701 CTTGTTTGCT GAAATGAAGG AACTCGGTTG TGGTCCAGAT GAGTTTACTT ACAACTTACT

2761 TCTTGATGCC ATGGGAAAGT CAATGCGGAT AGAGGAAATG CTAAAAGTTC AAGAAGAGAT

2821 GCATCGCAAG GGATATGAAT CAACTTATGT TACTTATAAC ACAATCATTT CAGGTCTTGT

2881 AAAGTCAAGA AGGTTGGAGC AGGCTATTGA TTTGTACTAC AACCTGATGA GCCAAGGTTT

2941 CTCACCCACA CCATGCACAT ATGGCCCTCT TCTTGATGGT CTGTTAAAAG CTGGAAGGAT

3001 AGAAGATGCA GAAAATCTTT TCAATGAGAT GCTGGAGTAT GGATGCAAGG CCAATTGCAC

3061 TATCTACAAT ATACTACTGA ATGGACATCG AATAGCTGGT AATACAGAGA AGGTCTGTCA

3121 TTTGTTTCAG GATATGGTTG ACCAGGGAAT AAACCCAGAT ATAAAATCCT ACACGATTAT

3181 TATTGACACA CTCTGCAAGG CAGGACAGTT AAATGATGGT CTAACATATT TTAGGCAATT

3241 ATTAGAAATG GGTCTTGAAC CTGATCTAAT TACTTACAAT TTGCTCATTG ATGGTCTTGG

3301 AAAATCAAAA AGATTAGAGG AAGCAGTGTC TCTATTCAAT GAGATGCAGA AGAAGGGAAT

3361 TGTCCCGAAC TTGTACACTT ATAATTCACT AATTCTCCAC TTAGGAAAAG CAGGGAAGGC

3421 TGCTGAAGCT GGGAAAATGT ATGAAGAGCT ACTGACGAAA GGCTGGAAGC CTAACGTTTT

3481 CACATATAAC GCTCTTATTA GGGGGTACAG TGTTTCCGGC AGTACTGATA GTGCCTATGC

3541 TGCCTATGGT CGGATGATTG TTGGCGGGTG CCTACCCAAT TCAAGCACGT ACATGCAGCT

3601 CCCAAATCAG CTGTGACTAA CTAGTTAGTG ACTGAATGTA CTTCTTCTGT ATAGTTTTGT

3661 CTATAAAAGG AAAAGGATCA ACTGTAGATA GTCCACTTCA ATATATCTGA GGGTTCTGCT

3721 GGTTCTTGTT CTACACTATA TTTTTGTACT TGATGGAAGA AAATTATTCA ATACACAGCT

3781 GACTTGATC

<210> 2

<211> 1020

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 2

Met Leu Glu Val Cys Cys Cys Ser Gly Val Leu Gly Gly Ser Pro Pro

1 5 10 15

Ser Ser Arg Thr Ala Gly Val Ser Ser Pro Gly Leu Ser Pro Ser Arg

20 25 30

Pro Ser Lys Arg Arg Ile Gly Arg Ala Arg Val Gln Pro Arg Ala Pro

35 40 45

Pro Pro Cys Asp Glu Arg Arg Ala Ala Glu Asp Val Ile His Ala Leu

50 55 60

Arg Ser Ala Asp Gly Pro Ala Glu Ala Leu Glu Arg Phe Arg Ser Ala

65 70 75 80

Ala Arg Lys Pro Arg Val Ala His Thr Thr Ala Ser Cys Asn Tyr Met

85 90 95

Leu Glu Leu Met Arg Gly His Gly Arg Val Gly Asp Met Ala Glu Val

100 105 110

Phe Asp Val Met Gln Arg Gln Ile Val Lys Ala Asn Val Gly Thr Phe

115 120 125

Ala Ala Ile Phe Gly Gly Leu Gly Val Glu Gly Gly Leu Arg Ser Ala

130 135 140

Pro Val Ala Leu Pro Val Met Lys Glu Ala Gly Ile Val Leu Asn Ala

145 150 155 160

Tyr Thr Tyr Asn Gly Leu Val Tyr Phe Leu Val Lys Ser Gly Phe Asp

165 170 175

Arg Glu Ala Leu Glu Val Tyr Arg Val Met Met Val Asp Gly Val Val

180 185 190

Pro Ser Val Arg Thr Tyr Ser Val Leu Met Val Ala Phe Gly Lys Arg

195 200 205

Arg Asp Val Glu Thr Val Leu Trp Leu Leu Arg Glu Met Glu Ala His

210 215 220

Gly Val Lys Pro Asn Val Tyr Ser Tyr Thr Ile Cys Ile Arg Val Leu

225 230 235 240

Gly Gln Ala Lys Arg Phe Asp Glu Ala Tyr Arg Ile Leu Ala Lys Trp

245 250 255

Arg Met Lys Gly Val Ser Arg Met Ser Leu Pro Ile Pro Cys Leu Tyr

260 265 270

Arg Phe Phe Ala Met Leu Ala Val Ser Val Met Pro Arg Met Phe Phe

275 280 285

Gly Arg Arg Arg Val Ile Lys Asn Leu Ile Glu Pro Thr Leu Leu Cys

290 295 300

Ile Ser Leu Val Thr Met Val Thr Arg Asn Gln Trp Lys Ser Gly Met

305 310 315 320

Gln Lys Leu Met Gly Thr Met Thr Met Leu Leu Leu Ile Gln Gln Leu

325 330 335

Leu Met His Cys Ala Lys Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu Trp Lys Cys

340 345 350

Leu Met Arg Asn Lys Arg Val Cys Leu Ser Ser Ile His Thr Thr Arg

355 360 365

Tyr Arg Gly Phe Leu Lys Leu Ile Asp Leu Val Met Pro Ser Cys Leu

370 375 380

Asn Ile Trp Ile Phe Met Asp Leu Asn Gln Met Val Thr His Met Phe

385 390 395 400

Phe Ser Ile Thr Met Glu Asn Leu Val Asn Leu Arg Gln Tyr Arg Asp

405 410 415

Met Asn Arg Ala Lys Gly Leu Cys Gln Met Leu Leu Leu Val Met Leu

420 425 430

Phe Cys Leu Val Leu Pro Asn Leu Val Asp Leu Ala Trp Gln Lys Gly

435 440 445

Tyr Phe Met Asn Lys Leu Trp Gly Phe Leu Arg Ile Leu Ser Pro Thr

450 455 460

Leu Ser Ser Val Ala Ala Arg His Gln Asn Leu Met Lys Leu Arg Phe

465 470 475 480

Ser Met Ile Leu Lys Ile Ile Val Phe Leu Met Phe Leu Pro Ile Leu

485 490 495

Leu Ile His Ser Thr Arg Gln Ala Gly Val Met Lys Pro Gly Gly Ser

500 505 510

Phe Ile Asn Lys Lys Ile Ser Gln Gln Met Gly Leu Thr Ile His Phe

515 520 525

Trp Gln Asp Trp Glu Gly Lys Val Lys Ser Arg Arg Cys Ile Cys Leu

530 535 540

Lys Lys Cys Thr Thr Val Ile Ile Leu Leu Ile His Thr Ile Arg Phe

545 550 555 560

Leu Thr Val Ser Ala Arg Thr Gly Gln Leu Met Met His Leu Ile Cys

565 570 575

Tyr Thr Val Leu Arg Lys Asp Ala Tyr Leu Ile Phe Arg Leu Thr Thr

580 585 590

Leu Leu Tyr Met Ala Leu Leu Lys Lys Lys Asp Ile Met Arg His Ser

595 600 605

Val Phe Phe Val Arg Arg Arg Phe Leu Phe Gln Ile Met Gln His Cys

610 615 620

Val Leu Ser Ser Gln Val Leu Lys Leu Asp Arg Lys Leu Cys Ile Leu

625 630 635 640

Ser Arg Thr Thr Ser Ser Asn Leu Ala Pro Lys Gln Ile Gly Leu His

645 650 655

Ala Ile His Trp Lys Gly Tyr Arg Arg Leu Ala Ser Lys Ser Gln Leu

660 665 670

Ser Leu Leu Lys Ser His Gln Val Val Leu Pro Trp Met Ile Ser Phe

675 680 685

Cys Ala His Leu Ser Ile Ser Val Ser Arg Arg Lys Leu Leu Lys His

690 695 700

Met Asn Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Leu Glu Phe His Lys Leu Asp

705 710 715 720

Tyr Ile Ile Leu Phe Val Gly Leu Leu Met Lys Thr Ile Leu Leu Lys

725 730 735

Ala Cys Leu Leu Lys Arg Asn Ser Val Val Val Gln Met Ser Leu Leu

740 745 750

Thr Thr Tyr Phe Leu Met Pro Trp Glu Ser Gln Cys Gly Arg Lys Cys

755 760 765

Lys Phe Lys Lys Arg Cys Ile Ala Arg Asp Met Asn Gln Leu Met Leu

770 775 780

Leu Ile Thr Gln Ser Phe Gln Val Leu Ser Gln Glu Gly Trp Ser Arg

785 790 795 800

Leu Leu Ile Cys Thr Thr Thr Ala Lys Val Ser His Pro His His Ala

805 810 815

His Met Ala Leu Phe Leu Met Val Cys Lys Leu Glu Gly Lys Met Gln

820 825 830

Lys Ile Phe Ser Met Arg Cys Trp Ser Met Asp Ala Arg Pro Ile Ala

835 840 845

Leu Ser Thr Ile Tyr Tyr Met Asp Ile Glu Leu Val Ile Gln Arg Arg

850 855 860

Ser Val Ile Cys Phe Arg Ile Trp Leu Thr Arg Glu Thr Gln Ile Asn

865 870 875 880

Pro Thr Arg Leu Leu Leu Thr His Ser Ala Arg Gln Asp Ser Met Met

885 890 895

Val His Ile Leu Gly Asn Tyr Lys Trp Val Leu Asn Leu Ile Leu Leu

900 905 910

Thr Ile Cys Ser Leu Met Val Leu Glu Asn Gln Lys Asp Arg Lys Gln

915 920 925

Cys Leu Tyr Ser Met Arg Cys Arg Arg Arg Glu Leu Ser Arg Thr Cys

930 935 940

Thr Leu Ile Ile His Phe Ser Thr Glu Lys Gln Gly Arg Leu Leu Lys

945 950 955 960

Leu Gly Lys Cys Met Lys Ser Tyr Arg Lys Ala Gly Ser Leu Thr Phe

965 970 975

Ser His Ile Thr Leu Leu Leu Gly Gly Thr Val Phe Pro Ala Val Leu

980 985 990

Ile Val Pro Met Leu Pro Met Val Gly Leu Leu Ala Gly Ala Tyr Pro

995 1000 1005

Ile Gln Ala Arg Thr Cys Ser Ser Gln Ile Ser Cys

1010 1015 1020

<210> 3

<211> 125

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 3

GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAAATGGAGAATGAAGGGTGTAAGCCGGATGTCATTACCCATACCGTGCTTATACAGGTTCTTTGCGATGCTGGCCGTATCAGTGATGCCAAGGAT

<210> 4

<211> 124

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 4

GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAATGGAGAATGAAGGGTGTAAGCCGGATGTCATTACCCATACCGTGCTTATACAGGTTCTTTGCGATGCTGGCCGTATCAGTGATGCCAAGGAT

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

GATTCGATGA AGCTTATCGG ATACTTGCGA AG

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ATCCTTGGCA TCACTGATAC GG

Claims

1. 一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因，其特征在于：所述的基因序列所编码的蛋白质如SEQ ID No.2所示。

3.检测权利要求1所述的受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因的方法，采用特异性dCAPs PCR引物对水稻植株所提取的DNA进行PCR扩增反应，所述特异性dCAPs PCR引物其核苷酸序列为：上游：5'GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3' 下游：5'ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3' 即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列；

由普通水稻DNA扩增所得到的125bp片段，如SEQ ID No.3所示，能被MboⅡ酶切成33bp和92bp的两个特异性片段，而由携带该低温响应的叶绿体发育基因的水稻的DNA扩增得到的124bp长度，如SEQ ID No.4所示序列，不被MboⅡ酶切断，根据DNA能否被MboⅡ酶切可快速检测到是否含有此基因的水稻品种。