CN103014021A - 水稻叶绿体早期发育控制基因OsMCP-UF及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制水稻叶片叶绿体早期发育的基因OsMCP-UF；该基因OsMCP-UF具有如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4所示的DNA序列。本发明还同时公开了一种杂交育种去除假杂种的方法，包括用具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列的基因通过杂交、回交导入水稻保持系、不育系品种；当叶片表型为黄化时，说明该植株为假杂种；应作去除处理，从而实现去除假杂种的目的。

Description

水稻叶绿体早期发育控制基因OsMCP-UF及其应用

技术领域

本发明属于水稻育种领域；具体地说，本发明涉及一种水稻叶绿体早期发育控制基因OsMCP-UF及其在杂交稻假杂种去除中的应用。

背景技术

水稻(Oyrza sativa L.)在我国粮食生产中占有极其重要的地位。据联合国粮农组织统计，近四十年来，我国水稻历年播种面积平均为4.7亿亩，最高为5.4亿亩，占粮食作物播种面积的26.15%；稻谷产量平均为10419.7万吨，最高为17825万吨占粮食产量的43.7%。水稻生产关系到国计民生，在粮食生产中举足轻重。

目前，我国杂交稻面积占水稻生产面积的50%左右，其技术体系以三系法和两系法并存，仍以三系法杂交水稻为主。伴随杂交水稻的大面积推广，在生产实践中，杂交稻仍面临亲本繁殖和制种两大环节中的纯度保持技术上的困难，这是限制一些强优组合生产应用的主要障碍。杂交稻科子真伪不易辨认，种子纯度鉴别困难等造成的真假杂种不易识别、杂种纯度不易保证的问题十分突出，给农民造成重大损失的事件时有发生。为此，广大育种工作者在培育优质高产杂交稻的同时，也在谋求解决杂交稻种子和亲本的纯度鉴定和真假种子识别的办法。随着生物科学技术的不断发展，同功酶法、DNA指纹技术在真假杂种识别上已获成功，但这些分子生物学手段技术含量高，需要精密仪器设备，投入大，花费昂贵，一般种子生产和销售单位难以掌握和应用于实际。因此，需要一种简便可靠的办法来解决杂交稻亲繁和制种的纯度检测问题。

水稻形态标记性状在真假杂种识别上具有直观、可靠、简便易行等优点，已为一些育种工作者所采用。水稻形态标记性状有多种，主要性状如穗色、穗形、着粒密度、籽粒颜色、芒的有无等；细微性状如种子的大小、形状(长宽比)、程尖色、俘毛长短、柱头外露遗迹等；特有性状如红色或紫红色的秤壳和米粒以及香味等；易变性状如株高、穗长、分孽力、开花抽穗期、生育期、叶片长短、叶色深浅等。水稻叶色标记性状属特有性状，常见的有紫叶、红叶、淡绿色、白化叶等。

在叶色标记性状用于杂交水稻育种研究上，中国水稻研究所董凤高等(1994)通过连续回交将隐性的淡绿叶形态标记导入光、温敏不育系，以期解决由于釉型光、温敏核不育系育性不稳而导致的杂交水稻制种纯度难以保证的问题。曹立勇等(1999)将隐性紫叶形态标记性状回交转入温敏不育系育成中紫S。浙江大学核农所应用核辐射技术培育出带叶色标记杂交水稻不育系全龙A等。叶荣国(1999)筛选出了周缘白化，黄白叶片的不育系。牟同敏等(l995)选育出了紫叶标记光温敏互作不育系，并对紫叶性状的遗传特性进行了分析。南京红太阳种业有限公司和安徽肥东良种繁育总场成功应用辐射及化学诱变技术，选育出幼苗叶片带隐性白化标记的水稻两系、三系不育系及其具有推广价值的新品种(系)，其中新组合红优1“是使用白化标记不育系庐86A与恢复系166配组而成，己在生产上示范推广。

参考文献具体如下：

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种控制水稻叶片叶绿体早期发育的新基因OsMCP-UF及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种控制水稻叶片叶绿体早期发育的基因OsMCP-UF；该基因OsMCP-UF具有如SEQ ID NO：1（野生型）和/或SEQ ID NO：4（突变体）所示的DNA序列。

作为本发明的控制水稻叶片叶绿体早期发育的基因OsMCP-UF的改进：该基因OsMCP-UF具有与SEQ ID NO：2所示的cDNA序列至少有80%同源性的基因序列。

本发明还同时提供了一种杂交育种去除假杂种的方法，包括用具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列的基因通过杂交、回交导入水稻保持系、不育系品种；

当叶片表型为黄化时，说明该植株为假杂种；应作去除处理，从而实现去除假杂种的目的。

备注说明：因为突变体的表型为新叶黄化，且为隐性突变，所以杂合子和野生型一样，为正常表型。将突变基因导入水稻保持系和不育系，因为是突变体，外在表形是新叶黄化。而杂交稻为杂合子，为正常表型。

SEQ ID NO：1是指序列表的NO1，依次类推。

本发明的杂交育种去除假杂种的方法适应于三系杂交育种的所有水稻品种。

综上所述：本发明的目的是提供一种控制水稻叶片叶绿体早期发育的新基因OsMCP-UF，如SEQ ID NO：2 所示的cDNA序列，也包括与SEQ ID NO：2所示的cDNA序列至少有80%同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID NO：3所示的蛋白质属于MCP家族，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO：2中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的具体实施内容如下：

从本实验室发展的EMS（ethyl methyl sulfonate）诱变的粳稻（Oryza sativa L. Japonicacv.）品种Nipponbare突变体库筛选到一个苗期叶绿体发育异常的突变体Osmcp-uf（图1），突变体Osmcp-uf叶片在发育早期黄化，叶绿素含量为野生型的62%左右，叶绿体结构异常，光合作用能力下降。突变体Osmcp-uf生长受到抑制的表型整个生育期都存在，生育期、结实率等农艺性状与野生型相比没有差异。通过遗传群体的分析确定，该突变体是一个符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体。

本发明采用基因图位克隆方法分离了OsMCP-UF基因。首先创建了一个F₂定位群体，由Osmcp-uf纯合突变体为母本，籼稻野生型Kasalath为父本杂交获得F₁杂合体，F₁自交后代F₂中的隐性个体作为基因的定位群体。并利用SSR（Simple Sequence Repeats）分子标记对Osmcp-uf进行初步定位。定位结果表明，OsMCP-UF初步定位在第1染色体短臂S1-8947和S1-9038两个标记之间的LOC_Os01g16040（图2），突变位点是第一个外显子上289 bp处，由GCG变为ACG，引起错义突变。该基因编码一个Mitochondrial Carrier Family（MCF）家族，是MCF家族中的ADP/ATP载体蛋白（AAC），由此将基因命名为OsMCP-UF，将突变体命名为Osmcp-uf。通过对该基因cDNA序列（SEQ ID NO：2）和基因组序列比对确定了该基因结构（图2），并将突变位点定位于该基因第一个外显子上。利用pfam网站(http://pfam.sanger.ac.uk)，输入OsMCP-UF蛋白序列，分析了其保守结构域。

为了进一步确证突变体突变表型是由OsMCP-UF基因突变引起的。我们对突变体进行了转基因恢复验证。将由OsMCP-UF基因自身启动子驱动完整的cDNA序列（SEQ ID NO：1）融GFP克隆到双元植物转基因载体pBIeGFP（新）中。将构建好的互补载体通过农杆菌介导的遗传转化系统转化突变体愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。通过观察T₁转基因苗表型，转化了外源OsMCP-UF基因的突变体（即转基因阳性株系）的叶片颜色复绿，株高也回复到野生型水平（图3）。转基因互补试验确证了突变表型是由OsMCP-UF基因突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。

这些结果表明，本发明中的叶色突变体Osmcp-uf是单基因控制、可遗传的隐性突变体，其突变基因Osmcp-uf杂交稻育种去除假杂种中有很大的应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是突变体表型分析图：

A，野生型（Wild Type，WT）和突变体Osmcp-uf正常营养液6天苗龄地上部表型，Bar = 2 cm；WT新叶为绿色，突变体Osmcp-uf新叶为黄色。

B，野生型（WT）和突变体Osmcp-uf正常营养液6天苗龄根部表型，Bar = 2 cm；

C，野生型（WT）和突变体Osmcp-uf正常营养液第三叶不同叶龄表型分析；a，见光第2天，b，见光第5天，c，见光第10天（左为WT，右为Osmcp-uf）；Bar = 2 cm；WT叶片一直为绿色，而突变体Osmcp-uf叶片从黄色渐渐变为绿色。

D，野生型（WT）和突变体Osmcp-uf正常营养液第三叶不同叶龄叶绿素含量分析；

E，野生型（WT）和突变体Osmcp-uf正常营养液见光第2天第三叶叶绿素含量分析；

F，野生型（WT）和突变体Osmcp-uf正常营养液6天苗龄地上部和地下部长度分析；

所有数据为5次重复的平均值 ± SD，**代表差异显著（p<0.01，t检验）。

图2是OsMCP-UF基因定位和基因结构图：

A，通过精细定位，基因被定位在S1-8989和S1-9038之间；

B，OsMCP-UF基因结构图及突变位点的位置。

图3是突变体Osmcp-uf回复验证图：

A，野生型、突变体和2个回复株系6天苗龄表型以及CAPS分析；图中可见2个回复株系恢复到野生型表型。

B，2个回复株系Southern blot分析；

C，野生型、突变体和2个回复株系6天苗龄第三叶叶绿素含量分析；

所有数据为5次重复的平均值 ± SD，**代表差异显著（p<0.01，t检验）。

图4是回交F1（杂合子）与突变体（纯合子）表型图片。

A，回交F1（杂合子）与突变体（纯合子）表型和CAPS鉴定。突变体表现为新叶黄化，而杂合子为正常野生型表型。

B，回交F1（杂合子）新叶为绿色。

C，突变体（纯合子）新叶为黄色。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1、突变体筛选和表型

以EMS诱变的Nipponbare突变体库为突变体筛选对象，M₂种子用蒸馏水冲洗干净，0.67%（质量浓度）稀HNO₃破休眠处理18小时，37℃暗处催芽至露白。将露白的种子播于水稻培养液（如表1所示）上浮着的尼龙网纱上面，在温度为30/22 ^oC (昼/夜)左右，光照12小时条件下培养7天，以叶色为筛选标准进行突变体的筛选，从中筛选到一个叶色黄化的突变体(图1 A)。该突变体Osmcp-uf最显著地表型是叶片黄化和生长受到抑制（图1）。野生型的新生叶片在见光后，叶绿体正常发育，叶色为绿色；而突变体Osmcp-uf的新生叶片见光后，为黄化表型，随着叶片的发育，叶色会渐渐复绿，当叶片完全成熟后，叶色恢复绿色。以第三叶为例，突变体Osmcp-uf第三叶在见光后第2天，为黄化表型，随着叶片的发育，到第5天时，叶缘上部已经恢复正常，而下部依然为黄化表型，第10天时，叶片完全恢复正常；而野生型第三叶从见光开始，一直为绿色（图1）。相应的叶绿素含量也表现出同样的变化。见光后第2天，突变体Osmcp-uf第三叶的叶绿素含量为野生型的62%，5天时，为野生型的88%，10天时，叶绿素含量与野生型没有显著差异。此现象一直到整个生育期结束。透射电镜结果显示，突变体新叶叶绿体膜结构完整，但是基粒类囊体数目变少，而且基粒类囊体片层结构变少。叶片完全成熟后，突变体Osmcp-uf叶片叶绿体结构都恢复到野生型水平。

表1 、水稻营养液配方

使用时，每10L培养液中加贮备液I、II、III、IV、VI各12.5 mL，加贮备液V 50 mL。用1 N HCl调节pH值至5.0-5.5。

实施例2、基因定位与序列分析

在突变体Osmcp-uf与野生型Nipponbare回交BC₁F₂代100个单株中，与突变体Osmcp-uf表型相同的为28，符合3:1（χ21 = 0.48 < χ20.05,1）的比例，因此突变体Osmcp-uf突变表型是由隐性单基因突变引起。

Osmcp-uf纯合突变体为母本，籼稻野生型Kasalath为父本杂交获得F₁杂合体，F₁自交得到定位群体，从定位群体F₂中挑选出隐性个体（即，表现为新生叶片黄化表型的个体）作为基因的定位群体。

初定位选取了F₂定位群体中的30个新生叶片黄化表型的突变个体，单株提取DNA，将模板浓度调整到50 ng/μL后各取2 μL混合成一个样品池（bulk）作为F₂的混合模板，同时分别提取野生型Nipponbare，野生型Kasalath，以及Nipponbare和Kasalath杂交的F₁ DNA用作对照。

F₂定位群体来自于纯合突变体（Osmcp-uf）和籼稻品种Kasalath 杂交后代（杂合子F₁自交产生），从1580F₂定位群体中共筛选出约385株突变个体用做精细定位。每株取1片叶片，每5株合成一份混合样品池提取DNA，共计77个混合DNA样品池，同时备份，以利于将来解包分析。

以实验室分子标记图谱为基础进行基因初定位，即，利用SSR（Simple Sequence Repeats）分子标记对Osmcp-uf进行初步定位。根据遗传距离每条染色体每隔约5 cM（centi-Morgen）取一个标记，来确定突变基因所在染色体位置，然后逐步扩大群体，发展新的SSR或者STS标记，对突变基因进行精细定位。

按照引物要求的反应条件进行PCR扩增（反应体系如下），通过6%的聚丙烯酰胺凝胶（凝胶配置方法如下）电泳分离，显色后（显色液配方如下），根据检测到的PCR产物多态性，30个F₂个体将基因初定位到第七号染色体上SSR标记S1-8947和S1-9038之间。

PCR反应体系：

聚丙烯酰胺凝胶（6%）配方

注：40%Arc-Bis（丙烯酰胺38g和亚甲基双丙烯酰胺2g 溶于100ml水）；

10% AP是指质量浓度为10%的过硫酸铵；

聚丙烯酰胺凝胶显色液配方

注：甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。

利用突变体Osmcp-uf与籼稻野生型Kasalath杂交F₂代385个单株，使用图位克隆的方法，将突变基因定位到第1号染色体短臂S1-8947和S1-9038两个多态标记之间，重组子分别为2/385，1/385。新发展的多态标记S1-8989、S1-9008和S1-9027重组子分别为2/385，0/385，0/385。用到的5个STS分子标记引物序列为：

S1-8947  F: 5’ CGATAATGAGTAGAAAGATAATG 3’

  R: 5’ CATATAACTGCTTGTACTATG 3’

S1-8989  F: 5’ CATCTCAAAACTAGAAACACAA 3’

  R: 5’ GAAATTTGAATGCTTTCTCTG 3’

S1-9008  F: 5’ GGAGATTAAAACATCGATTTTG 3’

  R: 5’ CATCTGTCAAATTTTTAGGG 3’

S1-9027  F: 5’ GTAGCCATGGAGCTGATGCAAC 3’

  R: 5’ CAACTCCATGGCTAGATGGAAG 3’

S1-9038  F: 5’ CTATCTCCTACACGGTTTTTG 3’

  R: 5’ GGTTCCTCCTCCACTTTATTC 3’ 。

除了引物作相应的替代外，PCR反应体系和PCR反应程序同上。

S1-8989和S1-9038两个多态标记之间含有2个PAC克隆，P0453A06和P0499C11，根据网站预测，该区域共含有8个基因。对8个基因的基因组序列进行测序发现，在基因LOC_Os01g16040 (SEQ ID NO：1)第一个外显子上289bp处有一单核苷酸突变，使序列由GCG变为ACG（SEQID NO：4），从而引起蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：3)中第97位的赖氨酸（A）错义突变成了苏氨酸（T）。该点突变通过CAPS得到了进一步确认（图3）。利用NCBI网站对OsMCP-UF的序列进行了生物信息学分析。

该基因编码一个Mitochondrial Carrier Protein（MCP）家族，是MCP家族中的ADP/ATP载体蛋白（AAC），由此将基因命名为OsMCP-UF，将突变体命名为Osmcp-uf。通过对该基因cDNA序列（SEQ ID NO：2）和基因组序列比对确定了该基因结构（图2），并将突变位点定位于该基因第一个外显子上。利用pfam网站(http://pfam.sanger.ac.uk)，输入OsMCP-UF蛋白序列，分析了其保守结构域。

实施例3、突变体中外源OsMCP-UF基因的功能互补验证实验

利用OsMCP-UF基因的启动子序列和基因组全长序列融合eGFP做回复实验。设计引物如下：

启动子扩增引物：    F：5’ GTCaagcttGGAGACATGGCTTCTTGGATG 3’

  R：5’ CCAtctagaATCGTCGTCGGTGGGCAG 3’

基因组全长扩增引物：F：5’ CCAtctagaATGAGCCACCGGCGAGTGGAT3’

  R：5’ CCAggatccGCATTAGTTTCTCCAGTTCCTTC 3’

以Nipponbare基因组DNA为模板，扩增出OsMCP-UF基因启动子和基因组全长序列(SEQ ID NO：1)，先用HindIII和XbaI双酶切启动子全长序列PCR产物，连入用HindIII和XbaI双酶切的pBIeGFP（新）载体中，获得pOsMCP-UF-eGFP载体。然后用XbaI和BamHI双酶切基因组全长序列PCR产物，连入用XbaI和BamHI双酶切pOsMCP-UF-eGFP载体，获得回复载体pOsMCP-UF::OsMCP-UF:eGFP。

将经测序检测正确的克隆通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体Osmcp-uf愈伤中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。通过CAPS标记和southen杂交试验证明转基因成功。转基因阳性植株完全恢复了突变体的表型（图 3）。即，通过观察T₁转基因苗表型，转化了外源OsMCP-UF基因的突变体（即转基因阳性株系）的叶片颜色复绿（图3）。转基因互补试验确证了突变表型是由OsMCP-UF基因突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。

实施例4、

突变体Osmcp-uf为隐性单基因突变引起，因此其与NIP回交F₁代的表型为野生型表型（图3）。利用基因的突变位点，设计CAPS引物，可以最为标记区分突变体和杂合子（图4）。因此将突变基因Osmcp-uf利用分子标记辅助，导入到杂交稻保持系和不育系中，在种植杂交稻时，就可以根据叶片表型，将假杂种（叶片黄化）去除掉。

CAPS引物：

F:CCCCTCTTCCTTCTTCGCTTC

R:TCCCTCAGATAGCAACCACGA

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种控制水稻叶片叶绿体早期发育的基因OsMCP-UF；其特征是：该基因OsMCP-UF具有如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的控制水稻叶片叶绿体早期发育的基因OsMCP-UF，其特征是：该基因OsMCP-UF具有与SEQ ID NO：2所示的cDNA序列至少有80%同源性的基因序列。

3.一种杂交育种去除假杂种的方法，其特征在于：包括用具有SEQ IDNo：4所示的核苷酸序列的基因通过杂交、回交导入水稻保持系、不育系品种；

当叶片表型为黄化时，说明该植株为假杂种；应作去除处理，从而实现去除假杂种的目的。

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