CN101830973A - 水稻OsAHL蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与水稻抗逆性(包括但不限于抗旱、耐低温、耐高盐胁迫)、叶绿体发育相关的OsAHL蛋白以及编码具有水稻OsAHL蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中第69-1169位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.2中第69-1169位的核苷酸序列杂交。本发明提供的水稻OsAHL基因具有调节叶绿体发育，增强光合系统活性和稳定性的功能；在植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐低温、耐高盐胁迫)方面具有明显的作用，具有很大的应用价值，能够明显减少农作物在干旱、半干旱或者高盐、低温等条件下产量和生物产量的损失。

Description

水稻OsAHL蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻OsAHL蛋白及其应用。

背景技术

水稻是农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国的粮食、水和生态安全具有重要意义。利用基因工程技术进行分子育种，将抗旱基因转入优良的水稻品种中，从而改良其抗旱性，培育即抗旱又高产优质的农作物新品种是抗旱育种的有效途径之一。

发掘抗旱基因是抗旱分子育种的基础。已发表的抗旱相关基因及其蛋白的研究越来越多。广义上的反式转录调节因子包括所有具有调节基因转录功能的蛋白分子，它们在植物生长和抗逆性方面发挥着巨大作用。

AT-hook是一种具有以GRP 3个氨基酸残基为核心序列的短小模体，有着很强的结合染色体中富含A/T的序列的能力。DUF296功能域是一类在原核生物和植物中保守的蛋白序列和结构，其具体功能尚无研究涉及。含DUF296功能域的蛋白往往同时伴随有一个AT-hook模体出现。

这种含DUF296功能域的蛋白分子能够形成同源三聚体，并且形成这种结构需要乙酰基以及Zn²⁺等配体的调节。这一类蛋白识别并结合在富含A/T的核骨架结合区MARs区域的特殊序列。拟南芥中的研究发现，含DUF296功能域的蛋白分子结合于常染色质表面，调整染色体核仁结构，从而调节相关区域内的基因表达，故将其归于转录调节因子。

发明内容

本发明的目的是提供一种与水稻抗逆性相关的OsAHL蛋白、其核酸序列、含该核酸序列的载体及宿主。

本发明的另一目的是提供编码水稻OsAHL蛋白的基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、抗盐等)中的应用。

本发明的再一目的是提供编码水稻OsAHL蛋白的基因在调节植物叶绿体发育相关基因表达，增强光合系统活性和稳定性中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种水稻OsAHL蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

前述的水稻OsAHL蛋白，其结构中含有AT-hook模体和DUF296功能域。

编码上述水稻OsAHL蛋白的基因，优选地，其编码的核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的从69-1169位的核苷酸序列具有至少70％的同源性；或者所述基因编码的核苷酸序列能与SEQ ID NO.2中从69-1169位的核苷酸序列杂交。

更优选地，编码上述水稻OsAHL蛋白的基因具有如SEQ ID No.2所示的从69-1169位的核苷酸序列。

本发明还提供一种核酸探针分子，其含有上述水稻OsAHL基因编码序列的8-100个连续核苷酸，优选地，含有上述水稻OsAHL基因编码序列的15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码水稻OsAHL相关的核酸分子。

本发明还提供含有上述水稻OsAHL基因的载体。

本发明还提供含有上述水稻OsAHL基因载体的宿主。优选地，所述宿主为真核细胞。更优选地，所述宿主为水稻。

本发明还提供含有上述水稻OsAHL基因的转化植物细胞。

本发明还提供上述水稻OsAHL基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、抗盐等)中的应用。

本发明进一步提供上述水稻OsAHL基因在调节植物叶绿体发育相关基因表达，增强光合系统活性和稳定性中的应用。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

前述的水稻OsAHL蛋白，其为具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“水稻抗逆蛋白(或多肽)编码序列”、“调节叶绿体发育蛋白(或多肽)编码序列”，均指编码具有水稻OsAHL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2中第69-1169位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.2序列的编码框第69-1169位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ IDNO.2中第69-1169位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。

该术语还包括能在中度严谨条件(70-85％序列一致性)下，优选地，在高度严紧条件(85％以上序列一致性)下与SEQ ID NO.2中从核苷酸第69-1169位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.2中从核苷酸第69-1169位的核苷酸序列的同源性至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的水稻OsAHL相同功能的蛋白的SEQ ID NO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，优选为1-60个，更优选为1-20个，最优选为1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，优选为30个以内，更优选为10个以内，最优选为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“水稻抗旱蛋白或多肽”、“调节叶绿体发育蛋白或多肽”，指具有水稻OsAHL蛋白活性的SEQ ID NO.1序列的多肽。该术语还包括具有与天然水稻OsAHL相同功能的SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，优选为1-30个，更优选为1-20个，最优选为1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，优选为10个以内，更优选为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻OsAHL蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的水稻OsAHL多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与水稻OsAHL相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用水稻OsAHL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“水稻OsAHL保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比，有至多10个，优选为至多8个，更优选为至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽按照表1进行替换而产生。

表1

替换前的残基	替换后的残基	优选的替换残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr

替换前的残基	替换后的残基	优选的替换残基
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括水稻OsAHL蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻OsAHL相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的水稻OsAHL多肽时，可以将水稻OsAHL编码序列可操作地连接表达调控序列，从而形成水稻OsAHL蛋白表达载体。

在本发明中，“可操作地连接”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连接多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连接编码序列。一般，“可操作地连接”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析水稻OsAHL基因产物的表达，即分析水稻OsAHL的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，根据本发明的水稻OsAHL核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选水稻OsAHL相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与水稻OsAHL相关基因相关的水稻cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选水稻cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对水稻OsAHL相关的全部或部分做放射活性标记而得。最适合于筛选的cDNA文库是来自水稻的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.等。这种筛选方法可以识别与水稻OsAHL相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的水稻OsAHL相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确顺序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成法将突变引入本发明蛋白序列中。

除了重组法之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接，以产生全长的分子。

利用本发明的水稻OsAHL蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与水稻OsAHL相关基因或蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明提供的水稻OsAHL基因及其编码蛋白在植物抗旱性方面具有明显的作用，能够明显降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失，具有很大的应用价值。

(2)利用转基因技术得到改良的含有本发明水稻OsAHL基因的转化植物在包括干旱、低温、高盐等条件下，生长、生存状况明显优于野生型植物，表明了水稻OsAHL基因能够明显提高植物的抗逆性。

(3)本发明提供的水稻OsAHL基因不仅能够有效调节逆境相关转录因子，而且能够直接或间接调节控制叶绿体发育以及光合作用相关功能蛋白和酶系统的表达，具有潜在的、巨大的应用价值。

附图说明

图1为水稻不同生育期干旱条件下OSAHL相对表达量变化；

图2为水稻IRAT109苗期在不同逆境胁迫处理下OsAHL相对表达量变化；

图3为水稻IRAT109苗期在不同激素处理下OsAHL相对表达量变化；

图4为本发明的水稻OsAHL(Os11g0149100)蛋白与水稻注释基因Os12g0147000、高粱基因Sb08g002940以及Sb05g002940编码的氨基酸序列之间的同源性比较；

图5为转OsAHL基因水稻苗期抗逆实验结果；

图6为干旱条件下OsAHL过量表达引起水稻的叶绿素含量变化；

图7为转OsAHL基因超表达水稻成株期干旱胁迫后表现；

图8表示转OsAHL基因超表达植株成株期抗旱性提高；

图9为本发明酵母双杂交实验中OsAHL的表达载体构件示意图；

图10为本发明酵母菌株YRG-2内表达验证OsAHL蛋白及其DUF296结构域具有同源结合能力。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。

实施例1水稻基因0sAHL在水稻品种IRAT109中表达谱分析

1.胁迫处理

(1)旱处理：IRAT109种子催芽后，移栽到土中培养，在苗期(4叶一新)、分蘖盛期(6叶一新)、孕穗期(减数分裂时期)进行旱处理。在各个时期，当盆中土层无水时开始断水，同时作为旱处理的开始，在旱处理时期的每天同一时间剪取植株叶片，投入液氮中冷冻用于RNA提取。

(2)苗期激素与化学试剂处理：IRAT109种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)，至幼苗长至30天开始处理。分别以ABA(50uM，150uM)、JA(50uM，150uM)、SA(0.5mM，1.5mM)、H₂O₂(100mM，200mM)、NaCl(100mM，250mM，500mM)、甘露醇(Mannitol)(100mM，250mM，500mM)处理，每种处理设1h和2h两个时间梯度。同时设有正常水管理对照。处理结束后，快速吸干根表面水分并分别剪取叶片和根，投入液氮冷冻后-80℃保存用于RNA提取。

2.RNA的提取：取部分组织，在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有TRIzol试剂(天根生化科技有限公司)的1.5mL EP管，充分振荡后，室温放置5分钟，于4℃，12000r/min离心15min后，上清液移至新的1.5mL EP管中，氯仿去蛋白后，等体积异丙醇沉淀RNA，溶解后用Dnase消化降解残留DNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.定量PCR分析

定量PCR体系与方法：PCR反应使用美国ABI

7000定量PCR仪，使用Takara公司的定量PCR试剂盒。每个PCR反应重复三次。反应体系包含SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)12.5μL，正、反向引物(定量PCR扩增引物序列为：F：5’-CTGGTGGGCTCAGTGTATCG-3’，R：5’-GCCATAGGCGGTGGTAGTG-3’)各0.5μL，各种处理的cDNA模板1μL，加水补足体积至20μL。反应条件如下：95℃10s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，设定在每个循环中60℃1s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他具体操作详见仪器使用说明书。

目的基因与参照基因的扩增效率：任取一样品分别稀释10×、100×、1000×、10000×，取1×～10000×各样品1μL进行定量PCR，方法同上，重复三次，计算目的基因与参照基因的平均CT值以及ΔCT值，通过cDNA浓度梯度的log值对ΔCT值作图，根据直线斜率绝对值判断扩增效率(Kenneth等，2001)。

结果分析方法：每种处理样品重复三次，取平均CT值，利用2-^ΔΔCT法进行结果分析。

定量RT-PCR结果显示，在水稻苗期、分蘖期及幼穗分化期等不同发育时期，随着干旱胁迫处理时间的持续，OsAHL基因的表达量先是快速的增加，达到正常水分处理下表达量的3-5倍，然后缓慢降低，恢复到正常的表达水平。图1为不同生育期干旱条件下OSAHL相对表达量变化，其是以水稻品种IRAT109为实验材料，同时期正常水分下植株为对照(n＝3)。误差线表示3次生物重复的标准误。

在各种激素、盐、渗透胁迫和低温(4℃)处理的样品中，OsAHL基因在根、叶中都有表达。不同浓度的ABA、H₂O₂、NaCl、SA、JA、Mannitol处理以及低温(4℃)均提高了OsAHL基因在水稻叶片中的表达。OsAHL基因在根中对各种处理的响应表达情况不一，在不同浓度的ABA、H₂O₂、NaCl、Mannitol和低温(4℃)等处理下，OsAHL基因在根中的表达被诱导升高，其促进作用随浓度升高与处理时间延长而加强。而SA和JA等抑制了OsAHL基因在根中的表达。图2为水稻IRAT109苗期在不同逆境胁迫处理下OsAHL相对表达量变化，其是以三叶期的水稻IRAT109为实验材料，分别在(A)4℃冷处理，(B)不同浓度的甘露醇，以及(C)不同浓度的NaCl等逆境下，OsAHL相对表达量明显提高。误差线表示3次生物学重复的标准误。图3为水稻IRAT109苗期在不同激素处理下OsAHL相对表达量变化，其是以三叶期的水稻IRAT109为实验材料，分别使用浓度的激素，处理不同的时间。具体激素为：(A)ABA；(B)H₂O₂；(C)茉莉酸JA；(D)水杨酸SA。误差线表示3次生物重复的标准误。

实施例2水稻OsAHL基因的克隆

1.幼苗培育

水稻(品种为“IRAT109”)由上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存，将水稻置于35℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备提取DNA或RNA。

2.RNA的提取：按照实施例1中的方法提取RNA。

3.基因的全长克隆

根据GeneBank中水稻数据库信息中提供的序列信息，设计引物，采用RT-PCR方法进行cDNA全长克隆。

通过RT-PCR[Pf1(SEQ ID NO.3)+Pr1(SEQ ID NO.4)]得到一个包含有完整开放阅读框在内的cDNA序列(SEQ ID NO.2)，长度为1331bp；回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析，知其与水稻注释基因LOC_Os04g48900完全匹配，与全长插入片段AK102958.1具有98％同源性。同时，其编码蛋白与已知禾本科植物高粱(Sorghum bicolor)的Sb08g002940有74％同源性，和Sb05g002940基因的同源性达到79％，与水稻(Oryza sativa)中的Os12g0147000的同源性也高达69％。这三个基因均具有一个AT-hook和DUF296功能域，但其功能均未知。通过查询Gramene网站，发现OsAHL基因位于抗旱QTL区间内。

其中，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的信息

(1)SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：19bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

(2)SEQ ID NO.4的信息

(i)序列特征：

(A)长度：22bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.4

通过组合使用上述方法，获得了水稻OsAHL蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.2)。

(3)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1331bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链(mRNA，cDNA)，双链(对应染色体基因位点DNA序列)

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：mRNA，cDNA，DNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

实施例3水稻OsAHL基因的序列信息与同源性分析

本发明水稻OsAHL全长cDNA的长度为1331bp，其序列如SEQ IDNO.2所示，其中开放读框位于69-1169位核苷酸(1101个核苷酸)。根据全长cDNA推导出水稻OsAHL的氨基酸序列，共366个氨基酸残基，分子量为37.2k道尔顿，等电点(pI)为7.57，其序列如SEQ ID NO.1所示。

将水稻OsAHL的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现OsAHL基因在核苷酸及氨基酸水平与Os11g0149100基因100％同源。Os11g0149100基因以及与其相关的EST均没有功能注释。OsAHL基因位于水稻抗旱QTL区间内，同时从实施例中可以看出，OsAHL基因在干旱条件下明显增强表达，因此，可以认为水稻OsAHL基因与水稻的抗旱性相关。

图4为本发明的水稻OsAHL(Os11g0149100)蛋白与水稻注释基因Os12g0147000、高粱基因Sb08g002940以及Sb05g002940编码的氨基酸序列之间的同源性比较。其中，1为水稻OsAHL(Os11g0149100)的氨基酸序列，2为水稻注释基因Os12g0147000的氨基酸序列，3为高粱注释基因Sb08g002940的氨基酸序列，4为高粱注释基因Sb05g002940的氨基酸序列；方框部分为AT-hook模体，其中的阴影部分为AT-hook核心保守序列；下划线部分为DUF296结构域的保守位点。

实施例4水稻OsAHL蛋白或多肽在水稻中进行真核细胞表达及转基因植株的抗逆性鉴定

步骤1.含目的基因(水稻OsAHL基因)的表达载体的构建：

根据水稻基因OsAHL的全长序列(SEQ ID NO.2)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻基因OsAHL的cDNA克隆至中间载体(如pBI121)，进一步克隆到双元表达载体(如pCAMBIA1300)上，在保证阅读框架正确的前提下再将该双元表达载体转入农杆菌中，并转化模式植物水稻日本晴(来自上海市农业生物基因中心)。

步骤2.愈伤诱导：

将水稻种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表2的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

步骤3.继代培养：

把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表2的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL 2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

步骤4.农杆菌和愈伤组织共培养：

挑取步骤1的农杆菌阳性转化子，接种于1mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30分钟至OD₆₀₀＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20分钟左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5天。

悬浮培养液：采用表2的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL 2，4-D(浓度1mg/mL)，配成100ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。

共培养培养基：采用表2的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL 2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。

步骤5.筛选培养：

共培养3天后，将愈伤组织转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表3的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mLHn和1mL Cn(100ppm)。

步骤6.分化培养：

挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表3的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

步骤7.生根培养：

待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表3的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

步骤8.转化植株培养：

待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3天后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表2培养基成分

表3培养基成分

实施例5含水稻基因OsAHL的转基因水稻植株的抗逆性鉴定

鉴于水稻基因OsAHL位于抗旱QTL区段内，经过对IRAT109苗期干旱胁迫及成株期干旱胁迫下的基因进行了定量PCR分析，结果表明该基因在水分胁迫(干旱、低温及高盐)条件下表达时明显增加。因此对含水稻OsAHL基因的转基因水稻(中花11)苗期和成株期水分胁迫实验，分析水稻基因OsAHL的抗逆(包括但不限于抗旱、抗盐、耐低温等)作用。

1苗期抗逆性实验

转OsAHL基因水稻(中花11)苗期实验主要包括盐胁迫(150mM、200mM NaCl)，低温胁迫(4-10℃)，20％的PEG胁迫和土壤干旱胁迫等。实验结果表明，与野生型水稻(中花11)相比，转OsAHL基因水稻(中花11)抗性显著提高。在150mM NaCl以及低温分别处理7天，转基因株系生存状况优于对照株系，并且在恢复正常培养条件后，其恢复生长的速度明显高于对照株系。在200mM NaCl以及20％的PEG分别处理12天后，恢复正常培养条件，最终转基因株系植株的存活率明显高于对照株系。苗期的土壤干旱胁迫条件下，转基因株系的株高和生长量均高于对照株系；叶片死亡、卷曲程度比对照株系较轻。所以，苗期实验表明，转OsAHL基因水稻(中花11)在包括干旱、低温、高盐等在内的水分胁迫条件下，生长、生存状况明显优于对照水稻(野生型中花11)，表明了OsAHL基因能够明显提高水稻对水分胁迫耐受性。图5为转OsAHL基因水稻苗期抗逆实验结果。转基因水稻与对照植株四叶期时开始处理，其中：(A)200mM NaCl；(B)20％PEG，分别处理12天，然后恢复正常培养条件7天后统计存活率；(C)低温胁迫(4-10℃)7天，恢复7后统计的植株高度。*表示与同样处理条件下野生型植株相比，t检验p值小于0.05；**表示与同样处理条件下野生型植株相比，t检验p值小于0.01。

2成株期抗旱性实验

成株期水分胁迫实验，采用土壤自然干旱法。水稻在PVC(Polyvinyl chloride polymer)管中栽培生长。PVC管直径20cm，高100cm，底部封闭，两侧对称分布两排各3个排水孔，孔径1cm。水稻生长前期用橡皮塞封闭各个孔，干旱胁迫开始时，根据实验的需要从上至下依次拔掉各层的孔塞，最终保持75cm的土壤水位。每个PVC在装土前紧贴管内壁放入一条相同口径的聚乙烯塑料袋，以便于考种时整体取出管内土壤调查根系性状。实验用土是河沙(洗净晒干)与风干细筛后的水稻田耕作层土壤按照1∶3质量配比的混合壤土，并添加氮磷钾重量比为1∶1∶1的复合肥，充分搅拌混匀。每个PVC管装土38Kg(含复合肥25g)。播种前多次加水直至管内土壤饱和，每管种植一棵健壮苗并追施1g尿素，随时天浇水保证有水层覆盖。

实验材料种植方式：野生型和转OsAHL基因超表达株系(5个不同转化子株系)，每株系各种两组，每组5株，共10株。对其中的一组断水进行干旱胁迫处理，在植株进入幼穗分化期左右时形成水分胁迫；另外一组的材料作为对照按照正常栽培条件进行水分管理。胁迫处理：在胁迫的前将PVC管先灌满水，使土壤水分充分饱和，开始胁迫时打开排水孔并捅破里面的塑料袋以便排去水分，到野生型中花11出现明显胁迫症状时复水，直至收获。实验中对植株进行以下性状的考察：抽穗期、株高、分蘖数、有效穗数、生物学产量、单株产量、百粒重、每穗颖花数、每穗实粒数、结实率以及根长、根重和根体积等。

试验结果表明，在正常水分条件和干旱胁迫下，转OsAHL基因水稻(中花11)根系状况均优于对照水稻(野生型中花11)。在正常水分条件和干旱条件下生长的转OsAHL基因水稻，其表现在根系更长，根体积更大，深层根系发达，根系活力更强，这说明OsAHL基因能够增强水稻的避旱性。与对照水稻相比，在干旱条件下转OsAHL基因水稻(中花11)能够更好的保持细胞水分，结实率、百粒重、单株产量和生物学产量均明显提高，证明基因OsAHL能够明显提高水稻抗旱、耐旱能力。在恢复灌溉后，转OsAHL基因水稻与野生型中花11相比，叶片恢复到正常状况的比例更高、速度更快，而且能够迅速生长出更多高位分蘖，表明基因OsAHL促进水稻在水分胁迫伤害之后恢复生长，能提高植物的复原抗旱性。

成株期抗旱试验证明，水稻基因OsAHL能够提高植物的避旱、抗旱、耐旱和复原抗旱性。图6为干旱条件下OsAHL过量表达引起水稻的叶绿素含量变化，其中(A至C)代表叶绿素a、b和总叶绿素相对含量；(D)代表叶绿素a/b比率变化。误差线表示3次重复的标准误；*表示与同样处理条件下野生型植株相比，t检验p值小于0.05；#表示与对照条件下同株系材料相比，干旱处理后数值变化经t检验p值小于0.05。

图7为转OsAHL基因超表达水稻成株期干旱胁迫后表现，其中(A)为正常水分管理条件下野生型与转基因株系；(B)为成株期干旱胁迫条件下，野生型与转基因株系；(C)为成株期干旱胁迫条件下，野生型与转基因株系分蘖情况；(D)为野生型与转基因株系根系在正常水分和干旱条件下直观表现。

图8表示转OsAHL基因超表达植株成株期抗旱性提高，其中(A)为干旱胁迫后转基因植株结实率；(B)单株产量；(C)生物学产量(地上部分干重)；(D)百粒重。误差线表示4次(正常水分条件下)或者8次(干旱条件下)数据重复标准误。*表示与野生型植株相比，t检验p值小于0.05；**表示t检验p值小于0.01。(E)干旱胁迫后转基因水稻叶片相对含水量显著高于野生型对照。误差线表示3次重复标准误，*表示与野生型植株相比，t检验p值小于0.05。(F)与野生型对照相比，转基因水稻离体叶片水分散失速度较慢。平均值±标准差(n＝3)。

实施例6应用基因芯片检测转OsAHL基因水稻(中花11)中基因表达谱变化

1.幼苗培育

转OsAHL基因水稻(中花11)与对照水稻(野生型中花11)，置于35℃萌发48小时，然后播种于塑料桶土壤中，置于温室中，待水稻叶片为5-6片时，提取RNA。

2.RNA的提取：按照实施例1中的方法提取RNA。

3.芯片分析：转OsAHL基因水稻(中花11)与对照水稻(野生型中花11)材料分别取3个单株，共6份材料，提取RNA进行芯片杂交。选取水稻全基因组表达芯片Affymetrix Oryza sativa(Rice)57KGeneChip(Affymetrix，US)，由博奥生物有限公司(中国，北京)进行芯片杂交和信号扫描实验。

然后根据实验数据，分析、比较转OsAHL基因水稻(中花11)与对照水稻(野生型中花11)之间基因转录普的差异。

4.分析结果：转OsAHL基因水稻(中花11)与对照水稻(野生型中花11)之间在基因组上的差异主要是外源OsAHL基因的存在与否，所以其在转录谱上的差异是由OsAHL的超表达引起的。实验发现，由于OsAHL基因的过量表达，引起了包括OsGLK2等在内的调节叶绿体发育相关基因的上调表达。通过PATHWAY分析发现，转OsAHL基因水稻(中花11)与对照水稻(野生型中花11)相比，相关基因变化最明显的是光合作用(p＝0.0000042)和光合系统Ⅱ(p＝0.0002)代谢途径，均达到极显著差异表达水平。

表4

表4为转OsAHL基因水稻(中花11)与对照水稻(野生型中花11)相比，表达量明显上升的部分基因，其中包括转录调节因子和叶绿体发育相关基因。

通过以上实验可以证明OsAHL基因能够调节其它一些逆境相关转录因子，直接或间接调节控制叶绿体发育以及光合作用相关功能蛋白和酶系统的表达。

实施例7酵母双杂交实验验证OsAHL蛋白能够形成同源聚合物

酵母菌株为YRG-2(MATα，ura3-52，his3-200，ade2-101，lys2-801，trp1-901，leu2-3112，gal4-542，gal80-538，LYS2::UASGAL1-TATA_GAL1-HIS3，URA3::UAS_{GAL4 17mers(x3)}-TATA_CYC1-lacZ)，购自Stratagene公司(Stratagene，La Jolla，CA)。

具体实验操作为：构建含完整OsAHL蛋白或OsAHL蛋白部分功能区域导入到pBD-GAL-ΔAHL以及pAD-GAL-2.1-ΔAHL的酵母双杂交载体，将其分别组合(图9)、转化导入酵母菌株YRG-2，阳性转化子SC-Leu-Trp培养基上生长3-5天诱导出孢，诱导后在SC-Leu-Trp-His(含30mM 3-AT)培养基上检测其互作效果。实验结果如图10所示，表明OsAHL蛋白及其DUF296结构域具有同源结合能力。

通过以上实验可以证明OsAHL基因能够调节其它一些逆境相关转录因子，直接或间接调节控制叶绿体发育以及光合作用相关功能蛋白和酶系统的表达。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>上海市农业生物基因中心

<120>水稻OsAHL蛋白及其应用

<130>KHP10112551.6

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>366

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<220>

<221>AT-hook motif

<222>(107)..(119)

<220>

<221>DUF296

<222>(137)..(256)

<400>1

Met His Met Glu Gly Gly Glu Gly Ile Ala Val Ala Gly Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Gly His Glu Ala Gly Phe Gly Leu Phe Arg Ala Ala Asp Val Thr Met

            20                  25                  30

Thr Glu Ala Gln Glu Ala Ala Lys Glu Tyr Gln Ser Ser Pro Ser Ser

        35                  40                  45

Pro Ser Thr Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Pro Val Ala Ala Ser Gly

    50                  55                  60

His Gly Gly Glu Ala Ala Ala Thr Pro Thr Met Trp Ser Leu Gly Gly

65                  70                  75                  80

Glu Lys Met Pro Ser Glu Ala Ala Gly Asp Asn Gly Met Gln Met Ser

                85                  90                  95

Gly His Ser Glu His Ala Ser Leu Ser Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg

            100                 105                 110

Pro Lys Gly Ser Gly Arg Arg Gln Ile Leu Ala Thr Leu Gly Glu Trp

        115                 120                 125

Tyr Ala Leu Ser Ala Gly Gly Ser Phe Thr Pro His Val Ile Ile Val

    130                 135                 140

Gly Thr Gly Glu Asp Val Ala Gly Arg Ile Met Ser Phe Ser Gln Lys

145                 150                 155                 160

Gly Pro Arg Ser Ile Cys Ile Leu Ser Ala Asn Gly Thr Ile Ser Asn

                165                 170                 175

Val Ala Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Gly Ser Thr Phe Thr Tyr Glu

            180                 185                 190

Gly Arg Phe Glu Ile Leu Gln Leu Thr Gly Ser Phe Thr Met Ala Glu

        195                 200                 205

Glu Gly Gly Arg Arg Arg Thr Gly Gly Leu Ser Val Ser Leu Ala Gly

    210                 215                 220

Pro Asp Gly Arg Val Val Gly Gly Val Val Ala Gly Met Leu Arg Ala

225                 230                 235                 240

Ala Ser Pro Ile Gln Val Ile Val Gly Ser Phe Leu Pro Asn Ser Leu

                245                 250                 255

Lys Gln His Gln Arg Arg Met Gly Leu Gln Gln Gln Pro Ser Ala Ala

            260                 265                 270

Pro Ala Leu Pro Pro Pro Met Ala Pro Pro Pro Val Leu Thr Ala Ala

        275                 280                 285

Met Pro Ile Ser Gln Ala Ala Pro Gly Thr Asn Gly Cys His Ala Pro

    290                 295                 300

Gln Val Ser Ser Met His Pro Gln Ala His Thr Gly Val Met Glu His

305                 310                 315                 320

Ser Ala Thr Ala Ser Gly Ala Met Asn Leu Asn Ser Ser Ser Ser Thr

                325                 330                 335

Gly Phe Thr Met Val Gly Trp Pro Val Ser Ser Gln Ser Met Gly His

            340                 345                 350

Arg Pro Ser Pro Asp Ile Asn Val Cys Leu Thr Pro Gln Glu

        355                 360                 365

<210>2

<211>1331

<212>DNA

<213>Oryza satiVa

<400>2

gccaagaaac accataaaga agagagtgag agagagtgtg tgtgtgagag gaggtgagct    60

tctctcacat gcacatggag ggaggggagg gcattgctgt agcaggtgca ggtggtggcc    120

atgaagccgg cttcggtttg ttcagagcgg ccgatgtgac catgacagag gcgcaagaag    180

cagccaagga gtaccagtct tctccctcct cgccgtcgac gtctcctact ccttccccgc    240

cgccggttgc tgcctccggc catggagggg aggccgctgc aacgccgacc atgtggagtt    300

tgggcggcga gaagatgccg agtgaggctg caggggacaa cggcatgcag atgtcaggcc    360

acagtgagca tgctagcttg agctccggac ggcgtagggg ccggccaaaa gggtccggga    420

gacgccagat cctagccact ctaggggaat ggtatgcgct atcagctgga gggagcttca    480

cccctcatgt catcatcgta ggcacagggg aggatgtggc ggggcgcata atgtccttct    540

ctcagaaggg tccacgctcg atttgcatcc tctctgccaa tgggaccatc tccaatgtgg    600

cattgagcca gcctggctcg tccggtagca ccttcaccta cgagggtcgg tttgagattc    660

tgcaactgac tggctccttt acaatggcgg aagaaggtgg tcggaggaga actggtgggc    720

tcagtgtatc gcttgccggt cctgatggcc gtgtcgttgg tggtgtagta gctgggatgc    780

tgcgtgccgc aagccctatt caggtgattg tggggagctt cctgcccaac agcctaaagc    840

agcatcagag gaggatgggc ctacaacagc aaccatctgc tgccccggca ctaccaccgc    900

ctatggctcc acctcctgtg ctcacagctg caatgcctat ctctcaggca gctcctggaa    960

ctaatggttg ccatgcgccg caggtctcat ctatgcatcc gcaagcccac accggtgtaa    1020

tggagcacag tgcaacagcc agtggcgcca tgaaccttaa cagctcaagc tccacaggtt    1080

tcaccatggt tgggtggcca gtcagctcac agtccatggg gcacaggcct tcacctgaca    1140

tcaatgtctg cttaactcct caggagtagc atcagctatt gagctatcat cttttgtcac    1200

ccccatccct gacacatttt gtagggcatg gctgttaatc tttgccatgt gcgatgacaa    1260

attatgggct ctattctaat ccattaggtc tgcggtttaa ttttgggggg agaaactagg    1320

caagactaag g                                                         1331

 

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>OrVza sativa

<400>3

gccaagaaac accataaag                                                 19

 

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Orvza sativa

<400>4

ccttagtctt gcctagtttc tc                                             22

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ctggtgggct cagtgtatcg                                                20

 

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gccataggcg gtggtagtg                                                19

Claims (10)

1.水稻OsAHL蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的水稻OsAHL蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其编码的核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的从69-1169位的核苷酸序列具有至少70％的同源性。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No.2所示的从69-1169位的核苷酸序列。

5.一种核酸探针分子，其特征在于，其含有权利要求2-4任一项所述水稻OsAHL基因编码序列的8-100个连续核苷酸。

6.含有权利要求2-4任一项所述基因的载体。

7.含有权利要求6所述载体的宿主。

8.含有权利要求2-4任一项所述基因的转化植物细胞。

9.权利要求2-4任一项所述的基因在提高植物抗逆性中的应用。

10.权利要求2-4任一项所述的基因在调节植物叶绿体发育相关基因表达，增强光合系统活性和稳定性中的应用。

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