CN109456983A - 大豆GmERF10基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及大豆GmERF10基因及其应用。本发明提供了一种大豆GmERF10基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1；本发明还提供了所述大豆基因在植物抗旱中的应用。本发明为大豆抗旱性鉴定、挖掘与作物抗旱相关的基因及发现其作用机制提供更多的理论依据，对揭示大豆基因的功能、利用基因工程技术改良大豆抗旱性等具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及大豆GmERF10基因及其应用。
背景技术
大豆是中国重要粮食作物之一，至今已经有五千多年的历史。大豆含有丰富的植物蛋白质，是食品粮油的主要来源。中国东北作为主产区，占全国种植面积的40％。但近些年，由于环境条件的不断恶化，大豆经受多种不良环境胁迫，导致产量受到影响。尤其是低温、高盐、干旱等胁迫环境严重影响了大豆的生长发育,常规育种方法并不能有效解决大豆抗胁迫机能，而利用基因工程技术将与抗胁迫相关基因转入到大豆植株中，能有效的缓解大豆抗胁迫环境能力。
植物进化过程中，在不同环境条件下，植物通过自身生理调节和基因的表达以达到对某些环境胁迫因子的适应能力。植物在生长发育过程中，在遭受干旱胁迫时，植物在染色体DNA水平、转录水平及转录后水平上产生一系列生理上的应答反应，而这个过程中转录因子起到至关重要的作用。当植物感受到外界环境的胁迫，转录因子的表达将会得到激活,被激活的转录因子结合与其相应的顺式元件,使下游基因得到表达，从而调控了植物的生长发育和生理生化状态。转录因子的表达调控范围比功能性蛋白更广，其能影响所有下游相关的抗逆基因的表达，对植物转录因子的研究有助于帮助植物应对胁迫环境。
目前发现的与抗旱基因相关的转录因子有几大类：AP2/ERF家族，NAC，MYB，MYC，锌指蛋白等，ERF属于AP2/ERF转录因子超家族的一员，是植物中一个较大的转录因子家族，仅含1个AP2/ERF的DNA结构域，不同家族保守区域的氨基酸具有各自不同的特点，它主要通过ERF结合域结合顺式作用元件GCC-box或DRE/CRT来调节抗性基因的表达。ERF转录因子最开始是在烟草中发现的，在AP2/ERF转录因子超家族中，AP2/ERF转录因子基因在非生物和生物因素胁迫诱导下产生，例如：干旱、高盐、机械损伤、低氧、低温以及乙烯、茉莉酸、脱落酸等胁迫相关的激素，AP2类的转录因子主要在调节发育过程中起作用，而ERF转录因子家族主要参与环境胁迫和激素刺激的过程，如低温、干旱、高盐等胁迫过程。
乙烯应答转录因子在大豆抗非生物胁迫过程中发挥着重要的作用，近年来研究表明发现很多ERF转录因子都参与了植物的盐和干旱胁迫以及其他激素途径。在大豆中ERF转录因子家族就已经发现了9个不同的基因，Mazarei等发现在大豆中GmEREBP1超表达可以提高转基因大豆对胞囊线虫的抗性。鹿丹等GmERF2在转入拟南芥中具有抗旱性，zhang等证明了转GmERF3基因的烟草可以提高对高盐和干旱的抗性，还可提高转基因烟草对青枯病、赤星病和TMV的抗性；Zhang,G等研究表明GmERF4转入到烟草中具有抗旱和耐盐功能；YingZhai等实验证明转GmERF5/6/7/8/9基因作为转录调控因子均参与大豆生物和非生物胁迫的应答。为丰富大豆ERF家族基因库，并且为增强大豆抗胁迫性，发现并研究大豆ERF基因尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大豆GmERF10基因及其应用，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物的抗旱能力。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
大豆GmERF10基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
编码上述大豆GmERF10基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有本发明所述的大豆GmERF10基因的表达载体。
本发明所述的GmERF10基因在植物抗旱中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明成功地将ERF基因转入大豆中，获得一种大豆新基因GmERF10，该目标基因的过表达及干扰影响大豆株系在干旱胁迫下的生理生化指标的变化，使转过表达基因株系脯氨酸含量提高，ABA含量也随之提高，使细胞缓冲能力和膜保护得到提高，从而提高了转过表达目的基因的抗旱能力。本发明为大豆抗旱性鉴定、挖掘与作物抗旱相关的基因及发现其作用机制提供更多的理论依据，对揭示大豆基因的功能、利用基因工程技术改良大豆抗旱性等具有重要意义，解决现在干旱等胁迫环境导致大豆减产等问题。
附图说明
图1克隆载体PCR检测；M：DL2000DNA marker，1-5克隆载体质粒；
图2过表达载体结构图；
图3过表达载体鉴定图；A：酶切鉴定图，M：DL2000DNA marker，1-2：重组质粒；B：PCR鉴定图，M：DL2000DNA marker，1-3：重组质粒；
图4干扰表达载体结构图；
图5干扰载体鉴定图；A：PCR鉴定图，M：DL2000DNA marker，1-2：正义片段，3-4：内含子片段，5-6：反义片段；B：酶切鉴定图，M：DL2000DNA marker，1-3：重组质粒；
图6农杆菌介导法过程图；A：萌发，B：预培养，C：共培养，D：筛选，E：伸长，F：生根，G：移栽；
图7过表达载体基因的PCR检测；A：35S启动子，M：DL2000DNA marker，1：过表达质粒，2：水，3：CK，4-8：转化植株；B：终止子Nos，M：DL2000DNA marker，1：过表达质粒，2：水，3：CK，4-7：转化植株；C：标记bar，M：DL2000DNA marker；1：过表达质粒，2：水，3：CK，4-8转化植株；
图8过表达载体Southern blot检测结果图；1：Maker，2：质粒，3：阴性对照，4-7：转化植株；
图9干扰载体PCR鉴定图；A：35S启动子，M：DL2000DNA marker，1：干扰质粒，2：水，3：CK，4-9：转化植株；B：终止子Nos，M：DL2000DNA marker，1：干扰质粒，2：水，3：CK，4-8：转化植株；C：标记bar，M：DL2000DNA marker，1：干扰质粒，2：水，3：CK，4-8转化植株；
图10干扰表达载体Southern blot检测结果图；1：Maker，2：质粒，3：阴性对照，4-6：转化植株；
图11转基因植株目标基因qRT-PCR检测图；
图12复水情况图；A：干旱0天，B：干旱7天，C：干旱7天复水，D：干旱13天，E:干旱13天复水，F:干旱17天，G：干旱17天复水；图A-E中，如图中从左→右依次为CK未处理、CK处理、过表达未处理、过表达处理、干扰表达未处理、干扰表达处理；图F、G中，如图中从左→右依次为CK未处理、CK处理、过表达未处理、过表达处理；
图13干旱胁迫下ABA含量；
图14干旱胁迫下脯氨酸含量；
图15干旱胁迫下干物质重。
具体实施方式
以下结合具体实施方式本发明做进一步说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验材料为大豆品种吉农18(吉审豆2006009)、大豆抗旱突变体M18(以吉农为试验材料，在承担的国家自然科学基金“大豆7S贮藏蛋白基因RNAi表达调控及特异种质创新”(30971805)项目实施中获得1株抗旱突变体，M18是该突变体后代经连续培育筛选获得的一稳定突变系)。
PCR扩增试剂盒、限制性内切酶bglII、bsteII，基因组试剂盒，2000分子量DNAmaker,DNA回收试剂盒，质粒提取试剂盒，琼脂糖凝胶，均由库美提供。
大肠杆菌菌种DH5α，农杆菌菌种EHA，pMD-18T克隆载体，pCANBIA3301表达载体，由吉林农业大学植物生物技术实验室保存并提供。
引物由库美公司合成提供，用Primer5.0设计引物，具体见表1。
表1相关引物序
实施例1大豆GmERF10基因的克隆
以大豆根系突变体RM18为试验材料，利用RNA-seq筛选与苗期大豆根系生长发育相关的显著差异表达基因，克隆大豆来源的促苗期根系发育的关键基因，本实验的乙烯应答因子基因便是其中之一，基因开放阅读框序列如下：
ATGGTGAAG TCGAAGAGCG TGGAGAAACC TGCGGAGGAA CAACAACGAG GTGGTGTTTCAGCGTACAGA GGAGTACGGA AGAGGAAGTG GGGGAAGTAC GTGTCGGAAA TTAGGCTGCC CAACAGCCGTCAAAGGATTT GGTTGGGTTC CTACGACAGC GCCGAAAAGG CGGCGCGTGC ATTCGACGCG GCCATGTTCTGCTTACGTGG CAGCGGTGCC AACTTTAATT TCCCGAGCGA CCGGCCCAAC ATCGCTGGCG GGAGGAACATGACGCCCTCG CAGATTCAGATCGCCGCGGC GCGTTTCGCC AATTCGGAGC CCCGAAAGGAGTGTTCGGGTAAACCCGTGG AGTCTTTGAC TTCGATTGAG GAAACGACGT CGTTTCCAGT AAATTCGGATACGGATACAT CTTCTCCTCT ATCAGTAGTG ACGATCCAAA ACGACACCGA
AGTAGCAACC GGGTCGTTTC CGGGTATATT TTCGGGTTTC GGGTCGGGTA ATTTCGTCCCCGAATTCTCC GATTTTCCGA GCTTCGATGA TTTCGGCCAC GATTTCTTCG TGCATGAGCT TCCGGGTTTCGATTACGGAG AAGAGAACTT GGATGGGTTG ATAATTCAGG ACTCGTTCCT GTGGAATTTC TAA
将基因在NCBI上比对，得到其为一个大豆乙烯应答因子基因，应用库美公司试剂盒提取大豆“突变体18”叶片基因组，利用Primer5.0设计克隆载体引物，之后以大豆“突变体18”为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件见表2，获得753bp片段，将扩增的凝胶电泳产物回收纯化，并连接到pMD-18T克隆载体上，挑取单菌落，提取质粒送到库美公司测序，将测序结果用DNAMAN分析，并进行PCR检测。
提取M18大豆嫩叶基因组，按表2扩增条件PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳产物回收纯化，连接到pMD-18T中，得到克隆载体。对转入克隆载体的质粒进行PCR鉴定，在633bp位置有条带，见图1，与开放阅读框片段大小一致，表明大豆ERF基因克隆成功，命名为GmERF10。
表2 PCR扩增条件
实施例2ERF过表达载体的构建
分别提取基因ERF和pCAMBIA3301质粒，采用CE-Design设计带有同源臂的引物，并扩增ERF片段，扩增条件如表2；将pCAMBIA3301用BglII和BsteII酶切，之后1％凝胶电泳回收，用无缝试剂盒以3：1比例连接纯化的ERF基因和酶切的pCAMBIA3301，挑取单菌落，提取质粒送到库美公司测序，将测序结果用DNAMAN分析以及PCR检测。载体构建图如图2所示。
以过表达重组质粒为模板，用BglII和BsteII进行双酶切鉴定，在700bp(含同源臂序列)位置左右有条带，见图3，与预计的片段大小一致，说明过表达载体构建成功。
实施例3干扰载体的构建
分别提取基因ERF和pCAMBIA3301质粒，并用CE-Design设计正义、反义、内含子引物，并分别进行基因片段扩增，扩增条件如表2，之后将扩增后的产物用无缝试剂盒以3:1的比例连接到pCAMBIA3301质粒上，挑取单菌落，提取质粒送到库美公司测序，将测序结果用DNAMAN分析，并进行酶切及PCR检测。载体构建图如图4所示。
以干扰重组质粒为模板，用BglII和BsteII进行双酶切及PCR鉴定，PCR检测在相应的位置均出现了条带(正义508bp；内含子200bp左右；反义508bp)，双酶切结果在1216bp左右有条带(正义+反义+内含子)，见图5，说明干扰表达载体构建成功。
实施例4遗传转化及分子检测
采用农杆菌介导法将ERF过表达及干扰基因分别转到JN18中，获得转化再生植株，过程见图6。
1.转过表达基因植株分子检测
1.1PCR检测：
以转化株系DNA为模板，以ERF过表达质粒为阳性对照，以受体吉农18为阴性对照，以无菌水为空白对照，分别对标记基因bar、启动子35s、终止子nos进行检测，扩增条件见表2，转化植株的条带均与预期位置大小相符，结果如图7，经过PCR检测获得过表达T0阳性植株6株，将收获的T0代种子于人工气候室加代，经PCR检测得到10株T1代过表达阳性植株，将得到的T1代种子种于人工气候室加代，得到40株T2代过表达阳性植株。说明过表达ERF基因已成功转化到受体植株中。
1.2过表达Southern blot检测
对PCR检测为阳性的T2代转基因植株的DNA进行酶切，以纯化的Bar为探针，以含有目的基因的质粒作为阳性对照，以JN18植株基因组为阴性对照。结果如图8，发现有多个杂交信号，并且位置单一、各不相同，说明基因以单拷贝的形式整合到大豆基因组中，并在不同位置发生整合，但是杂交信号的强弱不同。
2.转干扰表达植株分子检测
2.1PCR检测
通过农杆菌介导法获得转干扰表达阳性植株，对筛选标记基因Bar、启动子35S和Nos分别进行PCR检测，获得T0代植株10株，T1代阳性干扰表达植株12株，46株T2代干扰表达阳性植株。结果如图9。
2.2干扰表达Southern blot检测
对T2代转干扰基因阳性植株southern杂交检测，对筛选标记基因Bar进行Southern杂交分析，进一步验证基因在植株中的整合情况。杂交结果显示T2代植株均有明显的杂交信号，且杂交条带的大小、位置互不相同，说明基因已经以单拷贝的形式整合到大豆的基因组中。结果如图10。
3.qRT-PCR检测
对Southern杂交结果检测到有阳性信号的转基因植株、受体植株的根、茎、叶提取RNA，反转录为cDNA，以吉农18为对照，以β-Actin为内参基因，利用Primer Quest Tool对内参基因及目的基因进行特异性引物设计，其序列
Forward GGGTCGTTTCCGGGTATATTT
Reverse GAAGCTCATGCACGAAGAAATC
内参基因
QFACT ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC
QRACT GCTGGTCCTGGCTGTCTCC
扩增条件为95℃3min；95℃40s；55℃40s；35个循环。
利用All-in-OneqPCRMix试剂盒方法进行试验，三次重复，得到相应的Ct值之后，通过相对定量中的法计算定量结果。结果如图9，在大豆植株根、茎、叶中，设定受体植株的ERF基因表达量为1，其他转基因阳性植株的表达量都与这个设定值进行对比，结果如图所示在根中过表达、对照、干扰的表达量平均值依次为4.07、1、0.635，茎中依次为2.83、1、0.573，叶中依次为7.341、1、0.845，如图11结果表明，基因的相对表达量与对照相比差异显著，说明过表达ERF基因和干扰表达ERF基因在植株中得到表达。
实施例5转基因大豆的抗胁迫性
采用盆栽法对苗期大豆植株模拟干旱试验。
(1)种子的选取：选取转过表达及干扰表达基因种子，保证选取的种子大小及饱满度一致。对选取的种子用75％酒精消毒，用滤纸擦干，备用。
(2)种植及处理：选用同种花盆，保证每盆的土重量相同，种植之前浇透水。每盆种五粒，三次重复。在大豆三叶期时，对大豆进行干旱胁迫处理。
(3)观察及处理：胁迫结束后复水三天，观察幼苗的复水情况；测量幼苗干物质重、脯氨酸含量和ABA含量。
1.复水情况分析如图12，干旱处理0天，植株生长情况无明显差异；在人工气候室干旱处理7天，发现转入过表达ERF基因的阳性植株萎蔫不明显，复水三天后，植株完全得到恢复；对照吉农18略有萎蔫，复水三天后，萎蔫程度有较明显改善；然而转入干扰ERF基因的阳性植株干旱处理7天后，相比对照吉农18,萎蔫严重，且复水三天后，萎蔫程度改善并不完全。干旱处理13天后，发现转入干扰表达ERF基因的阳性植株萎蔫程度严重，已接近死亡，且复水三天后，萎蔫程度没有得到改善；对照吉农18萎蔫程度较明显，复水三天后，萎蔫程度有所恢复；然而，转入过表达ERF基因的阳性植株略有萎蔫，复水三天后，植株萎蔫程度得到明显恢复。干旱17天后，对照吉农18萎蔫程度严重，复水三天后，无明显改善，植株已接近死亡；转过表达ERF基因有较大程度萎蔫，复水三天后，萎蔫程度有所改善。
2.ABA含量
如图13，对转干扰表达载体植株、转过表达植株、对照植株进行干旱处理，干旱处理0天，各植株的ABA含量无明显差异；干旱处理7天后，转过表达载体植株明显高于对照植株，转干扰植株明显低于对照植株；干旱处理13天转过表达植株ABA含量显著高于对照植株；干旱处理17天，相比于未干旱处理的植株ABA含量增加了8.8倍。
3.脯氨酸含量
在人工气候室干旱处理0天、7天、13天和17天后结果如图14，0天处理情况下，转过表达ERF基因，转干扰表达ERF基因与对照植株吉农18并没有明显差别。干旱环境处理7天后，转过表达ERF基因，转干扰表达ERF基因与对照植株脯氨酸含量均有所上升，脯氨酸平均值表现为转过表达ERF基因＞对照植株＞转干扰表达ERF基因，且差异达到显著水平；干旱处理13天后，大豆株系的脯氨酸含量均显著增加，且已达到极显著水平；干旱处理17天，转过表达ERF基因株系相比0天干旱处理株系提高了9倍。说明在干旱胁迫下，转过表达ERF基因大豆株系能够积累较多的脯氨酸，抗旱能力更强。
4.干物质重
如图15，干旱处理0天，各植株干物质重无明显差异，干旱处理后各植株干物质重均表现为转过表达ERF基因＞对照植株＞转干扰表达ERF基因，且转过表达ERF基因干物质积累量明显高于对照植株。
ERF转录因子可能促进ABA形成，从而促进脯氨酸合成，通过脯氨酸含量的积累，使细胞缓冲能力和膜保护得到提高，从而提高了转过表达目的基因的抗旱能力。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 大豆GmERF10基因及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgaagt cgaagagcgt ggagaaacct gcggaggaac aacaacgagg tggtgtttca 60
gcgtacagag gagtacggaa gaggaagtgg gggaagtacg tgtcggaaat taggctgccc 120
aacagccgtc aaaggatttg gttgggttcc tacgacagcg ccgaaaaggc ggcgcgtgca 180
ttcgacgcgg ccatgttctg cttacgtggc agcggtgcca actttaattt cccgagcgac 240
cggcccaaca tcgctggcgg gaggaacatg acgccctcgc agattcagat cgccgcggcg 300
cgtttcgcca attcggagcc ccgaaaggag tgttcgggta aacccgtgga gtctttgact 360
tcgattgagg aaacgacgtc gtttccagta aattcggata cggatacatc ttctcctcta 420
tcagtagtga cgatccaaaa cgacaccgaa gtagcaaccg ggtcgtttcc gggtatattt 480
tcgggtttcg ggtcgggtaa tttcgtcccc gaattctccg attttccgag cttcgatgat 540
ttcggccacg atttcttcgt gcatgagctt ccgggtttcg attacggaga agagaacttg 600
gatgggttga taattcagga ctcgttcctg tggaatttct aa 642
<210> 2
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Lys Ser Lys Ser Val Glu Lys Pro Ala Glu Glu Gln Gln Arg
1 5 10 15
Gly Gly Val Ser Ala Tyr Arg Gly Val Arg Lys Arg Lys Trp Gly Lys
20 25 30
Tyr Val Ser Glu Ile Arg Leu Pro Asn Ser Arg Gln Arg Ile Trp Leu
35 40 45
Gly Ser Tyr Asp Ser Ala Glu Lys Ala Ala Arg Ala Phe Asp Ala Ala
50 55 60
Met Phe Cys Leu Arg Gly Ser Gly Ala Asn Phe Asn Phe Pro Ser Asp
65 70 75 80
Arg Pro Asn Ile Ala Gly Gly Arg Asn Met Thr Pro Ser Gln Ile Gln
85 90 95
Ile Ala Ala Ala Arg Phe Ala Asn Ser Glu Pro Arg Lys Glu Cys Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Val Glu Ser Leu Thr Ser Ile Glu Glu Thr Thr Ser Phe
115 120 125
Pro Val Asn Ser Asp Thr Asp Thr Ser Ser Pro Leu Ser Val Val Thr
130 135 140
Ile Gln Asn Asp Thr Glu Val Ala Thr Gly Ser Phe Pro Gly Ile Phe
145 150 155 160
Claims (4)
1.大豆GmERF10基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.编码权利要求1所述的大豆GmERF10基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含权利要求1所述大豆GmERF10基因的表达载体。
4.权利要求1所述的大豆GmERF10基因在提高植物抗旱能力中的应用。
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-
2018
- 2018-12-25 CN CN201811588491.0A patent/CN109456983A/zh active Pending
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