CN110468138B - 控制水稻耐冷性的基因tsg2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供控制水稻耐冷性的基因TSG2及其应用。基因TSG2的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明首次发现了一个新的控制水稻耐冷性的基因TSG2，为作物耐冷性遗传改良提供了新的基因位点。

Description

控制水稻耐冷性的基因TSG2及其应用

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体地说，涉及控制水稻耐冷性的基因TSG2及其应用。

背景技术

水稻作为主要粮食作物之一，起源于热带或亚热带地区，相对其它作物而言对低温非常敏感。随着不同地区人们对大米的消费需求，水稻在高纬度地区种植面积逐渐增大，冷害问题也就越来越突出。一般来说，水稻适宜生长温度在25℃～30℃，过低就会影响植物各种生理过程，造成苗期植物死亡和穗期灌浆不充分结实率低等问题。在我国，大面积水稻均面临冷害影响，包括我国东北高纬度地区以及南方地区的部分晚稻品种。因此，耐低温是水稻育种工作的重要改良目标之一。

随着分子辅助育种的日益成熟以及分子设计育种的逐渐兴趣，克隆耐低温相关基因显得尤为重要。然而，由于影响耐低温的生物学过程复杂，可能受多个微效数量性状基因控制，并且耐低温性状鉴定相对困难，在不同时期并不相同，导致水稻耐低温基因克隆进展缓慢。COLD1编码一个G蛋白信号调节因子，它能与G蛋白α亚基RGA1互作，促进Ca2+内流并增强G蛋白的GTP酶活性，进而增强水稻的耐寒性。qLTG3-1编码一个富含甘氨酸(GRP)的保守结构域蛋白，第17位氨基酸的差异(L17H)决定了水稻在低温条件下种子萌发的强与弱。OsGSTZ2第99位的苯丙氨酸(Ile)对提高水稻苗期耐低温起重要作用。LTG1编码酪蛋白激酶Ⅰ，其编码区357位的氨基酸替换(I357K)对于低温环境下水稻的生长速率、抽穗期和产量都有重要的影响。CTB1编码一个含有F-box结构域的蛋白，它与一个E3泛素连接酶亚基Skp1互作，参与泛素-蛋白酶体途径的低温信号传导。CTB4a编码一个保守的富亮氨酸受体样激酶LRR-RLK(leucine-rich repeat receptor-like kinase)，其与ATP合成酶的β亚基AtpB互作，影响ATP合成酶的活性，为低温下水稻灌浆提供能量供应。

ABA作为逆境相关主要激素，在低温逆境中扮演着重要角色。一般而言，在低温逆境下，维持相对低的ABA水平有利于提高水稻对低温的耐受力。例如，研究发现，类胡卜素(ABA合成的前体)的突变体phs1、phs2、phs3-1与phs4在苗期和生殖生长期水稻内源ABA水平降低，但对低温的耐受性有所提高。过量表达OsNAC095提高水稻幼苗内源ABA水平，却使水稻对低温敏感。其它激素可能也参与到水稻耐冷过程，并在平衡植物耐冷性与生长发育过程中起着重要作用，但目前报道尚少，为耐冷性水稻改良造成了障碍。

现已克隆的耐冷基因数目仍然非常有限，并且每个基因其影响的方面存在差异，在不同背景下功能可能也不相同，限制了其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种控制水稻耐冷性的基因TSG2及其应用。

为了实现本发明目的，本发明控制水稻耐冷性的基因TSG2，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的基因TSG2来源于水稻粳稻中花11(Oryza Sativa L.)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

不同水稻品种来源或不同植物来源的，与SEQ ID NO:1序列相似性大于90％的TSG2等位基因也属于本发明保护范围。

本发明还提供基因TSG2在耐低温水稻育种中的应用，其是利用基因工程手段，对水稻基因TSG2进行定点突变，使得该基因功能缺失，来实现对水稻耐冷性的遗传改良。

具体地，本发明的技术方案是指在野生型水稻中花11背景下，通过CRISPR/Cas9或其它基因编辑手段或RNA干扰方法等，将植物体内TSG2或其相似基因进行沉默或敲除后，导致基因丧失功能，从而大大提高水稻的耐冷性。

本发明还提供一种提高水稻耐冷性的方法，利用基因工程手段，对水稻基因TSG2进行定点突变，使得该基因功能缺失，从而提高水稻的耐冷性。

前述的方法，针对水稻中的目标基因TSG2设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化水稻(如中花11)，实现对水稻基因TSG2的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因水稻植株。

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GCCATGGGAAATGCGGTTAAGGG-3’。

优选地，水稻基因TSG2发生定点突变后，sgRNA作用位点的核苷酸序列由5’-GCCATGGGAAATGCGGTTAAGGG-3’突变为5’-GCCATGGGAAATGCTAAGGG-3’或5’-GCCATGGGAAATGCTTAAGGG-3’(SEQ ID NO:3-5)。

优选地，所述携带CRISPR/Cas的载体为pBGK032。载体pBGK032参见Yuming Lu,Xiao Ye,Renming Guo,Jing Huang,Wei Wang,Jiuyou Tang,Longtao Tan,Jian-kangZhu,Chengcai Chu,Yangwen Qian，Molecular Plant,2017,DOI:10.1016/j.molp.2017.06.007。

本发明还提供基因TSG2敲除载体，所述敲除载体是以水稻基因TSG2为靶点设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体(如pBGK032)中构建得到的；其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GCCATGGGAAATGCGGTTAAGGG-3’。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次发现了一个新的控制水稻耐冷性的基因TSG2，为作物耐冷性遗传改良提供了新的基因位点。将TSG2在水稻中花11背景下通过CRISPR/Cas9进行敲除后导致其基因功能丧失，获得多个功能丧失的等位基因突变体TSG2。将突变体和野生型水稻培养到10天左右，进行4℃冷处理3天，再转移到正常培养条件下恢复培养一周，结果表明野生型植株在此条件下存活率不到10％，而突变体存活率可达60％-80％。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中基因TSG2靶位点基因编辑结果。

图2为本发明较佳实施例中转基因株系tsg2-1和tsg2-2与野生型水稻的耐冷性比较结果。

图3为本发明较佳实施例中转基因株系tsg2-1和tsg2-2与野生型水稻对ABA的敏感性测试结果。

图4为本发明较佳实施例中转基因株系tsg2-1和tsg2-2与野生型水稻的种子萌发对ABA的敏感性测试结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1提高水稻耐冷性的方法

1、TSG2靶位点的基因编辑

选取TSG2基因(SEQ ID NO:1)上5’-GCCATGGGAAATGCGGTTAAGGG-3’序列为靶位点(其中下划线为符合NGG的PAM序列)，合成sgRNA，导入到包含有Cas9酶表达框的CRISPR/Cas9敲除载体pBGK032中，转化到农杆菌中，侵染水稻中花11成熟胚愈伤组织，再生后获得转基因株系。转化方法参见Nishimura,A.,Aichi,I.,and Matsuoka,M.,Natureprotocols,2006,1,2796-2802.

2、TSG2基因功能缺失纯合突变体的鉴定

提取得到的T0代转基因植株叶片总DNA为模板，用引物HPT-F(5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’)和引物HPT-R(5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’)组成的引物对进行PCR扩增，筛选得到T0阳性转基因植株(阳性植株PCR扩增产物大小为845bp)。以阳性植株的DNA为模板，在TSG2靶位点两端设计引物(TSG2-F:5’-TTGGGTGACGTACTTGGTGA-3’；TSG2-R:5’-AAGCATCCGAGTTCACAGGA-3’)，扩增后进行测序，筛选发生突变的株系。T0代自花授粉得到T1代，T1代自花授粉得到T2代。对T2代植株再次进行筛选，获得转基因阴性(T-DNA插入分离)但TSG2靶位点发生纯合突变体的独立株系二个，命名为tsg2-1和tsg2-2，其中tsg2-1在靶序列处发生了3个碱基的删除，导致编码基因第177位精氨酸R缺失，tsg2-2在同样位置发生了2个碱基的删除，导致编码蛋白从R177位开始移码(图1)。

3、转基因株系tsg2-1和tsg2-2的耐冷性实验

将tsg2-1和tsg2-2以及野生型对照中花11种子在37℃黑暗浸种萌发后，每个株系与野生型各对半铺于去掉底部的96孔塑料板中，在光照培养箱中使用1/2MS营养液水培10天，温度30℃，12h光/12h暗。10天后转移到4度冷室中光照培养3天(72h)，随后取出恢复正常条件培养7天。此时野生型接近完全死亡，而突变体株系大部分仍然存活，统计数据表明野生型存活率不到10％，tsg2-1存活率约60％，而tsg2-2存活率约80％，说明TSG2基因功能丧失可提高水稻耐冷性(图2)。

4、转基因株系tsg2-1和tsg2-2苗期生长对ABA的敏感性

将TSG2-1和TSG2-2以及野生型对照中花11种子脱壳并表面消毒后晾干，于无菌条件下置于固体1/2MS上培养，培养基中分别添加0、3M和6M的ABA，正常光照条件下培养一周后，比较植物地上部分苗和地下部分根的长度。结果发现，在不添加ABA条件下，突变体均比野生型矮，而添加ABA后，突变体高度和根长却大于野生型，说明突变体对ABA敏感性降低(图3)。

5、转基因株系tsg2-1和tsg2-2种子萌发对ABA的敏感性

将tsg2-1和tsg2-2以及野生型对照中花11种子分别置于不含ABA以及添加了3MABA和6M ABA的水中，30℃浸泡48h后每隔12小时统计萌发情况。结果发现不含ABA条件下，突变体萌发基本与野生型类似，而ABA的添加能显著抑制种子的萌发，并且浓度越高，抑制作用越显著。添加两种浓度的ABA后，突变体萌发速率均明显高于野生型，说明突变体的萌发过程对ABA敏感性降低(图4)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 控制水稻耐冷性的基因TSG2及其应用

<130> KHP181112744.9

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1539

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggggtgct tcctgtccaa gccggcgggg gcgggtcccc tcccgcccaa cgacgccgcc 60

gcgctccccg ccgacaaccc cgcagatccc gaggcggcgg ccgcgaatgg cggcgctgac 120

tccgcggcgg ccgacggcgg cggcgacgac aaggacgccg ccaagcgcgc ggtcccggtg 180

ttcagggagt tcggcctcgc cgagctgcgc gccgccacca agggcttcag cgccgacctc 240

atcgtctccg agagcggcga gaaggccccc aacgtcgtct accgcggccg cctcgacggc 300

ggccgcctca tcgccgtcaa gcgcttctcc cgcctctcct ggcccgaccc gcagcagttc 360

ctcgcggagg cggccggggt ggggaaggtg cgccacaagc gcctcgtcaa cctcatcgga 420

tgctgcgccg agggcgacga gaggctgctc gtcgccgagt acatgcccaa cgacaccctt 480

tccaagcatc tcttccactg ggataagcag cccttgccat gggaaatgcg gttaagggtt 540

gcgtattaca ttgcgcaggc actcgatcac tgcaatgccg agaaccgaaa aatctatcat 600

gacttgaatg cttatagagt actttttgat gaggaaggtg atcctcggct gtcaagtttt 660

ggactaatga agaacagccg cgatgggaaa agttatagca ctaatctggc ttacaccccg 720

cctgagtttc tacgaactgg cagagtcatc gccgagagtg tgatatatag ctatggaaca 780

gttcttttgg atcttttgag tgggaagcac atacctccta gccatgcact tgatttgata 840

agagggaaga atatactgtt gctcatggat tcctccttag aagggcagta tgctaatgaa 900

gatgcttcaa aactagttga ccttgcgtcg aaatgcttgc aatttgaagc gagggacaga 960

cccaatataa agtatctctt gtcttctgtt gggcctcttc agaagcaaaa ggaggtagca 1020

tcacatgtgt tgatgggtat tacaaaagcc acggcggtgt tgccaactat tctttctccc 1080

cttgggaagg cctgttccgg tatggacctt acagcagtac atgatatatt gctcaaaaca 1140

ggttacaaag atgaagaagg tgcagaaaat gagctgtcct ttcaagaatg gactcagcaa 1200

gtgcaagaga tgctgaatac caagaagttt ggtgacattg catttagaga caaggatttc 1260

aagactgcaa ttgactacta ctccaagctt gttggaatga tgtcagtgcc ttcagccaca 1320

gtttttgccc ggagaagttt ctcctatttg atgaatgggc agtcagagct tgctctccgg 1380

gacgcaatgc aggcccaggt ctgcatgccc gagtggccaa ctgccttcta cctacaagcc 1440

cttgctctct caaagctcgg catggaaact gacgcacaag atatgctaaa cgatggagcc 1500

acttttgagg ccaagaagca aaatagctgg cgaggttag 1539

<210> 2

<211> 512

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Gly Cys Phe Leu Ser Lys Pro Ala Gly Ala Gly Pro Leu Pro Pro

1 5 10 15

Asn Asp Ala Ala Ala Leu Pro Ala Asp Asn Pro Ala Asp Pro Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Asn Gly Gly Ala Asp Ser Ala Ala Ala Asp Gly Gly Gly

35 40 45

Asp Asp Lys Asp Ala Ala Lys Arg Ala Val Pro Val Phe Arg Glu Phe

50 55 60

Gly Leu Ala Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Gly Phe Ser Ala Asp Leu

65 70 75 80

Ile Val Ser Glu Ser Gly Glu Lys Ala Pro Asn Val Val Tyr Arg Gly

85 90 95

Arg Leu Asp Gly Gly Arg Leu Ile Ala Val Lys Arg Phe Ser Arg Leu

100 105 110

Ser Trp Pro Asp Pro Gln Gln Phe Leu Ala Glu Ala Ala Gly Val Gly

115 120 125

Lys Val Arg His Lys Arg Leu Val Asn Leu Ile Gly Cys Cys Ala Glu

130 135 140

Gly Asp Glu Arg Leu Leu Val Ala Glu Tyr Met Pro Asn Asp Thr Leu

145 150 155 160

Ser Lys His Leu Phe His Trp Asp Lys Gln Pro Leu Pro Trp Glu Met

165 170 175

Arg Leu Arg Val Ala Tyr Tyr Ile Ala Gln Ala Leu Asp His Cys Asn

180 185 190

Ala Glu Asn Arg Lys Ile Tyr His Asp Leu Asn Ala Tyr Arg Val Leu

195 200 205

Phe Asp Glu Glu Gly Asp Pro Arg Leu Ser Ser Phe Gly Leu Met Lys

210 215 220

Asn Ser Arg Asp Gly Lys Ser Tyr Ser Thr Asn Leu Ala Tyr Thr Pro

225 230 235 240

Pro Glu Phe Leu Arg Thr Gly Arg Val Ile Ala Glu Ser Val Ile Tyr

245 250 255

Ser Tyr Gly Thr Val Leu Leu Asp Leu Leu Ser Gly Lys His Ile Pro

260 265 270

Pro Ser His Ala Leu Asp Leu Ile Arg Gly Lys Asn Ile Leu Leu Leu

275 280 285

Met Asp Ser Ser Leu Glu Gly Gln Tyr Ala Asn Glu Asp Ala Ser Lys

290 295 300

Leu Val Asp Leu Ala Ser Lys Cys Leu Gln Phe Glu Ala Arg Asp Arg

305 310 315 320

Pro Asn Ile Lys Tyr Leu Leu Ser Ser Val Gly Pro Leu Gln Lys Gln

325 330 335

Lys Glu Val Ala Ser His Val Leu Met Gly Ile Thr Lys Ala Thr Ala

340 345 350

Val Leu Pro Thr Ile Leu Ser Pro Leu Gly Lys Ala Cys Ser Gly Met

355 360 365

Asp Leu Thr Ala Val His Asp Ile Leu Leu Lys Thr Gly Tyr Lys Asp

370 375 380

Glu Glu Gly Ala Glu Asn Glu Leu Ser Phe Gln Glu Trp Thr Gln Gln

385 390 395 400

Val Gln Glu Met Leu Asn Thr Lys Lys Phe Gly Asp Ile Ala Phe Arg

405 410 415

Asp Lys Asp Phe Lys Thr Ala Ile Asp Tyr Tyr Ser Lys Leu Val Gly

420 425 430

Met Met Ser Val Pro Ser Ala Thr Val Phe Ala Arg Arg Ser Phe Ser

435 440 445

Tyr Leu Met Asn Gly Gln Ser Glu Leu Ala Leu Arg Asp Ala Met Gln

450 455 460

Ala Gln Val Cys Met Pro Glu Trp Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Gln Ala

465 470 475 480

Leu Ala Leu Ser Lys Leu Gly Met Glu Thr Asp Ala Gln Asp Met Leu

485 490 495

Asn Asp Gly Ala Thr Phe Glu Ala Lys Lys Gln Asn Ser Trp Arg Gly

500 505 510

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccatgggaa atgcggttaa ggg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccatgggaa atgctaaggg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccatgggaa atgcttaagg g 21

Claims (4)

1.一种提高水稻耐冷性的方法，其特征在于，针对水稻中的目标基因TSG2设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化水稻，进而获得该基因功能缺失的转基因水稻植株；

其中，基因TSG2编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GCCATGGGAAATGCGGTTAAGGG-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述携带CRISPR/Cas的载体为pBGK032。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述水稻为中花11。

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