CN111499706A

CN111499706A - 棉花锌指蛋白GhZFPH4及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN111499706A
Application number: CN202010257509.XA
Authority: CN
Inventors: 刘永昌; 何福林; 李英; 曾丽亚; 袁志辉; 张斌; 刘小文
Original assignee: Hunan University of Science and Engineering
Current assignee: Hunan University of Science and Engineering
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111499706B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花锌指蛋白GhZFPH4及其编码基因和应用。本发明通过RT‑PCR技术从陆地棉中克隆到一个编码C2H2型锌指蛋白的基因GhZFPH4，通过亚细胞定位分析表明，GhZFPH4定位在细胞核中。发芽率和失水率测定结果表明，GhZFPH4对ABA有负调控作用。在不同浓度盐胁迫下，GhZFPH4过表达植株的绿色子叶比率和健康植株的比例都明显高于对照，而在未处理的情况下均无差异，表明GhZFPH4过表达增强了植株对盐胁迫的耐受性。本发明在作物的抗盐性育种方面具有广泛的应用前景，为棉花转基因创制耐盐资源提供选择。

Description

棉花锌指蛋白GhZFPH4及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花锌指蛋白GhZFPH4及其编码基因和应用。

背景技术

植物生活在自然环境中，每时每刻都受到周围环境的影响，当环境影响超过植物承受力的时候就会对植物产生胁迫，这些胁迫主要包括干旱、高温、霜冻、盐碱和病虫害等。其中盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。当非生物胁迫开始后，植物可以从分子水平上、细胞水平上对胁迫做出相应的回应，诱导许多胁迫相关基因的表达，从不同的水平对基因的表达进行调控，如转录水平调控、转录后加工调控及翻译后蛋白质的修饰，进而导致植物体内的生理代谢系统发生相应的变化，使植物抗逆性增强，最终在逆境中生存下来。

植物在不良环境中，通过调控基因表达，引起生理水平的变化，如合成大量的脯氨酸、甜菜碱、多糖和可溶性蛋白等物质，进而阻止、降低或修复由不利环境造成的各种伤害，这种抗逆能力称为耐逆性，在盐胁迫下的抗逆能力则成为耐盐性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。棉花是一种重要的纤维作物，中国目前是世界上最大的棉花生产国和消费国。目前，土壤盐胁迫已成为制约我国棉花生产的重要限制因子，棉花的生长发育、品质和产量均受盐渍化影响显著。因此，筛选和鉴定出与盐胁迫有关的基因并研究其功能，对于全面深入的阐明植物的耐盐分子机理具有重要意义。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种棉花锌指蛋白GhZFPH4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明还提供编码上述棉花锌指蛋白GhZFPH4的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明还提供一种重组表达载体，其含有上述棉花锌指蛋白GhZFPH4基因。

优选地，所述表达载体是pCambi1300-GFP。

进一步地，本发明还提供一种重组细胞，其含有上述的棉花锌指蛋白GhZFPH4基因或上述的重组表达载体。

优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

进一步地，本发明还提供一种改善植物耐盐性的方法，该方法包括将上述基因、重组表达载体或重组细胞导入植物或植物组织并使所述基因表达的步骤。

最后，本发明还提供上述基因、重组表达载体或重组细胞在改善植物耐盐性及培育植物新种质中的新用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过RT-PCR技术从陆地棉中克隆到一个编码C2H2型锌指蛋白的基因GhZFPH4，通过亚细胞定位分析表明，GhZFPH4定位在细胞核中。在不同浓度盐胁迫下，GhZFPH4过表达植株的绿色子叶比率和健康植株的比例都明显高于对照，而在未处理的情况下均无差异，表明GhZFPH4过表达增强了棉花的抗盐能力。本发明在作物的抗盐性育种方面具有广泛的应用前景，为棉花转基因创制耐盐资源提供选择。

附图说明

图1为GhZFPH4基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。

图2为GhZFPH4基因与其它植物锌指蛋白的氨基酸序列比对。

图3为GhZFPH4基因在烟草叶片中的亚细胞定位。

图4为GhZFPH4基因在棉花不同器官中的表达水平。

图5为在PEG处理下GhZFPH4基因在棉花幼苗中的表达水平。

图6为在盐处理下GhZFPH4基因在棉花幼苗中的表达水平。

图7为在ABA处理下GhZFPH4基因在棉花幼苗中的表达水平。

图8为在低温处理下GhZFPH4基因在棉花幼苗中的表达水平。

图9为ABA处理转基因植株的表型研究。

图10为种子在含不同盐浓度的1/2MS培养基上培养5天后的发芽率。

图11为风干处理5h后离体叶片表型比较。

图12为叶片失水率测定结果。

图13为不同盐浓度下野生型与转基因拟南芥的绿色子叶数。

图14为在不同盐浓度下生长两周的幼苗表型。

图15为不同盐浓度下不同类型植物统计分析。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所使用的材料均可自常规途径购买得到。实验棉花品种为陆地棉。大肠杆菌菌株XL1-Blue、农杆菌菌株EHA105和双元载体pCambi1300-GFP为湖南科技学院化学与生物工程学院提供。限制性内切酶、M-MLV反转录试剂盒、DNase I和SYBR Premix ExTaq购自TaKaRa公司。pEASY-Blunt Cloning Kit购自天根公司，其他试剂均为国产分析纯。

实施例1材料准备

精选棉花种子播种于石河子大学实验场。在盛花期挂牌标记开花日期，分别在开花后每隔3天收获棉铃，直到开花后30天，剥取出棉铃中纤维，用液氮快速冷冻后保存于-80℃冰箱，用于提取总RNA。

实施例2RNA提取及反转录cDNA

采用CTAB法提取根、茎、叶、花和不同时期棉纤维总RNA，用DNase I除去总RNA中基因组DNA后，通过NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定RNA浓度，然后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，保存于–80℃冰箱中备用。

实施例3GhZFPH4基因的克隆及生物信息学分析

以棉花GIS1的蛋白序列为探针在NCBI棉花EST数据库中进行比对，获得同源性高的4个EST核酸序列，序列号为DT567237.1、ES825295、DW494174、DW494173。根据所获得的序列设计出聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)引物，以新陆早33号纤维cDNA为模板进行PCR扩增。

实时荧光定量引物序列如下：

GhZFPH4-1F：CTTCATGGAACTCTAGCT[SEQ ID NO.3]

GhZFPH4-1R：GGCAAGGGATGCGAGGATG[SEQ ID NO.4]

克隆引物序列如下：

GhZFPH4-2F：ATGGAGAAGAACGAAAGGGAGA[SEQ ID NO.5]

GhZFPH4-2R：CCTCATCTTGCAGAGCAAAGAT[SEQ ID NO.6]

定位引物序列如下：

GhZFPH4-3F：GGATCCATGGAGAAGAACGAAAGGGAGA[SEQ ID NO.7]

GhZFPH4-3R：ACTAGTCAGATGTAGATCCAAACTCAC[SEQ ID NO.8]

扩增结束后，产物经浓度为1％琼脂糖凝胶电泳分离，然后利用凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的目的片段连接到克隆载体pEASY-Blunt上，转化大肠杆菌XL1-Blue进行扩增，利用碱裂解法提取质粒，然后用内切酶进行酶切验证，酶切产物通过琼脂糖凝胶分离，条带正确的质粒送进行测序。利用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)软件将GhZFPH4与拟南芥、棉花等植物中的锌指蛋白进行序列保守区域分析。利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线计算氨基酸理化性质，指标包括分子量、理论等电点。

本实施例通过RT-PCR技术从陆地棉中克隆到1个编码C2H2型锌指蛋白的基因，命名为GhZFPH4，该基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如图1所示。该基因编码的蛋白分子量为27.52kD，等电点为6.92，带负电荷残基(Asp+Glu)总数为25，带正电残基(Arg+Lys)总数为24。利用ClustalW软件对拟南芥和棉花中5个锌指蛋白的氨基酸序列进行多重序列比对分析，分析结果表明，拟南芥和棉花中的锌指蛋白序列具有保守基序，其中富含亮氨酸(Leu)的L-box位于N端，序列为ESFSQLPFIRR；位于中间部位的是保守的锌指结构域；EAR-motif/DLN-box则在蛋白的C端，其序列为：DHVSLDLHL。由图2可知，锌指结构域非常保守，具有两个保守的半胱氨酸和两个组氨酸，所以GhZFPH属于C2H2类型基因转录因子。除此之外，在保守的锌指结构域内还含有植物锌指蛋白特有的序列，即QALGGH。

实施例2GhZFPH4基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

以棉花cDNA为模板，利用GhZFPH4基因特异的引物扩增全长对的ORF序列，将该基因连接到pEASY-Blunt载体中。用Xba I、Kpn I双酶切载体pCambia1300-GFP和pEASY-Blunt-GhZFPH4，酶切产物用凝胶电泳分离，分别回收载体和目标片段。载体和目标片段按照一定比例混合，加入T4 DNA连接酶，22℃连接过夜，转化XL1-blue，提取质粒。Xba I、KpnI双酶切鉴定阳性克隆。

将pC1300-GhZFPH4-GFP、pC1300-GFP电击转入农杆菌EHA105中。利用烟草注射的方法在烟草叶片中瞬时表达GhZFPH4-GFP和GhZFPH4-RFP融合蛋白。注射3d后，撕取烟草表皮细胞用荧光显微镜观察蛋白的亚细胞定位。结果如图3所示，绿色荧光和红色荧光只分布在细胞核中，表明GhZFPH4是一个细胞核定位的蛋白。

实施例3GhZFPH4基因在棉花不同器官中的表达分析

以Ubiquitin(Ubi)基因做内参，GhUBI和GhZFPH4基因特异引物如SEQ ID NO.3-NO.8所示。反应体系为10μL，反应参数为：94℃预变性1min，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，45个循环。每次实验设置3次重复，采用2^-△△Ct法分析实验结果。通过实时荧光定量PCR检测GhZFPH4基因在棉花根、茎、叶、花及不开花后不同发育阶段纤维中的表达水平。

实时定量PCR分析结果表明，GhZFPH4在所检测的组织中的表达存在明显差异。GhZFPH4在叶中优势表达，在根、茎和花中的表达量相对较低。在纤维发育前期和后期也有较高的的表达量。纤维发育的中期表达量相对较低。如图4所示，四个表达较高的组织由高到低依次是：开花后3天的纤维、叶、开花后30天的纤维和6天的纤维，说明GhZFPH4可能参与调控了棉花纤维早期的发育过程。

实施例4GhZFPH4基因在不同非生物胁迫下的表达规律分析

将棉花(Gossypium hirsutum)种子播种于土壤中，在正常条件下生长约20天，待第三片真叶长出后，将幼苗移入营养液中培养2天，分别用15％PEG6000、400mm NaCl、4℃和0.1mm ABA处理0、1、3、6、12和24小时，提取整株幼苗RNA，用qPCR检测GhZFPH4基因在不同非生物胁迫下的表达水平。

结果如图5-图8所示，15％PEG6000、400mm NaCl、4℃和0.1mm ABA处理均显著诱导了GhZFPH4的表达。ABA处理后，GhZFPH4的转录量开始增加，3h后达到最高点，然后下降(图7)。经过NaCl处理后，GhZFPH4的诱导曲线在处理后6h达到峰值，并且显著下降(图6)。随着处理时间的延长，PEG和冷处理下GhZFPH4的表达明显增加，分别在12h和6h达到最高点(图5和图8)。

实施例5盐胁迫和ABA处理GhZFPH4转基因植株的分析

为了研究基因GhZFPH4在非生物胁迫中的作用，构建了转基因植株，利用两个转基因株系(OX-1和OX-2)和野生型(WT)，对盐和ABA处理下的萌发反应进行了研究。将同时收获的转基因和野生型拟南芥植株的种子经过表面消毒和低温处理后，分别播种在含0mM、100mM和125mM氯化钠的1/2MS培养基上，用同样的方法检测不同植株对ABA处理的反应。种子移入培养室，在22℃下连续光照进行培养，每12小时记录一次发芽率。7天后分别统计在含0mM、100mM和125mM氯化钠的1/2MS培养基上的绿色子叶比率。采用离体莲座叶进行失水试验，从4周龄植株上分别切下5片莲座叶，并立即测定其鲜重，将切下的叶片置于室温下的称重纸上，每30分钟称重一次并记录结果。OX-1、OX-2和WT株系分别选取三株植株进行失水试验。

如图9和图10所示，两个转基因株系均表现出较野生型低的ABA敏感性，在正常条件下，GhZFPH4超表达株的发芽率与野生型无明显差异，ABA处理下，野生型、OX-1和OX-2的发芽率显著降低。在含有0.5μM ABA的培养基上培养3d后，WT的发芽率为52％，而两个转基因株系的发芽率均在80％以上。当浓度增加到1μM时，WT的发芽率降低到40％，而转基因株系的发芽率在48％以上。

ABA是调节气孔运动和叶片失水的重要植物激素。本实施例研究了野生型和转基因植株的失水率。两个转基因株系的叶片失水率与野生型植株相比明显较快。如图11和图12所示，3小时后，转基因株系的叶片失水率分别为37％和39％，而野生型植株的叶片失水率为32％。OX-1和OX-2的大部分叶片在被切断5小时后严重枯萎，但野生型叶片表型状态更好。发芽率和失水率测定结果表明，GhZFPH4对ABA有负调控作用。

如图13和图14所示，在对照(即1/2MS)处理情况下野生型和转基因植株无显著差异，绿色子叶数量均随着盐浓度的增加而下降，但转基因植株的子叶数量明显高于野生型植株。在100mM NaCl处理后，野生型的绿色子叶数只有24.4％，转基因植株OX-1的绿色子叶数为80.4％，OX-2的绿色子叶数为61.8％。在125mM NaCl盐处理后，野生型的绿色子叶数仅为3.8％，转基因植株OX-1的绿色子叶数为61％，OX-2的绿色子叶数为36％。

如图15所示，在对照处理情况下，野生型和转基因不同类型的幼苗所占比例相同，而经过盐处理后转基因株系的较大幼苗数量明显高于野生型。经过100mM NaCl处理后，野生型中较大幼苗的数量只占约10％，较小幼苗的数量约80％，死亡幼苗的数量约占10％；而转基因株系OX-1和OX-2中较大幼苗的数量分别为80％和65％，较小幼苗的数量分别约占17％和30％，死亡幼苗分别约为3％和5％。经过125mM NaCl处理后，野生型中没有较大幼苗，较小幼苗的数量约占80％，死亡幼苗的数量约占20％，转基因型中的OX-1较大幼苗的数量约占35％，较小幼苗的数量约占55％，死亡幼苗的数量约占10％；OX-2中的较大幼苗数量约占15％，较小幼苗数量约占60％，死亡幼苗的数量约占25％。

综上所述，GhZFPH4转基因株系在高盐胁迫下的表型分析结果表明，GhZFPH4的表达水平受不同NaCl浓度的胁迫后，转基因型植株的表型及生长数量明显优于野生型植株，说明该基因的过表达增强了植株对盐胁迫的耐受性，在作物的抗盐性育种方面具有广泛的应用前景，为棉花转基因创制耐盐资源提供选择。

序列表

<110> 湖南科技学院

<120> 棉花锌指蛋白GhZFPH4及其编码基因和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> Gossypium spp

<400> 1

Met Glu Lys Asn Glu Arg Glu Thr His Asp Phe Met Asn Val Glu Ser

1 5 10 15

Phe Ser Gln Leu Pro Phe Ile Arg Pro Ala Pro Asn Lys Glu Lys Gly

20 25 30

Ile Arg Leu Phe Gly Lys Glu Phe Gly Gly Val Asp Pro Ala Thr Pro

35 40 45

Ser Asn Glu Ser Asp Ser Ala Glu Asn Asn Glu Asp Thr Thr Lys Glu

50 55 60

Asn Glu Asn Asn Gly Asp Asn Ser Arg Arg Phe Glu Cys His Tyr Cys

65 70 75 80

Cys Arg Asn Phe Pro Thr Ser Gln Ala Leu Gly Gly His Gln Asn Ala

85 90 95

His Lys Arg Glu Arg Gln His Ala Lys Arg Ala His Leu Gln Ser Ala

100 105 110

Met Val His Thr Ser Leu Ser Asp Ala His Ile Tyr Gly Leu Val Asn

115 120 125

Tyr Arg Leu Gly Ser Ala Pro Thr Pro Pro Ile Thr Tyr Pro Ser Trp

130 135 140

Asn Ser Ser Phe Thr Gly Ser Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Asn His Thr

145 150 155 160

Ser Phe Ser His His Pro Pro Ile Asn Gly Ser Pro Leu Gly Leu Trp

165 170 175

Arg Ile Pro Ser Thr Leu Gln Asn Asn Ser Ser Asn Phe Asn Pro Asp

180 185 190

Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Pro Leu Pro Leu Phe Thr Gly

195 200 205

Asp Glu Leu Lys Pro Pro Ser Gln Val Val Ala Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gln Ser Arg Tyr Val Tyr Glu Ser Lys Pro Arg Leu Gln Asp

225 230 235 240

His Val Ser Leu Asp Leu His Leu

245

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> Gossypium spp

<400> 2

atggagaaga acgaaaggga gactcacgac ttcatgaacg tagaatcctt ctctcagctt 60

ccctttatcc gccctgcccc caacaaagaa aagggcatcc gtttgttcgg caaggaattc 120

ggtggtgttg acccagctac gcccagcaac gagtccgact cagccgagaa caacgaagat 180

accaccaagg agaacgagaa caatggtgat aatagcagaa ggtttgagtg ccattattgt 240

tgcagaaact tccccacctc ccaagcttta ggtggtcacc aaaacgctca caaaagggaa 300

cgccaacatg cgaaacgagc tcatcttcag tcagcaatgg tgcacacctc tttatctgat 360

gctcatattt atggacttgt taactacagg ctaggctcag ctccaacacc accaatcact 420

tacccttcat ggaactctag ctttaccggt agtaccagta ggttttatgg gaaccatacc 480

tccttttctc atcacccacc catcaatggc agcccactgg ggttatggag aattccttct 540

acccttcaaa ataactcttc taatttcaat cctgaccgtt cctcatcatc ctcatcctcg 600

catcccttgc ctttgtttac cggcgatgag ttgaagccgc cctctcaggt tgttgctggc 660

ggtggtggtt caagctccca gagtcggtac gtttatgaat ccaagccaag attgcaagac 720

catgtgagtt tggatctaca tctgtaa 747

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cttcatggaa ctctagct 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggcaagggat gcgaggatg 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atggagaaga acgaaaggga ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cctcatcttg cagagcaaag at 22

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggatccatgg agaagaacga aagggaga 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

actagtcaga tgtagatcca aactcac 27

Claims

1.一种棉花锌指蛋白GhZFPH4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述的棉花锌指蛋白GhZFPH4的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种含有如权利要求2所述的棉花锌指蛋白GhZFPH4基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体是pCambi1300-GFP。

5.一种重组细胞，其含有如权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

7.一种改善植物耐盐性的方法，其特征在于，其包括将权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组细胞导入植物或植物组织并使所述基因表达的步骤。

8.如权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组细胞在改善植物耐盐性及培育植物新种质中的用途。