CN115161339A - 一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，确定植物材料和生长条件，载体构建与番茄遗传转化；RNA提取和基因表达量检测，确定非生物胁迫处理与生长参数；转录组测序和亚细胞定位，酵母细胞中的转录激活活性分析；分别进行DAB染色和NBT染色，超氧化物歧化酶活性的测定；分别进行酵母单杂交实验和电泳迁移率实验，统计分析。本发明分析结果表明，SlWRKY3正向调控胁迫响应相关基因的表达，SlWRKY3可以与六个SlGRXS1基因簇成员的启动子结合并激活其表达，有助于揭示SlWRKY3在高温胁迫下的生物学功能和机制，丰富番茄热胁迫相关WRKY转录因子的调控网络。

Description

一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法。
背景技术
植物的生长发育容易受到外界环境的胁迫，比如生物胁迫和非生物胁迫。非生物胁迫包括干旱、盐和温度胁迫是影响自然界植物地理分布、限制农业植物生产力和威胁粮食安全的主要环境因素。其中，高温胁迫是最难解决的因素之一。全球气候变化也加剧高温的危害。高温胁迫对植物的生长发育影响广泛，宏观上表现为缺水、畸形生长、雄性不育以及产量下降等，生理层面上表现为光合作用和呼吸作用受到抑制、易感病以及干物质下降等，分子层面又表现为蛋白质错误折叠、酶的催化活性下降以及质膜损伤等。植物会产生一系列防御机制以对抗热胁迫，使其能够在一定的高温范围内得以生存。
番茄作为茄科重要代表作物和重要的经济园艺作物，在世界范围内广泛种植。番茄是一种对温度敏感的作物，在种植过程中通常会面临高温胁迫的严峻挑战。因此，了解番茄对高温胁迫的响应对于提高番茄的耐热性至关重要。
转录因子(Transcription factors，TFs)是转录调控网络中的重要分子开关，通过与基因启动子中的顺式元件结合来调控下游基因，在提高植物耐热性方面发挥着重要作用。其中WRKY基因家族是高等植物中最大的转录因子家族之一。WRKY结构域的长度约为60个残基，N端是一个保守的7肽WRKYGQK，在C端也有非典型的锌指结构。WRKY蛋白可以结合W-box元件(具有核心基序TTGACC/T)来调节下游基因的表达。然而，番茄中WRKY转录因子是否以及如何参与对热胁迫的响应却鲜有研究。
植物谷氧还蛋白(GRX)调节植物发育和生理代谢。GRX是硫氧还蛋白折叠超家族的小硫醇蛋白，含有一个活性位点，序列基序CXXC/S。根据序列比对、活性位点序列和系统发育树，GRX可以区分三个GRX亚组。亚组I包含具有CPYC、CGYC、CPFC和CSY活性位点的“经典”GRX，亚组II的蛋白具有CGFS活性位点，亚组III具有CC[M/L][C/S]活性位点。CC型GRX是陆生植物特有的。一些涉及热胁迫响应的GRX已被报道，同时也揭示了其在抵抗高温胁迫中的积极作用。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术针对番茄中WRKY转录因子是否以及如何参与对热胁迫的响应鲜有研究，同时植物谷氧还蛋白GRX参与植物高温响应的研究还有待丰富，且GRX如何参与高温胁迫响应也有待进一步研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法。
本发明是这样实现的，一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，所述高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法包括：
WRKY转录因子SlWRKY3，属于Group I WRKY家族成员，SlWRKY3在热胁迫下显著上调；SlWRKY3通过清除活性氧和提高超氧化物歧化酶活性，正向调节番茄的耐热性；SlWRKY3正向调控胁迫响应相关基因的表达；其中，Solyc02g088340gDNA为SEQ ID NO：1，cDNA为SEQID NO：2。
进一步，所述高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法包括以下步骤：
步骤一，确定植物材料和生长条件，载体构建与番茄遗传转化；
步骤二，RNA提取和基因表达量检测，确定非生物胁迫处理与生长参数；
步骤三，转录组测序和亚细胞定位，酵母细胞中的转录激活活性分析；
步骤四，分别进行DAB染色和NBT染色，超氧化物歧化酶活性的测定；
步骤五，分别进行酵母单杂交实验和电泳迁移率实验，统计分析。
进一步，所述步骤一中的植物材料和生长条件的确定包括：
以番茄品种AC为材料进行遗传转化。植物在25±2℃的温室中生长，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为60～70％；采集AC的不同组织部位样品，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃冰箱用于RNA提取。
将T2代超量转基因系，突变体系以及AC的种子在温室中播种生长；将2周龄的幼苗移栽到10cm×10cm×10cm的塑料盆中，定期浇水以进行耐热性测定。
进一步，所述步骤一中的载体构建与番茄遗传转化包括：
对于过表达载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的编码区CDS，使用
Figure BDA0003700478780000021
一步克隆试剂盒克隆到pHELLSGATE8载体中；选择SlWRKY3第一外显子的两个靶点构建CRISPR/Cas9载体，构建成功的载体分别通过电击的方法转化到农杆菌菌株C58中，并用于番茄遗传转化；
通过PCR鉴定并确认具有pHELLSGATE8载体插入的超量转基因系；通过一代测序的方法对遗传转化得到的CRISPR/Cas9植株进行靶点编辑情况检测，鉴定出SlWRKY3突变体系。
进一步，所述步骤二中的RNA提取和基因表达量检测包括：
对正常条件和高温胁迫下的叶片以及不同组织部位的AC进行样品采集，用Trizol试剂提取总RNA，使用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒合成互补DNA；使用SYBR LightCycler480仪器检测基因的表达量；以番茄肌动蛋白基因BT013524为内参；基因的相对表达量用2-△△CT方法计算，包含三次技术重复。
所述非生物胁迫处理与生长参数的确定包括：
对正常条件下生长的6周龄幼苗进行非生物胁迫处理，并检测SlSWRKY3的表达量；对于高温和低温胁迫处理，将幼苗分别置于42℃和4℃的光照培养箱中；未经任何温度处理的幼苗作为相应的对照；对于盐胁迫处理，用200mM NaCl喷洒幼苗，并以喷洒水作为对照；对于干旱胁迫，将幼苗从土壤中采集后放在超净工作台中；在处理后0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h采集幼苗，立即在液氮中冷冻，用于RNA提取和基因表达量的检测。
对于SlWRKY3的超量转基因系和突变体系，在42℃处理后2天，采集从顶部数第三片完全展开的叶片；一部分样品在液氮中冷冻，用于测定超氧化物歧化酶活性，另一部分用于DAB和NBT染色；每株系进行三次重复，每个重复至少取三株幼苗；分别在处理前、处理后和恢复两天后拍照记录植株表型。
进一步，所述步骤三中的转录组测序包括：
将6周龄WT、OE-14系和CR-6系植株进行热胁迫处理，处理6h后采集叶片用于总RNA提取以及转录组测序；每个系均包含三个独立的生物学重复；使用Hiseq-PE150测序系统对样品进行测序；利用平均FPKM的基因表达方法，产生两倍以上表达且FDR调整的p值小于0.05的基因被鉴定为差异表达基因。
所述亚细胞定位包括：
对于亚细胞定位载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，随后通过同源重组的方法克隆到101YFP载体中；将CaMV35S:SlWRKY3-YFP的融合蛋白和细胞核标记CaMV35S:StERF3-RFP共同注射并瞬时表达到烟草叶片中；注射两天后，用激光共聚焦扫描显微镜观察烟草叶肉细胞的中的荧光。
所述酵母细胞中的转录激活活性分析包括：
将从AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGBKT7载体中，并将pGBKT7载体转入酵母菌株AH109中并在SD/-Trp平板上进行30℃培养；3天后，挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释，分别在SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade培养基上点斑，进行30℃培养3天后观察结果。
进一步，所述步骤四中的DAB染色包括：
DAB染色可以反映植物体内过氧化氢的积累水平。将正常条件下和热胁迫处理下的叶片在黑暗中用1mg/mL二氨基联苯胺溶液中浸泡6h；将染色后的叶片转移到漂白溶液中，并在90～95℃的水浴中放置15min以去除叶绿素；其中，所述漂白溶液由乙醇、乙酸和甘油按照3：1：1的比例混合而成。
所述NBT染色包括：
NBT染色可以反映植物体内超氧阴离子自由基的积累水平。将正常条件下和热胁迫处理下的叶片浸泡在含有0.1％NBT的10mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液中；将溶液在95℃的水浴中真空浸泡15min；将叶片用水合氯醛脱色，直到叶绿素完全消失，并储存在50％甘油溶液中用于拍照。
所述超氧化物歧化酶活性的测定包括：
采集从顶部数第三片完全展开的叶片，并立即在液氮中冷冻；用研钵磨碎叶片，称取0.1g用于测量SOD活性；在样品中加入含有1％聚乙烯吡咯烷酮的50mM pH 7.8的磷酸钾缓冲液，振荡混匀后在4℃下以12000g离心10min，并立即将上清液用于SOD活性测定；一个单位的SOD活性被定义为在550nm波长下时引起50％的硝基蓝四唑还原抑制所需的酶量。
进一步，所述步骤五中的酵母单杂交实验包括：
通过Matchmaker One-Hybrid Library Construction and Screening试剂盒进行酵母单杂交分析，鉴定SlWRKY3与SlGRXS1基因簇启动子是否结合。将AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGADT7中，构建猎物载体；从番茄基因组DNA中扩增SlGRXS1基因簇的2-kb启动子片段，并克隆到pAbai中产生诱饵载体；将线性化的诱饵载体转化到酵母菌株Y1Hgold中，在SD/-Ura培养基上培养，并放置在30℃培养箱中培养三天；将猎物载体转化到之前分别用诱饵载体转化的酵母菌株Y1H gold中，并将所得菌株在SD/-Leu-Ura培养基上培养；挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释至OD600为0.1，将稀释后的悬浮液在不同浓度金担子素A的SD/-Leu-Ura培养基上点斑；SD/-Leu-Ura培养基中的AbA浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40和50ng/ml。
进一步，所述步骤五中的电泳迁移率实验包括：
从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，并通过同源重组方法将其重组到用NdeI/XhoI双酶切的PET15d-MBP载体中；将带有MBP标签的重组融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中表达；转化的BL21细胞在400mL LB培养基中培养至OD600为0.6，并在16℃下用异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导蛋白表达20h，纯化蛋白；将SlGRXS1f 2-kb启动子上的3个W-box元件分别用P1、P2和P3表示，并用FAM探针标记；对于标记探针，将FAM连接到5′端的正义寡核苷酸上；单链探针退火形成双链探针，并稀释至10μM；对于竞争探针，单链探针退火形成双链探针，并直接以100μM的浓度使用；SlWRKY3蛋白与双链探针在黑暗中用20μL反应混合孵育；在4℃下孵育30min后，在含有0.5×TBE缓冲液的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离混合物；80V，1h后进行成像。
进一步，所述步骤五中的统计分析包括：
使用SigmaPlot和Excel软件进行统计分析；数据来自三个独立的重复，以平均值±标准差表示；使用t检验对两组之间的显著差异进行检测；*表示P<0.05，**表示P<0.01。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明鉴定了一种经典的WRKY转录因子SlWRKY3，属于Group I WRKY家族成员，SlWRKY3在热胁迫下显著上调。SlWRKY3通过清除活性氧和提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，正向调节番茄的耐热性。分析表明，SlWRKY3正向调控胁迫响应相关基因的表达。本发明通过进一步分析发现，SlWRKY3可以与六个SlGRXS1基因簇成员(SlGRXS1s)的启动子结合并激活其表达。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明提供的分析结果有助于揭示SlWRKY3在高温胁迫下的生物学功能和机制，丰富番茄热胁迫相关WRKY转录因子的调控网络。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
本发明从番茄热胁迫的转录组数据中鉴定了一个可以正向调控番茄热胁迫的WRKY转录因子，SlWRKY3。通过构建SlWRKY3的超量和CRISPR表达载体并进行遗传转化，获得了超量转基因系和CRISPR系。我们进一步通过表型鉴定，确定了其可以正向调控番茄耐热性。通过转录组分析，本发明还找到SlWRKY3的下游靶基因，为一个含有六个成员的SlGRXS1基因簇，进一步解析了SlWRKY3通过上调SlGRXS1基因簇的表达量提高番茄耐热性。本发明首次鉴定了番茄中可以正向调控热胁迫的WRKY转录因子，SlWRKY3，并解析了其调控机制，填补了国内外对番茄中WRKY转录因子调控热胁迫的技术空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的番茄中基于RNA-seq数据分析WRKY家族成员响应热胁迫的表达模式示意图；从NCBI数据库中提取基因的表达量并进行均一化；x轴表示热处理后的时间，每个处理三个重复；y轴代表WRKY家族成员的基因缩利号；标有星号的基因分别是SIWRKY18、SIWRKY59、SIWRKY3和SIWRKY78；
图2是本发明实施例提供的部分WRKY家族成员响应热胁迫的表达模式示意图；SIWRKY3(A)、SIWRKY18(B)、SIWRKY59(C)和SIWRKY78(D)响应热胁迫的表达模式；E定量RT-PCR(qRT-PCR)检测SIWRKY3热胁迫(42℃)下的表达模式；未经任何热胁迫的幼苗作为对照；x轴代表处理后的时间；y轴代表与对照相比的表达量；*，P值<0.05；**，P值<0.01；
图3是本发明实施例提供的SIWRKY3响应寒冷、盐分和干旱胁迫的表达模式示意图；A是冷胁迫(4℃)下SIWRKY3的表达模式；B是盐胁迫(200mM NaCl)下SIWRKY3的表达模式；C是干旱胁迫下SIWRKY3的表达模式；冷胁迫和干旱胁迫的对照均为不经过任何处理的植株；盐胁迫的对照为用水喷洒的植株；x轴代表处理后的时间，y轴代表SIWRKY3与对照相比的表达量；
图4是本发明实施例提供的SlWRKY3的保守结构域、核定位、组织特异性表达及转录激活活性分析示意图；A是番茄(Sl)、拟南芥(At)和水稻(Os)的WRKY3直系同源物的多序列比对；星号标记的基因是SIWRKY3；B是SlWRKY3的亚细胞定位；C是SlWRKY3的转录激活实验；D是AC不同组织中SIWRKY3的表达模式；R，根；S，茎；YL，幼叶；ML，成熟叶；FB，花芽；UF，未开放的花；OF，盛开的花；15DPA，开花后15天；25DPA，开花后25天；MG，绿熟期果实；BR，破色期果实；RR，红熟期果实；
图5是本发明实施例提供的SlWRKY3增强番茄耐热性示意图；A是qRT-PCR鉴定三个超量(OE)系和WT(AC)中SIWRKY3的表达量；B是三个CRISP R-Cas 9(CR)系的突变类型；CR-2系在第一个靶点和第二个靶点处分别有一个“T”和“A”插入；CR-6系在第一个靶点处有一个48bp的缺失，在第二个靶点处有一个“C”插入；CR-9系在第一个靶点处有一个“T”插入；这三种突变类型均导致了SlWRKY3翻译的提前终止；CSIWRKY3的OE系、CR系和WT在正常条件(对照)、热胁迫条件(热胁迫)和热胁迫后恢复两天(恢复)的表型；DSIWRKY3的OE系、CR系和WT在正常条件(对照)、热胁迫条件(热胁迫)下的DAB染色。斑点表示DAB在H2O2存在下的聚合；E是在正常条件(对照)和热胁迫条件(热胁迫)下SIWRKY3的OE系、CR系和WT的NBT染色；斑点表示NBT在O2 -存在下的聚合；F是SIWRKY3的OE系、CR系和WT在正常条件(对照)、热胁迫条件(热胁迫)下叶片中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定；
图6是本发明实施例提供的SIWRKY3的OE系、CR系和WT在热胁迫下的RNA-seq分析；A是OE-14系、CR-6系和WT在热胁迫下差异表达基因的维恩图；维恩图中圈出的所有数字之和表示比较组合中的差异表达基因总数，重叠区域表示两种组合共同的差异表达基因数：B是COE-14系、CR-6系和WT之间的差异表达基因的KEGG(B)和GO(C)分析；x轴表示差异表达基因数量与差异表达基因总数的比率，基因的数量由点的大小表示，qValue由点的颜色表示；D是各比较组合中共同差异表达基因数量的维恩图；E，F是OE-14系中相对于WT上调但在CR-6中相对于WT下调的基因和在OE-14系中相对于WT下调但在CR-6中上调的基因的GO(E)和KEGG(F)分析；x轴代表GO项(E)或KEGG通路(F)，y轴代表显著性水平；
图7是本发明实施例提供的qRT-PCR检测RNA-seq结果中三个胁迫相关基因的表达量示意图；A～C是qRT-PCR检测SIPRX(A)、SIPHR(B)和SISGR(C)在OE-14系、CR-6系和WT中表达量；
图8是本发明实施例提供的番茄中SlGRXS1基因簇鉴定及基于RNA-seq的表达分析示意图；A是SIGRXS1基因簇多序列比对；B是SIGRXS1基因簇的保守结构域分析；C是拟南芥(At)和水稻(Os)中GRXS1同源基因的系统发育树；D～I是基于RNA-seq结果分析SlGRXSla(solyc04g 011800)(D)、SIGRXSIb(solyc04g 011810)(E)、SIGRXSlc(solyc04g 011830)(F)、SlGRXSld(solyc04g 011840)(G)、SIGRXSle(solyc04g 011860)(H)和SIGRXSlf(solyc04g01118760)(I)在OE-14系、CR-6系和WT中的表达分析，相对表达量用FPKM表示；
图9是本发明实施例提供的基于RNA-seq分析热胁迫下SIGRXSI基因簇的表达模式示意图；A～F是热胁迫下SIGRXSla(solyc04g 011800)(A)、SIGRXSIb(solyc04g 011810)(B)、SIGRXSlc(solyc04g 011830)(C)、SIGRXSld(solyc04g 011840)(D)、SIGRXSle(solyc04g 011860)(E)和SIGRXSlf(solyc04g 011870)(F)的表达模式；x轴代表处理后时间，y轴代表SIGRXS1基因簇的相对表达量；
图10是本发明实施例提供的SlWRKY3与SIGRXS1基因簇的启动子结合示意图；A～F是酵母单杂交分析SIWRKY3与SIGRXS1a(solyc04g 011800)(A)、SIGRXS1b(solyc04g011810)(B)、SlGRXS1c(solyc04g 011830)(C)、SIGRXSld(solyc04g 011840)(D)、SIGRXSle(solyc04g011860)(E)和SIGRXSIf(solyc04g 011870)(F)启动子结合；GSIGRXS1f的2-kb启动子内的W-box分布，该区域中有3个顺式元件，分别命名为P1、P2和P3(用黑框表示)；H-JEMSA实验检测SIWRKY3与探针P1、P2和P3结合；“+”和“.”分别表示存在和不存在；5x、10x、20×、30×分别代表不同的竞争倍数；
图11是本发明实施例提供的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法中，WRKY转录因子SlWRKY3，属于Group I WRKY家族成员，SlWRKY3在热胁迫下显著上调；SlWRKY3通过清除活性氧和提高超氧化物歧化酶活性，正向调节番茄的耐热性；SlWRKY3正向调控胁迫响应相关基因的表达；其中，Solyc02g088340gDNA为SEQ ID NO：1，cDNA为SEQ ID NO：2。
如图11所示，本发明实施例提供的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法包括以下步骤：
S101，确定植物材料和生长条件，载体构建与番茄遗传转化；
S102，RNA提取和基因表达量检测，确定非生物胁迫处理与生长参数；
S103，转录组测序和亚细胞定位，酵母细胞中的转录激活活性分析；
S104，分别进行DAB染色和NBT染色，超氧化物歧化酶活性的测定；
S105，分别进行酵母单杂交实验和电泳迁移率实验，统计分析。
本发明实施例提供的步骤S101中的植物材料和生长条件的确定包括：
以番茄品种AC为材料进行遗传转化。植物在25±2℃的温室中生长，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为60～70％；采集AC的不同组织部位样品，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃冰箱用于RNA提取。
将T2代超量转基因系，突变体系以及AC的种子在温室中播种生长；将2周龄的幼苗移栽到10cm×10cm×10cm的塑料盆中，定期浇水以进行耐热性测定。
本发明实施例提供的载体构建与番茄遗传转化包括：
对于过表达载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的编码区CDS，使用
Figure BDA0003700478780000091
一步克隆试剂盒克隆到pHELLSGATE8载体中；选择SlWRKY3第一外显子的两个靶点构建CRISPR/Cas9载体，构建成功的载体分别通过电击的方法转化到农杆菌菌株C58中，并用于番茄遗传转化；
通过PCR鉴定并确认具有pHELLSGATE8载体插入的超量转基因系；通过一代测序的方法对遗传转化得到的CRISPR/Cas9植株进行靶点编辑情况检测，鉴定出SlWRKY3突变体系。
本发明实施例提供的步骤S102中的RNA提取和基因表达量检测包括：
对正常条件和高温胁迫下的叶片以及不同组织部位的AC进行样品采集，用Trizol试剂提取总RNA，使用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒合成互补DNA；使用SYBR LightCycler480仪器检测基因的表达量；以番茄肌动蛋白基因BT013524为内参；基因的相对表达量用2-△△CT方法计算，包含三次技术重复。
本发明实施例提供的非生物胁迫处理与生长参数的确定包括：
对正常条件下生长的6周龄幼苗进行非生物胁迫处理，并检测SlSWRKY3的表达量；对于高温和低温胁迫处理，将幼苗分别置于42℃和4℃的光照培养箱中；未经任何温度处理的幼苗作为相应的对照；对于盐胁迫处理，用200mM NaCl喷洒幼苗，并以喷洒水作为对照；对于干旱胁迫，将幼苗从土壤中采集后放在超净工作台中；在处理后0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h采集幼苗，立即在液氮中冷冻，用于RNA提取和基因表达量的检测。
对于SlWRKY3的超量转基因系和突变体系，在42℃处理后2天，采集从顶部数第三片完全展开的叶片；一部分样品在液氮中冷冻，用于测定超氧化物歧化酶活性，另一部分用于DAB和NBT染色；每株系进行三次重复，每个重复至少取三株幼苗；分别在处理前、处理后和恢复两天后拍照记录植株表型。
本发明实施例提供的步骤S103中的转录组测序包括：
将6周龄WT、OE-14系和CR-6系植株进行热胁迫处理，处理6h后采集叶片用于总RNA提取以及转录组测序；每个系均包含三个独立的生物学重复；使用Hiseq-PE150测序系统对样品进行测序；利用平均FPKM的基因表达方法，产生两倍以上表达且FDR调整的p值小于0.05的基因被鉴定为差异表达基因。
本发明实施例提供的亚细胞定位包括：
对于亚细胞定位载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，随后通过同源重组的方法克隆到101YFP载体中；将CaMV35S:SlWRKY3-YFP的融合蛋白和细胞核标记CaMV35S:StERF3-RFP共同注射并瞬时表达到烟草叶片中；注射两天后，用激光共聚焦扫描显微镜观察烟草叶肉细胞的中的荧光。
本发明实施例提供的酵母细胞中的转录激活活性分析包括：
将从AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGBKT7载体中，并将pGBKT7载体转入酵母菌株AH109中并在SD/-Trp平板上进行30℃培养；3天后，挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释，分别在SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade培养基上点斑，进行30℃培养3天后观察结果。
本发明实施例提供的步骤S104中的DAB染色包括：
DAB染色可以反映植物体内过氧化氢的积累水平。将正常条件下和热胁迫处理下的叶片在黑暗中用1mg/mL二氨基联苯胺溶液中浸泡6h；将染色后的叶片转移到漂白溶液中，并在90～95℃的水浴中放置15min以去除叶绿素；其中，所述漂白溶液由乙醇、乙酸和甘油按照3：1：1的比例混合而成。
本发明实施例提供的NBT染色包括：
NBT染色可以反映植物体内超氧阴离子自由基的积累水平。将正常条件下和热胁迫处理下的叶片浸泡在含有0.1％NBT的10mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液中；将溶液在95℃的水浴中真空浸泡15min；将叶片用水合氯醛脱色，直到叶绿素完全消失，并储存在50％甘油溶液中用于拍照。
本发明实施例提供的超氧化物歧化酶活性的测定包括：
采集从顶部数第三片完全展开的叶片，并立即在液氮中冷冻；用研钵磨碎叶片，称取0.1g用于测量SOD活性；在样品中加入含有1％聚乙烯吡咯烷酮的50mM pH 7.8的磷酸钾缓冲液，振荡混匀后在4℃下以12000g离心10min，并立即将上清液用于SOD活性测定；一个单位的SOD活性被定义为在550nm波长下时引起50％的硝基蓝四唑还原抑制所需的酶量。
本发明实施例提供的步骤S105中的酵母单杂交实验包括：
通过Matchmaker One-Hybrid Library Construction and Screening试剂盒进行酵母单杂交分析，鉴定SlWRKY3与SlGRXS1基因簇启动子是否结合。将AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGADT7中，构建猎物载体；从番茄基因组DNA中扩增SlGRXS1基因簇的2-kb启动子片段，并克隆到pAbai中产生诱饵载体；将线性化的诱饵载体转化到酵母菌株Y1Hgold中，在SD/-Ura培养基上培养，并放置在30℃培养箱中培养三天；将猎物载体转化到之前分别用诱饵载体转化的酵母菌株Y1H gold中，并将所得菌株在SD/-Leu-Ura培养基上培养；挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释至OD600为0.1，将稀释后的悬浮液在不同浓度金担子素A的SD/-Leu-Ura培养基上点斑；SD/-Leu-Ura培养基中的AbA浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40和50ng/ml。
本发明实施例提供的电泳迁移率实验包括：
从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，并通过同源重组方法将其重组到用NdeI/XhoI双酶切的PET15d-MBP载体中；将带有MBP标签的重组融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中表达；转化的BL21细胞在400mL LB培养基中培养至OD600为0.6，并在16℃下用异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导蛋白表达20h，纯化蛋白；将SlGRXS1f 2-kb启动子上的3个W-box元件分别用P1、P2和P3表示，并用FAM探针标记；对于标记探针，将FAM连接到5′端的正义寡核苷酸上；单链探针退火形成双链探针，并稀释至10μM；对于竞争探针，单链探针退火形成双链探针，并直接以100μM的浓度使用；SlWRKY3蛋白与双链探针在黑暗中用20μL反应混合孵育；在4℃下孵育30min后，在含有0.5×TBE缓冲液的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离混合物；80V，1h后进行成像。
本发明实施例提供的统计分析包括：使用SigmaPlot和Excel软件进行统计分析；数据来自三个独立的重复，以平均值±标准差表示；使用t检验对两组之间的显著差异进行检测；*表示P<0.05，**表示P<0.01。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
首先，本发明通过前期转录组数据挖掘，得到番茄WRKY转录因子家族中可能参与高温胁迫的候选基因，SlWRKY3；
其次，通过对野生材料进行高温处理，以及不同处理时间取样进行SlWRKY3表达量检测，初步确定SlWRKY3在高温胁迫下可以被诱导且上调表达；
进一步，通过遗传转化的方法获得SlWRKY3的超量表达材料以及CRISPR敲除材料。对超量材料和敲除材料进行高温胁迫处理，发现超量材料较耐热，对照材料次之，敲除材料耐热性最差。对处理后的材料进行取样测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性，DAB染色以及NBT染色，得到了与表型一致的结果。基于以上结果，本发明确定了SlWRKY3在番茄中的正向调控作用；
最后，为了挖掘SlWRKY3调控耐热性的分子机制，本发明对高温处理的超量、敲除以及对照材料进行转录组测序。通过对测序结果分析，很多胁迫相关基因在三种材料中差异表达。其中，本发明将一个包含六个基因的SlGRXS1基因簇作为SlWRKY3下游靶基因的候选基因进行下一步研究。通过酵母单杂交实验以及电泳迁移率实验等实验，本发明得出结论：SlWRKY3可以结合SlGRXS1基因簇的启动子并且激活其表达，从而正向调控高温胁迫。
本发明丰富了番茄响应高温胁迫的分子调控网络，确定了SlWRKY3在高温胁迫中的作用，以及其在高温下通过直接激活SlGRXS1基因簇来应对胁迫的潜在机制。同时，本发明也为通过培育耐高温材料从而提高番茄产量的育种目标提供了新的见解。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
1、材料方法
1.1植物材料和生长条件
以番茄品种Ailsa Craig(AC)为材料进行遗传转化。植物在25±2℃的温室中生长，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为60～70％。采集AC的不同组织部位样品，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃冰箱用于RNA提取。
将T2代超量转基因系，突变体系以及AC的种子在温室中播种生长。将2周龄的幼苗移栽到10cm×10cm×10cm的塑料盆中，定期浇水以进行耐热性测定。
1.2载体构建与番茄遗传转化
对于过表达载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的编码区(CDS)，使用
Figure BDA0003700478780000122
一步克隆试剂盒(Vazyme，中国)克隆到pHELLSGATE8载体中。参考前人的方法，选择SlWRKY3第一外显子的两个靶点构建CRISPR/Cas9载体。这些构建成功的载体分别通过电击的方法转化到农杆菌菌株C58中，然后用于番茄遗传转化。通过PCR鉴定并确认具有pHELLSGATE8载体插入的超量转基因系。通过一代测序的方法对遗传转化得到的CRISPR/Cas9植株进行靶点编辑情况检测，进一步鉴定出SlWRKY3突变体系。表1中列出了这些实验中使用的所有引物(见表1)。
表1引物列表
Figure BDA0003700478780000121
Figure BDA0003700478780000131
1.3RNA提取和基因表达量检测
对正常条件和高温胁迫下的叶片以及不同组织部位的AC进行样品采集，用Trizol试剂(Aidlab，中国)提取总RNA。使用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme，中国)合成互补DNA(cDNA)。使用SYBR Light Cycler 480仪器检测基因的表达量。以番茄肌动蛋白基因(登录号BT013524)为内参。表1列出了本发明中使用的引物序列(见表1)。基因的相对表达量用2-△△CT方法计算(包含三次技术重复)。
1.4非生物胁迫处理与生长参数
通过Gao等人的描述进行非生物胁迫处理。对正常条件下生长的6周龄幼苗进行非生物胁迫处理，并检测SlSWRKY3的表达量。对于高温和低温胁迫处理，将幼苗分别置于42℃和4℃的光照培养箱中。未经任何温度处理的幼苗作为相应的对照。对于盐胁迫处理，用200mM NaCl喷洒幼苗，并以喷洒水作为对照。对于干旱胁迫，将幼苗从土壤中采集后放在超净工作台中。在处理后0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24小时采集幼苗，立即在液氮中冷冻，用于RNA提取和基因表达量的检测。
对于SlWRKY3的超量转基因系和突变体系，在42℃处理后2天，采集从顶部数第三片完全展开的叶片。一部分样品在液氮中冷冻，用于测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，另一部分用于DAB和NBT染色。每株系进行三次重复，每个重复至少取三株幼苗。分别在处理前、处理后和恢复两天后拍照记录植株表型。
1.5转录组测序(RNA-seq)
将6周龄WT、OE-14系和CR-6系植株进行热胁迫处理，处理6小时后采集叶片用于总RNA提取以及转录组测序。每个系均包含三个独立的生物学重复。使用Hiseq-PE150测序系统对样品进行测序。平均FPKM(每百万个碱基对测序的每千碱基转录本序列的预期片段数)是目前使用最多的基因表达方法。产生两倍以上表达且FDR调整的p值小于0.05的基因被鉴定为差异表达基因(DEG)。
1.6亚细胞定位
对于亚细胞定位载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，随后通过同源重组的方法克隆到101YFP载体中。将CaMV35S:SlWRKY3-YFP的融合蛋白和细胞核标记CaMV35S:StERF3-RFP共同注射并瞬时表达到烟草叶片中。注射两天后，用激光共聚焦扫描显微镜(SP8，LEICA)观察烟草叶肉细胞的中的荧光。
1.7酵母细胞中的转录激活活性分析
将从AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGBKT7载体(Clontech，USA)中，并将pGBKT7载体转入酵母菌株AH109中(Clontech，USA)并在SD/-Trp平板上进行30℃培养。3天后，挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释，分别在SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade培养基上点斑，然后进行30℃培养3天后观察结果。
1.8DAB染色
DAB染色可以反映植物体内过氧化氢(H2O2)的积累水平。将正常条件下(对照)和热胁迫处理下的叶片在黑暗中用1mg/mL DAB(二氨基联苯胺)溶液中浸泡6h。将染色后的叶片转移到漂白溶液(乙醇：乙酸：甘油，3:1:1)中，然后在水浴(90～95℃)中放置15分钟以去除叶绿素。
1.9 NBT染色
NBT染色可以反映植物体内超氧阴离子自由基(O2 -)的积累水平。在Joanna的染色方法的基础上进行适当的修改。简言之，将正常条件下(对照)和热胁迫处理下(热胁迫)的叶片浸泡在含有0.1％NBT(Nitrotetrazolium Blue chloride)的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.8)中。将溶液在水浴(95℃)中真空浸泡15分钟。将叶片用水合氯醛脱色，直到叶绿素完全消失，然后储存在50％甘油溶液中用于拍照。
1.10超氧化物歧化酶活性的测定
采集从顶部数第三片完全展开的叶片，并立即在液氮中冷冻。用研钵磨碎叶片，称取0.1g用于测量SOD活性。在Zhu等人的基础上进行适当的修改。在样品中加入含有1％聚乙烯吡咯烷酮的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)，振荡混匀后在4℃下以12000g离心10分钟，并立即将上清液用于SOD活性测定。一个单位的SOD活性被定义为在550nm波长下时引起50％的硝基蓝四唑还原抑制所需的酶量。
1.11酵母单杂交实验
为了鉴定SlWRKY3与SlGRXS1基因簇启动子是否结合，根据制造商的说明，通过Matchmaker One-Hybrid Library Construction and Screening试剂盒(Clontech，USA)进行酵母单杂交(Y1H)分析。将AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGADT7中，构建猎物载体。从番茄基因组DNA中扩增SlGRXS1基因簇的2-kb启动子片段，然后克隆到pAbai中，产生诱饵载体。所使用的引物序列列于表1中。首先将线性化的诱饵载体转化到酵母菌株Y1Hgold中，在SD/-Ura培养基上培养，并放置在30℃培养箱中培养三天。随后，将猎物载体转化到之前分别用诱饵载体转化的酵母菌株Y1H gold中，并将所得菌株在SD/-Leu-Ura培养基上培养。挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释至OD600为0.1，将稀释后的悬浮液在不同浓度金担子素A(AbA)的SD/-Leu-Ura培养基上点斑。SD/-Leu-Ura培养基中的AbA浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40和50(单位均为ng/ml)。
1.12电泳迁移率实验
从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，并通过同源重组方法将其重组到用NdeI/XhoI双酶切的PET15d-MBP载体中。将带有MBP标签的重组融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达。转化的BL21(DE3)细胞在400mL Luria-Bertani(LB)培养基中培养至OD600为0.6，然后在16℃下用异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达20小时，进一步纯化蛋白。将SlGRXS1f 2-kb启动子上的3个W-box元件分别用P1、P2和P3表示，并用FAM探针标记。对于标记探针，将FAM连接到5′端的正义寡核苷酸上。单链探针退火形成双链探针，然后稀释至10μM。对于竞争探针，单链探针退火形成双链探针，然后直接以100μM的浓度使用。SlWRKY3蛋白与双链探针在黑暗中用20μL反应混合孵育。在4℃下孵育30分钟后，在含有0.5×TBE缓冲液的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离混合物。80V，1h后进行成像。
1.13统计分析
使用SigmaPlot和Excel软件进行统计分析。数据来自三个独立的重复，以平均值±标准差(SD)表示。使用t检验对两组之间的显著差异进行检测。*表示P<0.05，**表示P<0.01。
2、结果
2.1SlWRKY3在不同非生物胁迫下的表达模式
WRKY转录因子在植物应对不同非生物胁迫的响应中具有重要意义。然而，它们在耐热性调节中的作用很大程度上仍然是未知的。为了探索WRKY转录因子家族的热胁迫响应，本发明从NCBI的SRA数据库(PRJNA560638)中获取了番茄在热胁迫下的RNA-seq数据。基于之前对WRKY转录因子的分类，本发明提取了其热胁迫反应数据(见表2)。本发明发现WRKY家族中的许多成员在热胁迫下上调或下调(见图1)。其中，四个成员SlWRKY3、SlWRKY18、SlWRKY59和SlWRKY78在热胁迫下显着上调(见图1，图2A～2D)。进一步分析发现SlWRKY3的上调倍数最高，本发明推测SlWRKY3最有可能参与番茄的热胁迫反应(见图2A)。为了验证本发明的猜想，本发明将AC幼苗在42℃下处理。处理后采集叶片提取RNA并进行反转录，进一步通过对SlWRKY3的表达量检测，本发明发现SlWRKY3在1h、3h和6h对热胁迫有较高的响应，尤其是在处理后1h最明显，表达量比对照高出4倍(见图2E)。本发明还鉴定了SlWRKY3对其他非生物胁迫(冷、盐、干旱)的响应，发现SlWRKY3可以被冷、盐或干旱不同程度地诱导(见图3)。综上所述，SlWRKY3参与了番茄对不同非生物胁迫的响应，尤其是在响应热胁迫中起重要作用。
表2番茄WRKY家族成员响应热胁迫表达谱数据
Figure BDA0003700478780000161
Figure BDA0003700478780000171
Figure BDA0003700478780000181
2.2 SlWRKY3是经典的WRKY转录因子
通过SOL Genomics Network数据库(//solgenomics.net/)本发明提取了SlWRKY3的序列并进行BLAST发现SlWRKY3编码461个氨基酸。本发明在NCBI数据库(NationalCenter for Biotechnology Information)中搜索了与SlWRKY3最同源的蛋白，分别在番茄、拟南芥和水稻中发现了2个、2个和3个。本发明进一步分析了这八个蛋白的保守结构域(见图4A)。多序列比对表明，这些蛋白中都包含两个由高度保守的WRKYGQK序列和两个C2H2锌指结构组成的WRKY结构域(见图4A)。根据保守结构域的分析，这些蛋白均属于Group IWRKY家族成员。
为了确定SlWRKY3的亚细胞定位，本发明构建了含有与101YFP融合的SlWRKY3的重组载体(见图4B)并瞬时转化到本氏烟草中。激光共聚焦扫描显微镜显示黄色荧光信号主要在细胞核中，并与细胞核标记完全重叠，表明SlWRKY3定位于细胞核。
为了检测SlWRKY3是否具有转录激活活性，本发明用在AH109酵母细胞中表达的pGBKT7-SlWRKY3进行了酵母双杂交实验(Y2H)(见图4C)。包含pGBKT7-SlWRKY3的酵母细胞在SD/-Trp培养基上正常生长，但在SD/-Trp-His-Ade培养基上不能生长，结果表明SlWRKY3在酵母中没有转录激活活性。此外，本发明还检测了在正常条件下生长的AC植株的不同组织部位中SlWRKY3的表达模式，发现SlWRKY3在所有组织中都有表达，特别是在开花后25天(25DPA)、成熟叶片(ML)，破色期果实(BR)和红熟期果实(RR)中有较高的表达(见图4D)，表明SlWRKY3可能在叶片和果实中发挥重要作用。基于这些结果，本发明得出结论，SlWRKY3是经典的WRKY转录因子。
2.3 SlWRKY3正向调节番茄的耐热性
为了分析SlWRKY3在番茄热胁迫反应中的作用，本发明通过遗传转化的方法获得了超量转基因系(OE)和突变体系(CR)。通过检测SlWRKY3的表达量，本发明选择表达显著升高的三个OE系OE-4、OE-8和OE-14进行功能分析(见图5A)。通过一代测序，本发明选择具有插入或缺失碱基的三个CR系CR-2、CR-6和CR-9进行功能分析(见图5B)。选择6周龄的幼苗进行热胁迫处理。在正常生长条件下，OE系、CR系和WT植株之间没有明显的表型差异(见图5C)。然而，经过两天的热胁迫处理(42℃)，OE系植株比WT耐受性更强，而与WT相比，CR系植株对热胁迫更敏感(见图5C)。将处理过的植株在正常生长条件恢复。恢复两天后，OE系相对于WT植株表现出更强的恢复能力，萎蔫程度可以得到很好的缓解。但CR系植株恢复能力最弱，萎蔫程度难以缓解(见图5C)。
DAB染色法用于测量过氧化氢(H2O2)的含量。本发明在正常生长条件和热胁迫下对OE系、CR系和WT植株的叶子进行了DAB染色(见图5D)。染色结果表明，OE系、CR系和WT在正常生长条件下无显着差异。然而，在热胁迫下CR系植株的叶片比WT植物染色更深，而在热胁迫下OE系植株的叶片比WT染色更浅。在热胁迫下，CR系植株中积累的H2O2较多，而OE系植株中积累的H2O2较少。NBT染色实验是一种类似于DAB染色的ROS积累指标，用于测量超氧阴离子(O2 -)的含量。本发明对正常生长条件和热胁迫下OE系、CR系和WT植株的叶片进行了NBT染色，获得了与DAB染色相似的结果(见图5E)。DAB和NBT染色实验共同表明OE系植株在热胁迫下积累的ROS较少，而CR系植物积累的ROS较多。除此之外，本发明还评估了SOD活性，即活性氧清除的指标(见图5F)。在正常生长条件下，OE系、CR系和WT植株之间没有显着差异。然而，热胁迫后，OE系、CR系和WT的SOD活性显着增加，但相对于WT，OE系的增加幅度较高，CR系较低。这些数据表明，OE系有更高的清除ROS的能力。
2.4热胁迫下SlWRKY3超量和突变体系的转录组分析
为了探索SlWRKY3介导的热胁迫耐受性的调控机制，本发明对OE-14系、CR-6系和WT植株在热胁迫下的叶片进行了RNA-Seq分析。在OE-14系和WT之间共鉴定出2335个DEG，CR-6系和WT之间共鉴定出1202个DEG(见图6A)。进一步分析表明，在热胁迫下的OE-14系、CR-6系和WT中共鉴定出407个DEG(见图6A，表3)。KEGG分析表明，SlWRKY3显着影响脂肪酸延伸、植物激素信号转导、角质、软木脂和蜡质生物合成等多种途径(见图6B)。这些基因在几个过程中富集，例如对创伤的反应、细胞氧化还原稳态和单羧酸生物合成(见图6C)。通过RNA-Seq分析揭示了热胁迫下51个基因在OE-14系中表达上调而在CR-6系中表达下调，34个基因在OE-14系中表达下调而在CR-6系中表达上调(见图6D)。
表3 RNA-seq中差异表达基因列表
Figure BDA0003700478780000191
Figure BDA0003700478780000201
Figure BDA0003700478780000211
Figure BDA0003700478780000221
Figure BDA0003700478780000231
Figure BDA0003700478780000241
Figure BDA0003700478780000251
Figure BDA0003700478780000261
Figure BDA0003700478780000271
Figure BDA0003700478780000281
本发明进一步分析了85个基因(51个基因和34个在OE-14系和CR-6系之间差异表达的基因)(见图6D)。这85个基因在生物质量、细胞氧化还原稳态、细胞稳态和稳态过程等生物过程(BP)的调节和蛋白质二硫键氧化还原酶活性、二硫键氧化还原酶活性、氧化还原酶活性和电子转移活性等分子功能(MF)的调控中显着富集(见图6E)。KEGG分析显示这些基因与植物激素信号转导和生物素代谢等途径显着相关(见图6F)。
本发明进一步通过定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法检测了RNA-seq中SlPRX(solyc02g092580)、SlPHR(solyc10g078720)和SlSGR(solyc06g068270)等胁迫相关差异基因的表达量，结果与RNA-seq数据相吻合，即这些基因在均在OE-14系中表达上调，在CR-6系中表达下调(见图7)。
2.5SlWRKY3通过激活一个SlGRXS1基因簇来调节热胁迫耐受性
RNA-seq的结果给本发明提供了SlWRKY3可能靶向氧化还原相关基因的线索(见图6C)。本发明进一步分析了显着富集的差异基因，并鉴定了一个含有六个基因的谷氧还蛋白(GRXs)基因簇。这些SlGRXs属于CC型GRX(Rouhier et al.2004)，并且基因簇成员之间有超过90％的同源性(见图8A)。通过BLAST对NCBI数据库查找这些SlGRXs的保守结构域，发现它们都分别包含一个Glrx-like-plant结构域(见图8B)。为了了解同源蛋白的系统发育关系，本发明分别从拟南芥和水稻中检索到8个和9个蛋白序列。系统发育树表明，SlGRXs与AtGRXS1(AT1G03020.1)更为同源(见图8C)，因此分别被命名为SlGRXS1a(solyc04g011800)，SlGRXS1b(solyc04g011810)，SlGRXS1c(solyc04g011830)，SlGRXS1d(solyc04g011840)，SlGRXS1e(solyc04g011860)和SlGRXS1f(solyc04g011870)。本发明进一步分析了热胁迫下SlWRKY3的OE系、CR系和WT中SlGRXS1基因簇的表达水平。由于6个SlGRXS1基因之间的同源性较高，本发明选择FPKM来表征其表达水平。相对于WT，SlGRXS1基因簇的表达水平在OE系中较高而在CR系中较低(见图8D～8I)。GRX已被证明广泛参与植物的非生物胁迫响应，这可能是SlWRKY3的OE系增强耐热性的基础。
2.6 SlWRKY3与SlGRXS1基因簇的启动子结合
为了探究SlGRXS1基因簇是否响应热胁迫，本发明提取了相应的转录组数据(见表4)，发现SlGRXS1基因簇在热胁迫下有不同程度的上调(见图9)。为了进一步确定SlWRKY3和SlGRXS1基因簇之间的调控机制，本发明分析了SlGRXS1基因簇的启动子。这六个SlGRXS1基因的启动子都包含几个W-box元件(WRKY转录因子家族的结合位点)(见表5)。本发明进一步通过酵母单杂交验证了SlWRKY3的确可以与SlGRXS1基因簇的启动子结合(见图10A～10F)。本发明进一步分析了SlGRXS1f的2-kb启动子区域，发现了三个W-box元件，分别命名为P1、P2和P3(见图10G)。随后进行了电泳迁移率实验(EMSA)，结果表明SlWRKY3与SlGRXS1f启动子中的三个W-box元件均可以结合，表明SlWRKY3通过W-box与SlGRXS1f启动子结合并调节其表达(见图10H～10J)。
表4 SlGRXS1基因簇成员热胁迫响应表达谱数据
Figure BDA0003700478780000291
表5 SlGRXS1基因簇成员启动子W-box元件分析
Figure BDA0003700478780000292
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaaaagca actccacttt cttctttatc tcttgagaag aagaagaaga aaactgaaaa 60
tgggggaaac aggggaagct tcagcaatat cgtttccatc tttgacaatt ccacctcgcc 120
cttcatttga atcctttttt aacatgtctt ctttcagccc aggtccaatg tctcttgttt 180
ccagtttctt gtctgatcag agccctgatt ctgcagattg tcctccttct ttctcccagc 240
ttctcgccgg atatgaatat tctggagatc ctcctgggtg tcaaaagaac tctgggtata 300
accaaaatgg gtctgtgaat cctcaattgt tcgttattcc ctctggtttg agtccttctg 360
gattccttaa ttctcctggc tttctttccc cacttcaggt aaaaatataa tctgctcaaa 420
ttcttcatct atcttgtaat aatatatcaa taatagccaa aaacttgttt ttttttattt 480
tatgttttga tttagtaatt tatctacttt ggtaagttta ttctataaac atgtttttga 540
taaggatcca gtattctagt aatgagttcg ctcaaacttt atatgtttta aatttcatca 600
agttgggtga atgcagacct tatccctacc tttgtgcgtt agaggtagag agactgtttc 660
taagttggtt atagaaatag ttaatctgaa agtcatcaaa attacttttg gcatcatgtg 720
gttacttatg gtatttcaat ttgattgtag agtccctttg gaatgtcaca tcagcaggct 780
ctagcacatg ttacagcaca ggctgaattt tctagttcat atatgcaaat gcaaatgcaa 840
atgcaagccc aagaccagtg ttcctctcag gtggctccag tagaagcatt aggacatgag 900
ttgtcgattg atccaaagga gtcttccttg cagataaagg aatgtctgca atctagtttg 960
gataacaagc catcagacaa tcagggtaag caatttgaac agccggaggt ttctcaatct 1020
gagaacaaga catcctctgg tgctctcgat aagccagctt gtgatggtta taactggaga 1080
aaatatggtc agaaaaaggt taaagctagt gaatgcccta ggagctacta taagtgcaca 1140
tatctcaaat gtctagtgaa gaagaaggtt gagcggtctg ttgatggtca cataactgag 1200
atcacatata atggccgtca caaccatgat caaccaacca aacgaagaaa aaatggttct 1260
gctttggata atacagactg ctttggagtt cgaccagata ttagtacaca tgattggaca 1320
gtaatgaata gctcggatgg gtcttctcct tctcgatctg accaggttcc aacccaaatg 1380
gtatctgaac ttcttgtgaa aagagaatgt gatgaaaccg aaagctattt gatagacgta 1440
gatgatgaag ggcatgatga accagatgca aagagaacgt gagtcctcct ttcatgacta 1500
aaagaatgcg ccatccttct ttagtaaaac aagaagaaaa tattgtagag caacaaaagt 1560
atgtatctaa ttcaattact atgtcacagg aagacggcaa ttgagactgt agcttcatca 1620
catgtcacag tagctgaatc caagattgtt ctgcagacga gaagtgaagt tgatttctta 1680
gatgatggat ataaatggcg aaaatatggg cagaaggtgg taaaggggac tcagcatcca 1740
aggtatcttc tgagttctga ctgcacaatt tttttcaatt taatgttagt tgctgttctg 1800
taagagtctt gttttatgta gagtttatta tcgtgaactc ttcaggaaat gatgctactt 1860
atctccttga acttcttaaa tataccaaaa caatagctca aatttcttgt gcatcttgat 1920
tttacaatag tctgaaatgg atacagtgtg aagtcccata caagaggaaa cttgcacaat 1980
gtagttaaga atgtcactag aggtttattc aacagtgata acatttctta cgaaatagga 2040
agaactggat gtatgaattt ttatgcgaaa gcatgtgcca gaatttaaag atctttatat 2100
gtgcatatga ttagtcatta gaacaaacaa gtgcagtaag atactctgga gattaaaatc 2160
aagtgctata atcagctgca gcgtcttgtt tgagcaatac tagttctttg tccttccaga 2220
atatgtttat cacatgtgtc ctgttctttt gctatatggc atcaataatc cgcttgtgca 2280
tccacacttg atatacagga gttactatcg gtgcacatat cctggatgca atgtccgcaa 2340
acaagtcgag agggcttcaa ctgatccaaa agctgtcata acaacatatg aaggcaagca 2400
taatcatgat attcctactg ttagtgttag gaatagagga acaaggaata aatacagcta 2460
aagatagcgt tgagaacgta agaaacagtg tgaaggcctt cagttcacaa aaatatcttg 2520
gtttctgaaa acaacaacaa aattccctcg tgtgaaaact gaaagattgc agcattagta 2580
gcatcaggaa aagtagaagg gtgaaaagat gtggtttgag cttcttactt ctgtacaaaa 2640
agcttattat attatctatt ccatgttgaa aaccacatgc ttggtccctt gaatttgttg 2700
gttggtctca agaaatattt gtaaatttta ttgctaattt gtaagatgtc taa 2753
<210> 2
<211> 1734
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaaaaagca actccacttt cttctttatc tcttgagaag aagaagaaga aaactgaaaa 60
tgggggaaac aggggaagct tcagcaatat cgtttccatc tttgacaatt ccacctcgcc 120
cttcatttga atcctttttt aacatgtctt ctttcagccc aggtccaatg tctcttgttt 180
ccagtttctt gtctgatcag agccctgatt ctgcagattg tcctccttct ttctcccagc 240
ttctcgccgg atatgaatat tctggagatc ctcctgggtg tcaaaagaac tctgggtata 300
accaaaatgg gtctgtgaat cctcaattgt tcgttattcc ctctggtttg agtccttctg 360
gattccttaa ttctcctggc tttctttccc cacttcagag tccctttgga atgtcacatc 420
agcaggctct agcacatgtt acagcacagg ctgaattttc tagttcatat atgcaaatgc 480
aaatgcaaat gcaagcccaa gaccagtgtt cctctcaggt ggctccagta gaagcattag 540
gacatgagtt gtcgattgat ccaaaggagt cttccttgca gataaaggaa tgtctgcaat 600
ctagtttgga taacaagcca tcagacaatc agggtaagca atttgaacag ccggaggttt 660
ctcaatctga gaacaagaca tcctctggtg ctctcgataa gccagcttgt gatggttata 720
actggagaaa atatggtcag aaaaaggtta aagctagtga atgccctagg agctactata 780
agtgcacata tctcaaatgt ctagtgaaga agaaggttga gcggtctgtt gatggtcaca 840
taactgagat cacatataat ggccgtcaca accatgatca accaaccaaa cgaagaaaaa 900
atggttctgc tttggataat acagactgct ttggagttcg accagatatt agtacacatg 960
attggacagt aatgaatagc tcggatgggt cttctccttc tcgatctgac caggttccaa 1020
cccaaatggt atctgaactt cttgtgaaaa gagaatgtga tgaaaccgaa agctatttga 1080
tagacgtaga tgatgaaggg catgatgaac cagatgcaaa gagaacgaag acggcaattg 1140
agactgtagc ttcatcacat gtcacagtag ctgaatccaa gattgttctg cagacgagaa 1200
gtgaagttga tttcttagat gatggatata aatggcgaaa atatgggcag aaggtggtaa 1260
aggggactca gcatccaagg agttactatc ggtgcacata tcctggatgc aatgtccgca 1320
aacaagtcga gagggcttca actgatccaa aagctgtcat aacaacatat gaaggcaagc 1380
ataatcatga tattcctact gttagtgtta ggaatagagg aacaaggaat aaatacagct 1440
aaagatagcg ttgagaacgt aagaaacagt gtgaaggcct tcagttcaca aaaatatctt 1500
ggtttctgaa aacaacaaca aaattccctc gtgtgaaaac tgaaagattg cagcattagt 1560
agcatcagga aaagtagaag ggtgaaaaga tgtggtttga gcttcttact tctgtacaaa 1620
aagcttatta tattatctat tccatgttga aaaccacatg cttggtccct tgaatttgtt 1680
ggttggtctc aagaaatatt tgtaaatttt attgctaatt tgtaagatgt ctaa 1734

Claims (10)

1.一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法包括：
WRKY转录因子SlWRKY3，属于Group I WRKY家族成员，SlWRKY3在热胁迫下显著上调；SlWRKY3通过清除活性氧和提高超氧化物歧化酶活性，正向调节番茄的耐热性；SlWRKY3正向调控胁迫响应相关基因的表达。
2.如权利要求1所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法包括以下步骤：
步骤一，确定植物材料和生长条件，载体构建与番茄遗传转化；
步骤二，RNA提取和基因表达量检测，确定非生物胁迫处理与生长参数；
步骤三，转录组测序和亚细胞定位，酵母细胞中的转录激活活性分析；
步骤四，分别进行DAB染色和NBT染色，超氧化物歧化酶活性的测定；
步骤五，分别进行酵母单杂交实验和电泳迁移率实验，统计分析。
3.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤一中的植物材料和生长条件的确定包括：
以番茄品种AC为材料进行遗传转化；植物在25±2℃的温室中生长，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为60～70％；采集AC的不同组织部位样品，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃冰箱用于RNA提取；
将T2代超量转基因系，突变体系以及AC的种子在温室中播种生长；将2周龄的幼苗移栽到10cm×10cm×10cm的塑料盆中，定期浇水以进行耐热性测定。
4.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤一中的载体构建与番茄遗传转化包括：
对于过表达载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的编码区CDS，使用
Figure FDA0003700478770000011
II一步克隆试剂盒克隆到pHELLSGATE8载体中；选择SlWRKY3第一外显子的两个靶点构建CRISPR/Cas9载体，构建成功的载体分别通过电击的方法转化到农杆菌菌株C58中，并用于番茄遗传转化；
通过PCR鉴定并确认具有pHELLSGATE8载体插入的超量转基因系；通过一代测序的方法对遗传转化得到的CRISPR/Cas9植株进行靶点编辑情况检测，鉴定出SlWRKY3突变体系。
5.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤二中的RNA提取和基因表达量检测包括：
对正常条件和高温胁迫下的叶片以及不同组织部位的AC进行样品采集，用Trizol试剂提取总RNA，使用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒合成互补DNA；使用SYBR LightCycler 480仪器检测基因的表达量；以番茄肌动蛋白基因BT013524为内参；基因的相对表达量用2-△△CT方法计算，包含三次技术重复；
所述非生物胁迫处理与生长参数的确定包括：
对正常条件下生长的6周龄幼苗进行非生物胁迫处理，并检测SlSWRKY3的表达量；对于高温和低温胁迫处理，将幼苗分别置于42℃和4℃的光照培养箱中；未经任何温度处理的幼苗作为相应的对照；对于盐胁迫处理，用200mM NaCl喷洒幼苗，并以喷洒水作为对照；对于干旱胁迫，将幼苗从土壤中采集后放在超净工作台中；在处理后0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h采集幼苗，立即在液氮中冷冻，用于RNA提取和基因表达量的检测；
对于SlWRKY3的超量转基因系和突变体系，在42℃处理后2天，采集从顶部数第三片完全展开的叶片；一部分样品在液氮中冷冻，用于测定超氧化物歧化酶活性，另一部分用于DAB和NBT染色；每株系进行三次重复，每个重复至少取三株幼苗；分别在处理前、处理后和恢复两天后拍照记录植株表型。
6.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤三中的转录组测序包括：
将6周龄WT、OE-14系和CR-6系植株进行热胁迫处理，处理6h后采集叶片用于总RNA提取以及转录组测序；每个系均包含三个独立的生物学重复；使用Hiseq-PE150测序系统对样品进行测序；利用平均FPKM的基因表达方法，产生两倍以上表达且FDR调整的p值小于0.05的基因被鉴定为差异表达基因；
所述亚细胞定位包括：
对于亚细胞定位载体的构建，从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，随后通过同源重组的方法克隆到101YFP载体中；将CaMV35S:SlWRKY3-YFP的融合蛋白和细胞核标记CaMV35S:StERF3-RFP共同注射并瞬时表达到烟草叶片中；注射两天后，用激光共聚焦扫描显微镜观察烟草叶肉细胞的中的荧光；
所述酵母细胞中的转录激活活性分析包括：
将从AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGBKT7载体中，并将pGBKT7载体转入酵母菌株AH109中并在SD/-Trp平板上进行30℃培养；3天后，挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释，分别在SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade培养基上点斑，进行30℃培养3天后观察结果。
7.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤四中的DAB染色包括：
DAB染色可以反映植物体内过氧化氢的积累水平；将正常条件下和热胁迫处理下的叶片在黑暗中用1mg/mL二氨基联苯胺溶液中浸泡6h；将染色后的叶片转移到漂白溶液中，并在90～95℃的水浴中放置15min以去除叶绿素；其中，所述漂白溶液由乙醇、乙酸和甘油按照3：1：1的比例混合而成；
所述NBT染色包括：
NBT染色可以反映植物体内超氧阴离子自由基的积累水平；将正常条件下和热胁迫处理下的叶片浸泡在含有0.1％NBT的10mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液中；将溶液在95℃的水浴中真空浸泡15min；将叶片用水合氯醛脱色，直到叶绿素完全消失，并储存在50％甘油溶液中用于拍照；
所述超氧化物歧化酶活性的测定包括：
采集从顶部数第三片完全展开的叶片，并立即在液氮中冷冻；用研钵磨碎叶片，称取0.1g用于测量SOD活性；在样品中加入含有1％聚乙烯吡咯烷酮的50mM pH 7.8的磷酸钾缓冲液，振荡混匀后在4℃下以12000g离心10min，并立即将上清液用于SOD活性测定；一个单位的SOD活性被定义为在550nm波长下时引起50％的硝基蓝四唑还原抑制所需的酶量。
8.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤五中的酵母单杂交实验包括：
通过Matchmaker One-Hybrid Library Construction and Screening试剂盒进行酵母单杂交分析，鉴定SlWRKY3与SlGRXS1基因簇启动子是否结合；将AC的cDNA中扩增的SlWRKY3的CDS克隆到pGADT7中，构建猎物载体；从番茄基因组DNA中扩增SlGRXS1基因簇的2-kb启动子片段，并克隆到pAbai中产生诱饵载体；将线性化的诱饵载体转化到酵母菌株Y1H gold中，在SD/-Ura培养基上培养，并放置在30℃培养箱中培养三天；将猎物载体转化到之前分别用诱饵载体转化的酵母菌株Y1H gold中，并将所得菌株在SD/-Leu-Ura培养基上培养；挑取阳性克隆用灭菌的蒸馏水稀释至OD600为0.1，将稀释后的悬浮液在不同浓度金担子素A的SD/-Leu-Ura培养基上点斑；SD/-Leu-Ura培养基中的AbA浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40和50ng/ml。
9.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤五中的电泳迁移率实验包括：
从AC的cDNA中扩增SlWRKY3的CDS，并通过同源重组方法将其重组到用NdeI/XhoI双酶切的PET15d-MBP载体中；将带有MBP标签的重组融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中表达；转化的BL21细胞在400mL LB培养基中培养至OD600为0.6，并在16℃下用异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导蛋白表达20h，纯化蛋白；将SlGRXS1f 2-kb启动子上的3个W-box元件分别用P1、P2和P3表示，并用FAM探针标记；对于标记探针，将FAM连接到5′端的正义寡核苷酸上；单链探针退火形成双链探针，并稀释至10μM；对于竞争探针，单链探针退火形成双链探针，并直接以100μM的浓度使用；SlWRKY3蛋白与双链探针在黑暗中用20μL反应混合孵育；在4℃下孵育30min后，在含有0.5×TBE缓冲液的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离混合物；80V，1h后进行成像。
10.如权利要求2所述的高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法，其特征在于，所述步骤五中的统计分析包括：
使用SigmaPlot和Excel软件进行统计分析；数据来自三个独立的重复，以平均值±标准差表示；使用t检验对两组之间的显著差异进行检测；*表示P<0.05，**表示P<0.01。
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