CN108103074B

CN108103074B - 二穗短柄草抗旱基因和表达载体及其编码蛋白质与应用

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Publication number: CN108103074B
Application number: CN201711426688.XA
Authority: CN
Inventors: 何光源; 杨广笑; 常俊丽; 何圆; 张扬
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN108103074A

Abstract

本发明提供了一种二穗短柄草抗旱基因和表达载体及其编码蛋白质与应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列或与SEQ ID NO.1所示的序列互补的核苷酸序列。该蛋白质由权利要求1所述的基因编码得到，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述基因用于在提高植物对干旱胁迫的耐受性方面的应用。本发明所述基因调节植物通过关闭气孔减少蒸腾作用损失的水分；在干旱条件下具有更发达的根系保证水分吸收；能够提高抗氧化酶系统中过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等酶活力以及时清除活性氧ROS，降低活性氧对细胞造成的氧化损伤，提高植物对干旱的耐受性。

Description

二穗短柄草抗旱基因和表达载体及其编码蛋白质与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及到二穗短柄草抗旱基因和表达载体及其编码蛋白质与应用。

背景技术

干旱、高盐、极端温度等逆境条件严重危害植物的正常生长发育，并造成农作物减产。近年来，面对环境气候逐渐恶化的严峻现实，如何提高植物抗性以应对非生物逆境胁迫压力越来越受到人们的重视。植物在长期适应外界环境的过程中，进化出了动态的基因调控网络和复杂的生理变化机制。抗逆基因的鉴定与功能研究，对阐明植物抗逆性的分子机制及其育种实践均具有重要意义。与传统育种方法相比，转基因技术因为周期短、效率高等优点，被越来越多地应用到农业科学与实践之中。近年来随着生物信息学、基因组学、测序技术等的快速发展，越来越多的与植物抗逆相关的基因及基因家族被鉴定和克隆，为作物育种提供了良好的资源和理论基础。

14-3-3蛋白通过与被磷酸化了的靶蛋白相结合进而改变靶蛋白的定位、活性、稳定性等生理特性，在植物生命进程中发挥广泛而重要的调节作用。通过酵母双杂交、文库筛选等实验方法，上百个潜在的14-3-3蛋白的靶蛋白被鉴定，其中涉及到基础代谢、光信号通路、生物、非生物逆境胁迫、植物激素信号转导等多种生理过程，为14-3-3蛋白功能的鉴定展示了广阔前景。近些年来，在拟南芥、大豆等物种中的研究表明，14-3-3蛋白在植物非生物逆境胁迫应答过程中发挥着重要作用。

二穗短柄草为禾本科早熟禾亚科一年生草本植物，具有植株矮小、生长周期短、生活条件要求简单、自花授粉等特点，二倍体染色体构成简单、基因组小仅有272Mb，介于拟南芥(119Mb)和水稻(382Mb)之间、DNA重复序列少、基因密度高、基因组序列与小麦、大麦等禾本科早熟禾亚科物种共线性好、与水稻相比，与小麦等农作物具有更近的亲缘关系。随着2010年二穗短柄草二倍体株系Bd21基因组测序的完成，二穗短柄草作为一种新兴的禾本科模式植物越来越受到人们关注。

由于二穗短柄草与小麦等农作物亲缘关系密切，鉴定二穗短柄草抗逆基因并分析其功能有助于推动对小麦、大麦等农作物非生物胁迫响应相关基因的研究。在二穗短柄草中分离得到抗干旱功能基因，为运用基因工程技术提高作物的抗干旱性，提供了更加丰富的抗逆优良候选基因。

发明内容

本发明提供了二穗短柄草抗旱基因BdGF14g和表达载体及其编码蛋白和应用，为作物抗逆尤其是抗旱提供了一种新的基因及应用。

按照本发明的第一方面，提供了一种植物抗旱基因，该基因的核苷酸序列为SEQID NO.1所示序列或与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列。

按照本发明的另一方面，提供了一种植物蛋白质，该蛋白质由权利要求1所述的基因编码得到，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，该蛋白质在细胞核、细胞质和细胞膜中表达。

按照本发明的另一方面，提供了一种重组表达载体，该载体含有权利要求1所述的基因。

优选地，该载体还含有报告基因；

优选地，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因。

按照本发明的另一方面，提供了一种工程菌，含有权利要求3-5任一所述的重组表达载体；

优选地，所述工程菌为大肠杆菌。

按照本发明的另一方面，提供了如权利要求1所述基因在提高植物对干旱胁迫的耐受性方面的应用。

优选地，所述基因通过提高植物抗氧化酶活力来清除植物活性氧，降低活性氧对细胞造成的氧化损伤；

优选地，所述抗氧化酶为过氧化氢酶、过氧化物酶或超氧化物歧化酶。

优选地，所述基因通过参与ABA信号途径，提高植物对干旱胁迫的耐受性；

优选地，所述基因通过参与ABA信号途径介导的植物气孔关闭，提高植物对干旱胁迫的耐受性。

优选地，所述基因在干旱条件下通过促进植物形成发达的根系，提高植物对干旱胁迫的耐受性。

优选地，所述基因通过诱导蔗糖合成酶基因和脱水响应蛋白基因表达，使植物细胞中蔗糖和脱水响应蛋白积累，从而使细胞内的渗透压提高，提高植物对干旱胁迫的耐受性。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明所述基因过表达提高了转基因植株对干旱胁迫的耐受性。干旱胁迫使植物细胞内活性氧ROS含量升高，造成细胞膜及细胞内不可逆的氧化损伤；降低CO₂摄入量引起光呼吸作用增强，阻碍ATP合成等，最终引起光合作用等多种重要生理过程受阻，导致作物产量下降。本发明所述基因调节植物关闭气孔减少蒸腾作用损失的水分；形成更多更发达的根系保证水分的吸收；所述基因通过诱导蔗糖合成酶基因和脱水响应蛋白基因表达，使植物细胞中蔗糖和脱水响应蛋白积累，从而使细胞内的渗透压提高，提高植物对干旱胁迫的耐受性；所述基因通过提高抗氧化酶系统中过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等酶活力以及时清除活性氧ROS，以此降低活性氧对细胞造成的氧化损伤，提高植物对干旱的耐受性。

(2)本发明所述蛋白定位在细胞核、细胞质和细胞膜中，对生物体在面对干旱环境时，该蛋白在细胞中存在普遍的调节作用，在外界干旱胁迫响应中发挥着重要作用。

附图说明

图1是利用荧光倒置显微镜观察BdGF14g基因的报告基因绿色荧光蛋白的表达。

图2是BdGF14g转基因烟草株系转录表达水平的半定量分析。

图3是BdGF14g基因过表达株系烟草抗旱性的影响。(a)将在MS固体培养基上正常生长一周的转基因烟草及野生型烟草幼苗转移到分别含有250mM及350mM甘露醇的MS固体培养基上继续生长两周，观察其根长生长情况；(b)测量正常生长条件下及甘露醇处理条件下各转基因株系及野生型烟草幼苗根长并统计结果；(c)将在MS固体培养基上正常生长两周的转基因及野生型烟草幼苗移栽至营养土中继续生长三周，干旱处理25天，观察其表型。浇水恢复7天，观察其表型；(d)浇水恢复7天后，统计各转基因株系及野生型烟草存活率。星号表示各转基因烟草株系与野生型烟草植株间各指标差异的显著性(*P<0.05；**P<0.01)。

图4为BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草生理指标的测量。将在MS培养基上正常生长两周的BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草移栽到营养土中正常生长三周，干旱处理15天，分别取正常生长条件及干旱处理下BdGF14g基因过表达烟草株系及野生型烟草的叶片，测量其(a)相对水含量(RWC)、(b)丙二醛(MDA)含量、(c)过氧化氢(H₂O₂)含量、(d)离子渗漏(ion leakage)、(e)过氧化氢酶(CAT)活性、(f)过氧化物酶(POD)活性、(g)超氧化物歧化酶(SOD)活性、(h)总抗氧化能力、(i)内源ABA含量。星号表示各转基因烟草株系与野生型烟草植株间各生理指标差异的显著性(*P<0.05；**P<0.01)。

图5为BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草相关基因表达分析。(a)图为NtABF2基因转录表达水平的差异；(b)图为NtNCED1基因转录表达水平的差异；(c)图为NtERD10C基因转录表达水平的差异；(d)图为NtSUS1基因转录表达水平的差异；星号表示不同过表达烟草株系与野生型烟草植株中各相关基因转录表达水平差异的显著性(*P<0.05；**P<0.01)。

图6BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草气孔实验分析。(a)图为在荧光倒置显微镜下观察各转基因株系及野生型烟草叶片下表皮气孔的张开情况；(b)图为野生型株系与转基因株系气孔开度差异对照图；星号表示转基因株系与野生型烟草植株间气孔开度差异的显著性(*P<0.05；**P<0.01)。

图7为钨酸钠处理后BdGF14g基因过表达烟草株系失去对干旱胁迫的耐受性。(a)图表示每张图中三个对应部分分别为野生型植株、OE1转基因株系以及OE2转基因株系的干旱胁迫表型图；(b)图表示野生型植株、OE1转基因株系以及OE2转基因株系在MS基础培养基中的干旱胁迫表型图；(c)图表示野生型植株、OE1转基因株系以及OE2转基因株系在甘露醇处理条件下的干旱胁迫表型图；(d)图表示野生型植株、OE1转基因株系以及OE2转基因株系在甘露醇、钨酸钠共同处理条件下的干旱胁迫表型图；(e)甘露醇处理及甘露醇、钨酸钠共同处理下BdGF14g基因过表达烟草株系及野生型烟草植株过氧化氢(H₂O₂)含量；(f)甘露醇处理及甘露醇、钨酸钠共同处理下BdGF14g基因过表达烟草株系及野生型烟草植株过氧化氢酶(CAT)活性；(g)甘露醇处理及甘露醇、钨酸钠共同处理下BdGF14g基因过表达烟草株系及野生型烟草植株总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；星号表示各转基因株系与野生型烟草植株间各生理指标差异的显著性(*P<0.05；**P<0.01)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：二穗短柄草BdGF14g基因的分离

1、BdGF14g基因克隆

在Phytozome v11.0(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)Blast得到的14-3-3基因序列提交NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对分析。利用Oligo7引物设计软件对二穗短柄草BdGF14g基因特异性扩增引物，引物序列见SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4，PCR反应体系见表1，PCR程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s；65℃退火5s；72℃延伸11s；72℃终延伸10min；4℃保存。其中，变性、退火、延伸三个连续的步骤设置35个循环反应。

表1 PCR反应体系

2、目的片段的胶回收

将PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶上进行点样，在120V电压下电泳20min。用凝胶成像分析系统检测目的条带，在蓝光切胶仪上用手术刀小心切下目的片段胶带放至1.5mL灭菌离心管中，用天根生化科技有限公司胶回收试剂盒进行目的片段的回收。实验步骤如下：

1)在装有切下的目的基因胶块的1.5mL离心管中加入等体积的溶胶液PN，在50℃水浴锅中溶化胶块，期间不时颠倒混匀，将溶化好的胶块冷却至室温；

2)将冷却至室温的溶胶液加入事先平衡好的吸附柱中(吸附柱装在收集管中)，室温吸附1min；

3)将装有吸附柱的收集管进行12,000rpm离心1min，弃上清；

4)在吸附柱中加入500μL漂洗液PW漂洗，弃上清；

5)重复步骤4)；

6)将装有吸附柱的收集管13,000rpm空离2min；

7)去掉收集管，打开吸附柱盖子并在室温下晾干；

8)将晾干的吸附柱套在新的收集管中，向吸附柱中间加入30μL洗脱缓冲液EB(65℃预温)，室温放置2min；

9)将上述收集管12,000rpm离心2min，收集所得液体，即目的基因DNA溶液。

3、BdGF14g基因的克隆载体构建

按照表2配置连接反应体系。将反应体系PCR管用涡旋仪混匀，并离心，置于16℃恒温连接仪上反应过夜。

表2连接反应体系

4、大肠杆菌感受态细胞的转化

大肠杆菌感受态细胞的转化所有步骤均在超净工作台中进行无菌操作，具体实验步骤如下：

1)取10μL连接产物加入到50μL感受态细胞(冰上放置)中，轻轻混匀，离心，冰浴30min；

2)将冰浴好的感受态细胞在42℃水浴锅中热激90s，迅速冰浴5min；

3)在感受态细胞中加入200μL LB液体培养基，在摇床上37℃，220rpm培养1h；

4)将培养的感受态细胞菌液涂平板至含有50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上；

5)恒温培养箱中37℃倒置培养过夜。

5、菌液PCR检测

在倒置培养过夜的LB固体培养基上，挑取10个单克隆至2mL灭菌离心管中，加入含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，在摇床中37℃，280rpm振荡培养3h，在超净工作台中分别吸取2μL菌液作为检测模板进行PCR扩增，PCR反应体系同表2，PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；65℃退火5s；72℃延伸11s；72℃终延伸10min；4℃保存。其中，变性、退火、延伸三个连续的步骤设置35个循环反应。PCR反应程序结束后，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统分析检测结果，得到含有正确目的条带的单克隆并送测序，将测序正确的单克隆菌液保种。

实施例2：pBI121-BdGF14g-GFP真核表达载体的构建

1、BdGF14g基因的PCR扩增

分别以含有测序正确的二穗短柄草BdGF14g基因的克隆载体pMD18-T-BdGF14g为模板，用Oligo7引物设计软件设计5’端带有pBI121载体多克隆位点区XbaI酶切位点及BamHI酶切位点的基因特异性引物进行PCR扩增，引物序列见表SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，PCR反应体系见表3/同表1，PCR程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s；65℃退火5s；72℃延伸11s；72℃终延伸10min；4℃保存。其中，变性、退火、延伸三个连续的步骤设置35个循环反应。

表3 PCR反应体系

2、目的片段的胶回收

3)将装有吸附柱的收集管进行12,000rpm离心1min，弃上清；

4)在吸附柱中加入500μL漂洗液PW漂洗，弃上清；

5)重复步骤4)；

6)将装有吸附柱的收集管13,000rpm空离2min；

7)去掉收集管，打开吸附柱盖子并在室温下晾干；

3、pBI121-GFP空载体的酶切反应

按照限制性内切酶说明书在250μL灭菌小离心管中配制好酶切反应体系，涡旋混匀并短暂离心后，放入37℃恒温培养箱进行pBI121-GFP空载体酶切反应20min。酶切体系如表4。酶切结束后，将酶切反应体系离心管置于80℃水浴锅水浴10min将限制性内切酶灭活，并冷却至室温。

表4酶切反应体系

4、目的基因连接到载体

用T4连接酶将胶回收的目的基因片段与双酶切过的pBI121-GFP空载体进行连接反应，连接体系如表5。将反应体系PCR管用涡旋仪混匀，并离心，置于16℃恒温连接仪上反应过夜。

表5连接反应体系

5、大肠杆菌感受态细胞的转化

5)恒温培养箱中37℃倒置培养过夜。

6、菌液PCR检测

在倒置培养过夜的LB固体培养基上，挑取10个单克隆至2mL灭菌离心管中，加入含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，在摇床中37℃，280rpm振荡培养3h，在超净工作台中分别吸取2μL菌液作为检测模板进行PCR扩增，PCR反应体系同表2，PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；65℃退火5s；72℃延伸11s；72℃终延伸10min；4℃保存。其中，变性、退火、延伸三个连续的步骤设置35个循环反应。PCR反应程序结束后，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统分析检测结果，得到含有正确目的条带的单克隆，将该单克隆菌液保种，并取20μL该菌液加入25mL含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基进行扩大培养，待抽质粒。

7、质粒提取

使用天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒提取质粒，操作步骤如下：

1)将25mL扩大培养的含有正确目的条带的单克隆大肠杆菌菌液进行12,000rpm离心1min，弃上清；

2)在所得大肠杆菌菌体中加入1mL P1溶液重悬，用涡旋仪混匀；

3)在上述溶液中加入1mL P2溶液室温裂解3min，其间轻柔混匀不得剧烈震荡，直至菌液变得澄清；

4)在上述溶液中迅速加入1.4mL P3溶液，迅速轻轻混匀以防产生局部沉淀；

5)将离心管进行12,000rpm离心10min，转移上清至事先平衡好的吸附柱中(吸附柱套在收集管中)，室温吸附1min；

6)将收集管12,000rpm离心1min，弃上清；

7)在吸附柱中加入500μL漂洗液PW，进行12,000rpm离心1min，弃上清；

8)重复步骤7)；

9)将收集管13,000rpm离心2min；

10)去掉收集管，打开吸附柱盖子，室温晾干；

11)将晾干的吸附柱套在新的收集管中，向吸附柱中间悬空加入60μL洗脱缓冲液EB(65℃预温)，室温静置2min；

12)将收集管12,000rpm离心1min，所得溶液即含有目的基因的质粒溶液。

8、重组质粒的酶切鉴定

酶切体系的配制同表4。将配好的酶切反应体系用涡旋仪混匀，离心，37℃恒温培养箱反应20min，加入1μL 10×上样缓冲液终止酶切反应，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下检测重组质粒是否含有被正确双酶切开的目的条带。

9、重组质粒测序

将被正确双酶切开的重组质粒送测序公司测序，得到pBI121-BdGF14g-GFP真核表达载体。

实施例3：二穗短柄草BdGF14g蛋白的亚细胞定位

1、农杆菌感受态的制备及转化

农杆菌细胞感受态的制备及转化实验所有操作步骤均在超净工作台中进行无菌操作，具体流程如下：

1)用微量移液器从-80℃超低温冰箱吸取保种的农杆菌EHA105菌株菌液10μL至2mL灭菌离心管中，加入1mL含有50mg/L链霉素的YEB液体培养基，在28℃摇床上用200rpm转速进行过夜培养；

2)取1mL上述所得菌液转移至100mL YEB中(内含50mg/L链霉素)，在28℃摇床200rpm进行扩大培养，用紫外/可见分光光度计测量其OD值至OD₆₀₀＝0.4左右；

3)将上述农杆菌菌液冰浴30min；

4)将冰浴后的农杆菌菌液进行4℃，5,000rpm离心5min；

5)去上清，在所得菌体中加入预冷的10mL 20mM CaCl₂悬浮所得菌体；

6)将悬浮的农杆菌进行4℃，5,000rpm离心5min；

7)去上清，在所得菌体中加入1mL 20mM CaCl₂再次悬浮所得菌体；

8)将上述农杆菌菌体悬浮液分装到1.5mL的灭菌离心管中，用液氮对其进行冷冻处理。将制备成功的农杆菌感受态细胞保存至-80℃超低温冰箱。

9)取制备成功的农杆菌感受态细胞放置于冰上，向其中加入8μL重组质粒载体；

10)将含有重组质粒的农杆菌感受态细胞冰浴30min；

11)将上述农杆菌感受态细胞进行液氮处理1min；

12)将液氮处理后的感受态细胞放至37℃水浴锅中水浴5min后，立即放至冰上冰浴2-5min；

13)向上述农杆菌感受态细胞中加入500μL YEB液体培养基；

14)将上述农杆菌菌液在28℃摇床上200rpm振荡培养3小时；

15)将培养好的农杆菌菌液涂平板至添加50mg/L链霉素，50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上，28℃恒温培养箱中避光倒置培养3天；

16)用基因特异性引物对在上述筛选培养基上生长出来的农杆菌单克隆进行PCR检测，将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下分析农杆菌转化阳性克隆，挑取阳性克隆至1mL添加50mg/L链霉素，50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，在28℃摇床上200rpm振荡培养6h，进行保种，用于下一步烟草叶片下表皮的注射。

2、农杆菌瞬时转化烟草叶片

农杆菌的活化在超净工作台中进行无菌操作，步骤如下：

1)挑取含有目的基因pBI121-BdGF14g-GFP重组质粒载体及pBI121-GFP空载体对照的农杆菌划线平板单克隆，加入5-10mL LB液体培养基，在28℃摇床上250rpm振荡培养过夜；

2)按1:500-1,000的比例将上述活化的农杆菌菌液转接至LB液体培养基(含10mMMES，20μM乙酰丁香酮，50mg/L卡那霉素，50mg/L链霉素)中，在28℃条件下250rpm摇床振荡培养过夜；

3)将上述农杆菌菌液进行4℃，4,000rpm离心10min，去上清；

4)用重悬缓冲液重悬所得菌体；(重悬缓冲液含10mM MES，150μM乙酰丁香酮，10mMMgCl₂)

5)测量重悬菌液在600nm波长处的OD值；

6)用重悬缓冲液调整菌体重悬液OD值至OD₆₀₀＝1-1.5；

7)室温静置菌体重悬液3-6h；

8)烟草叶片注射：从人工气候室取生长状态良好、叶片大而平展的烟草叶片，用注射器进行烟草叶片下表皮的注射。注射时，一只手轻轻推送注射器，另一只手小心抵住注射部位叶片下表皮，避免菌液流出；

9)注射过的烟草重新放回人工气候室继续培养24-36h，用镊子分别小心撕取注射含目的基因pBI121-BdGF14g-GFP重组质粒载体及pBI121-GFP空载体对照农杆菌菌液的烟草叶片下表皮，铺至滴有一滴无菌超纯水的干净载玻片上，使之平展，再用盖玻片轻轻盖好，避免产生气泡，用滤纸从一侧将多余水分吸干，制成临时观察用玻片，放至荧光倒置显微镜下观察注射有不同基因载体及空载体对照农杆菌的烟草叶片绿色荧光蛋白表达情况。

用含目的基因pBI121-BdGF14g-GFP重组质粒载体及pBI121-GFP空载体对照的农杆菌菌液对烟草叶片下表皮细胞进行瞬时转化后，撕取烟草叶片下表皮利用荧光倒置显微镜对绿色荧光蛋白的表达情况进行观察。结果如图1所示，在注射含pBI121-GFP空载体对照农杆菌的烟草叶片中，绿色荧光蛋白在叶片下表皮细胞膜、细胞质、细胞核内均有表达；注射含目的基因pBI121-BdGF14g-GFP重组质粒载体农杆菌的烟草叶片中，绿色荧光蛋白在叶片下表皮细胞膜、细胞质、细胞核均有表达，表明BdGF14g蛋白定位于细胞核、细胞质、细胞膜中。

实施例4：二穗短柄草BdGF14g基因遗传转化烟草

1、烟草叶片的处理

处理烟草叶片所有实验步骤均在超净工作台中进行无菌操作，流程如下：

1)选取长势良好、大而平展的烟草叶片，用75％乙醇消毒表面10s，无菌超纯水清洗3-5遍；

2)用0.1％HgCl₂消毒叶片8min，无菌水清洗3-5遍；

3)用灭菌滤纸擦干烟草叶片表面，用锋利的手术刀将其切成1×1cm²的小块，放至共培养基平板上28℃暗培养3天，期间及时检查叶片染菌情况并及时处理。

2、农杆菌的活化

1)挑取含有目的基因质粒载体的农杆菌平板划线单克隆，加入5-10mLLB液体培养基，在28℃摇床中250rpm振荡培养过夜；

2)按1:500-1,000的比例将振荡培养过夜的农杆菌转接至新的LB液体培养基中(含10mM MES生物缓冲液，20μM乙酰丁香酮，50mg/L卡那霉素，50mg/L链霉素)，在相同条件下继续培养，直至OD₆₀₀升至大约0.4；

3)将上述农杆菌菌液进行4℃，4,000rpm离心10min，去上清；

4)用MS液体培养基(含10mM MES生物缓冲液，150μM乙酰丁香酮，10mM MgCl₂)重悬所得菌体。

3、农杆菌侵染烟草叶片

1)取出暗培养的烟草叶片放至盛有用MS液体培养基悬浮的农杆菌菌液的三角瓶中浸染10min，期间不断摇晃，使农杆菌充分接触侵染叶片；

2)倒掉农杆菌菌体悬浮液，用灭菌滤纸小心擦干烟草叶片表面残留的农杆菌菌液；

3)在共培养固体培养基上铺一层灭菌滤纸，使滤纸与培养基贴合，将侵染后的叶片下表皮朝下接触滤纸平铺于培养基上，叶片之间稍留空隙，进行为期三天的共培养；

4)将以上烟草叶片挪至分化平板，进行25℃光照培养。期间不断观察愈伤生长分化情况，并注意及时清理和转移染菌叶片；

5)待经农杆菌侵染的烟草叶片边缘长出愈伤组织，并分化出芽时，用锋利的手术刀片切下小芽相对粗壮的嫩茎部分，将其插在生根培养基中，在组织培养间继续进行25℃光照生根培养；

6)待生根培养基中的小芽生根且根系生长较为发达后移栽至营养土中，在人工气候室继续光照培养。

4、转基因烟草阳性植株鉴定及转基因株系的获得

用液氮对在人工气候室培养的，生长状态良好的转基因烟草幼苗叶片分别进行取样，用植物总RNA提取试剂盒分别提取所取样本总RNA，用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA作为转基因植株阳性检测的模板。分别用基因特异性引物及载体上标记基因的引物对各转基因烟草株系cDNA模板进行PCR检测，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下鉴定含有目的基因的转基因阳性烟草幼苗并最终分别收获其种子。将所收取不同转基因株系阳性种子晒干后放至冷库处理两周。从冷库取转基因阳性不同烟草株系的种子，放入2mL灭菌离心管中，在超净工作台中分别用75％乙醇消毒其表面30s，10％过氧化氢消毒8min，用无菌超纯水清洗3-5遍后，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，放至组织培养间进行光照培养。观察含有卡那霉素的筛选培养基上转基因烟草种子的萌发及生长情况。将筛选成功长出真叶的烟草幼苗移栽至营养土中，在人工气候室继续光照培养直至成熟，仔细收取各转基因株系烟草种子即T₁代种子，晒干后放至冷库处理两周。从冷库取转基因烟草阳性株系T₁代种子，放入2mL灭菌离心管中，在超净工作台中用75％乙醇消毒表面30s，10％过氧化氢消毒8min，用无菌超纯水清洗3-5遍后，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，放至组织培养间进行光照培养，用液氮对长出的T₂代烟草幼苗进行取样，分别提取总RNA并反转录合成cDNA作为模板，用荧光定量PCR分析目的基因在T₂代转基因阳性烟草中的过表达情况，挑取三个独立的转基因阳性株系进行抗旱性研究或移栽至营养土中进行抗旱表型的鉴定。

用基因特异性引物及卡那霉素、GFP载体标记引物分别对二穗短柄草BdGF14g基因过表达株系、空载体对照、野生型烟草模板cDNA进行半定量PCR检测，共获得6个独立的RNA水平上BdGF14g基因过表达阳性烟草株系，收获T₂代种子后，挑选株系OE1，OE2，OE3进行后续转基因烟草表型鉴定分析。半定量PCR结果分析如图2。其中，OE1-6表示6个独立的BdGF14g基因过表达阳性烟草株系，WT表示野生型烟草株系，VC表示转空载体烟草株系，烟草Ntubiquitin基因作为内参基因。从图2可得知，BdGF14g基因过表达阳性烟草株系中BdGF14g基因得到了表达，野生型烟草株系和转空载体烟草株系中没有BdGF14g基因表达。

实施例5：转基因烟草阳性株系抗旱表型的鉴定

1、转基因烟草根长实验

在超净工作台中消毒T2代不同转基因烟草阳性株系种子及野生型烟草种子，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上萌发并在组织培养间光照培养一周后，将长势良好且相似的烟草幼苗转移至分别含有250mM及350mM甘露醇的MS固体培养基及MS固体培养基上继续生长两周。观察野生型、空载体对照及不同过表达株系烟草幼苗根长生长情况，测量并分析数据。

2、转基因烟草抗旱表型分析

在超净工作台中消毒T₂代不同转基因烟草阳性株系种子及野生型烟草种子，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上萌发并在组织培养间光照培养两周后，将长势良好且相似的烟草幼苗移栽至营养土中，放至组织培养间培养架上，继续生长三周，挑选长势良好且相似的烟草幼苗，干旱处理25天，观察不同转基因烟草株系及野生型的生长状况并拍照，对转基因烟草株系及野生型植株进行浇水恢复7天，观察其生长状态并拍照，统计分析存活率。

结果如图3所示，在分别含有250mM及350mM甘露醇的MS固体培养基上生长的BdGF14g基因过表达烟草株系的根长要显著长于野生型及空载体转基因株系。在对照MS固体培养基上生长的转基因烟草过表达株系与野生型及空载体过表达株系的根长没有明显差异。干旱处理25天的BdGF14g基因过表达烟草株系生长状态明显优于野生型及空载体对照株系，BdGF14g基因过表达烟草株系仍保留有相对较绿的叶片，野生型及空载体烟草植株叶片则已经萎蔫、枯黄甚至死亡。浇水恢复7天后，野生型及转空载体对照烟草株系死亡，BdGF14g基因过表达烟草株系则继续保持生长状态。以上结果表明转基因烟草株系比野生型及空载体对照烟草具有更强的抗旱能力。统计各过表达株系及野生型、空载体对照植株的存活率，BdGF14g基因过表达株系(91.1％，83.4％，66.8％)要显著高于WT(17.4％)及VC(12.1％)。以上实验结果表明BdGF14g基因增强了转基因烟草对干旱胁迫的耐受性。

实施例6：转基因烟草阳性株系抗旱机制分析

1、转基因烟草生理指标的测定

在超净工作台中消毒T₂代转基因烟草阳性种子及野生型烟草种子，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养上萌发并在组织培养间培养两周后，将长势良好且相似的烟草幼苗移栽至营养土中，组织培养间继续生长三周，挑选长势良好且相似的烟草幼苗，干旱处理15天左右，分别取干旱处理下及正常生长条件下转基因烟草及野生型烟草叶片测定各项生理指标。

(1)丙二醛(MDA)含量的测定

使用丙二醛含量测定试剂盒测定。氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质；过氧化脂质逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平。MDA与硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)缩合，生成红色产物，在532nm有最大吸收峰，进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量；同时测定600nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。

(2)相对水含量(Relative water content，RWC)的测定

根据Sun等人的测量方法测量。步骤如下：分别剪取干旱处理15天及正常生长条件下的二穗短柄草BdGF14g基因过表达株系及野生型、空载体对照烟草叶片，用分析天平称重并记录其鲜重(F_W)，然后将各叶片分别放入含有超纯水的干净培养皿中，做好标记，使之完全浸泡在水中，浸泡6h后，用滤纸轻轻擦干并称重(T_W)，再将叶片彻底烘干48h后取出称重(D_W)。RWC(％)＝[(F_W-D_W)/(T_W-D_W)]×100。通过计算可得干旱处理下及正常生长条件下二穗短柄草BdGF14g基因过表达株系及野生型、空载体对照间烟草叶片相对水含量差异。

(3)离子渗漏(Ion leakage，IL)测定

根据Hu等人的方法测定离子渗漏。步骤如下：分别剪取干旱处理下及正常生长条件下BdGF14g基因过表达株系及野生型、空载体对照烟草叶片0.3g左右，将叶片剪成宽约0.5cm的条状。将各基因型叶片分别放入装有10mL灭菌超纯水的15mL离心管中，使超纯水完全浸没叶片，室温静置过夜。用电导率测定仪测定初始电导率C1；随后将各离心管样品放入100℃水浴锅中进行沸水浴30min，冷却至室温后分别测定其电导率，记为C2。其中，用灭菌超纯水调零。离子渗漏计算公式为：IL(％)＝C1/C2×100。

(4)H₂O₂含量的测定

使用过氧化氢(H₂O₂)含量测定试剂盒测量。过氧化氢(H₂O₂)可以与钼酸作用生成一种络合物，在405nm处测定其生成量可计算出H₂O₂的量。

(5)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

使用总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性测定试剂盒测量。超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)保护细胞免受损伤。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)，超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

(6)过氧化物酶(POD)活力测定

使用过氧化物酶(POD)活性测定试剂盒测量。利用过氧化物酶(POD)催化过氧化氢反应的原理，通过测定420nm处吸光度的变化得出其酶活性。具体实验步骤参见说明书。

(7)过氧化氢酶(CAT)活力测定

使用过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒测量。过氧化氢酶(CAT)分解过氧化氢的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的过氧化氢与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。

(8)内源ABA含量的测定

使用植物脱落酸(ABA)酶联免疫检测试剂盒测定。该试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中脱落酸(ABA)的水平。向预先包被了植物脱落酸(ABA)单克隆抗体的酶标孔中加入脱落酸(ABA)，温育；温育后加入生物素标记的抗ABA抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中脱落酸(ABA)的浓度呈正相关。操作步骤如下：

1)将试剂盒提供的原倍标准品按照说明在小试管中倍比稀释，待测定ABA含量后做标准曲线；

2)分别取正常生长条件下及干旱处理条件下二穗短柄草BdGF14g基因过表达株系及野生型、空载体对照烟草叶片，按1:9比例加入磷酸缓冲液，冰上研磨。将充分研磨的叶片匀浆转入2mL灭菌离心管中，8,000rpm离心10min，小心吸取上清，待用；

3)加样。空白孔：空白对照孔不加样品，生物素标记的抗ABA抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A、B和终止液，其余各步操作相同；标准品孔：加入标准品50μL，链霉素-HRP50μL(标准品中已经事先整合好生物素抗体，故不加)；待测样品孔：加入样本40μL，然后各加入抗-ABA抗体10μL、链霉亲和素HRP 50μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60min；

4)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成1倍应用液，备用；

5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干；

6)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10min；

7)终止：每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立即转为黄色；

8)测定：以空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度值，测定应在加终止液后10min以内进行；

9)根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

(9)总抗氧化能力的测定

使用总抗氧化能力测定试剂盒测定，测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在酸性环境下，物质还原三价铁离子-三吡啶三吖嗪(Fe³⁺-TPTZ)产生蓝色的二价铁离子-三吡啶三吖嗪(Fe²⁺-TPTZ)的能力反映了其总抗氧化能力。

结果如图4所示，BdGF14g基因过表达株系及野生型和空载体对照转基因烟草间丙二醛(MDA)、离子渗漏率(IL)、过氧化氢(H₂O₂)含量、相对水含量(RWC)没有明显差别。但在干旱胁迫处理条件下，BdGF14g基因过表达株系含有显著低于野生型和空载体对照转基因株系的丙二醛、离子渗漏率、过氧化氢含量和相对较高的相对水含量，表明BdGF14g基因过表达株系在干旱胁迫条件下，受到了比野生型及空载体对照烟草株系相对较小的细胞膜氧化损伤及细胞内氧化损伤。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)的生物活性及总抗氧化能力的大小反应了细胞抗氧化系统的强弱，测定其活性及大小可以分析细胞清除超氧阴离子自由基、羟基、过氧化氢、单线态氧等活性氧以抵抗氧化胁迫减少细胞氧化损伤的能力。测定结果表明，在正常生长条件下，BdGF14g基因过表达株系及野生型和空载体对照烟草株系的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的生物活性及总抗氧化能力的大小不存在明显差异，但在干旱胁迫处理下，BdGF14g基因过表达株系的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的生物活性及总抗氧化能力均显著高于野生型及空载体对照烟草株系。以上实验结果表明BdGF14g基因过表达烟草株系可能通过增强抗氧化系统的酶活力来抵抗干旱胁迫。干旱胁迫下，植物缺水造成渗透胁迫，产生ABA，ABA与受体结合后与PP2C相互作用，释放SnRK从而激活ABA信号通路，导致干旱相关的基因转录表达，引发一系列抗旱生理过程。因此植物内源ABA含量的测定对植物抗旱机制的研究具有重要意义。测量结果表明，在正常生长条件下，BdGF14g基因过表达株系及野生型和空载体对照烟草株系的内源ABA含量不存在明显差异。但是在干旱胁迫处理下，BdGF14g基因过表达株系的内源ABA含量要显著高于野生型及空载体对照烟草株系。这说明BdGF14g基因可能通过参与ABA信号通路提高过表达烟草株系对干旱胁迫的耐受性。

3、过表达烟草株系抗旱相关基因的表达分析

在超净工作台中消毒T₂代二穗短柄草BdGF14g基因不同过表达株系及野生型、空载体对照烟草种子，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养上萌发并放至组织培养间组培架上光照培养两周后，将长势良好且相似的烟草幼苗转移至含有300mM甘露醇的MS固体培养基及MS固体培养基上，继续光照培养一周。将继续生长一周的各转基因株系及野生型烟草幼苗分别用液氮进行整株取样，用植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，用cDNA第一链合成反转录试剂盒反转录所提RNA，合成cDNA，作为模板进行荧光定量PCR分析。相关基因表达分析所用引物如下：NtNCED1基因的正反引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、NtABF2基因的正反引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、NtERD10C基因的正反引物如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12、NtSUS1基因的正反引物如SEQ ID NO.13和SEQID NO.14、Ntubiquitin基因的正反引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。

为研究BdGF14g基因过表达株系提高对干旱胁迫耐受性在基因转录表达水平的变化，在烟草中设计干旱胁迫相关基因的特异性引物进行荧光定量PCR分析。ABA信号与植物非生物逆境胁迫响应联系紧密，结合酵母双杂实验结果及内源ABA含量测定结果，设计ABA信号通路中的重要基因NtABF2、NtNCED1特异性引物进行表达分析；干旱胁迫下，植物积累蔗糖等渗透性保护物质抵御渗透压力，设计蔗糖合成过程中重要的蔗糖合成酶基因NtSUS1特异性的引物进行表达分析；非生物逆境胁迫引起植物细胞一系列保护蛋白的产生，设计保护蛋白NtERD10C基因特异性引物进行表达分析。荧光定量PCR结果如图5所示，在正常生长条件下，NtABF2、NtNCED1、NtSUS1和NtERD10C基因在BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草植株中表达水平没有显著差异，但在干旱处理下，以上相关基因在BdGF14g基因过表达株系中的表达水平均不同程度得显著高于野生型烟草植株，表明在BdGF14g基因过表达株系中，NtABF2、NtNCED1、NtSUS1和NtERD10C基因在提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受性中发挥重要作用。

4、气孔实验

分别取正常生长条件下长势良好、叶片平展、大小相似的二穗短柄草BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草叶片浸没于气孔张开缓冲液(含50μM CaCl₂，30mM KCl，10mMMES-Tris，氢氧化钾调pH至6.15)中，光照培养6h。用镊子分别小心撕取BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草叶片下表皮，在干净的载玻片中间部位滴一滴气孔张开缓冲液，将撕取的烟草叶片下表皮小心转移到载玻片的气孔张开缓冲液中，用镊子将其平展开来，小心盖上干净的盖玻片，用滤纸从盖玻片一侧将多余液体吸干，制成临时观察玻片。在荧光倒置显微镜下观察气孔张开情况并拍照。待气孔完全张开后，将总数一半的BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草叶片均放置在干净干燥的滤纸上，脱水处理40min；在剩余叶片的气孔张开缓冲液中加入50μM ABA处理2h，脱水及ABA处理后，用镊子小心撕取过表达株系及野生型烟草叶片下表皮，按上述方法制成临时观察玻片，在荧光倒置显微镜下观察BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草叶片在脱水及ABA处理后的气孔张开情况并拍照，统计结果如图6所示，ABA介导的气孔关闭在植物响应非生物逆境胁迫中发挥重要作用。根据酵母双杂结果、内源ABA含量测定结果及ABA相关基因表达分析结果，用50μM ABA及脱水处理离体转基因及野生型烟草叶片，荧光倒置显微镜观察结果表明BdGF14g基因过表达株系与野生型烟草叶片在处理前正常培养条件下气孔张开程度没有明显差别，用50μM ABA及脱水处理后，BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草叶片气孔均比处理前张开程度小，但过表达株系的关闭程度要明显大于野生型烟草。以上实验结果表明BdGF14g基因过表达烟草株系可能通过ABA介导的气孔关闭提高转基因烟草叶片对干旱胁迫的耐受性。

5、ABA合成抑制剂处理下转基因烟草抗氧化酶活性的测定

取冷库保存的T₂代二穗短柄草BdGF14g基因过表达株系及野生型、空载体对照烟草种子，在超净工作台中消毒后，在含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养上萌发并放至组织培养间组培架上光照培养两周后，将长势良好且相似的烟草幼苗转移至含有350mM甘露醇的MS固体培养基及含有350mM甘露醇、1mM钨酸钠的MS固体培养基上，继续光照培养两周。分别剪取甘露醇处理组及甘露醇、钨酸钠共同处理组各转基因株系及野生型烟草幼苗地上部分，用分析天平称重并记录，按照过氧化氢(H₂O₂)含量测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性测定试剂盒说明书的方法分别测定不同处理下不同转基因株系及野生型烟草样本中的H₂O₂含量、CAT、T-SOD酶活力，对测量结果进行统计分析。

钨酸钠是内源性ABA合成抑制剂。根据酵母双杂、干旱胁迫下BdGF14g基因过表达株系内源ABA含量测定、干旱胁迫下BdGF14g基因过表达株系ABA信号通路相关基因表达分析、干旱胁迫及ABA处理下BdGF14g基因过表达株系气孔关闭的实验结果，推断BdGF14g基因过表达烟草株系可能通过ABA信号通路增强转基因烟草植株对干旱胁迫的耐受性。为了证明ABA在BdGF14g基因过表达烟草株系抗旱过程中的作用，分别对BdGF14g基因过表达株系及野生型对照烟草植株进行甘露醇处理及添加内源ABA抑制剂钨酸钠的甘露醇处理，观察其表型并分别测量不同处理下BdGF14g基因过表达株系及野生型烟草抗氧化酶活力及过氧化氢含量。实验结果如图7所示，在甘露醇处理下，BdGF14g基因过表达株系生长状态明显优于野生型烟草植株，且过氧化氢含量显著低于野生型烟草，过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶活力明显高于野生型烟草；在添加了内源ABA抑制剂钨酸钠的甘露醇处理培养基中，BdGF14g基因过表达烟草株系的生长状态、过氧化氢含量、过氧化氢酶和总超氧化物歧化酶活力与野生型对照烟草植株则没有明显差异。以上实验结果表明，抑制BdGF14g基因过表达烟草株系的内源ABA合成之后，在干旱胁迫下BdGF14g基因过表达株系抗氧化酶系统酶活力减弱，表明BdGF14g基因过表达烟草株系可能通过ABA信号通路提高转基因烟草中的抗氧化酶活性从而实现对干旱胁迫的耐受性。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 华中科技大学

<120> 二穗短柄草抗旱基因及表达载体和其编码蛋白质与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 二穗短柄草(Brachypodium distachyon)

<400> 1

atgtcggcac ctgcggagct ttcccgtgag gagaatgtgt acatggccaa gctcgctgag 60

caggcagaga ggtacgagga gatggtcgag ttcatggaga aggtggccaa gacagttgac 120

tccgaggagc tcaccgtgga ggagcgcaac cttctctctg ttgcgtacaa gaatgtgatt 180

ggcgcccgcc gtgcctcttg gcgcattatc tcctccatcg aacagaagga ggagagccgt 240

ggcaacgagg accgggtcac actcatcaag gactaccgtg gcaagatcga gactgagctt 300

accaagatct gcgatggcat cctcaagctg ctcgaaaccc atcttgtccc ctcttccact 360

gcccctgagt ccaaggtctt ctaccttaag atgaagggtg actactacag gtatctggca 420

gaattcaaga gtggggctga gaggaaggat gctgctgaga ataccatggt ggcatacaag 480

gctgctcagg atattgcttt ggctgagctg gctccaactc atccaattag gcttggactg 540

gcactaaact tctcggtctt ctattatgag atcctcaact cccctgatcg tgcttgcaat 600

cttgcaaagc aggcttttga tgaggccatc tcggagctgg acaccctgag cgaggaatcc 660

tacaaggaca gcacattgat catgcaactc cttcgtgaca acctgaccct gtggacttcc 720

gacatcacgg aggacactgc ggaggagatc agggaggctc cgaagggtga ctctggtgat 780

gggcagtaa 789

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 二穗短柄草(Brachypodium distachyon)

<400> 2

Met Ser Ala Pro Ala Glu Leu Ser Arg Glu Glu Asn Val Tyr Met Ala

1 5 10 15

Lys Leu Ala Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Glu Glu Met Val Glu Phe Met

20 25 30

Glu Lys Val Ala Lys Thr Val Asp Ser Glu Glu Leu Thr Val Glu Glu

35 40 45

Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ala Arg Arg

50 55 60

Ala Ser Trp Arg Ile Ile Ser Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Ser Arg

65 70 75 80

Gly Asn Glu Asp Arg Val Thr Leu Ile Lys Asp Tyr Arg Gly Lys Ile

85 90 95

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Ile Cys Asp Gly Ile Leu Lys Leu Leu Glu

100 105 110

Thr His Leu Val Pro Ser Ser Thr Ala Pro Glu Ser Lys Val Phe Tyr

115 120 125

Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Phe Lys Ser

130 135 140

Gly Ala Glu Arg Lys Asp Ala Ala Glu Asn Thr Met Val Ala Tyr Lys

145 150 155 160

Ala Ala Gln Asp Ile Ala Leu Ala Glu Leu Ala Pro Thr His Pro Ile

165 170 175

Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu

180 185 190

Asn Ser Pro Asp Arg Ala Cys Asn Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Glu

195 200 205

Ala Ile Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser

210 215 220

Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser

225 230 235 240

Asp Ile Thr Glu Asp Thr Ala Glu Glu Ile Arg Glu Ala Pro Lys Gly

245 250 255

Asp Ser Gly Asp Gly Gln

260

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcggcac ctgcggagct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgcccatc accagagtca 20

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagaat gtcggcacct gcggagct 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatccct gcccatcacc agagtca 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagaatggct ccgcaagtta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcctagcaat tccagagtgg 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcagccatct atctattc 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcaactcatc catattca 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacgtggagg ctacagatcg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gttcctcttg ggcatgagtt 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtggggaaac accgctgaa 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caacaaggat gcgagggatg a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaagagtcaa cccgtcacct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acatcacgac cacaaccaga 20

Claims

1.核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列或与SEQ ID NO：1所示序列互补的序列的基因在提高植物对干旱胁迫的耐受性方面的应用，其特征在于，所述基因通过诱导蔗糖合成酶基因表达，使植物细胞中蔗糖积累，从而使细胞内的渗透压提高，提高植物对干旱胁迫的耐受性。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因通过提高植物抗氧化酶活力来清除植物活性氧，降低活性氧对细胞造成的氧化损伤。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗氧化酶为过氧化氢酶、过氧化物酶或超氧化物歧化酶。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因通过参与ABA信号途径，提高植物对干旱胁迫的耐受性。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因通过参与ABA信号途径介导的植物气孔关闭，提高植物对干旱胁迫的耐受性。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因在干旱条件下通过促进植物形成发达的根系，提高植物对干旱胁迫的耐受性。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因通过诱导脱水响应蛋白基因表达，使植物细胞中脱水响应蛋白积累，从而使细胞内的渗透压提高，提高植物对干旱胁迫的耐受性。