CN115029354B

CN115029354B - 一种植物生长调控基因PmGRF7及其应用

Info

Publication number: CN115029354B
Application number: CN202210539869.8A
Authority: CN
Inventors: 高志红; 王蕊; 周鹏羽; 侍婷; 倪照君
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-05-17
Also published as: CN115029354A

Abstract

本发明公开了一种植物生长调控基因PmGRF7及其应用。所述植物生长调控基因PmGRF7能够影响植物花粉、叶片以及果实的发育，可极好地应用于分子植物育种。同时PmGRF7基因超表达影响激素信号转导途径合成相关基因及生长发育相关基因的表达。本发明中PmGRF7基因的获得为不育品种的培育提供了珍贵的基因资源，对解析植物生长发育分子机制有重要意义。

Description

一种植物生长调控基因PmGRF7及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域，具体涉及一种植物生长调控基因PmGRF7，以及将其超表达后可以影响叶片形态，花粉发育以及植株育性的应用。

背景技术

梅原产于中国，根据用途分为果梅和花梅；具有良好的经济价值及观赏价值且果实营养价值高是备受欢迎的保健食品之一，其经济栽培主要分布在东亚及东南亚的亚热带地区，目前中国是梅栽培面积最大的国家。

雄蕊发育是果实形成的基础，花粉败育现象严重限制着果实产量与产业发展。因此雄性不育育种对于园艺生产有非常重要的意义。番茄遗传转化体系现已非常成熟，可以用于研究表型、基因表达等，有利于研究相关基因的功能。在前期研究中发现PmGRF7基因在不同休眠时期花芽中表达量呈显著差异，为了进一步了解PmGRF7的功能，需要通过对调控梅生长发育的关键基因进行克隆及基因功能验证，来为品种改良提供理论基础与基因资源。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种植物生长调控基因PmGRF7及其应用，超表达该基因可以有效影响植物叶片形态，花粉发育以及植株育性，对分子植物育种有重要意义。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

本发明的一个目的在于提供一种植物生长调控基因PmGRF7，其核苷酸序列如

SEQ ID NO:1所示。

本发明所述植物生长调控基因PmGRF7编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了含有上述基因PmGRF7的载体，及含有所述载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的还在于，提供上述植物生长调控基因PmGRF7、其编码的蛋白质、含有所述基因PmGRF7的载体、以及宿主细胞在调控植物生长发育中的应用：具体地，过表达所述基因PmGRF7，影响植物叶片形态、叶绿素含量及果实育性。

其中，所述影响植物叶片形态、叶绿素含量及果实育性方面的表现具体的为，超表达所述基因PmGRF7，所述植物叶片较厚，叶绿素含量显著增多，叶片伸展不完全，果实不育；所述果实不育，更具体的表现为：转基因植株可坐果，但果实无种子或仅有含败育痕迹的种子。其次，转基因番茄植株的花粉萌发力弱，形状皱缩，表面纹饰不规整，内无营养物质填充。

本发明的另一个目的还在于，提供上述基因PmGRF7、其编码的蛋白质、含有所述基因PmGRF7的载体、以及宿主细胞在调控激素信号转导途径合成相关基因及叶片生长发育相关基因的表达中的应用。具体地，超表达所述基因PmGRF7，所述植物激素信号转导途径合成相关基因及生长发育相关基因表达水平发生改变。

更具体地，所述植物激素信号转导途径合成相关基因包括GID2、ARF3、PYR1，所述叶片生长发育相关基因包括PHOT2、WOX4。

本发明最后还提供了一种改变叶片形态、叶绿素含量和果实育性的植物培育方法，所述方法是通过超表达所述植物生长调控基因PmGRF7。

作为一种实施方式，本发明所述植物为番茄。

有益效果：与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明从梅中克隆到一个调控叶片形态，花粉发育以及植株育性的基因，将本发明所提供的PmGRF7基因超表达载体导入番茄中，植株表型结果表明转化35S-pCAMBIA1301-PmGRF7载体的番茄叶片相较于对照组WT显著增厚，叶绿素含量显著增多，叶片伸展不完全。同时转基因植株可坐果，但果实无种子或仅有含败育痕迹的种子；转基因番茄植株的花粉相较于野生型萌发力弱，形状皱缩，表面纹饰不规整，内无营养物质填充。同时PmGRF7基因超表达影响番茄植物激素信号转导途径合成相关基因及叶片生长发育相关基因的表达。本发明中生长调控基因的获得为分子植物育种提供了珍贵的基因资源，同时对解析植物花粉败育分子机制有重要意义。

附图说明

图1：PmGRF7基因CDS序列(1641bp)克隆及其超表达载体构建的PCR检测结果。

图2：转基因番茄的生长过程。

图3：野生型番茄和3个转基因株系番茄叶片的GUS染色检测结果。

图4：DNA水平上转基因番茄PmGRF7基因的PCR检测结果。

图5：转录水平上PmGRF7基因表达量的qRT-PCR检测结果。

图6：PmGRF7基因超表达后转基因番茄相较于野生型番茄叶片显著增厚、叶绿素含量显著增加。

图7：PmGRF7基因超表达后转基因番茄相较于野生型番茄植株可坐果，但果实无种子或仅有含败育痕迹的种子。

图8：授野生型植株花粉后转基因番茄植株的果实仍无种子或仅有含败育痕迹的种子。

图9：转基因番茄相较于野生型番茄花粉萌发力弱。

图10：转基因番茄相较于野生型番茄的花粉形状皱缩，内无营养物质填充。

图11：转基因番茄相较于野生型番茄花粉表面纹饰不规整。

图12：植物内源激素标准样品色谱图。

图13：转基因番茄和野生型番茄成熟果实内源IAA、GA、ABA含量比较。

图14：转基因番茄和野生型番茄未成熟果实内源IAA、GA、ABA含量比较。

图15：转基因番茄和野生型番茄花朵内源IAA、GA、ABA含量比较。

图16：野生型番茄和PmGRF7转基因番茄叶片、果实和花朵的差异基因韦恩图。

图17：野生型番茄与转基因番茄的差异基因数量统计。

图18：野生型番茄与转基因番茄花朵、果实和叶片中差异表达基因的KEGG通路富集表达分析。

图19：野生型番茄与转基因番茄花朵和果实差异表达基因的聚类热图分析。

图20：野生型番茄与转基因番茄植株叶片差异表达基因的聚类热图分析。

图21：野生型番茄与转基因番茄植株叶片、果实、花朵共表达基因模块与表型相关性。

图22：野生型和转基因番茄植株叶片转录组中差异基因表达量的验证。

图23：野生型和转基因番茄植株花朵转录组中差异基因例如GID2表达量的验证。

图24：野生型和转基因番茄植株果实转录组中差异基因例如ARF3、PYR1表达量的验证。

图25：转基因番茄植株叶片转录组数据中KEGG通路分析表明在核糖体路径显著富集到多个AE。

具体实施方式

本发明通过对梅花芽四个休眠时期进行转录组分析，筛选出与休眠以及后续花发育过程相关联的基因PmGRF7，申请人以梅低需冷量品种‘桃形梅’为材料，分离出PmGRF7基因，该基因的cDNA如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，由174个氨基酸组成。通过转基因植株中的基因表达量、表型观察、生理指标测定及转录组数据分析说明该基因是植物花粉、叶片、果实生长中的重要转录因子。

将该基因构建基因超表达载体，转化到番茄植株。激素信号转导途径相关基因及形态调控相关基因表达量显示PmGRF7基因超表达可以影响其表达量。

结合转基因植株番茄叶片相较于对照组显著增厚，叶绿素含量显著增多，叶片伸展不完全；同时转基因植株可坐果，但果实无种子或仅有含败育痕迹的种子；转基因番茄植株的花粉相较于野生型萌发力弱，形状皱缩，表面纹饰不规整，内无营养物质填充以及植株内源激素含量的测定结果，显示超表达PmGRF7可以达到影响植株叶片形态以及育性的作用。本发明所述基因可以通过基因工程的方法，应用于分子遗传育种。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：PmGRF7基因的克隆及其超表达载体的构建和鉴定

1、选取‘桃形梅’花芽为材料，提取总RNA，反转录合成cDNA，并以此cDNA为模板，利用PmGRF7序列设计引物扩增完整的基因编码区。

2、PCR反应采用25μL体系：I-5TM 2×High-Fidelity Master Mix 12.5μl，上游引物PmGRF7-F(5′-CGGGATCCCGATGATGATGGTTCATCATGC-3′)10μM 1μl，下游引物PmGRF7-R(5′-GCTCTAGAGCTTATGCTTTGTTCTGATTC-3′)10μM 1μl，cDNA 1μl，ddH₂O 9.5μl。扩增程序为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10min。取2μL PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据图1电泳结果可见，PmGRF7 CDS全长序列(1641bp)被成功克隆。

3、选择特异的限制性酶切位点，设计构建PmGRF7表达载体的特异引物PmGRF7-F(5′-ctcgagggggggcccggtaccATGATGATGGTTCATCATGATAATCA-3′)和PmGRF7-R(5′-gggggatccactagttctagaTTATGCTTTGTTCTGATTCAACCAC-3′)，扩增带酶切位点的PmGRF7基因序列，将回收纯化的目的序列插入35S-pCAMBIA1301表达载体。最后将构建好的35S-PmGRF7载体进行双酶切和测序验证。

实施例2：番茄植株的遗传转化

1、在超净工作台中取适量种子，用无菌水冲洗2min，倒去无菌水；70％的酒精消毒30s，倒掉溶液；50％的NaClO消毒3min，期间不断晃动锥形瓶；无菌水冲洗35s。灭菌滤纸吸干种子表面的水，种于1/2MS培养基中，暗培养3～5天至种子萌发。随后置于23℃，光培养16h，暗培养8h的条件下培养，直至子叶完全展开时可用于遗传转化。

2、取-80℃保存的100μL农杆菌感受态细胞EHA105于室温或手心片刻待其至半融状态，然后分别加入pCAMBIA1301-PmGRF7、和pCAMBIA1301空载，用手拨打混匀，然后依次在冰上静置5min、在液氮中冷却5min、37℃水浴5min、迅速置于冰上冷却5min，接着加入0.8ml无抗性的LB液体培养基，于28℃，摇床200r/min振荡培养2～3h；吸取0.1ml的上述菌液，将菌液分别均匀涂布于含抗性的LB固体培养基(50mg/L Kan+20mg/L Rif)，于28℃培养2～3d至长出单一菌落；分别从各自培养基上挑取阳性单菌落，加入0.8ml的含抗性LB液体培养基(50mg/LKan+20mg/L Rif)，于28℃摇床，200r/min振荡培养至浑浊，以菌液作为模板，用特异引物进行PCR扩增验证。

3、吸取0.1ml上述目基因验证正确的菌液与150ml含抗性的LB液体培养基(50mg/LKan+20mg/L Rif)，于28℃摇床，200r/min振荡培养至OD600为1.0左右；将上述菌液25℃，4000r/min，离心10min，弃上清，沉淀分别用少量重悬液(10mM MES，10mM MgCl2，100μM AS)悬浮以备用；根据菌液沉淀的状态与浓度，用重悬液稀释至OD600为0.8左右，再将各重悬液静置28℃培养箱培养4～6h。

4、取两片子叶同时完全展开的无菌番茄苗，剪刀减去子叶的头尾，放入MS0培养基中浸润5min以润湿叶片，倒掉MS0，加入农杆菌悬浮液，不断轻摇侵染5min，使叶片的伤口与菌液能够充分接触；后将叶片置于无菌滤纸上，吸去多余菌液后接种在共培养培养基中，28℃条件下暗培养2～3d。之后将叶片转入筛选培养基1中，23℃光照下培养。待叶片分化出愈伤组织后转入筛选培养基2中。每两周更换一次培养基，至长出抗性芽，待抗性芽稍长时，剪下转至生根培养基中，待苗生长至瓶口，可进行下一步检测。检测后得到的阳性苗，打开瓶盖炼苗一周，移栽至营养穴盘中，16～25℃条件下缓苗，待缓苗结束后置于统一环境下培养，直至果实成熟。图2显示番茄子叶通过农杆菌介导的侵染，经历预培养、共培养、两次筛选培养和生根培养后，最终获得3个阳性株系。

实施例3：转基因阳性植株获得及表型观察

1、将100mg的x-Gluc溶于200ml的DMF(N,N-二甲基酰胺)，并配制50mM的亚铁氰化钾和铁氰化钾母液，以及0.125M的Na2EDTA，以上溶于一定比例的磷酸缓冲液，加入Triton-100和甲醇配成GUS工作液。剪下转化和野生型的番茄的叶片置于离心管中，GUS染液浸泡过夜染色，弃去GUS染色液，加入70％乙醇脱色，脱色后观察并拍照记录。图3表明，有3个转基因株系的叶片被染成蓝色，而对照组番茄叶片未变蓝，说明这3个株系的GUS基因有表达活性。

2、取GUS染色后检测确定为阳性植株的番茄叶片，提取DNA，DNA的提取参照植物DNA提取试剂盒(福际生物)操作说明。以野生型番茄叶片DNA为阴性对照，PmGRF7-F和PmGRF7-R为引物进行PCR扩增(图4)。

3、提取转基因番茄植株花及果实的总RNA，RNA提取同基因克隆。反转录为cDNA并以此为模板，进行实时荧光定量PCR分析。每个样品设置3个技术重复，试验由Origin 6.0软件完成，试验数据采用2-ΔΔCt方法进行分析(图5)。

4、采集野生型和转基因株系第一天盛开的花，取其雄蕊，23℃的条件下过夜散粉，离体花粉萌发培养基的组成是：蔗糖浓度为13％，硼酸浓度为150mg/kg，琼脂浓度为1％，将培养基滴于载玻片上，花粉抖落于培养基上，在湿润的环境下过夜后用正置显微镜观察。同样采集第一天盛开的花，取雄蕊，23℃的条件下过夜散粉，取材前需要准备好适量的固定液，使用新开封的戊二醛，遵循随配随用原则，配置好的戊二醛放入4℃保存。花粉散粉彻底后快速投入固定液。固定液的浓度为2.5％。在4℃的条件下固定8h或过夜。

5、通过图6至图11说明相较于野生型，转基因植株的叶片较厚，叶绿素含量显著增多，叶片伸展不完全，因此认为PmGRF7影响叶片形态的发育。此外，转基因植株可以坐果，但果实无种子或仅有含败育痕迹的种子。测定花粉萌发力后发现转基因番茄植株的花粉萌发力弱，形状皱缩，表面纹饰不规整，内无营养物质填充，说明其雄配子不育。转基因植株授野生型花粉后果实仍无种子或仅有含败育痕迹的种子，说明其雌配子也不育。

实施例4：野生型与转基因番茄植株生理指标测定及分析

1、称取样品1g，置入预冷的研钵中，加入液氮研磨，磨至顺滑后，加入5ml预冷的80％色谱级甲醇润洗研钵，接着转入50ml离心管中，黑暗中4℃浸提12h以上，浸提结束后10000r 4℃离心15min，将上清液转移到新的50ml离心管中，4℃黑暗放置，往离心后的残渣中加入5ml预冷的80％色谱甲醇，再次黑暗中浸提12h以上，10000r 4℃离心15min，收集混合两次上清液，加入0.2g PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)，黑暗条件下4℃震荡1h，再次10000r4℃离心15min，取上清液于C18小柱过滤，流出相用新的50ml离心管收集，保鲜膜封口，牙签扎孔，后用液氮速冻，冷冻干燥机中干燥48h以上，至管壁上无液体，加入1ml预冷的色谱级甲醇，充分溶解固体，用0.22μM有机滤膜滤入棕色进样瓶中，最后经安捷伦1290/ABQtrap6500HPLC-MS/MS液相色谱系统测定番茄花、成熟果实和不成熟果实中的IAA、GA和ABA含量。

图12为3个植物内源激素标准样品的色谱图，图13、图14和图15说明与野生型相比，转基因植株3个株系成熟果实的内源IAA增加，GA显著降低，而ABA含量变化趋势与GA相反；未成熟果实的内源IAA显著升高，2个株系的GA升高，而ABA变化不明显；而花朵中IAA含量略低于野生型，GA显著降低，ABA依然与GA呈相反趋势，3个株系花的IAA分别降低至对照组的0.6、0.75、0.8倍，GA下降至对照组的0.55、0.38、0.56倍，ABA上升至对照的1.54、1.83、3.91倍。这与前人研究的雄性不育植株中ABA含量的变化与GA相反的情况一致，说明PmGRF7超表达之后引起激素变化从而导致果实不育。

取新鲜番茄叶片和果实，擦净组织表面污物，剪碎，液氮速冻磨碎，混匀；称取待测剪碎的新鲜样品0.1g，共3份，分别置于试管中。加入5ml 95％乙醇，置于黑暗处浸泡24h后，进行比色测定；将提取液置于比色杯内，以95％的乙醇为参照调零，分别在波长665nm、649nm下测定吸光度；按下式a＝13.95*665–6.88*649；b＝24.96*649–7.32*665分别计算叶绿素a、b的浓度(mg/L)，a+b即叶绿素总浓度。之后再按下式计算色素含量：叶绿素含量＝(色素浓度*提取液体积)/样品鲜重。图6说明3个转基因株系植株叶片的叶绿素含量均显著增加。

实施例5：野生型番茄与PmGRF7转基因番茄转录组数据分析

1、同时取移栽至花盆中的PmGRF7超表达和野生型植株的叶片、花朵以及成熟和未成熟果实。为保证测序结果的可靠性，栽培过程中要尽量保证环境适宜，避免各种胁迫，且培养条件保证一致。挑选长势一致的植株取样，成熟和未成熟果实通过标签记录从而保证时期一致，取3个株系，每个株系3个重复，分别采样检测总RNA质量，进行转录组高通量测序。

2、用mRNA富集法或rRNA去除法对total RNA进行处理，富集mRNA后用打断buffer把获得的RNA片段化，以随机的N6引物进行反转录，再合成cDNA二链形成双链DNA。把合成的双链DNA末端补平并5’端磷酸化，3’端形成突出一个“A”的粘末端，再连接一个3’端有凸出“T”的接头。连接产物设计特异的引物进行PCR扩增。PCR产物热变性成单链，再用一段桥式引物将单链DNA环化得到单链环状DNA文库。最后上机测序。

3、过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，得到clean reads。然后对其进行组装得到Unigene，之后对Unigene进行功能注释、SSR检测，每个样品在All-Unigene的基础上计算表达量，对于多个样品根据需求检测不同样品之间的差异表达基因，并对差异表达基因做深入的聚类分析和功能富集分析。

4、使用Trinity对clean reads进行denovo组装,然后使用Tgicl将组装的转录本进行聚类去冗余，得到Unigene。Trinity包含三个独立模块:Inchworm，Chrysalis以及Butterfly，依次处理大量reads。Trinity首先把reads构建成大量单独的de Bruijn图，然后对每个图分别提取全长的转录本剪切亚型。Trinity的组装结果称为转录本，然后使用Tgicl进行聚类去冗余得到Unigene，对于多个样品，将再次使用Tgicl对每个样品的Unigene进行聚类去冗余得到最终的Unigene用于后续差异基因数量统计(图17)及富集分析(图16)、KEGG通路富集分析(图18)、WGCNA分析(图21)。

图17说明PmGRF7超表达株系的叶片和野生型相比，株系1有4574个基因上调表达，4146个基因下调表达；株系2有3869个基因上调表达，3296个基因下调表达；株系3有4911个基因上调表达，4634个基因下调表达。果实和野生型相比，株系1有4470个基因上调表达，5841个基因下调表达，株系2有1649个基因上调表达，1614个基因下调表达；株系3有3010个基因上调表达，4267个基因下调表达。花朵中，株系1有358个基因上调表达，1687个基因下调表达，株系2有123个基因上调表达，95个基因下调表达，株系3有1087个基因上调表达，2098个基因下调表达。

对差异基因参与的KEGG代谢途径进行富集，包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢、有机系统5个分支，对每一分支再进一步分类统计。图18说明差异基因的KEGG注释分类结果表明，花与果测序结果中的差异基因同时富集到植物激素信号转导路径且差异显著。而叶片的测序结果中富集到能量相关通路且差异变化显著，即光合作用-天线蛋白通路(Photosynthesis-antennaproteins)、光合作用通路(Photosynthesis)、光合作用中的碳固定(Carbon fixation in photosynthetic organisms)、乙醛酸和二羧酸代谢通路(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)。差异基因另富集到核糖体路径，鞘脂代谢路径，苯丙烷类代谢通路，植物激素信号转导路径。

图19显示了果实和花朵的聚类热图分析，表明与GA和ABA信号转导途径的相关基因大部分在转基因植株中表达更高，例如ABA应答转录因子(ABF4)和GA受体基因(GID b-1)，结合转基因植株中花朵和成熟果实内源GA显著降低、ABA显著升高的结果，说明PmGRF7超表达之后，引起GA、ABA相关基因的表达水平变化从而导致果实不育。

图20表明转基因植株中与叶绿素调控相关的基因对比野生型表达降低，差异显著，而与生长形态调控相关基因在转基因植株中表达更高，因此说明PmGRF7超表达之后通过影响核糖体途径、鞘脂代谢通路、光合作用通路相关基因从而调控叶片形态。

对WT vs Leaf和WT vs Flower和WT vs Fruit组中的差异表达基因进行WGCNA分析表明，这些DEGs被分为14个模块，分别用不同用颜色代码定义。模块中的基因均为与表达行为高度相关的基因。通过观察模块与样本之间的相关性发现，其中darkmagenta模块与转基因植株的花呈显著正相关；bisque4与与转基因植株的果实呈显著正相关；blue模块与转基因植株的叶显著负相关。

根据在果实、花和叶中的差异表达情况以及基因显著性Gene Significance(GS)大于0.2、模块关系Module membership(MM)大于0.9、模块连通性eigengene connectivity(KME)值大于0.9来筛选候选转录因子，表1说明在花中得到了6个响应激素转录因子基因；在叶片中得到了9个与叶绿体、组织发育以及ATP合成相关的转录因子基因；在果实中得到了3个与细胞组成、mRNA结合、生物进程有关的转录因子基因。进一步说明PmGRF7超表达之后，引起GA、ABA相关基因的表达水平变化从而导致果实不育；通过影响生长发育相关的能量代谢途径相关基因从而调控叶片形态。

表1相关特异性模块中核心转录因子的功能注释

进一步分析转录组中与叶绿素调控、形态调控、激素信号转导相关的差异基因，表2说明大部分相关基因都表现出转录差异，其中叶绿素调控相关途径中草酸辅酶A连接酶、NADP依赖性苹果酸酶(叶绿体)在3个超表达株系中上调表达，而光系统II修复蛋白PSB27-H1、叶绿素a-b结合蛋白下调表达。在形态调控相关途径中，核糖体代途径和鞘脂代谢途径等基因如50s核糖体蛋白、α-半乳糖苷酶下调表达，而苯丙烷类代谢途径基因苯丙氨酸氨裂解酶3和鞘脂代谢途径中的鞘氨醇C4-单加氧酶上调表达。表4说明花朵3个对照组的测序结果中，GA受体GID1b-1、IAA反应因子ABF3和ABA受体PYR1都在转基因植株中上调表达；而表3说明在转基因植株的果实中，GA受体GID2和ABA受体PYL4上调表达，IAA反应因子ARF3下调表达。

表2野生型和转基因番茄植株叶片中与叶绿素调控以及形态调控相关的差异表达基因

表3野生型和转基因番茄植株果实中与激素信号转导途径相关的差异转录基因

表4野生型和转基因番茄植株花朵中与激素信号转导途径相关的差异转录基因

对筛选出的差异转录因子进行qRT-PCR分析，图22、图23和图24说明，这些基因的表达趋势与转录组的数据基本一致，说明转录组数据可靠，可供后续分析。

上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种植物生长调控基因PmGRF7及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagagagaga aagagaaaga taagataata cgatatgggt ctactgttgt attctatatc 60

ttgagacttg atgatgtggt cagtgtctct gaaaaatccc cataagaaag cattagacaa 120

gcataaggct tttcctggaa gcagaaccaa aaagttggtc tctagagttt ttggtcaaga 180

gcttccattt ttttatgttt gatattcatg gaaaggtcgt ttcccaaata aggcaactgg 240

ttttctttta tatatttttt ggagtgaaca aagcttttgg catcacagac aaggagaccg 300

aagaaaatag gaccttggtt tgagtttgtg agcaaactgc aacgtacaga atcatttgcc 360

ttgcctggta agaagatgat gatggttcat catgataatc accgtcgtcc attttcatca 420

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tttcctttta caaatacaca gtggaaagag cttgagagac aagccatgat atacaagtat 720

atggttgcat ctctccctgt gcctcgtgat ctcctcttcc caattaccag agctccctca 780

agcccaacta tttctcaatc acccttgagt agcggtttca atcttaggct atcaaacagt 840

acagatccag agccagggag gtgcaagaga acagatggaa agaaatggag gtgttcaaga 900

gatgtggcgc ctgaccagaa gtactgtgag cgccatatgc acagaggccg tccccgttca 960

agaaagcatg tggaagttca tgccaacacc acaaccaaga gggttcgcca tgacatcaat 1020

caagctcctc ctaccatgtc cccggcaact gtgtcaattt ctaacaccac atccatcaac 1080

aagaatgttt gccagactca gtttattgaa tctactctgc aaccatacca tcagtctcct 1140

atgtttctga atagggacac tgtcaaggct gcaacttttg attctatgaa ctctgcttca 1200

tcaggcagag agcctaggag cttagattgg ctgatgatga aaggagaacc tgttcaaatg 1260

gccacttctg atccacaatg gcagcatctg atgcagagca aaacagagct aaactccaag 1320

atccccttct ttgatgctaa ttcctgtatt ttcacccgac gttctcaaga agagtgtttc 1380

ttgaatttga attcgtacac aaatttcaac gccggcggag aggatcaacc agacaacgag 1440

tgcaatatgt ttctcaatcc agatgtggtt tctttagata atcctctgtt ggaagaaacc 1500

ccaagatgtt tcattgacgc gtggtccaaa acaatgatag atgaagacac catggccaac 1560

tctattagca acaaagacaa tagctctgct ccatcaagtg ggcagctctc accttcttcc 1620

ctaacactgt caatgggagg ttataactcc atcaatgagg aaatgggtca gacgcaaatg 1680

agcttaggaa acaatggaaa tggtatgaag ccagggcttt caacatggct cagccctgct 1740

tcatgggttg cttcggcacc aggcgggcca ttagctgagg tcctaaaacc cacgaccagc 1800

gcagcatcaa atccatcgtc tcctatcaca gctgctactg ccaatggaga attgggtagc 1860

ccattggcga caacggtgtc atcaccatct ggggttcttc agaagacgtt tgcttcactg 1920

tctgatagta gtggtaatag cagcccaacc ctggcaagtt caagggctaa gcagccagag 1980

attgtttctc tgtggttgaa tcagaacaaa gcataatcaa tttttccttg ttacacgaaa 2040

accatgttct tttggtttgg tttggtagtt gttttggctg gttcttcgac tacagaagat 2100

gaacttgggt agtttagttg tgattctcca agtgagttct gaactcggtg acaagatttc 2160

tcttaatttt ccaagcttta ctgtattcta tcgtttttat tgaagaacct ttgttaactt 2220

ttttgctagt ggtggatcac tttaatattt tgcgtatact aagcctatga ggtggggctc 2280

tgtgtgtgtc tggatctatg tcggaagaaa tatctgcgtc gacttgtaga ctgctttctt 2340

tccccaacag ggttccactg tttatgcaag attcttctac taatgataag cttaccatca 2400

aattga 2406

<210> 2

<211> 546

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Met Val His His Asp Asn His Arg Arg Pro Phe Ser Ser Ser

1 5 10 15

Glu Arg Gly Glu Ala Asp Gly Pro Thr Cys Asn Arg Pro Pro Val Thr

20 25 30

Asp Asn Tyr Pro Asn Asn Asn Ser Val Tyr Asp Val Val Val Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gln Val Leu Arg Gly Leu Gln

50 55 60

Pro Phe Asp Ile Ser Asn Arg Thr Thr Asn Thr Pro Ile Ser Ala His

65 70 75 80

His Thr Ala Phe Arg Ser Pro Gly Gly Met Thr Thr Ser Leu Gly Phe

85 90 95

Pro Phe Thr Asn Thr Gln Trp Lys Glu Leu Glu Arg Gln Ala Met Ile

100 105 110

Tyr Lys Tyr Met Val Ala Ser Leu Pro Val Pro Arg Asp Leu Leu Phe

115 120 125

Pro Ile Thr Arg Ala Pro Ser Ser Pro Thr Ile Ser Gln Ser Pro Leu

130 135 140

Ser Ser Gly Phe Asn Leu Arg Leu Ser Asn Ser Thr Asp Pro Glu Pro

145 150 155 160

Gly Arg Cys Lys Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ser Arg Asp

165 170 175

Val Ala Pro Asp Gln Lys Tyr Cys Glu Arg His Met His Arg Gly Arg

180 185 190

Pro Arg Ser Arg Lys His Val Glu Val His Ala Asn Thr Thr Thr Lys

195 200 205

Arg Val Arg His Asp Ile Asn Gln Ala Pro Pro Thr Met Ser Pro Ala

210 215 220

Thr Val Ser Ile Ser Asn Thr Thr Ser Ile Asn Lys Asn Val Cys Gln

225 230 235 240

Thr Gln Phe Ile Glu Ser Thr Leu Gln Pro Tyr His Gln Ser Pro Met

245 250 255

Phe Leu Asn Arg Asp Thr Val Lys Ala Ala Thr Phe Asp Ser Met Asn

260 265 270

Ser Ala Ser Ser Gly Arg Glu Pro Arg Ser Leu Asp Trp Leu Met Met

275 280 285

Lys Gly Glu Pro Val Gln Met Ala Thr Ser Asp Pro Gln Trp Gln His

290 295 300

Leu Met Gln Ser Lys Thr Glu Leu Asn Ser Lys Ile Pro Phe Phe Asp

305 310 315 320

Ala Asn Ser Cys Ile Phe Thr Arg Arg Ser Gln Glu Glu Cys Phe Leu

325 330 335

Asn Leu Asn Ser Tyr Thr Asn Phe Asn Ala Gly Gly Glu Asp Gln Pro

340 345 350

Asp Asn Glu Cys Asn Met Phe Leu Asn Pro Asp Val Val Ser Leu Asp

355 360 365

Asn Pro Leu Leu Glu Glu Thr Pro Arg Cys Phe Ile Asp Ala Trp Ser

370 375 380

Lys Thr Met Ile Asp Glu Asp Thr Met Ala Asn Ser Ile Ser Asn Lys

385 390 395 400

Asp Asn Ser Ser Ala Pro Ser Ser Gly Gln Leu Ser Pro Ser Ser Leu

405 410 415

Thr Leu Ser Met Gly Gly Tyr Asn Ser Ile Asn Glu Glu Met Gly Gln

420 425 430

Thr Gln Met Ser Leu Gly Asn Asn Gly Asn Gly Met Lys Pro Gly Leu

435 440 445

Ser Thr Trp Leu Ser Pro Ala Ser Trp Val Ala Ser Ala Pro Gly Gly

450 455 460

Pro Leu Ala Glu Val Leu Lys Pro Thr Thr Ser Ala Ala Ser Asn Pro

465 470 475 480

Ser Ser Pro Ile Thr Ala Ala Thr Ala Asn Gly Glu Leu Gly Ser Pro

485 490 495

Leu Ala Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Gly Val Leu Gln Lys Thr Phe

500 505 510

Ala Ser Leu Ser Asp Ser Ser Gly Asn Ser Ser Pro Thr Leu Ala Ser

515 520 525

Ser Arg Ala Lys Gln Pro Glu Ile Val Ser Leu Trp Leu Asn Gln Asn

530 535 540

Lys Ala

545

Claims

1.一种植物生长调控基因PmGRF7、PmGRF7编码的蛋白质、包含PmGRF7的载体或宿主细胞在调控番茄生长发育中的应用，其特征在于，所述植物生长调控基因PmGRF7的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述调控番茄生长发育为：增厚番茄叶片、提高叶绿素含量、不完全伸展叶片和促使果实不育。

2.权利要求1中所述的植物生长调控基因PmGRF7、PmGRF7编码的蛋白质、包含PmGRF7的载体或宿主细胞在调控番茄激素信号转导途径合成相关基因及叶片生长发育相关基因的表达中的应用，其特征在于，所述激素信号转导途径合成相关基因为GID2、ARF3和PYR1；所述叶片生长发育相关基因为PHOT2。

3.一种改变叶片形态、叶绿素含量和果实育性的番茄培育方法，其特征在于，所述方法是通过超表达权利要求1中所述植物生长调控基因PmGRF7。