CN109234305B

CN109234305B - 一种棉花性状改良的方法

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Publication number: CN109234305B
Application number: CN201810779792.5A
Authority: CN
Inventors: 柯丽萍; 孙玉强
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN109234305A

Abstract

本发明公开了一种棉花性状改良的方法，所述方法是抑制或敲除棉花花青素甲基化修饰基因GhOMT1。本发明棉花性状的改变，通过调控花青素代谢通路中的花青素修饰基因的表达，导致无法合成细胞需要特定的花青素或花青素苷，改变花青素单体的组成和含量，反馈激活花青素生物合成，造成大量花青素或中间产物积累，使植株出现紫色，并且抗衰老、抗冻性状。

Description

一种棉花性状改良的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种利用棉花花青素甲基化修饰基因培育紫化、耐寒、抗衰老棉花的方法。

(二)背景技术

棉花是世界上主要的纤维作物之一。植物自发突变通常是在自然条件下，无人为因素介入的情况下发生的变异。王学德2002年报道发现了一棵无纤维棉花突变体，为棉花纤维发生机理研究及棉纤维相关基因的克隆提供了材料(蒋淑丽，王学德，5个棉花纤维突变体胚珠和纤维的离体诱导，棉花学报,2002,14(2):71-75,2002)。陈旭升等从陆地棉中分离出自然突变的具有高光合效率的亚红株突变体，随后又发现了自发突变矮化株(陈旭升，棉花矮秆突变体，中国棉花,2004,31(1):26-26；陈旭升，陆地棉亚红株新突变体；中国棉花，2004,31(12):19-19)。由于自发突变的低概率事件，加上棉花遗传背景的复杂性，有些即使发现一些表型变异，也很难用分子机理验证，而最终导致自发突变体库资源流失。

棉花花器官的颜色问题，已被当作研究棉花遗传和分类学方面的重要材料(Fryxell et al.,Phenetic analysis and the phylogeny of the diploid species ofGossypium L.(Malvaceae).Evolution,1971,554–562；Parks et al.,The applicationof flavonoid distribution to taxonomic problems in the genusGossypium.Bulletin of the Torrey Botanical Club,1975,350–361.；Liang et al.,New red flower germplasm lines of cotton selected from hybrid of Gossypiumhirsutum X G.bickii.Science in China Series C:Life Sciences,1997,40:284–292.)。尽管棉纤维是棉花的主要产品，但是对棉花花器官基因改造，也能提高棉花的经济价值。棉花花器官的生命历程极短暂，在正常生长环境下，一般早上开放，下午开始枯萎，至第二天正午凋零，并且其花色在这短短的时间内会发生巨大的变化(Neelakantam et al.,Pigments of cotton flowers.Part I.Cambodia(G.hirsutum).Proc Indian Acad Sci-Section A,1935,1:887–890；Chhabra et al.,Factors affecting anthocyaninsynthesis in cotton flowers.Physiology of sexual reproduction in floweringplants,Kalyani Publishers,New Delhi,1978,136–141)。通过表达分析发现，花器官中的类黄酮与基因和光线有复杂的关联，并且花色的改变主要与花青素合成基因表达有关，而pH等外界环境因素带来的影响极小；其中PAL,CHS,F3H,DFR,FLS,ANR,ANS以及UFGT这些基因与花器官中的花青素积累有紧密联系，而与FLS1基因相关的黄酮醇合成受光照影响大(Tan et al.,The Flavonoid Pathway Regulates the Petal Colors of CottonFlower.PLoS ONE,2013,8(8):e72364)。Parks等发现环境因素对棉花花色的影响远比对棉花叶片的影响要小得多(Parks et al.,Floral pigmentation studies in the genusGossypium.IV.Effects of different growing environments on flavonoidpigmentation.Am J Bot,1972,158–164)；棉花花色主要是由遗传决定的(Parks et al.,Floral Pigmentation Studies in the Genus Gossypium.II.Chemotaxonomic Analysisof Diploid Gossypium Species.Am J Bot,1965,849–856)。红叶棉(Empire Red LeafCotton，ERLC)是一个重要的遗传资源。在营养器官积累大量花青素能够抵御棉铃虫、粉虱、棉铃象甲等害虫的侵蚀(Zafar et al.,Development of genetic linkage map of leafred colour in cotton(Gossypium hirsutum)using DNA markers.Pak J Bot,2009,41:1127–1136；Fitt,Cotton pest management:part 3.An Australian perspective.AnnuRev Entomol,1994,39:543–562)。在棉花育种中，红叶棉可以在形态学研究上有重要利用价值，这个品种的表型是在光照下除了棉纤维之外，其他组织中有明显的花青素积累，呈现红色。Gao等通过瞬时表达，在ERLC启动子区两个串联重复的228bp片段，是RLC1基因(属于R2R3-MYB型)光依赖性表达和叶片等组织中花青素积累的关键所在，这也使得R2R3-MYB转录因子在光诱导下调控ERLC叶片花青素积累上的重要性更加明了，MYB调控RLC1基因表达，并能在金鱼草和棉花中增强花青素代谢通路中结构基因的表达(Gao et al.,ThePromoter Structure Differentiation of a MYB Transcription Factor RLC1 CausesRed Leaf Coloration in Empire Red Leaf Cotton under Light.PLoS ONE,2013,8(10):e77891)。

形态标记对于棉花育种具有重要的作用，比如棉花芽黄突变体，该突变体叶片黄化一般在苗期表现，随着植株的生长，叶绿素含量的增加，黄化的叶片逐渐变绿，达到野生型水平。芽黄突变体不仅是研究光合作用、叶绿素合成途径、基因表达调控的理想材料(刘朝辉等，一个新的水稻叶绿素缺失黄叶突变体的特征及基因分子定位.遗传，2012，34(2)：223-229)，而且在育种上芽黄突变体可以作为一种新的种质资源培育新品种(Gan etal.Inhibition of leaf senescence by autoregulated production ofcytokinin.Science，1995，270(5244)：l986-1988)。利用叶色突变这一容易识别的特点，将控制芽黄突变体的基因转到杂交亲本中，作为指示性状鉴定种子纯度，节约时间和成本(Zhao et a1.A chlorophyll-reduced seeding mutant in oilseed rape，Brassicanapus,for utilization in F1 hybrid production.Plant Breeding,2000,119(2):131-135)。另外可以将叶色突变的形态标记用于QTL(Quantitative trait locus)连锁分析，定位控制数量性状的基因，加快分子标记辅助育种的进程(苗晗等.黄瓜黄绿叶突变体光合色素变化及相关基因差异表达.中国农业科学,2010，43(19)：4027-4035)。1933年killough等首次报道陆地棉芽黄突变体材料v1，目前在四倍体棉种中已经发现22个芽黄突变体(宋美珍等.一个短季棉芽黄基因型的鉴定及生理生化分析.中国农业科学,2011,44(18):3709-3720)，涉及到26个芽黄基因。研究发现v1是v7的部分同源基因(Turcotte andFeaster.The interaction of two genes for yellow foliage in cotton.Journal ofHeredity,1973,64(4):23l-232)，v2和v14之间具有部分同源关系(Kohel et al.Geneticanalysis of virescent mutants and the identification of virescents vl2，vl3，v14，v15 and vl6 vl7 in upland cotton.Crop Science,1983,23(2):289-291)，且在已知的芽黄突变体中.存在着重叠芽黄基因和部分同源的芽黄基因对，例如v5v6,vl6vl7、yglyg2分别位于同一对同源转化群的两条染色体上(肖松华等.陆地棉芽黄基因的互作效应研究.江苏农业学报,1996,12(2):11-16)。

花青素(anthocyanin)又称花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，是植物花瓣中的主要呈色物质。花青素主要在植物液泡中积累，具有多种生物学功能，例如吸引昆虫传粉，抵御低温和紫外线伤害，以及抵御植物病害等；花青素是一种天然食用色素，具有安全、无毒的特点，并且资源丰富；花青素还是一种强效的自由基清除剂，具有抗氧化、抗衰老、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏与抗癌等多种生理功能，其抗氧化效果分别是维生素C和维生素E的20和50倍。苯丙氨酸是类黄酮生物合成的直接前体，合成的花青素在不同的物种中经历不同的修饰，常见的有糖基化、酰基化和甲基化。甲基化修饰使得花青素的结构、颜色具有多样性。植物类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid0-methyltransferase，FOMT)属转移酶类的甲基转移酶家族，是一类可催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosybL-methionine，SAM)中的-CH3基团转移到类黄酮-OH上的蛋白质酶。甲基化是类黄酮物质最基本、最主要的修饰反应之一，不仅可以降低类黄酮的化学反应活性，而且增加了其脂溶性，赋予了类黄酮更多的生理生化特性(Lam KC,Ibrahim RK,Behdad B,Dayanandan S.Structure,function,and evolution of plant O-methyltransferases.Genome,2007,50:1001-1013)。依赖于S-腺苷蛋氨酸的花青素甲基转移酶cDNA已从矮牵牛及葡萄中获得，它们一般属于依赖于阳离子的Ⅱ型MT(methylationtransferase)，而黄酮类MT属于Ⅰ型MT(张传丽等.植物类黄酮O-甲基转移酶研究进展.西北植物学报,2012,32(6):1274-1281)。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种棉花性状改良的方法，所述棉花的性状包括植株紫化、耐寒、抗衰老，为培育耐寒、抗衰老、遗传选择标记紫化性状等提供种质资源和材料。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种棉花性状改良的方法，所述方法是抑制或敲除棉花花青素甲基化修饰基因(GhOMT1)。

进一步，所述棉花花青素甲基化修饰基因GhOMT1的核苷酸序列(gDNA)为SEQ IDNO.1所示，cDNA序列为SEQ ID NO.2所示，该基因上游核心调控元件核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述棉花的性状包括紫化、耐寒、抗衰老。

本发明所述抑制GhOMT1表达或GhOMT1敲出的方法，包括以下步骤：

1)将GhOMT1基因与启动子可操作地连接；

2)构建含有GhOMT1基因与启动子的植物表达载体，所述表达载体至少含有增强型、组成型和或诱导型启动子；

3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4)用所述转化体感染植物，获得紫化耐寒抗衰老棉花植株。

本发明所述cDNA序列包含5’-非翻译区序列、开放阅读框(ORF)序列和3’-非翻译区序列，其中开放阅读框序列为编码序列，基因组DNA序列含有外显子和内含子序列。

GhOMT1基因上游序列即启动子和核心调控元件，其具有SEQ ID NO.3所示的DNA序列，本领域技术人员可以理解的是，将SEQ ID NO.3的DNA序列经过几个或一段核苷酸残基的取代、缺失或添加，或插入大片段DNA序列等改变下游基因表达模式也同样属于上述范围。

由上述GhOMT1基因编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，本领域技术人员可以理解的是，将SEQ ID NO.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.4的氨基酸残基序列相同生物活性的由SEQ ID NO.4衍生的蛋白质序列也同样属于上述范围。

本发明提供的植物表达载体，其至少含编码GhOMT1基因的核苷酸和启动子序列，所述植物表达载体通过将编码GhOMT1基因、启动子序列与植物表达载体可操作地连接而构建。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列以及其它的为基因工程操作的需要而插入的各种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，优选地，本发明的植物表达具有如图4，5所示的结构。例如，可以在所述表达载体中加入在植物中能表达的编码可发生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS基因、GFP基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如潮霉素标记物、抗卡拉霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂基因等。

用于构建本发明植物表达载体的启动子可以是任意一种启动子，包括增强型、组成型、组织特异型以及诱导型启动子。构建表达载体时，所述启动子可以单独使用，还可以和其它植物启动子结合使用。用于构建本发明植物表达载体的启动子优选组成型启动子或组织特异性启动子，更优选来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。通常，将GhOMT1基因构建在CaMV35S的下游。

用于构建本发明植物表达载体的出发载体可以是任意一种双元农杆菌载体或者可用于基因枪转化的植物表达载体。

在本发明的一种具体实施方案中，将GhOMT1基因或cDNA正向插入植物表达载体pBI121-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhOMT1基因的植物表达载体pBI21-35S-GhOMT1-NOS，其具有如图4所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因和各基因操作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。

在本发明的一种具体实施方案中，将GhOMT1基因片段插入植物干涉表达载体pB7GWIWG2(II)中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhOMT1基因的植物干涉表达载体pB7GWIWG2(II)-GhOMT1-F-T35S，其具有如图5所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因和各基因操作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。

本发明转化体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法，将含有本发明GhOMT1基因的表达载体转染棉花而获得转化体。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

本发明棉花性状的改变，通过调控花青素代谢通路中的花青素修饰基因的表达，导致无法合成细胞需要特定的花青素或花青素苷，改变花青素单体的组成和含量，反馈激活花青素生物合成，造成大量花青素或中间产物积累，使植株出现紫色，并且抗衰老、抗冻性状。

(四)附图说明

图1 GhOMT1基因在棉花植株和彩色棉纤维中的表达水平。C312为陆地棉品系；XC5为彩色棉新彩5号；F0-0DPA:开花当天的胚珠纤维；F0-6DPA:开花后6天的胚珠纤维；F-10DPA:开花后10天的纤维细胞；0-10DPA:开花后10天的胚珠，Leaves为幼嫩真叶(幼苗期)。

图2GhOMT1蛋白质与其他物种相关蛋白质的同源性比较。目的基因编码蛋白质为GhCOMT；雷蒙德氏棉GrFOMT；蓖麻ref|XP_003634428|RcPMT；葡萄ref|XP_003634428|VvCOMT；毛果杨ref|XP_002864309|PtOMT；

拟南芥ref|XP_002864309|AtOMT；苜蓿ref|XP_003602396.1|MtCOMT；高粱ref|NP_001242325.1|GmCOMT；大豆ref|NP_001066477.2|OsCOMT。

图3GhOMT的进化树分析。

图4本发明优选的植物表达载体pBI121-35S-GhOMT1-N0S结构图。其中NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；GhOMT1代表GhOMT1基因cDNA或GhOMT1基因组基因；NOS:Nos终止子；35S:来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB:T-DNA左边界；RB:T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pBI121载体。

图5本发明优选的抑制GhOMT1基因植物干涉表达载体pB7GWIWG2(II)-GhOMT1结构图。其中Bar代表双丙氨磷抗性基因(bialaphos resistance gene)，具有除草剂抗性；T35S:来源于花椰菜花叶病毒的终止子；GhOMT1-F代表GhOMT1特征性片段；intron代表一段非编码序列；p35S:来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB:T-DNA左边界；RB:T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pB7GWIWG2(II)载体。

图6:GhOMT1基因敲出转基因植株对棉花植株生长发育的影响。其中A1为非转基因棉花(野生型CK C312)植株的生长状况，A2为GhOMT1敲出转基因棉花(Ghomt1)植株的生长状况，野生型整株为绿色叶片、萼片和粉色花瓣，Ghomt1植株整株为紫色，花瓣为内红外紫；B1、D1为非转基因棉花(野生型CK C312)花器官发育比较，B2、D2为GhOMT1敲出转基因棉花(Ghomt1)植株花器官发育比较；C1为非转基因棉花(野生型CK C312)棉花叶片颜色比较，C2为GhOMT1敲出转基因棉花(Ghomt1)棉花叶片颜色比较。

图7陆地棉野生型C312植株和紫化突变体omt1植株中叶片花青素含量柱形图。

图8陆地棉野生型C312植株和紫化突变体omt1植株中GhOMT1基因表达量柱形图。

图9紫化突变体和陆地棉野生型衰老情况比较(11月底4-7℃田间条件下，左边为紫化突变体有20余片紫色功能叶；右边为已经凋亡陆地棉C312)。

图10紫化突变体omt1和陆地棉野生型C312在衰老阶段叶绿素含量柱形图。

图11紫化突变体omt1和陆地棉野生型C312在衰老阶段花青素含量柱形图。

图12紫化突变体和陆地棉野生型抗冻情况比较(11月底到12月初0-4℃田间条件下，左边(A、C)为紫化突变体有10余片紫色功能叶；右边(B、D)为已经凋亡陆地棉C312)。

图13转基因棉花的鉴定。干涉表达GhOMT1转基因棉花的表达分析，WT(CK):非转基因棉花(野生型)；RNAi1-4:RNAi干涉抑制GhOMT1转基因棉花。

图14干涉GhOMT1对棉花生长发育的影响。其中CK WT:非转基因棉花(野生型)；RNAi:干涉GhOMT1转基因棉花，红茎，红叶柄，红萼片，红花瓣，红叶缘。

图15 CRISPR/Cas9表达载体示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为珂字棉312(Gossypium hirsutumcv.C312)，彩色棉棕絮1号(Gossypium hirsutum cv.ZX1)。

实施例1棉花紫化耐衰老突变体的获得及其基因克隆

1、棉花紫化耐衰老突变体的获得

将构建好的T-DNA表达载体(pBI121)转到农杆菌LB4404扩大培养，将棉花C312幼苗下胚轴与装载T-DNA载体的农杆菌LB4404在诱导培养基(MSB5培养基+2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.1mg/L+KT(细胞分裂素)0.1mg/L)上23℃共同培养36-48h。用含有头孢霉素(500mg/L)的无菌水清洗胚性愈伤组织。将清洗后的胚性愈伤组织转移到抗性筛选培养基(MSB5培养基+IBA(吲哚乙酸)0.5mg/L+KT0.15mg/L+卡那霉素50mg/L)上筛选转化成功的胚性愈伤组织。将分化生长的不同愈伤组织块分别接种到继代培养基上(MSB5培养基+IBA0.5mg/L+KT 0.2mg/L)，继代挑出转化成功的胚性愈伤组织，培养形成胚状体，直到诱导再生植株。(具体方法参考Liping Ke,RuiE Liu,Bijue Chu,Xiushuang Yu,Jie Sun,BrianJones,Gang Pan,Xiaofei Cheng,Huizhong Wang,Shuijin Zhu,Yuqiang Sun.CellSuspension Culture-Mediated Incorporation of the Rice Bel Gene intoTransgenic Cotton.PLoS ONE,2012,7(7):e39974)。

从转基因再生株系中获得紫化突变体omt1植株，在自然条件下，从种子萌发开始，到植株死亡，整个生育期所有的组织器官都是紫色，并稳定遗传(图6)，整个植株的叶片中花青素含量极显著上升(图7)。该转基因紫化突变体通过PCR和Southern Blot分析，发现该株系已成功转入外源T-DNA，并以单拷贝插入。利用Tail-PCR分离T-DNA侧翼序列(方法参考：Liu YG,Mitsukawa N,Oosumi T,Whittier RF(1995)Efficient isolation andmapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetricinterlaced PCR.Plant Journal,8:457–463)，通过测序和序列分析，定位了T-DNA插入后沉默的目的基因为Plant Flavonoid 3-O-methyltransferase，即植物类黄酮甲基化转移酶(简称GhOMT1)，在紫化突变体中，该基因被沉默不再表达(图8，基因表达检测方法见实施例2)。而类黄酮甲基化转移酶(GhOMT1)可催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)中的-CH3基团转移到类黄酮-OH上，甲基化是类黄酮基本结构形成后最主要的修饰反应之一，和酰基化、糖基化等基本修饰反应导致了类黄酮种类的多样性以及功能的多样性。类黄酮甲基化可降低其活性基团的化学反应活性，还可以增加其脂亲和性，扩大了其在细胞内的分布范围，同时提高了其抗菌性。类黄酮是植物体内最重要的次生代谢物之一，在植物的生长、发育、抗逆境胁迫等多种生物进程中发挥着重要的作用，植物细胞需要一定量的类黄酮执行特定生理功能。所以，该紫化突变体性状形成主要有植物花青素生物合成途径上甲基化修饰功能缺失，导致细胞内不能合成特定类黄酮，反馈花青素合成途径，从而导致大量游离态花青素累积，形成紫色表型。

2、紫化突变体omt1植株抗衰老、抗冻验证

紫化突变体omt1植株和野生型C312植株在正常生长条件种植在10月底和12月初，分别进行紫化突变体抗衰老和抗冻表型观察、相应的生理指标分析，叶绿素和花青素含量测定。

(1)棉花花青素提取

通过酸化甲醇法提取棉幼叶花青素，称取约0.1g棉花顶端幼叶于液氮中研磨成粉末，加入到1.5mL带盖子的离心管中，并迅速添加含有0.5％(v/v)HCl甲醇提取液1mL，剧烈涡旋震荡约30s。待样品冷却至室温后，在避光的条件下置于转速为120rpm的摇床上1h。从摇床上取出悬浮液，在20℃，2630g的转速下，离心15min，以除去细胞碎片等杂质。用移液枪小心吸取上清液，并重复以上提取步骤2次。将2次上清提取液混合均匀后，避光冷藏，以备紫外分光光度检测试验使用。

(2)花青素含量测定

一般采用pH示差法测量花青素的含量(Giusti et al.,2001)。本实验将使用尤立科2102c紫外分光光度计对棉花叶片中花青素含量进行测定，实验比色杯直径1cm。实验开始前，需先用样品稀释液0.4M KC1-HC1缓冲液(pH4.5)将样品按体积比1:10，1:50，1:100，1:500，1:1 000稀释，确保花青素的吸光度在紫外分光光度计的线性测定范围。以ddH₂O调零，分别测定530nm、620nm、650nm吸光度值，结果见图7。

计算公式为：

花青素光密度值：ODλ＝(OD₅₃₀-OD₆₂₀)-0.1(OD₆₅₀-OD₆₂₀)

花青素含量计算公式：花青素含量(nmol/g)＝ODλ/ε×V/m×10^6

式中：ODλ为花青素在530nm波长下的光密度；ε为花青素摩尔消光系数4.62×10^6；V为提取液总体积(mL)，m为取样质量(g)；10^6为计算结果换算nmol的倍数。

注：花青素酸性溶液的吸收高峰波长是530nm；可溶性糖吸收高峰波长是620nm；叶绿素的吸收高峰波长是650nm。

(3)紫化突变体omt1植株在抗衰抗冻中的表型分析

大田正常种植和管理条件下，紫化突变体omt1植株整体表现出比对照C312植株更强的生长势。在逆境条件下生长优势更明显，表现为抗衰老、抗冻。在大田种植条件下，10月底野生型对照C312植株，整体落叶、枯萎情况下，紫化突变体omt1植株保持正常生长和20余片功能叶(图9)，花蕾正常生长，不落蕾。叶片中叶绿素和花青素含量极显著高于野生型C312(图10、图11)。

另外，紫化突变体omt1植株在低温下能够正常生长，在4℃条件下两周内，野生型对照植株的叶片全部枯死，而紫化突变体omt1植株顶端有10余片正常生长功能叶(图12)；在0℃条件下，紫化突变体omt1植株也能正常生长，保持10片左右功能叶，花蕾正常生长，不落蕾(图12)。

3、控制棉花紫化耐衰老突变性状的基因克隆

(1)用于基因克隆的棉花DNA的CTAB法提取

取新鲜C312棉花和突变体Ghomt1棉花叶片3g左右，加入液氮，迅速研磨成粉末状，装入50ml离心管中；快速加入65℃预热的CTAB溶液12ml(2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，l00mmol/LTris-HCl(pH8.0)，200mmol/L EDTA(pH8.0)，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(v/v)，使用前加入)，摇匀；65℃水浴1h，每10min轻轻摇动一次，使CTAB与粉末充分接触；加等体积的24:1(v/v)＝氯仿：异戊醇，上下颠倒，轻轻摇匀至一相，12000rpm，离心10min；取上清，重复上一步骤一次；取上清，加2/3体积异丙醇，轻轻上下混匀数次，出现絮状沉淀，-20℃冷冻30min；用枪头挑去絮状DNA于15ml离心管中，加70％乙醇浸泡，每1-2h换一次，至少2次；去乙醇，自然风干5min，用50-100ul ddH₂O溶解，分别注释保存，备用。

(2)棉花RNA的提取

选取约3g新鲜野生型C312和突变体Ghomt1棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15ml 65℃预热的RNA提取液(2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，l00mmol/LTris-HCl(pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(v/v)，使用前加入)，颠倒混匀。65℃水浴3-l0 min，期间混匀2-3次。氯仿:异戊醇(24:1，v/v)抽提2次(10000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl液，4℃放置6h，以酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1，v/v/v)各抽提1次(10000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12000r/min，室温，离心20min，弃上清。沉淀用200mL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5):氯仿:异戍醇(25:24:1，v/v/v)、氯仿:异戍醇(24:1，v/v)各抽提1次(10000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc水溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％(v/v)的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

(3)cDNA合成

提取棉花各种样品(幼苗期的叶片，开花当天的胚珠纤维，开花后6天的胚珠纤维，开花后10天的纤维细胞，开花后10天的胚珠)总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成cDNA—链。具体方法为：取约10μg总RNA到DEPC-处理的扩增管中，加入1μL、2.5μmol/L Oligo-dT，加DEPC处理水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL5×reaction buffer，2μL10mmol/L dNTPs，1μL RNase inhibitor(20U)，37℃处理5min。加入1μL AMV RTase(5U)后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，一链产物于-20℃冻存。

(4)筛选陆地棉GhOMT1序列

通过Tail-PCR技术(Liu YG,Mitsukawa N,Oosumi T,Whittier RF(1995)Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insertjunctions by thermal asymmetric interlaced PCR.Plant Journal,8:457–463)，获得紫化突变体omt1插入位点的侧翼序列，在棉属野生棉G.raimondii基因组序列和拟南芥基因组中进行比对和分析，根据野生棉G.raimondii位于2号染色体上编码植物类黄酮甲基转移酶基因CDS(Flavonol 3-O methyltransferase,GrFOMT)和拟南芥中已知的OMT基因cDNA序列，搜索NCBI数据库中的陆地棉EST序列，根据对应的序列设计表达引物，检测C312及彩色棉ZX1纤维发育相同时期的表达差异。结果表明：陆地棉基因组中筛选到的OMT基因序列中，与拟南芥OMT基因和野生棉G.raimondii中编码GrFOMT基因高度同源，相似性达97％。在陆地棉基因组中获得全长DNA序列，设计引物GhOMT1-F、GhOMT1-R(GhOMT1-F：TTAACATTAGATTCGGCCGT；GhOMT1-R：TCAATAAATTGCCCTTTTCT)。以棉花C312基因组DNA为模板，以GhOMT1-F和GhOMT1-R为引物进行GhOMT1基因序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)的扩增。20μL的基因组DNA扩增体系含1μL KOD FX Taq DNA聚合酶(1U/μl)，10μL 2X PCRbuffer for KOD FX，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1μL特异引物GhOMT1-F(5μmol/L)，1μLGhOMT1-R(5μmol/L)，1μL DNA(50ng)和4μL水。扩增程序为:94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，2min，35个循环；72℃延伸10min；4℃hold。

(5)利用实时定量RT-PCR进行差异表达分析

以步骤(3)合成的cDNA—链作为模板，采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR。表达引物5’端引物为GhOMT1-RT F(TCATGTTTTGGCTGATGCAC)，3’端引物为GhOMT1-RT R(TCAAGCAATGTTCACTCCA)。在20μL的反应体系中包括10μL SYRB MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5’-端和3’-端表达引物各1μL(5μmol/L)。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，30sec，预设循环数为40。用棉花GhUBQ7基因(GenBank登录号:DQ116441)作内标，GhUBQ7基因的5’引物是GhUBQ7-F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC，3’引物为GhUBQ7-R：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG。利用实时定量RT-PCR检测了大田里C312和ZX1开花当天的胚珠纤维(F0-0DPA)、开花后6天的胚珠纤维(F0-6DPA)、开花后10天的纤维细胞(F-10DPA)和开花后10天的胚珠(0-10DPA)中GhOMT1基因的表达差异。结果表明该基因的表达水平在C312和ZX1的F0-6DPA胚珠纤维和F-10DPA纤维中出现显著差异，在彩色棉ZX1中高于白絮C312，而在F0-0DPA胚珠纤维和0-10DPA胚珠中表达水平相似(图1)，都显著高于在叶片中的表达水平。由此推测GhOMT1基因在胚珠和种皮纤维中的表达水平高。

(6)GhOMT1基因cDNA序列和基因组序列的扩增

根据筛选到GhOMT1基因组序列，通过分析设计GhOMT1 cDNA扩增引物，设计5’端引物GhOMT1-cF(TTAACATTAGATTCGGCCGTTTG)和3’端引物GhOMT1-cR(TCAATAAATTGCCCTTTTCTCCA)，以C312幼嫩叶片的cDNA为模板进行PCR的cDNA扩增，体系含1μL KOD FX TaqDNA聚合酶(1U/μl)，10μL 2X PCR buffer for KOD FX，2μL 2.5mmol/LdNTPs，1μL特异引物GhOMT1-cF(5umol/L)，lμL GhOMT1-cR(5μmol/L)，0.2μL Ex，1μL cDNA一链产物。扩增程序为:94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，2min，30个循环；72℃延伸10min。

(7)GhOMT1基因上游核心调控序列和克隆

根据GhOMT1基因克隆和测序结果在陆地棉基因组中比对，获得在染色体上位置，并克隆和确定其上游核心调控序列和元件，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(8)扩增片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

1)电泳

将GhOMT1基因和GhOMT1基因cDNA的PCR扩增产物在1.0％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

2)回收

使用回收试剂盒:回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

3)克隆和测序

回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pGEm-T(上海Sangon)载体上。序列测定由英骏公司完成。

回收的片段与pGEm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：胶回收产物(100-500ng)1-3μl；pMD18-T Vector(50ng/μl)0.7μl，Solution I 5μl，ddH₂O，补至10μl。反应条件：20℃恒温反应2-3h，或4℃过夜反应。

实施例2利用RNAi干涉GhOMT1基因培育紫化耐衰老转基因棉花

(1)按照实施例1克隆全长的GhOMT1基因(SEQ ID NO.1所示)，将GhOMT1基因正向插入植物表达载体pBI121-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhOMT1基因的植物表达载体pBI21-35S-GhOMT1-NOS，如图4。

将GhOMT1基因片段(SEQ ID NO.1所示)插入植物干涉表达载体pB7GWIWG2(II)中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhOMT1基因的植物干涉表达载体pB7GWIWG2(II)-GhOMT1-F-T35S，如图5。

构建好的载体热击法转化DH-5α大肠杆菌感受态，此过程用卡那霉素LB培养基培养重组子。从转化GhOMT1基因的大肠杆菌DH-5α中提取到的质粒pB7GWIWG2(II)-GhOMT1，采用电击法导入到农杆菌LB4404中，具体操作步骤如下：0.1cm电击杯用纯酒精清洗2-3次，放于工作台上吹干，置于冰上冷却，同时农杆菌LB4404感受态冰上解冻；1-2μl质粒加入到解冻的LB4404中，轻轻吸打混匀，冰浴5-8min；将上述产物转到电击杯中，电转化仪调至AGR档，电击加入600μl SOC培养基(20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，溶剂为去离子水，pH7.0)，吸打，使菌液充分混合到培养基中，吸出于1.5ml离心管中。28℃，220rpm，摇菌1h；涂布于Spec(100mg/L)和Rif(25mg/L)双抗筛选LB培养基的平板上，置于28℃恒温培养箱培养1-2d；挑斑检测及摇菌，阳性克隆菌液加甘油保存于-80℃，备侵染用。

(2)将步骤(1)阳性克隆菌株在双抗选择LB培养基(Spec 100mg/L,Rif 25mg/L)上划线，26.5℃暗培养36-48hr，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基(胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KH₂PO₄ 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，溶剂为去离子水，pH值7.0)中，27℃、200rpm摇2hr，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。收集棉花C312幼苗下胚轴在无菌三角瓶中，把经活化的菌液倒入其中，刚盖过表面为宜，搅匀，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，薄层分散布于垫有滤纸的共培养基(MSB5培养基+2,4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L)中，19-21℃暗培养36-48小时，待少部分愈伤表面出现不太明显的菌落结束共培养。用含有头孢霉素(500mg/L)的无菌水清洗共培的下胚轴。将清洗后的下胚轴转移到抗性筛选培养基(MSB5培养基+2,4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L+除草剂BASTA75mg/L)上诱导愈伤组织至胚性愈伤组织，筛选转化成功的胚性愈伤组织，将分化生长的不同愈伤组织块分别接种到继代培养基上(MSB5培养基+IBA0.5mg/L+KT 0.2mg/L+除草剂BASTA75mg/L)，继代挑出转化成功的胚性愈伤组织，培养形成胚状体，直到诱导再生植株(具体方法参考Liping Ke,RuiE Liu,Bijue Chu,XiushuangYu,Jie Sun,Brian Jones,Gang Pan,Xiaofei Cheng,Huizhong Wang,Shuijin Zhu,Yuqiang Sun.Cell Suspension Culture-Mediated Incorporation of the Rice BelGene into Transgenic Cotton.PLoS ONE,2012,7(7):e39974)。

在GhOMT1基因干涉的转基因株系中，GhOMT1基因的表达水平极显著下降(图13)，而转基因植株的这个生育期，从苗期开始植株茎秆、分枝、叶柄，叶缘都是红色，遗传稳定；开花期，花萼，花蕾和花瓣都是红色(图14)。该干涉株系的表型遗传稳定，可以很好应用于杂交育种的杂交种苗期选择；而且该株系在低温(0-10℃)或干旱条件下，相对于非转基因背景植株，明显具有生长优势，尤其在新疆棉区倒春寒或花铃期突然冻害等灾变时期。

实施例3利用CRISPR-Cas9技术敲除GhOMT1基因培育紫化耐衰老转基因棉花

1.棉花GhOMT1基因的CRISPR/Cas9系统基因敲除载体

1)为了获得靶基因GhOMT1序列18-23bp guideRNA，首先按照CRISPR/Cas9系统确定靶位点的唯一限制性条件就是3’末端的PAM位点，和PAM前端的18-22bp的gRNA序列。寻找23bp的位点，标准的识别位点形式是GN19NGG，其中NGG是蛋白结合基因组所需要的PAM序列，不需要出现在构建的载体上，需要放入载体的只是NGG前面的GN19这20bp。GN19的第一位的G是小RNA转录所需要的起始信号。

靶基因GhOMT1序列的guideRNA(gttccttttagtaaggcata)，合成上下游引物(5’-GATTGN19-3’、3’-CN19CAAA-5’)，使他们退火后能够形带接头的小片段。

AtU6-26SK+：

5’-GATTGN19-3’：5’-GATTGttccttttagtaaggcata-3’；

3’-CN19CAAA-5’：3’-CaaggaaaatcattccgtatCAAA-5’。

上下游引物用水稀释到10M，分别取10ul吹打混匀，在PCR仪程序设置(95℃3min，22℃1min，ramprate0.1℃/s，22℃Hold)，缓慢降温，获得了带有BbsI粘性末端的双链guideRNA。

2)AtU6-26SK+载体BbsI酶切反应

AtU6-26SK+载体BbsI酶切体系

所用酶是NEB BbsI和对应酶切buffer，37℃，恒温水浴8-12h。

3)酶切产物回收：

30ul酶切体系琼脂糖凝胶电泳，分离目的条带，紫外灯照射凝胶挖取的条带，保存到准备好的1.5ml离心管，称重，计量。回收所用琼脂糖凝胶浓度为1.2％。电泳程序：电压100V，45-50min。Queen回收试剂盒进行目的片段琼脂糖凝胶回收回收，分光光度计测得浓度，标记为AtU6 BbsI-备用。

AtU6 BbsI-guideRNA连接反应：

4℃，连接过夜。

4)连接载体克隆验证：37℃热击转化大肠杆菌DH5α菌株扩繁

-80℃取出大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，冰上静置至冻融，将需转化载体加入到50ul感受态中，轻轻吸打混匀，冰上静置20min，同时将水浴锅调至42℃备用，4℃热击90s，快速冰上静置2min，加入解冻好的SOC复苏培养基(20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，溶剂为去离子水，pH7.0)，37℃震荡复苏培养1h。

5)抗性平板筛选目的克隆：

热击转化产物涂抹氨苄抗性平板(LB+Spec 100mg/L+Rif 25mg/L)，37℃暗培养12h，挑取单克隆，LB培养基震荡扩繁4-6h，载体引物PCR扩增检测，初步确定阳克隆，取样送测序公司测序检验，确定目标阳性克隆，菌体扩繁，50％甘油-20℃保存。载体构建guideRNA导入表达载体第一步完成，记为A+X载体(X代表不同的guideRNA)。

AtU6-guideRNA载体阳性克隆筛选PCR扩增体系

PCR程序：95℃4min；95℃30s；57℃1min；32循环；72℃10min；4℃保存。

由于表达载体构建需要pCAMBIA1300载体，以此为介体构建完整的表达载体。需将第一步构建好的A+X载体导入pCAMBIA1300载体：根据特有的酶切位点，选取合适的两个酶切位点：KpnI和SalI，分别对pCAMBIA1300载体和A+X载体进行相同的双酶切反应，获得具有相同粘性末端的酶切产物，以完成两载体的连接反应。

首先是两个载体质粒DNA的准备，分别用对应抗性的LB培养基大量扩繁培养载体菌株，Axygene质粒小提试剂盒质粒小提，标记质粒浓度，同时琼脂糖凝胶实验检测质粒提取质量，并取部分备用，其他-20℃保存。

A+X载体和pCAMBIA1300载体KpnI、SalI双酶切体系

37℃恒温水浴，1h，琼脂糖凝胶回收。

此次双酶切两个载体的目的回收片段分别是：A+载体645bp，pCAMBIA1300取线性质粒大小。在紫外灯照射辅助下挖取目的条带，保存到准备好的1.5ml离心管。同样，回收所用琼脂糖凝胶浓度为1.2％。电泳程序：电压100V，45-50min。

Queen回收试剂盒进行目的片段琼脂糖凝胶回收回收，分光光度计测得浓度，分别标记为A+X载体KpnI SalI双酶切产物和pCAMBIA1300载体KpnI、SalI双酶切产物备用。

6)A+载体KpnI SalI双酶切产物和pCAMBIA1300载体KpnI，SalI双酶切产物连接反应：

A+X载体、pCAMBIA1300载体KpnI，SalI双酶切产物连接体系

4℃，连接过夜。

连接载体克隆验证：37℃热击转化大肠杆菌DH5α菌株扩繁。

从-80℃低温冰箱冰箱取出大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，冰上静置至冻融，将需转化载体加入到50ul感受态中，轻轻吸打混匀，冰上静置20min，同时将水浴锅调至42℃备用，4℃热击90s，快速冰上静置2min，加入解冻好的SOC复苏培养基，37℃震荡复苏培养1h。

抗性平板筛选目的克隆：热击转化产物涂抹卡那抗性平板，37℃，暗培养12h，挑取单克隆，LB培养基震荡扩繁4-6h，载体引物PCR扩增检测，初步确定阳克隆，取样送测序公司测序检验，确定目标阳性克隆，菌体扩繁，50％甘油-20℃保存。载体构建A+X载体连接pCAMBIA1300载体完成，记为A+X-1300载体(X代表不同的guideRNA)。

A+X-1300载体阳性克隆筛选PCR扩增体系

分别用载体特异引物和组合引物检测，退火温度分别是57℃和59℃，延伸时间分别是1min和2min。

7)Cas9蛋白表达载体和pCAMBIA1300—AtU6—载体连接反应：

由于连接反应需要，分别对两个载体双酶切反应：KpnI、EcoRI。两个载体质粒DNA的准备，分别用卡那抗性的LB培养基大量扩繁培养载体菌株，Axygene质粒小提试剂盒质粒小提，标记质粒浓度，同时琼脂糖凝胶实验检测质粒提取质量，并取部分备用，其他-20℃保存。

A+X-1300载体和Cas9载体KpnI、EcoRI双酶切体系

37℃恒温水浴，1h，琼脂糖凝胶回收。

30ul酶切体系琼脂糖凝胶电泳，分离目的条带，紫外灯照射凝胶挖取目的条带，目标条带大小分别为5.8k和原有载体线性大小，保存到准备好的1.5ml离心管，同样，回收所用琼脂糖凝胶浓度为1.2％。电泳程序：电压100V，45-50min。

Queen回收试剂盒进行目的片段琼脂糖凝胶回收回收，分光光度计测得浓度，分别标记为A+X-1300载体KpnI EcoRI双酶切产物和Cas9载体KpnI EcoRI双酶切产物备用。

8)A+X-1300载体KpnI EcoRI双酶切产物和Cas9载体KpnI EcoRI双酶切产物连接反应：

A+X-1300载体、Cas9载体KpnI，SalI双酶切产物连接体系

4℃，连接过夜。

连接载体克隆验证：37℃热击转化大肠杆菌DH5α菌株扩繁

-80℃取出大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，冰上静置至冻融，将需转化载体加入到50ul感受态中，轻轻吸打混匀，冰上静置20min，同时将水浴锅调至42℃备用，4℃热击90s，快速冰上静置2min，加入解冻好的SOC复苏培养基，37℃震荡复苏培养1h。

抗性平板筛选目的克隆：热击转化产物涂抹卡那抗性平板，37℃，暗培养12h，挑取单克隆，LB培养基震荡扩繁4-6h，载体引物PCR扩增检测，初步确定阳克隆，取样送测序公司测序检验。

A+X-1300-C载体阳性克隆筛选PCR扩增体系

确定目标阳性克隆，菌体扩繁，50％甘油-20℃保存。载体构建A+X-1300载体连接Cas9载体完成，记为A+X-1300-C载体(X代表不同的guideRNA)CRISPR/Cas9表达载体构建完成。

9)A+X-1300载体KpnI EcoRI双酶切产物和Cas9载体KpnI EcoRI双酶切产物连接反应，确定目标阳性克隆，菌体扩繁，50％甘油-20℃保存。载体构建A+X-1300载体连接Cas9载体完成，记为A+X-1300-C载体(X代表不同的guiderRNA)CRISPR/Cas9表达载体构建完成(图15)。

2.CRISPR/Cas9表达载体遗传转化棉花胚性愈伤组织

将步骤1构建好的GhOMT1的CRISPR/Cas9载体转到农杆菌LB4404菌株扩大培养，把胚性愈伤组织分别与表达载体放置在基础诱导培养基(MSB5培养基+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L)上，23℃共同培养36-48h。然后用含有头孢霉素(500mg/L)的无菌水清洗胚性愈伤组织。将清洗后的胚性愈伤转移到抗性筛选培养基(MSB5培养基，2,4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L+除草剂BASTA 75mg/L)上筛选转化成功的胚性愈伤组织，阳性克隆的愈伤组织为表面红紫色。继代挑出转化成功的胚性愈伤组织，培养形成胚状体，直到诱导再生植株。再生转基因植株，在自然光照条件下，全株呈紫色、紫红色或红色表型。

序列表

<110> 浙江理工大学

<120> 一种棉花性状的改良方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2470

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

agattaaaaa attaaaaaat tccatgaatt agattaacat tagattcggc cgtttgaaat 60

gcagataagg tctcaaaatt ttggtaaagc gaaacaacca gaaacaggcg ctgagaaaga 120

aaccatgtct caagaagatc aagaggaaga agttgggaaa ctggccgtcc gcctagccaa 180

cgccgtggta cttccaatgg tcttgaaatc agccttggag ctgaacataa ttgacacaat 240

cttagccgct ggtgacggcg cgtttctgtc accttcccag attgcgagtg cccttccttc 300

aaagaatcct gacgcaccag tgctactaga tcgaatgcta cgcctgttgg ccagccattc 360

cattctcaaa tgcgcagtaa aagcaaagga aaaagaagaa attgaaagac tgtacggtgc 420

aggcccacta tgcaagttcc ttgttaagaa tcaagatgga gggtcgattg cacctctcct 480

tttgttgcac catgaccaag tcttcatgca aagctggtac catttaaatg atgctatact 540

agaaggaggg gttcctttta gtaaggcata cgggatgaca gcatttgaat atccaggaac 600

tgatcaacga ttcaatagag tatttaacca ggcaatgtca aatcatactg ctttgataat 660

gaggaagatt gttgatgttt acaaagggtt tgatgggttg aaagtgttgg ttgatgtggg 720

tggtgggatt ggggttgctc tcagttttat tacttcaaag tatcctcaaa tcaagggcat 780

caactttgat ctgcctcatg ttttggctga tgcacccact tattcaggtt ctataccaat 840

cactcccttt tatctcttga acagatttct ctgaaatcta tatgaaatta tgggatactt 900

gttagtccaa tctgatatga gtgtgtgtta atttaaagca ttgccatcgc tgggaaatgc 960

ttttagttgt gctgttttct ctttacatgc cttaacagta agcacttgaa accacaagca 1020

aactagagaa caatatcatt ttctttcttg tttaagtcta tctaattcta tctgctatta 1080

atttatgata aacgaattca tctcaattta tgttctgcag ggtagttggc aaagttgagt 1140

aaacccacat tgctaagaaa tgaacaagtt aaaatattta tacatggtgt tcgtttattg 1200

attttcatgt ctagctcatc taaagaggga gatatatatt tgagatatat atttgaggat 1260

aagcactttg gtttgagttt agtggtgtaa ttattttttt atattataat tattatattc 1320

aggggaaggg aggggcaggg ctctagcctt caaaatggaa aattgctaat ctctcaaaaa 1380

ttataaaatt ttaagttaat atgtggtaaa gttataattt gctccccaaa tgttagaatt 1440

tcaatctaat cctttcaaaa cctatcaaaa tataaacgaa tacagtgata aaattaaatt 1500

ttaactttta tgaaaatata taacttaatt tcaaccactc taaaaaatgt tctaccttta 1560

cacatataat tttaccaaaa gtaattgcat acatgaataa ttacattgcc aaaactgcat 1620

gcatgaataa ttacgttaag gtaatctatt aacagggtta acctttttga aaagatgtga 1680

aataacacat cttttgccga ataaaaagtg tttgttcttg aacagatccc ttttttgtgg 1740

cttataccaa aaaaaaaaaa atacatattg atataccttt tgctactctg ctctattgtt 1800

ttgacttgtt gtatcttaga gggaaactta tagcattaaa gaaagtgatt acgcatcttg 1860

ttctaaattt ttctttctta cctcacatat ttttctaaca atataggtgt tgagcatgtt 1920

ggcggagata tgtttgaaag tgttccaaaa ggtgatgcta ttttcttaaa ggtaagcctt 1980

tatgtcctat agcttggtaa atggagaact ttttttctat tttcttatca taattgatac 2040

atgtagaagt tgtggaatct gtttagctta gtaactttat gaaacttgca gtggatactc 2100

catgattgga gtgatgaaca ttgcttgaag cttctcaaga actgttggga agctctccct 2160

aatggtggga aagtgattat tgtggaatct atcttacccg aggttcccga taccagtgtt 2220

tcttcaaaca ttgtctgtga acaagatctg tttatgttag ctcaaaaccc ggggggcaaa 2280

gagagaaccc taaaggaata tgaggactta gctttaaaaa caggtttctc tgggtgtgaa 2340

gtaatctgct gtgcttataa cagctgggtc atgcaaatgg agaaaagggc aatttattga 2400

agttctattg gaagcttcca tttcctttca tctaccccaa caggaggatt caacataatg 2460

tttacttttt 2470

<210> 2

<211> 1077

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgtctcaag aagatcaaga ggaagaagtt gggaaactgg ccgtccgcct agccaacgcc 60

gtggtacttc caatggtctt gaaatcagcc ttggagctga acataattga cacaatctta 120

gccgctggtg acggcgcgtt tctgtcacct tcccagattg cgagtgccct tccttcaaag 180

aatcctgacg caccagtgct actagatcga atgctacgcc tgttggccag ccattccatt 240

ctcaaatgcg cagtaaaagc aaaggaaaaa gaagaaattg aaagactgta cggtgcaggc 300

ccactatgca agttccttgt taagaatcaa gatggagggt cgattgcacc tctccttttg 360

ttgcaccatg accaagtctt catgcaaagc tggtaccatt taaatgatgc tatactagaa 420

ggaggggttc cttttagtaa ggcatacggg atgacagcat ttgaatatcc aggaactgat 480

caacgattca atagagtatt taaccaggca atgtcaaatc atactgcttt gataatgagg 540

aagattgttg atgtttacaa agggtttgat gggttgaaag tgttggttga tgtgggtggt 600

gggattgggg ttgctctcag ttttattact tcaaagtatc ctcaaatcaa gggcatcaac 660

tttgatctgc ctcatgtttt ggctgatgca cccacttatt caggtgttga gcatgttggc 720

ggagatatgt ttgaaagtgt tccaaaaggt gatgctattt tcttaaagtg gatactccat 780

gattggagtg atgaacattg cttgaagctt ctcaagaact gttgggaagc tctccctaat 840

ggtgggaaag tgattattgt ggaatctatc ttacccgagg ttcccgatac cagtgtttct 900

tcaaacattg tctgtgaaca agatctgttt atgttagctc aaaacccggg gggcaaagag 960

agaaccctaa aggaatatga ggacttagct ttaaaaacag gtttctctgg gtgtgaagta 1020

atctgctgtg cttataacag ctgggtcatg caaatggaga aaagggcaat ttattga 1077

<210> 3

<211> 540

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

tgttatcctt cggttagcta ttcaacacct agatgactaa aaaaacatca tcttaaatag 60

ttggatgact taattgtaat tttttaaaat taaataacta aaataaaaac ttaaatataa 120

ttaaatgact agtaatataa tttactcttt gaaaaaattt attcaaaaaa agtcaaggag 180

agggcaataa acgattatgg gcacaggtaa agcttttagt gctgcaaata gttgagtgac 240

cgagtatttt aattttggtt aaaattaaat taattgatct aattcagtta atcagttggt 300

taataaattt aagttaaaag attttttaaa attttgatta atgatttatt cggtttaaaa 360

ttaaataatt agttgaactt aataaattat attaatatta tatatattag gctattacta 420

gttctgtaaa ttcggttaat aattaatttt ttaaaaataa ttttaattta attattagtt 480

aaaggattaa aaatttgatt aatactaagt caattagatt aactcctcgt ttgaacaccc 540

<210> 4

<211> 358

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Ser Gln Glu Asp Gln Glu Glu Glu Val Gly Lys Leu Ala Val Arg

1 5 10 15

Leu Ala Asn Ala Val Val Leu Pro Met Val Leu Lys Ser Ala Leu Glu

20 25 30

Leu Asn Ile Ile Asp Thr Ile Leu Ala Ala Gly Asp Gly Ala Phe Leu

35 40 45

Ser Pro Ser Gln Ile Ala Ser Ala Leu Pro Ser Lys Asn Pro Asp Ala

50 55 60

Pro Val Leu Leu Asp Arg Met Leu Arg Leu Leu Ala Ser His Ser Ile

65 70 75 80

Leu Lys Cys Ala Val Lys Ala Lys Glu Lys Glu Glu Ile Glu Arg Leu

85 90 95

Tyr Gly Ala Gly Pro Leu Cys Lys Phe Leu Val Lys Asn Gln Asp Gly

100 105 110

Gly Ser Ile Ala Pro Leu Leu Leu Leu His His Asp Gln Val Phe Met

115 120 125

Gln Ser Trp Tyr His Leu Asn Asp Ala Ile Leu Glu Gly Gly Val Pro

130 135 140

Phe Ser Lys Ala Tyr Gly Met Thr Ala Phe Glu Tyr Pro Gly Thr Asp

145 150 155 160

Gln Arg Phe Asn Arg Val Phe Asn Gln Ala Met Ser Asn His Thr Ala

165 170 175

Leu Ile Met Arg Lys Ile Val Asp Val Tyr Lys Gly Phe Asp Gly Leu

180 185 190

Lys Val Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Ile Gly Val Ala Leu Ser Phe

195 200 205

Ile Thr Ser Lys Tyr Pro Gln Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp Leu Pro

210 215 220

His Val Leu Ala Asp Ala Pro Thr Tyr Ser Gly Val Glu His Val Gly

225 230 235 240

Gly Asp Met Phe Glu Ser Val Pro Lys Gly Asp Ala Ile Phe Leu Lys

245 250 255

Trp Ile Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Leu Lys Leu Leu Lys

260 265 270

Asn Cys Trp Glu Ala Leu Pro Asn Gly Gly Lys Val Ile Ile Val Glu

275 280 285

Ser Ile Leu Pro Glu Val Pro Asp Thr Ser Val Ser Ser Asn Ile Val

290 295 300

Cys Glu Gln Asp Leu Phe Met Leu Ala Gln Asn Pro Gly Gly Lys Glu

305 310 315 320

Arg Thr Leu Lys Glu Tyr Glu Asp Leu Ala Leu Lys Thr Gly Phe Ser

325 330 335

Gly Cys Glu Val Ile Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Trp Val Met Gln Met

340 345 350

Glu Lys Arg Ala Ile Tyr

355

Claims

1.一种棉花耐寒和抗衰老性状改良的方法，其特征在于所述方法是抑制或敲除棉花花青素甲基化修饰基因GhOMT1。

2.如权利要求1所述棉花性状改良的方法，其特征在于所述棉花花青素甲基化修饰基因GhOMT1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。