JP2002526080A - サイクリンｄのポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにそれらの使用 - Google Patents

サイクリンｄのポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにそれらの使用

Info

Publication number
JP2002526080A
JP2002526080A JP2000574263A JP2000574263A JP2002526080A JP 2002526080 A JP2002526080 A JP 2002526080A JP 2000574263 A JP2000574263 A JP 2000574263A JP 2000574263 A JP2000574263 A JP 2000574263A JP 2002526080 A JP2002526080 A JP 2002526080A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
cyclin
plant
nucleic acid
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000574263A
Other languages
English (en)
Inventor
キース・エス・ロウ
ユーミン・タウ
ウィリアム・ジェイ・ゴードン−カム
カロリン・エイ・グレゴリー
ジョン・エイ・マケルヴァー
ジョージ・ジェイ・ハースター
Original Assignee
パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド filed Critical パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド
Publication of JP2002526080A publication Critical patent/JP2002526080A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞周期の制御に伴われる単離したポリヌクレオチドおよびこれによりコードされるタンパク質を提供する。本発明はまた、組換え発現カセット、宿主細胞、トランスジェニック植物および抗体組成物を提供する。本発明は、細胞周期タンパク質含量および／または植物の組成を変更することに関連する方法および組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的に植物の分子生物学に関する。詳細には、植物においてその
発現を調節する核酸およびその方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
細胞分裂は、植物の発生の全ての相において極めて重要な役割を果たしている
。環境変化に応答する器官形成および増殖の連続は、分裂組織において（および
側根の形成など、新たな分裂組織を形成する能力を有する細胞において）細胞分
裂活性の正確な空間的、時間的および発生学的制御を必要とする。細胞分裂のそ
のような制御は、組織自体、例えば葉の膨張、２次成長および核内倍加において
も（即ち分裂組織自体から分かれるのに）重要である。
【０００３】 複合ネットワークは、真核生物において細胞分化を制御している。制御経路は
、環境条件、栄養利用性、増殖因子またはホルモンなどのマイトジェンシグナル
または無精から有精への移行などの発生学的合図を伝達している。最終的には、
これらの制御経路は、細胞分裂のタイミング、頻度（速度）、水準および位置を
調節している。
【０００４】 細胞周期の調節の基本的機構は、真核生物において保存されている。触媒的タ
ンパク質であるセリン／トレオニンキナーゼおよび活性化サイクリンサブユニッ
トは細胞周期の進行を調節している。タンパク質キナーゼは一般的には、サイク
リン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と称され、その活性はリン酸化および脱リン酸化
現象並びにサイクリンと呼ばれる制御サブユニットとの結合により調節されてい
る。ＣＤＫはその活性化のためにサイクリンとの結合を必要とし、活性化のタイ
ミングはサイクリンの発現に大きく依存している。ＣＤＫは、別個の細胞周期の
転移を制御しているセリン／トレオニンタンパク質キナーゼのファミリーである
。
【０００５】 真核生物のゲノムは一般的には、複数のサイクリンおよびＣＤＫの遺伝子をコ
ードしている。高等な真核生物において、ＣＤＫファミリーの異なるメンバーは
細胞周期の異なる段階において作用している。サイクリン遺伝子は、細胞周期の
その出現のタイミングに従って分類される。サイクリンおよびＣＤＫサブユニッ
トに加えて、ＣＤＫはしばしば局在化、基質特異性または活性を変化させる他の
タンパク質と物理的に結合する。そのようなＣＤＫ相互作用タンパク質の例は、
ＣＤＫ阻害剤、網膜芽細胞腫−結合タンパク質（Ｒｂ）ファミリーの一員および
構成キナーゼ[Constitutive Kinase]サブユニット（ＣＫＳ）である。
【０００６】 複合体のタンパク質キナーゼの活性は、特定のチェックポイントにおいてフィ
ードバックにより制御されている。そのようなチェックポイントにおいて、ＣＤ
Ｋ活性は、次への進行のために制限される。フィードバック調節ネットワークが
チェックポイントの完了を感知すると、ＣＤＫは活性化され、そして細胞が次の
チェックポイントに移行する。ＣＤＫ活性の変化は、細胞周期因子の可逆性リン
酸化、複合体の細胞内局在の変化および制限成分の分解を伴う、複数のレベルに
おいて制御されている（P.W. Doerner, Cell Cycle Regulation in Plants, Pla
nt Physiol. (1994) 106:823-827）。
【０００７】 植物は、他の真核生物と区別される、独特の発生学的特徴を有している。植物
細胞は移動せず、故に細胞分裂、伸張およびプログラム細胞死が形態形成を決定
している。器官は増殖組織と称される特定化領域において植物の全生涯を通じて
形成される。また、多くの分化した細胞は、脱分化および細胞周期への再加入の
両方の潜在能力を有している。核の増加を伴うが、細胞質分裂を伴わない過程で
ある核内倍加を行う植物細胞のタイプの多くの例がある。植物細胞周期の制御遺
伝子の研究は、これら独特の現象を理解するのに寄与すると期待されている（O.
Shaul等., Regulation of Cell Division in Arabidopsis, Critical Reviews
in Plant Sciences, 15(2):97-112 (1996)）。
【０００８】 細胞が分裂して形質転換を起こすことを示唆する証拠がある。また、分裂細胞
が一時的にトランス遺伝子を発現する細胞の画分にのみ示されることが観察され
ている。さらに、非植物システム（粒子ガンまたは他の物理的手段により導入さ
れるＤＮＡに類似する）における損傷したＤＮＡの存在が急激に細胞周期を停止
させるということが報告されている（W. Siede, Cell cycle arrest in respons
e to DNA damage: lessons from yeast, Mutation Res. 337(2): 73-84）。故に
、形質転換を至適化するために、分裂を行う細胞の数を増加させる方法を提供す
ることが所望されている。
【０００９】 高等な真核生物における細胞分裂は、細胞が周期のＭ期またはＳ期の何れかに
早く移行することを抑制するという細胞周期における２つの主要なチェックポイ
ントにより調節されている。酵母およびほ乳類の系における証拠は、鍵となる細
胞周期活性化遺伝子の過剰発現が細胞分裂または非分裂細胞にける細胞分裂を引
き起こしうるまたは既に分裂した細胞の分裂を刺激しうる（即ち細胞周期の継続
時間を減少させ、細胞のサイズを減少させる）ことを繰り返し示している。過剰
発現が細胞分裂を刺激することが示されている遺伝子の例には、サイクリン（例
えば、Doerner, P.等, Nature (1996) 380:520-423; Wang, T.C.等, Nature (19
94) 369:669-671; Quelle D. E.等, Genes Dev. (1993) 7:1559-1571を参照）、
Ｅ２Ｆ転写因子（例えば、を参照）、ｃｄｃ２５（例えば、Bell, M.H.等, (199
3) Plant Molecular Biology 23:445-451; Draetta, D.等, (1996) BBA 1332:53
-63を参照）およびｍｄｍ２（例えば、Teoh, G.等, (1997) Blood 90:1982-1992
を参照）が含まれる。逆に、他の遺伝子産物は、細胞周期の陰性制御および／ま
たはチェックポイント調節、効果的阻害または進行の遅延が加わることが見出さ
れている（MacLachlan, T.K. 等, (1995) Critical Rev. Eukaroytic Gene Expr
ession 5(2):127-156を参照）。
【００１０】 トウモロコシにおける現在の遺伝子工学的方法は、新たなＤＮＡの受容体とし
ての特別な細胞タイプを必要とする。これらの細胞は、比較的未分化の盛んに増
殖するカルス細胞または未成熟の（カルスを生じる）胚の胚盤表面において見出
される。現在使用されているデリバリー法とは関係なく、ＤＮＡは完全に数千個
の細胞に導入され、形質転換体は一過性発現細胞に比例して１０?5の頻度で得ら
れる。この問題を悪化させるのは、トラウマＤＮＡの導入を伴うトラウマが受容
細胞の細胞周期を停止させることであり、蓄積された証拠はこれらの細胞の多く
がアポトーシスまたはプログラム細胞死することを示唆している。
【００１１】 １９５０年から１９８０年の間には、トウモロコシに増産が世界的に小麦およ
びイネを凌いだ。１９８０年代の初期から中期において（環境的および政治的要
因により）一時的に降下したものの、世界のトウモロコシ生産は１９５０年には
１億４５００万トンであったのが１９９０年までには５億トン近くまで確実に増
加した。収量および収穫領域における増加は世界的生産を促進するのに大きく寄
与し；収量は先進工業国において主要な役割を果たし、領域の拡大は発展途上国
において主要な役割を果たした。次の１０年間では、世界のトウモロコシに対す
る要求を満たすには現在の生産量をさらに２０％以上にすることが求められると
予測されている（Dowswell, C.R., Paliwal, R.L., Cantrell, R.P. 1996. Maiz
e in the Third World, Westview Press, Boulder, CO）。
【００１２】 トウモロコシ生産性と最も関連する要素は、動物飼料（貯蔵生牧草、飼料また
はまぐさの形態）のための顆粒収率および植物全体の収穫量である。故に、農作
物の最終的用途に依存する、栄養器官または生殖器官の相対的な成長が所望され
る。植物全体または穂を収穫するにしても、全体的収率は生長力および生育速度
に大きく依存する。現代のトウモロコシハイブリッドにおいて、植物全体の生長
力および収率における雑種強勢の衝撃が明白に示された（Duvick, D.N. 1984.
In: Genetic contributions to yield gains in five major crop plants. W.R
. Fehr, ed. CSSA, Madison, WI）。１９３０年代は組合せにおいて近交配を同
定することにより選択的に交配させていたため、トウモロコシの繁殖者は、いず
れの両親より生長力の良いハイブリッドが産生された。驚くべきことに、文献に
おいていくつかの興味深い観察があるが、何故ハイブリッドがその親の近交配よ
りも遙かに大きいかについて全く知られていない。代謝の研究において、雑種強
勢（いずれの両親よりも増加している）では根においてＰの取込みなどの生理的
特性が観察されていた（BaligerとBarber, 1979; NielsenとBarber, 1978）が、
しかし多くの酵素的特性について、ハイブリッドはしばしば近交配した親の中間
値である（Hageman, R.H., Leng, E.R., Dudley, J.W. 1967. Adv. Agron. 19:
45-86; Chevalier, P., Schrader, L.E. 1977. Crop Sci. 17:897-901; Schra
der, L.E. 1974. Crop Sci. 14:201-205; Schrader, L.E. 1985. PP 79-89.
In: Exploitation of physiological and genetic variability to enhance cr
op productivity. Harper, J.E. ed. Am. Soc. Plant Physiol. Rockville, M
D, Schrader, L.E., Cataldo, D.A., Peterson, D.M., Vogelzang, R.D. 1974.
Plant Physiol. 32:337-341）。
【００１３】 解剖学的データはほとんど混同していない。より早い時期の刊行物からのデー
タを要約すると、Kiesselbachは、その近交配の両親よりハイブリッドの生長力
が約１０％増加したのは細胞の増加が原因であり、９０％が増加した細胞数によ
るものであると述べている（Kiesselbach, T.A. 1922, 1949. The Structure a
nd Reproduction of Corn, Nebraska Agric. Exp. Stn. Res. Bull. 161.）。ト
ウモロコシの生長力の増加に寄与する細胞分裂の促進の証拠は問題にされていな
いままである。近年、これは、ArabidopsisにおけるサイクリンＢの過剰発現が
根における生物量を増加させ、根の細胞が小さくなる（細胞分裂の促進を示唆）
ことが示されたが、植物全体の形態学はまだ混乱している（Doerner等, 1996）
。同様に、トウモロコシにおけるトウモロコシCycD遺伝子の発現は生育および生
物量の蓄積を促進する。
【００１４】 他のより特別な用途が、全植物レベルでこれらの遺伝子ついて存在する。核内
倍加が植物内の多くの細胞タイプにおいて生じるが、これは特にトウモロコシの
主要な種子貯蔵組織である内胚乳において優勢である。内胚乳特異的プロモータ
ーの指示下において、CycD遺伝子の発現（および有糸分裂を阻害する遺伝子とCy
cDの可能な同時発現）はさらに核内倍加の過程を刺激する。
【００１５】
【発明の要約】
一般的に、本発明の課題は細胞周期の調節に関連する核酸およびタンパク質を
提供することである。 本発明の別の課題は、細胞周期の制御に伴われる他の相互作用タンパク質を同
定するために使用しうる核酸およびタンパク質を提供することである。 本発明の別の課題は、本発明のタンパク質の抗原性断片を提供することである
。 本発明の別の課題は、本発明の核酸を含むトランスジェニック植物を提供する
ことである。 本発明の別の課題は、トランスジェニック植物において本発明の核酸の発煙を
調節するための方法を提供することである。 本発明の別の課題は、細胞分裂する細胞の数を増加させる方法を提供すること
である。 本発明の別の課題は、収穫率を増加させる方法を提供することである。 本発明の別の課題は、形質転換の頻度を向上させる方法を提供することである
。 本発明の別の課題は、CycDタンパク質発現を調節することからなる、植物に陽
性成長効果を付与する方法を提供することである。
【００１６】 本発明の別の課題は、細胞の増殖を調節する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、細胞周期を調節する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、植物の高さまたは大きさを調節する方法を提供すること
である。 本発明の別の課題は、陽性増殖作用を付与する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、増殖速度を増加させる方法を提供することである。 本発明の別の課題は、器官成長、例えば種子、根、芽、穂、房、茎、花粉、雄
しべの成長を促進または阻害する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、器官の除去を生じさせる方法を提供することである。 本発明の別の課題は、単為結実を生じさせる方法を提供することである。 本発明の別の課題は、雄性不稔植物を作成する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、胚性応答、即ち大きさまたは成長速度を促進する方法を
提供することである。 本発明の別の課題は、カルス誘導を増進する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、陽性選択の方法を提供することである。 本発明の別の課題は、植物再生を増進する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、細胞が停止する、即ち細胞周期のＧ１期またはＧ０期に
おいて停止する時間の比率を変更する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、細胞が特定の細胞周期にとどまる時間を変更する方法を
提供することである。
【００１７】 本発明の別の課題は、細胞における渇水、熱または冷たさなどの環境ストレス
に対する応答を改善する方法を提供することである。 本発明の別の課題は、植物当たりの鞘の数を増加させる方法を提供することで
ある。 本発明の別の課題は、鞘または穂当たりの種子の数を増加させる方法を提供す
ることである。 本発明の別の課題は、種子の発生における遅延時間を変更する方法を提供する
ことである。 本発明の別の課題は、ホルモン非依存性の細胞増殖を付与する方法を提供する
ことである。
【００１８】 本発明の別の課題は、生物反応器における細胞増殖速度を増加させる方法を提
供することである。 従って、１つの態様において、本発明は、 （ａ） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または21に示されるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ） SEQ ID NO: 3-10, 15-20 または23-30に示されるプライマーを用いて単
子葉類の核酸ライブラリーから増幅されるポリヌクレオチド； （ｃ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １、 １１、 13、 又は 2１に示される2０個の連続す
る延期を有するポリヌクレオチド； （ｄ） 単子葉類のサイクリンＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド； （ｅ） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または 21に示されるコーディング領域全体と
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ここで同一性％
は５０のギャップクリエーションペナルティおよび３のギャップエクステンショ
ンペナルティを使用するＧＣＧ／ベストフィットプログラムを使用して決定され
る； （ｆ） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または 21により特徴付けられる核酸とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ここでそ
の条件は６０〜６５℃で０.１×ＳＳＣで洗浄することを包含する； （ｇ） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または 21に示される配列により特徴付けられ
るポリヌクレオチド； （ｈ） SEQ ID NO: 3-10, 15-20 または 23-30に示されるプライマーを用いて
トウモロコシ（Zea mays）の核酸ライブラリーから増幅される単離した核酸 （ｉ） （ａ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド；およ
び （ｊ） ＡＴＣＣに受託番号98847 または 98848にて寄託された配列を有するポ
リヌクレオチド からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたは核酸を含む単離した核酸に関
する。
【００１９】 別の態様において、本発明は、プロモーターに作動的に連結された請求項１に
記載の核酸を含む組換え発現カセットに関する。
【００２０】 いくつかの態様において、核酸はセンスまたはアンチセンスの向きにてプロモ
ーターに作動的に連結されている。
【００２１】 別の態様において、本発明は上述の組換え発現カセットで形質転換した宿主細
胞に向けられる。
【００２２】 別の態様において、本発明は単離した核酸によりコードされる少なくとも１０
個の連続したアミノ酸のペプチドを含む、単離したタンパク質に関する。いくつ
かの態様において、ポリペプチドはSEQ ID NO: 2, 12, 14, および 22からなる
群から選択される配列を有する。
【００２３】 別の態様において、本発明はSEQ ID NOS: 1, 11, 13, および21からなる群か
ら選択される核酸またはその相補的な核酸とストリンジェントな条件下で選択的
にハイブリダイズする、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド
を含む単離した核酸に関する。いくつかの態様において単離した核酸は作動的に
プロモーターに連結されている。 また別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチ
ドがSEQ ID NO: 1, 11, 13, および 21 からなる群から選択される核酸またはそ
の相補的な核酸の同一の長さに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する単
離した核酸に関する。
【００２４】 別の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 3-10, 15-20 および23-30に示され
るプライマーまたはこれに相補的なプライマーからなる群から選択されるプライ
マーを用いてトウモロコシ（Zea mays）の核酸ライブラリーから増幅される核酸
の配列を有するポリヌクレオチドをふくむ単離した核酸に関する。いくつかの態
様において、核酸ライブラリーはｃＤＮＡライブラリーである。 別の態様において、本発明は、上述のライブラリーから増幅される核酸を含む
組換え発現カセットに関し、ここで核酸はプロモーターに作動的に連結されてい
る。
【００２５】 いくつかの態様において、本発明はこの組換え発現カセットで形質転換した宿
主細胞に関する。 いくつかの態様において、本発明はこの宿主細胞から産生される本発明のタン
パク質に関する。
【００２６】 別の態様において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む単離した核酸に向けられるものであり、ここで（ａ）ポリペプチドは、SEQ
ID NO: 2, 12, 14, および 22からなる群から選択される第１のポリペプチドか
らの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含み；（ｂ）ポリペプチドは、
第１のポリペプチドと完全に免疫吸着する第１のポリペプチドに対して生じた抗
血清とは結合せず；そして（ｃ）ポリペプチドは第１のポリペプチドの１０％以
内の非グリコシル化形態における分子量を有する。
【００２７】 さらに別の態様において、本発明は、本発明の未単離のポリヌクレオチドと作
動的に連結された異質性プロモーターに関し、ポリペプチドは核酸ライブラリー
から増幅される核酸によりコードされる。 さらに別の態様において、本発明は、本発明の任意の単離した核酸と作動的に
連結された植物プロモーターを含む組換え発現カセットを含有するトランスジェ
ニック植物に関する。本発明はまた、トランスジェニック植物由来のトランスジ
ェニック種子を提供する。
【００２８】 別の態様において、本発明は、（ａ）プロモーターに作動的に連結された本発
明のポリヌクレオチドを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換し；（ｂ
）植物増殖条件下にて植物細胞を増殖させ；そして（ｃ）植物において遺伝子の
発現を調節するのに十分な時間、ポリヌクレオチドの発現を誘導する段階からな
る、植物において本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する方法
に関する。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現は、対照の未形質転換
植物と比較して増加または減少させることができる。
【００２９】 本発明の別の態様において、単離したタンパク質は、 (ａ) SEQ ID NO: 2, 12, 14, または 22に示されるアミノ酸の少なくとも２５
連続したアミノ酸を含むポリペプチド； (ｂ) 単子葉類のサイクリンＤタンパク質であるポリペプチド； (ｃ) SEQ ID NO: 2, 12, 14, または 22に示される配列と少なくとも６５％の
配列同一性を含むポリペプチドであって、ここで配列同一性（％）はデフォルト
パラメータを使用するＧＡＰ１０により決定されるものである； (ｄ) 請求項１に記載の核酸によりコードされるポリペプチド；および (ｅ) SEQ ID NO: 2, 12, 14, または22により特徴付けられるポリペプチド からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００３０】定義 単位、接頭辞および記号は、それらのSIで受容された形態で表示できる。特記
しない限り、核酸は左から右へ５'から３'の配置で書かれている。アミノ酸配列
は、カルボキシ配置に対してアミノがそれぞれ左から右へ書かれている。数の範
囲はその範囲を定義している数を含む。アミノ酸はここでは、それらの普通に知
られた３文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによ
り推奨された１文字記号のいずれか一方によって表すことができる。ヌクレオチ
ドも同様に、それらの普通に受容されている単一文字コードで表すことができる
。下記に定義する用語は、全体として本明細書への参照によりさらに十分に定義
される。
【００３１】 「増幅された」は、少なくとも一つの核酸配列を鋳型として用いた、核酸配列
の多コピーまたは核酸配列に相補的である多コピーの構築物を意味する。増幅系
は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR) 系、結合鎖反応(LCR)系、核酸配列をベースとす
る増幅(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario)、Ｑ−ベータレプリカーゼ系、
転写をベースとする増幅系(TAS)および鎖置換増幅(SDA)を包含する。例えば Dia
gnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persi
ng et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, DC (1993)
を参照されたい。増幅生成物はアンプリコン（amplicon）と称される。
【００３２】 「抗体」の用語は、抗体の抗原結合形態（例えばFab, F(ab)2）を意味する。
「抗体」の用語は、しばしば、分析物（抗原）を結合し、認識する、１個または
複数個の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされたポリペプチドまたは
その断片を意味する。しかし、種々の抗体断片は無傷抗体の消化によって定義す
ることができ、当業者ならば、そのような断片が、化学的に、または組換えＤＮ
Ａ手法を用いることによるかのいずれかによって、新たに合成できることが分か
るであろう。すなわち、ここで用いる、抗体の用語はまた、例えば単一鎖Ｆｖ、
キメラ抗体（すなわち、相異なる種からの一定のないし可変性の領域からなる）
、ヒト化された抗体（すなわち、非ヒト源からの相補性決定領域（ＣＤＲ）から
なる）および異種接合抗体（例えば二重特異性抗体）のような抗体断片をも包含
する。
【００３３】 「抗原」の用語は、それに対して抗体が発生され、および／またはその抗体が
特異的に免疫反応性である物質を意味する。抗原内の特異的な免疫反応性部位は
、エピトープまたは抗原決定基として知られている。これらのエピトープは、ポ
リマー組成物中のモノマーの線状配列、例えばタンパク質中のアミノ酸、である
か、またはより複雑な二次元または三次元構造から成ることができる。当業者な
らば、全ての免疫原（すなわち、免疫応答を引き出すことができる物質）が抗原
であることが分かるであろう。しかし、ハプテンのようなある種の抗原は、免疫
原ではないが、しかしキャリア分子に結合させることにより免疫原にすることが
できる。特定の抗原と免疫学的に反応する抗体は、生体内で産生され得るか、ま
たは例えばファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの
選択のような組換え手法により産生され得る。例えばHuse et al., Science 246
: 1275-1281(1989)およびWard, et al., Nature 341: 544-546(1989)およびVaug
han et al., Nature BIotech. 14: 309-314(1996)を参照されたい。
【００３４】 本明細書中で使用する「アンチセンス方向付け」は、アンチセンス鎖が転写さ
れる方向付けでプロモーターに操作可能に連結する複式ポリヌクレオチド配列を
意味する。このアンチセンス鎖は、内生の転写生成物に十分相補的であるのでそ
の内生転写生成物の翻訳がしばしば阻止される。
【００３５】 本明細書中で使用する「染色体領域」は、それが含むＤＮＡの線状セグメント
と比べることにより測定され得る染色体の長さに関する。この染色体領域は、２
種の独特なＤＮＡ配列、すなわちマーカーと比べることにより定義できる。
【００３６】 「保存的に修飾された変異型」の用語は、アミノ酸と核酸の両配列に適用され
る。特定のアミノ酸配列に関して、保存的に修飾された変異型はアミノ酸配列の
同一または保存的に修飾された変異型をコードする核酸を意味する。遺伝コード
の同義性のために、機能的に同一の核酸の多くはいずれか所定のたんぱく質をコ
ードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ
酸のアラニンをコードする。すなわち、アラニンがあるコドンにより特異化され
るいずれもの位置において、そのコドンはそのコード化されるポリペプチドを変
更せずに記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸
変異は、“沈黙変異（silent variations）”であり、保存的に修飾された変異
の１種を示す。ポリペプチドをコードするここでの全ての核酸配列はまた、核酸
のあらゆる可能な沈黙変異を記載する。当業者ならば核酸中のそれぞれのコドン
(ＡＵＧを除く。それは通常、メチオニンのただ一つのコドンである)が、修飾さ
れて機能的に同一の分子を生成することが分かるであろう。したがって、本発明
のポリペプチドをコードする核酸の各沈黙変異は、それぞれの記載されたポリペ
プチド配列中に内在し、参照によりここに組み込まれる。
【００３７】 アミノ酸配列について、当業者ならばコードされる配列において単一のアミノ
酸または複数のアミノ酸の小さな割合を変更し、加えまたは削除するような核酸
、ペプチド、ポリペプチドまたはたんぱく質の配列へのそれぞれの置換、削除ま
たは付加は、その変更が化学的類似アミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす場合
に“保存的に修飾された変異型”になることが分かるであろう。すなわち、１〜
１５からなる整数の郡より選択されるいずれかの数のアミノ酸残基をそのように
変更させることができる。すなわち、例えば１、２、３、４、５、７または１０
個の変更をなすことができる。保存的に修飾された変異型は典型的には、それら
が誘導される未修飾ポリペプチド配列と同様の生物学的活性を提供する。例えば
、基質特異性、酵素活性またはリガンド／レセプター結合は、一般的に、それの
天然基質に関して天然たんぱく質の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％
、７０％、８０％または９０％、好ましくは６０〜９０％である。機能的に同様
のアミノ酸を提供する保存的置換表は、本技術分野でよく知られている。
【００３８】 互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する６つ群は下記のとおりで
ある： １）アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T); ２）アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E); ３) アスパラギン(N)、グルタミン(Q); ４) アルギニン(R)、リジン(K); ５）イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V); および ６) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【００３９】 Creighton (1984) Proteins W.H. Freeman and Companyも参照されたい。
【００４０】 特異的核酸に関する「コードするまたはコードされた」は、特異的たんぱく質
への翻訳のための情報を包含することを意味する。たんぱく質をコードする核酸
は、その核酸の翻訳された領域内に翻訳されていない配列（例えばイントロン）
を含有することがあるか、またはそのような翻訳されていない介在配列（例えば
ｃＤＮＡ中のような）を欠如することもある。たんぱく質がコードされる情報は
、コドンの使用により特異化される。典型的には、アミノ酸配列は"普遍の"遺伝
コードを用いて核酸によりコードされる。しかし、ある種の植物、動物および真
菌のミトコンドリア、細菌Mycoplasma capricolum (Proc. Natl. Acad.Sci. (US
A), 82: 2306-2309 (1985))または繊毛虫Macronucleusに存在するような普遍コ
ードの変異型は、その核酸がこれらの生物を用いて発現する場合には使用しても
よい。
【００４１】 核酸を合成的に製造するかまたは変更する場合には、その核酸を発現すべき意
図された宿主の既知コドンの選択が、有利であることがある。例えば、本発明の
核酸配列は単子葉および双子葉の両植物種に発現されることがあるけれども、単
子葉植物または双子葉植物の特異的コドンの選択およびＧＣ含量の選択が異なる
ことが分かっているので、それらの選択を考慮するように配列を修飾することが
できる(Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)参照)。すなわち
、特定のアミノ酸のためのより好ましいトウモロコシコドンは、トウモロコシ由
来の既知遺伝子配列から誘導されることがある。トウモロコシ植物由来の２０個
の遺伝子用のトウモロコシコドン使用法は上記引用のMurray等の文献の表４に掲
げられている。
【００４２】 特異的なポリヌクレオチドまたはそのコードされたタンパク質に関してここで
用いる「全長配列」は、特異的なタンパク質の天然の（非合成の）、内生の、触
媒的に活性な形態の完全なアミノ酸配列を有することを意味する。全長配列は、
特異的な核酸またはタンパク質の天然の（非合成の）、内生細胞形態である対照
に関してサイズ比較を行うことにより決定することができる。配列が全長である
かどうかを決定する方法は、ノーザンブロットまたはウエスタンブロット、プラ
イマー拡張、Ｓ１保護、およびリボヌクレアーゼ保護のような例示的技術を包含
するこの技術において十分知られている。例えば、Plant Molecular Biology: A
Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin(1997)を参照され
たい。知られた全長の同質（オーソログおよび／またはパラログの）配列もまた
、本発明の全長配列を同定するのに使用することができる。さらに、コンセンサ
ス塩基配列は典型的には、全長としてのポリヌクレオチドの同定において、mRNA
助剤の５'および３'の翻訳されていない領域に存在する。例えば、コンセンサス
配列ＡＮＮＮＮＡＵＧＧ（ここで下線を引いたコドンは、Ｎ−末端メチオニンを
示す）は、そのポリヌクレオチドが完全な５'末端を有するかどうかを決定する
のを促進する。３'末端でのコンセンサス配列、例えばポリアデニル化配列は、
そのポリヌクレオチドが完全な３'末端を有するかどうかを決定するのを促進す
る。
【００４３】 ここで用いる核酸に関する「異種の（heterologous）」は、異質種から生ずる
核酸であるか、または同一種由来ならば、ヒトによる故意の介在により構成およ
び／またはゲノム座が天然型から実質的に修飾されている核酸である。例えば、
異質構造遺伝子に操作可能に連結されるプロモーターは、その構造遺伝子が誘導
されたものとは異なる種から由来するか、または同一種由来ならば、構成および
／またはゲノム座の一方または両方がそれらの原型から実質的に修飾されている
。異種たんぱく質は異質種から生じることがあるか、または同一種由来ならば、
ヒトによる故意の介在によりその原型から実質的に修飾されている。
【００４４】 「宿主細胞」はベクターを含有し、その発現ベクターの複製および／または発
現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は原核生物例えばE.coliであるか、また
は真核生物例えば酵母、昆虫、植物、両生類または哺乳類の細胞であることがで
きる。宿主細胞は単子葉または双子葉植物の細胞であるのが好ましい。特に好ま
しい単子葉宿主細胞はトウモロコシ宿主細胞である。
【００４５】 「ハイブリダイゼーション複合体」の用語は、互いに選択的にハイブリダイズ
された２種の一本鎖核酸配列により形成された二重らせん核酸構造を意味する。
【００４６】 「免疫学的に反応性の条件」または「免疫反応性条件」は、特定のエピトープ
に対して産生する抗体を、その特定のエピトープを含む反応混合物において実質
的に全ての他のエピトープに抗体が結合するよりも、検出可能な大きな程度（例
えば、バックグランドの少なくとも２倍）にまで、そのエピトープに結合させる
条件を意味する。免疫学的に反応性の条件は、抗体結合反応のフォーマットによ
るが、典型的には免疫検定プロトコルで使用する条件である。免疫検定のフォー
マットおよび条件については、Harlow および Lane, Antibodies, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(1988)を参照されたい。
【００４７】 細胞中への核酸の挿入に関する「導入された（introduced）」の用語は、“ト
ランスフェクション”または“形質転換”または“形質導入”を意味し、核酸が
細胞のゲノム（例えば染色体、プラスミドまたはミトコンドリアDNA）中に混入
し、自立性レプリコンに変換されるか、または一時的に発現され得る（例えばト
ランスフェクションされたｍＲＮＡ）真核生物または原核生物中へのその核酸の
組み入れを意味する。
【００４８】 「単離された」の用語は、核酸またはたんぱく質のような物質に関するもので
あって、その物質は、（１）天然に生ずる環境の下で見出されるように、通常は
それを伴うかまたはそれと相互作用するような諸成分を実質的または本質的に含
有しない。その単離された物質は、場合により、それの自然環境中の物質に関し
ては見出されない物質を含有し、または（２）物質が自然環境にある場合には、
その物質は、組成物に対してヒトが計画的に介在することによって、合成的に（
非天然的に）変更され、および／またはその環境中に見出される物質に対して在
来のものではない細胞（例えばゲノムまたは亜細胞の細胞小器官）中にある遺伝
子座に置かれる。合成物質を得るための変更は、その天然状態内のまたはその状
態から除去された物質について遂行され得る。例えば、天然に生ずる核酸は、そ
れが発生する細胞内で実施される非天然の、合成（すなわち“ヒトが創製する”
）方法により、もしそれが変更されるならば、またはもしそれが変更されたＤＮ
Ａから転写されるならば、単離される核酸になる。例えば、Compounds and Meth
ods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, イネ国特許
No. 5,565, 350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cell
s; Zarling et al., PCT／US93／03868を参照されたい。同様に、天然に生ずる
核酸（例えばプロモーター）は、それが非天然の手法により、その核酸に対して
無傷でないゲノムの遺伝子座に導入されるならば、単離されるようになる。 こ
こで定義される“単離される”核酸はまた、“異種核酸”をも意味する。
【００４９】 特記しない限り、「細胞周期核酸」の用語は、本発明の核酸であって、細胞周
期ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（“細胞周期ポリヌクレオチド”
）を含有する核酸を意味する。「細胞周期遺伝子」は、全長の細胞周期ポリヌク
レオチドの非相同ゲノム形態を意味する。
【００５０】 ここで用いる特定のマーカーについての「マーカーにより定義され、ないしマ
ーカーを包含する染色体領域内で局在化される」は、記載のマーカーにより範囲
を定められ、ないし該マーカーを包含する染色体の隣接する長さに関する。
【００５１】 ここで用いる「マーカー」は、染色体の独特の位置を同定するのに役立つ染色
体上の遺伝子座に関する。「多形マーカー」は、種々の形態のマーカーが、相同
対で存在する場合に、その対の染色体のそれぞれの伝達を続けさせることを可能
にするような多形態（対立遺伝子）で現れるマーカーを意味する。遺伝子型は、
１個または複数個のマーカーを使用することにより限定することができる。
【００５２】 ここで用いる「核酸」は、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかのデオキシリ
ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味し、そして別に限定さ
れないならば、天然ヌクレオチドの本質的性質を有する既知の類似体も包含し、
そこではそれらは天然産ヌクレオチド（例えばペプチド核酸）と同様の手法でハ
イブリダイズして一本鎖核酸になる。
【００５３】 「核酸ライブラリー」は、特定の生物のゲノムが転写された完全なフラクショ
ンを含有し、そして実質的に表現する単離されたＤＮＡまたはＲＮＡの分子の収
集を意味する。例えばゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーのような
典型的な核酸ライブラリーの構築は、標準的な分子生物学参考書例えばBerger a
nd Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology,
Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al.
, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989); and C
urrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Curren
t Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.
and John Wiley & Sons, Inc. (1994 Supplement)に教示されている。
【００５４】 本明細書中で用いる「操作可能に連結された（operably linked）」は、 第一
配列例えばプロモーターと第二配列との機能的連結に関し、そこではそのプロモ
ーター配列が第二配列に対応するＤＮＡの転写を開始しそして仲介する。一般的
に、"操作可能に連結された"は、連結されている核酸配列が隣接しており、そし
て二つのタンパク質コード領域を一緒にする必要がある場合には、隣接しており
かつ同一のリーディングフレーム中にあることを意味する。
【００５５】 本明細書中で用いる「植物」の用語は、植物全体、植物器官（例えば葉、幹、
根など）、種子および植物細胞およびその子孫を包含する。ここで使用される、
植物細胞は、限定なしに、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、
葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を包含する。本発明の方法で
使用され得る植物は、一般に形質転換技術に従う高度な植物と同じように広く、
単子葉および双子葉植物の両方を含む。特に好ましい植物はトウモロコシである
。
【００５６】 本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボポリヌクレオチド
、リボポリヌクレオチド、またはその類似体を含む。その類似体は天然のリボヌ
クレオチドの本質的な性質を有しており、天然に生じるヌクレオチドと同一の仕
方で核酸とハイブリダイズする。ポリヌクレオチドは、天然のまたは外来の構造
遺伝子または調節遺伝子の全長またはサブ配列とすることができる。他に指示が
無ければ、その用語は、それの相補配列と同様に特定された配列をも含む。故に
、安定性または他の理由で修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡ
は、本明細書では「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンのような特別
な塩基またはトリチル化塩基のような修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ
は、該用語がここで使用されているように、ポリヌクレオチドである。非常に多
くの修飾がＤＮＡやＲＮＡになされ、それは当該技術分野でよく知られた多くの
有益な目的に役立っている。用語ポリヌクレオチドは、単一および複合細胞を包
含する、ウイルスや細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態と同様に、
ポリヌクレオチドの化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態を包含
する。
【００５７】 「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の用語は、アミノ酸残
基のポリマーを称するのに互換的に使用されている。この用語は、天然アミノ酸
ポリマーと、１又はそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学
的な類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。天然産アミノ酸のこのような
類似体の本質的な性質は、タンパク質中に混入されると、そのタンパク質が、完
全に天然産アミノ酸からなることを除けば同一であるタンパク質に対して引き出
される抗体に特異的に反応することである。「ポリペプチド」、「ペプチド」お
よび「タンパク質」の用語はまた、例えば、限定するものではないが、グリコシ
ル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシ
ル化およびＡＤＰ−リボシル化を包含する修飾をも含む。例としての修飾は、大
抵の基礎的なテキスト、例えばProteins - Structure and Molecular Propertie
s, 2nd ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York(1993)に
記載されている。この主題については、多くの詳細な論文、例えばWold, F., Po
st-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pp.
1-12, Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson
, Ed., Academic Press, New York(1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 18
2: 626-646(1990) およびRattan et al., Protein Synthesis: Posttranslation
al Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62(1992)に提供
される論文が入手できる。よく知られているように、そして前述したように、ポ
リペプチドは常に、完全に線状であるわけではないことが分かるであろう。例え
ば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝鎖状であってもよいし、それ
らは一般的には翻訳後事象、例えば天然プロセシング事象および天然に生じない
ヒトによる操作によってもたらされる事象の結果として、枝分かれを有するかま
たは有しないで、環状であってもよい。環状、枝分かれした、および枝分かれし
た環状のポリペプチドは、非翻訳の天然の処理方法により、そしてまた完全な合
成方法によっても合成することができる。修飾は、ポリペプチド中のどこでも、
例えばペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端で起こ
ることが可能である。実際、共有修飾による、ペプチド中のアミノ基またはカル
ボキシル基、または両方の基の遮断が、天然および合成のポリペプチドにおいて
普通であり、そのような修飾は、本発明のポリペプチド中にも同様に存在するこ
とが可能である。例えば、タンパク質分解処理前における、E. coli細胞または
他の細胞中に作製されたポリペプチドのアミノ酸残基は、殆ど常に、Ｎ−ホルミ
ルメチオニンである。そのペプチドの翻訳後の修飾中、そのＮＨ2−末端にある
メチオニン残基は除去され得る。したがって、本発明は、本発明タンパク質のメ
チオニン含有の、およびメチオニンのより少ないアミノ末端変異体の両者の使用
を意図する。ここで使用されているように、一般に、ポリペプチドの用語は、そ
のような全ての修飾、特に宿主細胞中のポリヌクレオチドを発現することにより
合成されるポリペプチドに存在する修飾を包含する。
【００５８】 本明細書中で用いる、「プロモーター」の用語は、転写の開始から上流のＤＮ
Ａの領域であって、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質が認識して結合し
、そして転写を開始する領域に関する。「植物プロモーター」は植物細胞内で転
写を開始することが出来るプロモーターである。具体的な植物プロモーターは、
限定はされないが、アグロバクテリウムまたはリゾビウムのような植物細胞内で
発現する遺伝子を含む、植物、植物ウイルス、細菌から得られる。葉、根、種子
、繊維、木部導管、仮導管、または厚膜組織のようなある種の組織で転写が開始
されるプロモーターが例示される。そのようなプロモーターは「組織優先」と称
される。「細胞」タイプ特異的プロモーターは、ある種の細胞タイプにおいて、
１またはそれ以上の器官で、例えば、根や葉の導管細胞において主に発現する。
「誘導性」または「調節性」プロモーターは環境の制御下でのプロモーターであ
る。誘導性プロモーターにより転写されうる環境条件の例は、嫌気性条件または
光の存在である。他のタイプのプロモーターは、発生において制御されるプロモ
ーター例えば、花粉発生中に発現するプロモーターである。組織優先プロモータ
ー、細胞タイプ特異的プロモーター、発生において制御されるプロモーターおよ
び誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターを構成する。「構成的」プ
ロモーターは、もっと環境的条件で活性なプロモーターである。
【００５９】 用語「細胞周期ポリペプチド」は、細胞分裂の制御に伴われる、グリコシル化
または非グリコシル化形態の1つ以上のアミノ酸配列を指す。この用語はまた、
その断片、変異体、相同体、対立遺伝子または前駆体（例えばプレプロプロテイ
ンまたはプロプロテイン）を含む。用語「細胞周期タンパク質」は細胞周期ポリ
ペプチドを包含する。
【００６０】 本明細書中で用いる「組換え」は、異種の核酸の導入によって修飾されたか又
は細胞がある細胞から修飾されて誘導された細胞又はベクターを含む。例えば、
組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）の型では同じものは見出されない遺伝子
を発現する。そうでなければ異常に発現する、つまり意図的な人の干渉の結果発
現するか又はまったく発現しない、天然の遺伝子を発現する。ここで使用する「
組換え」なる用語は、故意の人の干渉なしに起こる、自然に生じる現象（例えば
、自然発生的な突然変異、自然の形質転換／変換／転移）による細胞やベクター
の変性を含むものではない。
【００６１】 ここで使用する「組換え発現カッセト」は核酸コンストラクトであり、組換え
でまたは合成で作られ、特定の核酸エレメントを有し、標的細胞で特定の核酸を
転写をさせるものである。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコ
ンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、核酸フラグメントに組み入れる
ことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は他の配列
のなかで転写されるべき核酸およびプロモーターを包含する。
【００６２】 「残基」又は「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」は相互に、タンパク質、ポリ
ペプチド、又はペプチド（集合的にタンパク質）の中に組み入れられたアミノ酸
を称するのに使用される。アミノ酸は特に制限されない限り天然のアミノ酸とす
ることができ、天然のアミノ酸と同様に機能し得る天然アミノ酸の公知の類似体
を含む。
【００６３】 「選択的にハイブリダイズする」の用語は、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で、非標的核酸配列へのハイブリダイズよりも検出可能なより
大きい等級（例えば、バックグランドの少なくとも２倍）の核酸配列の特定の核
酸標的配列へのハイブリダイズであり、非標的核酸は実質的除去されている。選
択的にハイブリダイズした配列は、典型的には少なくとも４０％配列同一性、好
ましくは６０−９０％配列同一性を有し、もっとも好ましくは１００％配列同一
性（即ち相補性）を相互に有している。
【００６４】 「特異的に反応性」の用語は、抗体と、その抗体の抗原結合部位により認識さ
れるエピトープを有するタンパク質との間の結合反応を意味する。この結合反応
は、タンパク質および他の生物体の異種集団の存在の中で認識されるエピトープ
を有するタンパク質の存在を決定する。すなわち、指定の免疫検定条件下で、特
異的抗体は、試料中に存在するエピトープを欠いた実質的に全てのその他の分析
物よりも実質的に大きな等級（例えばバックグランドの少なくとも2倍）まで認
識されるエピトープを有する分析物に結合する。
【００６５】 このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質のためのその
特異性について選択される抗体を必要とすることがある。例えば、本発明のポリ
ペプチドに生じる抗体を本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体から選択
することができる。免疫原として使用するタンパク質は、無傷の立体構造である
か、または線状エピトープを提供するように変性され得る。
【００６６】 種々のイムノアッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質（またはそ
の他の分析物）と特異的に反応する抗体を選択することができる。例えば、固相
ＥＬＩＳＡイムノアッセイを通常使用して、タンパク質と特異的に免疫反応する
モノクロナール抗体を選択することができる。選択活性を決定するのに使用でき
るイムノアッセイのフォーマットおよび条件についての記述に関しては、Harlow
and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publicati
ons, New York(1998)を参照されたい。
【００６７】 「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件」なる用語は、プローブが他の配列よりも検出可能な大きい程度（例えば
、バックグランドの少なくとも２倍）で標的配列とハイブリダイズする条件を意
味する。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なった状況では異なるで
あろう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件
を調節することにより、標的配列をプローブと１００％までの相補性（相同的プ
ロービング）で特定することが可能である。あるいは、ストリンジェント条件は
、低い程度の相似性が検出される（異相的プロービング）ほど配列のミスマッチ
を許すように調節することもできる。最適には、プローブは約５００ヌクレオチ
ドの長さであるが、５００より小さい長さから、標的配列の全長に等しい長さま
で大きく変えることができる。
【００６８】 典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１.５Ｍ Ｎａイオンより
低い濃度であり、典型的には０.０１から１.０Ｍ Ｎａイオン濃度であり（また
は他の塩）、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に対してｐＨ
７.０から８.３で温度はすくなくとも３０℃である、そして長いプローブ（例え
ば５０より大きいヌクレオチド）に対しては少なくとも６０℃である。ストリン
ジェント条件は、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加によっても達成されう
る。例示的な低いストリンジェント条件は、３７℃で３０−３５％ホルムアミド
、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液でのハイブ
リダイゼ−ション、および５０−５５℃で１Ｘ−２Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ
＝３.０Ｍ ＮａＣｌ／0.3Ｍクエン酸３ナトリウム）での洗浄である。例示的な
中程度のストリンジェント条件は、３７℃で４０−４５％ホルムアミド、１Ｍ
ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および５５−６０℃で０.
５Ｘ-１Ｘ ＳＳＣでの洗浄である。例示的な高いストリンジェンシー条件は、
３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳでのハイブリダイゼ
ーションそして６０−６５℃で０.１ＸＳＳＣでの洗浄である。一般的にハイブ
リダイゼーションは４〜１６時間の範囲の時間で行われる。
【００６９】 典型的には、特異性はハイブリダイゼーション後の洗浄の機能であり、重要な
要素は最後の洗浄液のイオン強度と温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの
ためには、Ｔmは、Anal. Biochem., 138:267-2841984）、Meinkoth およびWahl
の等式から概算される：Ｔm＝81.5℃＋16.6(log M)＋0.41(％GC)−0.61(％form)
−500／L；式中、Ｍは１価カチオンの容積モル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡに
おけるグアノシンとシトシンヌクレオチドの比率であり、％ｆｏｒｍは、ハイブ
リダイゼーション溶液中のホルムアミドの比率であり、Ｌは、塩基対におけるハ
イブリッドの長さである。Ｔmは相補性標的配列の５０％が完全にマッチしたプ
ローブとハイブリダイズした温度（定義されたイオン強度とｐＨ）である。Ｔm
は、ミスマッチング１％に対して約１℃減少する。かくしてＴm，ハイブリダイ
ゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性配列にハイブリダイズする
よう調節することができる。例えば、同一性が９０％以上の配列が求められると
きは、Ｔmは１０℃減少されうる。一般にストリンジェント条件は、規定された
イオン強度とｐＨで特定の配列およびその補体に対して熱融点（Ｔm）より約５
℃低く選択される。しかしながら、きびしいストリンジェント条件は、熱融点（
Ｔm）よりも１、２、３、または４℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび
／または洗浄を用いることができる；中程度のストリンジェント条件は熱融点（
Ｔm）よりも６、７７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよ
び／または洗浄を用いることができる；低いストリンジェント条件は、熱融点（
Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼ
ーションおよび／または洗浄を用いることができる。等式、ハイブリダイゼーシ
ョン、洗浄組成物、および所望のＴmを用いて当業者は、ハイブリダイゼーショ
ンおよび／または洗浄液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されている
ことを理解するであろう。もし、所望のミスマッチングの程度が４５℃（水溶液
）または３２℃（ホルムアミド液）より低いＴmの結果になるならば、より高い
温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させるのが好ましい。核酸のハイブリ
ダイゼーションへの詳細にわたるガイドは、Tijssen, Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid P
robes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and t
he strategy of nucleic acid probe assays”, New York (1993); and Current
Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al. Eds., Greene
Publishing and Wily-Interscience, New York (1995)に見られる。
【００７０】 ここで用いられる「トランスジェニック植物」には、そのゲノム内が異種ポリ
ヌクレオチドを包含する植物についてのものを含む。一般的に異種ポリヌクレオ
チドはこのポリヌクレオチドが次の世代に引き継がれる様にゲノム中に安定的に
組み込まれる。異種ポリヌクレオチドはゲノムだけに、または組替え発現カセッ
トの一部として組み込まれる。ここで用いられる“トランスジェニック”には、
細胞、細胞系、カルス、組織、植物の部分または植物を含み、そのゲノタイプが
最初にトランスジェニック植物として変換されたもの、ならびに最初のトランス
ジェニック植物から有性交配によって作成されたかまたは無性繁殖によって作成
された、異種核酸の存在によって変換されたものを含む。ここで用いられる“ト
ランスジェニック”の用語は、通常の植物繁殖方法またはランダム交叉繁殖、非
−組換え型のウイルス感染、非−組換え型のバクテリアによる形質転換、非−組
換え型の転位などの天然に生じる現象によるゲノム（染色体のまたは染色体外の
）の変異を含むものではない。
【００７１】 ここで用いられる「ベクター」には、宿主細胞のトランスフェクションに用い
られ、宿主細胞中にポリヌクレオチドを挿入することが出来る核酸を含む。ベク
ターはしばしばレプリコンである。発現ベクターはそこに挿入された核酸の転写
を許容する。
【００７２】 つぎの用語、（ａ）「参照配列」（reference sequence)、（ｂ）「比較窓」(c
omparison window)、（ｃ）「配列同一性」(sequence identity)、（ｄ）「配列同
一性パーセント」(percentage of sequence identity)、および（ｅ）「実質同
一」(substantial identity）を、二つまたはそれ以上の核酸またはポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの間の配列関係を記述するために用いた。
【００７３】 (ａ) ここで用いる「参照配列」は、配列比較のための基準として用いた決め
られた配列のことである。参照配列は、特定の配列のサブセットであるかまたは
全体、例えば全体長さのｃＤＮＡまたは遺伝子配列であるか、または完全ｃＤＮ
Ａまたは遺伝子配列である。
【００７４】 (ｂ) ここで用いる「比較窓」は、ポリヌクレオチド配列の隣接する特定的な
セグメントについてのものを意味し、ここでこのポリヌクレオチド配列は参照配
列と、二つの配列の最適のアラインメントについて比較されるが、比較窓中のポ
リヌクレオチド配列の部分は参照配列のものと比較して付加または欠失（すなわ
ちギャップ）を含みうる（なお参照配列は付加または欠失を含まない）。一般的
に比較窓は長さで少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドで、場合により３０
、４０、５０、１００またはそれ以上のものである得る。ポリヌクレオチド配列
中のギャップの包含による参照配列との高い相同性を回避するためにギャップペ
ナルティーが典型的には導入され、多くのマッチングを減ずることは、当業者が
よく理解するところである。
【００７５】 比較のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメント方法はこの技
術分野で周知である。Smith および Waterman の Adv. Appl. Math によるロー
カルホモロジーアルゴリズム（ベスト・フィット）は比較のための最適の配列の
アラインメントのために行いうる。2: 482 (1981)；Needleman and Wunsch の J
. Mol. Biol. 48: 443 (1970) のホモロジーアラインメントアルゴリズム（GAP
）により、 Pearson and Lipman の Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1988)
の同様の方法のサーチ（Tfasta and Festa） により、Intelligenetics, Mounta
in View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FAST のPC／Geneプログラム中のC
LASTAL、およびGenetic Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wi
sconsin, USA のWisconsin Genetics Software 中の TFASTAを含むがこれには限
定されるものではない、かかるアルゴリズムのコンピューター化された遂行によ
り行われる。このCLASTALプログラムは、Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-15
3 (1989); Corpet et al, Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huan
g et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992); お
よびPearson, et al., Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994) に
詳細に記載されている。 複数の配列の最適グローバルアライメントのために用い
るのに好適したプログラムはPile Up (Feng and Doolittle, Journal of Molecu
le Evolution, 25: 351-360 (1989))であって、これは Higgins and Sharp, CAB
IOS 5: 151-153 (1989) に記載された方法と同様のもので、ここにこれらの文献
を参照により本明細書に加入する。データベースの類似性のサーチに用いること
が出来るＢＬＡＳＴファミリーのプログラムには、ヌクレオチドの問題配列対ヌ
クレオチドのデータベース配列のためのＢＬＡＳＴＮ、ヌクレオチドの問題配列
対タンパク質データベース配列のためのＢＬＡＳＴＸ、 タンパク質の問題配列対
タンパク質のデータベース配列のためのＢＬＡＳＴＰ、タンパク質の問題配列対
ヌクレオチドのデータベース配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ、ヌクレオチドの問題
配列対ヌクレオチドのデータベース配列のためのTBLASTXがある。Current Proto
coles in Molecular Biology, Chapter19, Ausubel et al., Eds., Greene Publ
ishing and Wiley-Interscience, New York (1995) を参照されたい。
【００７６】 本技術分野の通常の知識を有す者が容易に理解するように、ＢＬＡＳＴ調査で
はタンパク質はランダム配列としてモデル化され得ると仮定されている。しかし
ながら、多くの実際のタンパク質は非ランダムの配列領域からなり、この領域は
ホモ重合性の区域で、短い周期の繰り返しの、または一つまたはそれ以上のアミ
ノ酸に富む領域である。 このような低−複雑性領域は、このタンパク質の他の領
域が全く同様でないとしても、関連しないタンパク質の間にアラインされている
。このような低−複雑アラインメントを減じる為に多くの低-複雑フィルタープ
ログラムを用いることができる。例えば、SEG (Wooten and Federhen, Comput.
Chem., 17: 149-163 (1993) およびＸＮＵ (Claverie and States, Comput. Che
m. 17: 191-201 (1993) 低−複雑フィルターが単独でまたは組み合わされて用い
ることができる。
【００７７】 (ｃ) ここで用いる「配列同一性」または「同一性」とは、二つの核酸または
ポリペプチド配列についてこの二つの配列中の残基に関してこれを対応する特定
の比較窓において最大の対応が取れるようにアラインした時に、この二つの配列
中の残基が同一であるということを表現するものである。配列同一性の比率がタ
ンパク質に関して用いられるときには、残基位置が同一でなく、しばしば保存さ
れた酸置換体により異なるもので、この場合アミノ酸残基は類似の化学的性質（
たとえば電荷または疎水性）を有しており、それゆえに分子の機能的性質を変え
ないものであると認識されるべきである。配列がそのような保存置換体で異なる
場合には、この置換分の保有された性質に対する補正の為に配列同一性百分率を
上方に修正されうる。かかる保存された置換体によって異なる配列は、"配列類
似性"または"類似性"を有すると呼ばれる。この修正を行う方法は当業者に周知
である。典型的には上記のことは保存された置換体を全体のミスマッチではなく
て部分的ミスマッチと評点することを含み、かくして配列同一性比率を増大させ
る。かくして、例えば同一のアミノ酸に評点１が与えられ、そして非−保存的置
換に評点０が与えられる場合に、保存的置換には０と１の間の評点が与えられる
。保存的置換の評点は、例えば、Meyers and Miller, Computer Applic. Biol.
Sci.,4: 11-17 (1988) の例えば ＰＣ／ＧＥＮＥ (Intelligenetics, Mountain
View, California, USA) 中において実行されたプログラムのアルゴリズムに従
って計算される。
【００７８】 (ｄ) ここで用いる「配列同一性の比率」とは、二つの最適にアラインされた
比較窓越しの配列を比較して決定された値を意味するが、ここで比較窓中のポリ
ヌクレオチド配列の部分は対照配列（このものには付加または欠失が無い）と比
較してこの二つの配列の最適アラインメントおいて付加または欠失（すなわちギ
ャップ）を含んでいる。比率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配
列に存在して合致した（マッチした）位置の数を測定して得られるが、得られた
この合致した位置の数を比較窓中の位置の合計の数で除し、その結果に１００を
乗じて配列同一性百分率が得られる。 本発明を定義する目的のために、核酸レベルの同一性％は、５０のキャップウ
エイトと３のレングスウエイトを用いるＧｅｎｅｓｃａｐｅ上のＢＥＳＴＦＩＴ
ＤＮＡ配列アラインメントソフトウエアによって決定した。本発明を定義する
目的のために、アミノ酸レベルの同一性％は、１２のキャップウエイトと４のレ
ングスウエイトを用いるＧｅｎｅｓｃａｐｅ上のＢＥＳＴＦＩＴ ＤＮＡ配列ア
ラインメントソフトウエアによって決定した。
【００７９】 (ｅ) (ｉ)ポリヌクレオチド配列の「実質的に同一」の用語は、標準パラメー
ターを用いる記載されたアラインメントプログラムの一つを用いる対照配列と比
較してポリヌクレオチドが５０〜１００％の間の配列同一性を有する配列を含む
こと、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％
の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少な
くとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、そ
して最も好ましくは９５％の配列同一性を有することを意味する。当業者には、
コドン縮重、アミノ酸類似性、読み取りフレームのポジショニング、などを考慮
して、かかる値が適切に調節されて二つのヌクレオチド配列でコードされたタン
パク質の対応する同一性を決定することが認識されるであろう。かかる目的で、
アミノ酸配列の実質的同一性は通常、４０〜１００％の間の配列同一性、好まし
くは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましく
は少なくとも９８％の配列同一性を意味する。
【００８０】 ヌクレオチド配列が実質的に同一であることのもう一つ表示は、二つの分子が
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズするかどうかと言うことにある
。遺伝コードの縮重は、多くのアミノ酸の置き換えを許容するので、同一のアミ
ノ酸をコードするヌクレオチド配列中に多様性を導き、かくして同一のポリペプ
チドをコードすることが出来るＤＮＡ配列でも、ストリンジェント条件下で互い
にハイブリダイズすることが出来ない。このことは、例えば核酸のコピーを遺伝
コードにより許される最大のコドン縮重を用いて作成する時に起こる。二つの核
酸配列が実質的に同一であることの一つの表示は、第一の核酸でエンコードされ
たポリペプチドが、第二の核酸でエンコードされたポリペプチドと免疫学的に交
差反応性であるということである。
【００８１】 (ｅ) （ii）「実質的に同一」の用語は、ペプチドが５５〜１００％の間の対
照配列に対する配列同一性、好ましくは少なくとも５５％の配列同一性、好まし
くは６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは少なく
とも９０％または９５％の 特定の比較窓中の対照配列に対する配列同一性を有
する配列を含むことを示すものという意味を有する。最適アラインメントは Nee
dleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) に記載のホモロジーアライ
ンメントアルゴリズムを用いて行われる。二つのペプチド配列が実質的に同一で
ある表示は、一つのペプチドが第二のペプチドに対して生じた抗体に対して免疫
学的に反応性であることである。かくして一つのペプチドが実質的に第二のペプ
チドと同一であること、つまり、二つのポリペプチドは保存的置換体でのみ異な
るのである。加えて、二つのペプチドが非−保存的変異でのみ異なりそしてもし
も抗体を認識するエピトープが実質的に同一であるときに、一つのペプチドは第
二のペプチドに対して実質的に同一であり得る。「実質的に類似」のペプチドは
上記した様に同一ではない残基位置の外に保存的アミノ酸変異により異なる配列
を共有する。
【００８２】 「２−ハイブリドシステム」とは蛋白質−蛋白質相互作用を同定するためのス
クリーニング法であって、既知の遺伝子（およびそのコード産物）を「餌」又は
ターゲットとして用い、そして「餌」分子との特定の相互作用をする表現遺伝子
ライブラリとその対応するコード産物をスクリーニングするものである。酵母菌
の二重ハイブリッドスクリーニングにおいてライブラリ構築方法と可視マーカ遺
伝子の使用は当業界でよく知られており、Sambrook, et al., 1990, Ausubel et
al., 1990 and G. Hannon and P. Bartel, Identification of interacting pr
oteins using the two-hybrid system. Methods Mol. Cellular Biol. 5:289-2
97 (1995)を参照できる。
【００８３】
【発明の詳述】 植物物のＣｙｃＤ遺伝子は３７から４４ｋＤの蛋白質をコードする。この蛋白
質はＧ１からＳ期へ進むために必要である。コードされた蛋白質はＣＤＫ３に結
合し、このことはサイクリンＤ−ＣＤＫ４キナーゼハイパーホスホリラートＲｂ
（cyclin D-CDK4 kinase hyperphosphorylates Rb）を活性化し、ＤＮＡ合成を
活性化するＥ２Ｆ転写因子を放出する。Ｇ１／Ｓ期サイクリンは最初酵母菌から
分離された(Hadwiger et al., 1989; Richardson et al., 1989)、そして数年後
にヒトから分離された(Matsushime et al., 1991)。従って、植物を含む種々の
他の生物でクローン化されてきた。３つのＣｙｃＤアイソホームが、動物および
植物の両方から見出されており、それらは最初酵母菌から同定された３つのCLN
遺伝子と相同性であり、また機能を補うことができるものである。哺乳類細胞に
おいて、サイクリンは細胞周期制御の成長シグナルの重要なインテグレータであ
るように見える。植物において、この予想はシロイヌナズナで特徴付けされた。
すなわち、スクロースおよびサイトカイニンのそれぞれによって誘導されるAtCy
cD2およびAtCycD3表現である(Francis et al., 1998)。AtCycD3はまた、硝酸塩
濃度によっても誘導され得る(Fuerst et al., 1998)。CycD1はシロイヌイズナth
aliana (Soni et al., 1995; EMBL accession number X83369)、 Antirrhinum m
ajus及び Helianthus tuberosumでクローン化された。サイクリンD2はArabidop
sis (Soni et al, 1995; X83370)で、また CycD3 は Arabidopsis (Soni et al.
, 1995; X83371), Antirrhinum, Helianthus (Freeman and Muray,未出版), Nic
otiana and Medicago (Dahl et al., 1995; X88864)でクローン化された。単子
葉植物相同体では報告はない。本発明において、とうもろこしCycDの全長クロー
ン（ZmCycDとする）を記載する。
【００８４】 一過性細胞周期刺激の正の効果に加えて、正の細胞周期レギュレータの安定な
発現はトランスジェニック植物及び植物細胞の回復における正の選択スキームに
とって有益となろう。インビトロで成長している細胞及び／又はカルス集団にお
いて、CycDのような遺伝子を発現する細胞は、その加速的分割速度に単純に依存
した微分的成長有利性を持つであろう。このトランスジェニック細胞又は細胞／
クラスタは培地でその非形質転換体である相手よりもより急速に成長し、形質転
換体の同定を容易にするであろうことは予測できる。そのような正の成長優位性
（CycD、またはCyｃDと他の細胞周期成分との和のような遺伝子の発現によりも
たらされる）はまた、他のタイプ、例えばプロトプラスト形質転換、葉に基づく
形質転換及び成長点での細胞の形質転換を含むの形質転換において有利となろう
。そのような成長刺激はまた、通常は培地に非馴化の組織の形質転換プロトコー
ルを拡げることができる。例えば、そのような組織には葉の一部（細胞が通常は
分割しないもの）、recalcitrant inbreds からの胚盤（疣状細胞は分裂しない
）、結節組織等である。
【００８５】 特に興味あるのはCycDのような細胞周期遺伝子を正の成長有利性をapical ini
tialsを含む分裂組織の細胞へ伝えるために使用することである。もしapical in
itialsが分裂組織の近隣細胞に相対的に同調した場合、不利な状態でないすぐ隣
の細胞により置きかえられるであろう。逆に正の成長有利性を有するapical ini
tialsに隣り合う形質転換細胞は長い時間に（すなわち継続する細胞世代を通じ
て）、野生型apical initialsにアウトコンピートとなり、最後にはこれらの細
胞を交換し同質の形質転換性成長点を確立する。 また、そのような細胞周期導入遺伝子の発現は、器官及び／又は全植物に対し
効果が有り得る。
【００８６】参照文献 Renaudin, J-P., Doonan, J.H., Freeman, D., Hashimoto, J., Hirt, H., Inze
, D., Jacobs, T., Kouchi, H., Rouze, P., Sauter, M., Savoure, A., Sorrel
l, D.A., Sundaresan, V., and Murray, J.A.H. 1996. Plant cyclins: a unif
ied nomenclature for plant A-, B- and D-type cyclins based on sequence o
rganization. Plant Molecular Biology 32:1003-1018. Dahl, M., Meskiene, I., Boegre, L., Ha, D.T.C., Swoboda, I., Hubmann, R.
, Hirt, H. and Heberle-Bors, E. 1995. The D-type alfalfa cyclin gene cy
cMs4 complements G 1 cyclin-deficient yeast and is induced in the G-1 ph
ase of the cell cycle. Plant Cell 7(11):1847-1857. Murray, J.A.H., Freeman, D., Greenwood, J., Huntley, R., Makkerk, J. Rio
u-Khamlichi, C., Sorrell, D.A., Cockcroft, C., Carmichael., J.P., Soni,
R. and Shah, Z.H. 1998. Plant D cyclins and retinoblastoma protein hom
ologues. In: Plant Cell Division, (Francis, D., Dudits, D. and Inze D.,
eds.), Portland Press, London. Fuerst, R.A.U.A., Soni, R., Murray, J.A.H. and Lindsey, K. 1998. Modula
tion of cyclin transcript levels in cultured cells of Arabidopsis thalia
na. Plant Physiol. 112:1023-1033. Hadwiger, J.A., Wittenberg, C., Richardson, H.E., de Barros Lopes, M. an
d Reed, S.I. 1989. A family of cyclin homologs that control the G1 pha
se in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(16):6255-6259. Matsushime, H., Roussel, M.F. and Sherr, C.J. 1991. Novel mammalian cy
clins (CYL genes) expressed during G1. Cold Spring Harb. Symp. Quant. B
iol. 56:69-74. Richardson, H.E., Wittenberg, C., Cross, F and Reed, S.I. 1989. An ess
ential G1 function for cyclin-like proteins in yeast. Cell 59(6):1127-1
133. Soni, R., Carmichael, J.P., shah, Z.H. and Murray, J.A.H. 1995. A fami
ly of cyclin D homologs from plants differentially controlled by growth
regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interacti
on motif. Plant Cell 7:85-103.
【００８７】 本発明は、特に、本発明の蛋白質の全量の変更（すなわち、増加又は減少）及
び／又はその植物中での蛋白質の量比を変更する、組成物及び方法を提供する。
すなわち、本発明は、細胞分裂の制御のような応用への使用を提供する。本発明
のポリペプチドは、非形質転換植物では見られない、時間的に又は量的に発現さ
せることができる。
【００８８】 特に、細胞周期蛋白質の変更は正の成長有利性及び穀物の収穫量の増加を予想
させるものである。細胞周期核酸はＤＮＡ−結合ドメインをコードする第２の核
酸配列に付加させることができ、ＣｙｃＤ相互作用性蛋白質を同定するための二
重ハイブリッドシステムに使用することができる。細胞周期蛋白質のレベルの変
更、例えば過発現は、種のサイズ、胚乳のサイズ、及び種中の蛋白質量を増加さ
せる核内倍化を増加させることが予想される。細胞周期蛋白質は活性成熟促進因
子（ＭＦＰ）とその成分をアフィニティ精製するために使用することができる。
【００８９】 本発明はまた、細胞周期遺伝子に対して十分な長さと相補性を有するポリヌク
レオチドからなる単離された核酸であって、プローブ、又は遺伝子組替体の検出
用、定量又は単離用増幅プライマとして使用するものを提供する。例えば本発明
の単離された核酸は、望ましい形質転換植物のためのスクリーニングや、遺伝子
の突然変異（例えば置換、欠失、付加）の検出や、化合物のアッセイのスクリー
ニングにおける酵素活性の発現のアップレギュレーションやは変化のモニタや、
遺伝子の対立遺伝子変異体（多型）の数の検出や、又は植物育成プログラムにお
ける分子マーカとしての使用するために、ｍＲＮＡのレベルの不足を検出するた
めのプローブとして使用され得る。本発明の単離核酸はまた、細胞周期ポリペプ
チドの組替え発現や抗体の調製及び／又はスクリーニングにおける免疫原として
使用され得る。本発明の単離核酸は又、宿主細胞、組織又は植物の１またはそれ
以上のサイクル遺伝子のセンスまたはアンチセンス抑制のために使用され得る。
本発明の単離核酸に結合、挿入、切断及び／又は架橋する化学試薬を付加したも
のは、転写や形質転換を変調するために使用され得る。さらには、挿入配列（す
なわちトランスポゾン）に特異的なプライマと本発明の単離核酸に特異的にハイ
ブリダイズするプライマを用いることで、挿入配列変異誘導植物から調製された
ｃＤＮＡライブラリから挿入配列不活性細胞周期遺伝子を同定するために核酸増
幅に使用することができる。望ましい不活性化遺伝子を含む植物からのProgeny
種は、その不活性に特徴的な表現型変化を研究するために植物に成長させること
ができる。「Tools to Determine the Function of Genes, 1995 Proceedings o
f the Fiftieth Annual Corn and Sorghum Industry Research Conference, Ame
rican Seed Trade Association, Washington, D.C., 1995」参照のこと。さらに
、本発明のポリヌクレオチドの非転写５'又は３'領域は、非相同的ｍＲＮＡのタ
ーンオーバーと及び／又は蛋白質合成を変調するために使用され得る。さらに、
本発明のポリヌクレオチドに特徴的なコドン優先性は、転写量及び／又は速度を
変調するため、非相同性配列に適用され得るし、または相同的または非相同的配
列において変更され得る。
【００９０】 本発明はまた、ここで開示する細胞周期ポリペプチド（すなわち、プレプロ酵
素、プロ酵素、又は酵素）からのアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる単離
蛋白質を提供する。本発明はなた、細胞周期ポリペプチドから少なくとも１つの
エピトープを含む蛋白質を提供する。本発明の蛋白質は酵素アゴニストまたは酵
素機能のアンタゴニストのアッセイに使用することができる、または本発明の蛋
白質と特に免疫活性である抗体を得るための免疫原又は抗原として使用すること
ができる。そのような抗体は、発現量のアッセイの使用でき、発現ライブラリか
ら本発明の核酸を同定及び／又は単離するため、又は細胞周期ポリペプチドの精
製のために使用することができる。
【００９１】 本発明の単離核酸は広い範囲の型の植物であり、次の族からの種を含む。 Cu
curbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Tr
ifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Ar
abidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscy
amus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ci
ahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocall
is, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salp
iglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza,
Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea,及び Populus。 好
ましい植物は、コーン、 大豆、モロコシ（sorghum）、ヒマワリ、小麦、イネ、
アルファルファおよびカノラ（canola）である。
【００９２】核酸 本発明は、特にＲＮＡ、ＤＮＡ及びアナログ及び／又はそれらのキメラであって
、細胞周期ポリヌクレオチドを含む。 Ａ．配列番号 2, 12, 14, or 22に記載の蛋白質、又はコンサバティブに改変さ
れた、若しくはそれらの多型変異体 本発明は細胞周期ポリヌクレオチドを含む単離相同的核酸であって、ここで該核
酸は、開示された配列番号 2, 12, 14, or 22の又はそれらのコンサバティブに
改変された若しくは多型変異体をコードする。当業者は、遺伝子コードの縮重は
同一のアミノ酸配列をコードする複数のポリヌクレオチドが可能であることを認
識するであろう。そのような「サイレントバリエーション」は、例えば、本発明
のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体を選択的にハイブリダイズして検出する
ために使用される。従って、本発明は配列番号 1, 11, 13,又は 21、及び配列番
号2, 12, 14,又は 22のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの「サイレ
ントバリエーション」を含む。さらに本発明は単離核酸、配列番号２, 12, 14,
又は22のコンサバティブに改変した異性体をコードする核酸を含む。コンサバテ
ィブに改変した異性体は非異性体ポリペプチドに対する免疫活性である抗体を作
成、又は選択するために使用される。
【００９３】 Ｂ．トウモロコシ核酸ライブラリから増幅されたポリヌクレオチド 上の（ｂ）で示したように、本発明は、細胞周期ポリヌクレオチドを含む単離
核酸であって、該ポリヌクレオチドがトウモロコシ核酸ライブラリから増幅され
たものである。 トウモロコシ株 B73, PHRE1, A632, BMS-P2#10, W23, および M
o17は既知であり公的使用が可能である。他のよく知らており、利用可能な株はM
aize Genetics Cooperation (Urbana, IL)から入手可能である。 核酸ライブラリはｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、又はイントロンプ
ロセッシングのいかなる段階での核酸転写から一般的に構築されたライブラリを
含む。一般的にはｃＤＮＡ核酸ライブラリは全長ｃＤＮＡの大部分を含むために
構築され得るであろう。しばしば、ｃＤＮＡライブラリは相対的に希少なｃＤＮ
Ａの存在を増加させるべく標準化されるものである。
【００９４】 全ＲＮＡ単離：ライブラリは種々のトウモロコシ組織から作成され得るが、最
大限の結果を得るために、根成長点、根成長培地、カルス及び縣濁培地、未成熟
穂及びタッセル、及び若シードリングのような分裂活性な組織からＲＮＡを単離
するべきである。細胞周期蛋白質は典型的には特定の細胞周期ステージで発現さ
れるので、aphidicolin, hydroxyurea, mimosineのような典型的細胞周期阻害剤
を用い、かつＧ１／Ｓ境界で細胞をブロックするダブル−ホスフェイトスタベイ
ション法を用いることによりそのような希少なメッセージを増幅させることがで
きる。細胞は又ダブル−ホスフェイトスタベイション法を用いてこの段階でブロ
ックされ得る。細胞分裂を刺激する例えばサイトカイニンのようなホルモン処理
はまた細胞周期ＲＮＡの発現を増加させるであろう。
【００９５】 そのような急激に分裂している組織（又はＧ１／Ｓ境界にある細胞）からの全
長ｃＤＮＡライブラリは全長の細胞周期関連ｃＤＮＡの同定のための好ましい機
会を与えるであろう。全長ｃＤＮＡライブラリは、「Biotinylated CAP Trapper
」法 (Carninci, P., et al., Genomics 37:327-336, 1996) or the "mRNA Cap
Retention Procedure" (Edery, I., et al., Molecular and Cellular Biology
15:3363-3371, 1995)を用いて構築できる。全長ｃＤＮＡライブラリは低レベル
で発現する遺伝子をサンプリングするより高い可能性を与えるために標準化する
ことができる。ｃＤＮＡライブラリの標準化法の例は、Soaresによりまとめられ
ている (Bonaldo, M.F., et al., Genome Research 6:791-806, 1996)。
【００９６】 細胞周期蛋白質の機能的フラグメントは制限分析、サザン分析、プライマ伸長
分析、及びＤＮＡ配列分析のような種々の方法を用いて同定され得る。機能はま
たトウモロコシホモログを持つＧ１細胞周期蛋白質の突然変異として知られてい
る相補的酵母菌株により決めることができる。例えば、プライマ伸長分析やＳ１
ヌクレアーゼプロテクション分析がクローン化遺伝子の転写の推定される開始部
位を位置付けるために使用され得る。METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7:
GENE TRANSFER AND EXPRESSIONのページ 4.8.1から 4.8.5; Walmsley et al.,Au
subel 「Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expressi
on by the S1 Nuclease Protection Assay」参照。
【００９７】 そのような機能分析の一般的方法は、ゲノムクローンのＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ
又は合成遺伝子配列を表現ベクタにサブクローニングし、その表現ベクタを非相
同性宿主へ導入し、そして細胞分裂を追跡するための種々のよく確立された可視
化方法と共に組み合わせてＤＮＡ合成をモニタするためにＢｒｄＵ導入のような
アッセイ系によることを含む(例えば T. Motomura, Cell cycle analysis in a
multinucleate green alga, Boergensia forbesti (Syphonoclades, Chlorophyt
a). Phycological Res. 44(1):11-17, and J.L. Kennard et al., Pre-mitotic
nuclear migration in subsidiary mother cells of Tradescantia occurs in
the G1 of the cell cycle. Cell Motility and the Cytoskeleton 36:55-67を
参照のこと)。ｃＤＮＡやゲノム遺伝子クローンの断片を調製する方法はよく知
られている。さらに、異性体も、例えばオリゴヌクレオチド−ディレクテッド突
然変異誘発法（oligonucleotide-directed mutagenesis）、リンカスキャニング
突然変異誘発法（linker-scanning mutagenesis）、ポリメラーゼ連鎖反応を用
いた突然変異誘発法（mutagenesis using the polymerase chain reaction）そ
の他の方法により得られる。例えば Ausubel, pages 8.0.3 - 8.5.9.、又一般的
には McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A Practical approach, (IRL P
ress, 1991)を参照のこと。このように本発明はまた、SEQ ID No.１，１１，１
３又は２２と実質的に配列の同等性を有しＣｙｃＤをコードするヌクレオチド配
列を有するＤＮＡを含む。
【００９８】 本発明のポリヌクレオチドは次のプライマ対を用いて増幅されたものを含む。
ZmCycDa-1のプライマセット 1) フランキングZmCycDa-1 cDNAのプライマセット: セット ＃１： For01 5' GCAAGCATGGTGCCGGGCTATGACTGC 3' Rev01 5' AGCGGTGAGGAGCACACCTGAAGCGTACCA 3' セット＃２：: For01 5' GCAAGCATGGTGCCGGGCTATGACTGC 3' Rev02 5' TCTATTCCTCTGCCGACCCCCATCCTT 3' セット＃３： For02 5' CCCCTCTCCACTTGAGAAGAACACAATTAG 3' Rev01 5' AGCGGTGAGGAGCACACCTGAAGCGTACCA 3' セット＃４： For02 5' CCCCTCTCCACTTGAGAAGAACACAATTAG 3' Rev02 5' TCTATTCCTCTGCCGACCCCCATCCTT 3' 2) ZmCycDa-1 cDNA内のプライマセット: セット＃１： For01 5' CGGGCTATGACTGCGCCGCCTCCGT 3' Rev01 5' CTCCTCTTGCTTGTGGAAGAACTATGG 3' セット＃２： For02: 5' ATGGTGCCGGGCTATGACTGCGCCG 3' Rev02: 5' TTAGAGTAGACGTCTAGTGATCCTT 3' ZmCycDb-1のプライマセット: 1) フランキング ZmCycDb-1のプライマセット: セット＃１： For01: 5' CAGACTTTGACTTGCTGGTGTCCGGT 3' Rev01: 5' GCCGCCTCTCAATGCACTCTTTG 3' セット #2 For02: 5' TGGGAGTGAGATACGCCGGTACAGA 3' Rev02: 5' TCCCATCGGATCTCCTCTAGCGCCC 3' 2) ZmCycDb-1内のプイライマセット: セット＃１： For01: 5' CACGCGCACCAGCCCACCGCCCAG 3' Rev01: 5' TCCCATCGGATCTCCTCTAGCGCCC 3' セット＃２： For02: 5' TCACTCTTTGGTCCATTGGGC 3' Rev02: 5' ATGGCGCCGAGCTGCTACGA 3' ZmCycDc-1のプライマセット: 1) フランキングZmCycDc-1 cDNAのプライマセット: セット＃１： For01: CAGTACCCCCACGCTGCACAG Rev01: TCACGCTTGTTCTGTCGTCTTTACAC セット＃２： For02: GCTGCTGCAAGTCCGCAACCACTG Rev02: CGCTTGTTCTGTCGTCTTTACACTG 2)ZmCycDc-1 cDNA内のプライマセット: セット＃１： For01: 5' ACCTCCATCCTCATCTGCCTGGAAGAC Rev01: 5' CTGGACTGCACTGCACTGCAATGC セット＃２： For02: 5' CATCCTCATCTGCCTGGAAGACGGC Rev02: 5' AATGCACTGCCAGCAGCTGAGCT
【００９９】 本発明はまた、全長核酸の部分配列を含む。部分配列のいかなる数もSEQ ID N
o.１，１１，１３又は２１を参照し、かつ、本発明のポリヌクレオチドへの少な
くとも２つの部位で、又は本発明のポリヌクレオチドを側に位置し、かつ含む核
酸の内側の２つの部位で、又は本発明のポリヌクレオチド内の１つの部位とそれ
を含む核酸内の１つのサイトでストリンジェント条件下で選択的に増幅するプラ
イマを用いて得られる。５'及び／又は３'末端を得る種々の方法が知られている
。例えば次が参照される。 Frohman, M. A., in PCR Protocols: A Guide to Me
thods and Applications, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J.
White, Eds. (Academic Press, Inc., San Diego, 1990), pp. 28-38.に記載の
RACE (Rapid Amplification of Complementary Ends) 、又は, U.S. Pat. No. 5
,470,722, および Current Protocols in Molecular Biology, Unit 15.6, Ausu
bel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1
995)が参照される。このように本発明は、細胞周期遺伝子、核酸転写物、ｃＤＮ
Ａ、又はそれらの相補的配列及び／又は部分配列を有する細胞周期ポリヌクレオ
チドを提供する。
【０１００】 プライマ配列は、本発明のポリヌクレオチドの近接した部分配列を参照して得
られる。プライマは、ＰＣＲ増幅条件下で、ゲノム及び／又は同じ種からのｃＤ
ＮＡライブラリを含む増幅混合物中の本発明のポリヌクレオチドへ選択的にハイ
ブリダイズさせるために選択される。一般的には、プライマはそれらが生成する
アンプリコン（amplicon）の部分配列に相補的である。１つの実施例では、プラ
イマは本発明のポリヌクレオチドのカルボキシ又はアミノ末端残基（又はそれら
の相補性物）をコードするコドンへ５'末端でアニールするように構築されるで
あろう。ヌクレオチドのプライマ長は少なくとも１５から５０の整数から選ばれ
る。そのように、プライマは少なくとも15, 18, 20, 25, 30, 40, 又は 50のヌ
クレオチドにすることができる。プライマの５'末端（「テール」）に例えばア
ンプリコンの停止末端にクローニングサイトを導入するために非アニール配列を
加えることができる。
【０１０１】 増幅プライマは場合によっては、SEQ ID No.１，１１，１３，又は２１のよう
なポリヌクレオチド配列、それらから誘導されるポリヌクレオチドから追加の近
隣ヌクレオチドで３'方向へ伸長され得る。プライマが伸長され得るヌクレオチ
ドの数は少なくとも１から２５の整数である。例えばプライマは追加的に１，５
，１０又は１５ヌクレオチドで伸長され得る。当業者であれば、伸長されたプラ
イマ配列はターゲット配列への結合（すなわちアニーリング）の特異性を増加さ
せ得ることは認識するであろう。
【０１０２】 増幅産物は以下に議論するように当業者によく知られた発現系を用いて翻訳さ
れ得る。得られた翻訳産物は、例えば適当な触媒活性（例えば比活性及び／又は
基質特異性）をアッセイすること、又は本発明のポリペプチドに特異性を有する
１またはそれ以上の直鎖エピトープの存在を確認することで本発明のポリペプチ
ドとして確認され得る。ＰＣＲ誘導テンプレートから蛋白質合成方法は当業界で
既知であり市販品として利用できる。例えば、 Amersham Life Sciences, Inc.,
Catalog '97, p.354を参照のこと。
【０１０３】 Ｃ．ポリヌクレオチド（Ａ）または（Ｂ）に選択的にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド 上記（ｃ）に指示したように、本発明は、細胞周期ポリヌクレオチドからなる
単離された核酸を提供し、この場合ポリヌクレオチドは、選択的なハイブリダイ
ゼーション条件下に、上述の（Ａ）または（Ｂ）項のポリヌクレオチドに選択的
にハイブリダイズする。したがって本発明のポリヌクレオチドは（Ａ）または（
Ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸の単離、検出および／または定量に使用す
ることができる。たとえば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託ライブラリー中
の部分または完全長クローンの同定、単離または増幅に使用することができる。
一部の実施態様においては、ポリヌクレオチドは、Ｚｅａ ｍａｙｓの核酸ライ
ブラリーから単離されたゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列である。好ましくはｃ
ＤＮＡライブラリーは少なくとも８０％の完全長配列、好ましくは少なくとも８
５％もしくは90％の完全長配列、さらに好ましくは少なくとも９５％の完全長配
列から構成される。ｃＤＮＡライブラリーは、稀な配列の提示を増加させるため
に正規化することができる。低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件が
通常であるが、相補性配列に比較して配列同一性の低い配列がもっぱら使用され
るわけではない。同一性がより大きい配列については中等度および高ストリンジ
ェント条件が任意に採用できる。低ストリンジェント条件は約７０％の配列同一
性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソログまたは
パラログ配列の同定に使用することができる。
【０１０４】 Ｄ．ポリヌクレオチド（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）と、少なくとも６０％特異
的な配列同一性を有するポリヌクレオチド 上記（ｄ）に指示したように、本発明は、細胞周期ポリヌクレオチドからなる
単離された核酸を提供し、この場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドレベルに
おいて、（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）項に開示されたポリヌクレオチドに特異的
な同一性を有する。 参照配列に対する同一性の百分率は少なくとも６０％であ
り最も近い整数に切り上げると、６０〜９９からなる整数群より選択される整数
として表すことができる。すなわち、参照配列に対する同一性の百分率は少なく
とも７０％、７５％、８０％、９０％または９５％であることができる。
【０１０５】 この実施態様のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（Ａ）、（Ｂ）または
（Ｃ）によってコードされるポリペプチドと任意に１個のエピトープを共有する
。すなわち、これらのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（Ａ）、（Ｂ）ま
たは（Ｃ）によってコードされる第二のポリペプチドに特異的に反応性の抗体か
らなる抗血清の産生を誘発する第一のポリペプチドをコードする。しかしながら
、第一のポリペプチドは抗血清が第一のポリペプチドで完全に免疫吸着された場
合、それ自体に対して産生された抗血清に結合しない。したがって、この実施態
様のポリヌクレオチドはたとえばポリヌクレオチド（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）
からなる核酸について発現ライブラリーのスクリーニングに使用する抗体を発生
させるために、あるいはポリヌクレオチド（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）によって
コードされるポリペプチドの精製もしくはイムノアッセイに使用することができ
る。この実施態様のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに使用できる核酸配列を包含す
る。
【０１０６】 抗血清への特異的結合についてのポリペプチドのスクリーニングは、慣用的に
ペプチドディスプレーライブラリーを用いて達成することができる。この方法は
、個々のメンバーが所望の機能もしくは構造を有するペプチドの大きな収集のス
クリーニングを包含する。ペプチドディスプレーライブラリーの抗体スクリーニ
ングは本技術分野において周知である。ディスプレーされたペプチド配列は、３
〜５０００またはそれ以上のアミノ酸長、しばしば５〜１００アミノ酸長、多く
の場合約８〜１５アミノ酸長を有する。ペプチドライブラリーの発生のためには
直接的な化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法が記載されている。１
つのタイプは、バクテリオファージまたは細胞の表面上へのペプチド配列のディ
スプレーが包含される。各バクテリオファージまたは細胞は、特定のディスプレ
ーされたペプチド配列をコードする核酸配列を含有する。このような方法は、Ｐ
ＣＴ特許公開番号 91／17271、91／18980、91／19818 および 93／08278 に記載
されている。ペプチドのライブラリーを発生させるための他のシステムはインビ
トロ化学合成および組換え法両者の態様を有する。ＰＣＴ特許公開番号 92／052
58、 92／14843 および 96／19256 参照。また、イネ国特許第5,658,754 および
5,643,768 も参照されたい。ペプチドディスプレーライブラリー、ベクターお
よびスクリーニングキットは Invitrogen（Carlsbad, CA）のような供給業者か
ら市販されている。
【０１０７】 Ｅ．プロトタイプポリペプチドからのおよびプロトタイプポリペプチドに交叉
反応性を示すサブ配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド 上記（ｅ）に指示したように、本発明は、細胞周期ポリヌクレオチドからなる
単離された核酸を提供し、この場合、ポリヌクレオチドは、上記（ａ）に提供し
たようなプロトタイプ細胞周期ポリペプチドからの連続アミノ酸のサブ配列を有
するタンパク質をコードする。プロトタイプ細胞周期ポリペプチドの実例はSEQ
ID No. ２、１２、１４または２４に示される。プロトタイプポリペプチドから
の連続アミノ酸の長さは少なくとも１０からプロトタイプ配列内のアミノ酸の数
までからなる整数の群より選択される。したがって、ポリヌクレオチドはたとえ
ば、プロトタイプポリペプチドからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０
、３５、４０、４５または５０の連続アミノ酸を有するポリペプチドをコードす
る。さらに、この実施態様のポリヌクレオチドによってコードされるこのような
サブ配列の数は、１〜２０からなる群より選択される任意の整数、たとえば２、
３、４または５とすることができる。サブ配列は１から配列中のヌクレオチドの
数までの任意の整数のヌクレオチド、たとえば少なくとも５、１０、１５、２５
、５０、１００または２００のヌクレオチドによって分離されていてもよい。
【０１０８】 この実施態様のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、免疫原
として提供された場合、プロトタイプポリペプチドたとえばそれらに限定される
ものではないが、上述の（ｂ）またはSEQ ID No. ２、１２、１４または２２に
例示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに特異的に結合
するポリクローナル抗体の産生を誘発する。しかしながら、一般に、この実施態
様のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、抗血清がプロトタイ
プポリペプチドで完全に免疫吸着された場合、プロトタイプポリペプチドに対し
て産生された抗血清に結合しない。抗体結合特異性／親和性の作成およびアッセ
イ方法は本技術分野において周知である。イムノアッセイフォーマットの例には
、ＥＬＩＳＡ、競合的イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロ
ット、間接免疫蛍光アッセイ等が包含される。
【０１０９】 好ましいアッセイ方法においては、プロトタイプポリペプチドに誘発される、
完全に免疫吸着され、プールされた抗血清を、タンパク質を試験するため、競合
的結合アッセイに使用することができる。プロトタイプポリペプチドに対する抗
血清の結合を５０％阻害するのに要求されるプロトタイプポリペプチドの濃度が
測定される。結合を阻害するのに要求されるタンパク質の量がプロトタイプタン
パク質の量の２倍未満であれば、タンパク質は免疫原に対して誘発された抗血清
に特異的に結合するといわれる。したがって、本発明のタンパク質は対立変異体
、保存的に修飾された変異体、およびプロトタイプポリペプチドに対するわずか
な組換え修飾体を包含する。
【０１１０】 本発明のポリヌクレオチドは、本発明の完全長の非グリコシル化細胞周期ポリ
ペプチドの分子量の20％以内の非グリコシル化タンパク質としての分子量を有す
るタンパク質を任意にコードする。分子量は還元条件下にＳＤＳ-ＰＡＧＥによ
って容易に測定することができる。好ましくは、分子量は本発明の完全長細胞周
期ポリペプチドの15％以内であり、さらに好ましくは10％または５％以内、最も
好ましくは本発明の完全長細胞周期ポリペプチドの３％、２％または１％以内で
ある。タンパク質の分子量の測定は、変性条件下にＳＤＳ-ＰＡＧＥによって慣
用的に実施できる。
【０１１１】 この実施態様のポリヌクレオチドは、本発明のネイティブな内因性（すなわち
、単離されていない）、完全長細胞周期ポリペプチドの少なくとも２０％、３０
％、４０％または５０％の比活性を有するタンパク質を任意にコードする。さら
に、この実施態様のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は任意に
ネイティブな、内因性、完全長細胞周期タンパク質と実質的に同じ見かけの解離
定数（Ｋm）および／または触媒活性（すなわち、顕微鏡的速度定数、Ｋcat）を
有する。本技術分野の熟練者には自明のように、Ｋcat／Ｋm値は基質を競合する
特異性を決定し、特異性定数と呼ばれることが多い。この実施態様のタンパク質
は、上述の細胞周期特異性パウウエイからポリペプチドの基質を用いて測定する
非単離、完全長細胞周期ポリペプチドの少なくとも１０％のＫcat／Ｋm値を有す
ることができる。任意に、Ｋcat／Ｋm値は、本発明の非単離、完全長細胞周期ポ
リペプチドのＫcat／Ｋm値の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％であり
、最も好ましくは本発明の非単離、完全長ポリペプチドのＫcat／Ｋm値の少なく
とも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。Ｋm、Ｋcat、およ
びＫcat／Ｋmの測定は当業者には周知の任意の手段によって測定することができ
る。たとえば、初期速度（すなわち、最初の５％またはそれ未満の反応）は、迅
速混合およびサンプリング法（たとえば、連続フロー、停止フローまたはクエン
チングフロー法）、フラッシュ光分解、または弛緩法（たとえば、温度ジャンプ
）を用い、分光測光法、分光蛍光法、核磁気共鳴または放射性操作のような測定
の方法と接合して測定することができる。速度論値は Lineweaver-Burk または
Eadle-Hofstee プロットを用いて得るのが便利である。
【０１１２】 Ｆ．（Ａ）〜（Ｅ）のポリヌクレオチドに相補性のポリヌクレオチド 上記（ｆ）に指示したように、本発明は、上記Ａ〜Ｅのポリヌクレオチドに相
補性の細胞周期ポリヌクレオチドからなる単離核酸を提供する。本技術分野の熟
練者には自明のように、相補性配列は、それらの全長により（Ａ）〜（Ｅ）のポ
リヌクレオチドと塩基ペアを作る（すなわち、それらの全長と１００％の配列同
一性を有する）。相補性塩基は二本鎖核酸中では、水素結合により会合する。た
とえば以下の塩基ペア：グアニンおよびシトシン、アデニンおよびチミン、なら
びにアデニンおよびウラシルは相補性である。
【０１１３】 Ｇ．（Ａ）〜（Ｆ）のポリヌクレオチドのサブ配列であるポリヌクレオチド 上記（ｇ）に指示したように、本発明は、上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリヌクレオ
チドからの少なくとも15連続塩基から構成される細胞周期ポリヌクレオチドから
なる単離核酸を提供する。ポリヌクレオチドの長さは少なくとも15から、そのポ
リヌクレオチドがサブ配列である核酸配列の長さまでからなる群より選択される
整数として与えられる。したがって、たとえば本発明のポリヌクレオチドは上記
（Ａ）〜（Ｆ）のポリヌクレオチドからの、長さが少なくとも１５、２０、２５
、３０、４０、５０、６０、７５、または１００の連続ヌクレオチドからなるポ
リヌクレオチドを包含する。この実施態様のポリヌクレオチドによってコードさ
れるこのようなサブ配列の数は任意に、１〜２０からなる群より選択される任意
の整数、たとえば２、３、４または５とすることができる。サブ配列は、１から
配列中のヌクレオチドの数までの任意の整数のヌクレオチド、たとえば少なくと
も５、１０、１５、２５、５０、１００または２００のヌクレオチドによって分
離されていてもよい。
【０１１４】 本発明のサブ配列はそれが由来する配列の構造的特徴からなることができる。
また、サブ配列は、それが由来するより大きな配列のある種の構造的特徴を欠い
てもよい。たとえばプロトタイプ配列と共通の少なくとも１個の線状のエピトー
プを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからの配列は、プロトタ
イプ配列と共通のエピトープをコードしてもよい。また、サブ配列はプロトタイ
プ配列と共通のエピトープをコードしないが、たとえば、それが由来する配列と
の核酸ハイブリダイゼーションによって、より大きな配列の単離に使用すること
ができる。サブ配列は、核酸に対し結合、相互作用、切断および／または架橋結
合するサブ配列化合物中に導入することにより、遺伝子発現の修飾または検出に
使用することができる。例示的化合物としては、アクリジン、ソラレン、フェナ
スロリン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリール接
合体が包含される。
【０１１５】核酸の構築 本発明の単離された核酸は、(a) 標準的な組換え方法、（b）合成技術、また
はこれらの組合せによって調製することができる。いくつかの実施態様において
、本発明のポリヌクレオチドは、単子葉植物からクローニングされ、増幅される
か、または構築される。好ましい態様において、単子葉植物はトウモロコシであ
る。殊に、ふさ毛および生長分裂組織からのＺａｅ ｍａｙｓの組織の使用が好
ましい。
【０１１６】 核酸は、本発明のポリヌクレオチド以外に、都合良く配列を有することができ
る。例えば、ポリヌクレオチドの単離に役立つように、一つないしそれ以上のエ
ンドヌクレアーゼ制限部位を有する多重クローニング部位が、核酸に挿入される
ことができる。また、翻訳可能な配列は、本発明の翻訳されたポリヌクレオチド
の単離に役立つように、挿入されることができる。例えば、ヘキサヒスチジン
マーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するために都合の良い手段を提供す
る。本発明の核酸は、ポリヌクレオチド配列を除いて、本発明のポリヌクレオチ
ドのクローニングおよび／または発現のための、ベクター、アダプターまたはリ
ンカーに一般的に連結することができる。クローニングベクター、発現ベクター
、アダプタおよびリンカーの使用は、当技術分野に知られている。核酸の実例に
は、次のようなベクター：Ｍ13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda
gt10, lambda gt11, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambada DASH II, la
mbda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pB
S+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pOPRSVI CAT, pOP13 CAT,
pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pOG44, pOG45, pFRTβGAL, pNEOβGAL,
pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda M
OSSlox, およびlambda MOSElox が含まれる。種々の核酸の開示に関しては、例
えば、Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, C
A);およびAmersham Life Sciences, Inc, Catalog '97 (Arlington Heights, IL
)を参照のこと。
【０１１７】 A. 核酸を構築する組換え法 RNA、cDNA、ゲノムDNAまたはそのハイブリッドなどの本発明において単離され
た核酸成分は、当業者において周知のかなり多くのクローニング法を用いて、植
物試料から得られる。いくつかの態様において、ストリンジェントな条件下で本
発明のポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
ーブは、cDNA、またはゲノムDNAライブラリーの中から、所望の配列を同定する
のに用いられる。RNAの単離、並びにcDNAおよびゲノムライブラリーの構築は、
当業者において周知のものであるが、次に、採用した方法のいくつかのものを特
に示す。
【０１１８】 A1. mRNAの単離と精製 植物細胞由来の全RNAは、ミトコンドリアRNA、葉緑体RNA、rRNA、hnRNA、mRNA
のような核酸を含む。全RNAの調製は、一般的に細胞の溶解、タンパク質の除去
、それに続く核酸の沈殿を包含する。植物細胞からの全RNAの抽出は様々な方法
で成し遂げられる。しばしば、抽出緩衝液にはSDSのような強い界面活性剤やグ
アニジンイソチオシアン酸やグアニジン塩酸またはフェノールなどの有機変性剤
が用いられる。全RNAの単離後、poly(A)+mRNAは、一般的には残ったRNAからolig
o（dT）セルロースを使って精製される。典型的な全RNAとmRNAの単離のプロトコ
ールはPlant Molecular Biology: A Laboratory Manual, clark, Ed., Springer
-Veriag, Berlin (1997)と Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel
, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995
) に詳述されている。全RNAやmRNAの単離のキットはStratagene (LaJolla, CA),
Clonetech (Palo Alto, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), 5'-3'(Paoli, PA)
といった業者から市販されている。イネ国特許第5,614,391号および第 5,459,25
3号を参照。mRNAは、およそ0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0kbの大きさの範囲の
集団に分画する。この分画それぞれに対して合成されたcDNAは、ベクター挿入前
にそれぞれのmRNAと同じ大きさの範囲に選抜される。この方法でmRNAの不完全な
逆転写によって生成した切れているcDNAを除くことができる。
【０１１９】 A2. cDNAライブラリーの構築 cDNAライブラリーの構築は一般的に５つの段階からなる。１番目に、一本鎖cD
NA合成はpoly(dT)プライマーまたはランダムな６つのヌクレオチド配列を用いた
poly(A)+mRNA鋳型から開始される。２番目は、結果として生じたRNA-DNAハイブ
リッドを一般的にはRNAse HとDNAポリメラーゼの組み合わせによって、二本鎖cD
NAに変換させる。３番目は、二本鎖cDNAの末端にアダプターを結合させる。アダ
プターの結合はクローニングのために結合力のある末端を形成する。４番目は、
二本鎖cDNAの大きさによる選抜により、過剰なアダプターとプライマーの断片を
取り除き、mRNAの分解による部分的なcDNA分子あるいは、逆転写酵素によって、
完全な一本鎖DNAを合成することができなかった部分的なcDNA分子を取り除く。
５番目に、cDNAはクローニングベクターに結合し、パッケージする。cDNA合成の
プロトコールは、当業者に周知であり、以下のような標準的な文献に記載されて
いる：Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer
-Veriag, Berlin (1997)、 CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel,
et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)
。cDNA合成キットは、Stratageneやpharmaciaのような業者から市販されている
。
【０１２０】 十分に純粋な完全長のcDNAライブラリーを提供する数多くのcDNA合成プロトコ
ールが詳述されている。十分に純粋な完全長のcDNAライブラリーは、少なくとも
90％、より好ましくは少なくとも93％、あるいは95％の完全長の挿入物を含むよ
うに構築される。このようなライブラリーの挿入物の長さは、０から、８、９、
10、11、12、13kbp、あるいはそれ以上の塩基対となる。このようなサイズの挿
入物に適したベクターは、当業者において周知であり、市販されている。たとえ
ば、Stratagene社のlambda ZAP Express（0-12kbのクローニング能を持つcDNAク
ローニングベクター）を参考。95％以上純粋な、完全長のcDNAライブラリーを構
築する一般的な方法はCarninciらによって記載されている（Genomics, 37:327-3
36 (1996)）。そのプロトコールでは、真核生物のmRNAのキャップ構造が化学的
にビオチン標識されている。ストレプトアビジンでコートされたマグネットビー
ズを用いて、完全長の一本鎖cDNA/mRNAハイブリッドのみがRnase I処理後に選択
的に回収される。この方法は、最初のmRNA組成の不偏性を示す高収量のライブラ
リーを得ることができる。完全長のライブラリーを作成する他の方法は、当該技
術分野において周知である。Edery et al., Mot. Cell Biol.,l5(6):3363-3371
(1995)、および、PCT 特許出願WO 96/34981を参照。
【０１２１】 A3.均一化あるいはサブトラクションcDNAライブラリー 均一化されていないcDNAライブラリーは由来する組織のmRNA組成を表している。
ある独特なのクローンは発現量の多い遺伝子に由来するクローンが数で勝るので
、その単離は面倒となる。cDNAライブラリーの均一化は、それぞれのクローンが
等しく出現するようにライブラリーを作成する過程である。
【０１２２】 均一化cDNAライブラリーへの方法は数多く、当該技術分野において周知である
。ひとつの方法はゲノムDNAとのハイブリダイゼーションが基本となっている。
結果として、均一化されたライブラリーにおいて、それぞれのハイブリダイズさ
れたcDNAの頻度はゲノムDNAにおけるそれぞれに対応する遺伝子の頻度に比例す
るだろう。もう一つの方法は、キネティックスに基づくものである。cDNAの再ア
ニーリングが二次的キネティックスに従うのであれば、より稀少なものは、迅速
にはアニーリングしにくいし、また、残留するcDNAの一本鎖の分画は、ハイブリ
ダイゼーションの工程の間で段々とより均一化していく。量的なものとは関係の
ないある種のcDNAに特異的な損失はCot値においても生ずることはない。均一化
ライブラリーの作成については、Ko. Nucl. Acids. Res,, 18(19):5705-5711 (1
990)、 Patanjali et al.. Proc. Natl. Acad. U.S.A., 88:1943-1947 (1991)、
イネ国特許第5,482.685号および 5,637,685号に記載されている。Soaresらによ
って記載されている一般的な方法では、均一化によってクローンの量は10の４乗
の桁から10の1乗の桁という狭い範囲に減少する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
91:9228-9232 (1994)）。
【０１２３】 サブトラクションcDNAライブラリーは、より少量のcDNAの種類の割合を増加す
るもうひとつの手段である。この手順において、mRNAのひとつのプールから調製
されたcDNAは、ハイブリダイゼーションによってｍRNAのもう一つのプールにあ
る配列を枯渇させる。cDNA:mRNAハイブリッドは取り除かれ、残ったハイブリダ
イズしていないcDNAプールはそのプールに独特の配列に富んでいる。Foote et a
l. in. Plant MolecularBiology: A Laboratory Manual, dark, Ed., Springer-
Verlag, Berlin (1997)、 Kho andZarbl, Technique, 3(2):58-63 (1991); Sive
and St. John, Nucl. Acids Res., 16(22): 10937 (1988)、 Current Protocol
s in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., GreenePublishing and Wile
y-Interscience, New York (1995)、 Swaroop et al., Nucl. Acids Res., 19)8
): 1954 (1991) を参照。cDNAのサブトラクションキットは市販されている。PCR
-Select (Clontech)を参照。
【０１２４】 A4.ゲノムライブラリーの作成 ゲノムライブラリーの作成のために、ゲノムDNAの大きな断片は、例えば制限
エンドヌクレアーゼを用いるランダムな断片化によって生成され、適したベクタ
ー中にパッケージできるDNAのコンカテマーであるベクターDNAに結合される。こ
のような末端を作製する方法論および核酸の配列を確かめるシーケンス法は、当
該技術分野において周知である。数多くの構築、クローニング、スクリーニング
の方法論の中で、当業者を指導するに十分な適切な分子生物学的手法や解説は、
以下の文献に見出される：Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laborator
y Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Vols. 1-3 (1989)、 Meth
ods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berg
er and Kimmel, Eds., San Diego: Academic Press, Inc. (1987)、 Current Pr
otocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greeae Publishing a
nd Wiley-Interscience, New York (1995)、 Plant Molecular Biology: A Labo
ratory Manual, dark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997)を参照。 ゲノム
ライブラリーの作成のためのキットもまた市販されている。
【０１２５】 A5. 核酸のスクリーニングと単離方法 cDNAあるいはゲノムライブラリーは、本明細書にて開示したのような本発明の
ポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを用いてスクリーニングできる。プロ
ーブは同種、あるいは異種の植物における相同遺伝子群を単離するためにゲノム
DNA、またはcDNA配列にハイブリダイズするのに用いられる。当業者は、ハイブ
リダイゼーションの様々なストリンジェンシーの程度を分析に使える；およびハ
イブリダイゼーションまたは洗浄の溶液をストリンジェントにできるということ
を理解する。ハイブリダイゼーションの条件をよりストリンジェントにすること
で、生じる2本鎖の形成によるプローブと標的の間の相補性の程度は高くなる。
ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、pH、ホルムアミドのような部
分的に変性させる溶媒の存在で制御することができる。例えば、ハイブリダイゼ
ーションのストリンジェンシーは、ホルムアミドを0％から50％の範囲以内で濃
度を操作することによって反応溶液の極性を変化させることで簡単に変えること
ができる。検出可能な結合のために必要な相補性（配列の同一性）の程度はハイ
ブリダイゼーション液および/または洗浄液のストリンジェンシーに従って変化
する。相補性の程度は、最適であれば100％になる。しかしながら、プローブや
プライマーにおけるわずかな配列の違いは、ハイブリダイゼーション液および／
または洗浄液のストリンジェンシーを低下させることによって代償されることを
理解しなければならない。
【０１２６】 目的の核酸はまた、増幅の手法を使って核酸のサンプルから増幅させることが
できる。たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）法は本発明のポリヌクレオチド
の配列や、ゲノムDNAやcDNAライブラリーから直接的に関連した遺伝子を増幅す
るのに用いることが可能である。PCRや他のインビトロでの増幅方法もまた、た
とえば、核酸のシーケンスや、他の目的にとって、発現しているタンパク質をコ
ードする核酸の配列をクローニングするため、フランキングしたゲノミック外列
、５'−未翻訳領域および３'配列をクローニングするため、また、サンプルにお
いて求められているmRNAの存在を検出するためのプローブとして使う核酸を作る
ために有用である。インビトロでの増幅方法を通して、当業者を指導するに十分
な適切な分子生物学的手法の例は、Berger、 Sambrook、 Ausubel、 Mullis ら
のイネ国特許第4,683,202号 (1987)、 PCR Protocols A Guide to Methods and
Applications, Innis et al., Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (19
90)に見出される。市販されているゲノムのPCR増幅キットは当該技術分野におい
て知られている。 Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)を参照。T4 gene3
2 protein (Boehringer Mannheim)は長いPCR産物の収量を上げるのに用いられる
。
【０１２７】 PCRを基にしたスクリーニング法もまた、記載されている。Wilfingerらは解析
対象から不完全なクローンを取り除くために最初の段階で最も長いcDNAを同定す
るというPCRを基礎とする方法について述べている（BioTechniques, 22(3): 481
-486 (1997) ）。この方法において、所望のcDNAのセンス鎖の５'末端に結合す
るプライマーとベクターに結合するプライマーの対が合成される。クローンは大
規模なスクリーニングが可能になるまでプールされる。この手順によって、可能
性のある最も長いクローンは候補となるクローンから特定される。さらには、PC
R産物は目的とするcDNAの存在の指標としてのみ使われ、PCR産物自体を利用しな
い。このような方法は上述した完全長のcDNA合成の方法論との組合せにおいて特
に有効である。
【０１２８】 B.核酸を生成するための合成法 本発明において単離された核酸はNarang らのホスホトリエステル法（Meth. E
nzymol. 68: 90-99 (1979)）、Brown らのホスホジエステル法（Meth. Enzymol.
68: 109-151 (1979)）、 Beaucage らによるジエチルホスホルアミダイト法（T
etra. Lett. 22: 1859-1862 (1981)）Beaucage と Caruthersによる固相ホスホ
ルアミダイトトリエステル法（Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862 (1981)） 、N
eedham-VanDevanterらが記載したような自動シンセサイザーを用いる方法（Nucl
eic Acids Res., 12: 6159-6168 (1984)）、そして、イネ国特許第 4,458,066号
の固体支持体法などの直接的な化学合成によって調製することができる。一般的
に化学的合成では、一本鎖オリゴヌクレオチドが作られる。これを相補的配列と
のハイブリダイゼーションによって、あるいは鋳型としてその一本鎖を用いたDN
Aポリメラーゼによる重合で二本鎖に変換する。当業者は、DNAの化学的合成は、
約100塩基の配列に限られるので、より長い配列は、短い配列の連結により得ら
れると理解するであろう。
【０１２９】組換え発現カセット 本発明はまた、本発明の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本発明の
所望のポリヌクレオチドをコードする核酸配列、例えば本発明の活性なタンパク
質をコードするのに十分な長さのポリペプチドをコードするcDNAまたはゲノム配
列は、所望の宿主細胞に導入され得る組換え発現カセットを構築するために用い
ることができる。組換え発現カセットは、代表的には、形質転換植物の組織など
のような意図された宿主細胞においてポリヌクレオチドを転写させる転写開始制
御配列に操作可能に連結された本発明のポリヌクレオチドから構成される。
【０１３０】 例えば、植物発現ベクターは、(1) ５'および３'制御配列の転写制御下にある
クローン化植物遺伝子、および（2）優性選択可能なマーカーを含有し得る。こ
のような植物発現ベクターはまた、所望によりプロモーター制御領域（例えば、
誘導性または構成性を付与するもの、環境的もしくはは発育上制御される発現、
または細胞もしくは組織特異的／選択的な発現を付与するもの）、転写開始部位
、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終止部位、および
／またはポリアデニル化シグナルを包含し得る。 供する。
【０１３１】 細胞周期ベクター群(cell cycle vectors)は、標準的な分子生物学的技術を用
いて構築された。例えば、Sambrook et al. (eds.) MOLECULAR CLONING: a LAB
ORATORY MANUAL, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, co
ld Spring Harbor, NY 1989)を参照のこと。プラスミド群は、pUC18をベースと
した。これらの実験に用いられたベクター群は、同じ基本的規制因子（basic re
gulatory elements）の組み合わせを含むものである。オメガプライム−５−プ
ライム配列（omega prime (O') 5-prine sequence） が、 Gallie et al., Nucl
. Acids Res. 15:3257-3273 (1987)によって開示されている。選択的マーカー遺
伝子であるbar (Thompson et al., EMBO J. 6:2519-2523 (1987))が、形質転換
体を回収するために、ヴィアラフォス選択（bialaphos selection)と組み合わせ
て用いられた。重複エンハンサー領域を有するカリフラワー モザイクウィルス
３５Ｓプロモーター（Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter）が Gardner et
al., Nucl. Acid Res. 9:2871-2888 (1981)に開示されている。７９塩基対のタ
バコ モザイクウィルス リーダー（ The 79 bp Tobacco Mosaic Virus leade
r）が、Gallie et al., Nucl. Acid Res. 15:3257-3273 (1987) によって開示さ
れており、そして前記プロモーターの下流に挿入され、そしてトウモロコシアル
コール脱水素酵素遺伝子ＡＤＨ１−Ｓの第１イントロンがこれに次いだ。Dennis
et al., Nucl. Acid Res. 12:3983-3990 (1984)に述べられている。３'末端配
列pinII は An et al., Plant Cell 1:115-122 (1989)に述べられている。
【０１３２】 再生植物のすべての組織において本発明のポリヌクレオチドの発現をもたらす
、植物プロモーターフラグメントが採用され得る。このようなプロモーターは、
本明細書において「構成（constitutive）」プロモーターと称され、そして、多
くの環境条件下、および発生ないし細胞分化の状態下で活性なものである。構成
プロモーターの例は、カリフラワー モザイクウィルス（CaMV) ３５Ｓ転写開
始領域、アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Agrobacterium tumefaci
ens）のＴ−ＤＮＡ由来の１'−または２'−プロモーター、ユビキチン１プロモ
ーター、Smasプロモーター、シンナミルアルコール脱水素酵素プロモーター（イ
ネ国特許第5,683,439号)、Nos プロモーター、pEmu プロモーター、rubisco プ
ロモーター、GRP1-8プロモーター、およびその他の当業者に公知の種々の植物遺
伝子からの転写開始領域を包含するものである。
【０１３３】プロモーター A. 誘発性プロモーター群 誘発性プロモーターは、ZmCycDをコード化するヌクレオチド配列へと、作動的
に連結可能である。場合によって、誘発性プロモーターは、ZmCycDをコード化す
るヌクレオチド配列へと作動的に連結可能なシグナル配列をコード化するヌクレ
オチド配列へと作動的に連結可能である。誘発性プロモーターを用いることで、
誘発剤への応答における転写率が高まる。
【０１３４】 任意の誘発性プロモーターが、この発明において用いられ得る。Ward et al.
Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993)を参照のこと。代表的な誘発性プロモータ
ーは、銅に応答するACE1システムからのもの (Mett et al., PNAS 90:4567-4571
(1993)); ベンゼンスルフォンアミド除草剤安全化剤に応答するトウモロコシか
らのIn2遺伝子、 (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991) a
nd Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994))、および Tn10 からの
Tetレプレッサー (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237 (1991)を包含
する。特に好ましい誘発性プロモーターは、通常植物が応答しない誘発剤に対し
て応答するプロモーターである。代表的な誘発性プロモーターは、糖質コルチコ
イドステロイド ホルモンによって誘発された転写活性を有するステロイド ホ
ルモン遺伝子からの誘発性プロモーターである（Schena et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 88:10421 (1991)）。
【０１３５】 発現ベクターは、ZmCycD をコード化するヌクレオチド配列に作動的に連結さ
れた誘発性プロモーターを有する。発現ベクターは、植物細胞へと導入され、そ
して、予定形質転換細胞が、誘発性プロモーターの誘発因子へと曝される。該細
胞は、上記したようなノーザン、RPAまたはRT-PCR (トランスジーン特異性プロ
ーブ／オリゴ対を用いる）、BrdU または 細胞分裂アッセイによって、ZmCycDタ
ンパク質の存在に関しスクリーニングされることができる。
【０１３６】 B. 組織特異性または組織優先性プロモーター群 組織特異性プロモーターは、ZmCycDタンパク質をコード化するヌクレオチド配
列へと作動的に連結され得る。場合によって、組織特異性プロモーターは、ZmCy
cDをコード化するヌクレオチド配列へと作動的に連結可能なシグナル配列をコー
ド化するヌクレオチド配列へと作動的に連結可能である。組織特異性プロモータ
ーへと作動的に連結されたZmCycDをコード化する遺伝子で形質転換された植物は
、特定の組織において独占的にまたは優先的に、ZmCycDタンパク質を産生する。
【０１３７】 任意の組織特異性または組織優先性プロモーターが本発明において利用可能で
ある。代表的な組織特異性または組織優先性プロモーターは、例えば、ファセオ
リン遺伝子からのもの (Murai et al., Science 23:476-482 (1983)および Seng
upta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-3324 (1985))、na
pin プロモーター、(-conglycinin プロモーター、大豆レクチンプロモーター、
トウモロコシ 15 kD zeinプロモーター、 22 kD zein プロモーター、 (-zein
プロモーター, waxy プロモーター, shrunken 1 プロモーター、グロブリン−１
プロモーター およびshrunken 2 プロモーター (Thompson, et al.; BioEssays
; Vol. 10; p. 108; (1989) などといった種子優先性プロモーター； 例えば、cab または rubisco からのもの(Simpson et al., EMBO J. 4(11):27
23-2729 (1985) および Timko et al., Nature 318:579-582 (1985))のような葉
特異性および光誘発プロモーター； 例えば、LAT52 からのもの(Twell et al., Mol. Gen. Genet. 217:240-245 (1
989))のような葯特異性プロモーター； 例えば、Zm13からのもの(Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 224:161-168 (
1993)) のような花粉特異性プロモーター；または、 例えば、apg からのもの(Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (199
3))のような小胞子優先性プロモーターを包含する。
【０１３８】 発現ベクターは、細胞周期タンパク質をコード化するヌクレオチド配列に作動
的に連結された組織特異性または組織優先性プロモーターを有する。発現ベクタ
ーは、植物細胞へと導入される。該細胞は、上記したような、BrdU または 細胞
分裂アッセイのいずれかによって、細胞周期タンパク質の存在に関しスクリーニ
ングされる。
【０１３９】 C. 構成プロモーター群 構成プロモーターは、細胞周期タンパク質をコード化するヌクレオチド配列へ
と作動的に連結され得る。または、構成プロモーターは、細胞周期タンパク質を
コード化するヌクレオチド配列へと作動的に連結可能なシグナル配列をコード化
するヌクレオチド配列へと作動的に連結可能である。
【０１４０】 多くの種々の構成プロモーター群が、本発明において利用可能である。代表的
な構成プロモーターは、例えば、 CaMV からの35S プロモーター(Odell et al.,
Nature 313:810-812 (1985))、 ツユクサ黄色斑紋ウィルス（Commelina yellow
mottled virus ）(R. Torbert et al., Plant Cell Rep. 17:284-287 (1988))
のような植物ウィルスからのプロモーター群、並びに、 例えば、コメ アクチン (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990))、
ユビキチン(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) および
Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992))、pEMU (Last et
al., Theor. Appl. Genet. 81: 581-588 (1991))、MAS (Velten et al., EMBO J
. 3:2723-2730 (1984))およびトウモロコシH3 ヒストン (Lepetit et al., Mol.
Gen. Genet. 231:276-285 (1992) および Atanassova et al., Plant Journal
2(3):291-300 (1992))のような遺伝子からのプロモーター群を包含する。
【０１４１】 アブラナ属ナプス（Brassica napus ）のALS3構造遺伝子の5'末端までのXbaI/
NcoI フラグメント(あるいはXbaI/NcoIフラグメントと実質的な配列類似性を有
するヌクレオチド配列)である、 ALS プロモーターが、特に有用な構造プロモー
ターである（同時継続しているパイオニア ハイ−ブレッド インターナショナ
ル イネ国特許出願番号第08/409,297号）。
【０１４２】 発現ベクターは、植物細胞へと導入され、そして、予定形質転換細胞が、上記
したようなBrdU または 細胞分裂アッセイのいずれかによって、細胞周期タンパ
ク質の存在に関しスクリーニングされる。
【０１４３】 あるいはまた、植物プロモーターは、特定の組織において、または、より正確
な環境的または発生的制御下において、本発明のポリヌクレオチドを直接発現で
きる。このようなプロモーターは、本明細書において「誘発性（inducible）」
プロモーターと呼称される。誘発性プロモーターによる転写をもたらし得る環境
条件は、病原体攻撃、好気性条件、または光の存在を包含する。誘発性プロモー
ターの例としては、低酸素または寒冷ストレスによって誘発可能なAdh1プロモー
ター、熱ストレスによって誘発可能なHsp70プロモーター、および光によって誘
発可能な PPDK プロモーターが挙げられる。
【０１４４】 発生的制御下におけるプロモーターの例は、葉、根、果実、種子または花のよ
うなある特定の組織においてのみ、ないしはある特定の組織に優先的に、転写を
開始するプロモーターを包含する。プロモーターの操作は、ゲノムにおけるそれ
の存在位置に依存してもまた変化し得る。これゆえ、誘発性プロモーターは、あ
る存在位置において、完全または部分的に構成的になる。
【０１４５】 異種および非異種（すなわち、内因性）のいずれのプロモーター群も、本発明
の核酸の発現をもたらすために用いることができる。これらのプロモーター群は
また、例えば、 組換え型発現カセットにおいて、細胞周期定数および／または
所望する組織における組成を、減じる、増加させる、または変化させるためのア
ンチセンス核酸の発現を誘導するために用いられ得る。これゆえ、いくつかの実
施態様においては、核酸構成は、植物細胞における、例えば、トウモロコシ（Ze
a mays）において作用するプロモーターを有し、本発明のポリヌクレオチドと作
動的に連結される。このような実施態様において有用なプロモーター群は、本発
明のポリペプチドの発現をもたらす内因性プロモーター群を包含する。
【０１４６】 いくつかの実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドの発現をアップま
たはダウン規制するように、プロモーターまたはエンハンサー因子として働く単
離核酸が、本発明のポリヌクレオチドの非異種形態の適当な位置（通常、上流）
に導入されることができる。例えば、異種プロモーター群は、変異、欠失、およ
び／または置換によって生体内的に変容されることができ(Kmiec, イネ国特許第
5,565,350号; Zarling et al., PCT/US93/03868を参照のこと。)、また、単離
プロモーター群は、細胞周期遺伝子の発現を調整するように、この細胞周期遺伝
子から適当な方向に、適当な距離をおいて植物細胞中へ導入されることができる
。遺伝子発現は、細胞周期の内容および／または組成を変えるような植物成長に
適した条件下において変調され得る。これゆえ、本発明は、本発明のポリヌクレ
オチドの天然で、内因性（すなわち、非異種）の形態に対し作動的に連結された
、異種のプロモーター群またはエンハンサー群を調製するための組成および方法
を提供する。
【０１４７】 特別な発現パターンを用いて、例えば、組織タイプ、細胞タイプ、発生の段階
、および／または環境条件の点で、プロモーター群を同定する方法は、当分野に
おいて周知である。例えば、The Maize Handbook, Chapters 114-115, Freeling
and Walbot, Eds., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement,
3rd edition, Chapter 6, Sprague and Dudley, Eds., American Society of A
gronomy, Madison, Wisconsin (1988)を参照のこと。プロモーター単離方法にお
ける代表的な段階は、標的組織において、ある度合いの特異性を有して発現され
た遺伝子産物の同定である。ｃＤＮＡライブラリーへのディファレンシャルハイ
ブリッド形成法、差引きハイブリッド形成法、ディファレンシャルディスプレイ
、ディファレンシャル２−Ｄゲル電気泳動法、ＤＮＡプローブアレイ、および標
的細胞においてある特異性を持って発現するものであると知られているタンパク
質の単離が、手法群の範囲内である。これらの方法は、当業者に周知のものであ
る。例えば、クローンテック ユニバーサル ゲノムウォーカー キット（Clon
tech (Palo Alto, CA) Universal GenomeWalker Kit）などといった、プロモー
ター群を同定するために用いられる商業的に入手可能な製品は、当分野において
公知である。
【０１４８】 タンパク質−べース法にとって，アミノ酸配列を得ることは少なくとも同定さ
れたタンパク質の部分のためには有用である。核酸を調製するための基礎として
たんぱく質配列を使用する。該核酸は、ゲノミックＤＮＡを直接確認するか、ま
たは好ましくは標的組織から調製されたライブラリーからのｃＤＮＡクローンを
確認するプローブとして使用し得る。一度そのようなｃＤＮＡクローンが確認さ
れると、その配列は、示された遺伝子の転写の５'末端で配列を確認するのに使
用され得る。一度そのような配列が確認されると、タンパク質配列かまたは核酸
配列から出発して、遺伝子転写由来の確認されたこれらの配列は、標的器官から
調製されたゲノミックライブラリーをスクリーンするのに使用され得る。転写の
スタート部位を同定し、確認する方法はこの分野でよく知られている。
【０１４９】 特殊な環境の条件またはストレスの下で、又は特定の組織内で、或いは特殊な
発生段階で、発現された分離プロモーターの方法において、遺伝子の数は、所望
の環境で所望の組織でまたは所望の段階で発現することが確認される。さらなる
分析は、該植物の１つまたはそれ以上の組織でそれぞれ特殊な遺伝子の発現を示
すであろう。所望の組織または条件で活性を持つが、他の一般の組織で活性を有
しないプロモーターを確認し得る。
【０１５０】 プロモーター配列を確認するために、ここに記載のクローンの５'部分が、プ
ロモーター配列の配列特徴のために分析される。例えば，プロモーター配列エレ
メントは、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）を含み、それは
、通常、発現スタート部位の上流約２０乃至４０塩基ペアに位置する５−１０ｂ
ｐのＡＴ−リッチのストレッチである。ＴＡＴＡボックスの確認はこの技術分野
でよく知られている。例えば，このエレメントの位置を予測する１つの方法は、
プライマーエクテンション、Ｓ１分析、および/またはＲＮアース保護のような
スタンダードＲＮＡ―マッピング法を使用して、転写スタート部位を確認するこ
とである。ＡＴ−リッチ配列の存在を確認するためには、構造―機能分析を行う
ことが出来、推定領域の突然変異生成や、結合した下流のレポーター遺伝子の発
現に突然変異の影響の定量化を含んでいる。例えば、The Maize handbook, Chap
ter 114, Freeling and Walbot, Eds., Spring, New York,(1994)参照。
【０１５１】 植物において、ＴＡＴＡボックス,−８０乃至―１００位からさらに上流に、
トリヌクレオタイドＧ（またはＴ）を取り巻くアデニンのシリーズを有するプロ
モーターエレメント（即ちＣＡＡＴボックス）が一般的にはある。NG. J. Messi
ng et al., in Genetic Engineering in Plants, Kosage, Meredith and Hollae
nder, Eds., pp. 221-227 1983.とうもろこしにおいては、よく維持されたＣＡ
ＡＴボックスはないが、いくつかの短い維持されたタンパク質―結合モチーフが
ＴＡＴＡボックスの上流にある。これらは、各遺伝子に特有に、光調節、嫌気性
誘導、ホルモン調節、またはアントシアニン生合成に関係するトランス作用性転
写要素のためのモチーフを含んでいる。
【０１５２】 一度、プロモポーターおよび/あるいは遺伝子配列が知られれば、適当なサイ
ズの領域がゲノミックＤＮＡから選択され、それは、５'から転写開始または翻
訳開始部位までであり、そのような配列はコーディング配列に結合される。もし
転写開始部位が融合のポイントとして使われるならば、たくさんの可能な５'非
翻訳されていない領域が転写開始部位と部分的なコーディング配列との間で使用
可能である。もし、特定のプロモーターの３'末端で翻訳開始部位が使用される
ならば、それは、コーディング配列のメチオニン開始コドンに直接結合される。
【０１５３】 もし、ポリペプチド発現が望まれるのならば，ポリヌクレオチドコーディング
領域の３'末端でポリアデニル化領域を含むのが一般に望ましい。ポリアデニル
化領域は、天然の遺伝子から、種々の他の植物の遺伝子から、またはＴ−ＤＮＡ
から誘導できる。加えられるべき３'末端配列は例えば、ノパリンシンターゼま
たはオクトピンシンターゼ遺伝子、或いは他の植物遺伝子から、または好ましく
ないが、他の真核性の遺伝子から誘導することが出来る。
【０１５４】 イントロン配列は、細胞質ゾルに蓄積する成熟したメッセージの量を増大させ
るために５'非翻訳領域または部分的コーディング配列のコーディング配列へ加
えることが出来る。植物および動物両方の発現構成における転写ユニットにおい
て、接合可能なイントロンの封入はｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で１
０００倍まで遺伝子発現を増大することが示されてきた。Buchman and Berg, Mo
l. Cell Biol. 8:4395-4405(1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (
1987).遺伝子発現のそのようなイントロン増強は、転写ユニットの５'末端近く
に置かれたときに典型的には最も大きくなる。とうもろこしイントロンＡｄｈ１
−Ｓイントロン１，２、および６，Bronze-1イントロンは本分野で知られている
。The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Spring, Ne
w York(1994)参照。
【０１５５】 本発明のポリヌクレオチドからの配列からなるベクターは、典型的には、植物
細胞において選択可能な表現型を参照するマーカー遺伝子からなるであろう。通
常、選択可能なマーカー遺伝子は、適当な遺伝子で抗生物質抵抗性をコード化す
るであろう。適当な遺伝子は、抗生物質スペクチノマイシン（例えば、ａａｄａ
遺伝子）への抵抗性をコード化する遺伝子、ストレプトマイシン抵抗性をコード
するストレプトマイシンリン酸転移酵素（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシンまたは
ゲネチシン抵抗性をコード化するネオマイシンリン酸転移酵素（ＮＰＴ II）遺
伝子、ヒグロマイシン抵抗性をコード化するヒグロマイシンリン酸転移酵素（Ｈ
ＰＴ）遺伝子、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害する除草剤
への抵抗性をコード化する遺伝子、特に、スルホニル尿素―タイプ除草剤（例え
ば、特にＳ４および/またはＨｒａ突然変異における抵抗性を導く突然変異を含
むアセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子）への抵抗性をコード化する遺
伝子、ホスフィノトリシンまたはバスタ（basta）（例えば、bar遺伝子）のよう
な、または本技術分野で知られた他の遺伝子のようなグルタミンシンターゼの作
用を阻害する除草剤への抵抗性をコード化する遺伝子である。バー（bar）遺伝
子は、除草剤バスタへの抵抗性をコード化し、ｎｐｔII遺伝子は抗生物質カナマ
イシンおよびゲネチシンへの抵抗性をコード化し、そしてＡＬＳ遺伝子は除草剤
クロルスルフロンへの抵抗性をコード化する。
【０１５６】 高等植物における遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは、本技術分野でよ
く知られており、Meth. In Enzymol.153:253-277(1987) にRogersらにより記載
された、Agrobacterium tumefaciensの腫瘍―誘発（Ｔｉ）プラスミドから誘導
されたベクターを含む。これらのベクターは、植物組み込みベクターであり、形
質転換において、該ベクターはホスト植物のゲノムにベクターＤＮＡの一部を組
み込む。典型的な有用なA. tumefaciens ベクターは、SchradlらがGene 61:1-11
(1987)におよびBergerらがProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:8402-8406(1989)
に報告したプラスミドpKYLX6およびpKYLX7である。他の有用なベクターは、プラ
スミドpBI101.2であり、それはClontec Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)か
ら入手可能である。
【０１５７】 本発明のポリヌクレオチドは、所望により、センスまたはアンチセンスのどち
らの配向でも発現可能である。センスまたはアンチセンス配向のいずれの遺伝子
のコントロールは、観察できる植物の特徴に直接のインパクトをもつことが出来
ることがわかるであろう。アンチセンス法は、植物における遺伝子発現に便利に
使用し得る。これを完成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントはクロ
ーンされ、RNAのアンチセンスストランドが転写されるように、プロモーターに
結合される。構成は次いで植物に形質転換され、RNAのアンチセンスストランド
が生成される。植物の細胞においては、関心のある酵素をコード化するmRNAの蓄
積を避けることによってアンチセンスRNAが遺伝子発現するのを阻害しているこ
とがみられた。例えば、Sheehy et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:8805
-8809(1988);およびHiatt et al., U.S.Patent No.4,801,340参照。
【０１５８】 抑制の他の方法は、センス抑制である。センス配向に配列した核酸の導入は、
標的遺伝子の転写をブロックすることにより有効な手段と見られている。内因性
遺伝子の発現を調節するこの方法の使用の例は、Napoli et al., The Plant Cel
l 2:279-289(1990)およびU.S.Patent No.5,034,323を参照されたい。
【０１５９】 触媒的RNA分子またはリボザイムもまた植物遺伝子の抑制を阻害するのに使用
することが出来る。事実上どの標的RNAとペアにするリボザイムをデザインする
ことは可能であり、標的RNAを機能的に不活させる特定の位置でホスホジエステ
ルバックボーンを開裂させることも可能である。この開裂を実施するに当たり、
リボザイム自身は変わらないで、リサイクルが可能であり、他の分子を開裂させ
る。これはリボザイムを本当の酵素にしている。アンチセンスRNAs内のリボザイ
ム配列の封入は、それらへのRNA―開裂作用を与えており、その際コンストラク
トの活性を増大している。標的RNA―特異的リボザイムのデザインと使用はHasel
off et al., らにより、Nature 334:585-591(1988)に記載されている。
【０１６０】 種々の架橋剤、アルキル化剤および本発明のポリヌクレオチドにペンダント基
として形成させる基は、核酸を結合させ、ラベルし、検出し、そして/或いは開
裂させるのに使用可能である。例えば、Vlassov, V.V., et al.,はNucleic Acid
s Res. (1986) 14:4065-4076に、シングルーストランデッドDNAフラグメントと
標識配列に相補のヌクレオチドのアルキル誘導体との共有結合を記載している。
同じグループによる同様な研究がKnorre, D. G., et al.,によりBiochimi (1985
) 67:785-789に報告されている。IversonとDervanは、開裂を活性化し得る修飾
されたヌクレオチドの結合により媒介されたシングルーストランデッドDNAの配
列―特異的開裂を示した（J. Am. Chem. Soc. (1987) 109: 1241-1243）。Meyer
, R.B., et al., はJ. Am. Chem. Soc. (1989) 111: 8517-8519 で、シングルー
ストランデッド標的ヌクレオチド配列に相補のアルキル化剤を使用して標的ヌク
レオチドへ共有架橋結合を行ったことを報告している。ソラレン（ｐｓｏｒａｌ
ｅｎ）によって媒介されたシングルーストランデッドオリゴヌクレオチドへの光
活性化された架橋結合がLee, B. L. et al.,によりBiochemstry (1988) 27:3197
-3203に記載されている。トリプルーヘリックス形成プローブにおける架橋結合
の使用もHome, et al.,によりJ. Am. Chem. Soc. (1990) 112: 2435-2437に記載
されている。シングルーストランデッドオリゴヌクレオチドへの架橋結合のため
のアルキル化剤としてのN4,N4―エタノシトシンは、WebbおよびMatteucciにより
、J. Am. Chem. Soc. (1986) 108:2764-2765; Nucleic Acids Res. (1986) 14:7
661-7674;に、Feteriz et al., により、J. Am. Chem. Soc. 113:4000(1991)に
記載されている。核酸と結合させたり、検出したり、ラベルしたり、そして/或
いは開裂させたりするために、種々の化合物が本技術分野で知られている。例え
ば、U.S.Patent Nos. 5,543,507; 5,672,593; 5,484,908; 5,256,648;および5,6
81,941参照。
【０１６１】 タンパク質 単離された本発明のタンパク質は、より完全に上述されたような本発明のどの
ひとつのポリヌクレオチドにもコードされた、少なくとも10アミノ酸を持つポリ
ペプチド、あるいは保存的に修飾されたその誘導体ポリペプチドを含む。ポリペ
プチド配列の実例はSEQ ID No. ２、１２、１４または２４に示される。本発明
のタンパク質またはその誘導体は、本発明のポリペプチド由来の隣接するアミノ
酸のどの数も含むことができ、その数は10から全長細胞周期ポリペプチドの残基
数までからなる整数の群から選択される。場合によっては、この隣接するアミノ
酸のサブ配列（subsequence）は長さが、少なくとも、15、20、25、30、35また
は40アミノ酸、しばしば50、60、70、80または90アミノ酸である。さらに、その
ようなサブ配列の数は2、3、4、5のような1から20までからなる群から選択され
る任意の整数でありうる。
【０１６２】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドと同一の特異的な配列を有するポリペ
プチドを含むタンパク質を提供する。配列同一性のパーセントは60から99から成
る集合から選ばれた整数である。代表的な配列同一性値は、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、および99％を包含する。
【０１６３】 当業者が認めるように、本発明は、本発明の触媒的に活性のポリペプチド（即
ち酵素）を含む。触媒的に活性のポリペプチドは、天然（非合成）、内在性ポリ
ペプチド活性の、少なくとも20％、30％または40％、好ましくは少なくとも50％
、60％または70％、最も好ましくは少なくとも50％、60％または70％の特異的活
性を持つ。さらに、基質特異性（kcat/ Km）は、天然（非合成）、内在性ポリペ
プチドと同様である。代表的には、Kmは天然（非合成）、内在性ポリペプチドの
少なくとも30％、40％または50％、好ましくは少なくとも60％、70％、80％また
は90％である。酵素活性と基質特異性（kcat/ Km）を解析し、定量する方法は当
業者によく知られている。
【０１６４】 一般に、本発明のタンパク質は抗原として用いた場合、上述した本発明のポリ
ペプチドでコードされた本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体の産生を
引き出すであろう。ポリペプチドの実例には、完全長でSEQ ID No. ２、１２、
１４または２４に示されるようなものが含まれる。さらに、本発明のタンパク質
は、同一のポリペプチドで完全に免疫吸着した本発明のポリペプチドに対して生
じた抗血清とは結合しない。結合を決定するイムノアッセイは当業者の技法のイ
ムノアッセイがよく知られている。より好ましいイムノアッセイは、後で記載す
る競合イムノアッセイである。故に、本発明のタンパク質は、イムノアッセまた
はタンパク質精製技術のような典型的な利用に対して本発明のタンパク質に免疫
反応する抗体を構築するための免疫原として用いることができる。
【０１６５】宿主細胞におけるタンパク質の発現 本発明の核酸を使用して、細菌、酵母、昆虫、哺乳類、または好ましくは植物
細胞のような組換え操作された細胞における本発明のタンパク質の発現が可能と
なる。細胞は非天然の条件（例えば、量、組成、位置および／または時間の）に
おけるタンパク質を産生する。その理由は、それらは人間の干渉によって遺伝的
に変更されたからである。
【０１６６】 真核細胞において、非機能的融合タンパク質の過剰発現が所望されうる。発現
する細胞から融合タンパク質を単離し、精製した後、酵素分解を用いて機能を修
復し、精製CycDタンパク質にすることができる。また、CycDとの融合は、他の細
胞周期遺伝子を精製するための親和性マトリクスおよび親和性カラムに対する用
途を有し得る。例えば、“His-パッチ”チオレドキシン融合体を発現させ、単離
した融合タンパク質を金属キレートカラムに結合させることができる。次いで、
全細胞抽出物をカラムに通して、CycDと相互作用するタンパク質を選択的に捕集
することができる。一般的な方法については、Ausubel等, 1990年を参照のこと
。同様に、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ融合体を用いて、このタイプの
親和性結合のための固相マトリクスにタンパク質を結合させることができる。こ
の方法は、例えばL. Magnaghi-Jaulin等.,“網膜芽細胞腫タンパク質がヒストン
デアセチラーゼを用いることにより転写を抑制する”, Nature 391:601-604 (19
98) において、タンパク質がGST-Rbに結合する、その細胞周期遺伝子の特定に用
いられている。別の機能的遺伝子をCycD遺伝子と融合させることも有益である。
【０１６７】 当業者であれば、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に用いることが
できる数多くの発現系を知り得ると期待される。原核生物または真核生物におけ
るタンパク質の発現に関し公知の多様な方法を詳細に記載しない。
【０１６８】 簡潔な概要において、本発明のタンパク質をコードする単離した核酸の発現は
、典型的には、例えば DNAまたはcDNAをプロモーター（構成性または誘導性のも
の）に操作可能に連結され、次いで、発現ベクター中に組み込むことにより達成
される。このベクターは、原核生物でもまたは真核生物のいずれにおいても複製
および組込みに適しているものとすることができる。典型的発現ベクターは、転
写および翻訳ターミネーター、開始配列および本発明のタンパク質をコードする
DNAの発現の制御に有用なプロモーターを含む。クローン遺伝子のレベルの発現
を得るために、最低限で 、例えば、転写を導く強力なプロモーター、翻訳開始
のためリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含む発現ベクタ
ーを構築することが所望される。当業者であれば、本発明のタンパク質を、その
生物学的活性を低減させることなく修飾することができると認識するであろう。
若干の修飾は、クローニング、発現または融合タンパク質中への標的分子の組込
みを促進にすることができる。この種の修飾は当業者にとって周知であり、例え
ば、開始部位を提供するためにアミノ末端に添加されるメチオニン、または、都
合良く位置した制限酵素部位、終止コドン、あるいは精製配列を作成して位置さ
せるためにいずれかの末端に配置される付加的アミノ酸（例えばポリHis）を包
含する。
【０１６９】 A. 原核生物における発現 原核細胞は、発現のための宿主として用いることができる。原核生物は、Ｅ.
ｃｏｌｉの種々の菌株により最も頻繁に代表されるが、他の微生物の菌株も、ま
た用いることができる。本明細書で定義される一般的に用いられる原核細胞の制
御配列は転写開始のためプロモータを含むように、また場合によってはオペレー
ターを有し、リボソーム結合部位配列を包含し、β−ラクタマーゼ（ペニシリナ
ーゼ）およびラクトース（lac）プロモータシステム(Chang et al., Nature 198
:1056 (1977))、トリプトファン（trp）プロモータシステム(Goeddel et al., N
ucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) およびλ誘導P LプロモータおよびN-ジーン
リボソーム結合サイト(Shimatake et al., Nature 292:128 (1981))のような、
汎用のプロモーターを包含するものである。Ｅ.ｃｏｌｉ中にトランスフェクシ
ョンされるDNAベクターに選択マーカーを包含させることもまた有用である。こ
のようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリンまたはクロラムフェ
ニコールに対する抵抗性を示す遺伝子を含む。
【０１７０】 ベクターは、適当な宿主細胞に遺伝子導入するために選択される。代表的な細
菌ベクターは、プラスミドまたはバクテリオファージ起源のものである。適当な
細菌細胞は、ファージベクター粒子に感染させるかまたは裸のファージベクター
DNAでトランスフェクションする。プラスミドベクターが使われる場合、細菌細
胞はプラスミドベクターDNAで形質転換される。本発明のタンパク質を発現する
ための発現系は、バシルス種およびサルモネラ菌を用いるものが利用可能である
(Palva, et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach, et al., Nature 302: 54
3-545 (1983))。
【０１７１】 B. 真核生物の発現 多くの真核生物の発現系、例えば酵母、昆虫細胞系、植物および哺乳類の細胞
は、当業者にとって公知である。以下に簡潔に説明するように、本発明のものは
これらの真核系において発現させることができる。いくつかの態様において、以
下に詳述するように、形質転換/トランスフェクションされた植物細胞は、本発
明のタンパク質を産生するのための発現系として使用される。
【０１７２】 酵母における異種タンパク質の合成は周知である。Sherman, F., et al., Met
hods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)）は、酵母に
おいてタンパク質を産生するために利用できる種々の方法を記載する良く知られ
た研究である。適切なベクターは、通常、例えば3-ホスホグリセリン酸キナーゼ
またはアルコールオキシダーゼを含むプロモーターなどの発現制御配列、および
複製オリジン、末端配列およびその他の望まれるものを有する。例えば好適なベ
クターは文献（Botstein et al., Gene 8: 17-24(1979); Broach et al.,
Gene 8: 121-133(1979))に記載されている。
【０１７３】 本発明のタンパク質はいったん発現させて、細胞を溶解させ、そして標準的タ
ンパク質分離技術を溶解物に適用することにより酵母から分離することができる
。精製法の監視は、その他の標準的免疫検定技術であるウェスタンブロッティン
グ法またはラジオイムノアッセイを用いて行うことができる。
【０１７４】 本発明のタンパク質をコードする配列が、また、種々の発現ベクター、例えば
哺乳類、昆虫または植物起源の形質転換細胞培養において用いられる発現ベクタ
ーと連結させることができる。ペプチドの製造に有用な細胞培養の例は哺乳類細
胞培養である。哺乳類の細胞系はしばしば単層の細胞の形態のものであるが、哺
乳類細胞懸濁液もまた用いることができる。未損傷のタンパク質を発現しうるい
くつかの適切な宿主細胞系は当該分野において開発されており、HEK293、BHK21
およびCHO細胞系が包含される。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制
御配列、例えば複製オリジン、プロモーター（例えばCMVプロモータ、HSV tkプ
ロモータまたはpgk（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）、エンハン
サー(Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986))、そして、必要なプロセシ
ング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAプロセッシング部位、ポリアデ
ニル化部位（例えばSV40ラージT Ag ポリＡ付加部位）、および転写終止配列を
包含しうる。本発明のタンパク質の産生に有用な他の動物の細胞は 、例えば、t
he American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridom
as (7th edition, 1992)から入手可能である。
【０１７５】 昆虫細胞において本発明のタンパク質を発現するための適当なベクターは、通
常SF9 バクロウィルス由来のものである。適切な昆虫細胞系は、ボウフラ、カイ
コ、ヨトウムシ、蛾およびシュナイダー細胞系などのショウジョウバエ細胞系を
含む（Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365 (1987)を参照）。
【０１７６】 酵母と同様に、より高等な動物または植物宿主細胞を使用する場合には、ポリ
アデニル化シグナルまたは転写終止配列は典型的にベクターに組み込まれる。終
止配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。 配列は、また、転写物を正確にスプライスするための配列を包含させることがで
きる。スプライシング配列の例は、SV40由来のVP1イントロンである(Sprague, e
t al., J. Virol. 45: 773−781 (1983))。加えて、宿主細胞において複製を制
御するための遺伝子配列を、ウシ乳頭腫ウイルス型ベクターにおいて見出される
ように、ベクターに組み込むことができる(Saveria-Campo, M., Bovine Papillo
ma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol. II a Practi
cal Approach, D.M. Glover, Ed., IRL Press, Arlington, Virginia pp. 213-2
38 (1985))。
【０１７７】２ハイブリッド系の使用 ２ハイブリッド系を使用する遺伝学的手法においてクローン化されるトウモロ
コシCycD遺伝子の重要な用途は、相互作用するタンパク質、即ちCycD遺伝子にコ
ードされる産物と特異的に相互作用するタンパク質を特定することである。この
方法は、典型的には酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いて行うものであるが、
機能的な転写因子を２つの成分；ＤＮＡ結合因子および活性化ドメインに分離し
て、互いに非共有結合を保持するときに、ＤＮＡと結合して転写を活性化すると
いうことを利用する。この試験系は次のようにして構築する：ＤＮＡ結合ドメイ
ンをレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼの５'に位置させ、この発現カセ
ットで酵母株を形質転換する。転写因子のＤＮＡ結合ドメインの核酸配列をこの
遺伝子（または遺伝子の部分配列）に連結してベイトとして用いる。このＤＮＡ
結合ドメイン−ベイト融合体の発現は、例えば酵母adh1プロモーターにより誘導
させる。遺伝子融合体のライブラリーは、遺伝子（または遺伝子の断片）と融合
した転写因子の活性化ドメインを用いて目的の発現ライブラリー（活性化ドメイ
ンハイブリッドと称する）から作成した。活性化ドメイン・ハイブリッドの発現
はまた、例えば酵母adh1プロモーターを用いて行う。２ハイブリッドスクリーニ
ングを実施するために、ＤＮＡ結合ドメイン・ハイブリッドをコードするプラス
ミドと活性化ドメイン・ハイブリッドのライブラリーを、既に不活性なレポータ
ーを含有する酵母株に（連続的にまたは同時に）導入する。活性化ドメイン・ハ
イブリッドが特異的にＤＮＡ結合ドメイン・ハイブリッドと結合している形質転
換した酵母は、ルシフェラーゼを発現する。陽性は、さらに配列分析、さらに生
物学的相互作用の適合性の試験により特徴付ける。
【０１７８】 共通して使用するＤＮＡ結合ドメインは、E. coliにおけるlexAタンパク質お
よび酵母におけるGa14タンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインを包含する。同様に
、共通して使用する活性化ドメインは、B42（細菌）およびGa14（酵母）を包含
する。詳細については、Hannon G,とBartel P, Identification of interacting
proteins using the two-hybrid system, Methods Mol. Cellular Biol. 5:289
-297 (1995)を参照のこと。
【０１７９】細胞のトランスフェクション／形質転換 トランスフェクション／形質転換の方法は本発明にとって重要ではない。多様
なトランスフェクションまたは形質転換の方法が現在利用できる。より新しい方
法が、作物やその他の宿主細胞を形質転換するのに利用されているので、それら
を直ぐに応用することができる。故に、生物において表現型の変化に影響する配
列の転写および／または翻訳を得るために、宿主細胞のゲノムにDNA配列を挿入
する非常に多様な方法が開発されている。従って、効果的なトランスフェクショ
ン／形質転換を提供する任意の方法を使用することができる。
【０１８０】 Ａ．植物の形質転換 本発明の所望のポリヌクレオチドをコードするDNA配列、例えば全長のタンパ
ク質をコードするcDNAまたはゲノム上の配列は、所望の植物中に導入され得る組
換え発現カセットの構築に用いられている。
【０１８１】 遺伝子の形質転換方法 外来性遺伝子を植物に導入する多くの方法が知られており、これを用いて植物
宿主に目的の細胞周期遺伝子を挿入することができ、これには生物学的および物
理的な植物形質転換プロトコルが包含される。例えば、Miki等, 1993, "Procedu
re for Introducing Foreign DNA into Plants," In: Methods in Plant Molecu
lar Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc.
, Boca Raton, 第67-88頁を参照のこと。選択された方法は宿主植物によって変
わるが、これにはリン酸カルシウム法などの化学的トランスフェクション法、Ag
robacteriumなどの微生物媒介遺伝子導入法（Horsch,等, Science 227:1229-31,
1985）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよび物分解性
照射法[biolistic bombardment]が包含される。
【０１８２】 発現カセット、ベクター、植物細胞または組織のインビトロ培養法、植物の形
質転換および再生法は知られており、利用可能である。例えば、Gruber, 等, 19
93, "Vectors for Plant Transformation" In: Methods in Plant Molecular Bi
ology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca
Raton, 第89-119頁を参照のこと。
【０１８３】Agrobacterium−媒介形質転換 最も広く利用されている発現ベクターを植物に導入する方法は、Agrobacteriu
mの天然の形質転換系に基づくものである。A. tumefaciens およびA. rhizogene
s が植物病原性細菌であり、遺伝学的に植物細胞を形質転換する。A. tumefacie
ns およびA. rhizogenes,のＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドは植物の遺伝
学的形質転換の原因となる遺伝子を運搬する。例えば、Kado, 1991, Crit. Rev.
Plant Sci. 10:1を参照のこと。Agrobacteriumベクター系およびAgrobacterium
−媒介遺伝子導入法の記載は、上述のGruber 等,; 上述のMiki, 等; および Mo
loney等, 1989, Plant Cell Reports 8:238に与えられている。
【０１８４】直接的遺伝子導入法 イネについてのAgrobacterium−媒介形質転換法は（Hiei等., 1994, The Plan
t Journal 6:271-282）に、トウモロコシについては（Ishida等, 1996, Nature
/ Biotechnology 14:745-750）に開示されている。総称して直接的遺伝子導入法
と称する幾つかの植物の形質転換法が、Agrobacterium−媒介形質転換に代わる
ものとして開発されている。サトウモロコシにおけるAgrobacterium−媒介形質
転換法はWO 98/49332に開示されている。トウモロコシにおけるAgrobacterium−
媒介形質転換法はWO 98/32326に開示されている。
【０１８５】 植物形質転換の一般に適用できる方法は、ミクロ投射媒介形質転換(microproj
ectile-mediated transformation)であり、そこにおいて、DNAは、約1〜4マイク
ロメートルを計測するミクロ投射器の表層で運ばれる。発現ベクターは、 植物
細胞壁および膜を通過するのに十分な速度である300〜600m/sの速度にミクロ投
射器を加速する生化学者的装置で、植物組織へと導入される(Sanford et al.,
(1987), Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford, 1988, Trends Biotech 6:299; S
anford, (1990), Physiol. Plant 79:206; Klein et al., (1992), Biotechnolo
gy 10:268)。
【０１８６】 植物に対するDNAの物理的な配給のための他の方法が、ザンら（Zang et al.,
(1991), BioTechnology 9:996.1）において述べられるように、標的細胞の超音
波処理である。あるいはまた、リポソームまたはスフェロプラスト融解が、 発
現ベクターを植物中に導入するために用いられている。例えば、Deshayes et al
., (1985), EMBO J. 4:2731; and Christou et al., (1987), PNAS USA 84:3962
を参照のこと。CaCl2沈降、ポリビニルアルコールまたはpoly-L-オルニチンを使
用する原形質体へのDNAの直接の摂取が、また、報告されている。例えば、Hain
et al., (1985), Mol. Gen. Genet. 199:161; and Draper et al., (1982), Pla
nt Cell Physiol. 23:451を参照のこと。
【０１８７】 原形質体および全細胞および組織のエレクトロポレーションもまた開示されて
いる。例えば、Donn et al., (1990), In:Abstracts of the VIIth Int'l. Cong
ress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, page 53; D'Halluin e
t al., (1992), Plant Cell 4:1495-1505; and Spencer et al., (1994), Plant
Mol. Biol. 24:51-61を参照のこと。
【０１８８】 完全な植物細胞へのＤＮＡのマイクロインジェクションもまた、プロトプラス
トへのマイクロインジェクションのように記載されている。例えば完全な細胞に
ついてはNeuhaus等, 1987, Theor. Appl. Genet. 75:30-36 を、そしてプロトプ
ラストについてはCrossway等., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185; およびR
eich等, 1986, Biotechnology 4:1001-1004を参照のこと。
【０１８９】粒子損傷[Particle Wounding]／Agrobacteriumデリバリー 他の有用な基本的な形質転換プロトコルには、Bidney,等., Plant Mol. Biol.
18:301-313 (1992).により記載されるように、粒子照射による損傷とその後の
ＤＮＡのデリバリーのためのAgrobacteriumの使用との組合せが含まれる。植物
の形質転換に有用なプラスミドにはPHP9762が含まれる。PHP9762についてにバイ
ナリーバックボーンはbin 19である。Bevan, Nucleic Acids Research 12:8711-
8721 (1984)を参照のこと。
【０１９０】 一般的に、目的の分裂組織の形質転換法は、種子に暗室中にて２４時間吸水さ
せ、子葉および根の基を除去し、次いで分裂組織の移植体を培養すること含む。
２４時間後、第一葉を取り出して、頂端分裂組織に露呈する。移植体を頂端ドー
ムの側面に置き、例えば粒子で２回照射し、次いでAgrobacteriumと共培養する
。目的の分裂組織について共培養を開始するために、Agrobacteriumを分裂組織
上に置く。約３日間のの共培養後、セフォタキシムを含む（NPTII選択のための
カナマイシンを添加）培養培地に分裂組織を移す。選択はカナマイシンを用いて
行うことができる。
【０１９１】 分裂した分裂組織の方法は、種子の吸水、子葉を崩壊させて胚軸の平面に無菌
の損傷を形成させること、根の先端を切除すること、次いで始原葉間において移
植体を縦に二等分することを含む。二等分したものを培地上の切り口に置き、次
いで粒子で２回照射して、Agrobacteriumと共培養する。分裂組織については、
分裂組織をAgrobacterium懸濁液中に３０分間置く。次いでこれらを懸濁液から
固体培地に移して、３日間共培養する。この期間後、分裂組織はセフォタキシム
を含む（NPTII選択のためのカナマイシンを添加）新鮮な培養培地に移す。
【０１９２】植物交配による運搬 一度、単一の形質転換植物、例えば所望の遺伝子で形質転換した植物が前述の
組換えＤＮＡ法により得られると、慣用される植物交配法を用いて、構造遺伝子
を運搬させることおよび交配および戻し交配を介して制御配列と結合させること
ができる。一般的に、そのような植物交配の技術は、所望の遺伝子を特定の農作
物中に運搬させるために使用されている。本発明において、そのような方法は、
次の段階：（１）形質転換した植物を第２の未形質転換植物と有性交配させ；（
２）交配の子孫由来の生殖体を回収し；そして（３）生殖体から形質転換含有植
物を生長させることを含む。
【０１９３】 本発明において単離された核酸は、当該技術分野において知られている技術に
従って植物体中に導入することができる。一般に、上記されたような組換え発現
カセットや、植物細胞の形質転換に適した組換え発現カセットが用意される。非
常に多様な高等植物種の形質導入の技術は良く知られており、技術、科学および
特許の文献に記載されている。例えば、Weising et al. Ann. Rev. Genet. 22:4
21-477(1988) を参照。例えば、DNAコンストラクト、エレクトロポレーション、
PEGポレーション、粒子銃法（パーティクルボンバードメント）、シリコンファ
イバーデリバリー、植物細胞のプロトプラストまたは胚性カルスのような技術を
用いて、植物細胞のゲノムDNAに直接導入することができる。また、DNAコンスト
ラクトが適当なT-DNAフランキング領域と結合され、従来のAgrobacterium tumef
aciens 宿主ベクターに導入される。細胞がバクテリアに感染し際に、Agrobacte
rium tumefaciens 宿主の病原性は、コンストラクトと隣接しているマーカーを
植物細胞DNAに挿入する。
【０１９４】 ポリエチレングリコール沈殿を用いたDNAコンストラクトの導入はPanszkowski
et al., Embo J. 3:2717-2722 (1984)に記載されている。。エレクトロポレー
ションの技術はFromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985) に記
載されている。衝撃的（ballistic）形質転換の技術はKlein et al., Nature 32
7:70-73(1987)に記載されている。
【０１９５】 Agrobacterium tumefaciensを媒介した形質転換技術は、科学文献に詳細に記
載されている。例えば、Horsch et al., Science 233: 496-498(1984) やFraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803 (1983)を
参照。Agrobacteriumは双子葉植物に主に有効であったが、ある種の単子葉植物
もまたAgrobacteriumにより形質転換さすることができる。例えば、トウモロコ
シのAgrobacteriumによる形質転換はイネ国特許第5,550,318号に記載されている
。
【０１９６】 トランスフェクションまたは形質転換の他の方法は、（１）Agrobacterium rh
izogenesを媒介とする形質転換（例えば、Lichtenstein and Fuller In: Geneti
c Engineering, vol.6, PWJ Rigby, Ed., London ,Academic Press (1987) やLi
chtenstein, C.P., and Draper, J., DNA Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed
.,Oxford, IRI Press, (1985)を参照）、特許出願PCT/US87/02512 (1988年4月7
日に公開されたWO 88/02405)にA. tumefaciensベクターpARC8またはpARC16とと
もに、A. rhizogenes株A4とそのRiプラスミドの利用が記載されている、(2)リポ
ソーム媒介のDNA取り込み（例えば、Freeman et al., Plant cell Physiol. 25:
135, 1984を参照）、（３）ボルテックス法 （例えば、Kindle, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 87: 1228 (1990)を参照）を包含する。
【０１９７】 DNAは、Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, In
tern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plane Mol. Biol. Reporter,
6: 165(1988)ににより記載されているように、花粉の中への直接的なDNA導入に
より植物体中に導入することができる。遺伝子のコードするポリペプチドの発現
は、Pena et al., Nature, 325: 274 (1987)に記載されているように、植物体の
生殖器官へのDNA注入によって得られる。Neuhaus et al., Theor. Appl. genet.
, 75:30 (1987) やBenbrook et al., in Poceedings Bio Expo 1986, Buterwort
h, Stoneham, Mass., pp.27-54 (1986)に記載されているように未成熟胚の細胞
や乾燥させた胚を再水和したものに直接的にDNAを注入することもできる。ベク
ターとして使用されている多くの種類の植物ウィルスも当該技術分野において知
られており、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)、ジェミニウィルス、ブロム
モザイクウィルスおよびタバコモザイクウィルスが包含される。
【０１９８】 Ｂ． 原核生物、下等な真核生物および動物細胞のトランスフェクション 動物や下等な真核生物（例えば酵母）の宿主細胞は、様々な手段によりトラン
スフェクションに有用であるかまたは有用になる。動物細胞にDNAを導入するた
めの、いくつかのよく知られている方法がある。これらはリン酸カルシウム法、
DNAを含むバクテリアのプロトプラストを受容細胞に融合させること、DNAを含む
リポソームで受容細胞を処理すること、DEAEデキストラン、エレクトロポレーシ
ョン、バイオリスティック（注：パーティクルガンと金粒子を用いた方法）、細
胞への直接的なDNAのマイクロインジェクションなどを包含する。トランスフェ
クションされた細胞は当該技術分野においてよく知られた方法により培養される
。Kuchler, R.J., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowde
n, Hutchinson and Ross, Inc. (1977) 。
【０１９９】タンパク質合成 本発明のタンパク質は細胞外合成法を用いて構築することができる。長さが約
50アミノ酸以下のタンパク質の固相合成は、順次、不溶性の支持体にＣ末端側の
アミノ酸を付加し、次いで残留するアミノ酸の配列に引き続いて付加されること
により実施される。固相合成の技術はBarany and Merrifield, Solid-Phase Pep
tide Synthesis, pp.3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology.
Vol.2: Special Methods in peptide Synthesis, Part A.; やMerrifield, et.
al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156(1963) またはStewart et al., Solid Ph
ase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)
に記載されている。より大きな長さのタンパク質はアミンと短い断片のカルボキ
シル残基の縮合によって合成することができる。カルボキシル終結末端の活性化
によるペプチド結合の形成方法（例えば、共役試薬N,N'-ジシクロヘキルカルボ
ジイミドの使用による）は当業者によく知られている。
【０２００】タンパク質の精製 本発明のタンパク質は、当業者に知られた標準的方法により精製することがで
きる。本発明の組換えにより生成されたタンパク質は、直接的に発現させるか、
融合タンパク質として発現させることができる。組換えタンパク質は細胞破壊（
例えば音波処理、フレンチプレス）とアフィニティークロマトグラフィーの組み
合わせによって精製される。融合生成物においては、適切なタンパク質分解酵素
を用いた融合タンパク質の連続的な切断が、所望の組換えタンパク質を放出させ
る。
【０２０１】 本発明のタンパク質は、組換えまたは合成であっても、リン酸アンモニウムの
ような化学物質による選択的な沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫沈降法な
どを含む、当該技術分野においてよく知られている標準的な技術によって高い純
度で精製することができる。例えば、R. Scopes, Protein Purification: Princ
iples and Practice, Springer- Verlag: New York (1982)や Deutscher, Guide
to Protein Purification, Academic Press (1990)を参照。抗体は、例えば本
明細書に記載のタンパク質に対して生じさせることができる。E.coliからの精製
はイネ国特許第4,511,503号に記載される次の方法で実施することができる。タ
ンパク質は、そのタンパク質を発現している細胞から単離され、本明細書に記載
の標準的なタンパク質化学の技術により精製することができる。発現したタンパ
ク質の検出は、当該技術分野において知られている方法により実施することがで
き、これには、例えばラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット法または免疫
沈降法が包含される。
【０２０２】トランスジェニック植物の再生 任意の上記形質転換技術により誘導された形質転換植物細胞は形質転換した遺
伝子型を保持する完全な植物体に再生するために培養することができる。このよ
うな再生技術は、たびたび組織培養成長培地中のある植物ホルモンの操作に依存
し、典型的には本発明のポリヌクレオチドとともに導入された殺生物性または／
および殺植物性のマーカーに依存する。
【０２０３】 植物性発現ベクターを用いて形質転換した植物細胞は、標準的な植物の組織培
養法に従って、例えば単一細胞、カルスまたはリーフディスク葉原基から再生す
ることができる。当該技術分野においてよく知られていることだが、ほぼどんな
植物からでも、様々な細胞、組織、器官から完全な植物体を再生するように培養
できることが可能である。培養されたプロトプラストからの植物体の再生はEvan
s et al., Protoplaasts Isolation and culture, Handbook of Plant cell Cul
ture, Macmillilan Publishing Company, New York, pp.124-176 (1983)やBindi
ng, Regulation of Plants, Plant Protoplasts,, CRC Press, Boca Raton, pp.
21-73 (1985)に記載されている。
【０２０４】 形質転換した植物細胞、カルスまたはエクスプラントは暗所での再生培地上で
数週間、一般には約１〜３週間培養してソマティックエンブリオを成熟させる。
好適な再生培地はＭＳ塩例えばＰＨＩ−ＥおよびＰＨＩ−Ｆ培地を含む。植物細
胞、カルスまたはエクスプラントは次いで典型的には発根培地上でシュートおよ
び根が発達するまで明／暗サイクル中で培養される。植物再生方法はこの分野で
公知であって、好ましい方法は Kamoら（Bot. Gaz. 146(3); 324-334, 1985）、
Westら（The Plant Cell 5: 1361-1369, 1993）および Duncanら（Planta, 165:
322-332, 1985）により明らかにされている。
【０２０５】 小植物体は次いで発根培地を含むチューブに移植することができ、ほぼ次の週
の間成長し、より発根するようにされる。植物は次いで温室中のポットの中の土
壌混合物に移植することができる。
【０２０６】 Horsch et al., Science, 227: 1229-1231 (1985) に記載されているように
、葉の外植体からAgrobacteriumにより導入された外来製遺伝子を含む植物の再
生を実施することができる。Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
80:4803(1983)の示すように、この方法において、形質転換体は、選択試薬の存
在下および形質転換された植物種の芽の再生が誘導される培地中において生育さ
せる。この方法は、一般的に２から４週間以内に芽を生じ、次いでこれらの形質
転換体の芽は選択試薬および最近の増殖抑制する抗生物質を含んだ適当な根誘導
培地に移される。本研究のトランスジェニック植物は稔性または不稔性でありう
る。
【０２０７】 植物のカルス、外植体、器官またはそれらからの一部分から再生させることが
できる。そのような再生技術は、通常、Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys
. 38: 467-486に記載されている。それぞれの単一植物のプロトプラストまたは
種々の外植体からの植物体の再生は、当該技術分野においてよく知られている。
例えば、Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissba
ch, eds., Academic Press, Inc., Sandiego, Calif. (1988) を参照。この再生
と発育の過程は組換え体の細胞および芽の選択、組換え体の芽の植え付け、およ
び土壌での苗木の生育の段階を包含する。トウモロコシの細胞培養および再生に
ついては、一般的にThe Maize Handbook, Freeling and Walbot, Eds., Springe
r, New York (1994);および Corn and Corn Improvement, 3rd edition, Spragu
e and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (198
8) を参照。
【０２０８】 一つの技術は組換え発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に組み込
まれ、作動性と確認された後で、有性交配によって他の植物体に導入することが
できる。数多全ての任意の標準的な繁殖技術を交配する種次第では使用すること
ができる。
【０２０９】 増殖作物において、成熟したトランスジェニック植物は挿し木を行うことによ
って、または、または多数の同一 植物を生産する組織培養技術によって繁殖さ
せることが可能である。所望されるトランスジェニック体を選択し、新しい変種
が得て、商業的な利用のために栄養繁殖させる。種子による繁殖させた作物にお
いては、成熟したトランスジェニック植物を自家交配して、同型の近交植物を産
生する。近交植物は新しく導入された異種由来の核酸を含む種子を生産する。こ
れらの種子を生育させて、選択された表現型を示す植物を生産することができる
（例えば変化した細胞周期コンテントまたは組成のもの）。
【０２１０】 再生された植物から得られた一部分、即ち花、種子、葉、枝、果実などは、こ
れらの部分が本発明において単離された核酸を含む細胞からなる場合には、本発
明に包含される。子孫と変種、そして再生された植物体の突然変異株もまた、こ
れらの部分が導入された核酸配列を保持するならば、本発明の範囲内の包含され
る。
【０２１１】 選択マーカーを発現するトランスジェニック植物は、例えば標準的なイムノブ
ロット法とDNA検出技術によって、本発明の核酸の伝播についてスクリーニング
することができる。トランスジェニック系統もまた、典型的に異種の核酸の発現
レベルにより評価される。RNAレベルの発現は最初に測定し、発現が陽性な植物
体を認識し、定量することができる。RNA解析の標準的な技術は利用されており
、異種由来のRNA鋳型だけを増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチド
プライマーを用いたPCR増幅分析、および異種由来の核酸特異的なプローブを用
いた溶液ハイブリダイゼーションアッセイを包含する。次いでRNA陽性植物体は
、本発明の特異的反応性の抗体を用いたウエスタンイムノブロット分析により、
タンパク質の発現を分析することができる。加えて、標準的なプロトコールによ
るｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学法は、それぞれ、
異種由来の核酸に特異的なプローブと抗体を用いて実施され、トランスジェニッ
ク細胞内での発現部位の限定することができる。一般的に多数のトランスジェニ
ック系統は通常、組み込まれた核酸についてスクリーニングされ、最も適切な発
現特性を有する植物を同定して選択する。
【０２１２】 好ましい態様は、添加した異種由来の核酸に同質であるトランスジェニック植
物、即ち２つの付加された核酸配列、染色体対のそれぞれの染色体の同じ遺伝子
座に位置する１つの遺伝子を保持するトランスジェニック植物である。同質のト
ランスジェニック植物は単一の付加された異種由来の核酸を保持する異質性のト
ランスジェニック植物を有性交配（自殖）し、生産された種子のうちの一部を発
芽させ、その結果生産された植物体をコントロールの植物体（すなわち、自生種
、非トランスジェニック体）と比較して細胞分割の変化を解析することにより得
られる。親世代の植物体との戻し交配や非トランスジェニック植物体との異系交
配もまた考慮される。
【０２１３】細胞周期タンパク質の含量および／または組成の調節 さらに本発明は、植物またはその部分において細胞周期タンパク質の含量また
は組成を調節する（即ち増加または減少させる）方法を提供する。調節は、植物
において細胞周期タンパク質の含量（即ち、細胞周期タンパク質の総量）および
／または細胞周期タンパク質の組成（植物における種々の細胞周期モノマーの比
率）を増加または減少させることにより行うことができる。方法は、上述した本
発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現カセットで一時的にまたは安定的に植
物細胞を形質転換して形質転換植物細胞を得ることからなる。安定的な形質転換
植物細胞のためには、植物形成条件下で形質転換した植物細胞を増殖させ、植物
または植物の部分において細胞周期タンパク質の含量および／または組成を調節
するのに十分な時間にわたり、本発明のポリヌクレオチドの発現を誘導させる。
【０２１４】 いくつかの態様において、植物の細胞分裂は、インビボまたはインビトロで未
単離の細胞周期遺伝子のプロモーターを変更させて、遺伝子発現の上方または下
方制御することにより調節することができる。いくつかの態様において、天然の
細胞周期遺伝子のコーディング領域は置換、添加、挿入または欠失を介して変更
させて、コードされる酵素の活性を減少させることができる。例えば、Kmiec,
イネ国特許第5,565,350号；Zarling等, PCT/US93/03868を参照のこと。そしてい
くつかの態様において、プロモーターを含む単離した核酸（例えばベクター）は
植物細胞中にトランスフェクションする。次いで、本発明のポリヌクレオチドに
作動的に連結されたプロモーターを含む植物細胞は、当業者に知られた方法、例
えばサザンブロット、ＤＮＡシーケンスまたはプロモータおよび遺伝子に特異的
なプライマーを用いて、そこから産生される増幅物[amplicon]を検出するＰＣＲ
分析により選択されるが、これらに限定されるものではない。前述の態様により
変更または修飾された植物または植物の部分は、植物において細胞周期タンパク
質の含量および／または組成を調節するのに十分な時間にわたり植物形成条件下
にて生長させる。植物形成条件は当該技術分野において知られており、既に簡単
に述べている。
【０２１５】 一般的に、含量または組成は、前述の組換え発現カセットを欠いている天然の
対照の植物、植物の部分または細胞と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％
、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％増加または減
少している。本発明における調節は、発生の所望の段階まで植物を生長させる間
および／または成長した後に起こりうる。一時的および／または特定の組織にお
ける核酸の発現の調節は、既に詳細に述べているように、本発明のポリヌクレオ
チドに作動的に、例えばセンスまたはアンチセンスの向きで連結された適当なプ
ロモーターを用いることにより制御することができる。また、本発明のポリヌク
レオチドの発現の誘導は、誘導性化合物の有効量の外からの投与によって制御す
ることができる。誘導性プロモーターおよび誘導性化合物は当該技術分野におい
て知られている。特に好ましい態様において、細胞分裂は単子葉類、特にトウモ
ロコシにおいて調節される。
【０２１６】分子マーカー 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む植物体の遺伝子型を決定する方法
を提供する。遺伝子型決定は染色体対の相同性を区別する方法を提供し、植物体
の個体群を分離することに使用できる。分子マーカー法は系統学、穀物品種間の
遺伝的関係の記述、交雑性または体細胞性の雑種の同定、単一遺伝子の特徴に作
用する染色体の位置の同定、クローニングに基づくマッピング、量的な遺伝形質
の研究に使用することができる。例えば、Plant Molecular Biology: A Laborat
ory Manual, Chapter 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997)を参照
。分子マーカー法については、一般的なThe DNA Revolution by Andrew H. Pate
rson 1996 (Chapter 2) in: Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Paters
on) by Academic Press/R. G. Landis Company, Austin, Texas, pp.7-21を参照
。
【０２１７】 本発明における遺伝子型決定の特別な方法は、制限断片長多型性（RFLP）のよ
うな、また、これに限らず、分子マーカー分析技術をいくつも使用することがで
きる。RFLPは、核酸配列の多様性によって生じた対立遺伝子のDNA制限断片間の
対立遺伝子間の差異の結果である。当業者に良く知られているように、RFLPは一
般的にゲノムDNAの抽出と制限酵素による消化によって検出される。一般的には
、その結果生じた断片は長さに従って分離され、プローブ（1コピーのプローブ
が好ましい）でハイブリダイズさせる。相同染色体に由来する制限断片が明らか
になる。対立遺伝子間の断片長の違いはRFLPを示す。従って、本発明は、RFLP解
析のような技術を用いることによって、染色体の配列と同様に、これらの遺伝子
と遺伝的に連結した本発明の細胞周期遺伝子または核酸を分離する方法を提供す
る。連結した染色体配列は、本発明の細胞周期遺伝子の50センチモルガン（cM）
以内、しばしば40または30cM以内、好ましくは20または10cM以内、より好ましく
は5、3、2または１cM以内である。
【０２１８】 本発明において、植物体の核ゲノムの分子マーカーマッピングに使用される核
酸プローブは、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレ
オチドをコードする遺伝子に対して選択的にハイブリダイズする。好ましい態様
において、そのプローブは本発明のポリヌクレオチドから選択される。典型的に
は、これらのプローブはcDNAプローブまたはPst Iゲノムクローンである。プロ
ーブの長さは、先に詳細に述べているが、一般的には最低15塩基長、より望まし
いのは最低20、25、30、35、40または50塩基長である。しかし、一般的に、プロ
ーブは約1キロ塩基長以下である。プローブが半数体の染色体全量において唯一
の遺伝子座とハイブリダイズする単一コピーのプローブであるのが好ましい。RF
LPマッピングに使用するいくつかの例示的な制限酵素はEcoRI、EcoRV、およびSs
tIである。ここに用いたような「制限酵素」という用語は、特定の核酸配列を認
識して、単独で、または他の組成物とともに切断する組成物を含む。
【０２１９】 RFLPを検出する方法は(a)制限酵素による植物体のゲノムDNAの消化; (b) 選択
的なハイブリダイゼーション条件下での上述のゲノムDNA中の本発明のポリヌク
レオチドの配列に対する核酸プローブとのハイブリダイズ; (c)そこからのRFLP
の検出から構成される。本発明の多様な（対立遺伝子の）変異体を区別する他の
方法は、当業者によく知られている分子マーカー技術を利用して行うことができ
、その技術には1)一本鎖高次構造解析（SSCP）; 2)変性濃度勾配ゲル電気泳動（
DGGE）; 3)リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ; 4)対立遺伝子特異的オリ
ゴヌクレオチド（ASOs）; 5)E. coliのmutSタンパク質のような核酸のミスマッ
チを認識するタンパク質の使用; および6)対立遺伝子特異的PCRなどがある。他
の2つの相補的なDNA鎖間のミスマッチの検出を基にしたほかの方法としてはクラ
ンプ変性ゲル電気泳動（CDGE）; ヘテロ２重鎖解析（HA）; 化学的ミスマッチ切
断（CMC）がある。例示的な多型性変異体は、前述のTabel Iに提供されている。
従って、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発
明のポリヌクレオチドの混入が疑念される試料と核酸プローブの接触の段階から
なる遺伝子型決定の方法をさらに提供する。一般的に、試料は植物体試料であり
、好ましくは本発明のトウモロコシポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、mRNA）
を含んでいると予想される試料である。ストリンジェントな条件下において、核
酸プローブは多型マーカーを含む本発明のポリヌクレオチドの部分配列と選択的
にハイブリダイズする。核酸プローブと多型マーカー核酸配列との選択的なハイ
ブリダイゼーションはハイブリダイゼーション複合体を形成する。ハイブリダイ
ゼーション複合体の検出は、試料内の多型マーカーの存在を示す。好ましい態様
においては、核酸プローブは本発明のポリヌクレオチドから構成されている。
【０２２０】 非翻訳領域（UTR）とコドン選択性 一般的に、翻訳効率はRNAの５'非翻訳領域（５'UTR）の特異的な配列要素によ
って制御されることが見出されている。正の配列モチーフには、翻訳開始コンセ
ンサス配列（Kozak, Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987)）と５＜Ｇ＞７メチル
ＧＰＰＰＧキャップ構造（Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (198
5)）がある。負の要素には、安定な分子内の５'非翻訳領域ステム−ループ構造
（Muesing et al., Cell 48:691 (1987)）とAUG配列または５' UTR中の適当なAU
Gが前に存在する短いオープンリーディングフレーム（Kozak, 前述、Rao et al.
, Mol. and Cell. Biol. 8:284 (1988)）がある。故に本発明は、異種由来のコ
ーディング配列の翻訳を調節する５'および/または３' UTRを提供する。
【０２２１】 さらに、本発明のポリヌクレオチドのポリペプチドコード領域はコドン使用を
変えるように変更することが可能である。コドン使用の変更は、翻訳効率を変え
るためおよび／または所望の宿主での発現のためにコーディング配列を最適化す
るため、またはトウモロコシにおける発現のために外来の配列におけるコドン使
用を最適化するために用いることができる。本発明のポリヌクレオチドのコーデ
ィング領域のコドン使用は、Wisconsin大学Genetics Computer Groupから得るこ
とのできる「Codon Preference」（Devereaux et al., Nucleic Acids Res. 12:
387-395 (1984)を参照）またはMacVector 4.1（Eastman Kodak Co., New Haven,
Conn）のような市販の利用可能なソフトウエアパッケージを用いて縮重を解析
することができる。従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも
一つのコーディング領域に特徴的なコドン使用頻度を提供する。コドン使用頻度
を決定するために使用できるポリヌクレオチド数は、1からここに提供した本発
明のポリヌクレオチド数までの整数のいずれともなりうる。さらに、付け加える
なら、そのポリヌクレオチドは配列全長ともなりうる。統計的解析のための例示
的な配列数は、最低で1、5、10、20、50または100となる。
【０２２２】配列シャッフリング 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびそこから得られる組成物を使用す
る配列シャッフリングのための方法を提供する。配列シャッフリングは、PCT公
報第96/19256号に記載されている。さらに、Zhang, J.- H., et al. Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 94:4504-4509 (1997) および Zhao, et al., Nature Biotech
16:258-261 (1998)を参照のこと。一般に、配列シャッフリングは、所望の特
徴を有するポリヌクレオチドのライブラリーを作成するための手段を提供するも
のであり、そして所望の特徴について選択するまたはスクリーニングすることが
できる。組換えポリヌクレオチドのライブラリーは関連した配列ポリヌクレオチ
ド集団から作成され、これは配列領域を含み、実質的な配列一致性を有し、かつ
インビトロまたはインビボにおいて相同的に組換えることができる。配列組換え
ポリヌクレオチド集団は、所望されるあるいは有利な特徴を有しかつ、適切な選
択法またはスクリーニング法により選択しうるポリヌクレオチドのサブ集団を含
む。特徴は、スクリーニング系で選択されるかあるいは検知され得る任意の特性
または属性とすることができ、そしてコードされるタンパク質、転写エレメント
、転写制御配列、RNAプロセッシング、RNAの安定性、染色体転座、翻訳、または
遺伝子もしくはトランス遺伝子のその他の発現特性、複製エレメント、タンパク
質結合エレメントなどの特性、例えば選択可能または検知可能な特性を付与する
任意の特徴を包含する。いくつかの態様において、選択された特徴は、本明細書
で示されるように、野生型タンパク質を超えるように変更されたKmおよび／また
はKcatである。他の態様において、配列シャッフリングから作成されたタンパク
質またはポリヌクレオチドは、シャッフルしていない野生型ポリヌクレオチドよ
り大きいリガンド結合親和性を有する。さらに他の態様において、配列シャッフ
リングから作成されたタンパク質またはポリヌクレオチドは、シャッフルしてい
ない野生型ポリヌクレオチドと比較して、変更された至適pH条件を有している。
このような特性における増加は、野生型の値の少なくとも110%、120%、130%、14
0%または150%を超える値であり得る。
【０２２３】 核酸の標識および検出方法 本発明の核酸を標識する方法は、本発明の必須の態様ではなく、現在知られて
いる、または最近開発された多くの任意の方法によって達成することができる。
本発明における使用に適している検出可能な標識には分光学的、放射性同位元素
的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により
検出可能な任意の組成物が包含される。本発明に有用な標識には、標識ストレプ
トアビジン接合体で染色するためのビオチン、磁性ビーズ、蛍光染料（たとえば
フルオレセイン、テキサス赤、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射性標
識（たとえば、3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14Ｃ，または32Ｐ）、酵素（たとえば、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて
一般に使用される他の酵素）、ならびに比色用標識たとえばコロイド状金または
着色ガラスもしくはプラスチック（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ラテックス等）のビーズが包含される。
【０２２４】 本発明の核酸はハイブリダイズする核酸の存在を検出するために通常用いられ
る数種の方法の任意の一つによって標識することができる。検出の一般的な方法
の一つには3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14Ｃまたは32Ｐ等で標識されたプローブを用いる
オートラジオグラフィーの使用である。放射性同位元素の選択は、合成の容易さ
、安定性および選ばれた同位元素の半減期による研究の好ましさに依存する。他
の標識には、蛍光団、化学ルミネセンス物質、および酵素で標識された抗体に結
合するリガンドが包含される。また、直接標識たとえば蛍光団、化学ルミネセン
ス物質または酵素に接合できるプローブを使用することができる。標識の選択は
、要求される感度、プローブとの接合の容易さ、安定性の要求、および利用可能
な装置に依存する。本発明の核酸の標識は、たとえば標識ＰＣＲプライマーの使
用により容易に達成される。
【０２２５】 一部の実施態様においては、標識は核酸の調製における増幅工程時に、同時に
導入される。すなわち、たとえば標識プライマーまたは標識ヌクレオチドによる
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、標識された増幅産物を提供する。他の実施
態様においては、標識ヌクレオチド（たとえば、蛍光標識ＵＴＰおよび／または
ＣＴＰ）を用いる転写増幅が転写される核酸中に標識を導入する。
【０２２６】 非放射性プローブは多くの場合、間接的手段で標識される。たとえばリガンド
分子はプローブに共有結合される。リガンドはついで、固有に検出可能であるか
または検出可能なシグナル系、たとえば、酵素、蛍光団または化学ルミネセンス
化合物に共有結合された抗-リガンド分子に結合させる。標識として興味がある
酵素は主として、ヒドロラーゼ、たとえばホスファターゼ、エステラーゼおよび
グリコシダーゼ、またはオキシドリダクターゼとくにペルオキシダーゼである。
蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導
体、ダンシル、ウンベリフェロン等が包含される。化学ルミネサーにはルシフェ
リン、および 2,3-ジヒドロフタラジンジオン、たとえばルミノールが包含され
る。リガンドおよび抗-リガンドには広範囲の様々なものが使用される。リガン
ドが天然の抗-リガンドを有する場合、すなわち、ビオチン、チロキシンおよび
コルチゾールである場合には、それは、その標識された天然にある抗-リガンド
と接合して使用することができる。また、ハプテン性または抗原性化合物を抗体
と組み合わせて用いることができる。
【０２２７】 プローブは標識との直接接合によって標識することもできる。たとえばクロー
ン化ＤＮＡプローブは直接、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフ
ァターゼとカップリングされ（Renz M. & Kurz K, A Colorimetric Method for
DNA Hybridization, Nucl.Acids Res. 12: 3435-3444, 1984）、合成オリゴヌク
レオチドは直接アルカリホスファターゼとカップリングされた（Jablonski E.ら
,Preparation of Oligodeoxynucleotide-Alkaline Phosphatase Conjugates and
Their Use as Hybridiztion Probes, Nucl.Acids Res. 14: 6115-6128, 1986;
および Li P.ら, Enzyme-linked Synthetic Oligonucleotide probe: Non-Radio
active Detection of Enterotoxigenic Escherichia coli in Faeca Specimens,
Nucl.Acids Res. 15: 5275-5287, 1987）。
【０２２８】 このような標識の検出手段は本技術分野の熟練者には周知である。すなわち、
たとえば放射性標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて
検出し、蛍光マーカーは発光を検出する光検出計を用いて検出することができる
。酵素標識は通常、酵素を基質とともに提供し、酵素の基質に対する作用によっ
て生成された反応生成物を検出することにより検出し、比色標識は単に着色標識
を可視化することによって検出される。
【０２２９】 タンパク質に対する抗体 本発明のタンパク質に対しては、それらの天然に存在する（完全長）型または
組換え型の両者における個体、対立遺伝子、株もしくは種変異体、およびそれら
のフラグメントを含めて、抗体を産生させることができる。さらに、これらのタ
ンパク質に対してはそれらのネイティブなコンフィギュレーションまたはノンネ
イティブなコンフィギュレーションのいずれに対しても抗体を産生させることが
できる。また、抗-イディオタイプ抗体も発生させることができる。多くの抗体
作成方法が熟練者には周知である。以下の考察は利用できる技術の一般的な概観
として提供するものであるが、以下の方法には多くの変法があることは熟練者の
認識するところである。
【０２３０】 本発明のタンパク質と特異的な反応性を有する抗体を産生させるためには、多
くの免疫原が使用される。長さ５アミノ酸またはそれ以上の、単離された組換え
、合成またはネイティブな細胞周期タンパク質および本発明のポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質から選択されるタンパク質はモノクローナルまた
はポリクローナル抗体のための好ましい免疫原（抗原）である。本発明の候補タ
ンパク質をノンネイティブな、二次、三次または四次構造で発現または変性させ
る発現ライブラリーのスクリーニングまたは他のアッセイのための抗体の形成の
前に、本発明のタンパク質は通常、変性され、また所望により還元されることは
、熟練者には容易に理解されるところである。天然に存在する細胞周期ポリペプ
チドは、純粋な型でも不純な型のいずれでも使用できる。
【０２３１】 ついで、本発明のタンパク質は抗体を産生できる動物に注射される。本発明の
タンパク質の存在および量を測定するための以後のイムノアッセイにおける使用
のため、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかを発生させること
ができる。ポリクローナル抗体の発生方法は本技術分野の熟練者には周知である
。略述すれば、免疫原（抗原）、好ましくは精製タンパク質、適当な担体（たと
えば、ＧＳＴ、キーホールリンペットヘモシアニン等）にカップリングしたタン
パク質、または免疫処置ベクターたとえば組換えワクシニアウイルスに導入した
タンパク質（イネ国特許第4,722,848号参照）をアジュバントと混合し、この混
合物により動物を免疫処置する。免疫原プレパレーションに対する動物の免疫応
答を試験血液の採取、および興味あるタンパク質に対するそれらの反応性を決定
してモニターする。免疫原に対して適当な高力価を示す抗体が得られたならば、
その動物から血液を収集し、抗血清を調製する。抗血清をさらに分画化してタン
パク質に対し反応性の抗体を所望により濃縮する（たとえば、Coligan, Current
Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY, 1991; Harlow & Lane, Antibod
ies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989 参照）。
【０２３２】 本発明のタンパク質の予め定められたフラグメントに対する抗体は、それらの
結合フラグメントおよび一本鎖組換えバージョンを含めて、動物を上述の担体タ
ンパク質とフラグメントの接合体で免疫処置することによって産生される。通常
、興味ある免疫原は、少なくとも約５個のアミノ酸、より通常には長さ10個のア
ミノ酸、好ましくは長さ15個のアミノ酸、さらに好ましくは長さ20個またはそれ
以上からなるタンパク質である。ペプチドは通常、担体タンパク質にカップリン
グし（たとえば、融合タンパク質として）、または免疫処置ベクター中で組換え
発現させる。抗体が結合するペプチド上の抗原決定基は通常、長さ３〜10個のア
ミノ酸である。
【０２３３】 モノクローナル抗体は所望の抗体を分泌する細胞から調製される。モノクロー
ナル抗体は、それから免疫原が誘導されたタンパク質への結合についてスクリー
ニングされる。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、少なくとも
106〜107，通常は少なくとも 108，好ましくは少なくとも 109，さらに好ましく
は少なくとも 1010，最も好ましくは少なくとも 1011 l/モルのその同系１価抗
原に対する親和性定数をもつ抗体結合部位を有するのが通常である。
【０２３４】 場合によっては、モノクローナル抗体は様々な哺乳動物宿主たとえばマウス、
齧歯類、霊長類、ヒト等から調製することが望ましい。このようなモノクローナ
ル抗体を調製する技術の記載は、たとえば Basic and Clinica Immunology, 4th
ed., Stitesら編, Lange Medical Publications, Los Altos, CA およびその引
用文献; Harlow & Lane 前出; Goding, Monoclonal Antibodies: Priciples and
Practice, 2nd ed., Academic Press, New York, NY, 1986; Kohler & Milstein
,Nature 256: 495-497, 1975 に見いだされる。簡単に要約すると、この方法は
、動物に、本発明のタンパク質からなる免疫原を注射することによって行われる
。ついで動物を屠殺してその脾臓を摘出し、それを骨髄腫細胞と融合させる。そ
の結果、インビトロで再生できるハイブリド細胞、「ハイブリドーマ」が得られ
る。ついでハイブリドーマの集団をスクリーニングし、それぞれ免疫原に対する
単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。この方法では、得られた個
々の抗体種は、免疫原物質上に認識される特異的部位に応答して発生した免疫処
置動物からの不死化、クローン化単一Ｂ細胞の産物である。
【０２３５】 他の適当な技術には、ファージまたは類似のベクター中、組換え抗体のライブ
ラリーの選択が包含される（たとえば Huseら, Science 246: 1275-1281, 1989;
Wardら, Nature 341: 544-546, 1989 および Vaughanら, Nature Biotechnology
14: 309-314, 1996 参照）。また、アビディティの高いヒトモノクローナル抗体
は、非再配列ヒト重鎖および軽鎖Ｉg 遺伝子座のフラグメントよりなるトランス
ジェニックマウス（すなわち、ミニローカストランスジェニックマウス）から得
ることができる（Fishwildら, Nature Biotech. 14: 845-851, 1996）。組換え
免疫グロブリンもまた産生させることができる（Cabilly, イネ国特許第4,816,5
67号; Queenら, Proc.Nat'l.Acad.Sci. 86: 10029-10033, 1989 参照）。
【０２３６】 本発明の抗体はまた本発明のタンパク質を単離する親和性クロマトグラフィー
に使用することもできる。カラムは固体支持体たとえばアガロース、セファデッ
クス等のようなビーズにたとえば抗体を連結することによって調製し、細胞溶解
物をカラムに通過させ、洗浄し、緩和な変性剤の濃度を次第に上昇させて処理す
ると、精製されたタンパク質が放出される。
【０２３７】 抗体は特定の発現産物たとえば正常または異常タンパク質について発現ライブ
ラリーをスクリーニングするため使用することができる。通常、このような操作
では抗体は抗体結合により抗原の存在の検出を容易にする残基で標識される。
【０２３８】 本発明のタンパク質に対して産生された抗体はまた抗-イディオタイプ抗体の
産生に使用することができる。これらは、それぞれの抗原の存在に関連する様々
な病理学的状態の検出または診断に有用である。
【０２３９】 本発明のタンパク質および抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有
結合または非共有結合によって連結して標識されることが多い。各種の広範囲の
標識および接合技術が科学論文および特許に広範に報告されている。適当な標識
には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光残基、化学ルミネセンス
残基、磁性粒子等が包含される。
【０２４０】 タンパク質イムノアッセイ 本発明のタンパク質を検出する方法は本発明の必須の態様ではない。好ましい
実施態様においては、タンパク質は、よく知られた多くの免疫学的結合アッセイ
を使用して検出および／または定量される（たとえば、イネ国特許第4,366,241
号、4,376,110号、4,517,288号および 4,837,168号参照）。一般的なイムノアッ
セイの総説には、Methods in Cell Biology, Vol.37: Antibodies in Cell Biol
ogy,Asai 編, Academic Press, Inc., New York, 1993 および Basic and Clini
cal Immunology 7th Edition, Stites & Terr 編, 1991 を参照されたい。さら
に、本発明のイムノアッセイは数種の任意のコンフィギュレーションで実施する
ことができる（たとえば、Enzyme Immunoassay. Maggio 編, CRC Press, Boca R
aton,Florida, 1980; Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, L
aboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Sci
ence Publishers B.V., Amsterdam, 1995; Harlow and Lane, 前出; Immunoassa
y: A Practical Guide, Chan 編, Academic Press, Orlando, FL, 1987; Princi
ples and Practice of Immunoassays, Price and Newman Eds., Stockton Press
, NY,1991; Non-isotopic immunoassays, Ngo Ed., Plenum Press, NY, 1988 の
総説参照）。免疫学的結合アッセイ（または、イムノアッセイ）は通常、アナラ
イト（この場合は本発明のタンパク質）に特異的に結合し、多くの場合それを固
定化するために「捕獲剤」が使用される。捕獲剤は、アナライトに特異的に結合
する残基である。好ましい実施態様においては、捕獲剤は本発明のタンパク質（
単数または複数）を特異的に結合する抗体である。抗体は本明細書に記載するよ
うに、本技術分野の熟練者には周知の多くの任意の方法で産生することができる
。
【０２４１】 イムノアッセイはまた、多くの場合、捕獲剤とアナライトによって形成される
結合複合体に特異的に結合し、それを標識するために、標識剤を使用する。標識
剤それ自体、抗体／アナライト複合体からなる残基の一つであることが可能であ
る。すなわち標識剤は標識された本発明のタンパク質または本発明のタンパク質
に特異的に反応する標識抗体とすることができる。また、標識剤は抗体／タンパ
ク質複合体に特異的に結合する他の抗体のような第三の残基であってもよい。
【０２４２】 好ましい実施態様においては、標識剤は標識を有する第二の抗体である。また
、第二の抗体は標識を欠くが、それはついで、第二の抗体が誘導された種の抗体
に特異的な標識された第三の抗体によって結合される。第二の抗体は、検出可能
な残基たとえばビオチンによって修飾され、それに第三の標識分子たとえば酵素
標識ストレプトアビジンが結合してもよい。
【０２４３】 免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合できる他のタンパク質、たとえば、
プロテインＡまたはプロテインＧも標識剤として使用することができる。これら
のタンパク質は連鎖球菌の細胞壁の正常な構成成分である。それらは様々な種の
免疫グロブリン定常領域と強力な非免疫原性反応性を示す（一般的には Kronval
ら, J.Immunol. 111: 401-1406, 1973 および Akerstrom ら, J.Immunol. 135:
2589-2542, 1985 参照）。
【０２４４】 アッセイを通じ、試薬のそれぞれの配合ののち、インキュベーションおよび／
または洗浄工程が要求される。インキュベーション工程は、約５秒から数時間ま
で様々であり、好ましくは約５分から約24時間である。しかしながら、インキュ
ベーション時間は、アッセイフォーマット、アナライト、溶液の容量、濃度等に
依存する。通常アッセイは室温で行われるがさらに広い温度範囲たとえば10℃〜
40℃で実施することができる。
【０２４５】 本発明のイムノアッセイの細部は採用される特定のフォーマットによって変動
するが、生物学的サンプル中の本発明のタンパク質を検出する方法は一般的に、
生物学的サンプルを、免疫学的に反応性の条件下に本発明のタンパク質と特異的
に反応する抗体と接触させる。免疫学的に反応性の条件下に、抗体はタンパク質
に結合され、結合した抗体の存在が直接的または間接的に検出される。
【０２４６】 Ａ．非競合的アッセイフォーマット 本発明のタンパク質を検出するイムノアッセイには競合的アッセイフォーマッ
トおよび非競合的アッセイフォーマットが包含される。非競合的イムノアッセイ
は捕獲されたアナライト（すなわち、本発明のタンパク質）の量を直接測定する
アッセイである。一つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいては、たとえ
ば捕獲剤（たとえば、免疫反応性条件下に本発明のタンパク質に特異的な反応性
を有する抗体）を固体基板に直接結合させ、それらをそこに固定化することがで
きる。これらの固定化抗体はついで、試験サンプル中に存在するタンパク質を捕
獲する。このようにして固定化されたタンパク質はついで、標識剤、たとえば標
識を有する第二の抗体によって結合される。また、第二の抗体は標識を欠くが、
それはついで、第二の抗体が誘導された種の抗体に特異的な標識された第三の抗
体によって結合される。第二の抗体は、検出可能な残基たとえばビオチンによっ
て修飾され、それに第三の標識分子たとえば酵素標識ストレプトアビジンが結合
してもよい。
【０２４７】 Ｂ．競合的アッセイフォーマット 競合的アッセイにおいては、サンプル中に存在するアナライトの量は、サンプ
ル中に存在するアナライトによって捕獲剤（たとえば、免疫反応性条件下にタン
パク質に特異的に反応性を示す抗体）から置換された（競合により排除された）
添加された（外因的な）アナライト（たとえば本発明のタンパク質）の量を測定
することによって間接的に測定される。一つの競合的アッセイにおいては、既知
量のアナライトをサンプルに加え、ついでサンプルを、本発明のタンパク質を特
異的に結合する捕獲剤と接触させる。捕獲剤に結合したタンパク質の量はサンプ
ル中に存在するアナライトの濃度に逆比例する。
【０２４８】 とくに好ましい実施態様においては、抗体を固体基板上に固定化する。抗体に
結合したタンパク質の量は、タンパク質／抗体複合体中に存在するタンパク質の
量を測定するかまたは複合体化されずに残ったタンパク質の量を測定することの
いずれかによって決定される。タンパク質の量は標識されたタンパク質を提供す
ることによって検出できる。
【０２４９】 ハプテン阻害アッセイは他の好ましい競合的アッセイである。このアッセイで
は、既知量のアナライト（たとえば、本発明のタンパク質）を固体基板上に固定
化する。免疫反応性条件下にタンパク質に特異的な反応性を示す抗体の既知量を
サンプルに加え、ついでサンプルを固定化タンパク質と接触させる。この場合、
固定化タンパク質に結合する抗体の量はサンプル中に存在するタンパク質の量に
逆比例する。この場合も固定化された抗体の量は、抗体の固定化分画または溶液
中に残った抗体分画のいずれかを検出することにより検出できる。検出は、抗体
が標識されていて直接的であるか、または上述のように抗体を特異的に結合する
標識残基の以後の添加により間接的に行われてもよい。
【０２５０】 Ｃ．イムノアッセイに使用するためのプール抗血清の発生 特定の免疫原たとえば配列番号：２，12, 14 または 22 のアミノ酸配列から
なる免疫原に対して発生させた抗体に特異的に結合するか、またはそれと特異的
な免疫反応性を示すタンパク質をイムノアッセイによって決定する。このイムノ
アッセイには、本発明のポリペプチド（すなわち、免疫原性ポリペプチド）に対
して産生させたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は他のタンパク質
に対して低い交叉反応性をもつように選択され、このような交叉反応性があれば
イムノアッセイに使用する前に免疫吸着［たとえば、異なる基質特異性のタンパ
ク質（たとえば、異なる酵素）および／または同じ基質特異性をもつが異なる形
態のタンパク質による抗血清の免疫吸着］によって除去する。
【０２５１】 イムノアッセイに用いるための抗血清を製造するため、ポリペプチドを本明細
書に記載のようにして単離する。たとえば、組換えタンパク質を哺乳動物または
他の真核細胞系において産生させることができる。マウスの近交系を標準アジュ
バントたとえばフロインドのアジュバントおよび標準マウス免疫処置ピロトコー
ルを用いてタンパク質で免疫処置する（Hsrlow & Lane, 前出）。あるいは、本
明細書に開示された配列に由来する合成ポリペプチドを担体タンパク質に接合さ
せて免疫原として使用する。ポリクローナル抗体を集め、イムノアッセイたとえ
ば固体支持体上に固定化した免疫原との固相イムノアッセイで、免疫原ポリペプ
チドに対して滴定する。力価 104またはそれ以上のポリクローナル抗血清を選択
し、たとえば Harlow & Lane 前出の 570-573頁に記載されたような競合的結合
イムノアッセイの１つを用いて、形態または基質特異性が異なるポリペプチドに
対するそれらの交叉反応性を試験する。これらの別個のタイプのポリペプチドは
、アッセイされるポリペプチドによって特異的に結合される抗体を同定するため
にコンペティターとして用いられる。競合的ポリペプチドは組換えタンパク質と
して産生させ、本明細書に記載するように、標準分子生物学およびタンパク質化
学を用いて単離することができる。
【０２５２】 競合的結合フォーマットにおけるイムノアッセイは交叉反応性の測定に使用さ
れる。たとえば、免疫原性ポリペプチドを固体支持体に固定化する。アッセイに
加えたタンパク質は、固定化抗原に対する抗血清の結合と競合する。上記タンパ
ク質が固定化タンパク質に対して抗血清の結合と競合する能力を免疫原ポリペプ
チドに対して比較する。上記タンパク質についての交叉反応性％を、標準的計算
法を用いて計算する。ポリペプチドの異なる型と10％未満の交叉反応性を有する
抗血清を選択し、プールする。ついで、交叉反応性を示す抗体を、異なる型のポ
リペプチドでの免疫吸着により、プールした抗血清から除去する。
【０２５３】 免疫吸着されプールされた抗血清はついで、免疫原ポリペプチドに対して第二
の「標的」ポリペプチドを比較するために、本明細書に記載の競合的結合イムノ
アッセイに使用する。この比較を行うためには、２種のポリペプチドはそれぞれ
広範囲の濃度でアッセイし、固定化タンパク質に対する抗血清の結合の50％阻害
に要求される各ポリペプチドの量を標準方法を用いて測定する。要求される標的
ポリペプチドの量が、必要な免疫原ポリペプチドの量の２倍より小さい場合には
、標的ポリペプチドは免疫原タンパク質に対して発生した抗体に特異的に結合す
ると言われる。特異性の最終決定として、プールされた抗血清を免疫原性ポリペ
プチドにより免疫吸着に用いたポリペプチドに対する結合が認められなくなるま
で完全に免疫吸着する。完全に免疫吸着された抗血清をついで試験ポリペプチド
との交叉反応性について試験する。反応性が認められない場合には、試験ポリペ
プチドは免疫原性タンパク質によって誘発された抗血清によって特異的に結合さ
れることになる。
【０２５４】 Ｄ．他のアッセイフォーマット とくに好ましい実施態様においては、サンプル中における本発明のタンパク質
の存在の検出および定量のために、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析
が使用される。この方法は、一般的に、サンプルタンパク質を分子量に基づいて
ゲル電気泳動により分離し、分離されたタンパク質を適当な固体支持体（ニトロ
セルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導化ナイロンフィルター）
に移し、本発明のタンパク質を特異的に結合する抗体とともにサンプルをインキ
ュベートすることからなる。抗体は固体支持体上のタンパク質に特異的に結合す
る。これらの抗体は、直接標識されるか、または抗体に特異的に結合する標識抗
体（たとえば、標識ヒツジ抗-マウス抗体）を用いて以後に検出されてもよい。
【０２５５】 Ｅ．タンパク質の定量 本発明のタンパク質は本技術分野の熟練者には周知の多くの任意の手段によっ
て、検出および定量することができる。これらには、たとえば電気泳動、毛細管
電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）、高度拡散クロマトグラフィー等の分析生物学的方法、およびたとえ
ば流体もしくはゲル沈降反応、免疫拡散（単純および二重）、免疫電気泳動、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光
測定法等の免疫学的方法が包含される。
【０２５６】 Ｆ．非特異的結合の低下 イムノアッセイおよびアナライトの精製時に、非特異的結合の低下が望ましい
場合が多いことは熟練者には周知の通りである。アッセイが抗原、抗体、または
固体支持体上に固定化された他の捕獲剤を包含する場合、基板に対する非特異的
結合を最小限にすることが望ましい。このような非特異的結合を低下させる方法
は本技術分野の熟練者にはよく知られている。通常、これには基板のタンパク性
組成物によるコーティングが包含される。タンパク性組成物には、とくに、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳およびゼラチンが広く使用されている。
【０２５７】 Ｇ．イムノアッセイ標識 標識剤は、たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、結合タンパク
質もしくは複合体、親和性マトリックスのようなポリマー、炭水化物または脂質
とすることができる。本発明に用いるのに適当な検出可能標識には、比色法、放
射性同位元素、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的
手段によって検出可能な任意の組成物が包含される。検出は任意の既知の方法、
たとえばイムノブロッティング、ウエスタン分析、ゲル-移動性シフトアッセイ
、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション分析（ＦＩＳＨ）、放射性もしくは生
物ルミネセンスマーカーの追跡、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、ストップフロー
分光法、カラムクロマトグラフィー、毛細管電気泳動、またはサイズ／または電
荷の変化に基づき分子を追跡する他の方法によって行うことができる。アッセイ
に用いられる特定の標識または検出可能な基は本発明に必須の態様ではない。検
出可能な基は検出可能な物理的または化学的性質を有する任意の材料とすること
ができる。このような検出可能な標識はイムノアッセイの分野において十分に開
発されていて、一般的にこのような方法に有用な任意の標識が本発明に適用でき
る。すなわち、標識は、比色的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光
学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明に有用な
標識には、核酸の標識について述べたように、磁性ビーズ、蛍光染料、放射性標
識、酵素および比色法の標識または着色ガラスもしくはプラスチックのビーズが
包含される。
【０２５８】 標識は、本技術分野で周知の方法に従い、アッセイの所望の成分に直接または
間接的にカップリングされる。上に指摘したように、要求される感度、化合物の
接合の容易さ、安定性の要求、使用可能な設備および使い捨て装置に依存する標
識の選択によって、広範な様々の標識が使用できる。
【０２５９】 非放射性標識は多くの場合、間接的な手段によって結合される。一般的には、
リガンド分子（たとえば、ビオチン）は、分子に共有結合によって結合される。
リガンドはついで、固有に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合
物もしくは化学ルミネセンス化合物のようなシグナル系に共有結合した抗-リガ
ンド（たとえば、ストレプトアビジン）分子に結合させる。多くのリガンドおよ
び抗-リガンドが使用できる。リガンドが天然の抗-リガンドを有する場合、たと
えばビオチン、チロキシンおよびコルチゾールである場合には、標識された天然
に存在する抗-リガンドと接合させて使用することができる。また、ハプテン性
または抗原性化合物を抗体と組み合わせて使用することができる。
【０２６０】 分子はまた、たとえば酵素または蛍光団に接合させることによりシグナル発生
化合物に直接接合させることもできる。標識として興味がある酵素は、主として
ヒドロラーゼとくにホスファターゼ、エスおよびグリコシダーゼ、またはオキシ
レダクターゼとくにペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセイン
およびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン
等が包含される。化学ルミネセンス化合物には、ルシフェリン、および 2,3-ジ
ヒドロフタラジンジオン、たとえばルミノールが包含される。使用できる様々な
標識またはシグナル産生系についてはイネ国特許第4,391,904号を参照されたい
。この記載は引用により本明細書に導入される。
【０２６１】 標識を検出する手段は本技術分野の熟練者には周知である。すなわち、標識が
放射性標識の場合はたとえば、検出方法にはオートラジオグラフィーにおけるシ
ンチレーションカウンターまたは写真フィルムが包含される。標識が蛍光標識の
場合には、それは適当な光波長をもつ蛍光色素を励起させ、生じた蛍光をたとえ
ば顕微鏡、可視的検査、写真フィルムの使用、電荷カップリング装置（ＣＣＤ）
のような電子検出計の使用、または光電子増幅管等によって検出することにより
検出することができる。同様に、酵素標識は、酵素の適当な基質を提供し、生じ
た反応産物を検出することによって検出することができる。最後に、単純な比色
標識は、その標識が伴う色を単に観察することにより検出できる。たとえば様々
なディップスティックアッセイにおいて、接合した金は多くの場合、ピンク色を
生じ、一方、様々な接合ビーズはビーズの色に見える。
【０２６２】 一部のアッセイフォーマットは標識成分の使用を要求しない。たとえば、凝集
アッセイは標的抗体の存在を検出するために使用することができる。この場合、
抗原-コーティング粒子は、標的抗体よりなるサンプルによって凝集する。この
フォーマットにおいては、いずれの成分も標識する必要はなく、標的抗体の存在
は単に肉眼による検査で検出される。
【０２６３】 酵素の活性または発現を修飾する化合物のアッセイ 本発明はまた本発明の活性なポリペプチドへの結合（たとえば基質）および／
またはその活性を上昇もしくは低下（すなわち修飾）をもたらす化合物を同定す
る方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドを測定すべき酵素を結合
するまたはその活性の修飾する能力を有する化合物と接触させることからなる。
使用されるポリペプチドは、ネイティブな完全長の細胞周期ポリペプチド（たと
えば酵素）の比活性の少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％もしくは40％
、さらに好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも70％もしくは80
％を有する。一般的に、ポリペプチドは、その化合物の効果を測定するのに十分
な範囲、通常約１ｎＭ〜10ｎＭ存在する。同様に、化合物は約１ｎＭ〜10ｎＭ存
在する。熟練者には明らかなように、酵素濃度、リガンド濃度（すなわち、基質
、産物、インヒビター、アクティベーター）、ｐＨ、イオン強度および温度のよ
うなファクターは有用なカイネティックデータが得られ、ポリペプチドに結合ま
たはその活性を修飾する化合物の存否が測定できるように制御される。酵素のカ
イネティックスを測定する方法は本技術分野において周知である（たとえば Seg
al,Biochemical Calculation, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York, 1976
参照）。
【０２６４】 以上本発明を、理解を明瞭にするためにの例示および実施例により一部詳細に
説明したが、ある種の変更および修飾は上述の特許請求の範囲に示した本発明の
範囲内において実行されるものであることは自明の通りである。
【０２６５】 クローン、ＺmＣycＤa-1 ならびにＺmＣycＤc-1 は、American Type Culture
Collection（ATCC）に寄託されている。ATCC は 10801 University Boulevard,
Manassas, Virginia 20110-2209 にある。寄託はブダペスト条約の規定により行
われ、それぞれ ATCC 受入番号 98848 および 98847 を与えられている。
【０２６６】 特許出願が係属中の間は、寄託された培養物に対するアクセスは Comissioner
of Patents and Trademarks ならびに 37 ＣＦＲ1.14 および 35 Ｕ.Ｓ.Ｃ.122
に基づき Comissioner によりその資格を与えられた者に可能である。
【０２６７】 寄託物質の公衆による利用に関して寄託者に課せられたすべての制限は特許の
付与に際しても排除されない。しかしながら、寄託の利用は政府の決定によって
発行された特許権の適用制約において本発明を実施に対する実施許諾を構成する
ものではないことを理解すべきである。
【０２６８】
【実施例】
実施例１：トウモロコシCycD遺伝子の単離 トウモロコシの組織から、ChomczynskiとSacchi［Chomczynski, P., and Sacc
hi, N., Anal. Biochem. 162, 156(1987)］によって記載されたイソチオシアン
酸グアニジンフェノール法の改良法を用いて、TRIzol試薬(Life Technology Inc
. Gaithersburg, MD)により全ＲＮＡを単離した。要約すると、植物組織の試料
を、TRIzol試薬の添加前に液体窒素中において粉砕し、次いで乳鉢と乳棒でホモ
ジナイズした。クロロホルム添加の後、遠心し、水相と有機相に分離した。その
全RNAはイソプロピルアルコール沈殿で水相から回収された。
【０２６９】 ポリ(Ａ)＋ＲＮＡ単離： 全ＲＮＡからのポリ(Ａ)＋ＲＮＡの選択はPolyATract システム（Promega Cor
poration. Madison, WI）を用いて実施した。要約すると、ビオチン標識したオ
リゴｄＴプライマーを用いてｍＲＮＡの３'ポリＡテールにハイブリダイズさせ
た。そのハイブリッドは常磁性粒子を結合したストレプトアビジンとマグネティ
ック分離スタンドを用いて捕集した。そのｍＲＮＡを高ストリンジェントな条件
にて洗浄し、ＲＮａｓｅ不含脱イオン水を用いて抽出した。
【０２７０】 ｃＤＮＡライブラリー作製： ｃＤＮＡ合成を行い、SuperScriptプラスミドシステム (Life Technology Inc
. Gaithersburg, MD)を用いて一方向性のｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃ
ＤＮＡの第１のストランドはＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴプライマーをプライ
ミングすることで合成した。その反応は４５℃でSuperScript逆転写酵素IIで触
媒した。ｃＤＮＡの二番目の鎖はα−32Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、その反応物の一
部をアガロースゲル電気泳動で解析し、ｃＤＮＡサイズを決定した。５００ｂｐ
より小さいｃＤＮＡ分子やライゲートしてないアダプターはＳｅｐｈａｃｒｙｌ
−Ｓ４００クロマトグラフィーで除去した。選択されたｃＤＮＡ分子はｐＳＰＯ
ＲＴ１ベクターのＮｏｔＩとＳａｌＩの間に連結した。植物の成長点のソースだ
けでなく、芽培養物や未成熟な花序（房および穂）のソースも含む、トウモロコ
シの細胞分裂的に活性な組織を使用した。
【０２７１】 シーケンス用鋳型の調製： 個々のコロニーを選択し、ＤＮＡをＭ１３フォワードプライマーとＭ１３リバ
ースプライマーを用いたＰＣＲ、もしくはプラスミド単離のいずれかで調製した
。全てのｃＤＮＡクローンは、最初、Ｍ１３リバースプライマーを用いてシーケ
ンスした。遺伝子の付加的な断片が発見されたので、新たなシーケンスプライマ
ーを設計した。
【０２７２】 プロトコル、Murray(ed.)、271-281頁（Humana Press, Inc. 1991）。細胞周
期タンパク質の機能的な断片は、細胞への導入、Ｇ１をＳ期移行へと刺激する能
力によって同定された。Ｓ期への移行はある細胞集団におけるＤＮＡ複製の増加
、および細胞分裂の速度の増加により分かる。
【０２７３】 ５'ＲＡＣＥ ライブラリーＲＡＣＥはいくつかの先に開発されたのトウモロコシライブラリ
ーを用いて行った。５'ＲＡＣＥには３枚葉段階のトウモロコシプラントの葉お
よび茎から作製されたｃＤＮＡライブラリーを用いた。５'ＲＡＣＥの原理は非
常に多くの刊行物例えば Frohman M.A. 1993. Rapid Amplification of Comple
mentary DNA Ends for Generation of Full-Length Complementary DNAs: Therm
al RACE. In: Methods in Enzymology, vol. 28, pp 340-356に詳細に述べられ
ている。詳細な手順はClonTech Marathonクローニングマニュアルにある。
【０２７４】 実施例２：トウモロコシ細胞周期遺伝子を同定するための、２−ハイブリッド
システムにおけるCycDの利用 Ｇ１−Ｓ期移行とＳ期初期におけるCycD遺伝子の発現は、細胞周期を通して連
続して重要な役割を果たす。CycD遺伝子ファミリーによりコードされるタンパク
質は網膜芽細胞腫関連遺伝子ファミリーの一員に結合し、次いでリン酸化する複
合体の重要な部分である。順番に、RbはE2Fを放出し、この転写因子はＤＮＡ修
復へとつながる現象のカスケードを開始する。そのように、CycD遺伝子とそれを
コードするタンパク質は他の細胞周期制御タンパク質を同定するために使用する
ことができる。これは、酵母２−ハイブリッドスクリーニングにおいて、CycD遺
伝子をベイト（ＤＮＡ結合ドメインと融合される標的）として用いて行うことが
できる。２−ハイブリッドライブラリー作製、レポーター遺伝子のクローニング
、酵母培養、酵母の形質転換の方法は、全て、確立された方法（Sambrook等., 1
990; Ausubel et al., 1990; Hannon と Bartels, 1995を参照）に従った。この
方法を用いて、トウモロコシCdc2、Cdk4、Rb遺伝子は活性化ドメインハイブリッ
ドの成分として同定され、さらなるシーケンス解析を通して確かめられる。同様
に、CIPやInkのような、Cdk4/CycD複合体の阻害剤が同定される。
【０２７５】 実施例３：Cdk4タンパク質とそれらをコードする遺伝子を同定するためのCycD
結合アフィニティーカラム 精製された組換えCycDタンパク質は共有結合性の架橋もしくは上述したように
アフィニティー精製によってマトリックスに固定化することができる。それから
、このマトリックスはCycDタンパク質、インターアリア、サイクリン依存性キナ
ーゼと相互作用するタンパク質をプルダウンするのに使用することができる。そ
の後、CDK活性はタンパク質基質への放射性リン付加とイムノアッセイによって
決定されるCDKタンパク質レベルを測定することで評価することができる。また
、これを用いていろいろな植物組織およびタンパク質画分に存在するCDK活性を
精製することができる。他のCycD相互作用タンパク質の存在やレベルもまた、免
疫学的アッセイ、活性の数量化、SDS-PAGE解析や他の方法に基づいて決定するこ
とができる。さらに、これらの方法は、生殖生長状態、分裂能力、発生段階、ま
たは別の試料の質と相関し得る。CycD相互作用タンパク質を同定するために、Cy
cDの核酸もまたＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸シーケンスに付加す
ることができる。
【０２７６】 実施例４：一過性のCycD発現はＤＮＡ複製を活性化し、トランス遺伝子の組込
みを促進する ＤＮＡ導入の方法に関わらず、外来ＤＮＡの組込みを受容する細胞は活発に分
裂していなければならない。ここに外来ＤＮＡの組込みが分裂している細胞で起
こることを示唆する証拠がある（これはAgrobacteriumおよび直接的ＤＮＡ導入
法をともに含む）。分裂している形質転換細胞は一時的にトランス遺伝子を発現
する細胞のほんの一部であると考えられてきた。損傷したＤＮＡの導入（本発明
者が粒子銃導入法で示したものに類似）は直ちに細胞分裂の停止、サイクリン依
存性キナーゼ阻害剤（CDKI's）関与する作用を引き起こすことが（植物以外の系
にて）よく知られている。この阻害は異所性の一時的な正の細胞周期調節因子の
過剰発現または負の制御因子の抑制により防ぐことができる。停止の方法；即ち
損傷したＤＮＡの存在または細胞周期が進行していない分化細胞への導入に関わ
らず、細胞周期の活性化は組換え頻度を増加させる。これを立証するためにCycD
を構成性プロモーター（即ち第一ユビキチンイントロンを含むユビキチンプロモ
ーターのような強力なトウモロコシプロモーターまたはnosのように弱い構成性
プロモーター）とともにクローン化されている。UBI::bar::pinIIを持った適当
な植物発現カセット中（例えば、UBI::ZmCycD::pinIIを持ったプラスミド中）の
ZmCycD遺伝子のデリバリーは、多くの確立した植物細胞のための方法、たとえば
、粒子銃照射、超音波処理、PEG処理またはプロトプラストのエレクトロポーレ
ーション、未損傷の組織のエレクトロポーレーション、silica-fiber法、マイク
ロインジェクションまたはAgrobacteriumを介した形質転換などによって実施す
ることができる。上記の方法の一つを用いて、適当なトウモロコシ培養培地上で
成長することのできるトウモロコシ細胞にＤＮＡを導入することができる。その
ようなコンピテント細胞はトウモロコシの懸濁培養、固形培地上のカルス培養、
新しく単離された未成熟胚または、分裂組織細胞から得ることができる。Hi-II
遺伝子型の未成熟胚はこれら２つのプラスミドの同時形質転換の標的として用い
られる。CycD遺伝子の一過性のCycD遺伝子の発現はG1/Sチェックポイントの制御
を解消し、受容細胞（即ちその中にＤＮＡが導入される）の割合を増加させる。
Ｓ期および分裂への進行の頻度の増加を確かめるために細胞学的手法を用いるこ
とが可能である（即ちCycDに隣接してGFPのような視覚的マーカーを形質転換し
た細胞では緑に染まる細胞が高い分裂率を示すだろう）。Ｓ期（ＤＮＡ複製を行
っている）の細胞は核酸類似体取り込みを検出して調べることができる。例えば
、ブロモデオキシウリジン（BrdU）と細胞の培養に続いて、このチミジン類似体
を抗BrdUでの免疫細胞化学またはBrdU標識後のTopro3染色による増感によって検
出することができる。CycDの発現はBrdU取り込み細胞の割合を増加させると考え
られる（即ち、形質転換していない細胞と比較して、形質転換細胞はより高い割
合でBrdUを取り込む）。ＤＮＡ合成の増加はプロトプラスト（または核）の蛍光
標示式細胞分取器（FACS）などの方法と、プロピディウムイオジンおよびDAPIの
ような適当なBrdU非感受性の蛍光ＤＮＡ標識または上述のBrdU検出法を組み合わ
せて、調べることも可能である。例えば、組織を破砕して核を取り出し、（我々
が加えたGFPマーカーからの）緑の蛍光およびＤＮＡの含有量をFACSを用いて解
析する。そのようなFACS解析は、同時に形質転換されたGEPレポーターの発現がC
ycDによって起こるＧ１期、Ｓ期およびＧ２期の細胞の割合の変化に相関してい
ることを立証することができる。CycD発現がＳ期の細胞の割合を増加させたこと
を示すために、同様の実験を蛍光標識された抗BrdU抗血清を用いて行うことが可
能である。細胞周期の時期特異的なプローブも細胞周期の進行を調べるために使
用することができる。例えば、多くの紡垂体に関わるタンパク質は分裂の間のか
なり短い時間に発現される、そして、サイクリン、ヒストンまたはＤＮＡ合成酵
素に対する抗体または核酸プローブはG1/S移行の正のマーカーとして用いること
ができる。CycD遺伝子カセットを受け取った細胞では、細胞周期の活性化は、分
裂率の増大により示され、DAPIまたはHoechst 33258といったＤＮＡ染色剤を用
いて分裂形態を染色することで検出される。CycD発現細胞のFACS解析は高い割合
の細胞がＳ期に向かって進行しているまたはＳ期中を進行していることを示すと
期待される。Ｇ１期にあるより少ない細胞および／またはより速い細胞周期の時
間（即ち、より短いＧ１期およびＧ２期）によってＳ期の進行が証明される。上
述したように、細胞周期の時期特異的なプローブを用いたときはより多くの割合
の細胞が標識される。
【０２７７】 トランス遺伝子組換えの効果を証明するために、選択液中でのバイアラフォス
抵抗性コロニーの生育は、確実な分析法である。ＤＮＡ導入の１−７日以内で、
胚は３ｍｇ／ｌの選択試薬バイアラフォス（bialaphos）含んでいる培養液へと
移される。胚、または後のカルスは２週間毎に新しい選択プレートに移された。
６−８週間後、形質転換カルスらは回収された。導入された遺伝子を含むトラン
スジェニックカルスはPCR法とサザン分析を用いて、検証されることができる。
ノーザン分析は、どのカルスがbar遺伝子を発現するか、そして、通常の野生型
以上のレベルでCycD遺伝子が発現しているかどうかを検証するのに用いることも
できる（細胞から新しく単離したばかりのｍＲＮＡ群とのプローブのハイブリダ
イゼーションに基づく）。一時的な、高レベルでのCycD発現を持つ未成熟な胚に
おいて、より大多数の安定な組換え体が回収されている（増加する組換え頻度の
ほぼ直接的な結果）。増加する組換え頻度は、in situハイブリダイゼーション
法のような、完全に確立された標識方法を用いて検証されている。
【０２７８】 （一時的な組換え頻度の増加への一時的なCycD媒介細胞周期への刺激を用いて
）この特異的な適用に対して、CycD遺伝子の異所性の安定な発現の可能性を減じ
ることが望まれるかもしれない。一時的発現のみの戦略を用いることができる。
これは細胞分裂の一時的な刺激によるトランス遺伝子の組換えを増幅するように
組換えられるためのトランス遺伝子カセットと共に、（CycD遺伝子から転写され
た）RNAまたはCycDタンパク質伝達を含んでいる。CycD-RNAを生成するための完
全に確立された方法を用いて、そしてこれは精製されて、マイクロインジェクシ
ョン、粒子銃を用いた導入法（ボンバードメント）、エレクトロポレーションま
たはシリカファイバー法のような物質的な方法を用いて、トウモロコシ細胞へと
導入される。タンパク質の伝達に対しては、遺伝子はまず細菌やバキュロウイル
スの系に発現させ、タンパク質を精製し、次いでマイクロインジェクション、粒
子銃を用いた導入法（ボンバードメント）、エレクトロポレーションまたはシリ
カファイバー法のような物質的な方法を用いて、トウモロコシ細胞へと導入され
る。あるいは、CycDタンパク質はAgrobacterium TumefaciensからAgrobacterium
ビルレンスタンパク質との融合の形式で植物細胞へ伝達する。融合型はCycDと、
植物細胞へ直接的に伝達されることが知られているVirE2、VirD2またはVirFのよ
うな、細菌のビルレンスタンパク質との間で構成されている。融合型は植物細胞
内への伝達を媒介に必要な細菌のビルレンスタンパク質のそれらの性質と、トラ
ンス遺伝子の組込みの促進に必要なCycD活性とを保持するように構成される。こ
の方法は、同じ宿主細胞へのT-DNAと機能を持つCycDタンパク質の同時性の共デ
リバリーの高頻度を確実にする。上記の方法はCycD遺伝子またはそれにコードさ
れるＤＮＡ複製や細胞分裂を一時的に刺激する生成物を用いる多様な手段を代表
するものであり、これが、生じるこの試行のために改良された細胞的な、または
分子的な環境を供給することによって、故にトランス遺伝子の組込みを促進する
。
【０２７９】 実施例５；変異したCycDの発現は、細胞周期を刺激して、組み込みと成長を増
加させる 他の真核細胞での結果に基づいてZmCycD遺伝子の発現はG1/Ｓ期の移行を刺激
し、細胞分裂を促進する。分裂の割合の増加は多数の異なる方法、即ち放射性同
位体標識核酸のより急速な組み込みや急速な成長（例えば、多くの生物量蓄積）
により評価される。適切な植物の発現カセットにおいてのZmCycDの伝達は、植物
細胞に対して、例えば粒子銃法（粒子照射）、音波処理、プロトプラストのPEG
処理またはエレクトロポレーション、未処理の組織のエレクトロポレーション、
シリカファイバー法、マイクロインジェクション、Agrobacterium媒介形質転換
を含めた、大多数の、完全に確立された方法によって、行われている。ZmCycD遺
伝子の発現の結果はＧ１／Ｓ期の移行と、それ以降の細胞分裂を刺激し、導入さ
れた遺伝子の組み込みの最適な細胞環境を提供するだろう（実施例１による）。
これが、主として、従来の培養技術では反応しない遺伝子型においての組織培養
の反応（細胞分裂）のきっかけとなったり、または、野生型（非トランスジェニ
ック型）組織に於いて観察される通常の割合を超えて、トランスジェニック組織
の成長を刺激する。これを証明するために、CycD遺伝子（ZmCycDc-1）は構成性
プロモーター（最初のユビキチンイントロンを含むユビキチンプロモーターUBI
）と共にカセットへと単離された。粒子銃法（粒子照射）は、適したトウモロコ
シ培養液中での成長をする可能性をもつトウモロコシ細胞に、UBI::ZmCycDc-1::
pinIIを含んでいるプラスミドを、UBI::PAT〜GFP::pinIIを含んでいるプラスミ
ド（発現する時に、バイアラフォス（bialaphos 抗生物質名）抵抗性と緑色蛍
光を与える機能上のPAT〜GFP融合タンパク質を生成する）と共に導入するのに用
いられた。このようなコンピテント細胞はトウモロコシの懸濁培養、固体培地の
カルス培養、新たに単離した未成熟な胚または分裂組織細胞から得ることができ
る。Hi-II遺伝子型の未成熟な胚はこれらの二つのプラスミドをともに伝達する
ためのターゲットとして用いられる。果実は授粉後おおよそ１０日に収穫され、
１.２−１.５ｍｍの未成熟な胚は穀粒から単離された。未成熟な胚は１８−７２
時間後から粒子銃法により導入された。普通は、粒子銃法による導入に先立って
、６−１８時間高張液中に置かれ、粒子銃法による導入の後にさらに１８時間こ
の液中に置かれる。
【０２８０】 ＤＮＡ粒子銃法 （粒子照射） 粒子銃法による導入に前の６−１８時間の間、未成熟な胚は余分な浸透性のあ
る液（MS基礎液、MusashigeとSkoog, 1962, Physiol. Plant15:473-497, 0.25M
ソルビトールを加えた）に置かれる。高張液中の胚は粒子銃法による導入の標的
として用いられた。
【０２８１】 粒子銃法のために、プラスミドＤＮＡ（上記した）は標準的にはＣａＣｌ2−
スペルミジン化学物質を用いて１.８μmタングステン分子上に沈澱させた（例え
ば、Klein, et al., 1987, Nature 327:70-73を参照）。それぞれのプレートは
一度に600PSIにて、Dupont Helium Gunを用いて、粒子銃法による導入をされる
（Lowe等, 1995, Bio/Technol 13:677-682）。トウモロコシの未成熟な胚の単離
、カルスの開始、カルスの分裂増殖および植物の再生に対して用いられた典型的
な液の組成については、Armstrong, C. 1994.「The Maize Handbook」M. Freeli
ng and V. Walbot, eds. Springer Verlag, NY, pp.663-671を参照。
【０２８２】 選択 7日以内に、胚は３ｍｇ／ｌの選択試薬バイアラフォス（bialaphos 抗生物質
名）を含む、Ｎ６を基本とした培養液中に移された。胚、または後のカルスは２
週間毎に新しい選択プレートに移された。粒子銃法による導入後の最初の１４日
の後に未成熟な胚から発展したカルスらはエピフルオレセント解像顕微鏡を用い
たGFPの発現により、選択された。一般的に（たとえば、細胞周期遺伝子の欠如
において）これは多細胞形質転換体が成長するのを観察するには早すぎる。その
代わり、このような短い粒子銃法による導入後期間の後には、大多数のGFP発現
単一細胞を、主に、コントロール胚（UBI::PAT〜GFP::pinIIプラスミドのみが導
入されている）において観察された。しかし、GFPを発現する多細胞の塊は観察
されなかった。コントロール処理との明らかな比較においてUBI::CycDc-1はPAT
〜GFPマーカーと共に取り込まれたとき、大多数のGFP＋多細胞塊はこの同じ初期
の時点にて、未成熟な胚からの成長が観察された。この初期の刺激とかなり大多
数の成長過程の形質転換体は、CycD処理下で観察され、この細胞周期遺伝子の発
現は組換え頻度を増加させること（故にかなり大多数）、かつ、組換えの起きた
後でこれらの小さなコロニーの成長を刺激すること（故に形質転換体はこの初期
段階において明らかに可視化できる）を示唆している。６−８週間後、形質転換
カルスらは回収された。PAT〜GFP遺伝子とCycDの双方が未成熟な胚に形質転換さ
れる処理において、大多数の成長過程にあるカルスらが、選択培地において回収
され、カルスの成長が促進された(bar遺伝子処理のみの場合と比較して)。この
タイプの最初の対照実験において、未成熟な胚は３０個の果実から収穫された（
３ヶ月の期間を経て）。それぞれの果実から２５個の胚がコントロールとして用
いられ、２５個の胚がUBI::CycDc-1処理に用いられた。それ故に処理毎に用いら
れた胚の合計数は７５０個となる。コントロール処理での形質転換頻度（開始時
の胚の数と比較した、組換え遺伝子発現する独立したカルス数）は２.４％であ
った。UBI::CycDc-1処理胚に対しては、形質転換頻度は７.２％に増加した。
【０２８３】 第２の実験はトウモロコシCycDa-1およびCycDc-aの遺伝子がコントロール処理
（サイクリン遺伝子は含まれない）と比較して、形質転換頻度増加が引き起こさ
れることが証明した。（上記に示したのと類似した方法で行われた）粒子銃法に
よる導入実験に対して、３個のHi-II果実は10DAPにおいて収穫され、未成熟胚は
３つの処理（処理毎に１２５個の胚）の間で公平に分配した。さらに、形質転換
体は２つのCycD処理において初期段階で現れ、CycD処理の形質転換体の最終的な
数は大幅に高かった（図１を参照）。粒子銃法による導入の後４６日間のGFP発
現による選別をする時、コントロール処理ではGFPを発現多細胞カルスは観察さ
れず、一方、CycDc-1と CycDa-1処理では肉眼で見えるGFP+カルスがそれぞれ０.
７％と２.３％の頻度であった。７７日後、コントロールでの全体的な形質転換
体の頻度は７.４％であり、一方、CycDc-1と CycDa-1では、頻度は１２.０％と
１８.３％にそれぞれ増加していた。加えてCycD処理下でのカルスはコントロー
ル処理下よりも大幅に大きく、これらの遺伝子が成長の割合も促進することを示
唆している。
【０２８４】 細胞周期のプロフィールの違いもまた、コントロール（野生型）細胞と比較し
てCycD発現細胞において観察されている。CycDの過剰発現は細胞分裂を促進する
事を示すために、UBI::CycDを発現しているトウモロコシのカルスの細胞周期プ
ロフィールはセルソータを用いて解析されている（フローサイトメトリー分析）
。フローサイトメトリーは細胞周期を研究するのに標準的な方法であり、たとえ
ば、Sonea IM 等., Am J Vet Res. 1999 60(3): 346-53のような文献に完全に確
立されている手順を用いている。要約すると、Ｇ１期にある細胞数対Ｇ２期にあ
る細胞数を数えることによって、ある集団内での、細胞分裂を進行している細胞
のパーセンテージを推測する。Ｇ１期にある細胞の割合が多ければ多いほど、分
裂している細胞の数は少ない。標準的な培養条件下ではトウモロコシカルス中の
Ｇ１／Ｇ２細胞のおおよそ７０％がＧ１期にある。CycD遺伝子を発現するトウモ
ロコシカルスにおいて、Ｇ１期およびＧ２期における細胞の分布状態の変化が観
察された。１９回のCycDa-1発現の試行の内１４回においてＧ１期の細胞の割合
が６０％以下に減少し、いくつかの場合では３０％にまで落ち込んだ。故にこれ
らの１４回のCycDa-1の試行において、野生型のトウモロコシカルスに比較して
、多くの細胞が細胞分裂を進行中である。異なるCycD遺伝子を用いることでもま
た、形質転換体の細胞周期は変化したが、それは同程度の数の試行においてでは
なかった。細胞の分裂の割合が増加した１９回のCycDa-1発現の試行の内の１４
回に比べて、３２回のCycDc-1発現の試行の２回だけがＧ１細胞の比率が６２％
よりも低いことを示している。類似したベクター遺伝子を発現させたが、CycD遺
伝子を欠如させたコントロールカルスでは、細胞周期プロフィールは非処理の野
生型トウモロコシカルスらのものと類似していた。
【０２８５】 CycDa-1とCycDc-1処理からのカルスらは簡単に再生した。健康で稔性のある遺
伝子組換え植物は温室で生育する。CycD遺伝子組換え植物の種子のセットはコン
トロール植物と類似しており、遺伝子組換した子孫世代は回収された。
【０２８６】 あるCycD遺伝子に対してより高い発現レベルが形質転換に改良したことが観察
された。この粒子銃法の実験（粒子銃法による導入）（上記に示したのと類似し
た方法で行われた）に対しては、３個のHi-II果実が10DAPにおいて収穫され、未
成熟胚は３つの処理（処理毎に１２５個の胚）の間で公平に分配した。この処理
は非サイクリンコントロール（UBI::PAT〜GFP::pinII）または３つのサイクリン
発現プラスミド（UBI::CycDc-1、nos::CycDc-1またはUBI::Da-1）のうちの１つ
を加えたUBI::PAT〜GFP::pinIIマーカーを含めていた。CycDc-1遺伝子に対して
、この実験は高レベル（UBI）でのサイクリン発現を低レベルのもの（nos）と比
較している。図２を見たとき、コントロール処理の形質転換頻度は３.０％であ
った。UBIプロモーターによって発現が進められるとき、CycDc-1とCycDa-1遺伝
子の形質転換頻度はそれぞれ１４.４％と１７.６％である。しかしながら、nos
プロモーターの下流にCycD-１遺伝子を配置するとコントロールと類似した形質
転換を引き起こした（１.６％）。この結果に基づいて、より高い発現レベルは
それに対応して形質転換体の高い回収率を引き起こす。
【０２８７】 実施例６：化学薬品による選択を用いない形質転換体の同定 CycD遺伝子を選択マーカーの付加をせずに導入した時、周囲の野生型（形質転
換されていない）組織よりも早く成長する能力によってトランスジェニック・カ
ルスを同定することができる。トランスジェニック・カルスはPCRやサザン分析を
用いて確認することができる。どのカルスがbar遺伝子を発現しているか、また
、どれがトウモロコシCycD遺伝子を正常な野生型細胞よりも高いレベルで発現し
ているか、ノーザン分析によっても確認することができる（細胞から新たに単離
したmRNAとプローブとのハイブリダイゼーションに基づく）。
【０２８８】 誘導可能な発現： CycD遺伝子は、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーターのような誘導可能
なプロモーターと共にカセットにクローン化することができる。発現ベクターを
植物細胞に共導入し、バイアラフォスによる選択後、形質転換細胞を毒性緩和剤
（誘導剤）にさらす。この化学物質によるCycDの誘導は、Ｇ１／Ｓ移行の刺激お
よびより速い細胞分裂を生じさせる。ノーザン分析、またはＲＴ−ＰＣＲ（トラ
ンス遺伝子特異的プローブ／オリゴペアを用いて）によってZmCycD RNAの存在を
、CycD特異的抗体を用いたウエスタン分析、またはハイブリダイゼーション法を
用いてCycDがコードするタンパク質を、その細胞について調べる。増加したＤＮ
Ａ複製は、BrdU標識とそれに続くこのチミジン類似物を取り込んだ細胞の抗体に
よる検出によって検出できる。同様に、他の細胞周期分裂分析は、上述のように
使用することができる。
【０２８９】 実施例７：組織特異的または細胞特異的プロモーターを用いたCycD遺伝子発現
の制御は異なる成長の利益を提供する 組織特異的または細胞特異的プロモーターを用いたCycD遺伝子発現は、その発
現組織もしくは細胞の細胞周期の進行を活性化する。例えば、種子特異的プロモ
ーターの使用は細胞分裂率を上昇させ、結果として種子の生物量は増大する。代
わるべきものとして、強く発現される、初期の房に特異的なプロモーターでのCy
cD発現はこの全ての生殖構造の発達を促進する。
【０２９０】 他の細胞型の、および／または、異なる発達段階のCycDの発現は同様に細胞分
裂率を活性化する。シロイロナズナ（Arabidopsis）で観察された結果（Doerner
ら、1996）と同様に、根特異的または根に優先的なCycDの発現は大きな根および
早い成長（即ち、より多くの生物量蓄積）という結果を生じさせる。
【０２９１】 実施例８：分裂組織の形質転換 分裂組織の形質転換のプロトコルは、先端の始原細胞または、細胞損傷もしく
は選択的な抑性による再生に続いて先端の始原細胞になりうる細胞の形質転換に
基づく。これらの先端の始原細胞の祖先は分化して組織および成熟した植物の器
官（即ち葉、茎、穂、房など）を形成する。ほとんどの被子植物の分裂組織はそ
れぞれ自身の始原細胞セットを有する層をなしている。通常、若枝の先端はこれ
らの層がほとんど混ざっていない。トウモロコシにおいては先端の分裂組織の外
層L1は分化して、表皮を形成し、一方、内層L2の細胞の派生物は配偶子を含む植
物内部の一部分になる。これらの層の各々の始原細胞は位置によってただ一つに
決定されており、それが死んだり、易感染性になったときは隣接した細胞がそれ
に代わることができる。分裂組織の形質転換はしばしば先端の始原細胞の集合体
を標的とし、結果として植物体はキメラとなる。たとえば、もし、分裂組織のL1
層の始原細胞の４分の１が形質転換されたならば、1/4の表皮だけが形質転換さ
れるだろう。選択的な抑圧を領域の拡大に用いることができるが、多くの細胞集
団が分裂組織の機能と生存を必要とするので、この選択は非致死でなければなら
ない。先端の分裂組織で作動する（分裂組織特異的もしくは構成性）プロモータ
ーの発現下でのサイクリンＤ発現カセットによる先端の始原細胞の形質転換は、
形質転換した細胞の成長を早め、分裂組織を均質に向かわせる野生型の始原細胞
を排除し、植物体のキメラの性質を最小化する。これを立証するためにCycD遺伝
子を分裂組織中で作動するプロモーター（即ち第一ユビキチンイントロンを含む
ユビキチンプロモーターのような構成性トウモロコシプロモーター、またはトウ
モロコシヒストン、cdc2またはアクチンのプロモーターのような分裂組織細胞で
作動するプロモーター）を持ったカセットにクローン化している。子葉鞘期の胚
を単離し、高ショ糖成熟培地（Loweら、1997を参照）上で培養する。サイクリン
Ｄ発現カセットはUbi:GUS:pinIIのようなレポーターコンストラクトと共に、慣
用される粒子銃形質転換プロトコルを用いて露出した先端の円頂に（好ましくは
単離後24時間）共導入することができる。対照として、CycDコンストラクトを等
量のpUCプラスミドＤＮＡに取り換えることができる。成熟培地上で一週間から
１０日の培養した後、胚は低ショ糖でホルモンを含まない発芽培地に植え継ぎが
可能である。GUS染色のために発達中の植物の葉を採取することが可能である。
分裂組織細胞でのCycD遺伝子の一過性の発現は、Ｇ１→Ｓの移行の活性化を通し
て、組換え頻度の上昇およびその後のトランスジェニック領域の拡大という結果
を生じさせる。CycD遺伝子の組換えおよび発現は、発現細胞に競合的な長所をも
たらし、トランスジェニック領域の進行性拡大という結果を生じるだろう。CycD
を発現している分裂組織細胞の成長率の増加によって、それらは植物が生長して
いる間に野生型の分裂組織細胞に取って代わる。その結果、トランスジェニック
領域の拡大が、付与された細胞層（即ち周縁部の拡大）および隣接した細胞層（
即ち周縁部以外の侵略）において起こる。分裂組織は増加的に大きな領域がCycD
発現細胞で占められ、故にCycD生殖細胞の遺伝の頻度は上昇するはずである。
【０２９２】 実施例９：CycDカセット除去のためのFlp/Frtシステムの使用 CycD遺伝子が組み込まれ、CycDの発現がトウモロコシトランスジェニックの再
生に有用であるが、最終的にはその最終生産物が所望されない場合、CycD発現カ
セット（または適当なFRT組換え配列に隣接するその一部分）はFLPを介した組換
えを用いて除くことができる（1997年11月18日出願のイネ国特許出願第08/972,2
58号明細書を参照）。
【０２９３】 上記実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を何ら制限す
るものではない。本発明の他の変形は当業者であれば容易であり、添付した特許
請求の範囲に包含される。本明細書にて引用した全ての文献、特許および特許出
願は引用することにより組み込む。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ZmCycD遺伝子を用いていない形質転換と比較した、ZmCycD遺伝子を含有する処
理における形質転換の頻度を表している。
【図２】 ZmCycD遺伝子を用いていない形質転換と比較した、ZmCycD遺伝子を含有する処
理における形質転換の頻度を表している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウィリアム・ジェイ・ゴードン−カム アメリカ合衆国アイオワ州50322．アーバ ンデイル．シクスティセブンス・ストリー ト3916 (72)発明者 カロリン・エイ・グレゴリー アメリカ合衆国アイオワ州50302．クライ ヴ．エヌ・ダブルユー・ワンハンドレッド アンドサーティセブンス・コート1411 (72)発明者 ジョン・エイ・マケルヴァー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27712． ダーラム．ゲイトウッドドライブ5112 (72)発明者 ジョージ・ジェイ・ハースター アメリカ合衆国アイオワ州50310．デモイ ン．ペインロード2623 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD06 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD14 CD17 4B024 AA08 BA80 CA04 CA07 DA01 EA04 FA02 GA11 GA27 HA11 4B063 QA05 QQ21 QQ43 QQ53 QQ79 QR33 QR76 QS05 QS36 QS38 QX10 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 BB01 BC01 BD50 CA24 CA47 CA53 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA31 EA05 EA50 FA74

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ） SEQ ID NO: ２, 12, 14, または22に示されるポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ） SEQ ID NO: ３２10, 15-20 または23-30に示されるプライマーを用いて
    単子葉類の核酸ライブラリーから増幅されるポリヌクレオチド； （ｃ） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または 21に示される２０個の連続する塩基を
    有するポリヌクレオチド； （ｄ） 単子葉類のサイクリンＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド； （ｅ） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または 21に示されるコーディング領域全体と
    少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ここで同一性％
    は５０のギャップクリエーションペナルティおよび３のギャップエクステンショ
    ンペナルティを使用するＧＣＧ／ベストフィットプログラムを使用して決定され
    る； （f） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または 21により特徴付けられる核酸とストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ここでその
    条件は６０〜６５℃で０.１×ＳＳＣで洗浄することを包含する； （ｇ） SEQ ID NO: 1, 11, 13, または 21に示される配列により特徴付けられ
    るポリヌクレオチド； （ｈ） SEQ ID NO: 3-10, 15-20 または 23-30に示されるプライマーを用いて
    トウモロコシ（Zea mays）の核酸ライブラリーから増幅される単離した核酸 （ｉ）（ａ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド；および （ｊ） ＡＴＣＣに受託番号９８８４７または９８８４８にて寄託された配列を
    有するポリヌクレオチド からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたは核酸を含む単離した核酸。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがトウモロコシ由来である、請求項１に記
    載の短はなした核酸。
  3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1, 11, 13, または21よりな
    る群から選択される配列を有する、請求項１に記載の単離した核酸。
  4. 【請求項４】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の単離し
    た核酸。
  5. 【請求項５】 ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸配列に連結され
    ている、請求項１に記載の単離した核酸。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の核酸を少なくとも１つ含むベクター。
  7. 【請求項７】 センスまたはアンチセンスの向きにてプロモーターに作動的
    に連結されている、請求項１に記載の核酸を含む組換え発現カセット。
  8. 【請求項８】 核酸がアンチセンスの向きにてプロモーターに作動的に連結
    されている、請求項７に記載の組換え発現カセット。
  9. 【請求項９】 請求項７に記載の組換え発現カセットを含む宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 植物細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 トウモロコシ、大豆、サトウモロコシ、ヒマワリ、サフラ
    ワー、小麦、イネ、アルファルファまたは脂肪種子アブラナの細胞である、請求
    項１０に記載の宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 少なくとも１つの請求項７に記載の発現カセットを含むト
    ランスジェニック植物。
  13. 【請求項１３】 トウモロコシ、大豆、サトウモロコシ、ヒマワリ、サフラ
    ワー、小麦、イネ、アルファルファまたは脂肪種子アブラナである、請求項１２
    に記載の植物。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の植物由来の種子。
  15. 【請求項１５】 請求項１３に記載の植物由来の種子。
  16. 【請求項１６】 （ａ）SEQ ID NO: 2, 12, 14, または 22に示されるアミ
    ノ酸の少なくとも２５個の連続したアミノ酸を含むポリペプチド； （ｂ）単子葉類のサイクリンＤタンパク質であるポリペプチド； （ｃ）SEQ ID NO: 2, 12, 14, または 22に示される配列と少なくとも６５％の
    配列同一性を含むポリペプチドであって、ここで配列同一性％は配列全体に基づ
    き、デフォルトパラメータを使用するＧＡＰ１０により決定されるものである； （ｄ）請求項１に記載の核酸によりコードされるポリペプチド；および （ｅ）SEQ ID NO: 2, 12, 14, または22により特徴付けられるポリペプチド からなる群から選択されるポリペプチドを含む単離したタンパク質。
  17. 【請求項１７】 ポリペプチドが触媒的に活性である、請求項１６に記載の
    タンパク質。
  18. 【請求項１８】 請求項１６に記載のタンパク質をコードするリボ核酸配列
    。
  19. 【請求項１９】 （ａ） 作動的にプロモーターに連結されたサイクリンＤ
    のポリヌクレオチドを含む組換え発現カセットで細胞を形質転換し； （ｂ） 細胞中のサイクリンＤタンパク質を調節するのに十分なポリヌクレオチ
    ドの発現を誘導し得る時間、細胞増殖条件下で細胞を増殖させる ことからなる、細胞中のサイクリンＤタンパク質のレベルを調節する方法。
  20. 【請求項２０】 サイクリンＤタンパク質が増加する、請求項１９に記載の
    方法。
  21. 【請求項２１】 サイクリンＤタンパク質が減少する、請求項１９に記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】 細胞中のサイクリンＤタンパク質のレベルを、サイクリン
    Ｄのリボ核酸を導入することにより一時的に調節する、請求項１９に記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】 サイクリンＤタンパク質が細胞分裂を変化させるのに十分
    な量で存在する、請求項１９に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 サイクリンＤタンパク質が分裂細胞数を増加させるのに十
    分な量で存在する、請求項１９に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 サイクリンＤタンパク質が形質転換の頻度を向上させるの
    に十分な量で存在する、請求項１９に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 サイクリンＤタンパク質が細胞増殖を変化させるのに十分
    な量で存在する、請求項１９に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 サイクリンＤタンパク質が細胞に対して陽性増殖効果を付
    与するのに十分な量で存在する、請求項１９に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 サイクリンＤタンパク質が増殖速度を増加させるのに十分
    な量で存在する、請求項１９に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 細胞が植物細胞であり、植物細胞がサイクリンＤタンパク
    質を発現し得る植物を再生させるのに適する条件下で増殖する、請求項１９に記
    載の方法。
  30. 【請求項３０】 植物細胞がトウモロコシ、大豆、小麦、イネ、アルファル
    ファ、ヒマワリまたはカノーラ由来である、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 サイクリンＤタンパク質が収穫高を増加させるのに十分な
    量で存在する、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 サイクリンＤタンパク質が植物の高さまたは大きさを変化
    させるのに十分な量で存在する、請求項２９に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 サイクリンＤタンパク質が器官の成長を促進または阻害す
    るのに十分な量で存在する、請求項２９に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 器官が種子、根、芽、穂、房、茎、花粉または雄しべであ
    る、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、器官を除去
    させる、請求項３３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、単為結実さ
    せる、請求項２９に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、雄性不稔植
    物を作成する、請求項２９に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 サイクリンＤタンパク質が胚形成応答を促進するのに十分
    な量で存在する、請求項２９に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 サイクリンＤタンパク質がカルス誘導を増進させるのに十
    分な量にて存在する、請求項２９に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、陽性選択を
    付与する、請求項２９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、植物再生を
    増進させる、請求項２９に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、細胞がＧ１
    期またはＧ０期において停止する時間の比率を変化させる、請求項２９に記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、細胞が特定
    の細胞周期に留まる時間を変化させる、請求項２９に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、脱水、熱ま
    たは寒さを包含する環境ストレスに対する細胞の応答を向上させる、請求項２９
    に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、植物当たり
    の鞘の数を増加させる、請求項１９に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、鞘または穂
    当たりの種子の数を増加させる、請求項２９に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、種子の発生
    における遅延時間を変化させる、請求項２９に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、細胞増殖に
    依存しないホルモンを供給する、請求項２９に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 サイクリンＤタンパク質のレベルを調節して、生物反応器
    中の細胞の増殖速度を増加させる、請求項１９に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 サイクリンＤリボ核酸を導入することにより細胞中のサイ
    クリンＤタンパク質のレベルを一時的に調節する、請求項１９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 サイクリンＤポリペプチドを導入することからなる、植物
    細胞中のサイクリンＤタンパク質のレベルを一時的に調節する方法。
  52. 【請求項５２】 請求項１に記載の核酸配列を、ＤＮＡ結合ドメインをコー
    ドする第２の核酸配列に連結することを含む、サイクリンＤと相互作用するタン
    パク質を特定する方法。
JP2000574263A 1998-09-23 1999-09-21 サイクリンｄのポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにそれらの使用 Pending JP2002526080A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10155198P 1998-09-23 1998-09-23
US60/101,551 1998-09-23
PCT/US1999/021946 WO2000017364A2 (en) 1998-09-23 1999-09-21 Cyclin d polynucleotides, polypeptides and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002526080A true JP2002526080A (ja) 2002-08-20

Family

ID=22285242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000574263A Pending JP2002526080A (ja) 1998-09-23 1999-09-21 サイクリンｄのポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにそれらの使用

Country Status (7)

Country Link
US (6) US6518487B1 (ja)
EP (1) EP1115868A2 (ja)
JP (1) JP2002526080A (ja)
AU (1) AU769488B2 (ja)
CA (1) CA2343697A1 (ja)
IL (1) IL142122A0 (ja)
WO (1) WO2000017364A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023018066A (ja) * 2015-03-16 2023-02-07 中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所 植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1338652A3 (en) * 1998-03-23 2004-05-19 E.I.Du pont de nemours and company Plant cell cyclin genes
AU3103599A (en) * 1998-03-23 1999-10-18 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant cell cyclin genes
DE60020248T2 (de) * 1999-09-15 2006-01-26 Purdue Research Foundation, West Lafayette Erhöhte transformation von pflanzenzellen durch hinzufügen von wirtsspezifischen genen, welche an der t-dna-integration beteiligt sind
US6696622B1 (en) 1999-09-15 2004-02-24 Purdue Research Foundation Enhanced plant cell transformation by addition of host genes involved in T-DNA integration
US7122716B2 (en) 1999-09-15 2006-10-17 Purdue Research Foundation Enhanced plant cell transformation by addition of host genes involved in T-DNA integration
WO2001023594A2 (en) * 1999-09-27 2001-04-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced stress tolerance in maize via manipulation of cell cycle regulatory genes
CZ302015B6 (cs) 1999-10-08 2010-09-08 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Inhibitory Fab I
AU2001269074A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-24 Cropdesign N.V. A novel plant cyclin
US6512165B1 (en) * 2000-07-10 2003-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for enhancing plant transformation frequencies
US7279336B2 (en) 2000-09-14 2007-10-09 Gelvin Stanton B Methods and compositions for enhanced plant cell transformation
AU2004260931B9 (en) 2003-04-29 2012-01-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Novel glyphosate-N-acetyltransferase (GAT) genes
ATE420640T1 (de) * 2001-04-06 2009-01-15 Affinium Pharm Inc Fab-i-inhibitoren
MXPA04002817A (es) 2001-09-27 2004-07-05 Pioneer Hi Bred Int Polinucleotidos de fitato y metodos de uso.
WO2003087313A2 (en) 2002-04-08 2003-10-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced silk exsertion under stress
MXPA05001287A (es) 2002-08-06 2005-08-03 Verdia Llc Variantes de amino oxidasa ap1.
DK1575951T3 (da) * 2002-12-06 2014-09-15 Debiopharm Int Sa Heterocykliske forbindelser, fremgangsmåder til fremstilling deraf og deres anvendelse i terapi
EP1608377B1 (en) * 2003-03-17 2008-10-01 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising inhibitors of fab i and further antibiotics
CN103333885A (zh) 2003-06-23 2013-10-02 先锋高级育种国际公司 将单基因控制的保绿潜力工程化进植物中
US7371927B2 (en) * 2003-07-28 2008-05-13 Arborgen, Llc Methods for modulating plant growth and biomass
US20070169227A1 (en) 2003-12-16 2007-07-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same
BRPI0508573A (pt) * 2004-03-10 2007-08-14 Cropdesign Nv métodos para melhorar o rendimento de planta e para a produção de uma planta transgênica, plantas, construto, partes capazes de serem colhidas, e, uso de um ácido nucleico isolado codificador de ciclina d3 operacionalmente ligado em um promotor
SI1828167T1 (sl) * 2004-06-04 2014-12-31 Debiopharm International Sa Forum "Apres-Demain" Akrilamidni derivati kot anitibiotična sredstva
BRPI0512904A (pt) 2004-06-30 2008-04-15 Pioneer Hi Bred Int método para o aumento da resistência de plantas a patógenos de fungo
BRPI0512920B1 (pt) 2004-07-02 2017-05-16 Du Pont cassete de expressão, microorganismo transformado, método para indução de resistência a patógeno de planta em uma planta, composição anti-patogênica e método para proteção de uma planta contra um patógeno de planta
EP1831376A1 (en) 2004-12-28 2007-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved grain quality through altered expression of seed proteins
ATE491797T1 (de) * 2005-03-25 2011-01-15 Cropdesign Nv Pflanzen mit erhöhtem ertrag und verfahren zur herstellung davon
WO2006127310A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving crop plant architecture and yield
EP1945776A2 (en) 2005-11-10 2008-07-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Dof (dna binding with one finger) sequences and methods of use
WO2007067416A2 (en) * 2005-12-05 2007-06-14 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclylacrylamide compounds as fabi inhibitors and antibacterial agents
BRPI0707413A2 (pt) 2006-02-09 2011-05-03 Pioneer Hi Bred Int genes para aprimoramento da eficiência de utilização do nitrogênio em culturas
CA2638739A1 (en) 2006-03-01 2007-09-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions related to the quantitative trait locus 6 (qtl6) in maize and methods of use
AR060523A1 (es) 2006-04-19 2008-06-25 Pioneer Hi Bred Int Moleculas de polinucleotidos aislados que corresponden a alelos mutantes y tipo salvaje del gen de maiz d9 y metodos para usarlas
EP2027276B1 (en) 2006-05-16 2011-02-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antifungal polypeptides
EP2018435B1 (en) 2006-05-17 2012-07-11 Pioneer Hi-Bred International Inc. Artificial plant minichromosomes
US7951995B2 (en) 2006-06-28 2011-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
EP2054422B1 (en) 2006-07-20 2017-06-14 Debiopharm International SA Acrylamide derivatives as fab i inhibitors
WO2008098374A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Salts, prodrugs and polymorphs of fab i inhibitors
WO2008145629A2 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Cropdesign N.V. Yield enhancement in plants by modulation of maize alfins
US8367895B2 (en) 2008-01-17 2013-02-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for the suppression of target polynucleotides from the family aphididae
US8847013B2 (en) 2008-01-17 2014-09-30 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods for the suppression of target polynucleotides from lepidoptera
CN102197137A (zh) 2008-10-30 2011-09-21 先锋国际良种公司 对谷氨酰胺合成酶(gs)进行操作以改善高等植物中的氮利用效率和籽粒产量
US8334429B2 (en) 2008-12-31 2012-12-18 Pioneer Hi Bred International Inc Auxotrophic Agrobacterium for plant transformation and methods thereof
BRPI1008674A2 (pt) 2009-02-19 2015-08-25 Pioneer Hi Bred Int Métodos de redução do desenvolvimento de pragas resistentes.
EA201171245A1 (ru) 2009-04-14 2012-05-30 Пайонир Хай-Бред Интернешнл, Инк. Модуляция acc-синтазы, улучшающая урожайность растений при условиях низкого содержания азота
CN102439032B (zh) 2009-05-04 2015-07-22 先锋国际良种公司 通过调节ap2转录因子增加植物中的产量
US9175301B2 (en) 2009-07-24 2015-11-03 Pioneer Hi Bred International Inc Use of dimerization domain component stacks to modulate plant architecture
US20110035843A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel eto1 genes and use of same for reduced ethylene and improved stress tolerance in plants
US8592649B2 (en) 2009-08-20 2013-11-26 Pioneer Hi Bred International Inc Functional expression of shuffled yeast nitrate transporter (YNT1) in maize to improve nitrate uptake under low nitrate environment
US20110061132A1 (en) 2009-08-20 2011-03-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Functional expression of yeast nitrate transporter (ynt1) in maize to improve nitrate uptake
EP3098317B1 (en) 2009-08-28 2018-08-22 E. I. du Pont de Nemours and Company Compositions and methods to control insect pests
BR112012007516A2 (pt) 2009-10-02 2015-09-15 Pioneer Hi Bred Int ácido nucléico isolado, plantas , células vegetais, métodos de redução de produção de etileno em uma planta, de aumento de produtividade em uma planta e de aumento de tolerância à aridez, cassete de expressão e semente
CA2785530A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-23 Danisco Us Inc. Membrane bioreactor for increased production of isoprene gas
WO2011082304A1 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineering plant resistance to diseases caused by pathogens
MX2012007855A (es) 2010-01-06 2013-06-05 Du Pont Identificacion de ritmos diurnos en tejidos fotosinteticos del zea mays y uso en el mejoramiento de plantas de cultivo.
BR112012018618A2 (pt) 2010-01-26 2017-01-10 Pioneer Hi Bred Int método para seleção de uma planta ou germoplasma apresentando tolerãncia, tolerãncia aumentada, susceptibilidade, ou susceptibilidade aumentada a um ou mais herbicidas, planta, kit para seleção de pelo menos uma planta de soja, método de triagem de uma soja, método para controlar de modo seletivo plantas daninhas, método para triar de modo seletivo plantas de soja para tolerância a um ou mais herbicidas
WO2011163590A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for enhancing resistance to northern leaf blight in maize
US8993837B2 (en) 2010-08-13 2015-03-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc Chimeric promoters and methods of use
CA2807785A1 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel defensin variants and methods of use
WO2012071039A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Pioner Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
WO2012071040A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
TWI667347B (zh) 2010-12-15 2019-08-01 瑞士商先正達合夥公司 大豆品種ｓｙｈｔ０ｈ２及偵測其之組合物及方法
BR112013015515A2 (pt) 2010-12-28 2018-04-24 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada da planta, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição, método para controlar uma população de praga de lepidóptero, método para matar uma praga de lepidóptero, método para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida, planta que tem incorporado de maneira estável em seu genoma um construto de dna, método para proteger uma planta contra uma praga
CN103796507B (zh) 2011-02-01 2017-09-01 科罗拉多小麦研究基金会公司 乙酰辅酶a羧化酶除草剂抗性植物
CN103459601A (zh) 2011-02-11 2013-12-18 先锋国际良种公司 具有对抗玉米根虫的活性的合成杀昆虫蛋白
US8878007B2 (en) 2011-03-10 2014-11-04 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US9090906B2 (en) 2011-03-30 2015-07-28 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Mutant Bacillus thuringiensis cry genes and methods of use
WO2012148835A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper i-class homeobox gene for improved plant performance
WO2013063344A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineered pep carboxylase variants for improved plant productivity
MX2014005212A (es) 2011-10-31 2014-11-25 Pioneer Hi Bred Int Mejoramiento de la tolerancia a la sequia, eficiencia de uso de nitrogeno y rendimiento de una planta.
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
US9783814B2 (en) 2012-03-13 2017-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
WO2013187554A1 (en) * 2012-06-13 2013-12-19 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology In GENE FOR CONTROLLING NUMBER OF SEEDS PER POD IN SOYBEAN AND USES THEREOF
BR112014031260A2 (pt) 2012-06-15 2019-08-20 Du Pont métodos e composições que envolvem variantes de als com preferência de substrato nativo
US9347105B2 (en) 2012-06-15 2016-05-24 Pioneer Hi Bred International Inc Genetic loci associated with resistance of soybean to cyst nematode and methods of use
MX356695B (es) 2012-06-19 2018-06-11 Debiopharm Int Sa Profarmacos derivados de (e)-n-metil-n-((3-metilbenzofuran-2-il)me til)-3-(7-oxo-5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-3-il) acrilamida.
WO2014042923A1 (en) 2012-09-13 2014-03-20 Indiana University Research & Technology Corporation Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof
US9783820B2 (en) 2012-10-15 2017-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions to enhance activity of Cry endotoxins
WO2014081673A2 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineering plants for efficient uptake and utilization of urea to improve crop production
WO2014100525A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for auxin-analog conjugation
US20150361447A1 (en) 2013-01-25 2015-12-17 Pioneer Hi-Breed International, Inc. Maize event dp-032218-9 and methods for detection thereof
WO2014164014A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants
WO2014164074A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced nitrate uptake and nitrate translocation by over-expressing maize functional low-affinity nitrate transporters in transgenic maize
WO2014164116A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Functional expression of bacterial major facilitator superfamily (sfm) gene in maize to improve agronomic traits and grain yield
CA2905743C (en) 2013-03-13 2021-09-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
CA2903693A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
BR112015023286A2 (pt) 2013-03-14 2018-03-06 Arzeda Corp polipeptídeo recombinante com atividade da dicamba descarboxilase, construto de polinucleotídeo, célula, método de produção de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo tendo atividade da dicamba descarboxilase, método para descarboxilar dicamba, um derivado de dicamba ou um metabolito de dicamba, método para a detecção de um polipeptideo e método para a detecção da presença de um polinucleotideo que codifica um polipeptideo tendo atividade da dicamba descarboxilase
CA3200166A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US20140289906A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions Having Dicamba Decarboxylase Activity and Methods of Use
WO2014152507A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of acc deaminase expression
CN105143454A (zh) 2013-03-15 2015-12-09 先锋国际良种公司 Acc氧化酶多核苷酸和多肽的组合物和使用方法
US11459579B2 (en) 2013-07-09 2022-10-04 Board Of Trustees Of Michigan State University Transgenic plants produced with a K-domain, and methods and expression cassettes related thereto
WO2015006105A1 (en) 2013-07-09 2015-01-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Transgenic plants produced with a k-domain, and methods and expression cassettes related thereto
EP3030072B1 (en) 2013-08-08 2020-03-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof
CN105874062B (zh) 2013-10-18 2021-07-20 先锋国际良种公司 草甘膦-n-乙酰转移酶(glyat)序列以及使用方法
US20170247719A1 (en) 2014-09-17 2017-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CN107074917B (zh) 2014-10-16 2022-05-24 先锋国际良种公司 具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途
EP3207126A4 (en) 2014-10-16 2018-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof
WO2016205445A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
KR20180114177A (ko) 2016-02-26 2018-10-17 데비오팜 인터네셔날 에스 에이 당뇨병성 족부 감염의 치료제
MX2018011298A (es) 2016-03-18 2019-03-07 Pioneer Hi Bred Int Metodos y composiciones para producir gametos clonados, sin reducir, sin recombinar.
US11781151B2 (en) 2016-04-14 2023-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal CRY1B variants having improved activity spectrum and uses thereof
CN109072249B (zh) 2016-04-19 2023-08-18 先锋国际良种公司 具有改善的活性谱的多肽的杀昆虫组合及其用途
CA3022858A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
WO2018060881A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 University Of Florida Research Foundation, Inc. Insect toxin delivery mediated by a densovirus coat protein
WO2018140214A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nematicidal protein from pseudomonas
BR112020012477A2 (pt) 2017-12-19 2020-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. polipeptídeo recombinante; polipeptídeo inseticida recombinante; composição agrícola; construto de dna; célula hospedeira; planta transgênica; método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto ou população de praga; método para controlar a infestação de praga; e método para melhorar o rendimento de uma cultura
US11905518B2 (en) 2018-02-12 2024-02-20 Curators Of The University Of Missouri Small auxin upregulated (SAUR) gene for the improvement of root system architecture, waterlogging tolerance, drought resistance and yield in plants and methods of uses
BR112021020770A2 (pt) * 2019-04-18 2022-01-04 Pioneer Hi Bred Int Fatores de embriogênese para reprogramação celular de uma célula vegetal
EP4192232A2 (en) 2020-08-10 2023-06-14 E. I. du Pont de Nemours and Company Compositions and methods for enhancing resistance to northern leaf blight in maize
WO2022115524A2 (en) 2020-11-24 2022-06-02 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
BR112023023044A2 (pt) 2021-05-06 2024-01-23 Agbiome Inc Genes pesticidas e métodos de uso
CA3239251A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Rebekah Deter Kelly Pesticidal genes and methods of use
WO2024044596A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2024129674A1 (en) 2022-12-13 2024-06-20 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69133537T2 (de) 1990-11-29 2007-05-31 Cropdesign N.V. Kontrolle von pflanzenzellvermehrung und -wachstum
US6066501A (en) 1991-05-16 2000-05-23 Cold Spring Harbor Laboratory D-type cyclin and uses related thereto
WO1992020796A2 (en) 1991-05-16 1992-11-26 Cold Spring Harbor Laboratory D-type cyclin and uses related thereto
US5514571A (en) 1993-08-05 1996-05-07 University Technologies International Inc. Cyclin D1 negative regulatory activity
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
DE19512934C2 (de) * 1995-04-06 2002-04-11 Continental Teves Ag & Co Ohg Bremsscheibe
US6166293A (en) 1996-07-18 2000-12-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of increasing growth and yield in plants
US6252139B1 (en) 1996-07-18 2001-06-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of increasing growth and yield in plants
JP2001519659A (ja) 1997-03-26 2001-10-23 ケンブリッジ・ユニバーシティ・テクニカル・サービシス・リミテッド 修飾された生長を有する植物
CA2307171A1 (en) 1997-10-24 1999-05-06 Cropdesign N.V. A novel mitogenic cyclin and uses thereof
AU3103599A (en) 1998-03-23 1999-10-18 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant cell cyclin genes
US5863875A (en) * 1998-06-24 1999-01-26 The Lubrizol Corporation Coating additive, coating composition containing said additive and method for coating a substrate using said coating composition

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023018066A (ja) * 2015-03-16 2023-02-07 中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所 植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法

Also Published As

Publication number Publication date
US7799566B2 (en) 2010-09-21
AU769488B2 (en) 2004-01-29
CA2343697A1 (en) 2000-03-30
US20100285591A1 (en) 2010-11-11
US20030110529A1 (en) 2003-06-12
EP1115868A2 (en) 2001-07-18
US20030213016A1 (en) 2003-11-13
WO2000017364A3 (en) 2000-07-13
US6518487B1 (en) 2003-02-11
AU6397299A (en) 2000-04-10
US20110167522A1 (en) 2011-07-07
US20080242624A1 (en) 2008-10-02
IL142122A0 (en) 2002-03-10
WO2000017364A2 (en) 2000-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7799566B2 (en) Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof
CA2329056A1 (en) Cell cycle genes, proteins and uses thereof
US6194638B1 (en) Alteration of hemicellulose concentration in plants
US6313375B1 (en) Maize aquaporins and uses thereof
US6313376B1 (en) Maize aquaporins and uses thereof
US20080060099A1 (en) Cell Cycle Nucleic Acids, Polypeptides and Uses Thereof
US6809183B2 (en) RecA proteins
WO2000047614A1 (en) Transgenic plants with modified expression of the dp protein
JP2002523096A (ja) トウモロコシＫｕ７０オーソログおよびその使用
US20060281910A1 (en) Alternative splicing factors polynucleotides, polypeptides and uses thereof
JP2002537000A (ja) トウモロコシアデノシンデアミナーゼｃＤＮＡおよびその使用
AU3983399A (en) Zea mays phosphate transporter genes and uses thereof
JP2002530082A (ja) トウモロコシｄｎａリガーゼｉオーソログおよびその使用
JP2002543782A (ja) 新規なトウモロコシｒａｄ５１様遺伝子およびその使用
CZ2000715A3 (cs) Geny kódující enzymy pro biosyntézu ligninu a jejich použití
MXPA00011008A (en) Zea mays phosphate transporter genes and uses thereof
JP2003505089A (ja) Ｄｎａリガーゼｉｉオーソログおよびその使用
JP2002528080A (ja) トウモロコシｋｉｎ１７オーソロガスおよびその使用