CN103459601A - 具有对抗玉米根虫的活性的合成杀昆虫蛋白 - Google Patents

Abstract

传统上影响昆虫害虫群体的主要方法是施用广谱化学杀昆虫剂。然而，人们越来越担忧与合成化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。因此，人们有极大兴趣开发替代杀虫剂，包括使用微生物剂或另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治。本发明提供了用于此类生物防治的组合物和方法。本发明公开了经修饰的Cry3杀虫多肽、编码此类多肽的多核苷酸和使用方法。本发明提供的经修饰的多核苷酸可用于转化生物体和宿主细胞，所述宿主包括植物、昆虫和微生物。经修饰的多肽的表达可为所述宿主提供对抗一种或多种昆虫病原体的改善的杀昆虫活性。

Description

具有对抗玉米根虫的活性的合成杀昆虫蛋白

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物害虫防治领域。更具体地讲，本发明涉及得自编码δ-内毒素的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Cry3家族基因的核酸，δ-内毒素的特征在于对昆虫害虫具有杀虫活性。本发明的组合物和方法利用所公开的核酸及其编码的经修饰杀虫多肽来防治害虫。

背景技术

昆虫害虫是造成农作物损失的主要因素。西方玉米根虫(Diabroticavirgifera virgifera LeConte)是北美洲最具破坏性的玉米根虫物种之一，特别是在中西部玉米种植区。相关的物种北方玉米根虫(D.barberi Smith andLawrence)共栖于大部分范围内，并且在生物学方面与西方玉米根虫相当类似。第三种玉米根虫物种南方玉米根虫(D.undecimpunctata howardi)在其他区域造成重大经济损失。

玉米根虫幼虫如果未经治理可破坏相当百分比的玉米。在美国，目前估计有3千万英亩(120,000km²)的玉米（总种植面积8千万）受到玉米根虫侵扰，并且预计在下个20年该区域会蔓延。美国农业部估计玉米根虫每年造成10亿美元的收入损失，这包括8亿美元的产量损失和玉米种植户2亿美元的治理成本。

玉米的大部分损害由幼虫摄食造成。新孵化的根虫位于土壤中的玉米根部，最初在细根毛上开始摄食并钻入玉米植物的根尖。随着幼虫长大，它们在主根上摄食并掘入初生根。当大量根虫出现时，幼虫摄食以及根腐病原体对受损根的腐化可造成根缩减至茎基部。严重的根损伤可妨碍根输送水和营养物质进植物中的能力，从而减缓植物生长并造成谷物产量下降。严重的根损伤还可造成玉米植株倒伏，使得收获更困难。成虫摄食穗丝可造成穗丝缩减至穗尖，通常称为穗丝剪断(silk clipping)。在饲料玉米中，甲虫群体有时会大得足以在散粉期间造成严重的穗丝剪断，这可能会妨碍授粉。

根萤叶甲属(Diabrotica)（鞘翅目：叶甲科）的玉米根虫属于美国农作物最重要的昆虫害虫。例如，南方玉米根虫(SCRW)(Diabroticaundecimpunctata howardi Barber)是玉米、葫芦和花生的经济上重要的害虫。南方玉米根虫黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardiBarber)或十一星瓜叶甲(spotted cucumber beetle)广泛分布于北美洲，出现于落基山脉东部的大部分地区、加拿大南部和墨西哥。在美国南部最为众多并最具破坏性。这种昆虫为多化性的并且在其分布的南部以成虫过冬（Branson和Krysan(1981)Environmental Entomology（《环境昆虫学》）10:826-831）。南方玉米根虫感染许多饲料作物和杂草的根部，以及花生、苜蓿且有时为葫芦的根部。每年，有2千万至2千5百万英亩的玉米用土壤杀昆虫剂处理以保护作物不被玉米根虫幼虫摄食损害（Fuller等人(1997)J Econ Entomol（《经济昆虫学杂志》）90:1332-1340）。对玉米根虫施加的土壤杀昆虫剂代表美国杀昆虫剂的主要用途之一。每年与施加以防治幼虫损害玉米根和防治成虫损害玉米穗丝的杀昆虫剂相关的成本，连同作物损失一起可接近10亿美元（Metcalf(1986)，载于：M.Kogan[编辑]，Ecological Theory and Integrated Pest Management Practice（《生态学理论与害虫综合治理实践》）。纽约的约翰·威利父子出版公司(John Wiley &Sons,New York)）。

使用微生物剂如真菌、细菌或另一种昆虫物种对农业上重要的昆虫害虫进行生物防治，可提供具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言，使用生物杀虫剂具有更低的污染和环境危害风险。与传统的广谱化学杀昆虫剂的特征相比，生物杀虫剂还提供更高的靶标特异性。生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济产量。

微生物杀昆虫剂特别是那些从芽孢杆菌(Bacillus)菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。已知芽孢杆菌属微生物的某些物种对于多种昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫害虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等等。苏云金芽孢杆菌和日本金龟芽孢杆菌(Bacilluspapilliae)是至今为止发现的最成功的生物控制剂的代表。幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)的菌株（Harwook编辑，((1989)Bacillus（《芽孢杆菌》）（普莱南出版社(Plenum Press)），306）和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株（国际专利申请公布No.WO96/10083）也被指出具有昆虫致病性。杀虫活性看起来集中在伴胞晶体蛋白包涵体中，但从芽孢杆菌的营养生长期也分离到杀虫蛋白。有数种编码这些杀虫蛋白的基因已得到分离和表征（参见例如美国专利No.5,366,892和No.5,840,868）。

最近，农业科学家通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，开发出了抗虫性增强的作物。例如，已对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从苏云金芽孢杆菌的菌株分离的杀虫蛋白。这些蛋白称为δ-内毒素或Cry毒素（参见例如，Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.（《细胞分子生命科学》）59(3):417-425；Schnepf等人(1998)MicrobiolMol Biol Rev.（《微生物分子生物学评论》）62(3):775-806）。这些经遗传工程改造的作物目前在美国农业中广泛应用，给农场主提供了替代传统昆虫防治方法的环境友好的方案。另外，经遗传工程改造而含有杀虫Cry毒素的马铃薯已被出售给美国农场主。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物已证明在商业上十分成功，但它们对仅仅较窄范围的经济上重要的昆虫害虫具有抗性。

因此，仍然需要具有更广范围对抗昆虫害虫的杀昆虫活性的新型Bt毒素，包括例如具有对抗鞘翅目的更多种类昆虫的活性的毒素。此外，仍然需要具有对抗多种昆虫害虫的活性的生物杀虫剂和具有改善的杀昆虫活性的生物杀虫剂。

发明内容

提供了保护植物免受植物害虫侵害的组合物和方法。该组合物包含Cry3杀虫多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。本发明所公开的多肽展现出增强的对植物害虫的杀虫活性。还提供了包含编码本发明的杀虫多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施例中，本发明的经修饰的Cry多肽展现出相对于Cry3天然多肽(SEQ ID NO:6)改善的杀虫活性。

本发明的组合物包含编码经修饰的Cry3杀虫多肽的序列的核酸分子、含有那些核酸分子的载体以及含有所述载体的宿主细胞。组合物还包含多肽序列。核苷酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，该DNA构建体或表达盒用于在生物体（包括微生物和植物）中转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以为设计用于在生物体（包括但不限于微生物或植物）中表达的合成序列。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。

具体地讲，提供了具有改善活性的经修饰的Cry3蛋白。使用计算机模拟(in silico)蛋白质序列设计和DNA改组，鉴定了具有改善的对抗鞘翅目害虫的杀昆虫活性的多肽。提供了用于产生本发明的经修饰的多肽和使用此类多肽防治或杀灭所关注害虫（特别是鞘翅目害虫）的方法。

本发明的组合物和方法可用于产生具有杀虫剂抗性的生物体，特别是细菌和植物。这些生物体和衍生自它们的组合物对农业用途而言是理想的。本发明的组合物还可用于生成改变的或改善的杀虫蛋白。

本发明涵盖以下实施例：

1.一种经修饰的Cry3杀虫多肽，所述多肽具有一个或多个氨基酸置换，该氨基酸置换赋予所述多肽在pH为5至9的溶液中更大的溶解度。

2.实施例1的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述一个或多个置换位于选自如下位置的位置，所述位置对应于SEQ ID NO:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610。

3.一种经修饰的Cry3杀虫多肽，所述多肽包含至少一个氨基酸置换，其中所述置换使所述多肽比野生型Cry3多肽的碱性更弱。

4.实施例3的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述置换包括将碱性氨基酸替换为中性或酸性氨基酸，将中性氨基酸替换为酸性氨基酸，或它们的组合。

5.实施例3的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述置换位于选自如下位置的位置：所述位置对应于SEQ ID NO:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610。

6.实施例4的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述碱性氨基酸残基包括组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基并且所述酸性和/或中性氨基酸残基包括谷氨酸或天冬氨酸残基。

7.实施例4的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述碱性氨基酸残基包括组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基并且所述酸性和/或中性氨基酸残基包括丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基。

8.实施例1-7中任一项的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

9.实施例8的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列。

10.实施例1-8中任一项的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述多肽还包含与SEQ ID NO:6的位置152或158相对应的至少一个氨基酸置换，其中所述多肽表现出对蛋白酶消化的抗性。

11.实施例1-10中任一项的经修饰的Cry3杀虫多肽的片段或变体，其中所述片段或变体保留杀虫活性。

12.一种多核苷酸，其具有编码实施例1-10中任一项的经修饰的Cry3杀虫多肽的核苷酸序列。

13.一种DNA构建体，其包含实施例12的多核苷酸。

14.实施例13的DNA构建体，其中所述多核苷酸有效连接至驱动在微生物或植物中表达的启动子。

15.实施例14的DNA构建体，其中所述启动子驱动在植物中表达。

16.实施例14的DNA构建体，其中所述启动子为根偏好的启动子。

17.一种植物，其包含实施例12的多核苷酸。

18.一种植物，其包含实施例13-16中任一项的DNA构建体。

19.实施例17或18的植物，其中所述植物为单子叶植物。

20.实施例17或18的植物，其中所述植物为双子叶植物。

21.实施例19的植物，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、甘蔗、小麦、水稻、大麦、高粱和黑麦。

22.实施例21的植物，其中所述单子叶植物为玉蜀黍。

23.一种转基因植物，其表达实施例1-10中任一项的多肽。

24.实施例23的植物，其中所述植物为单子叶植物。

25.实施例23的植物，其中所述植物为双子叶植物。

26.实施例24的植物，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、甘蔗、小麦、水稻、大麦、高粱和黑麦。

27.实施例26的植物，其中所述单子叶植物为玉蜀黍。

28.一种转基因种子，其由实施例17-27中任一项的植物产生。

29.一种产生具有改善的杀虫活性的植物的方法，所述方法包括将具有编码经修饰的Cry3杀虫多肽的核苷酸序列的多核苷酸引入所述植物中，所述多肽具有至少一个氨基酸置换，其中所述置换包括将碱性氨基酸残基替换为酸性或中性氨基酸，其中所述多核苷酸序列有效连接至驱动在植物细胞中表达的启动子序列，并且其中所述多肽具有相对于野生型Cry3多肽改善的杀虫活性。

30.实施例29的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽具有至少一个氨基酸置换，所述置换位于选自如下位置的位置，所述位置对应于SEQ ID NO:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610。

31.实施例29的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含氨基酸置换，所述置换将一个或多个组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基替换为谷氨酸或天冬氨酸残基。

32.实施例29的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含氨基酸置换，所述置换将一个或多个组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基替换为丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基。

33.实施例29-32中任一项的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含与SEQ ID NO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

34.实施例33的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含SEQID NO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列。

35.实施例29-33中任一项的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含与SEQ ID NO:6的位置152或158相对应的至少一个氨基酸置换，所述置换给所述多肽赋予对蛋白酶消化的抗性。

36.实施例31或32的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含SEQ ID NO:1、2、3、8、11或14的片段或变体，其中所述片段或变体保留杀昆虫活性。

37.一种用于防治耕作区的昆虫害虫的方法，其包括在所述区域种植实施例28的转基因种子。

38.一种微生物，其包含实施例12的多核苷酸或实施例13或14的DNA构建体。

39.一种转基因微生物，其表达实施例1-10中任一项的经修饰的Cry3杀虫多肽。

40.一种杀虫组合物，其包含实施例38或39的至少一种微生物。

41.一种用于防治耕作区的昆虫害虫的方法，其包括向所述昆虫害虫的环境施加有效量的实施例40的杀虫组合物。

42.实施例41的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目昆虫。

附图说明

图1示出了本发明的Cry3杀虫多肽序列，其中突出显示了替换的残基及其位置。

具体实施方式

本发明涉及用于影响昆虫害虫尤其是植物昆虫害虫的组合物和方法。提供了涉及增加Cry3内毒素毒性的组合物和方法。本发明的组合物包括新型的经修饰的杀虫多肽（如，蛋白质）的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸和氨基酸序列的修饰包括将碱性氨基酸残基替换为酸性或中性氨基酸残基。例如，可将碱性氨基酸（精氨酸、组氨酸和赖氨酸）的任何一者替换为酸性氨基酸（如，天冬氨酸和谷氨酸）或中性氨基酸（如，丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸）。

本发明的Cry3多肽可通过如下任何一者进行设计：计算机模拟蛋白质设计、DNA序列改组和定点诱变，以将碱性氨基酸残基更改为中性或酸性残基。在任何修饰之后，测试所得多肽的杀昆虫活性。提供了具有SEQID NO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列或其变体或片段的多肽。还提供了包含编码SEQ ID NO:1,2,3,8,11或14中所示的氨基酸序列或其变体或片段的核苷酸序列的多核苷酸，包括但不限于SEQ ID NO:7、9、10、12、13和15，以及其变体和片段。

天然存在的Cry3Aa蛋白不溶于中性pH处或附近的低盐缓冲液。这些低盐和中性pH条件模拟玉米根虫(CRW)肠道的环境。因此，Cry3Aa对抗西方玉米根虫(WCRW)和南方玉米根虫(SCRW)的活性非常低。本发明的一些氨基酸置换给经修饰的Cry3Aa多肽赋予在具有约pH5至约pH9的pH的溶液中相对于天然Cry3Aa多肽更大溶解度。本发明的氨基酸置换包括使Cry3多肽碱性变弱的那些。因此，氨基酸置换包括将碱性氨基酸替换为中性或酸性氨基酸，以及将中性氨基酸置换为酸性氨基酸。这些氨基酸置换可对任何Cry3多肽进行，包括天然的（如，天然存在的）、突变的或改组的序列。这些变化可增加Cry3多肽在根虫肠道的溶解度。本发明的核酸分子和核苷酸序列可用于转化任何生物体以产生所编码的经修饰的Cry3杀虫多肽。本发明提供涉及使用这种经转化的生物体来影响或者防治植物害虫的方法。

因此，本发明的经修饰的Cry3多肽包括经修饰而使多肽碱性变弱的Cry3多肽。也就是说，本发明的经修饰的Cry3多肽包含将碱性氨基酸替换为中性氨基酸或将中性氨基酸替换为酸性氨基酸的置换。在野生型（如，天然存在的）Cry3序列，特别是SEQ ID NO:6中进行置换以将碱性氨基酸替换为更弱碱性（如，中性或酸性）的氨基酸。

本发明的新型杀虫多肽和核苷酸序列可通过重组工程改造，例如通过DNA改组然后定点诱变来生成。这些改组的多肽表现出增加的溶解度以及增加的对抗WCRW和SCRW的杀昆虫活性，该活性比天然存在的Cry蛋白例如Cry3Aa和Cry8Bb明显更高。

在下面的描述中，以广义方式使用到多个术语。提供以下定义以帮助理解本发明。

本文所用的术语“重组工程改造”或“工程改造的”表示基于对蛋白质作用机制的了解和对被引入、缺失或置换的氨基酸的考虑，利用重组DNA技术在蛋白质结构中引入（例如工程改造出）变化。

本文所用的“DNA改组”是指用于同源基因体外重组的方法，其中待重组的基因被DNA酶I随机片段化。方法是本领域熟知的（如，Joern(2003)Methods in Molecular Biology（《分子生物学方法》）231:85-89）。然后通过琼脂糖凝胶纯化所得的具有所需大小的片段，并使用变性、退火和聚合酶延伸的多个循环进行重新组装。当来自不同亲本DNA链的片段在高序列同一性区域退火时发生重组。该重新组装之后，将通过多轮PCR扩增产生的全长嵌合体克隆进合适的表达盒中。

本文所用的“计算机模拟蛋白质序列设计”是指使用计算机分子设计和蛋白质序列分析策略修饰蛋白质。这些方法利用对蛋白三维结构的分析来指导选择适当的氨基酸序列以便在所关注蛋白中产生所需性质或功能。已经开发了多种用于计算机模拟蛋白质设计的学术软件包，并且可用于本发明，包括但不限于3D-JIGSAW、CPHModel、GeneSilico、I-TASSER、SWISS-MODEL、Selvita Protein Modeling Platform、Abalone、GOR和Phobius。

本文所用的术语“Cry3”或“Cry3家族”是指本发明的核苷酸或氨基酸序列，其与之前描述的归类为Cry3和/或CryIII的序列具有高度的序列同一性或相似性。在一些实施例中，本发明的序列与如下序列具有高度的序列同一性或相似性：Cry3Aa1（SEQ ID NO:6或16）、Cry3Aa2(SEQ IDNO:17)、Cry3Aa3(SEQ ID NO:18)、Cry3Aa4(SEQ ID NO:19)、Cry3Aa5(SEQ ID NO:20)、Cry3Aa6(SEQ ID NO:21)、Cry3Aa7(SEQ ID NO:22)、Cry3Aa8(SEQ ID NO:23)、Cry3Aa9(SEQ ID NO:24)、Cry3Aa10(SEQ IDNO:25)、Cry3Aa11(SEQ ID NO:26)、Cry3Aa12(SEQ ID NO:27)、Cry3Ba1(SEQ ID NO:28)、Cry3Ba2(SEQ ID NO:29)、Cry3Bb1(SEQ IDNO:30)、Cry3Bb2(SEQ ID NO:31)、Cry3Bb3(SEQ ID NO:32)或Cry3Ca1(SEQ ID NO:33)。在一些这些实施例中，本发明的序列与Cry3Aa蛋白质具有高度的序列同一性或相似性。

本发明的序列是由天然存在的（即，存在于自然界的）Cry3序列修饰而成，因为它们具有至少一个氨基酸置换，并且本文称为“经修饰的Cry3”序列（核苷酸或多肽）。在一些实施例中，经修饰的Cry3序列为经修饰的Cry3Aa序列。

本发明的经修饰的Cry3序列在低盐溶液中在中性pH下表现出高溶解度。因此，本发明的序列高度可溶于CRW的肠道和具有约pH5至约pH9的pH的溶液。在一个实施例中，将暴露的碱性氨基酸残基替换为更酸性的氨基酸残基，从而提供负电荷。同样，可将碱性氨基酸替换为中性氨基酸并可将中性氨基酸替换为酸性氨基酸。所谓“暴露的碱性氨基酸残基”旨在表示毒素晶体结构表面上的为组氨酸、赖氨酸或精氨酸的那些氨基酸。因此，经修饰的Cry3序列在位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610处具有一个或多个氨基酸置换。这些位置是相对于SEQ ID NO:6所示的野生型Cry3Aa1多肽而言的。

可以在上述位置处进行至少一个修饰。此类修饰包括将碱性氨基酸置换为更酸性或中性的氨基酸残基。此类酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。酸性氨基酸为极性的并且在生理pH下带负电。此类酸性氨基酸置换的例子可包括但不限于K63E、N97D、K152E、R158E、K222S、K384E和K496E。

在另一方面，本发明提供对Cry3Aa进行的一个或多个修饰，使得该蛋白质在玉米根虫(CRW)肠道环境中的溶解度增加（如，增大）。天然Cry3Aa蛋白不表现出对CRW的杀昆虫活性，在不存在高盐的情况下在pH5至pH9范围中高度不溶（Li等人(1991)Nature（《自然》）353:815-821）。表现出高CRW活性的经修饰的Cry3Aa序列（参见实例1中作为IP3-H列出的变体）在与CRW肠道pH相似的约pH7（即，pH5至pH9）处表现出高溶解度。

应认识到，可以修饰Cry3多肽中的一个或多个氨基酸。在所有情况下，可在多个位点进行改变或修饰，并测试所得毒素蛋白的活性。因此，由包含突变的核苷酸序列所编码的多肽相对于天然（即，天然存在的）或背景序列，将包含至少一个氨基酸改变或添加，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、620、630、640个或最多652个氨基酸改变。

在另一个实施例中，可对与天然存在的蛋白质（如SEQ ID NO:6）的位置152和158相对应的位置处的至少一个蛋白酶敏感残基进行修饰以给该蛋白质赋予对蛋白酶消化的抗性，特别是对抗胰蛋白酶的抗性。在一个实施例中，修饰包括下列置换中的至少一者：与SEQ ID NO:6相对应的K152E和R158E。这些残基位于α3和4之间的环区(loop)。可使所述残基中的至少一者突变。突变给该蛋白质赋予对玉米根虫(CRW)肠道中的胰蛋白酶消化的抗性。这样，可在该位点进行改变并针对消化性测试该蛋白质。该位点处的降低肠道消化性的任何改变均涵盖于本文中。其他修饰可包括以下置换中的至少一者：与SEQ ID NO:6相对应的K63E、N97D、K152E、R158E、K222S、K384E和K496E。本文所用的术语“蛋白水解位点”或“切割位点”指这样的氨基酸序列，其赋予对一类蛋白酶或某种特定蛋白酶的敏感性，使得含有该氨基酸序列的多肽被该类蛋白酶或该特定蛋白酶消化。蛋白水解位点据称对能识别该位点的蛋白酶“敏感”。本领域认识到，消化的效率会不同，而消化效率的降低可导致多肽在昆虫肠道中的稳定性或寿命提高。因此，蛋白水解位点可赋予对不止一种蛋白酶或一类蛋白酶的敏感性，但各种蛋白酶在该位点的消化效率可不同。蛋白水解位点包括例如胰蛋白酶位点、胰凝乳蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。

在一些实施例中，本发明所公开的杀虫多肽或其变体或片段与衍生它们的亲本多肽（如，SEQ ID NO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33）相比时表现出改善的杀虫活性。本文所用的术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义地用来指某生物体或物质（例如蛋白质）的可以通过害虫在取食和暴露达适当时长后害虫死亡率、害虫体重减轻、害虫排斥性和害虫其他行为和身体的变化（但不限于通过这些方面）进行测量的活性。这样，杀虫活性可影响害虫健康状况的至少一个可测量参数。本文所用的“害虫”意指干扰植物发育和/或生长或对其有害的生物体。本领域的技术人员应理解，并非所有物质或其混合物对所有害虫同样有效。本文特别关注的是用作杀昆虫剂从而具有对抗昆虫害虫的生物活性的杀虫多肽。因此，具有杀虫活性的生物体或物质不利地影响害虫健康状况的至少一个可测量参数。例如，“杀虫蛋白”是本身显示杀虫活性或与其他蛋白质组合而显示杀虫活性的蛋白质。

评估杀虫活性的测定法是本领域公知的。参见例如美国专利No.6,570,005和No.6,339,144。还可参见Brooke等人(2001)Bull.Entomol.Res.（《昆虫学研究通报》）91:265-272；Chen等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）104:13901-13906；Crespo等人(2008)Appl.Environ.Microb.（《应用与环境微生物学》）74:130-135；Khambay等人(2003)Pest Manag.Sci.（《害虫治理科学》）59:174-182；Liu和Dean(2006)Protein Eng.Des.Sel.（《蛋白质工程、设计与选择》）19:107-111；Marrone等人(1985)J.Econ.Entomol.（《经济昆虫学杂志》）78:290-293；Robertson等人，Pesticide Bioassays with Arthropods（《节肢动物的杀虫剂生物测定》）（第2版，CRC出版社，2007）；Scott和McKibben(1976)J.Econ.Entomol.（《经济昆虫学杂志》）71:343-344；Strickman(1985)Bull.Environ.Contam.Toxicol.（《环境污染与毒物学通报》）35:133-142；Verma等人(1982)WaterRes.（《水研究》）16525-529；以及美国专利No.6,268,181。昆虫生物测定法的例子包括但不限于害虫在取食和暴露于杀虫剂或杀虫多肽达适当时长后的害虫死亡率、害虫体重减轻、害虫排斥性、害虫吸引性和害虫其他行为和身体的变化。一般方法包括将杀虫剂、杀虫多肽或具有杀虫多肽的生物体添加至封闭容器中的饮食来源。参见例如美国专利No.6,339,144和No.6,570,005。然后在取食和暴露适当的一段时间后，通过（但不限于）死亡率变化、体重减轻、吸引、排斥和其他行为和身体的变化来测量杀虫活性。

用于测试杀虫活性的优选发育阶段为这些上述昆虫害虫的幼虫或不成熟形态。可将昆虫在完全黑暗中在约20℃至约30℃和约30%至约70%相对湿度下饲养。可如以下文献中所述进行生物测定法：Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.（《经济昆虫学杂志》）83(6):2480-2485。饲养昆虫幼虫和进行生物测定法的方法是本领域普通技术人员公知的。

在本发明的一些实施例中，杀虫基因编码苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素或其变体，特别是已知Cry毒素的同源物。“Bt”或“苏云金芽孢杆菌”毒素旨在表示在多种苏云金芽孢杆菌菌株中存在的类别更广泛的毒素，包括诸如植物性杀昆虫蛋白和δ-内毒素之类的毒素。参见例如Crickmore等人(1998)Microbiol.Molec.Biol.Rev.（《微生物学与分子生物学评论》）62:807-813；和Crickmore等人(2004)发表于lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt的Bacillus Thuringiensis ToxinNomenclature（苏云金芽孢杆菌毒素命名法），所述两篇文献全文均以引用的方式并入本文。植物杀昆虫蛋白（例如VIP1类、VIP2类或VIP3类的成员）是分泌性杀昆虫蛋白，由昆虫中肠液进行蛋白水解加工。它们对广谱的鳞翅目昆虫具有杀虫活性。参见例如美国专利No.5,877,012，其全文以引用的方式并入本文。Btδ-内毒素对多种昆虫害虫（包括鳞翅目、双翅目和鞘翅目的成员）的幼虫有毒性。这些昆虫毒素包括但不限于Cry毒素，包括例如Cry1、Cry3、Cry5、Cry8和Cry9。特别关注的是与已知Cry3基因同源的杀虫基因。在某些情况下，本发明的多肽δ-内毒素和编码它们的核苷酸序列将与野生型（即，天然存在的）Cry3序列（如，SEQ IDNO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33）具有高度的序列同一性或相似性。在这些实施例的一些中，本发明的杀虫多肽和编码它们的核苷酸序列将与野生型Cry3Aa序列具有高度的序列同一性或相似性。

Cry内毒素最初以无活性原毒素形式产生，该形式通过昆虫肠道中蛋白酶的作用而蛋白水解转化为活性内毒素。一旦具有活性，内毒素就结合至肠道上皮细胞并形成阳离子选择性通道，造成细胞溶解并随后死亡。参见Carroll等人(1997)J.Invertebr.Pathol.（《无脊椎动物病理学杂志》）70:41-49；Oppert(1999)Arch.Insect Biochem.Phys.（《昆虫生物化学与生理学文献》），42:1-12；和Rukmini等人(2000)Biochimie（《生物化学》）82:109-116。

BtCry蛋白具有五个保守序列域和三个保守结构域（参见例如，deMaagd等人(2001)Trends Genetics（《遗传学趋势》）17:193-199）。大多数氨基末端的保守结构域（结构域I）由七个α螺旋组成，其中中央疏水螺旋-α5被六个其他两亲螺旋包围，并且参与膜插入和孔形成。第二保守结构域（结构域II）由涉及细胞结合的三个反平行的β-折叠片组成，并且大多数羧基末端的保守结构域（结构域III）由β-夹层组成。结构域II和III中的暴露区域参与受体识别和结合，因此被认为是毒素特异性的决定因素。这些结构域的位置和性质是本领域技术人员已知的。参见例如Grochulski等人(1995)J Mol Biol（《分子生物学杂志》）254:447-464；Morse,Yamamoto和Stroud(2001)Structure（《结构》）9:409-417；Li等人(1991)Nature（《自然》）353:815-821；Galitsky等人(2001)Acta Cryst（《晶体学报》）D57:1101-1109；Boonserm等人(2006)J Bacteriol（《细菌学杂志》）188:3391-3401；Boonserm等人(2005)J Mol Biol（《分子生物学杂志》）348:363-382；以及Guo等人(2009)J Struct Biol（《结构生物学杂志》）168:259-266。

具有“改善的杀虫活性”或“改善的杀虫活性”的多肽可指多肽与参考多肽（如，天然存在的Cry3多肽）相比表现出对抗单种植物害虫的活性或对抗广谱植物害虫的活性增加。在一些实施例中，本发明所公开的杀虫多肽或其变体或片段与天然存在的Cry3多肽（如，SEQ ID NO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33）相比时表现出改善的杀虫活性。在某些实施例中，本发明所公开的杀虫多肽与天然存在的多肽（如，SEQ ID NO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33）相比表现出高2倍至100倍的对抗至少一种敏感昆虫害虫的活性，包括但不限于约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍和100倍。改善的或增强的杀虫活性的发现，要求证明针对同一害虫进行测定，相对于天然存在的多肽的杀虫活性而言，对昆虫靶标的杀虫活性提高至少10%，或者杀虫活性提高至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、100%、150%、200%或300%或者更高。

在某些实施例中，本发明所公开的杀虫多肽或其变体或片段与天然存在的Cry3多肽相比时表现出更高的对抗鞘翅目害虫的杀虫活性。在这些实施例的一些中，经修饰的Cry3多肽与天然存在的Cry3多肽相比时具有更高的对抗根虫（包括但不限于南方玉米根虫或西方玉米根虫）的杀虫活性。

本发明的组合物包括编码杀虫多肽的核酸及其片段和变体。具体地讲，本发明提供编码SEQ ID NO:1、2、3、8、11或14中所示氨基酸序列的经修饰的核苷酸序列。还提供了具有由本文所述核酸分子编码的氨基酸序列的经修饰的多肽。

本发明涵盖分离的或实质上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物活性部分，实质上或基本上不含通常在该多核苷酸或蛋白质的天然环境中存在的、与该多核苷酸或蛋白质相伴随或相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳的是，“分离的”多核苷酸不含在衍生该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列（即位于该多核苷酸的5'和3'末端的序列）（最佳的是蛋白质编码序列）。例如，在多个实施例中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30%、20%、10%、5%或1%（以干重计）的污染性蛋白质的蛋白质的制备物。

核苷酸和氨基酸序列及由其所编码的多肽的片段和变体也为本发明所涵盖。本文所用的术语“片段”是指本发明的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码保持天然的或相应的全长蛋白质的生物活性从而具有相关生物活性例如杀虫活性的蛋白质片段。

作为经修饰的Cry3家族核苷酸序列的片段的核酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1,000、1,200、1,400、1,600、1,800或1900个核苷酸或最多至本文所公开的经修饰的Cry3家族核苷酸序列中所存在的核苷酸数目。在特定实施例中，本发明的核酸公开了衍生自（如产生自）本发明核酸的片段，其中所述片段编码经截短修饰的表征为杀虫活性的Cry3家族内毒素。由本发明的多核苷酸片段编码的截短多肽表征为这样的杀虫活性，该杀虫活性相对于衍生该片段的核酸所编码的相应全长多肽的活性，是相当的或得到改善。在一些实施例中，本发明的核酸片段在天然或相应的全长编码序列的3'末端截短。核酸片段也可同时在天然或相应的全长编码序列的5'和3'末端截短。

此外，应当理解本发明还涵盖这样的多肽，其为本发明示例性杀虫蛋白的片段并且长度为本发明杀虫多肽的至少约100、约200、约300、约400、约500、约600、约620、约630、约640、约641、约642、约643或约644个连续氨基酸并且保留杀虫活性。

本文所用的术语“变体”是指基本上类似的序列。变体核苷酸序列包括核苷酸序列，如那些例如通过使用定点诱变产生但仍编码本发明的杀虫蛋白的核苷酸序列。通常，通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数测定，本发明的特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的序列同一性。本发明的核苷酸序列的变体可与该序列相差少至1-15个核苷酸、少至1-10个如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个核苷酸。

本发明的特定核苷酸序列（即示例性的核苷酸序列）的变体，也可通过比较由变体核苷酸序列编码的多肽与参考核苷酸序列编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评价。任何两个多肽之间的序列同一性百分数可用本文别处描述的序列比对程序使用默认参数进行计算。在任何给定的本发明多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽所具有的序列同一性百分数进行评价的情况中，两条编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%或至少约98%、约99%或更高的序列同一性。本发明的蛋白质的生物活性变体与该蛋白可相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个（如6-10个）、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。

本文所用的术语“变体蛋白”涵盖通过如下方式衍生自本发明多肽的多肽：在该天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失（所谓的截短）或者添加一个或者多个氨基酸；在该天然蛋白质中的一个或者多个位点缺失或者添加一个或者多个氨基酸；或者在该天然蛋白质中的一个或者多个位点置换一个或者多个氨基酸。因此，术语“变体蛋白”涵盖这样的生物活性片段，其包含足够数目的连续氨基酸残基以保持本发明多肽的生物活性，即具有杀虫活性。

本发明的经修饰的Cry3家族蛋白质可通过多种方式（包括氨基酸置换、缺失、截短和插入）进行变更。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，可通过向合成的核酸（例如DNA分子）中引入突变来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。诱变和核酸变更的方法是本领域公知的。例如，可使用寡核苷酸介导的定点诱变技术来引入所设计的变化。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）82:488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.（《酶学方法》）154:367-382；美国专利No.4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in MolecularBiology（《分子生物学技术》）（纽约麦克米兰出版公司(MacMillanPublishing Company,New York)）；以及其中引用的参考文献。

本发明的核苷酸序列可在用于影响害虫特别是害虫（如鞘翅目害虫）的方法中直接使用。

以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。

(a)本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或者基因序列的区段或者完整的cDNA或者基因序列。

(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即空位），以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或者更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，对任何两个序列之间的序列同一性百分数的确定，可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS（《计算机在生物科学中的应用》）4:11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.（《应用数学进展》）2:482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）48:443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.（《美国国家科学院院刊》）85:2444-2448的搜索局部比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc..Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）872264的算法，其在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）90:5873-5877中作了修正。

可利用这些数学算法的计算机执行进行序列的比较，从而确定序列同一性。此类程序包括但不限于：PC/Gene程序（可获自美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics,MountainView,California)）中的CLUSTAL；GCGWisconsin Genetics Software 

版本10（可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(AccelrysInc.,9685 Scranton Road,San Diego,California,USA)）中的ALIGN程序（版本2.0）和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的序列比对可用默认参数来进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins等人(1988)Gene（《基因》）73:237-244(1988)；Higgins等人(1989)，CABIOS（《计算机在生物科学中的应用》）5:151-153；Corpet等人(1988)Nucleic AcidsRes.（《核酸研究》）16:10881-90；Huang等人(1992)，CABIOS（《计算机在生物科学中的应用》）8:155-65；以及Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.（《分子生物学方法》）24:307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)（出处同上）的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weightresidue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）215:403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)（出处同上）的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分=100、字长=12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、得分=50、字长=3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids R es.（《核酸研究》）25:3389中所描述采用Gapped BLAST（在BLAST2.0中）。或者，可使用PSI-BLAST（在BLAST2.0中）来进行迭代搜索，该搜索可检测分子之间的远源关系。参见Altschul等人(1997)，出处同上。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各个程序的默认参数（例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质）。参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的互联网网站www.ncbi.hlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。

除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的%同一性和%相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp打分矩阵；氨基酸序列的%同一性和%相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62打分矩阵；或其任何等同程序。本文所用术语的“等同程序”指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。

GAP利用Needleman和Wunsch(1970)（出处同上）的算法来寻找两个完整序列的能使匹配数最大而使空位数最小的比对。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics SoftwarePackage的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以以选自0-200的整数来表示。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP给出具有最好的比对的家族中的一个成员。这个家族可能存在许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50（相似性阈值）时，对相似性打分。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的记分矩阵为BLOSUM62（参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）89:10915）。

(c)在两个多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质（例如电荷或疏水性）的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是例如如在程序PC/GENE（美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics,MountainView,California)）中所执行那样进行计算。

(d)本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列（不包含添加或缺失）相比可包含添加或缺失（即空位），以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

如本文所用，经修饰的Cry3多肽的在与天然存在的Cry3（如，SEQID NO:6）的特定氨基酸残基相应的位置处的氨基酸残基是指经经修饰的Cry3多肽内的氨基酸残基，当使用比对程序例如本领域已知的程序或本文所述的程序将经修饰的Cry3序列与天然存在的Cry3序列（如SEQ ID NO:6）比对达到最大同源性时，该氨基酸残基看起来与天然存在的Cry3序列中的特定位置处的氨基酸残基相对。

本发明的经修饰的Cry3家族序列在表达盒中提供，以便在所关注生物体中表达。表达盒将包括有效连接至本发明的经修饰的Cry3家族序列的5'和3'调控序列。本文所用的术语“有效连接”是指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列引发并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。表达盒可另外含有至少一个待共转化进该生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外的基因。

这种表达盒提供有多个限制位点，以使该经修饰的Cry3家族序列的插入处于调节区的转录调节之下。表达盒可另外含有可选标记基因。

该表达盒将在5'至3'转录方向上包括：转录和翻译起始区（即启动子）、本发明的经修饰的Cry3家族DNA序列和在充当宿主的生物体中具有功能的转录和翻译终止区（即终止区）。转录起始区（即启动子）相对于宿主生物体和/或相对于本发明的经修饰的Cry3家族序列可以是天然的、类似的、外来的或异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。本文所用的术语“外来的”表示启动子在引入该启动子的天然生物体中不存在。当启动子相对于本发明的Cry3家族序列为“外来的”或“异源的”时，其意指启动子对于本发明的有效连接的经修饰的Cry3家族序列而言，不是天然的或天然存在的启动子。本文所用的嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。如果启动子是天然或自然的序列，则所有效连接的序列的表达相比野生型表达被变更，这导致表型变更。

终止区可以是对于转录起始区而言是天然的，可以对于有效连接的所关注DNA序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自另一来源（即对于该启动子、所关注的Cry3家族序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的）。

便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学与普通遗传学》）262:141-144；Proudfoot(1991)Cell（《细胞》）64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.（《基因和发育》）5:141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell（《植物细胞》）2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene（《基因》）91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）17:7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.（《核酸研究》）15:9627-9639。

如适当，可将核酸进行优化以提高在宿主生物体中的表达。因此，如果宿主生物体是植物，则可用植物偏好的密码子合成出合成的核酸以改进表达。有关宿主偏好的密码子用法的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.（《植物生理学》）92:1-11。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同（Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）17:477-498）。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人（出处同上）的表4中列出。本领域有用来合成植物偏好的基因的方法。参见例如，美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）17:477-498，以引用方式并入本文。

已知有另外的序列修饰可增强在细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。本文所用的术语“宿主细胞”指含有载体并支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞，或者单子叶或者双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个例子是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，对序列进行修饰以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可另外含有5'前导序列。此类前导序列可起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：微小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列（脑心肌炎病毒5'非编码区）（Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）86:6126-6130）；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列（烟草蚀纹病毒）（Gallie等人(1995)Gene（《基因》）165(2):233-238）；MDMV前导序列（玉米矮花叶病毒）；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)（Macejak等人(1991)Nature（《自然》）353:90-94）；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻译前导序列（Jobling等人(1987)Nature（《自然》）325:622-625；烟草花叶病毒前导序列(TMV)（Gallie等人(1989)，载于：Molecular Biology of RNA（《RNA的分子生物学》），Cech编辑（纽约Liss出版社(Liss,New York)），第237-256页）；以及玉蜀黍枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)（Lommel等人(1991)Virology（《病毒学》）81:382-385）。另参见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.（《植物生理学》）84:965-968。

在制备表达盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换（例如转换和易位）。

多种启动子可用于本发明的实践中。启动子可基于所需的结果来选择。可将核酸与组成型启动子、组织偏好型启动子、诱导型启动子或其他启动子进行组合，以在宿主生物体中表达。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV35S启动子（Odell等人(1985)Nature（《自然》）313:810-812）；水稻肌动蛋白（McElroy等人(1990)Plant Cell（《植物细胞》）2:163-171）；遍在蛋白（Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）12:619-632以及Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）18:675-689）；pEMU（Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.（《理论与应用遗传学》）81:581-588）；MAS（Velten等人(1984)EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》）3:2723-2730）；ALS启动子（美国专利No.5,659,026），等等。其他的组成型启动子包括例如以下各个美国专利中论述的那些：No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463、No.5,608,142、和No.6,177,611。

取决于所需的结果，可能有利的是从诱导型启动子表达基因。对于调节本发明的核苷酸序列在植物中的表达特别有意义的是损伤诱导启动子。这种损伤诱导启动子可响应昆虫取食所引起的损害，包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pinII)基因（Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.（《植物病理学年鉴》）28:425-449）；Duan等人(1996)，Nature Biotechnology（《自然生物技术》），14:494-498）；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2（Stanford等人(1989)，Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学与普通遗传学》）215:200-208）；系统素（McGurl等人(1992)，Science（《科学》），225:1570-1573）；WIP1（Rohmeier等人(1993)，Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）22:783-792；Eckelkamp等人(1993)，FEBSLetters（《欧洲生化学会联合会快报》）323:73-76）；MPI基因（Corderok等人(1994)，Plant J.（《植物杂志》）6(2):141-150）；等等，将这些文献以引用方式并入本文。

另外，病原体诱导型启动子可在本发明的方法和核苷酸构建体中使用。这种病原体诱导型启动子包括那些来自致病相关蛋白（PR蛋白）的在病原体感染后被诱导的启动子；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.（《荷兰植物病理学杂志》）89:245-254；Uknes等人(1992)，Plant Cell（《植物细胞》）4:645-656；以及Van Loon(1985)，Plant Mol.Virol.（《植物分子病毒学》）4:111-116。另参见WO99/43819，将该文献以引用方式并入本文。

在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见例如，Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）9:335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions（《分子植物-微生物相互作用》）2:325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）83:2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学与普通遗传学》）2:93-98；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）93:14972-14977。另参见Chen等人(1996)Plant J.（《植物杂志》）10:955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）91:2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.（《植物杂志》）3:191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell（《植物细胞》）1:961-968；美国专利No.5,750,386（线虫诱导型）；以及其中引用的参考文献。特别值得关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导（参见例如，Cordero等人(1992)Physiol.Mol.Plant Path.（《生理与分子植物病理学》）41:189-200）。

组织偏好的启动子可用来使增强的杀虫蛋白表达靶向于特定的植物组织内。组织偏好的启动子包括以下文献中描述的那些启动子：Yamamoto等人(1997)Plant J.（《植物杂志》）12(2)255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.（《植物细胞生理学》）38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.（《分子遗传学与普通遗传学》）254(3):337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.（《转基因研究》）6(2):157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.（《植物生理学》）112(3):1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.（《植物生理学》）112(2):525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.（《植物生理学》），112(2):513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.（《植物细胞生理学》）35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.（《细胞分化的结果与问题》）20:181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.（《植物分子生物学》）23(6):1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）90(20):9586-9590；以及Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.（《植物杂志》）4(3):495-505。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。

根偏好启动子或者根特异性启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从各种相容的物种从头分离。参见例如，Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）20(2):207-218（大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因）；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell（《植物细胞》）3(10):1051-1061（法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件）；Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）14(3):433-443（根瘤农杆菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子）；以及Miao等人(1991)Plant Cell（《植物细胞》）3(1):11-22（编码细胞溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达）。另参见Bogusz等人(1990)PlantCell（《植物细胞》）2(7):633-641，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入进非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高表达rolC和rolD根诱导基因的分析（参见Plant Science（《植物科学》）(Limerick)，79(1):69-76）。他们得出结论认为，增强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合，表明编码章鱼氨酸合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2'基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合（参见EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》），8(2):343-350）。与nptII（新霉素磷酸转移酶II）融合的TR1'基因显示了相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子（Kuster等人(1995)PlantMol.Biol.（《植物分子生物学》），29(4):759-772）；以及rolB启动子（Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》），25(4):681-691）。另参见以下美国专利：No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,459,252、No.5,401,836、No.5,110,732和No.5,023,179。

一般而言，表达盒将包含用于选择转化细胞的可选标记基因。可选标记基因被用于选择转化的细胞或组织。可选标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。合适的可选标记基因的另外例子包括但不限于：编码对氯霉素的抗性的基因（HerreraEstrella等人(1983)EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》）2:987-992）；甲氨喋呤（Herrera Estrella等人(1983)Nature（《自然》）303:209-213；以及Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）16:807-820）；链霉素（Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学与普通遗传学》）210:86-91）；壮观霉素（Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.（《转基因研究》）5:131-137）；博来霉素（Hille等人(1990)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）7:171-176）；磺酰胺（Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）15:127-136）；溴苯腈（Stalker等人(1988)Science（《科学》）242:419-423）；草甘膦（Shaw等人(1986)Science（《科学》）233:478-481；以及美国专利申请No.10/004,357和No.10/427,692）；草胺膦（DeBlock等人(1987)EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》）6:2513-2518）。主要参见：Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.（《生物技术新观点》），3:506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）89:6314-6318；Yao等人(1992)Cell（《细胞》）71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.（《分子微生物学》）6:2419-2422；Barkley等人(1980)，载于The Operon（《操纵子》），第177-220页；Hu等人(1987)Cell（《细胞》）48:555-566；Brown等人(1987)Cell（《细胞》）49:603-612；Figge等人(1988)Cell（《细胞》）52:713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）86:5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）86:2549-2553；Deuschle等人(1990)Science（《科学》）248:480-483；Gossen，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）90:1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.（《分子细胞生物学》）10:3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）89:3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）88:5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.（《分子结构生物学主题》）10:143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.（《抗微生物剂化学疗法》）35:1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)，Biochemistry（《生物化学》）27:1094-1104；Bonin，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）89:5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.AgentsChemother.（《抗微生物剂化学疗法》）36:913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology（《实验药理学手册》），第78卷（柏林施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin)）；以及Gill等人(1988)Nature（《自然》）334:721-724。将这些公开内容以引用的方式并入本文。

上面关于可选标记基因的列表无意于限制。任何可选标记基因均可用于本发明。

本发明的方法涉及将多肽或多核苷酸引入进植物中。“引入”旨在意指以使得多核苷酸或多肽得以进入植物细胞的内部的方式将这些序列呈送给植物。本发明的方法不依赖于将多核苷酸或多肽引入植物中的具体方法，只要该多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

本发明的核酸和核苷酸序列可用于转化任何生物体以产生所编码的杀虫蛋白。本发明提供涉及使用这种转化的生物体来影响或防治植物害虫的方法。本发明的核苷酸序列也可用于转化细胞器如叶绿体（McBride等人(1995)Biotechnology（《生物技术》）13:362-365；以及Kota等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）96:1840-1845）。因而本发明提供了转化有这些新多核苷酸的植物和微生物，以及涉及将这种核酸、杀虫组合物、转化的生物体及其产物用于影响昆虫害虫的方法。

本文所用的术语“影响昆虫害虫”指在昆虫发育的任何阶段引起昆虫取食、生长和/或行为方面的变化，包括但不限于：杀死昆虫；迟滞生长；阻碍繁殖能力；拒食活性等等。

本文特别关注的是昆虫害虫。本文所用的“昆虫害虫”意指妨碍或有害植物发育和/或生长的节肢动物门的生物体，更具体地讲是指昆虫纲的生物体。昆虫纲可划分为两个群（历史上称作亚纲）：(1)无翅昆虫，称为无翅亚纲；和(2)有翅昆虫，称为有翅亚纲。害虫的例子包括但不限于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、食毛目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目和缨尾目，特别是鞘翅目和鳞翅目。虽然严格意义上并非昆虫，节肢动物如蛛形纲，特别是蜱螨亚纲，也包括在“昆虫害虫”中。昆虫害虫包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。

特别关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：Anthonomus grandis Boheman（棉籽象鼻虫）；Cylindrocopturusadspersus LeConte（向日葵茎象鼻虫）；Diaprepes abbreviatus Linnaeus（蔗根象鼻虫）；Hypera punctata Fabricius（三叶草叶象）；Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel（稻水象鼻虫）；Metamasius hemipterus hemipterusLinnaeus（西印度蔗象鼻虫）；M.hemipterus sericeus Olivier（丝蔗象鼻虫）；Sitophilus granarius Linnaeus（谷象鼻虫）；S.oryzae Linnaeus（米象鼻虫）；Smicronyx fulvus LeConte（红向日葵籽象鼻虫）；S.sordidusLeConte（灰色葵花籽象甲）；Sphenophorus maidis Chittenden（玉米象虫）；S.livis Vaurie（甘蔗象虫）；Rhabdoscelus obscurus Boisduval（新几内亚蔗象甲）；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：Chaetocnema ectypa Horn（沙漠玉米跳甲）；C.pulicaria Melsheimer（玉米跳甲）；Colaspis brunneaFabricius（葡萄肖叶甲）；Diabrotica barberi Smith & Lawrence（北方玉米根虫）；D.undecimpunctata howardi Barber（南方玉米根虫）；D.virgiferavirgifera LeConte（西方玉米根虫）；Leptinotarsa decemlineata Say（科罗拉多马铃薯甲虫）；Oulema melanopus Linnaeus（谷物叶甲虫）；Phyllotreta cruciferae Goeze（玉米跳甲）；Zygogramma exclamationisFabricius（向日葵甲虫）；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：Epilachna varivestis Mulsant（墨西哥豆甲虫）；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫，包括但不限于：Antitrogus parvulusBritton（Childers蔗蚧螬）；Cyclocephala borealis Arrow（北方隐金龟子，白蚧螬）；C.immaculata Olivier（南方隐金龟子，白蚧螬）；Dermolepidaalbohirtum Waterhouse（灰背蔗甲虫）；Euetheola humilis rugiceps LeConte（甘蔗甲虫）；Lepidiota frenchi Blackburn（法国蔗蚧螬）；Tomarusgibbosus De Geer（胡萝卜甲虫）；T.subtropicus Blatchley（甘蔗蚧螬）；Phyllophaga crinita Burmeister（白蛴螬）；P.latifrons LeConte（六月甲虫）；Popillia japonica Newman（日本甲虫）；Rhizotrogus majalisRazoumowsky（欧洲金龟子）；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自以下各科属的线虫：叩头虫科(Elateridae)、伪金针虫属(Eleodes spp.)，纹叩甲属(Melanotus spp.)，包括M.communis Gyllenhal（线虫）；宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)；丘胸叩甲属(Limonius spp.)；细胸叩甲属(Agriotes spp.)；Ctenicera spp.；Aeolus spp.；来自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(bark beetle)；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)科的甲虫，例如但不限于Migdolus fryanus Westwood（长角甲虫）；和来自吉丁虫科(Buprestidae)的甲虫，包括但不限于Aphanisticuscochinchinae seminulum Obenberger（潜叶吉丁虫）。

本发明还涵盖包含至少一种本发明核苷酸序列的转化植物或转基因植物。在一些实施例中，该植物稳定转化有核苷酸构建体，该核苷酸构建体包含有效连接至可驱动在植物细胞中表达的启动子的至少一种本发明核苷酸序列。本文所用的术语“转化植物”和“转基因植物”是指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因植物或转化植物的基因组中，使得该多核苷酸被传递到后续各代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。

应理解，本文所用的术语“转基因”包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因（的）”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组（染色体基因组或染色体外基因组）改变。

“稳定转化”旨在意指被引入进植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中，并能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入植物中但没有整合进植物的基因组中，或者多肽被引入进植物中。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型（即单子叶植物或双子叶植物）而异。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入进植物基因组中的合适方法包括：显微注射（Crossway等人(1986)Biotechniques（《生物技术》）4:320-334）、电穿孔（Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）83:5602-5606）、农杆菌介导的转化（美国专利No.5,563,055和No.5,981,840）、直接基因转移（Paszkowski等人(1984)EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》），3:2717-2722）以及弹道粒子加速（参见例如美国专利No.4,945,050、No.5,879,918、No.5,886,244和No.5,932,782；Tomes等人(1995)Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:FundamentalMethods（《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》），Gamborg和Phillips编辑，柏林斯普林格出版社；以及McCabe等人(1988)Biotechnology（《生物技术》）6:923-926）；以及Lecl转化(WO00/28058)。对于马铃薯转化，参见Tu等人(1998)Plant Molecular Biology（《植物分子生物学》）37:829-838；以及Chong等人(2000)TransgenicResearch（《转基因研究》）9:71-78。另外的转化程序可见于Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.（《遗传学年鉴》）22:421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology（《颗粒科学与技术》）5:27-37（洋葱）；Christou等人(1988)Plant Physiol.（《植物生理学》）87:671-674（大豆）；McCabe等人(1988)Bio/Technology（《生物技术》）6:923-926（大豆）；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.（《体外细胞和发育生物学》）27P:175-182（大豆）；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.（《理论与应用遗传学》）96:319-324（大豆）；Datta等人(1990)Biotechnology（《生物技术》）8:736-740（水稻）；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）85:4305-4309（玉蜀黍）；Klein等人(1988)Biotechnology（《生物技术》）6:559-563（玉蜀黍）；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.（《植物生理学》）91:440-444（玉蜀黍）；Fromm等人(1990)Biotechnology（《生物技术》）8:833-839（玉蜀黍）；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)（《自然》（伦敦））311:763-764；美国专利No.5,736,369（谷类）；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）84:5345-5349（百合科(Liliaceae)）；DeWet等人(1985)The Experimental Manipulation of OvuleTissues（《胚珠组织的实验操纵》），Chapman等人编辑，纽约朗文出版社(Longman,New York)，第197-209页（花粉）；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports（《植物细胞报道》）9:415-418；以及Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.（《理论与应用遗传学》）84:560-566（晶须介导的转化）；D'Halluin等人(1992)Plant Cell（《植物细胞》）4:1495-1505（电穿孔）；Li等人(1993)Plant Cell Reports（《植物细胞报道》）12:250-255；以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany（《植物学年刊》）75:407-413（水稻）；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology（《自然生物技术》）14:745-750（玉蜀黍，经由根瘤农杆菌）；所有这些文献和专利均以引用方式并入本文。

在特定实施例中，可使用多种瞬时转化方法将本发明的经修饰的Cry3家族序列提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于将经修饰的Cry3家族蛋白或其变体和片段直接引入植物中，或者将经修饰的Cry3家族转录物引入植物中。这类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等人(1986)Mol Gen.Genet.（《分子遗传学与普通遗传学》）202:179-185；Nomura等人(1986)Plant Sci.（《植物科学》）44:53-58；Hepler等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.（《美国国家科学院院刊》）91:2176-2180；以及Hush等人(1994)The Journal of Cell Science（《细胞科学杂志》）107:775-784；将所有这些文献以引用方式并入本文。或者，可使用本领域已知的技术将经修饰的Cry3家族多核苷酸瞬时转化进植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行沉淀。因此，从粒子结合的DNA可发生转录，但其释放出来而整合进基因组中的频率则大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEI;Sigma#P3143)的粒子。

用于将多核苷酸靶向插入于植物基因组中的特定位置的方法是本领域已知的。在一个实施例中，将多核苷酸插入所需的基因组位置是用位点特异性重组系统来实现的。参见（例如）WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献都以引用方式并入本文。简单而言，可将本发明的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒旁侧为有两个不相同的重组位点。将转移盒引入进在其基因组中稳定掺入了这样的靶位点的植物中，该靶位点旁侧为两个对应于该转移盒的所述位点的不相同重组位点。提供适当的重组酶，将该转移盒整合于该靶标位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。

可根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports（《植物细胞报道》）5:81-84。然后可栽培这些植株并用同一转化株系或不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得子代。可培养两代或更多代以确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特征的表达已得到实现。

本发明的核苷酸序列可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而提供给植物。通常，这种方法涉及将所关注的核苷酸构建体掺入于病毒DNA或RNA分子内。已经认识到，本发明的重组蛋白可最初作为病毒多聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的杀虫蛋白。还认识到，这种包含本发明杀虫蛋白的氨基酸序列的至少一部分的病毒多聚蛋白可具有所需的杀虫活性。这种病毒多聚蛋白及编码它们的核苷酸序列为本发明所涵盖。给植物提供核苷酸构建体并在植物中产生所编码的蛋白质的方法（涉及病毒DNA或RNA分子）是本领域已知的。参见例如，美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367和No.5,316,931；将这些专利以引用方式并入本文。

如本文所用，术语植物还包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷物旨在意指商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。

本发明可用于任何植物物种（包括但不限于单子叶植物和双子叶植物）的转化。所关注的植物的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica）物种（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea），特别是可用作种子油来源的那些芸苔属植物；苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)、小米（例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、稷(Panicummiliaceum)、粟(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana)）、向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花（海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum)）、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musaspp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣（例如Lactucasativa）、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和香甘瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。可用于实施本发明的针叶树包括（例如）松树如火炬松(Pinustaeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(true firs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。本发明的植物包括作物植物（例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、小米、烟草等等），例如玉米和大豆植物。

草坪草包括但不限于：一年生蓝草(Poa annua)；一年生黑麦草(Loliummultiflorum)；加拿大蓝草(Poa compressa)；紫羊茅(Festuca rubra)；细弱剪股颖(Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(Agrostis palustris)；光穗冰草(Agropyrondesertorum)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；硬羊茅(Festuca longifolia)；肯塔基蓝草(Poa pratensis)；果园草(Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(Loliumperenne)；紫羊茅(Festuca rubra)；红顶草(Agrostis alba)；粗茎蓝草(Poatrivialis)；羊茅(Festuca ovina)；无芒雀麦草(Bromus inermis)；高羊茅(Festuca arundinacea)；梯牧草(Phleum pratense)；绒毛剪股颖(Agrostiscanina)；碱茅(Puccinellia distans)；西方冰草(Agropyron smithii)；百慕达草(Cynodon spp.)；圣奥古斯丁草(Stenotaphrum secundatum)；结缕草(Zoysiaspp.)；美洲雀稗(Paspalum notatum)；地毯草(Axonopus affinis)；百足草(Eremochloa ophiuroides)；狼尾草(Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(Paspalum vaginatum)；蓝格兰马草(Bouteloua gracilis)；野牛草(Buchloedactyloids)；垂穗草(Bouteloua curtipendula)。

所关注的植物包括谷物植物（提供所关注的种子）、油籽植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、大米、高粱、黑麦、小米等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。

在某些实施例中，本发明的核酸序列可与所关注多核苷酸序列的任何组合进行堆叠，以产生具有所需表型的植物。例如，本发明的多核苷酸可与任何其他编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的多核苷酸进行堆叠，所述多肽为例如其他苏云金芽孢杆菌毒蛋白（描述于美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,736,514、No.5,723,756、No.5,593,881、以及Geiser等人(1986)Gene（《基因》）48:109）、五邻体蛋白(pentin)（描述于美国专利No.5,981,722）等。所产生的组合还可包括所关注的多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。本发明的多核苷酸也可与任何其他基因或基因的组合堆叠，以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括（但不限于）：动物饲料所需的性状例如高油基因（如美国专利No.6,232,529）；平衡的氨基酸（例如hordothionin（美国专利No.5,990,389、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,703,049）；大麦高赖氨酸（Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.（《欧洲生物化学期刊》）165:99-106；和WO98/20122）以及高甲硫氨酸蛋白（Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》）261:6279；Kirihara等人(1988)Gene（《基因》）71:359；以及Musumura等人(1989)PlantMol.Biol.（《植物分子生物学》）12:123)）；消化性提高（例如经修饰的贮藏蛋白（提交于2001年11月7日的序列号为10/053,410的美国专利申请）；和硫氧还蛋白（提交于2001年12月3日的序列号为10/005,429的美国专利申请）），将这些专利的公开内容以引用方式并入本文。

本发明还提供通过使用本发明的杀虫蛋白与至少一种其他或“第二”杀虫蛋白的组合来增加昆虫靶标范围的方法。本领域已知的任何杀虫蛋白都可应用于本发明的方法中。这种杀虫蛋白包括但不限于Btδ-内毒素、蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶和过氧化物酶。

本发明的多核苷酸也可与疾病或除草剂抗性所需的性状进行堆叠（例如伏马毒素脱毒基因（美国专利No.5,792,931）；无毒性和疾病抗性基因（Jones等人(1994)Science（《科学》）266:789；Martin等人(1993)Science（《科学》）262:1432；以及Mindrinos等人(1994)Cell（《细胞》）78:1089）；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂如草胺膦或basta（例如bar基因）；和草甘膦抗性（如序列号为10/004,357的美国专利申请和序列号为10/427,692的美国专利申请中所公开的EPSPS基因和GAT基因）；以及加工或过程产物所需的性状，如高油（例如美国专利No.6,232,529）；改性油（例如脂肪酸去饱和酶基因（美国专利No.5,952,544；WO94/11516））；改性淀粉（例如ADPG焦磷酸化酶（AGP酶）、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE)）；以及聚合物或生物塑料（例如美国专利No.5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶（Schubert等人(1988)J.Bacteriol.（《细菌学杂志》）170:5837-5847）有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达），将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。还可将本发明的多核苷酸与提供诸如雄性不育（如，参见美国专利No.5.583,210）、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或诸如细胞周期调节或基因靶向（如，WO99/61619；WO00/17364；WO99/25821）之类的转化技术性状的多核苷酸组合，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。

这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或

方法或者遗传转化来对植物进行杂交育种。如果性状是通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包含一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化方案将性状与所关注的多核苷酸同时引入，其中所关注的多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中（反式）或包含在同一转化盒中（顺式）。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组体系在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见（例如）WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献的全部均以引用的方式并入本文。

本发明的组合物可用于以多种方式影响昆虫害虫并保护植物、种子和植物产品。例如，所述组合物可在涉及通过选自喷雾、喷粉、广播或种子涂覆的程序将有效量的杀虫组合物置于害虫的环境中的方法中使用。

在植物繁殖材料（果实、块茎、鳞茎、球茎、谷物、种子），但尤其是种子，作为商品出售之前，其通常用保护剂涂料进行处理，所述保护剂涂料包含除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制品中的几种的混合物，如果需要的话还进一步加上制剂领域常用的载体、表面活性剂或促施用助剂，以提供对抗细菌、真菌或动物害虫造成的损害的保护。为了处理种子，可通过如下方法将保护剂涂料施用至种子：用液体制剂浸渍块茎或谷物，或用组合的湿或干制剂对种子进行涂覆。另外，在特殊的情况中，其他施用至植物的方法也是可能的，例如针对芽或果实进行的处理。

包含编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列的本发明植物种子，可用包含种子处理化合物的种子保护剂涂料进行处理，所述种子处理化合物为例如克菌丹、萎锈灵、福美双、甲霜灵、甲基嘧啶磷以及其他常用于种子处理的化合物。在本发明的范围内的一个实施例中，将包含本发明的杀虫组合物的种子保护剂涂料单独使用或与常用于种子处理的种子保护剂涂料之一组合使用。

认识到，可用编码杀虫蛋白的基因来转化昆虫病原生物体。这种生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。

本发明还涵盖转化有至少一种本发明核酸的微生物、转化有包含该核酸的表达盒的微生物或转化有包含该表达盒的载体的微生物。在一些实施例中，该微生物是在植物上繁殖的微生物。本发明的一个实施例涉及包囊的杀虫蛋白，其包含能够表达至少一种本发明的杀虫蛋白的转化微生物。

可通过合适的载体将编码本发明的杀虫蛋白的基因引入微生物宿主中，并将所述宿主施用至环境或施用至植物或动物。在将核酸插入细胞中的语境中的术语“引入”，意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指涉核酸掺入进真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入进细胞的基因组（例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA）中、转化成自主复制子或者瞬时表达（例如转染的mRNA）。

可选择已知可占领一种或多种所关注的作物的“植物圈”（叶面、叶围、根围和/或根面）的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供表达杀虫蛋白的基因的稳定维持和表达，并且理想的是，提供对该杀虫剂的改善保护使其不受环境降解和失活。

这种微生物包括细菌、藻类和真菌。特别要关注的是诸如以下的微生物：细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Methylius、农杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)以及产碱杆菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别要关注的是诸如以下的植物圈细菌物种：丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、富营养产碱菌(Alcaligenesentrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacterrosues vinlandir)，以及诸如以下的植物圈酵母物种：深红酵母(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(Sporobolomyces rosues)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别要关注的是有色素微生物。

有多种方式可用来将表达杀虫蛋白的基因引入处于容许该基因的稳定维持和表达的条件下的微生物宿主中。例如，可构建出这样的表达盒，其包括所关注的核苷酸构建体及为了该核苷酸构建体的表达该核苷酸构建体所有效连接的转录和翻译调节信号、与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列（据此将发生整合）和/或在宿主中具有功能的复制系统（据此将发生整合或稳定维持）。

转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见例如，美国专利No.5,039,523和No.4,853,331；EPO0480762A2；Sambrook等人(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆实验指南》），Maniatis等人编辑（纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork)），下文称为“Sambrook II”；Davis等人编辑(1980)AdvancedBacterial Genetics（《高级细菌遗传学》），纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社；以及其中引用的参考文献。

若含杀虫蛋白的细胞要被进行处理以在将经处理的细胞施用于靶标害虫的环境时延长杀虫蛋白在细胞中的活性，则合适的宿主细胞可包括原核生物或真核生物，通常限于那些不会产生对高等生物体（如哺乳动物）有毒的物质的细胞。但是，若毒素不稳定或施用水平足够低而避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性，则可以使用会产生对高等生物体有毒的物质的生物体。作为宿主，特别要关注的将是原核生物和低等真核生物如真菌。示例性的原核生物（革兰氏阴性和革兰氏阳性二者）包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiceae)，如根瘤菌属(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，如发光杆菌属(photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物有真菌，如藻菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括酵母如酵母菌属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，如红酵母属(Rhodotorula)、短梗霉属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。

在为了杀虫蛋白生产目的而选择宿主细胞时特别要关注的特征包括杀虫蛋白基因向宿主中引入的便利性、表达系统的可获得性、表达的效率、蛋白质在宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。对于作为杀虫剂微胶囊使用特别要关注的特征包括杀虫剂的保护质量，如厚细胞壁、色素沉着以及包涵体的胞内包装或形成；叶亲和力；哺乳动物毒性的缺乏；对害虫取食的吸引力；在不对毒素造成损害的情况下杀灭和固定的容易性；等等。其他考虑因素包括配制和操作容易性、经济性、贮存稳定性等。

特别要关注的宿主生物包括酵母，例如红酵母属物种(Rhodotorulaspp.)、短梗霉属物种(Aureobasidium spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)和掷孢酵母属物种(Sporobolomyces spp.)；叶面生物体例如假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、欧文氏菌属物种(Erwinia spp.)和黄杆菌属物种(Flavobacterium spp.)和其他此类生物体，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属物种、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。

可将编码本发明的杀虫蛋白的基因引入在植物上繁殖的微生物（体表寄生菌）中，以将杀虫蛋白递送至潜在的靶害虫。体表寄生菌例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。

根定殖细菌例如可通过本领域已知的方法从所关注的植物分离。具体而言，可从植物的根分离出定殖根的蜡状芽孢杆菌菌株（参见例如，Handelsman等人(1991)Appl.Environ.Microbiol.（《应用与环境微生物学》）56:713-718）。可通过本领域已知的标准方法将编码本发明的杀虫蛋白的基因引入根定殖蜡状芽孢杆菌中。

可通过电转化手段将编码杀虫蛋白的基因例如引入到根定殖芽孢杆菌中。具体而言，可将编码杀虫蛋白的基因克隆进穿梭载体如pHT3101中（Lerecius等人(1989)FEMS Microbiol.Letts.（《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》）60:211-218）。含有特定杀虫蛋白基因的编码序列的穿梭载体pHT3101可例如通过电穿孔手段转化进根定殖芽孢杆菌中（Lerecius等人(1989)，FEMS Microbiol.Letts.（《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》）60:211-218）。

可设计表达系统，使得杀虫蛋白被分泌到革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）的细胞质之外。分泌杀虫蛋白的好处是：(1)避免所表达的杀虫蛋白的潜在细胞毒性作用；和(2)改进杀虫蛋白的纯化效率，包括但不限于提高每体积细胞培养液的蛋白质回收和纯化效率和降低每单位蛋白质的回收和纯化时间和/或成本。

可例如通过将适当的大肠杆菌信号肽与杀虫蛋白的氨基末端融合，使杀虫蛋白在大肠杆菌中分泌。大肠杆菌识别的信号肽可存在于已知在大肠杆菌中分泌的蛋白质，例如OmpA蛋白（Ghrayeb等人(1984)EMBO J,（《欧洲分子生物学组织杂志》）3:2437-2442）。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白质，因此它的信号肽据认为在转移过程中有效。另外，在加工前不需要对OmpA信号肽进行修饰，而其他信号肽例如脂蛋白信号肽则需要（Duffaud等人(1987)Meth.Enzymol.（《酶学方法》）153:492）。

可在细菌宿主中发酵本发明的杀虫蛋白，并且将所得的细菌加工并以与苏云金芽孢杆菌菌株用作杀昆虫喷剂相同的方式用作微生物喷剂。在杀虫蛋白从芽孢杆菌分泌的情况中，用本领域已知的程序将分泌信号移除或者突变。这种突变和/或缺失能防止杀虫蛋白在发酵过程中分泌到生长培养基中。杀虫蛋白保持在细胞内，然后将细胞进行加工以得到包囊的杀虫蛋白。任何合适的微生物都可用于这个目的。已用假单胞菌属将苏云金芽孢杆菌内毒素表达为包囊蛋白，并且将所得的细胞进行加工并作为杀虫剂喷施（Gaertner等人(1993)Advanced Engineered Pesticides（《高级工程化杀虫剂》），Kim编辑）。

作为另一个选择，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生杀菌蛋白。异源基因的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。然后将这些细胞在当将细胞施用于靶标害虫的环境时能延长该产生的毒素在细胞中的活性的条件下进行处理。所得的产物保持该毒素的毒性。然后可按照常规技术配制这些天然包囊的杀虫蛋白以便施用于靶害虫的寄生环境，例如土壤、水和植物的叶。参见例如EPA0192319，以及其中引用的参考文献。

在本发明中，可将转化的微生物（其包括完整生物体、细胞、孢子、杀虫蛋白、杀虫组分、害虫影响组分、突变体、活的或死的细胞和细胞组分，包括活的或死的细胞和细胞组分的混合物在内，和包括破碎的细胞和细胞组分在内）或者分离的杀虫蛋白与可接受的载体一起配制成例如以下杀虫组合物：悬浮液、溶液、乳液、撒粉、可分散颗粒、可润湿粉末以及可乳化浓缩物、气溶胶、浸渍颗粒、助剂、可涂覆糊、还有例如在聚合物物质中的包囊物。

本发明提供包含本发明的转化微生物的杀虫组合物。在这种实施例中，转化微生物通常以杀虫有效量与合适的载体一起存在于杀虫组合物中。本发明还涵盖这样的杀虫组合物，其以杀昆虫有效量单独包含本发明的分离蛋白或包含本发明的分离的蛋白质与本发明的转化微生物和/或本发明的包囊杀虫蛋白的组合，以及包含合适的载体。

以上所公开的这类组合物可通过加入以下物质来获得：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外保护剂、缓冲剂、助流剂或肥料、微量营养物供体或其他能影响植物生长的制品。可将包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料的一种或多种农业化学品与常用于配制领域的载体、表面活性剂或助剂进行组合，以便于产品处理和施用于特定的靶害虫。合适的载体和助剂可以是固体或液体，并对应于通常用于配制技术的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明的活性成分通常以组合物的形式施用，并且可施用至待处理的作物区、植物或种子。例如，可在粮仓或筒仓等内贮藏准备时或贮藏期间，将本发明的组合物施用至籽粒。本发明的组合物可与其他化合物同时施用或相继施用。施用含有本发明细菌菌株产生的至少一种杀虫蛋白的本发明活性成分或本发明农用化学组合物的方法包括但不限于：叶面喷施、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应害虫侵扰的强度。

合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物如例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或二酯或者这类酯的盐；脂肪醇硫酸盐如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如丁基萘磺酸盐；磺化的萘-甲醛缩合物的盐；磺化的苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐如酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或者二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯的磺酸钠。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酸酯例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，这种酯类与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇如2,4,7,9-四乙基-5-癸炔-4,7-二醇，或者乙氧基化的炔二醇。阳离子表面活性剂的例子包括例如脂族单胺、二胺或聚胺如乙酸盐、环烷酸盐或者油酸盐；或者含氧胺如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或聚胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或者季铵盐。

惰性材料的例子包括但不限于无机矿物质如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或者植物材料如软木、粉末玉米穗轴、花生壳、稻壳和胡桃壳。

本发明的组合物可以合适的形式直接施用或作为在施用前需要用适当量的水或其他稀释剂稀释的主要组合物的浓缩物。杀虫浓度将随具体制剂的性质而异，具体而言，随它是浓缩物还是直接施用而异。组合物含有1至98%的固体或液体惰性载体和0至50%或0.1至50%的表面活性剂。这些组合物将以商业产品的标示比率施用，例如当为干燥形式时约0.01磅至5.0磅每英亩，当为液体形式时约0.01品脱至10品脱每英亩。

在又一个实施例中，本发明的组合物以及转化的微生物和杀虫蛋白可在配制前先进行处理，以延长当施用于靶标害虫的环境时的杀虫活性，只要预处理对杀虫活性无害。这种处理可通过化学和/或物理手段进行，只要处理不会有害地影响组合物的性质。化学试剂的例子包括但不限于卤化剂；醛类如甲醛和戊二醛；抗感染剂如氯化苯甲烃铵；醇类如异丙醇和乙醇；以及组织固定剂如Bouin固定剂和Helly固定剂（参见例如，Humason(1967)Animal Tissue Techniques（《动物组织技术》）（W.H.Freeman andCo.公司））。

在本发明的其他实施例中，可能有利的是用蛋白酶例如胰蛋白酶处理经修饰的Cry3家族多肽以活化该蛋白质，然后再将本发明实施例的杀虫蛋白组合物施用于靶标害虫的环境。通过丝氨酸蛋白酶活化原毒素的方法是本领域公知的。参见例如Cooksey(1968)Biochem.J.（《生物化学杂志》）6:445-454；以及Carroll和Ellar(1989)Biochem.J.（《生物化学杂志》）261:99-105，将这些文献的教导内容以引用方式并入本文。例如，合适的活化方案包括但不限于将待活化的多肽例如纯化的经修饰的Cry3多肽（例如具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列）与胰蛋白酶以1/100重量比的Cry3蛋白质/胰蛋白酶在20nM NaHCO₃(pH8)中混合，并在36℃下消化样品3小时。

组合物（包括本发明的转化微生物和杀虫蛋白）可通过例如以下方式施用于害虫、植物、植物种子、植物部分或耕作区的环境：喷雾、雾化、撒粉、散播、涂覆或倾倒、引入土壤中或引到土壤上、引入灌溉水中、在害虫已开始出现时或者在害虫出现前进行种子处理或普通施用或散粉作为保护措施。例如，可将本发明的杀虫蛋白和/或转化微生物与谷物混合以在贮藏过程中保护谷物。通常重要的是在植物生长的早期阶段获得对害虫的良好防治，因为这是植物可能受到最严重损害的时期。本发明的组合物可便利地含有另一种杀昆虫剂，如果认为这有必要的话。在本发明的一个实施例中，在种植时将组合物直接施用于土壤，施用的形式为载体与芽孢杆菌菌株或者本发明的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。另一个实施例是包含农业化学品例如除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体与芽孢杆菌菌株或者本发明的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。

可在种植前或之后将杀虫组合物施用于耕作区。耕作区可包括昆虫害虫或者耕作区的环境条件可有利于昆虫害虫（如，昆虫害虫生长优选的空气温度、季节、土壤温度）。本文所用的“耕作区”包括期望在其中栽培植物的任何区域。这种耕作区包括但不限于在其中栽培植物的田地（如作物田、草地、树林地、生产林、用于栽培水果和蔬菜的田地等等）、温室、生长室等等。

在本发明的一些实施例中，多核苷酸编码抗体，当在至少一种选自植物和微生物的生物体中表达时所述抗体结合至所关注的经修饰的多肽（即，经修饰的Cry3家族蛋白）的表位。此类抗体可测定所关注的多肽的表达水平和/或蛋白酶活性。

在另一个实施例中，该抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体-Cry3蛋白复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领域所熟知的。参见例如Conrad和Sonnewald(2003)Nature Biotech.（《自然生物技术》）21:35-36，将该文献以引用的方式并入本文。

所谓“表位”意指抗体针对其而产生的并将与抗体结合的抗原分子的一部分。表位可包含线性氨基酸残基（即，表位内的残基以线性方式一个接一个顺序排列）、非线性氨基酸残基（本文称为“非线性表位”；这些表位不顺序排列），或线性或非线性氨基酸残基二者。通常，表位为短氨基酸序列，如，长度为约五个氨基酸。用于鉴定表位的系统性技术是本领域已知的并在例如美国专利No.4,708,871中有所描述。简而言之，可合成衍生自抗原的一组重叠寡肽，并使之结合至针的固相阵列上，每个针上有一独特寡肽。针的阵列可构成96孔微量滴定板，从而允许同时测定所有96个寡肽，例如用于结合至生物标记特异性单克隆抗体。或者，噬菌体展示肽文库试剂盒（新英格兰生物实验室(New England Biolabs)）目前可商购获得，适用于表位作图。使用这些方法，可以确定连续氨基酸的每个可能子集的结合亲和力以便鉴别给定抗体所结合的表位。当表位长度肽序列用于免疫抗体所来源的动物时，表位还可通过推理鉴定。

还提供了本文所公开的抗体的抗原结合片段和变体。此类变体将保留亲本抗体的所需结合性质。用于制备抗体片段和变体的方法是本领域普遍可用的。例如，本文所公开的抗体的氨基酸序列变体可通过在所克隆的编码所关注抗体的DNA序列中突变来制备。诱变和核苷酸序列变更的方法是本领域所熟知的。参见例如Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques inMolecular Biology（《分子生物学技术》）（纽约麦克米伦出版公司(MacMillan Publishing Company,New York)）；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）82:488-492；Kunkel等人(1987)Methods Enzymol.（《酶学方法》）154:367-382；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室指南》）（纽约冷泉港出版社）；美国专利No.4,873,192；以及其中引用的参考文献；将这些文献以引用方式并入本文。

还提供具有本发明抗体的结合特性的抗体。“结合特性”或“结合特异性”在用于提及抗体时是指抗体识别与比较抗体相同或类似的抗原表位。此类抗体的例子包括例如在竞争性结合测定法中与本发明的抗体竞争的抗体。本领域技术人员可使用标准方法确定抗体是否竞争性干扰另一种抗体。

在构建所关注抗体多肽的变体中，进行修饰使得变体继续具有所需活性，即与Cry3蛋白相似的结合特异性。显然，将在编码该变体多肽的DNA中所作的突变必须不将序列设置在阅读框外，并且优选将不会产生互补区，该互补区可以产生二级mRNA结构。参见欧洲专利公开No.75,444。

优选地，抗体变体包含与参考抗体分子的氨基酸序列或与参考抗体分子的较短部分具有至少70%或75%的序列同一性，优选至少80%或85%的序列同一性，更优选至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的序列同一性的氨基酸序列。更优选地，所述分子具有至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。出于本发明的目的，使用Smith-Waterman同源性搜索算法，使用具有空位开放罚分=12且空位延伸罚分=2、BLOSUM矩阵=62的仿射空位搜索，来确定%序列同一性。Smith-Waterman同源性搜索算法在如下文献中提出：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.（《应用数学进展》）2:482-489。变体可例如与参考抗体相差少至1至15个氨基酸残基，少至1至10个氨基酸残基例如6-10个，少至5个，少至4、3、2个，或甚至1个氨基酸残基。

用于制备抗体和用于选择适当抗体的方法是本领域已知的。参见例如Celis编辑（出版中）Cell Biology&Laboratory Handbook（《细胞生物学与实验室手册》），第三版（纽约学术出版社(Academic Press,NewYork)），将该文献全文以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，涉及Cr蛋白的商业抗体可用于实践本发明。

以下实例以举例说明的方式给出，而非限制本发明。

实验

实例1–IP3-1序列设计

为了将氨基酸序列多样性引入Cry3Aa，通过计算机模拟设计称为IP3-1的新Cry3型蛋白。在将一定多样性引入Cry3Aa的设计过程中，进行适度改变例如I→V、L→F、K→H、G→A，预计这只会在蛋白质结构中引起非常小的变化。此类结构变化在与通过改组引入的额外多样性组合时可导致更高的活性。

为了设计IP3-1，对所有可用的天然存在的Cry3肽序列进行比对。一个残基接一个残基地扫描Cry3序列，以找出Cry3蛋白中不同的特定残基。将Cry3Aa上找到的这些多样化残基一个接一个地更改为其他Cry3蛋白中找到的另一残基。通过计算机在结构上评估每个突变以确保多肽的结构完整性。使用同源建模根据其氨基酸序列来预测Cry3Aa衍生物的三维构象。使用Accelrys Discovery Studio^TMv2.0产生Cry3衍生物的同源模型。将通过X射线结晶学确定的Cry3Aa结构（蛋白数据库ID 1DLC，链A；参见Li等人(1991)Nature（《自然》）353:815-821）用作参考。AccelrysDiscovery Studio调用MODELER（Sali和Blundell(1993)J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）234:779-815）利用共轭梯度和模拟退火优化程序来构建模型蛋白结构。如此构建的同源模型可确认二级结构元件内的溶剂暴露位置和突变残基侧链的详细取向。当在结构评估期间鉴定出某些残基具有重大问题时，丢弃此类突变。在突变和结构评估循环之后，获得IP3-1的最终氨基酸序列。

利用大肠杆菌密码子用法将IP3-1氨基酸序列回译为核苷酸序列。IP3-1核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4和5中示出。合成IP3-1核苷酸序列并克隆进pMAL大肠杆菌载体中，以将IP3-1蛋白表达为MBP融合体。pMAL载体得自新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，将合成的DNA克隆进该载体中，并根据制造商推荐的方法纯化MBP-IP3-1融合蛋白。融合蛋白在大肠杆菌中表达为可溶性蛋白质。然而，当用因子Xa在pH8下消化该融合蛋白以从MBP分离IP3-1蛋白时，IP3-1蛋白沉淀。不含MBP的IP3-1在广泛pH范围（如测试的pH5至pH9）中几乎完全不可溶。该计算机设计的IP3-1的溶解度和玉米根虫(CRW)杀昆虫活性显示出与天然存在的Cry3Aa的报道特性相同（数据未示出）。

为了增加IP3-1的溶解度，尝试了若干突变（图1）。如下所述制备了多个突变体，并测定它们的溶解度和杀昆虫活性。在这些之中，有两组突变（组1：K152E-R158E和组2：E221S-K232S）在大约pH7处表现出一定程度改善的溶解度。此外，这些突变体表现出对抗WCRW的明显活性。

在突变条件下改组IP3-1DNA，如Stemmer(1994)Nature（《自然》）370:389-391所述。选出五千个改组变体，并筛查它们对抗WCRW的杀昆虫活性。在这些之中，3个改组变体表现出高CRW活性（表1）。这些变体称为IP3-H1、IP3-H4和IP3-H7（图1）。对这些变体进行测序，在IP3-1上找到下列突变：

IP3-H1：I340V、K384E、Q472L、F589L

IP3-H4：K63R、N97D、Q119H、F584L、I(M)593V

IP3-H7：I12T、K63E、Q232H、K496E、Y557H、S610T

如图1中证实的，每个改组变体含有将碱性氨基酸残基转换为中性或酸性残基的至少一个突变。IP3-H变体具有对抗WCRW、SCRW和NCRW的活性，而野生型Cry3Aa和IP3-1表现出低活性或无活性。从这些改组的CRW活性变体中，将上述的两组突变组合以产生如下新序列：

添加K152E-R158E突变产生：H1→H2、H4→H5和H7→H8

进一步添加E221S-K232S突变产生：H2→H3、H5→H6和H8→H9

通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质以确定精确的浓度。将蛋白质浓度调整为2.0mg/ml并在37℃下将其混合于96孔板的昆虫饮食中。该饮食用低温融化性琼脂糖制备，从而允许在37℃下与IP3蛋白彻底混合。在该饮食在室温下凝固后，在每孔中侵染昆虫（新生CRW幼虫）。将板用透气性塑料膜密封，并在28℃下温育4天。根据进食抑制和死亡率，对昆虫对IP3蛋白的响应进行评分。通过概率元分析计算EC50并示于表1中。

表1：IP3变体多肽的杀昆虫活性

实例2-IP3变体植物转化构建体的生成

将IP3变体的蛋白质序列H2(SEQ ID NO:8)、H3(SEQ ID NO:1)、H5(SEQ ID NO:11)、H6(SEQ ID NO:2)、H8(SEQ ID NO:14)和H9(SEQ IDNO:3)回译并优化用于在玉蜀黍中表达。所得的序列H2(SEQ ID:7)、H3(SEQ ID:9)、H5(SEQ ID:10)、H6(SEQ ID NO:12)、H8(SEQ ID NO:13)和H9(SEQ ID NO:15)由新泽西州皮斯卡特维的美国金斯瑞公司(GenscriptUSA Corp,Piscataway,NJ)合成，分别在5’和3’端带有BamHI和SnaBI限制性酶切位点。将每个变体以BamHI–SnaBI片段亚克隆进Gateway入门载体，该载体含有具有玉蜀黍泛素1启动子-5’UTR-内含子组合的植物表达盒(UBIZMPRO-UBIZM-5UTR–UBIZMINTRON)和马铃薯PINII终止子序列。所得的植物表达盒含有以此次序有效连接在一起的下列元件：UBIZMPRO-UBIZM-5UTR–UBIZMINTRON、IP3-变体基因和PINII终止子。表达盒两侧为Gateway attL3和attL4重组位点，并且该入门载体用于将表达盒转移进含有attR3和attR4的双元目的转化载体。最终的植物转化载体含有IP3-变体表达盒，该表达盒处于含有控制PAT可选标记基因的表达的玉蜀黍泛素1启动子-5’UTR-内含子以及35S终止子序列的盒的上游。

实例3-农杆菌介导的玉蜀黍转化和转基因植物的再生

对于含有IP3变体的玉蜀黍转化载体的农杆菌介导转化而言，采用Zhao的方法（美国专利5No.5,981,840和国际专利公布WO98/32326；将所述专利各自的内容据此以引用方式全文并入）。简而言之，从玉蜀黍分离出未成熟胚，在一定条件下使胚与转化有IP3变体植物转化构建体的农杆菌悬液接触，凭借该条件该细菌能够将本发明的基因序列转移至至少一个未成熟胚的至少一个细胞中（步骤1：感染步骤）。在该步骤中，将未成熟胚浸入农杆菌悬液中以起始接种。使胚与农杆菌共培养一段时间（步骤2：共培养步骤）。在该感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在该共培养期之后，进行任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂（步骤3：静息步骤）。为了消除农杆菌以及为了感染细胞的静息期，将未成熟胚在含有抗生素但不含选择剂的固体培养基上培养。接着，在含有选择剂的培养基上培养接种的胚，并且回收生长的转化愈伤组织（步骤4：选择步骤）。在含有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚，从而导致转化细胞的选择性生长。然后使愈伤组织再生成植株（步骤5：再生步骤），并且固体培养基上培养在选择性培养基上培育的愈伤组织以便再生植株。

实例4-转基因玉蜀黍根组织中的IP3变体的表达和表征

将取自V4-V6根的组织样品置于1.2mL管中并在0.6mL冷PBST（磷酸盐缓冲盐水加吐温-20）中提取。离心后，移除上清液，稀释并通过ELISA分析IP3变体表达。用于蛋白质测定的Cry3A ELISA试剂盒购自缅因州波特兰的恩沃劳格公司(EnviroLogix,Inc.,Portland,ME)。用于IP3变体蛋白的ELISA方法利用顺序“夹心”形式以确定样品提取物中蛋白质的浓度。在用抗CRY3A的抗体预包被的平板中温育标准品（在三个复孔中分析）和稀释样品提取物（在两个复孔中分析）。温育后，将未结合的物质从平板洗去。将针对各选择的蛋白质的不同特异性抗体（其与辣根过氧化物酶(HRP)缀合）添加至平板并温育。随后，将未结合的物质从平板洗去，从而留下“夹”在平板上包被的抗体与抗体-HRP缀合物之间的结合着的蛋白质。通过添加在HRP存在下产生有色产物的底物完成对结合的抗体-蛋白质复合物的检测。用酸溶液终止该反应并用读板仪测定每个孔的光密度(OD)。两个复孔所得结果的平均值用于确定根组织中表达的IP3变体浓度，单位为占总可溶蛋白质的百万分率(PPM)。

该分析结果以25个转基因事件中每种IP3变体积聚水平的平均值示于表2中。根组织中测试的所有IP3变体均观察到积聚。变体之间的表达水平差异可归因于多种因素，包括每种变体在植物组织中的固有稳定性和毒性，基因优化对于表达的有效性如何，以及与用于ELISA检测的CRY3AAb的交叉反应性差异。

表2：转基因玉蜀黍事件中的IP3变体的表达

转基因	根中的表达(ppm)
		对照	-
IP3-H2	1571
		IP3-H3	852
IP3-H5	6493
		IP3-H6	10094
IP3-H8	9942
		IP3-H9	9309

实例5-表达对抗玉米根虫的IP3变体的事件的功效

用表达IP3变体的事件研究了西方玉米根虫(WCRW)造成的根损伤。对大约在V4生长期的盆栽植物用大约400粒WCRW卵手工侵染，办法是将所述WCRW卵施加于土壤中。当成体WCRW开始出现于阴性对照花盆时，进行根部损伤评分。将植物从花盆取出，然后用加压水轻轻冲洗。使用0-3的结节损伤评级表(node injury scale)对根部损伤评级(CRWNIS)（Oleson等人(2005)J.Econ.Entomol.（《经济昆虫学杂志》）98(1):1-8），并计算每个处理的平均值。对WCRW以表达不同IP3变体的事件为食进行的平均根损伤评级示于表3中。

表3.表达对抗WCRW幼虫的各IP3变体的玉蜀黍的功效

变体ID	CRWNIS评分*	SD
			阴性对照	2.0	0.30
IP3-H2	0.12	0.28
			IP3-H3	0.26	0.51
IP3-H5	0.23	0.34
			IP3-H6	0.44	0.6
IP3-H8	0.64	0.76
			IP3-H9	0.38	0.58

SD：标准偏差

*玉米根虫结节损伤评分(CRWNIS)等级系统

根虫损伤测定法的结果证实这些IP3变体在转基因玉蜀黍中表达时提供了对WCRW的显著改善的控制。阴性对照植物受到了平均2个结节的根损伤，与之相比，表达IP3变体的转基因株的结节损伤评分在0.12至0.64的范围内。

应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指该实体的一者或多者；例如，“多肽”应理解为表示一个或多个多肽。同样地，术语“一个”（或“一种”）、“一（个）种或多（个）种”和“至少一（个）种”在本文中可互换使用。

在本说明书通篇中，词语“包含”及其语法变体要被理解为暗示包括规定的元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组。

本文所用的术语“约”当指值时，意在涵盖偏离指定的量达，在一些实施例中，±50%的偏差，在一些实施例中，±20%的偏差，在一些实施例中，±10%的偏差，在一些实施例中，±5%的偏差，在一些实施例中，±1%的偏差，在一些实施例中，±0.5%的偏差，在一些实施例中，±0.1%的偏差，只要这种偏差适于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。

另外，在量、浓度或其他值或参数以范围（优选范围）或上限优选值和下限优选值列表给出时，这应该理解为具体地公开了由任何范围上限或上限优选值和任何范围下限或下限优选值的任何配对形成的所有范围，而无论是否单独公开了这些范围。如果本文中叙述了数值的范围，除非另外指明，否则该范围旨在包括它们的端点，以及该范围内的所有整数和分数。当限定范围时，无意于使本公开的主题的范围受限于所叙述的具体值。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义。虽然，本文中类似的任何方法和材料可用于本发明的实施或测试，但优选的方法和材料在本文中也有所描述。

借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。

Claims (54)

1.一种经修饰的Cry3杀虫多肽，所述多肽在与天然存在的Cry3多肽相比时包含至少一个氨基酸置换，其中所述置换使所述经修饰的Cry3杀虫多肽比所述天然存在的Cry3多肽碱性更弱。

2.根据权利要求1所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述置换包括将碱性氨基酸替换为中性或酸性氨基酸，将中性氨基酸替换为酸性氨基酸，或它们的组合。

3.根据权利要求2所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述酸性氨基酸包含谷氨酸或天冬氨酸残基。

4.根据权利要求2所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述中性氨基酸包含丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含氨基酸置换，所述置换将天然存在的Cry3多肽的一个或多个组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基替换为谷氨酸或天冬氨酸残基。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含氨基酸置换，所述置换将天然存在的Cry3多肽的一个或多个组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基替换为丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述天然存在的Cry3杀虫多肽具有与SEQ ID NO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述天然存在的Cry3杀虫多肽具有SEQ ID NO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33中所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述一个或多个置换位于这样的位置，所述位置选自对应于SEQ IDNO:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、531、557、584、589、593和610的位置。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽具有与SEQ ID NO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

11.根据权利要求10所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽具有SEQ ID NO:1、2、3、8、11或14中所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽在与SEQ ID NO:6的位置152或158对应的位置处包含酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽表现出对蛋白酶消化的抗性。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽在与天然存在的Cry3多肽相比时具有改善的杀虫活性。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽在与天然存在的Cry3多肽相比时在pH5至9的溶液中具有更大溶解度。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽具有对抗鞘翅目(Coleopteran)的杀虫活性。

16.根据权利要求15所述的经修饰的Cry3杀虫多肽，其中所述鞘翅目为西方玉米根虫或南方玉米根虫。

17.一种多核苷酸，其具有编码根据权利要求1-16中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽的核苷酸序列。

18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与SEQ IDNO:7、9、10、12、13或15所示的序列具有至少90%序列同一性。

19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列在SEQ IDNO:7、9、10、12、13或15中示出。

20.一种表达盒，其包含根据权利要求17-19中任一项所述的多核苷酸。

21.根据权利要求20所述的表达盒，其中所述多核苷酸有效连接至驱动在微生物或植物中表达的启动子。

22.一种宿主细胞，其包含根据权利要求17-19中任一项所述的多核苷酸。

23.一种植物，其包含根据权利要求17-19中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸有效连接至在所述植物中有活性的启动子。

24.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物为单子叶植物。

25.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物为双子叶植物。

26.根据权利要求24所述的植物，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、甘蔗、小麦、水稻、大麦、高粱和黑麦。

27.根据权利要求26所述的植物，其中所述单子叶植物为玉蜀黍。

28.一种转基因种子，其由根据权利要求23-27中任一项所述的植物产生。

29.一种产生具有改善杀虫活性的植物的方法，所述方法包括将具有编码经修饰的Cry3杀虫多肽的核苷酸序列的多核苷酸引入所述植物中，所述经修饰的Cry3杀虫多肽在与天然存在的Cry3多肽相比时具有至少一个氨基酸置换，其中所述置换使所述经修饰的Cry3杀虫多肽比所述天然存在的Cry3多肽碱性更弱，其中所述多核苷酸序列有效连接至驱动在植物细胞中表达的启动子序列。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述置换包括将碱性氨基酸替换为中性或酸性氨基酸，将中性氨基酸替换为酸性氨基酸，或它们的组合。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述酸性氨基酸包含谷氨酸或天冬氨酸残基。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述中性氨基酸包含丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基。

33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含氨基酸置换，所述置换将天然存在的Cry3多肽的一个或多个组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基替换为谷氨酸或天冬氨酸残基。

34.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽包含氨基酸置换，所述置换将天然存在的Cry3多肽的一个或多个组氨酸、赖氨酸或精氨酸残基替换为丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基。

35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述天然存在的Cry3杀虫多肽具有与SEQ ID NO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述天然存在的Cry3杀虫多肽具有SEQ ID NO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33中所示的氨基酸序列。

37.根据权利要求29-36中任一项所述的方法，其中所述一个或多个置换位于这样的位置，所述位置选自对应于SEQ ID NO:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、531、557、584、589、593和610的位置。

38.根据权利要求29-37中任一项所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽具有与SEQ ID NO:1、2、6、8、11或14所示的所述氨基酸序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽具有SEQ ID NO:1、2、3、8、11或14中所示的所述氨基酸序列。

40.根据权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽在与SEQ ID NO:6的位置152或158对应的位置处包含酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽表现出对蛋白酶消化的抗性。

41.根据权利要求29-40中任一项所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽在与天然存在的Cry3多肽相比时具有改善的杀虫活性。

42.根据权利要求29-41中任一项所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽在与天然存在的Cry3多肽相比时在pH5至9的溶液中具有更大溶解度。

43.根据权利要求29-42中任一项所述的方法，其中所述经修饰的Cry3杀虫多肽具有对抗鞘翅目的杀虫活性。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述鞘翅目为西方玉米根虫或南方玉米根虫。

45.一种用于防治耕作区的昆虫害虫的方法，其包括在所述区域种植根据权利要求28所述的转基因种子。

46.一种杀虫组合物，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的经修饰的Cry3杀虫多肽。

47.根据权利要求46所述的杀虫组合物，其还包含载体。

48.一种用于防治耕作区的昆虫害虫的方法，其包括向所述昆虫害虫的环境施加有效量的根据权利要求46或47所述的杀虫组合物。

49.一种包含根据权利要求17-19中任一项所述的多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸有效连接至驱动在所述微生物中表达的启动子。

50.一种杀虫组合物，其包含根据权利要求49所述的至少一种微生物。

51.根据权利要求50所述的杀虫组合物，其还包含载体。

52.一种用于防治耕作区的昆虫害虫的方法，其包括向所述昆虫害虫的环境施加有效量的根据权利要求50或51所述的杀虫组合物。

53.一种用于防治耕作区的昆虫害虫的方法，其包括在所述区域种植根据权利要求28所述的转基因种子。

54.根据权利要求48、52和53中任一项所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目。

Images