CN105407709B - 具有广谱活性的杀昆虫多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株获得的编码具有对昆虫害虫(包括鳞翅目和鞘翅目昆虫)的杀虫活性的多肽的核酸及其变体和片段。本发明的具体实施例提供编码杀虫蛋白的分离核酸、包括本发明实施例的核酸的杀虫组合物、DNA构建体及转化的微生物和植物。这些组合物可在防治害虫特别是植物害虫的方法中使用。

Description

具有广谱活性的杀昆虫多肽及其用途
对以电子方式提交的序列表的引用
创建于2104年7月18日、大小为74千字节的文件名为“5277PCT_sequence_listing.txt”的序列表以计算机可读形式与本说明书同时提交。该序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及从新型苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)基因获得的天然和重组核酸，该新型苏云金芽孢杆菌基因编码以针对昆虫害虫的杀虫活性为特征的杀虫多肽。本发明的组合物和方法利用所公开的核酸及其编码的杀虫多肽来防治植物害虫。
背景技术
昆虫害虫是造成全世界农作物损失的主要因素。例如，行军虫取食、黑地蚕损害或者欧洲玉米螟损害可对农业生产商造成经济上的破坏。单单是欧洲玉米螟侵袭非甜质玉米和甜玉米造成的昆虫害虫相关作物损失，一年的损害和防治费用就达大约十亿美元。
传统上，影响昆虫害虫群体的主要方法是施用广谱化学杀昆虫剂。但是，消费者和政府监管者都日益关注与合成化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。由于这些关注，监管者禁止或者限制了一些危害比较大的杀虫剂的使用。因此，人们对于开发替代杀虫剂有很大的兴趣。
使用微生物剂如真菌、细菌或者另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治，可提供具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言，生物杀虫剂的使用造成的污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀昆虫剂的特征性靶标特异性更高的靶标特异性。另外，生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济产量。
已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些物种对于多种昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫害虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等等。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)和日本金龟芽孢杆菌(Bacillus papilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)的菌株(Harwook，ed.，((1989)Bacillus(Plenum Press)，306)(Harwook编辑，1989年，《芽孢杆菌》，(普莱南出版社)，306)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株(WO 96/10083)也被指出具有昆虫病原性。杀虫活性看起来集中在伴胞晶体蛋白包涵体中，但从芽孢杆菌的营养生长期也分离到杀虫蛋白。有数种编码这些杀虫蛋白的基因已得到分离和表征(参见例如美国专利No.5,366,892和No.5,840,868)。
微生物杀昆虫剂特别是那些从芽孢杆菌(Bacillus)菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。最近，农业科学家通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，开发出了抗虫性增强的作物。例如，已对玉米和棉花作物进行遗传工程改造以产生从Bt的菌株分离的杀虫蛋白(参见例如Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.59(3)：417-425(Aronson，2002年，《细胞分子生命科学》，第59卷，第3期，第417-425页)；Schnepf et al.(1998)Microbiol Mol Biol Rev.62(3)：775-806)(Schnepf等人，1998年，《微生物分子生物学评论》，第62卷，第3期，第775-806页))。这些经遗传工程改造的作物目前在美国农业中广泛应用，给农场主提供了替代传统昆虫防治方法的环境友好的方案。另外，经遗传工程改造而含有杀虫Cry毒素的马铃薯已被出售给美国农场主。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物已证明在商业上十分成功，但它们仅对较窄范围的经济上重要的昆虫害虫具有抗性。
因此，仍然需要对昆虫害虫具有更大范围的杀昆虫活性的新Bt毒素，例如对更多种类的鳞翅目昆虫具有活性的毒素。另外，仍然需要对多种昆虫害虫具有活性的生物杀虫剂并且需要具有改善的杀昆虫活性的生物杀虫剂。
发明内容
本发明提供用于影响昆虫害虫的组合物和方法。更具体而言，本发明的实施例涉及利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列来产生能表达本发明实施例的杀昆虫多肽的转化微生物和植物从而影响昆虫的方法。在一些实施例中，所述核苷酸序列编码对至少一种属于鳞翅目的昆虫具有杀虫作用的多肽。
本发明实施例提供编码具有抗昆虫害虫的杀虫活性的多肽的核酸分子及其片段和变体(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15，它们分别编码以下多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16)。获自Bt的本发明实施例的野生型(例如天然)核苷酸序列编码一种杀昆虫肽。本发明实施例还提供所公开的核苷酸序列的编码生物活性(例如杀昆虫)多肽的片段和变体。
本发明实施例还提供由本发明实施例的天然或经修饰的(例如经诱变或经操纵的)核酸所编码的分离的杀虫(例如杀昆虫)多肽。具体举例，本发明实施例的杀虫蛋白包括从经诱变的核酸产生的全长蛋白质和多肽的片段，所述经诱变的核酸被设计用来将特定氨基酸序列引入到本发明实施例的多肽中。在具体的实施例中，所述多肽相对于衍生它们的天然多肽的杀虫活性具有增强的杀虫活性。
本发明实施例的核酸也可用于产生转基因的(例如转化的)单子叶植物或双子叶植物，所述植物的特征在于其基因组包括至少一个被稳定掺入的核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包括可操作性连接至驱动所编码的杀虫多肽表达的启动子的本发明实施例的编码序列。因此，本发明还提供转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。
在一个具体的实施例中，可使用已被优化以使在宿主植物中的表达提高的核酸来产生转化植物。例如，可将本发明实施例的杀虫多肽之一进行反翻译，以产生包括为了在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸，所述宿主例如是作物如玉米(Zea mays)作物。这种转化的植物(例如双子叶植物或者单子叶植物)对编码序列的表达将导致产生杀虫多肽并给植物赋予提高的抗虫性。一些实施例提供表达能在用于影响各种昆虫害虫的方法中使用的杀虫多肽的转基因植物。
本发明实施例还包括含有本发明实施例的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫组合物，并可任选包括另外的杀昆虫肽。本发明实施例涵盖将这种组合物应用于昆虫害虫的环境以影响昆虫害虫。
附图说明
图1A至1D显示SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列比对。氨基酸差异以阴影表示。
具体实施方式
本发明的实施例涉及用于影响昆虫害虫尤其是植物害虫的组合物和方法。更具体而言，本发明实施例的分离核酸及其片段和变体包括编码杀虫多肽(例如蛋白质)的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白对昆虫害虫具有生物活性(例如杀虫活性)，所述昆虫害虫例如但不限于鳞翅目的昆虫害虫。
本发明实施例的组合物包括编码杀虫多肽的分离核酸及其片段和变体、包括本发明实施例的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白以及杀虫组合物。一些实施例提供相对于相应的野生型蛋白的杀虫活性而言具有改善的对鳞翅目害虫的杀昆虫活性的经修饰的杀虫多肽。本发明实施例还提供用这些新核酸转化的植物和微生物，以及涉及将这种核酸、杀虫组合物、转化的生物体及其产物用于影响昆虫害虫的方法。
本发明实施例的核酸和核苷酸序列可用于转化任何生物体以产生所编码的杀虫蛋白。本发明提供涉及使用这种转化的生物体来影响或防治植物害虫的方法。本发明实施例的核酸和核苷酸序列也可用于转化细胞器如叶绿体(McBride et al.(1995)Biotechnology 13：362-365(McBride等人，1995年，《生物技术》，第13卷，第362-365页)；和Kota et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1840-1845(Kota等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第1840-1845页))。
本发明实施例还涉及对编码生物活性杀虫蛋白的天然编码序列的片段和变体的识别。本发明实施例的核苷酸序列可在用于影响害虫特别是昆虫害虫(如鳞翅目害虫)的方法中直接使用。因此，本发明实施例提供不依赖使用传统的合成化学杀昆虫剂而影响昆虫害虫的新方法。本发明实施例涉及对天然生物可降解杀虫剂及编码它们的基因的发现。
本发明实施例还提供天然编码序列的片段和变体，所述天然编码序列也编码生物活性(例如杀虫)多肽。本发明实施例的核酸涵盖已被优化以便由特定生物体的细胞表达的核酸或者核苷酸序列，例如已使用基于具有增强的杀虫活性的多肽的氨基酸序列的植物偏好密码子进行了反翻译(即逆翻译)的核酸序列。本发明实施例还提供能赋予本发明实施例的多肽改善的或变更的性质的突变。参见例如美国专利7,462,760。
在下面的描述中，以广义方式使用到多个术语。提供了以下定义以便理解本发明实施例。
单位、前缀和符号可以以其国际单位制(SI)接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。以上定义的术语通过参考本说明书整体而得到更完全的定义。
本文所用的“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如肽核酸)：其以与天然核苷酸相似的方式杂交至单链核酸。
本文所用的术语“编码”或“所编码的”在指定的核酸的语境中使用时，意指该核酸包括指导核苷酸序列翻译成指定蛋白质所必需的信息。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来指定的。编码蛋白的核酸可以包括在该核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。
本文所用的指涉指定的多核苷酸或其所编码的蛋白质的“全长序列”，意指具有天然的(非合成的)内源序列的整个核酸序列或者整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码指定蛋白质的全长催化活性形式。
本文所用的术语“反义”在核苷酸序列的取向的语境中使用时，指双链多核苷酸序列以反义链得以转录的取向可操作性连接到启动子。反义链与内源转录产物充分互补，使得内源转录产物的翻译常常被抑制。因此，在术语“反义”在特定核苷酸序列的语境中使用的情形中，这个术语指该参考转录产物的互补链。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，并且适用于天然氨基酸聚合物。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指整合进蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。该氨基酸可以是天然氨基酸，并且除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸的已知类似物。
本发明实施例的多肽可以由本文公开的核酸产生，或者通过使用标准的分子生物学技术产生。例如，本发明实施例的蛋白质可通过在适当的宿主细胞中表达本发明实施例的重组核酸来产生，或者作为另一种选择，通过离体(ex vivo)程序的组合来产生。
本文所用的术语“分离的”和“纯化的”可互换使用，指这样的核酸或者多肽或者它们的生物活性部分：实质上或者基本上不含通常在其天然环境中存在的与所述核酸或多肽相伴或者相互作用的成分。因此，分离的或纯化的核酸或多肽，当通过重组技术产生时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。
“分离的”核酸通常不含在该核酸的来源生物体的基因组DNA中天然位于该核酸的旁侧的序列(即位于该核酸的5′和3′末端的序列)(例如蛋白质编码序列)。例如，在各个实施例中，分离的核酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸的旁侧的核苷酸序列。
本文所用的术语“分离的”或者“纯化的”在用来指本发明实施例的多肽时，意指该分离的蛋白质实质上不含细胞物质，并且包括具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的污染性蛋白质的蛋白质制剂。当本发明实施例的蛋白质或其生物活性部分用重组法生产时，培养基代表少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或者非目的蛋白质的化学品。
“重组的”核酸分子(或DNA)在本文用来指处于重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸不含在该核酸的来源生物体的基因组DNA中天然处于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(优选蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，“分离的”或“重组的”在用来指核酸分子时排除分离的染色体。
如本文所用，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”是指与天然或基因组核酸序列相比在核酸序列中具有一个或多个改变的核酸分子。在一些实施例中，对天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码简并性引起的核酸序列改变；用于在植物中表达的核酸序列的密码子优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一种氨基酸置换、插入、缺失和/或添加引起的核酸序列改变；与基因组核酸序列相关的一个或多个内含子的去除；一个或多个异源内含子的插入；与基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区的缺失；一个或多个异源上游或下游调节区的插入；与基因组核酸序列相关的5′和/或3′非翻译区的缺失；异源5′和/或3′非翻译区的插入；以及聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是合成核酸序列。
在本说明书通篇中，词语“包括”及其语法变体应被理解为暗示包括规定的元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组。
本文所用的术语“影响昆虫害虫”指在昆虫发育的任何阶段引起昆虫取食、生长和/或行为方面的变化，包括但不限于：杀灭昆虫；延迟生长；防止繁殖能力；拒食活性；等等。
本文所用的术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义地用来指某生物体或物质(例如蛋白质)的可以通过害虫在取食和暴露达适宜时间长度后害虫死亡率、害虫体重减轻、害虫排斥性和害虫其他行为和身体变化(但不限于通过这些方面)进行测量的活性。因此，具有杀虫活性的生物体或物质不利地影响害虫适合度的至少一个可测量参数。例如，“杀虫蛋白”是本身或与其他蛋白质组合表现杀虫活性的蛋白质。
如本文所用，术语“杀虫有效量”表示某物质或者生物体的当在害虫的环境中存在时具有杀虫活性的量。对于每种物质或者生物体，杀虫有效量是针对在指定环境中受影响的每种害虫凭经验确定。类似地，当害虫是昆虫害虫时，“杀昆虫有效量”可用来指“杀虫有效量”。
本文所用的术语“重组工程改造的”或“工程改造的”意指基于对蛋白质作用机制的了解和对被引入、缺失或置换的氨基酸的考虑，利用重组DNA技术在蛋白质结构中引入(例如工程改造出)变化。
本文所用的术语“突变核苷酸序列”或“突变”或“经诱变的核苷酸序列”表示这样的核苷酸序列，其已被诱变或变更以含有一个或多个在相应的野生型序列中不存在的核苷酸残基(例如碱基对)。这种诱变或变更由核酸残基的一个或多个添加、缺失或置换或取代所组成。当突变是通过添加、移除或取代蛋白水解位点的氨基酸作出时，这个添加、移除或取代可在蛋白水解位点基序内或靠近蛋白水解位点基序，只要达到突变的目的(即，只要该位点的蛋白水解被改变)。
突变核苷酸序列可编码表现出改善的或降低的杀昆虫活性的突变杀昆虫毒素，或者编码这样的氨基酸序列，该氨基酸序列能赋予含有它的多肽改善的或降低的杀昆虫活性。本文所用的术语“突变体”或“突变”在蛋白质、多肽或氨基酸序列的语境中是指这样的序列，其已被诱变或变更以含有一个或多个在相应的野生型序列中不存在的氨基酸残基。这种突变或变更由氨基酸残基的一个或多个添加、缺失或置换或取代所组成。突变多肽表现出改善的或降低的杀昆虫活性，或者代表这样的氨基酸序列，该氨基酸序列能赋予含有它的多肽改善的杀昆虫活性。因此，术语“突变体”或“突变”指突变核苷酸序列和所编码的氨基酸中的任一者或二者。突变体可单独使用，或者可与本发明实施例的其他突变体或者与其他突变体以任何相容的组合进行使用。“突变多肽”可相反地表现出杀昆虫活性的降低。在不止一个突变被添加到特定核酸或蛋白质的情形中，所述突变可同时添加或依序添加；如果是依序添加，突变可以按任何合适的顺序添加。
本文所用的术语“改善的杀昆虫活性”或“改善的杀虫活性”指本发明实施例的杀昆虫多肽相对于其相应的野生型蛋白质的活性具有增强的杀昆虫活性，和/或该杀昆虫多肽对更广范围的昆虫有效，和/或该杀昆虫多肽对不易受野生型蛋白的毒性影响的昆虫具有特异性。改善的或增强的杀虫活性的发现，要求证明相对于野生型杀昆虫多肽的针对同一昆虫靶标测定的杀虫活性而言，对该昆虫靶标的杀虫活性提高至少10％，或至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％或300％或更高。
例如，如果相对于受野生型Bt毒素影响的昆虫范围而言受该多肽影响的昆虫范围更广或更窄，则就提供了改善的杀虫或杀昆虫活性。在需要多用途性的情况下，更宽的影响范围可能是合乎需要的，而在例如有益昆虫可能反而会被该毒素的使用或存在影响的情况下，较窄的影响范围可能是合乎需要的。尽管本发明实施例不受任何特定作用机制的限定，但也可以通过多肽的一个或多个特征的改变从而提供改善的杀虫活性；例如，多肽在昆虫肠内的稳定性或寿命相对于相应野生型蛋白质的稳定性或寿命可能有所改善。
本文所用的术语“毒素”指表现出杀虫活性或杀昆虫活性或改善的杀虫活性或改善的杀昆虫活性的多肽。“Bt”或“苏云金芽孢杆菌”毒素旨在包括苏云金芽孢杆菌各个菌株中存在的较广类别的Cry毒素，包括诸如Cry1、Cry2或Cry3之类的毒素在内。
术语“蛋白水解位点”或者“切割位点”指这样的氨基酸序列，其赋予对一类蛋白酶或某种特定蛋白酶的敏感性，使得含有该氨基酸序列的多肽被该类蛋白酶或该特定蛋白酶消化。蛋白水解位点据称对能识别该位点的蛋白酶(一种或多种)“敏感”。本领域认识到，消化的效率会不同，而消化效率的降低可导致多肽在昆虫肠道中的稳定性或寿命提高。因此，蛋白水解位点可赋予对不止一种蛋白酶或一类蛋白酶的敏感性，但各种蛋白酶在该位点的消化效率可不同。蛋白水解位点包括例如胰蛋白酶位点、胰凝乳蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。
研究已证实，鳞翅目昆虫肠道蛋白酶包括胰蛋白酶类、胰凝乳蛋白酶类和弹性蛋白酶类。参见例如Lenz et al.(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212(Lenz等人，1991年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第16卷，第201-212页)；和Hedegus et al.(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47(Hedegus等人，2003年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第53卷，第30-47页)。例如，在棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫的中肠中发现了大约18种不同的胰蛋白酶类(参见Gatehouse et al.(1997)InsectBiochem.Mol.Biol.27：929-944(Gatehouse等人，1997年，《昆虫生物化学与分子生物学》，第27卷，第929-944页)。已研究了这些蛋白酶偏好的蛋白水解底物位点。参见例如Petersonet al.(1995)Insect Biochem.Mol.Biol.25：765-774(Peterson等人，1995年，《昆虫生物化学与分子生物学》，第25卷，第765-774页)。
已试图了解Bt毒素的作用机制和对毒素进行工程改造使其具有改善的性质。已证实昆虫肠道蛋白酶可影响Bt Cry蛋白对昆虫的影响。一些蛋白酶会通过将Cry蛋白从“原毒素”形式加工成毒性形式或“毒素”而将它们活化。参见Oppert(1999)Arch.InsectBiochem.Phys.42：1-12(Oppert，1999年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第42卷，第1-12页))；和Carroll et al.(1997)J.Invertebrate Pathology 70：41-49(Carroll等人，1997年，《无脊椎动物病理学杂志》，第70卷，第41-49页)。毒素的这种活化可包括从蛋白质移除N末端肽和C末端肽，也可包括蛋白质的内部切割。其他蛋白酶可降解Cry蛋白。参见Oppert(出处同上)。
对具有不同特异性的Cry毒素的氨基酸序列的比较揭示出五个高度保守的序列块。在结构上，这类毒素包括三个不同的结构域，它们从N末端到C末端分别为：参与孔形成的一簇七个α螺旋(称为“结构域1”)、参与细胞结合的三个反平行β片层(称为“结构域2”)和β夹层(beta sandwich)(称为“结构域3”)。这些结构域的位置和性质是本领域技术人员已知的。参见例如Li et al.(1991)Nature，305：815-821(Li等人，1991年，《自然》，第305卷，第815-821页)和Morse et al.(2001)Structure，9：409-417(Morse等人，2001年，《结构》，第9卷，第409-417页)。当指涉特定结构域如结构域1时，应理解，该结构域相对于特定序列的确切终点并不关键，只要该序列或其部分包括能提供至少某种归因于该特定结构域的功能的序列。因此，例如，当指涉“结构域1”时，意指特定序列包括一簇七个α螺旋，但就该簇而言所使用的或所指的序列的确切终点并不关键。本领域技术人员熟悉这种终点的确定和这类功能的评价。
为更好地表征和改善Bt毒素，研究了细菌Bt的多种菌株。发现从Bt菌株的培养物制备的晶体制品具有针对多种鳞翅目害虫的杀虫活性(参见例如实验实例1)。已作出努力以从选定的菌株鉴定编码晶体蛋白的核苷酸序列，并且从这些细菌菌株分离出了本发明实施例的野生型(即天然)核酸，将其克隆进表达载体中并转化进大肠杆菌中。认识到，取决于给定的制品的特性，有时需要进行胰蛋白酶预处理以活化杀虫蛋白才能展示出杀虫活性。因此，应理解，一些杀虫蛋白需要蛋白酶消化(例如通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)进行活化，而其他蛋白质不用进行活化就具有生物活性(例如杀虫活性)。
这种分子可通过例如美国专利7,462,760所描述的手段进行变更。另外，可对核酸序列进行工程改造以编码含有额外的突变的多肽，所述额外的突变相对于天然多肽的杀虫活性赋予改善的或变更的杀虫活性。这种经工程改造的核酸的核苷酸序列包括野生型序列中不存在的突变。
本发明实施例的突变多肽通常通过涉及以下步骤的方法制备：获得编码Cry家族多肽的核酸序列；分析该多肽的结构，以基于考虑靶结构域在毒素的作用方式中的所建议的功能，鉴定用于对潜在的基因序列进行诱变的特定“靶”位点；向该核酸序列中引入一个或多个突变，以在被编码的多肽序列的一个或多个氨基酸残基中产生期望的变化；和测定所产生的多肽的杀虫活性。
许多Bt杀昆虫毒素由于它们的氨基酸序列和三级结构的相似性而有不同程度的相关性，并且获得Bt毒素的晶体结构的手段是公知的。Cry3A和Cry3B多肽二者的示例性高分辨率晶体结构解析可在文献中获得。Cry3A基因的已解出的结构(Li et al.(1991)Nature353：815-821(Li等人，1991年，《自然》，第353卷，第815-821页))使人们把握了毒素的结构与功能之间的关系。将已发表的Bt毒素的结构分析与已报道的与特定结构、基序等相关的功能结合起来考虑，发现该毒素的特定区域与该蛋白质的特定功能和作用模式各分立步骤相关。例如，许多从Bt分离的毒素通常被描述为包括三个结构域：参与孔形成的七螺旋束、参与受体结合的三片层结构域以及β夹层模体(Li et al.(1991)Nature 305：815-821(Li等人，1991年，《自然》，第305卷，第815-821页))。
如美国专利No.7,105,332和7,462,760中报道，可通过靶向位于Cry蛋白的结构域1的α螺旋3和4之间的区域来改善该毒素的毒性。这个理论是以关于杀昆虫毒素的大量知识为前提的，这些知识包括：1)已报道Cry3A毒素的结构域1的α螺旋4和5插入到易感昆虫的中肠的衬细胞的脂质双层中(Gazit et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：12289-12294(Gazit等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第12289-12294页))；2)本发明人认识了野生型蛋白质的氨基酸序列内的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位点的位置；3)据观察，经胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理进行体外活化后，野生型蛋白质在抵抗某些昆虫方面更具有活性；和4)据报道，将毒素从3′末端消化导致了对昆虫的毒性降低。
可在多个背景序列中产生和设置一系列突变，以产生具有增强的或变更的杀虫活性的新型多肽。参见例如美国专利7,462,760。这些突变体包括但不限于：在位于结构域1的螺旋3和4之间的区域中添加至少一个对蛋白酶更敏感的位点(例如胰蛋白酶切割位点)；将野生型序列中的原始的对蛋白酶敏感的位点用不同的对蛋白酶敏感的位点替代；在特定的位置添加多个对蛋白酶敏感的位点；在对蛋白酶敏感的位点(一个或多个)附近添加氨基酸残基，以改变多肽的折叠从而增强在对蛋白酶敏感的位点(一个或多个)处对多肽的消化；以及添加突变以保护多肽免遭会降低毒性的降解性消化(例如，作出一系列的其中野生型氨基酸被缬氨酸替代的突变以保护多肽免遭消化)。各突变可单独使用或以任何组合使用以提供本发明实施例的多肽。
使用BLAST和PSI-BLAST在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的非冗余数据库(nr)中通过相似性搜索识别出了同源序列。该同源蛋白由主要来自苏云金杆菌的Cry毒素构成。
作为额外的或备选的蛋白酶敏感位点的突变可对若干类蛋白酶敏感，如丝氨酸蛋白酶(其包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)或诸如弹性蛋白酶之类的酶。因此，可设计作为额外的或备选的蛋白酶敏感位点的突变，使得该位点容易被一系列蛋白酶如哺乳动物蛋白酶或昆虫蛋白酶识别和/或切割。也可将蛋白酶敏感位点设计成被已知在某种生物体中产生的特定类别的酶或者特定的酶切割，例如玉米穗虫(Heliothis zea)产生的胰凝乳蛋白酶(Lenz et al.(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212)(Lenz等人，1991年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第16卷，第201-212页)。突变也可赋予对蛋白水解消化的抗性，例如对胰凝乳蛋白酶在该肽C末端的消化的抗性。
在本发明实施例的核酸所编码的多肽的氨基酸序列中存在额外和/或备选的蛋白酶敏感位点，可改善该所编码的多肽的杀虫活性和/或特异性。因此，可将本发明实施例的核苷酸序列进行重组工程改造或操纵，以产生与未经修饰的野生型毒素相比具有改善的或变更的杀昆虫活性和/或特异性的多肽。另外，本文所公开的突变可被设置进其他核苷酸序列或者与其他核苷酸序列联用以提供改善的性质。例如，可将容易被昆虫胰凝乳蛋白酶(例如披肩粘虫或者玉米穗虫中存在的胰凝乳蛋白酶)切割的蛋白酶敏感位点(Hegedus etal.(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47(Hegedus等人，2003年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第53卷，第30-47页)；和Lenz et al.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16：201-212(Lenz等人，1991年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第16卷，第201-212页))置入Cry背景序列，以提供对该序列的改进的毒性。这样，本发明实施例提供具有改善性质的毒性多肽。
例如，经诱变的Cry核苷酸序列可构成包括额外密码子的额外突变体，所述额外密码子将第二胰蛋白酶敏感氨基酸序列(天然胰蛋白酶位点之外的)引入到所编码的多肽中。本发明实施例的备选的添加突变体包括这样的额外密码子，其被设计用来将至少一个额外的不同蛋白酶敏感位点引入进多肽中，例如紧邻天然胰蛋白酶位点的5′或3′的胰凝乳蛋白酶敏感位点。作为另一种选择，可产生置换突变体，其中该核酸的编码天然蛋白酶敏感位点的至少一个密码子被破坏，而备选的密码子被引入进该核酸序列中以提供一种不同的(例如置换的)蛋白酶敏感位点。也可将取代突变体添加给Cry序列，其中所编码多肽中存在的天然胰蛋白酶切割位点被破坏而在它的位置引入胰凝乳蛋白酶或者弹性蛋白酶切割位点。
已认识到，可使用任何编码作为蛋白水解位点或推定的蛋白水解位点的氨基酸序列(例如诸如NGSR、RR或者LKM之类的序列)的核苷酸序列，并且用来将任何这些切割位点引入进变体多肽中的密码子的确切种类可根据在特定植物物种中的使用(即表达)而变。还认识到，可将任何所公开的突变引入到本发明实施例的任何下述多核苷酸序列中，所述多核苷酸序列包括提供作为修饰靶标的天然胰蛋白酶切割位点的氨基酸残基的密码子。因此，可将全长毒素或其片段的变体修饰成含有额外的或备选的切割位点，并且这些实施例旨在被本文所公开的实施例的范围所涵盖。
本领域技术人员将会认识到，可向本发明实施例的序列加入任何有用的突变，只要所编码的多肽保持杀虫活性。因此，还可将序列进行突变，使得所编码的多肽对胰凝乳蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。可以以任何组合在特定位置加入不止一个识别位点，并且可以给该毒素添加多个识别位点或从该毒素移除多个识别位点。因此，额外的突变可包括三个、四个或更多个识别位点。应认识到，可在任何合适的多核苷酸序列中工程构建出多个突变；因此，全长序列或其片段都可被修饰成含有额外的或备选的切割位点以及被修饰成能抵抗蛋白水解消化。这样，本发明实施例提供含有能改善杀虫活性的突变的Cry毒素，以及用于使用其他Bt毒素影响害虫的改善的组合物和方法。
突变可保护多肽免遭蛋白酶降解，例如通过从不同区域移除推定的蛋白水解位点(如推定的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点)来保护。可移除或变更这些推定位点中的一些或全部，使得在原始位点位置处的蛋白水解降低。可通过将突变多肽与野生型毒素进行比较，或通过将在它们的氨基酸序列中有差异的各个突变毒素进行比较，来评估蛋白水解的变化。推定的蛋白水解位点和蛋白水解位点包括但不限于以下序列：RR，胰蛋白酶切割位点；LKM，胰凝乳蛋白酶切割位点；和胰蛋白酶位点。这些位点可通过添加或缺失任何数目和种类的氨基酸残基进行变更，只要多肽的杀虫活性得以提高。因而，由包括突变的核苷酸序列所编码的多肽相对于天然或背景序列，将包括至少一个氨基酸变化或添加，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270或280个或更多个氨基酸变化或添加。也可通过截短天然的或全长的序列来改善多肽的杀虫活性，如本领域已知的。
本发明实施例的组合物包括编码杀虫多肽的核酸及其片段和变体。具体而言，本发明实施例提供包括编码在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列的核苷酸序列的分离核酸分子，或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中示出的核苷酸序列，以及它们的片段和变体。
具体而言，本发明实施例提供编码SEQ ID NO：16中示出的氨基酸序列的分离核酸分子，或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：15中示出的核苷酸序列，以及它们的片段和变体。
还值得关注的是编码本发明实施例的杀虫蛋白的优化的核苷酸序列。本文所用的短语“优化的核苷酸序列”指经优化以在特定生物体例如植物中表达的核酸。可使用本领域已知的方法针对所关注的任何生物体制备优化的核苷酸序列。参见例如，美国专利No.7,462,760，该专利描述了编码所公开的杀虫蛋白的优化的核苷酸序列。在该例子中，核苷酸序列是这样制备的：将蛋白质的氨基酸序列进行反翻译，并改变核苷酸序列以包括玉蜀黍偏好的密码子而仍编码同一氨基酸序列。Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)对该程序作了更详细的描述。优化的核苷酸序列可用于提高杀虫蛋白在植物中的表达，所述植物为例如禾本科(Gramineae，Poaceae)的单子叶植物，例如玉蜀黍或玉米植物。
在一些实施例中，提供包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的多肽以及它们的片段和变体。
在一个实施方案中，提供包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽以及它们的片段和变体。
在一个实施方案中，提供包括SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的多肽以及它们的片段和变体。
在具体的实施例中，本发明实施例的杀虫蛋白提供全长杀昆虫多肽、全长杀昆虫多肽的片段以及从被设计用来向本发明实施例的多肽中引入特定氨基酸序列的经诱变核酸产生的变体多肽。在具体的实施例中，被引入进多肽中的氨基酸序列包括提供酶(如蛋白酶)的切割位点的序列。
本领域知道，Bt毒素的杀虫活性通常是通过在昆虫肠道中由各种蛋白酶对该肽进行切割来活化的。由于肽可能并不总是以十足的效率在昆虫肠道中被切割，因此全长毒素的片段与全长毒素本身相比可能具有增强的杀虫活性。因此，本发明实施例的多肽中的一些包括全长杀昆虫多肽的片段，并且所述多肽片段、变体和突变中的一些与衍生出它们的天然杀昆虫多肽的活性相比具有增强的杀虫活性，特别是如果该天然杀昆虫多肽在进行活性筛选之前不用蛋白酶进行体外活化的话。因此，本申请涵盖所述序列的截短版本或片段。
可将突变设置进任何背景序列中，包括这种截短的多肽，只要该多肽保持杀虫活性。本领域技术人员使用本领域已知的或本文别处描述的测定法，可容易地比较两种或更多种蛋白质的杀虫活性。应当理解，本发明实施例的多肽可通过表达本文公开的核酸来产生，或通过使用标准的分子生物学技术来产生。
已经认识到，杀虫蛋白可以是低聚体，并且在分子量、残基数目、组成肽、针对特定害虫的活性以及其他特征方面会有不同。但是，通过本文给出的方法，可分离和表征对多种害虫具有活性的蛋白质。本发明实施例的杀虫蛋白可与其他Bt毒素或其他杀昆虫蛋白组合使用，以增加昆虫靶标范围。此外，本发明实施例的杀虫蛋白与其他Bt毒素或具有独特性质的其他杀昆虫原理组合使用，对于防止和/或管理昆虫抗性具有特别的实用性。其他杀昆虫剂包括蛋白酶抑制剂(丝氨酸类型和半胱氨酸类型二者)、α-淀粉酶和过氧化物酶。
核苷酸和氨基酸序列以及它们所编码的多肽的片段和变体也被本发明实施例涵盖。本文所用的术语“片段”指本发明实施例的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码保持天然的或相应的全长蛋白质的生物活性从而具有杀虫活性的蛋白质片段。因此，可公认本发明实施例的多核苷酸和氨基酸序列中的一些可正确地称为片段和突变体二者。
应当理解，术语“片段”在用于指本发明实施例的核酸序列时，也涵盖可用作杂交探针的序列。这类核苷酸序列通常不编码保持生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段长度可为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸并且最多至编码本发明实施例的蛋白质的全长核苷酸序列。
编码本发明实施例的杀虫蛋白的生物活性部分的本发明实施例的核苷酸序列的片段，将编码至少15、25、30、50、100、200、250或者300个连续氨基酸或者直至本发明实施例的杀虫多肽中存在的氨基酸的总数(例如对于SEQ ID NO：2为739个氨基酸)。因此，应当理解，本发明实施例还涵盖这样的多肽，其为本发明实施例的示例性杀虫蛋白的片段，且长度为至少15、25、30、50、100、200、250或300个连续氨基酸，或者最多至本发明实施例的杀虫多肽中存在的氨基酸总数(例如对于SEQ ID NO：2为739个氨基酸)。本发明实施例的核苷酸序列的可用作杂交探针或PCR引物的片段，通常不需要编码杀虫蛋白的生物活性部分。因此，本发明实施例的核酸的片段可编码杀虫蛋白的生物活性部分，或者它可以是可采用本文公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。杀虫蛋白的生物活性部分可如下制备：分离本发明实施例的核苷酸序列其中之一的一部分，表达杀虫蛋白的编码部分(例如通过体外重组表达)，并评估杀虫蛋白的该编码部分的活性。
为本发明实施例的核苷酸序列的片段的核酸，包括至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、850、900或950个核苷酸或者直至本文公开的核苷酸序列中存在的核苷酸的数目(例如对于SEQ ID NO：1为2220个核苷酸)。特定的实施例设想衍生自(例如产生自)本发明实施例的第一核酸的片段，其中该片段编码具有杀虫活性的截短毒素。由本发明实施例的多核苷酸片段编码的截短多肽具有这样的杀虫活性：该杀虫活性相对于衍生该片段的第一核酸所编码的相应全长多肽的活性相当或得到改善。可预想本发明实施例的这种核酸片段可在天然的或相应的全长编码序列的3′末端截短。核酸片段也可同时在天然或相应的全长编码序列的5′和3′末端截短。
术语“变体”在本文中用来指实质上相似的序列。对于核苷酸序列而言，保守变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码本发明实施例的杀虫多肽其中之一的氨基酸序列的序列。本领域普通技术人员将易于理解，由于遗传密码的简并性，存在大量编码本发明的核苷酸序列。表1是提供每个氨基酸的同义密码子的密码子表。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU全部都编码氨基酸精氨酸。因此，在本发明核酸中由某密码子指定为精氨酸的每个位置处，该密码子可更改为上述任何相应的密码子，而不改变所编码的多肽。应当理解，RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。
表1
如适当，可将核酸进行优化以提高其在宿主生物体中的表达。因此，如果该宿主生物体是植物，则可用植物偏好的密码子合成出合成的核酸以改进表达。有关宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell and Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。例如，尽管本发明实施例的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实是不同的(Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页))。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子的用法在Murray等人(出处同上)的表4中列出。合成植物偏好基因的方法是本领域可获得的。参见例如美国专利No.5,380,831和No.5,436,391以及Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)和Liu H et al.Mol Bio Rep37：677-684，2010(Liu H等人，《分子生物学报道》，第37卷，第677-684页，2010年)，所述专利和文献以引用方式并入本文。玉蜀黍(Zea maize)密码子使用表也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4577(可使用www前缀访问)。表2示出了玉蜀黍最佳密码子分析(修改自Liu H et al.Mol Bio Rep 37：677-684，2010(Liu H等人，《分子生物学报道》，第37卷，第677-684页，2010年))。
表2
使用卡方列联检验来比较密码子使用以甄别最佳密码子。出现明显更频繁(P\0.01)的密码子用星号指示。
大豆(Glycine max)密码子使用表在表3中示出并且也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N(可使用www前缀访问)。
表3
技术人员还将理解，可通过核酸序列的突变引入变化，从而引起所编码的多肽的氨基酸序列的变化，而不改变蛋白的生物活性。因此，可通过将一个或多个核苷酸置换、添加和/或缺失引入本文所公开的相应核酸序列中来形成变体核酸分子，使得一个或多个氨基酸置换、添加或缺失被引入所编码的蛋白中。可通过标准技术，比如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。此类变体核酸序列也被本发明涵盖。
诸如这些的天然等位基因变体可用公知的分子生物学技术(例如本文述及的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)进行识别。
在一些实施例中，编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的多肽的多核苷酸是非基因组核酸序列。
在一些实施例中，编码SEQ ID NO：16的多肽的多核苷酸是非基因组核酸序列。
变体核苷酸序列也包括通过合成衍生的核苷酸序列，如那些例如通过使用定点诱变产生但仍编码本发明实施例的杀虫蛋白(如突变毒素)的核苷酸序列。通常，本发明实施例的特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，这通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数测定。本发明实施例的核苷酸序列的变体可与该序列相差少至1-15个核苷酸、少至1-10个如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个核苷酸。
本发明实施例的特定核苷酸序列(即示例性的核苷酸序列)的变体，也可通过比较由变体核苷酸序列编码的多肽与由参考核苷酸序列编码的多肽之间的序列同一性百分比来进行评价。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的多肽具有给定序列同一性百分数的多肽的分离核酸。任何两条多肽之间的序列同一性百分比可用本文别处描述的序列比对程序使用默认参数进行计算。在本发明实施例的任何给定的一对多核苷酸是通过比较它们编码的两条多肽所共有的序列同一性百分比来进行评价的情况中，这两条所编码的多肽之间的序列同一性百分比为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％，通常至少约75％、80％、85％，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，或者至少约98％、99％或更高的序列同一性。
本文所用的术语“变体蛋白质”涵盖通过以下方式源自天然蛋白质的多肽：对天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(所谓截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸。因此，术语“变体蛋白”涵盖天然蛋白质的下述生物活性片段：该生物活性片段包括足够数量的连续氨基酸残基以保持天然蛋白质的生物活性，即具有杀虫活性。这种杀虫活性相对于天然蛋白质可以是不同的或改善的，或者其可以是未改变的，只要杀虫活性得以保持即刻。
本发明实施例所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性，即本文所述的杀虫活性。这类变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。本发明实施例的天然杀虫蛋白的生物活性变体将与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，这通过用本文别处描述的序列比对程序使用默认参数测定。本发明实施例的蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，杀昆虫多肽与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些实施例中，该多肽具有改变的物理性质。如本文所用，术语“物理性质”是指适用于描述蛋白的物理化学特性的任何参数。如本文所用，“所关注的物理性质”和“所关注的性质”可互换使用，是指正研究和/或修饰的蛋白的物理性质。物理性质的例子包括但不限于蛋白表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水性密度、表面可电离基团的总数、表面张力、蛋白大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容和第二维里系数。物理性质的例子还包括但不限于溶解度、折叠性、稳定性和消化性。在一些实施例中，该多肽增强了蛋白水解片段在昆虫肠道中的消化性。由模拟胃液来消化的模型是本领域技术人员已知的(Fuchs，R.L.and J.D.Astwood.FoodTechnology50：83-88，1996(Fuchs，R.L.和J.D.Astwood，《食品技术》，第50卷，第83-88页，1996年)；Astwood，J.D.，et al Nature Biotechnology 14：1269-1273，1996(Astwood，J.D.等人，《自然生物技术》，第14卷，第1269-1273页，1996年)；Fu TJ et al J.Agric FoodChem.50：7154-7160，2002(Fu TJ等人，《农业食品化学杂志》，第50卷，第7154-7160页，2002年))。
本发明实施例还涵盖转化有至少一条本发明实施例的核酸、转化有包括该核酸的表达盒或转化有包括该表达盒的载体的微生物。在一些实施例中，该微生物是在植物上繁殖的微生物。本发明的一个实施例涉及封装的(encapsulated)杀虫蛋白，该封装的杀虫蛋白包括能够表达至少一种本发明实施例的杀虫蛋白的转化微生物。
本发明实施例提供包括本发明实施例的转化微生物的杀虫组合物。在这种实施例中，转化微生物通常以杀虫有效量与合适的载体一起存在于杀虫组合物中。本发明实施例还涵盖这样的杀虫组合物，其以杀昆虫有效量单独包括分离的本发明实施例的蛋白质或包括分离的本发明实施例的蛋白质与本发明实施例的转化微生物和/或本发明实施例的封装杀虫蛋白的组合，以及包括合适的载体。
本发明实施例还提供通过使用本发明实施例的杀虫蛋白与至少一种其他或“第二”杀虫蛋白的组合来增加昆虫靶标范围的方法。本领域已知的任何杀虫蛋白都可采用于本发明实施例的方法中。这种杀虫蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶和过氧化物酶。
本发明实施例还涵盖包括至少一种本发明实施例的核苷酸序列的转化植物或转基因植物。在一些实施例中，该植物稳定转化有这样的核苷酸构建体：该构建体包括与能驱动在植物细胞中的表达的启动子可操作性连接的至少一种本发明实施例的核苷酸序列。如本文所用，术语“转化植物”和“转基因植物”是指在其基因组中包括异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因植物或转化植物的基因组中，使得该多核苷酸被传递到后续各代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。
应理解，如本文所用的术语“转基因”包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初以此方式变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)变更。
本文所用的术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞和它们的后代。转基因植物的部分落入本发明实施例的范围内，包括例如植物细胞、植物原生质体、可从中再生出植株的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块(clump)、以及在植物或诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、果壳、秆、根、根尖、花粉囊等的植物部分中完整的植物细胞，它们起源于之前转化有本发明实施例的DNA分子的转基因植物或其后代并因此至少部分地由转基因细胞组成。可用于本发明实施例的方法中的植物的类别通常与适于转化技术的高等植物的类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物在内。
虽然本发明实施例并不依赖于特定的生物机制来提高植物对植物害虫的抗性，但本发明实施例的核苷酸序列在植物中的表达可导致本发明实施例的杀虫蛋白的产生和植物对植物害虫的抗性的提高。本发明实施例的植物可在农业中在用于影响昆虫害虫的方法中使用。某些实施例提供可在用于影响植物的昆虫害虫(如鳞翅目害虫)的方法中使用的转化作物(例如玉蜀黍植物)。
“受试植物或植物细胞”是其中已针对所关注基因实现了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包括该变更的植物或植物细胞。“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参照点。
对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即与用于进行遗传变更得到受试植物或细胞的原始材料有相同的基因型；(b)与原始材料有相同的基因型、但已转化了无效(null)构建体(即转化了对目的性状已知没有作用的构建体，如包括标志物基因的构建体)的植物或植物细胞；(c)属受试植物或植物细胞的后代中非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同、但不被暴露于会诱导目的基因的表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。
本领域技术人员会容易认识到，分子生物学领域的进展如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链反应方法和蛋白质工程技术，可提供适用于对具有农业意义的蛋白质的氨基酸序列和相应遗传序列二者进行变更或工程改造的广泛工具和方案集合。
因此，本发明实施例的蛋白质可通过各种方式(包括氨基酸置换、缺失、截短和插入)进行变更。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，可通过向合成的核酸(例如DNA分子)中引入突变来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。诱变和核酸变更的方法是本领域公知的。例如，可使用寡核苷酸介导的定点诱变技术来引入所设计的变化。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker andGaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》，麦克米兰出版公司，纽约)，以及其中引用的参考文献。
可对本发明实施例的经诱变的核苷酸序列进行修饰，以改变所编码的多肽的一级序列中存在的约1、2、3、4、5、6、8、10、12个或更多个氨基酸。作为另一种选择，可对天然序列引入甚至更多的变化，使得所编码的蛋白质与相应的野生型蛋白质相比可具有至少约1％或2％、或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、或甚至约13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％、21％、22％、23％、24％或25％、30％、35％或40％或更多的密码子被变更或以别的方式被修饰。以同样的方式，所编码的蛋白质与相应的野生型蛋白质相比可具有至少约1％或2％或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、或甚至约13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％、21％、22％、23％、24％、或25％、30％、35％、或40％或更多的额外的密码子。应理解，本发明实施例的经诱变的核苷酸序列旨在涵盖具有杀虫活性(例如通过对欧洲玉米螟幼虫的拒食性质所确定的改善的杀虫活性)的生物功能性等同肽，这种序列可由于已知在核酸序列以及因而其所编码的蛋白质内天然出现的密码子冗余性和功能等同性而产生。
本领域技术人员会认识到，氨基酸添加和/或置换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对形似性，如它们的疏水性、电荷、大小等。考虑了前述各种特性的示例性氨基酸置换组是本领域技术人员公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
有关不会影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导可在以下文献所述的模型中找到：Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)(Dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和结构图表集》(美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区))，将该文献以引用方式并入本文。可作出保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换。
因此，本发明实施例的基因和核苷酸序列包括天然序列和突变形式二者。同样，本发明实施例的蛋白质涵盖天然蛋白质和变型形式(例如截短多肽)及其修饰(例如突变)形式。这种变体将继续具有所需的杀虫活性。显然，要在编码该变体的核苷酸序列中作出的突变必须不将该序列置于阅读框外，并且通常不会生成可能会产生二级mRNA结构的互补区。参见EP专利申请公开No.75,444。
不期望本文所涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和置换会造成该蛋白质特性的根本变化。然而，当在进行置换、缺失或插入之前难以预测置换、缺失或插入的确切效应时，本领域技术人员会知道将通过常规的筛选测定法(如昆虫取食测定法)来评价该效应。参见例如Marrone et al.(1985)J.Econ.Entomol.78：290-293(Marrone等人，1985年，《经济昆虫学杂志》，第78卷，第290-293页)和Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485(Czapla和Lang，1990年，《经济昆虫学杂志》，第83卷，第2480-2485页)，将这两篇文献以引用方式并入本文。
变体核苷酸序列和蛋白质还涵盖衍生自诱变和引起重组的程序(如DNA改组)的序列和蛋白质。用这种程序，可操纵一个或多个不同的编码序列以产生具有所需性质的新的杀虫蛋白。以此方式，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包括具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用该方法，可将本发明实施例的核苷酸序列的全长编码序列、编码所关注结构域的序列基序或者任何片段在本发明实施例的核苷酸序列与其他已知Cry核苷酸序列的相应部分之间进行改组(shuffle)，以获得编码具有改善的所关注性质的蛋白质的新基因。
目的性质包括但不限于每单位杀虫蛋白的杀虫活性、蛋白稳定性以及对非靶标物种特别是人类、牲畜和表达本发明实施例的杀虫多肽的植物和微生物的毒性。本发明实施例不受具体的改组策略的局限，只要至少一种本发明实施例的核苷酸序列或其部分涉及这个改组策略。改组可仅涉及本文公开的核苷酸序列，或者可另外涉及本领域已知的其他核苷酸序列的改组。DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)；Stemmer(1994)Nature 370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页)；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336-347页)；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Crameri et al.(1998)Nature 391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)；美国专利No.5,605,793和No.5,837,458。
本发明实施例的核苷酸序列也可用于从其他生物体，特别是其他细菌，更特别是其他芽孢杆菌属菌株分离相应的序列。以此方式，诸如PCR、杂交等之类的方法可以用来基于这类序列与本文所述序列的序列同源性来识别这类序列。本发明实施例涵盖了基于其序列与本文所述的完整序列或其片段的序列同一性而选择的序列。这类序列包括为所公开的序列的直系同源物的序列。术语“直系同源物”指衍生自共同祖先基因并且由于物种形成而存在于不同物种中的基因。当其核苷酸序列和/或其所编码的蛋白质序列如本文其他地方所定义的那样具有实质性的同一性时，存在于不同物种中的基因被认为是直系同源物。直系同源物的功能在各种物种中常常是高度保守的。
在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从提取自任何所关注生物体的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，并且公开于以下文献中：Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)，下文称“Sambrook”。另参见Innis et al.，eds.(1990)PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications(Academic Press，New York)(Innis等人编辑，1990年，《PCR方案：方法和应用指南》，学术出版社，纽约)；Innis and Gelfand，eds.(1995)PCRStrategies(Academic Press，New York)(Innis和Gelfand编辑，1995年，《PCR策略》，学术出版社，纽约)；以及Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(AcademicPress，New York)(Innis和Gelfand编辑，1999年，《PCR方法手册》，学术出版社，纽约)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，将已知的核苷酸序列的全部或一部分用作探针，该探针与来自所选生物体的一组克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)中存在的其他对应核苷酸序列选择性杂交。该杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用可检测基团如32P或任何其他可检测标记物标记。因此，例如，杂交用探针可通过对基于本发明实施例的序列的合成寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交用探针和构建cDNA文库和基因组文库的方法是本领域公知的，在“Sambrook”中有公开。
例如，本文所公开的整个序列，或其一个或多个部分可用作能够与相应的序列和信使RNA特异性杂交的探针。为实现在各种条件下的特异性杂交，这种探针包括对本发明实施例的序列而言是独特的并且长度通常为至少约10个或20个核苷酸的序列。这种探针可用于通过PCR从选定的生物体扩增相应的Cry序列。这项技术可用于从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括对平板(plated)DNA文库(噬菌斑或菌落，参见例如Sambrook)的杂交筛选。
这类序列的杂交可以在严格条件下进行。本文所用的术语“严格条件”或“严格杂交条件”指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，比背景高至少2倍、5倍或者10倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以识别与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000或500个核苷酸。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50-55℃下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.5倍至1倍SSC中在55-60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并最后在0.1倍SSC中在60-65℃下洗涤至少约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可以包括约0.1％至约1％的SDS。杂交的持续时间通常小于约24小时，往往为约4至约12小时。
特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm(热熔点)可以根据Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的方程来估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中的鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，“％form”为杂交溶液中的甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。洗涤通常至少进行至达到平衡和获得低的杂交背景水平为止，例如2小时、1小时或30分钟。
每1％错配，Tm降低约1℃；因而，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极端严格条件可采用比Tm低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用比Tm低6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可采用比Tm低11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。
利用所述公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则可增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指南可见于Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)(Tijssen，1993年，《生物化学和分子生物学实验技术-与核酸探针的杂交》，第I部分第2章，爱思唯尔出版社，纽约)；和Ausubel et al.，eds.(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)(Ausubel等人编辑，1995年，《现代分子生物学实验手册》，第2章，格林出版与威立国际科学，纽约)。另参见“Sambrook”。因此，本发明实施例涵盖编码本发明实施例的Cry蛋白并在严格条件下与本文公开的Cry序列或与其片段杂交的分离的序列。
以下术语用来描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质同一性”。
(a)本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完全的cDNA或基因序列。
(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续的且指定的区段，其中该比较窗口中的多核苷酸序列相比于参考序列(不包括添加或缺失)可包括添加或缺失(即空位)，以便两条序列进行最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，任何两条序列之间的序列同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。这类数学算法的非限制性例子有Myers andMiller(1988)CABIOS 4：11-17(Myers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部比对算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的全局比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的搜索局部比对方法；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，872264)的算法，在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中进行了修改。
这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可得自加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，Califomia))中的CLUSTAL；GCG威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)版本10(可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys公司(Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，Califomia，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higginset al.(1988)Gene 73：237-244(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；Higgins et al.(1989)CABIOS 5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-90页)；Huang et al.(1992)CABIOS8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-65页)；和Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988年)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLAST程序基于上文的Karlin和Altschul(1990年)算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、score(得分)＝100、wordlength(字长)＝12来进行，以获得与编码本发明实施例的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTN程序、score(得分)＝50、wordlength(字长)＝3来进行，以获得与本发明实施例的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以使用如Altschul etal.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所描述采用空位BLAST(在BLAST 2.0中)。作为另外一种选择，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul et al.(1997)(Altschul等人，1997年)，出处同上。当采用BLAST、空位BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。还可以以人工方式通过检查来进行比对。
除非另有规定，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp打分矩阵，获得核苷酸序列的同一性百分数和相似性百分数；使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62打分矩阵或其任何等同程序，获得氨基酸序列的同一性百分数和相似性百分数。本文所用术语的“等同程序”指任何下述的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。
GAP利用Needleman和Wunsch(1970)(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的能使匹配数最大而使空位数最小的比对。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它使得可以提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG威斯康星遗传学软件包的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以以选自0至200的整数来表示。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示关于比对的四个价值(merit)因素：品质(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity)。品质是为了将序列进行比对而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短片段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将相应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG威斯康星遗传学软件包的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
(c)在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时这两条序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城(Mountain View，California)的Intelligenetics公司)中所执行的那样进行计算的。
(d)本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中与参考序列(不包括添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可包括添加或缺失(即空位)，以便最佳比对两个序列。通过以下方式计算所述百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
(e)(i)多核苷酸序列的“实质上相同”这个术语意指在使用所描述的比对程序之一采用标准的参数与参考序列进行比较时，多核苷酸包括具有至少70％、80％、90％或95％或更高的序列同一性的序列。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两条核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列实质上相同通常意指序列同一性为至少60％、70％、80％、90％或95％或更高的序列同一性。
核苷酸序列基本上相同的另一种指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，将严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。但是，严格条件涵盖在比Tm低约1℃至约20℃的范围内的温度，其取决于本文另外限定的所需的严格程度。在严格条件下不互相杂交的核酸，如果它们编码的多肽是实质上相同的，则它们仍是实质上相同的。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列基本上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽发生免疫交叉反应。
(e)(ii)在肽的情形中，术语“实质上相同”指肽包括下述的序列，即在指定比较窗口上该序列与参考序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性。出于这些目的的最佳比对可用Needleman和Wunsch(1970)(出处同上)的全局比对算法来进行。两条肽序列实质上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。“实质上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可能在于保守氨基酸变化。
本文中术语“核苷酸构建体”的使用无意于将本发明实施例局限于包括DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸，也可应用于本文公开的方法中。本发明实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这类构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，本发明实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖可在本发明实施例的方法中采用以转化植物的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于那些由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及它们的组合所构成的核苷酸构建体、分子和序列。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子，也包括合成的类似物。本发明实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖所有形式的核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
又一个实施例涉及转化的生物体，如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物体。该转化的生物体包括：本发明实施例的DNA分子、含所述DNA分子的表达盒或者含所述表达盒的载体，它们可稳定掺入到转化的生物体的基因组中。
本发明实施例的序列在DNA构建体中提供以用于在所关注生物体中表达。该构建体将包括有效连接至本发明实施例的序列的5′和3′调节序列。本文所用的术语“有效连接”指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。该构建体可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者，所述额外基因(一个或多个)可在多个DNA构建体上提供。
这种DNA构建体提供有多个限制位点，以使Cry毒素序列的插入处于调节区的转录调节之下。DNA构建体可另外含有选择性标记基因。
该DNA构建体在5′至3′转录方向上将包括：转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明实施例的DNA序列、在充当宿主的生物体中具有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。所述转录起始区(即启动子)相对于宿主生物体和/或相对于本发明实施例的序列可以是天然的、类似的、外来的或者异源的。另外，该启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。如本文所用的术语“外来的”表示启动子在引入该启动子的天然生物体中不存在。如果启动子相对于本发明实施例的序列是“外来的”或者“异源的”，则意指该启动子不是所有效连接的本发明实施例的序列的天然或自然存在的启动子。本文所用的嵌合基因包括与转录起始区可操作连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。如果启动子是天然或自然的序列，则所有效连接的序列的表达相比野生型表达被变更，这导致表型变更。
终止区可以是对于转录起始区而言是天然的，可以对于有效连接的所关注DNA序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自另一来源(即对于该启动子、所关注的序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的)。
易得的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，比如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon etal.(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因与发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；和Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。
如适当，可将核酸进行优化以提高其在宿主生物体中的表达。因此，如果该宿主生物体是植物，则可用植物偏好的密码子合成出合成的核酸以改进表达。有关宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。例如，尽管本发明实施例的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实是不同的(Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。合成植物偏好基因的方法是本领域可获得的。参见例如美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.18：455-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第18卷，第455-498页)，这些专利和文献以引用方式并入本文。
已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。如本文所用的术语“宿主细胞”指含有载体并支持预期表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞，或者单子叶或者双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个例子是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene 165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature 353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling et al.(1987)Nature 325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie etal.(1989)in Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑，(Liss，纽约)，第237-256页))；和玉蜀黍枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81：382-385)(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。另参见Della-Cioppa et al.(1987)PlantPhysiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。
在制备表达盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和颠换)。
有多种启动子可用于本发明实施例的实施。可根据期望的结果来选择启动子。可将核酸与组成型启动子、组织偏好型启动子、诱导型启动子或其他启动子进行组合，以在宿主生物体中表达。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO 99/43838和美国专利No.6,072,050中所公开的Rsyn7启动子的核心启动子及其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；遍在蛋白(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149；No.5,608,144；No.5,604,121；No.5,569,597；No.5,466,785；No.5,399,680；No.5,268,463；No.5,608,142；和No.6,177,611中所讨论的。
取决于所需的结果，从诱导型启动子表达基因可能是有利的。对于调节本发明实施例的核苷酸序列在植物中的表达特别有意义的是损伤诱导启动子。这种损伤诱导启动子可响应昆虫取食所引起的损害，包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449(Ryan，1990年，《植物病理学年度评论》，第28卷，第425-449页))；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology 14：494-498(Duan等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第494-498页))；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208(Stanford等人，1989年，《分子遗传学与普通遗传学》，第215卷，第200-208页))；系统素(McGurl et al.(1992)Science 225：1570-1573(McGurl等人，1992年，《科学》，第225卷，第1570-1573页))；WIP1(Rohmeier etal.(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792(Rohmeier等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第783-792页)；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323：73-76(Eckelkamp等人，1993年，《欧洲生化学会联合会快报》，第323卷，第73-76页))；MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J.6(2)：141-150)(Corderok等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第2期，第141-150页))等等，这些文献以引用方式并入本文。
另外，病原体诱导启动子可在本发明实施例的方法和核苷酸构建体中使用。这种病原体诱导型启动子包括那些来自致病相关蛋白(PR蛋白)的在病原体感染后被诱导的启动子；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等等。参见例如Redolfi et al.(1983)J.Plant Pathol.89：245-254(Redolfi等人，1983年，《植物病理学杂志》，第89卷，第245-254页)；Uknes et al.(1992)Plant Cell 4：645-656(Uknes等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第645-656页)；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116(Van Loon，1985年，《植物分子病毒学》，第4卷，第111-116页)。还可参见WO 99/43819，该专利以引用的方式并入本文。
在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见例如Marineau etal.(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342(Marineau等人，1987年，《植物分子生物学》，第9卷，第335-342页)；Matton et al.(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331(Matton等人，1989年，《分子植物-微生物相互作用》，第2卷，第325-331页)；Somsischet al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430(Somsisch等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第2427-2430页)；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98(Somsisch等人，1988年，《分子遗传学与普通遗传学》，第2卷，第93-98页)；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977(Yang等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第14972-14977页)。另参见Chen et al.(1996)Plant J.10：955-966(Chen等人，1996年，《植物杂志》，第10卷，第955-966页)；Zhang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2507-2511(Zhang等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2507-2511页)；Warner et al.(1993)Plant J.3：191-201(Warner等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第191-201页)；Siebertz et al.(1989)Plant Cell 1：961-968(Siebertz等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第961-968页)；美国专利No.5,750,386(线虫可诱导的)；以及其中引用的参考文献。特别值得关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见例如Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.PlantPath.41：189-200(Cordero等人，1992年，《生理与分子植物病理学》，第41卷，第189-200页)。
可通过施加外源化学调节剂将化学调节启动子用于调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作前突生除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他值得关注的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子(参见例如，糖皮质类固醇诱导型启动子，载于Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)和McNellis etal.(1998)Plant J.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页))以及四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见例如Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页)和美国专利No.5,814,618和No.5,789,156)，将所述文献和专利以引用方式并入本文。
组织偏好的启动子可用来使增强的杀虫蛋白表达靶向于特定的植物组织内。组织偏好启动子包括以下文献中讨论的那些启动子：Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamata etal.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；Van Campet al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto etal.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196(Lam，1994年，《细胞分化的结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对此类启动子进行修饰，以便弱化表达。
叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kwon etal.(1994)Plant Physiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-67页)；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Gotor et al.(1993)Plant J.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-18页)；Orozco et al.(1993)PlantMol.Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；和Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)。
根偏好启动子或者根特异性启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从各种相容的物种从头(de novo)分离。参见例如Hire et al.(1992)PlantMol.Biol.20(2)：207-218(Hire等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第2期，第207-218页)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller and Baumgartner(1991)Plant Cell3(10)：1051-1061(Keller和Baumgartner，1991年，《植物细胞》，第3卷，第10期，第1051-1061页)(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger et al.(1990)PlantMol.Biol.14(3)：433-443(Sanger等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第3期，第433-443页)(根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao et al.(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(Miao等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第1期，第11-22页)(编码细胞溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。另参见Bogusz et al.(1990)Plant Cell 2(7)：633-641(Bogusz等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第7期，第633-641页)，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(Trematomentosa)的血红蛋白基因分离的两种根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入进非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析结果(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76(《植物科学》，Limerick，第79卷，第1期，第69-76页))。他们得出结论认为，增强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合证实，编码章鱼碱合酶的农杆菌属(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并通过叶组织中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合(参见EMBO J.8(2)：343-350(《欧洲分子生物学组织杂志》，第8卷，第2期，第343-350页))。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster et al.(1995)PlantMol.Biol.29(4)：759-772(Kuster等人，1995年，《植物分子生物学》，第29卷，第4期，第759-772页))；和rolB启动子(Capana et al.(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691(Capana等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第4期，第681-691页))。还可参见美国专利No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,459,252、No.5,401,836、No.5,110,732和No.5,023,179。
“种子偏好的”启动子包括“种子特异性”启动子(这种启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)和“种子萌发”启动子(这种启动子在种子萌发期间活跃)。参见Thompson et al.(1989)BioEssays 10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页)，将其以引用方式并入本文。此类种子偏好的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)基因启动子；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)基因启动子；和mi1ps(肌醇-1-磷酸合酶)基因启动子(参见美国专利No.6,225,529，其以引用的方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白和Glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、g-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。另参见WO 00/12733，其中公开了来自endl和end2基因的种子偏好启动子；该专利以引用方式并入本文。在特定组织中具有“偏好”表达的启动子在该组织中表达的程度高于在至少一种其他植物组织中表达的程度。一些组织偏好启动子几乎专门在特定组织中表达。
如果需要低水平表达，则要使用弱启动子。一般来讲，如本文所用的术语“弱启动子”指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平表达”意指处于约1/1000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。作为另一种选择，认识到术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中而不在其他细胞中驱动表达从而造成总表达水平较低的启动子。如启动子驱动不可接受的高水平表达，则可缺失或者修饰启动子序列的一些部分以降低表达水平。
这种弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利No.6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149；No.5,608,144；No.5,604,121；No.5,569,597；No.5,466,785；No.5,399,680；No.5,268,463；No.5,608,142；和No.6,177,611中所公开的，其以引用的方式并入本文。
一般来讲，表达盒将包括用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。合适的选择性标记基因的另外例子包括但不限于：编码对以下抗生素的抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella et al.(1983)EMBO J.2：987-992)(Herrera Estrella等人，1983年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第2卷，第987-992页))；甲氨蝶呤(Herrera Estrella et al.(1983)Nature 303：209-213(Herrera Estrella等人，1983年，《自然》，第303卷，第209-213页)；和Meijer et al.(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820(Meijer等人，1991年，《植物分子生物学》，第16卷，第807-820页))；链霉素(Jones et al.(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91(Jones等人，1987年，《分子遗传学与普通遗传学》，第210卷，第86-91页))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard et al.(1996)Transgenic Res.5：131-137(Bretagne-Sagnard等人，1996年，《转基因研究》，第5卷，第131-137页))；博来霉素(Hille et al.(1990)PlantMol.Biol.7：171-176(Hille等人，1990年，《植物分子生物学》，第7卷，第171-176页))；磺酰胺(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136(Guerineau等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第127-136页))；溴苯腈(Stalker et al.(1988)Science 242：419-423(Stalker等人，1988年，《科学》，第242卷，第419-423页))；草甘膦(Shaw et al.(1986)Science 233：478-481(Shaw等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页)；以及美国专利No.7,709,702和No.7,462,481)；膦丝菌素(DeBlock et al.(1987)EMBO J.6：2513-2518(DeBlock等人，1987年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第6卷，第2513-2518页))。主要参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新观点》，第3卷，第506-511页)；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yaoet al.(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Hu et al.(1987)Cell 48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown et al.(1987)Cell 49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge et al.(1988)Cell 52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404(Dauschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle et al.(1990)Science 248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Gossen，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Reines etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborskiet al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子结构生物学主题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolbet al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂与化学疗法》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂与化学疗法》，第36卷，第913-919页)；Hlavka et al.(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，施普林格出版社，柏林)；和Gill et al.(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容以引用的方式并入本文。
以上选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因都可用于本发明实施例。
本发明实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入到植物中。“引入”意在指以多核苷酸或者多肽序列进入植物细胞内部的方式将多核苷酸或者多肽呈送到植物。本发明实施例的方法不依赖于将多核苷酸或多肽引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。
“稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可以根据转化所靶向的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)变化。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法包括：微量注射法(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔法(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))、农杆菌介导的转化(美国专利No.5,563,055和No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见例如，美国专利No.4,945,050；No.5,879,918；No.5,886,244和No.5,932,782；Tomes et al.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基础方法》，Gamborg和Phillips编辑，柏林斯普林格出版社)；及McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))；和Lecl转化(WO 00/28058)。关于马铃薯转化，参见Tu et al.(1998)Plant Molecular Biology 37：829-838(Tu等人，1998年，《植物分子生物学》，第37卷，第829-838页)和Chong et al.(2000)Transgenic Research 9：71-78(Chong等人，2000年，《转基因研究》，第9卷，第71-78页)。另外的转化程序可见于Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页)；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou et al.(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论与应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉米)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm et al.(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-VanSlogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，《(胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，纽约朗文出版社，第197-209页)(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler etal.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)和Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda et al.(1996)NatureBiotechnology 14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)；全部上述文献以引用的方式并入本文。
在具体的实施例中，本发明实施例的序列可用多种瞬时转化方法提供给植物。这类瞬时转化方法包括但不限于直接向植物中引入Cry毒素蛋白或其变体和片段，或者向植物中引入Cry毒素转录物。这类方法包括(例如)显微注射法或粒子轰击法。参见例如Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学与普通遗传学》，第202卷，第179-185页)；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)以及Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有这些文献以引用方式并入本文。作为另一种选择，可使用本领域已知的技术将Cry毒素多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括利用病毒载体系统，和将多核苷酸以避免DNA随后释放的方式沉淀。因此，从粒子结合的DNA可发生转录，但其释放出来而整合进基因组中的频率则大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)的粒子。
用于在植物基因组中特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，在期望的基因组位置插入多核苷酸是使用位点特异性重组系统实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，这些专利全部以引用方式并入本文。简而言之，可将本发明实施例的多核苷酸包括在转移盒中，该转移盒旁侧是两个不相同的重组位点。将转移盒引入植物中，该植物基因组中稳定掺入有靶位点，其中所述靶位点旁侧是两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提供适当的重组酶，将转移盒整合在该靶标位点处。目的多核苷酸因此被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可栽培这些植株并用同一转化株系或不同的株系进行授粉，并识别出具有所需表型特征的组成型或者诱导型表达的所得杂交种。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。
本发明实施例的核苷酸序列可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而提供给植物。通常，这种方法涉及将所关注的核苷酸构建体掺入于病毒DNA或RNA分子内。认识到，本发明实施例的重组蛋白可最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的杀虫蛋白。还认识到，这种包括本发明实施例的杀虫蛋白的氨基酸序列的至少一部分的病毒聚蛋白可具有所需的杀虫活性。这种病毒聚蛋白及其编码核苷酸序列为本发明实施例所涵盖。给植物提供核苷酸构建体并在植物中产生所编码的蛋白质的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本领域已知的。参见例如，美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367和No.5,316,931；将这些专利以引用方式并入本文。
本发明实施例还涉及本发明实施例的转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶、以及根和苗的插条。
所述实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharumspp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属(Cucumis)的成员比如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron)物种)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水仙(水仙属(Narcissus)物种)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。可用于实施本发明实施例的针叶树类包括例如松树，如火炬松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和蒙特利松(Pinus radiata)；黄杉(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(true firs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abiesbalsamea)；和雪松如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。本发明实施例的植物包括作物植物，它们包括但不限于：玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属(Brassica spp.)、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、小米、烟草、甘蔗等。
草坪草包括但不限于：一年生早熟禾(Poa annua)；一年生黑麦草(Loliummultiflorum)；加拿大早熟禾(Poa compressa)；紫羊茅(Festuca rubra)；细弱翦股颖(Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(Agrostis palustris)；光穗冰草(Agropyrondesertorum)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；硬羊茅(Festuca longifolia)；草地早熟禾(Poa pratensis)；果园草(Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(Lolium perenne)；红狐茅(Festuca rubra)；红顶草(Agrostis alba)；粗茎早熟禾(Poa trivialis)；羊茅(Festuca ovina)；无芒雀麦草(Bromus inermis)；高羊茅(Festuca arundinacea)；梯牧草(Phleum pratense)；绒毛翦股颖(Agrostis canina)；碱茅草(Puccinellia distans)；蓝茎冰草(Agropyron smithii)；百慕大草(Cynodon spp.)；圣奥古斯丁草(Stenotaphrumsecundatum)；结缕草(Zoysia spp.)；百喜草(Paspalum notatum)；地毯草(Axonopusaffinis)；百足草(Eremochloa ophiuroides)；狼尾草(Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(Paspalum vaginatum)；蓝格兰马草(Bouteloua gracilis)；野牛草(Buchloedactyloids)；垂穗草(Bouteloua curtipendula)。
所关注的植物包括谷物植物(提供所关注的种子)、油籽植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦、粟等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
在某些实施例中，本发明实施例的核酸序列可与所关注的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠(stack)，以产生具有所需表型的植物。例如，本发明实施例的多核苷酸可与任何其他编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的多核苷酸进行堆叠，所述多肽为例如其他Bt毒性蛋白(描述于美国专利No.5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiser et al.(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页)，pentin(描述于美国专利No.5,981,722)等。所产生的组合还可包括所关注的多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。本发明实施例的多核苷酸也可与任何其他基因或者基因组合进行堆叠，以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于动物饲料所需的性状如高油基因(例如美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionin类(美国专利No.5,990,389；No.5,885,801；No.5,885,802和No.5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)；和WO 98/20122)；以及高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)；以及Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))；增加的消化性(例如经修饰的贮藏蛋白(美国专利6,858,778)；和硫氧还蛋白(美国专利7,009,087)，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。
本发明实施例的多核苷酸也可与疾病或者杀虫剂抗性所需的性状进行堆叠(例如伏马毒素脱毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒基因和抗病基因(Jones et al.(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin et al.(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；以及Mindrinos etal.(1994)Cell 78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂，例如草胺膦或basta(例如bar基因)；以及草甘膦抗性(如公开于美国专利No.7,709,702和No.7,462,481的EPSPS基因和GAT基因)；以及处理或加工产品所需的性状如高油(例如美国专利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5.602.321；β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰基辅酶A还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用方式并入本文。还可将本发明实施例的多核苷酸与提供诸如雄性不育(如，参见美国专利No.5.583，210)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或诸如细胞周期调节或基因靶向(如，WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。
在一些实施例中，堆叠的性状可为已取得监管批准的性状或事件，包括但不限于表4A-1F中的事件。
表4A Glycine max I.大豆
表4A续表Glycine max L.大豆
表4B Triticum aestivum小麦
表4B，续表Triticum aestivum小麦
表4C Zea mays L.玉蜀黍
表4C续表Zea mays L.玉蜀黍
表4C续表Zea mays L.玉蜀黍
表4C续表Zea mays L.玉蜀黍
表4C续表Zea mays L.玉蜀黍
表4C续表Zea mays L.玉蜀黍
表4D Oryza sativa水稻
表4E Helianthus annuus向日葵
表4F Medicago sativa苜蓿
其他监管批准的事件是本领域技术人员熟知的并且可见于环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，可使用www前缀对其进行访问)和国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications)(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，可使用www前缀对其进行访问)。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交方法或遗传转化来对植物进行杂交育种。如果性状是通过遗传转化植株来堆叠，则目的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，以通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化方案将性状与所关注多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包括在单独的转化盒中(反式)或包括在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况下，期望引入会抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到，可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，这些专利全部以引用方式并入本文。
本发明实施例的组合物可用于以多种方式保护植物、种子和植物产物。例如，所述组合物可用于涉及通过选自喷雾、喷粉、广播或者种子涂覆的程序将有效量的杀虫组合物置于害虫的环境中的方法中。
在植物繁殖材料(果实、块茎、鳞茎、球茎、谷物、种子)，但尤其是种子，作为商品出售之前，其通常用保护剂涂料进行处理，所述保护剂涂料包括除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制品中的几种的混合物，如果需要的话还进一步加上制剂领域常用的载体、表面活性剂或促施用助剂，以提供对抗细菌、真菌或动物害虫造成的损害的保护。为了处理种子，可通过如下方法将保护剂包衣涂覆至种子：用液体制剂浸渍块茎或谷粒，或用组合的湿或干制剂对种子进行涂覆。另外，在特殊的情况中，其他施用至植物的方法也是可能的，例如针对芽或果实进行的处理。
包括编码本发明实施例的杀虫蛋白的核苷酸序列的本发明实施例的植物种子，可用包括种子处理化合物的种子保护剂包衣进行处理，所述种子处理化合物例如克菌丹、萎锈灵、福美双、甲霜灵(methalaxyl)、甲基嘧啶磷以及其他常用于种子处理的化合物。在一个实施例中，包括本发明实施例的杀虫组合物的种子保护剂包衣单独使用或者与常用于种子处理的种子保护剂包衣之一组合使用。
认识到，可用编码杀虫蛋白的基因来转化昆虫病原生物体。这种生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。
可通过合适的载体将编码本发明实施例的杀虫蛋白的基因引入到微生物宿主中，并将所述宿主施放到环境或者植物或者动物。在将核酸插入细胞中的语境中的术语“引入”，意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉核酸掺入进真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入进细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转化成自主复制子或者瞬时表达(例如转染的mRNA)。
可选择已知会占领一种或者多种所关注作物的“植物圈(phytosphere)”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供表达杀虫蛋白的基因的稳定维持和表达，并且理想地提供改善的对该杀虫剂的保护使其不受环境降解和失活。
这种微生物包括细菌、藻类和真菌。特别要关注的是微生物：例如细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、农杆菌属(Agrobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)；真菌，尤其是酵母如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别值得关注的是诸如以下的植物圈细菌物种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、富营养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)，以及诸如以下的植物圈酵母物种：深红酵母(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、Kluyveromyces veronae和茁芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别要关注的是有色素微生物。
有多种方式可用来将表达杀虫蛋白的基因引入到处于容许该基因的稳定维持和表达的条件下的微生物宿主中。例如，可构建出这样的表达盒，其包括所关注的核苷酸构建体，该核苷酸构建体与用于表达该核苷酸构建体的转录和翻译调节信号有效连接，并且包括宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列(据此将发生整合)和/或在宿主中具有功能的复制系统(据此将发生整合或稳定维持)。
转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见例如美国专利No.5,039,523和No.4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook；Maniatis et al.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)(Sambrook；Maniatis等人，(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约))；Davis et al.，eds.(1980)Advanced BacterialGenetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)(Davis等人编辑，1980年，《高级细菌遗传学》，(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约))，以及其中引用的参考文献。
如果含杀虫蛋白的细胞要被进行处理以延长当将经处理的细胞施用于靶标害虫(一种或多种)的环境时杀虫蛋白在细胞中的活性，则合适的宿主细胞可包括原核生物或者真核生物，通常限于那些不会产生对高等生物体(如哺乳动物)有毒的物质的细胞。但是，如果毒素不稳定或者施用水平足够低以避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性，则可以使用会产生对高等生物体有毒的物质的生物体。作为宿主，特别要关注的将是原核生物和低等真核生物如真菌。示例性原核生物(革兰氏阴性和革兰氏阳性)包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，如根瘤菌属(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，如发光杆菌属(photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物有真菌，如藻菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括酵母如酵母菌属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；以及担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，如红酵母属(Rhodotorula)、短梗霉属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。
在为了杀虫蛋白生产目的而选择宿主细胞时特别值得关注的特征包括杀虫蛋白基因向宿主中引入的便利性、表达系统的可获得性、表达的效率、蛋白质在宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。对于作为杀虫剂微胶囊的用途所关注的特征包括杀虫剂的保护质量，如厚细胞壁、色素沉着以及包涵体的胞内包装或者形成；叶亲和力；无哺乳动物毒性；对害虫取食的吸引力；轻松杀害和固定而不会损坏毒素；等等。其他考虑因素包括配制和操作容易性、经济性、保藏稳定性等。
特别值得关注的宿主生物体包括酵母，如红酵母属(Rhodotorula spp.)物种、短梗霉属(Aureobasidium spp.)物种、酵母属(Saccharomyces spp.)物种(如酿酒酵母(S.cerevisiae))、掷孢酵母属(Sporobolomyces spp.)物种、叶面生物如假单胞菌属(Pseudomonas spp.)物种(如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluorescens))、欧文氏菌属(Erwinia spp.)物种和黄杆菌属(Flavobacterium spp.)物种和其他此类生物体，包括Bt、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
可将编码本发明实施例的杀虫蛋白的基因引入到在植物上繁殖的微生物(体表寄生菌)中，以将杀虫蛋白递送到潜在的靶标害虫。体表寄生菌例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
根定殖细菌可通过例如本领域已知的方法从所关注的植物分离。具体而言，定殖于根的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株可从植物的根分离(参见例如，Handelsmanet al.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713-718(Handelsman等人，1991年，《应用与环境微生物》，第56卷，第713-718页)。可通过本领域已知的标准方法将编码本发明实施例的杀虫蛋白的基因引入到根定殖芽孢杆菌中。
可通过电转化手段将编码杀虫蛋白的基因例如引入到根定殖芽孢杆菌中。具体而言，可将编码杀虫蛋白的基因克隆到穿梭载体如pHT3101中(Lerecius et al.(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60：211-218(Lerecius等人，1989年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第60卷，第211-218页)。含有特定杀虫蛋白基因的编码序列的穿梭载体pHT3101可例如通过电穿孔手段转化到根定殖芽孢杆菌中(Lerecius et al.(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60：211-218(Lerecius等人，1989年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第60卷，第211-218页))。
可设计表达系统，使得杀虫蛋白被分泌到革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)的细胞质之外。分泌杀虫蛋白的好处是：(1)避免所表达的杀虫蛋白的潜在细胞毒性作用；和(2)改善杀虫蛋白的纯化效率，包括但不限于提高每体积细胞培养液的蛋白质回收和纯化效率和降低每单位蛋白质的回收和纯化时间和/或成本。
可例如通过将适当的大肠杆菌信号肽与杀虫蛋白的氨基末端融合，使杀虫蛋白在大肠杆菌中分泌。大肠杆菌识别的信号肽可存在于已知在大肠杆菌中分泌的蛋白质，例如OmpA蛋白(Ghrayeb et al.(1984)EMBO J，3：2437-2442(Ghrayeb等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2437-2442页))。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白质，因此它的信号肽被认为在易位过程中有效。另外，在加工前不需要对OmpA信号肽进行修饰，而其他信号肽例如脂蛋白信号肽则需要(Duffaud et al.(1987)Meth.Enzymol.153：492(Duffaud等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第492页))。
可在细菌宿主中发酵本发明实施例的杀虫蛋白，并且将所得的细菌加工并以与Bt菌株已被用作杀昆虫喷雾剂相同的方式用作微生物喷雾剂。在杀虫蛋白(一种或多种)从芽孢杆菌分泌的情况中，用本领域已知的程序将分泌信号移除或者突变。这种突变和/或缺失能防止杀虫蛋白(一种或多种)在发酵过程中分泌到生长培养基中。杀虫蛋白保持在细胞内，然后将细胞进行加工以得到包囊的杀虫蛋白。任何合适的微生物都可用于这个目的。已用假单胞菌属将Bt毒素表达为包囊蛋白，并且将所得的细胞进行加工并作为杀虫剂喷施(Gaertner et al.(1993)，in：Advanced Engineered Pesticides，ed.Kim(Gaertner等人，1993年，载于《高级工程化杀虫剂》，Kim编辑))。
作为另一个选择，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生杀虫蛋白。异源基因的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。然后将这些细胞在当将细胞施用于靶标害虫(一种或多种)的环境时能延长该产生的毒素在细胞中的活性的条件下进行处理。所得的产物保持该毒素的毒性。然后可按照常规技术配制这些天然包囊的杀虫蛋白以便施用于靶标害虫的寄生环境，例如土壤、水和植物的叶。参见例如EP0192319以及其中引用的参考文献。
在本发明实施例中，可将转化的微生物(其包括完整生物体、细胞、孢子(一种或多种)、杀虫蛋白(一种或多种)、杀虫组分(一种或多种)、害虫影响组分(一种或多种)、突变体(一种或多种)、活的或者死的细胞和细胞组分，包括活的或者死的细胞和细胞组分的混合物在内，和包括破碎的细胞和细胞组分在内)或者分离的杀虫蛋白与可接受的载体一起配制成例如以下杀虫组合物(一种或多种)：悬浮液、溶液、乳液、撒粉、可分散颗粒或丸、可润湿粉末以及可乳化浓缩物、气溶胶或喷雾剂、浸渍颗粒、助剂、可涂覆糊、胶体还有例如在聚合物物质中的包囊物。这种配制的组合物可通过诸如将包括该多肽的细胞的培养物进行干燥、冻干、均质、提取、过滤、离心、沉淀或者浓缩的常规手段进行制备。
以上所公开的这类组合物可通过加入以下物质来获得：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外保护剂、缓冲剂、助流剂或肥料、微量营养物供体或其他能影响植物生长的制品。可将包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料的一种或多种农业化学品与常用于配制领域的载体、表面活性剂或者助剂，或其他组份进行组合，以便于产品操作和施用于特定的靶标害虫。合适的载体和辅剂可以是固体或液体，并对应于通常用于配制技术的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明实施例的活性成分通常以组合物的形式施用，并且可以施用于待处理的作物区、植物或者种子。例如，本发明实施例的组合物可以在粮仓或者青贮塔(silo)等中施用于在准备贮藏时或者在贮藏过程中的谷物。本发明实施例的组合物可以与其他化合物同时或者相继施用。施用含有至少一种通过本发明实施例的细菌菌株产生的杀虫蛋白的本发明实施例的活性成分或者本发明实施例的农业化学组合物的方法，包括但不限于叶面施用、种子涂覆和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应害虫侵染的强度。
合适的表面活性剂包括，但不限于，阴离子化合物如羧酸盐，例如金属羧酸盐；长链脂肪酸羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或者二酯或者这类酯的盐；脂肪醇硫酸盐如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化的脂肪醇硫酸盐；乙氧基化的烷基苯酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐，如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如萘磺酸丁酯；磺化萘-甲醛缩合物的盐；硫化苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐如酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或者二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯磺酸钠。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酸酯例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，这种酯类与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或者乙氧基化的炔二醇。阳离子表面活性剂的例子包括，例如脂肪族单胺、二胺或聚胺如乙酸盐、环烷酸盐或者油酸盐；或含氧胺，如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或聚胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。
惰性材料的例子包括但不限于无机矿物质如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或者植物材料如软木、粉末玉米穗轴、花生壳、稻壳和胡桃壳。
本发明实施例的组合物可以为适于直接施用的形式，或者作为初级组合物的浓缩物，在施用前需要用适量的水或者其他稀释剂稀释。杀虫浓度将随具体配方的性质而异，具体而言，取决于它是浓缩物还是直接施用。组合物含有1至98％的固体或液体惰性载体和0至50％或0.1至50％的表面活性剂。这些组合物将以商业产品的标示比率施用，例如当为干燥形式时约0.01磅至5.0磅每英亩，当为液体形式时约0.01品脱至10品脱每英亩。
在又一个实施例中，本发明实施例的组合物以及转化的微生物和杀虫蛋白可在配制前先进行处理，以延长当施用于靶标害虫的环境时的杀虫活性，只要该预处理对杀虫活性无害。这种处理可通过化学和/或物理手段进行，只要该处理不会有害地影响组合物(一种或多种)的性质。化学试剂的例子包括但不限于卤化剂；醛，如甲醛和戊二醛；抗感染剂，如氯化苯甲烃铵；醇类，如异丙醇和乙醇；以及组织固定剂，如Bouin固定剂和Helly固定剂(参见例如，Humason(1967)Animal Tissue Techniques(W.H.Freeman and Co.(Humason，1967年，《动物组织技术》，W.H.弗里曼公司))。
在其他实施例中，可能有利的是用蛋白酶例如胰蛋白酶处理Cry毒素多肽以活化该蛋白质，然后再将本发明实施例的杀虫蛋白组合物施用于靶标害虫的环境。通过丝氨酸蛋白酶活化原毒素的方法是本领域公知的。参见例如Cooksey(1968)Biochem.J.6：445-454(Cooksey，1968年，《生物化学杂志》，第6卷，第445-454页)以及Carroll and Ellar(1989)Biochem.J.261：99-105(Carroll和Ellar，1989年，《生物化学杂志》，第261卷，第99-105页)，将所述文献的教导内容以引用方式并入本文。例如，合适的活化方案包括但不限于将待活化的多肽例如纯化的新型Cry多肽(例如具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列)与胰蛋白酶以1/100的蛋白质/胰蛋白酶重量比在20nM NaHCO3，pH 8中进行组合，并将该样品在36℃下消化3小时。
组合物(包括本发明实施例的转化微生物和杀虫蛋白)可通过例如以下方式施用于昆虫害虫的环境：喷雾、雾化、撒粉、分散、涂覆或者倾倒、引入土壤中或者引到土壤上、引入灌溉水中、在害虫已开始出现时或者在害虫出现前进行种子处理或者一般施用或者散粉作为保护措施。例如，可将本发明实施例的杀虫蛋白和/或转化微生物与谷物混合以在贮藏过程中保护谷物。通常重要的是在植物生长的早期阶段获得对害虫的良好防治，因为这是植物可能受到最严重损害的时期。本发明实施例的组合物可便利地含有另一杀昆虫剂，如果认为这有必要的话。在一个实施例中，在种植时将组合物直接施用于土壤，施用的形式为载体与芽孢杆菌菌株或者本发明实施例的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。另一个实施例是包括农业化学品例如除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体与芽孢杆菌菌株或者本发明实施例的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。
本领域技术人员会认识到，并不是所有的化合物都对所有的害虫同等有效。本发明实施例的化合物显示出对昆虫害虫的活性，这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨尾目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鞘翅目和鳞翅目。
鳞翅目的昆虫包括但不限于行军虫、地蚕、尺蠖和夜蛾科(Noctuidae)的heliothine类：Agrotis ipsilon Hufnagel(黑地蚕)；A.orthogonia Morrison(西部地蚕)；A.segetum Denis&Schiffermüller(蔓青蛾)；A.subterranea Fabricius(粒肤地蚕)；Alabama argillacea Hübner(棉叶虫)；Anticarsia gemmatalis Hübner(黎豆毛虫)；Athetis mindara Barnes and McDunnough(粗皮地蚕)；Earias insulana Boisduval(多刺螟蛉)；E.vittella Fabricius(斑点螟蛉)；Egira(Xylomyges)curialis Grote(柑橘地蚕)；Euxoa messoria Harris(黑边地蚕)；Helicoverpa armigera Hübner(美洲螟蛉)；H.zea Boddie(玉米穗虫或玉米螟蛉)；Heliothis virescens Fabricius(烟青虫)；Hypenascabra Fabricius(苜蓿绿叶蛾)；Mamestra configurata Walker(披肩粘虫)；M.brassicae Linnaeus(甘蓝夜蛾)；Melanchra picta Harris(斑马纹夜蛾)；Pseudaletiaunipuncta Haworth(行军虫)；Pseudoplusia includens Walker(大豆尺蠖)；Richiaalbicosta Smith(西方豆地蚕)；Spodoptera frugiperda JE Smith(秋夜蛾)；S.exigua Hübner(甜菜夜蛾)；S.litura Fabricius(烟草地蚕，簇毛虫)；Trichoplusia ni Hübner(卷心菜尺蠖)；来自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、球果蛾和雕叶虫，如Achroia grisella Fabricius(小蜡螟)；Amyelois transitella Walker(脐橙螟蛾)；Anagasta kuehniella Zeller(地中海粉蛾)；Cadra cautella Walker(杏仁蛾)；Chilo partellus Swinhoe(斑点茎秆钻心虫)；C.suppressalis Walker(条纹茎/水稻钻心虫)；C.terrenellus Pagenstecher(甘蔗茎钻心虫)；Corcyra cephalonica Stainton(米蛾)；Crambus caliginosellus Clemens(玉米根网虫)；C.teterrellus Zincken(蓝草网虫)；Cnaphalocrocis medinalis Guenée(稻卷叶虫)；Desmia funeralis Hübner(葡萄卷叶虫)；Diaphania hyalinata Linnaeus(甜瓜虫)；D.nitidalis Stoll(泡菜虫)；Diatraeagrandiosella Dyar(西南玉米钻心虫)；D.saccharalis Fabricius(甘蔗钻心虫)；Elasmopalpus lignosellus Zeller(小玉米茎钻心虫)；Eoreuma loftini Dyar(墨西哥水稻钻心虫)；Ephestia elutella Hübner(烟草(可可)蛾)；Galleria mellonella Linnaeus(大蜡蛾)；Hedylepta accepta Butler(甘蔗卷叶虫)；Herpetogramma licarsisalisWalker(草地网虫)；Homoeosoma electellum Hulst(向日葵蛾)；Loxostege sticticalisLinnaeus(甜菜网虫)；Maruca testulalis Geyer(豆荚钻心虫)；Orthaga thyrisalisWalker(茶树网蛾)；Ostrinia nubilalis Hübner(欧洲玉米钻心虫)；Plodiainterpunctella Hübner(印度谷蛾)；Scirpophaga incertulas Walker(黄茎钻心虫)；Udea rubigalis Guenée(芹菜叶虫)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫Acleris gloverana Walsingham(西部黑头蚜虫)；A.variana Fernald(东部黑头蚜虫)；Adoxophyes orana Fischer von(夏季果实卷叶蛾)；黄卷蛾属(Archips spp.)，包括A.argyrospila Walker(果树卷叶虫)和A.posana Linnaeus(欧洲卷叶虫)；Argyrotaenia属；Bonagota salubricola Meyrick(巴西苹果卷叶虫)；色卷蛾属(Choristoneura spp.)；Cochylis hospes Walsingham(向日葵带蛾)；Cydialatiferreana Walsingham(榛树虫)；C.pomonella Linnaeus(苹果蠹蛾)；Endopizaviteana Clemens(葡萄浆果蛾)；Eupoecilia ambiguella Hübner(葡萄树蛾)；Grapholitamolesta Busck(东方果实蛾)；Lobesia botrana Denis&Schiffermüller(欧洲葡萄树蛾)；Platynota flavedana Clemens(杂色卷叶蛾)；P.stultana Walsingham(杂食卷叶虫)；Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller(眼斑蚜蛾)；和Suleima helianthana Riley(向日葵蚜蛾)。
鳞翅目中选择的其他农艺学害虫包括但不限于Alsophila pometaria Harris(秋星尺蠖)；Anarsia lineatella Zeller(桃条麦蛾)；Anisota senatoria J.E.Smith(橙色条纹橡树虫)；Antheraea pernyi Guérin-Méneville(中国橡树柞蚕蛾)；Bombyx moriLinnaeus(蚕)；Bucculatrix thurberiella Busck(棉叶潜蛾)；Colias eurythemeBoisduval(苜蓿粉蝶)；Datana integerrima Grote&Robinson(核桃天社蛾)；Dendrolimussibiricus Tschetwerikov(落叶松毛虫)、Ennomos subsignaria Hübner(榆树尺蠖)；Erannis tiliaria Harris(椴尺蠖)；Erechthias flavistriata Walsingham(甘蔗芽蛾)；Euproctis chrysorrhoea Linnaeus(黄毒蛾)；Harrisina americana Guérin-Méneville(葡萄叶烟翅斑蛾)；Heliothis subflexa Guenée；Hemileuca oliviae Cockrell(牧草天蚕蛾)；Hyphantria cunea Drury(美国白蛾)；Keiferia lycopersicella Walsingham(番茄蛲虫)；Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst(东部铁杉尺蠖)；L.fiscellarialugubrosa Hulst(西部铁杉尺蠖)；Leucoma salicis Linnaeus(缎蛾)；Lymantria disparLinnaeus(舞毒蛾)；天幕毛虫属；Manduca quinquemaculata Haworth(五点天蛾，番茄天蛾幼虫)；M.sexta Haworth(番茄天蛾幼虫，烟草天蛾幼虫)；Operophtera brumata Linnaeus(冬尺蠖)；毒蛾属；Paleacrita vernata Peck(春尺蠖)；Papilio cresphontes Cramer(巨燕尾蝶，桔凤蝶)；Phryganidia californica Packard(加州橡树虫)；Phyllocnistiscitrella Stainton(柑桔潜叶蛾)；Phyllonorycter blancardella Fabricius(斑幕潜叶蛾)；Pieris brassicae Linnaeus(大白粉蝶)；P.rapae Linnaeus(小菜蛾)；P.napiLinnaeus(暗脉菜粉蝶)；Platyptilia carduidactyla Riley(洋蓟羽蛾)；Plutellaxylostella Linnaeus(菱纹背蛾)；Pectinophora gossypiella Saunders(棉红铃虫)；Pontia protodice Boisduval&Leconte(南方菜青虫)；Sabulodes aegrotata Guenée(杂食尺蠖)；Schizura concinna J.E.Smith(红驼背毛虫)；Sitotroga cerealella Olivier(麦蛾)；Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller(松异带蛾)；Tineola bisselliellaHummel(结网衣蛾)；Tuta absoluta Meyrick(番茄斑潜蝇)和Yponomeuta padellaLinnaeus(巢蛾)。
值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：Anthonomus grandisBoheman(棉籽象鼻虫)；Cylindrocopturus adspersus LeConte(向日葵茎象鼻虫)；Diaprepes abbreviatus Linnaeus(蔗根象鼻虫)；Hypera punctata Fabricius(三叶草叶象)；Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel(稻水象鼻虫)；Metamasius hemipterushemipterus Linnaeus(西印度蔗象鼻虫)；M.hemipterus sericeus Olivier(丝蔗象鼻虫)；Sitophilus granarius Linnaeus(谷象鼻虫)；S.oryzae Linnaeus(米象鼻虫)；Smicronyx fulvus LeConte(红向日葵籽象鼻虫)；S.sordidus LeConte(灰向日葵籽象鼻虫)；Sphenophorus maidis Chittenden(玉蜀黍喙甲)；Rhabdoscelus obscurusBoisduval(新几内亚甘蔗象鼻虫)；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：Chaetocnema ectypa Horn(沙漠玉米跳甲)；C.pulicaria Melsheimer(玉米跳甲)；Colaspis brunnea Fabricius(葡萄肖叶甲)；Diabrotica barberi Smith&Lawrence(北方玉米根虫)；D.undecimpunctata howardiBarber(南方玉米根虫)；D.virgifera virgifera LeConte(西方玉米根虫)；Leptinotarsadecemlineata Say(科罗拉多马铃薯甲虫)；Oulema melanopus Linnaeus(谷物叶甲虫)；Phyllotreta cruciferae Goeze(玉米跳甲)；Zygogramma exclamationis Fabricius(向日葵甲虫)；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：Epilachna varivestisMulsant(墨西哥豆甲虫)；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫，包括但不限于：Antitrogus parvulus Britton(Childers蔗蚧螬)；Cyclocephala borealis Arrow(北方隐金龟子，白蚧螬)；C.immaculata Olivier(南方隐金龟子，白蚧螬)；Dermolepidaalbohirtum Waterhouse(灰背蔗甲虫)；Euetheola humilis rugiceps LeConte(甘蔗甲虫)；Lepidiota frenchi Blackburn(法国蔗蚧螬)；Tomarus gibbosus De Geer(胡萝卜甲虫)；T.subtropicus Blatchley(甘蔗蚧螬)；Phyllophaga crinita Burmeister(白蛴螬)；P.latifrons LeConte(六月甲虫)；Popillia japonica Newman(日本甲虫)；Rhizotrogusmajalis Razoumowsky(欧洲金龟子)；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯甲虫；来自叩头虫科(Elateridae)以下各属的线虫：伪金针虫属(Eleodes spp.)、纹叩甲属(Melanotusspp.)，包括M.communis Gyllenhal(线虫)；宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)；丘胸叩甲属(Limonius spp.)；细胸叩甲属(Agriotes spp.)；Ctenicera spp.；Aeolus spp.；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)的甲虫，例如但不限于Migdolus fryanus Westwood(长角甲虫)；和来自吉丁虫科(Buprestidae)的甲虫，包括但不限于Aphanisticus cochinchinae seminulumObenberger(潜叶吉丁虫)。
值得关注的双翅目的成虫和未成熟虫包括：潜叶虫Agromyza parvicornis Loew(玉米斑潜叶蝇)；摇蚊，包括但不限于Contarinia sorghicola Coquillett(高粱瘿蚊)；Mayetiola destructor Say(黑森瘿蚊)；Neolasioptera murtfeldtiana Felt(向日葵籽瘿蚊)；Sitodiplosis mosellana Géhin(小麦吸浆虫)；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、Oscinella frit Linnaeus(瑞典秆蝇)；蛆虫，包括但不限于地种蝇属物种(Delia spp.)，包括Delia platura Meigen(玉米种蝇)；D.coarctata Fallen(麦种蝇)；Fanniacanicularis Linnaeus、F.femoralis Stein(小家厕蝇)；Meromyza americana Fitch(麦秆蝇)；Musca domestica Linnaeus(家蝇)；Stomoxys calcitrans Linnaeus(螫蝇)；面蝇、角蝇、丽蝇、金蝇属物种(Chrysomya spp.)；伏蝇属物种(Phormia spp.)；及其他蝇类害虫、马蝇类虻属物种(Tabanus spp.)；肤蝇类胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；牛蝇类皮蝇属物种(Hypoderma spp.)；鹿蝇类斑虻属物种(Chrysopsspp.)；蜱蝇属(Melophagus)羊蝶蝇(ovinus Linnaeus，keds)；及其他短角亚目(Brachycera)、蚊类伊蚊属物种(Aedes spp.)；按蚊属物种(Anopheles spp.)；库蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇类原蚋属物种(Prosimulium spp.)；蚋属物种(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
半翅目昆虫也属值得关注的昆虫，它们例如但不限于以下各科：球蚜科(Adelgidae)、粉虱科(Aleyrodidae)、蚜科(Aphididae)、链蚧科(Asterolecaniidae)、沫蝉科(Cercopidae)、叶蝉科(Cicadellidae)、蝉科(Cicadidae)、菱飞虱科(Cixiidae)、软介壳虫科(Coccidae)、缘蝽科(Coreidae)、胭蚧科(Dactylopiidae)、飞虱科(Delphacidae)、盾蚧科(Diaspididae)、毡蚧科(Eriococcidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、圆飞虱科(Issidae)、长蝽科(Lygaeidae)、硕蚧科(Margarodidae)、角蝉科(Membracidae)、盲蝽科(Miridae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、蝽科(Pentatomidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、木虱科(Psyllidae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)和网蝽科(Tingidae)。
来自半翅目的农艺学上重要的成员包括但不限于：Acrosternum hilare Say(绿蝽象)；Acyrthisiphon pisum Harris(豌豆蚜虫)；球蚜属(Adelges spp.)(球蚜)；Adelphocoris rapidus Say(苜蓿褐盲蝽(rapid plant bug))；Anasa tristis De Geer(南瓜虫)；Aphis craccivora Koch(豇豆蚜虫)；A.fabae Scopoli(黑豆蚜虫)；A.gossypiiGlover(棉花蚜虫，甜瓜蚜虫)；A.maidiradicis Forbes(玉米根蚜虫)；A.pomi De Geer(苹果蚜虫)；A.spiraecola Patch(绣线菊蚜虫)；Aulacaspis tegalensis Zehntner(甘蔗介壳虫)；Aulacorthum solani Kaltenbach(毛地黄蚜虫)；Bemisia tabaci Gennadius(烟草粉虱，甘薯粉虱)；B.argentifolii Bellows&Perring(银叶粉虱)；Blissus leucopterusleucopterus Say(麦长蝽)；负子蝽属(Blostomatidae spp.)；Brevicoryne brassicaeLinnaeus(卷心菜蚜虫)；Cacopsylla pyricola Foerster(梨木虱)；Calocorisnorvegicus Gmelin(马铃薯盲蝽)；Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(草莓蚜虫)；臭虫属(Cimicidae spp.)；缘蝽属(Coreidae spp.)；Corythuca gossypii Fabricius(棉花网蝽)；Cyrtopeltis modesta Distant(番茄蝽)；C.notatus Distant(吸蝇(suckfly))；Deois flavopicta(吹沫虫)；Dialeurodes citri Ashmead(柑橘粉虱)；Diaphnocorischlorionis Say(皂荚树蝽)；Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko(俄罗斯小麦蚜虫)；Duplachionaspis divergens Green(盾介壳虫)；Dysaphis plantaginea Paaserini(红苹果蚜虫)；Dysdercus suturellus(棉蝽)；Dysmicoccus boninsisKuwana(灰甘蔗粉蚧)；Empoasca fabae Harris(马铃薯叶蝉)；Eriosoma lanigerumHausmann(苹绵蚜)；葡萄斑叶蝉属(Erythroneoura spp.)(葡萄斑叶蝉)；Eumetopinaflavipes Muir(岛屿甘蔗飞虱)；扁盾蝽属(Eurygaster spp.)；Euschistus servus Say(褐椿象)；E.variolarius Palisot de Beauvois(一斑蝽象)；长蝽属(Graptostethusspp.)(长蝽系群(complex of seed bugs))；以及Hyalopterus pruni Geoffroy(桃大尾蚜)；Icerya purchasi Maskell(吹绵蚧)；Labopidicola allii Knight(洋葱蝽)；Laodelphax striatellus Fallen(灰飞虱)；Leptoglossus corculus Say(松叶根蝽)；Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer(甘蔗网蝽)；Lipaphis erysimi Kaltenbach(芜箐蚜虫)；Lygocoris pabulinus Linnaeus(通绿盲蝽)；Lygus lineolaris Palisot deBeauvois(牧草盲蝽)；L.Hesperus Knight(西部牧草盲蝽)；L.pratensis Linnaeus(普通牧场蝽)；L.rugulipennis Poppius(欧洲牧草盲蝽)；Macrosiphum euphorbiae Thomas(马铃薯蚜虫)；Macrosteles quadrilineatus Forbes(翠菊叶蝉)；Magicicada septendecimLinnaeus(周期蝉)；Mahanarva fimbriolata(甘蔗吹沫虫)；Melanaphis sacchariZehntner(甘蔗蚜虫)；Melanaspis glomerata Green(黑介壳虫)；Metopolophiumdirhodum Walker(玫瑰粮食蚜虫)；Myzus persicae Sulzer(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；Nasonovia ribisnigri Mosley(莴苣蚜虫)；Nephotettix cinticeps Uhler(绿叶蝉)；N.nigropictus(水稻叶蝉)；Nezara viridula Linnaeus(南方绿蝽象)；Nilaparvatalugens(褐飞虱)；Nysius ericae Schilling(假臭虫)；Nysius raphanus Howard(假臭虫)；Oebalus pugnax Fabricius(稻蝽象)；Oncopeltus fasciatus Dallas(大马利筋蝽)；Orthops campestris Linnaeus；瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)(根蚜和瘿蚜)；Peregrinus maidis Ashmead(玉米飞虱)；Perkinsiella saccharicida Kirkaldy(甘蔗飞虱)；Phylloxera devastatrix Pergande(美洲山核桃葡萄根瘤蚜)；Planococcus citriRisso(柑橘粉蚧)；Plesiocoris rugicollis Fallen(苹果盲蝽)；Poecilocapsuslineatus Fabricius(四线盲蝽)；Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)；粉蚧属(Pseudococcus spp.)(其他的粉蚧系群)；Pulvinaria elongata Newstead(羊胡子草介壳虫)；Pyrilla perpusilla Walker(甘蔗叶蝉)；红蝽属(Pyrrhocoridae spp.)；Quadraspidiotus perniciosus Comstock(梨园蚧)；锥蝽属(Reduviidae spp.)；Rhopalosiphum maidis Fitch(玉米叶蚜虫)；R.padi Linnaeus(禾谷缢管蚜)；Saccharicoccus sacchari Cockerell(粉色甘蔗粉蚧)；Schizaphis graminum Rondani(麦二叉蚜)；Sipha flava Forbes(黄色甘蔗蚜虫)；Sitobion avenae Fabricius(麦长管蚜)；Sogatella furcifera Horvath(白背飞虱)；Sogatodes oryzicola Muir(水稻飞虱)；Spanagonicus albofasciatus Reuter(白斑盲蝽)；Therioaphis maculata Buckton(斑点苜蓿蚜)；谷蛾属(Tinidae spp.)；Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe(黑色柑橘蚜虫)；和T.citricida Kirkaldy(褐色柑橘蚜虫)；Trialeurodes abutiloneus(纹翅粉虱)和T.vaporariorum Westwood(温室粉虱)；Trioza diospyri Ashmead(柿木虱)；和Typhlocyba pomaria McAtee(白色苹果叶蝉)。
还包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成虫和幼虫，如Aceria tosichella Keifer(小麦卷叶螨)；Panonychus ulmi Koch(欧洲红螨)；Petrobia latens Müller(褐色小麦螨)；Steneotarsonemus bancrofti Michael(甘蔗茎蟎)；叶螨科(Tetranychidae)的蜘蛛螨和红螨、Oligonychus grypus Baker&Pritchard，O.indicus Hirst(甘蔗叶蟎)、O.pratensisBanks(班克斯草螨)、O.stickneyi McGregor(甘蔗蜘蛛螨)；Tetranychus urticae Koch(二斑蜘蛛螨)；T.mcdanieli McGregor(McDaniel螨)；T.cinnabarinus Boisduval(红蜘蛛螨)；T.turkestani Ugarov&Nikolski(草莓蜘蛛螨)；细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨类：Brevipalpus lewisi McGregor(柑橘扁平螨)；瘿螨科(Eriophyidae)的锈螨和芽蜱以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)中的尘螨，蠕形螨科(Demodicidae)中的毛囊螨，食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱虫。Ixodes scapularis Say(鹿蜱)；Ixodes holocyclus Neumann(澳洲寄生蜱)；Dermacentor variabilis Say(美洲犬蜱)；Amblyomma americanum Linnaeus(美洲钝眼蜱)；以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。
缨尾目的昆虫害虫是值得关注的，例如Lepisma saccharina Linnaeus(蠹虫)；Thermobia domestica Packard(小灶衣鱼)。
另外涉及的节肢害虫包括：蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如Loxosceles reclusaGertsch&Mulaik(褐色隐士蜘蛛)和Latrodectus mactans Fabricius(黑寡妇蜘蛛)以及蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足类例如Scutigera coleoptrata Linnaeus(蚰蜒)。此外，等翅目(Isoptera)的昆虫害虫是值得关注的，包括白蚁科(termitidae)的那些昆虫害虫，例如但不限于Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren和Pseudacanthotermesmilitaris Hagen(甘蔗白蚁)。缨翅目(Thysanoptera)的昆虫也是值得关注的，包括但不限于蓟马类，例如Stenchaetothrips minutus van Deventer(甘蔗蓟马)。
可在昆虫害虫的早期发育阶段(例如作为幼虫或者其他发育未完全的形式)对昆虫害虫测试本发明实施例的组合物的杀虫活性。可将昆虫在完全黑暗中在约20℃至约30℃和约30％至约70％相对湿度下饲养。可如以下文献中所述进行生物测定：Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83(6)：2480-2485(Czapla和Lang，1990年，《经济昆虫学杂志》，第83卷，第6期，第2480-2485页)。饲养昆虫幼虫和进行生物测定法的方法是本领域普通技术人员公知的。
有多种生物测定技术为本领域技术人员所知。一般程序包括将实验化合物或者生物体添加到密闭容器中的食物源。然后在取食和暴露适当的一段时间后，通过(但不限于)死亡率变化、体重减轻、吸引、排斥和其他行为和身体的变化来测量杀虫活性。本文所述的生物测定可用于幼虫阶段或者成虫阶段的任何取食昆虫害虫。
以下实例以举例说明的方式给出，而非限制本发明。
实验
实例1-基因鉴定和大肠杆菌(E.coli)表达
从分别被标示为DP2179、DP1886、JAPH0844、UZ70、DP371、DP597和DP371的菌株筛选苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)分离物，获得了编码SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：16的杀昆虫蛋白的基因。图1A至1D显示了SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列比对。表5显示了SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：14的氨基酸序列之间的同一性百分数。表6提供了菌株及杀昆虫多肽的多核苷酸序列和多肽序列的序列标识符。
表5
表6
合成出杀昆虫多肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16的分别的编码序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15，克隆到pET28载体中并转化到大肠杆菌(E.coli)BL21细胞(Invitrogen)中。使大规模的1.0L培养物生长直到O.D.600nm达到约0.8，然后用1mM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导培养物，让培养物在16℃下生长16小时。用50mL的添加了0.02％溶菌酶(w/v)和0.1％Tween-20及1片完全蛋白酶抑制剂(Complete ProteaseInhibitor)(罗氏公司(Roche))的500mM NaCl/20mM Tris/5mM咪唑/pH 7.9，将细胞沉淀裂解。裂解后，将溶液进行超声处理，将裂解物在25,000rpm下离心30分钟。使含有可溶性蛋白质级分的上清液滤过0.45u真空过滤器，然后加入1ml的Talon(克隆技术公司(Clontech))浆料，然后在100rpm下温育1小时以结合在旋转体(rotator)上。然后将裂解物添加到柱子，分离结合的蛋白质并用20ml的50mmM NaCl/20mM Tris/5mM咪唑/pH 7.9洗涤，然后用1.5ml的50mmM NaCl/20mM Tris/500mM咪唑/pH 7.9洗脱。然后将纯化的蛋白质透析到50mM碳酸钠缓冲液pHl0中。将纯化的蛋白质送去用体外取食测定法在一组鳞翅目昆虫中检测杀昆虫活性。
实例2-用部分纯化的蛋白质进行的鳞翅目测定
进行杀昆虫活性生物测定筛选，以评价杀昆虫蛋白对各种鳞翅目物种的效应：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、黑地蚕(Agrotisipsilon)、秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(Pseudoplusia includens)和黎豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。
鳞翅目取食测定是在96孔板装置中对包括纯化的蛋白质的人工食物进行的。于是将纯化的蛋白质(25ul)加入到人工食物中。每孔放入2到5只新生幼虫，随意取食5天。对于诸如发育迟缓和/或死亡的幼虫反应，结果表示为阳性。如果幼虫与饲喂只加入上述缓冲液的食物的阴性对照相似，则结果表示为阴性。对于每种纯化的蛋白质，以单一浓度对欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、玉米穗虫(CEW，Helicoverpa zea)、黑地蚕(BCW，Agrotisipsilon)、秋夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(SBL，Pseudoplusiaincludens)和黎豆毛虫(VBC，Anticarsia gemmatalis)进行初步生物测定筛选。昆虫测定法如下进行记分：3＝100％死亡率；2＝严重发育迟缓；1＝发育迟缓；0＝无活性。
杀昆虫多肽SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4的初步杀昆虫测定结果分别在表7、表8和表9中显示。
表7
表8
表9
对于杀昆虫多肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12，在初步生物测定后，还针对该组昆虫测定了一系列浓度的所述各种纯化蛋白质样品。杀昆虫多肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的杀昆虫测定结果分别在表10、表11、表12和表13中示出。
表10
稀释 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ug/cm2 67.5 33.8 16.9 8.4 4.2 2.1 1.1 0.5 0.3 0.1 0.07
ECB 2.5 2.25 2.5 2.5 3 2 2 2 2.25 1.75 1.75
CEW 2.5 2.25 2 1.75 1.5 1.25 1.5 1.25 1.25 0 0
FAW 2 2 1.75 1.5 1 0.5 0 0 0 0 0
BCW 2.5 2.75 2.75 2.5 2 1.75 1.5 1.25 0.75 0 0
SBL 3 3 3 3 3 3 3 3 1.25 1 0.5
VBC 2.5 2.75 2.25 2 2 1.75 1.75 0.5 0 0 0
表11
稀释 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ug/cm2 67.5 33.8 16.9 8.4 4.2 2.1 1.1 0.5 0.3 0.1 0.07
ECB 3 3 3 3 2.75 2.67 3 2.75 2.75 2.5 1.75
CEW 2 2.25 1.5 1.25 0.75 0.5 0.5 0.25 0 0 0
FAW 2 2 1.5 1 0.75 0 0 0 0 0 0
BCW 1.5 1.5 0.75 0 0 0 0 0 0 0 0
SBL 3 3 3 3 3 3 3 3 2.33 1.75 0.75
VBC 3 3 3 3 3 3 2.75 2.5 2.5 2.5 2.5
表12
表13
稀释 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ug/cm2 33.8 16.9 8.4 4.2 2.1 1.1 0.5 0.3 0.1 0.07
ECB 2 2.33 2.33 2.5 2.5 2 2 2 2.33 2
CEW 1.75 1 1 0.5 0 0 0 0 0 0
FAW 1 0.25 0 0 0 0 0 0 0 0
BCW 0.75 0 0 0 0 0 0 0 0 0
SBL 3 2.75 3 3 3 3 3 3 3 3
VBC 2.25 2.25 2.67 2.25 2.25 1.5 1 1 1 0.5
对于杀昆虫多肽SEQ ID NO：2，测定了一系列浓度的SEQ ID NO：2蛋白，并计算了50％死亡率(LC50)或50％个体受抑制(IC50)的浓度。杀昆虫多肽SEQ ID NO：2的LC50/IC50结果示于表14中。
表14
杀昆虫多肽SEQ ID NO：2的杀昆虫测定结果示于表15中。
表15
稀释 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ug/cm2 112.5 56.3 28.1 14.1 7 3.5 1.8 0.9 0.5 0.2 0.1
ECB 3 3 3 3 3 2 2 2 1 1 0
CEW 2 2 2 2 2 1 1 1 0 0 0
FAW 3 2 3 1 1 1 0 0 0 0 0
BCW 3 3 2 2 1 0 0 0 0 0 0
实例3-杀昆虫多肽在卷心菜尺蠖(CBL)的Cry1A或Cry2A抗性品系中的交叉抗性
为测定抗Cry蛋白的昆虫是否对杀昆虫多肽SEQ ID NO：2具有交叉抗性，用杀昆虫多肽SEO ID NO：2处理对Cry1A或Cry2A具有易感性或抗性的卷心菜尺蠖(Trichoplusiani)幼虫。
由康奈尔大学昆虫系(纽约州杰尼瓦市(Geneva NY))培育并维持T.ni菌株，并进行该测定。T.ni菌株对Cry1Ac和Cry2Ab杀昆虫蛋白的(定量)易感性不同：一个菌株对Cry1Ac和Cry2Ab都具有易感性(SS)，而其他两个菌株对Cry1Ac或Cry2Ab具有降低的易感性。两种Bt抗性菌株均来源于从加拿大不列颠哥伦比亚省的一个商业温室收集的Bt抗性T.ni群体。已通过与SS实验室菌株回交6次或更多次(然后进行抗性选择)，产生了与实验室SS菌株同基因的Cry1Ac抗性品系(GLEN-Cry1Ac-BCS8)和Cry2Ab抗性菌株。T.ni菌株(GLEN-Cry1Ac-BCS4)中的温室引起的Cry1Ac抗性(RR＞900)对Cry1Ab具有高水平的交叉抗性(RR＞800)，但对Cry1Bb、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1J、Cry2Ab或Cry9C没有交叉抗性(RR-2.1-6：7)，对Cry1F具有低水平的交叉抗性(RR＝7.8倍)。Cry1Ac抗性的机制据发现是某个变更影响了Cry1Ab和Cry1Ac与中肠中的Cry1Ab/Cry1Ac结合位点的结合(Wang等人，2007)。
使用了食物覆盖生物测定法(diet overlay bioassay)测定了T.ni的Bt易感菌株和抗性菌株的幼虫对杀昆虫蛋白的易感性(Kain，Zhao et al.2004.J.Econ.Entomol.97：2073-2978(Kain，Zhao等人，2004年，《经济昆虫学杂志》，第97卷，第2073-2978页)；Wang，Zhao et al.2007.Appl.Environ.Microbol.73：1199-1207(Wang，Zhao等人，2007年，《应用环境微生物学》，第73卷，第1199-1207页)。简单地讲，为进行新生幼虫生物测定，将某一样品浓度的0.2ml等分试样施加到30ml昆虫饲养杯中的5ml人工食物的表面(-7cm2)。每个生物测定除包括阴性对照之外，包括8个至10个浓度的样品，每个浓度设5个重复。蛋白质溶液是通过将蛋白质与适量的缓冲溶液混合而制备的。10只新生幼虫(＜孵化后24小时)将被放入每个测定杯中。在27℃、50％相对湿度和16∶8小时光照：黑暗的光周期中取食经处理的食物4天后，对每种样品造成的死亡率和幼虫生长抑制率(如果幼虫在4天内不进入第二龄期，则确定为抑制)进行打分。基于概率单位分析计算50％死亡率的浓度(LC50)或50％的个体被抑制的浓度(IC50)，并使用Polo统计软件进行统计分析。杀昆虫多肽SEQ ID NO：2的交叉抗性结果示于表16中。
表16
SS＝易感菌株
R＝抗性菌株
RR＝抗性比率
实例4：瞬时表达和对瞬时叶组织的昆虫生物测定
将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：15的多核苷酸克隆到处于如下启动子的控制下的瞬时表达载体中：玉蜀黍遍在蛋白启动子(Christensen and Quail，(1996)TransgenicResearch 5：213-218(Christensen和Quail，1996年，《转基因研究》，第5卷，第213-218页))和来自紫茉莉花叶病毒的启动子的复制形式(DMMV PRO；Dey and Maiti，(1999)PlantMol.Biol.，40：771-82(Dey和Maiti，1999年，《植物分子生物学》，第40卷，第771-82页))。将农杆菌细胞悬液引入完整组织的植物细胞使得可以测量或研究可重复感染和后续植物来源转基因表达的农杆菌渗入方法是本领域熟知的(Kapila，et.al.，(1997)Plant Science122：101-108(Kapila等人，1997年，《植物科学》，第122卷，第101-108页))。简而言之，用测试和对照菌株的标准化细菌细胞培养物对玉蜀黍的幼株进行农杆菌渗入。从每一棵幼株产生叶圆片，并用西方玉米根虫(WCRW，(Diabrotica virgifera))和适当的对照侵扰叶圆片。在侵扰两天后对绿叶组织的消耗程度进行打分。
取食2天后，针对每个处理组中24个叶圆片，对ECB、CEW、FAW、BCW、SBL和VBC幼虫消耗的叶组织的量进行打分。相比于阴性对照(DsRed)，在24个叶圆片中，积累有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16杀昆虫多肽的组织的受损程度显著较轻。
实例5-农杆菌介导的玉蜀黍转化和转基因植物的再生
对于用多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15)进行的农杆菌介导的玉蜀黍转化，可使用Zhao的方法(美国专利No.5，981,840和PCT专利公布WO98/32326；这两个专利的内容以引用方式并入本文)。简单地讲，从玉蜀黍分离不成熟胚，并使胚在细菌能够将毒素核苷酸序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15)转移到至少一个不成熟胚的至少一个细胞的条件下与农杆菌的悬浮液接触(步骤1：感染步骤)。在这个步骤中，可将未成熟胚浸入农杆菌悬液中以引发接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该感染步骤之后，可将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在这个共培养期之后，设想到任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化子的选择剂(步骤3：静息步骤)。可将未成熟胚在含有抗生素但无选择剂的固体培养基上培养，为了消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息阶段。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并可将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。
实例6：大豆胚的转化
用含有与合适的启动子有效连接的毒素核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的质粒如下对大豆胚进行轰击。为了诱导体细胞胚，从适当的大豆栽培种的经表面灭菌的未成熟种子解剖出长3-5mm的子叶，然后将其在适当的琼脂培养基上于26℃在光照或黑暗中培养六至十个星期。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在反复选择作为早期球状阶段的胚而繁殖的体细胞胚的簇之后，如下所述维持悬浮物。
大豆胚发生悬浮培养物可在旋转振荡器上在150rpm、26℃下维持在35mL液体培养基中，以荧光灯按16∶8小时白日/黑夜时间表进行维持。每隔两周，通过将大约35mg的组织接种到35mL的液体培养基中，将培养物进行传代培养。
可然后通过粒子枪轰击方法(Klein，et al.，(1987)Nature(London)327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》(伦敦)，第327卷，第70-73页)、美国专利No.4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。可使用Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪器(氦改型)进行这些转化。
可用于促进大豆转化的选择性标记基因包括但不限于，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz，etal.，(1983)Gene 25：179-188(Gritz等人，1983年，《基因》，第25卷，第179-188页))和来自根瘤农杆菌Ti质粒T DNA的胭脂氨酸合成酶基因的3′区。可分离包括与合适的启动子有效连接的毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15)的表达盒作为限制性片段。然后可将这个片段插入携带标志基因的载体的独特限制性酶切位点中。
向50μL的60mg/ml 1μm金粒子悬浮液加入(按顺序)：5μL DNA(1μg/μl)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl2(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μL 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μL无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。
将大约300-400mg的两周龄悬浮培养物置于空的60×15mm培养皿中，用移液管将残余液体从组织移除。对于每次转化实验，通常轰击大约5-10个组织平板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。
轰击后五至七天，可将液体培养基与新鲜培养基交换，轰击后七至十二天与含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基交换。该选择培养基可每周更换。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新株系当作独立的转化事件处理。然后可将这些悬浮物传代培养，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物、专利或者专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。
虽然为了清楚地理解起见已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修饰。

Claims (20)

1.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：
(a)由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列组成的核酸分子；
(b)编码由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包括具有已被设计用于在植物中表达的植物偏好的密码子的合成核苷酸序列。
3.一种DNA构建体，所述DNA构建体包括根据权利要求1所述的核酸分子和与所述核酸分子可操作性连接的异源调节元件。
4.制备宿主细胞的方法，所述宿主细胞包括根据权利要求3所述的DNA构建体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述宿主细胞为细菌细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述宿主细胞为植物细胞。
7.制备转基因植物的方法，所述转基因植物包括植物细胞，所述植物细胞包括根据权利要求3所述的DNA构建体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物选自玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、烟草和大麦。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物选自卷心菜和油籽油菜。
10.制备植物种子的方法，所述植物种子包括根据权利要求3所述的DNA构建体。
11.一种分离的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列编码的多肽。
12.一种组合物，所述组合物包括根据权利要求11所述的多肽。
13.根据权利要求12所述的组合物，所述组合物包括1重量%至99重量%的所述多肽。
14.一种防治鳞翅目或鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括使所述群体接触杀虫有效量的根据权利要求12所述的组合物。
15.一种杀灭鳞翅目害虫的方法，所述方法包括使所述害虫接触或者给所述害虫饲喂杀虫有效量的根据权利要求12所述的组合物。
16.一种生产具有杀虫活性的多肽的方法，所述方法包括将宿主细胞在编码所述多肽的所述核酸分子得以表达的条件下进行培养，所述宿主细胞包括根据权利要求3所述的DNA构建体，所述多肽选自：
(a)由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列编码的多肽。
17.制备在其基因组中稳定掺入了DNA构建体的植物或植物细胞的方法，所述DNA构建体包括编码具有杀虫活性的多肽的核酸分子，其中所述核酸分子选自：
(a)包括SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核酸分子；
(b)编码包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；
其中所述核苷酸序列与驱动编码序列在植物细胞中的表达的启动子可操作性连接。
18.一种产生抗害虫的转基因植物或植物细胞的方法，所述方法包括向所述植物或植物细胞中引入包括编码杀虫多肽的核酸分子的表达载体，其中所述核酸分子选自：
(a)由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列组成的核酸分子；
(b)编码由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子。
19.一种保护植物免遭害虫侵扰的方法，所述方法包括向所述植物或植物细胞中引入包括编码杀虫多肽的核苷酸序列的表达载体，其中所述核苷酸序列选自：
(a)由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列组成的核酸分子；
(b)编码由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述杀虫多肽具有针对鳞翅目害虫的杀昆虫活性。
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