CN102361983B - 具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了编码多肽的得自苏云金芽孢杆菌菌株的核酸及其变体和片段，所述多肽具有针对昆虫害虫包括鳞翅目的杀虫活性。本发明的特定实施方案提供了编码杀虫蛋白质的分离的核酸、杀虫组合物、DNA构建体以及包括实施方案的核酸的转化的微生物和植物。这些组合物在用于控制害虫特别是植物害虫的方法中有用。

Description

具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因

发明领域

本发明涉及得自新苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）基因的天然存在和重组的核酸，其编码特征在于针对昆虫害虫的杀虫活性的杀虫多肽。本发明的组合物和方法利用所公开的核酸，及其编码的杀虫多肽，以控制植物害虫。

发明背景

昆虫害虫是世界农作物损失中的主要因素。例如，黏虫摄食、小地老虎损害或玉米螟损害对于农业生产者可以是经济上破坏性的。来自对单独的田间和甜玉米的玉米螟攻击的昆虫害虫相关作物损失在损害和控制费用方面已达到每年约10亿美元。

传统上，用于影响昆虫害虫群体的主要方法是广谱化学杀昆虫剂的应用。然而，消费者和政府管理者同样变得越来越关注与合成化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。因为此种关注，管理者已禁止或限制一些较危险杀虫剂的使用。因此，存在开发可替代杀虫剂的重大兴趣。

使用微生物试剂例如真菌、细菌或另一个昆虫物种生物学控制具有农业重要性的昆虫害虫提供了对合成化学杀虫剂的环境友好和商业上有吸引力的替代物。一般来说，生物杀虫剂的使用呈现了污染和环境危害的较低危险，并且生物杀虫剂提供了比传统广谱化学杀昆虫剂特有的更大的靶特异性。此外，生物杀虫剂经常生产成本更少，并且因此改善关于广泛多样作物的经济产量。

已知芽孢杆菌属（Bacillus）的微生物的特定物种具有针对广泛范围的昆虫害虫的杀虫活性，所述昆虫害虫包括鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、半翅目（Hemiptera）等。苏云金芽孢杆菌（Bt）和日本甲虫芽孢杆菌（Bacillus papilliae）在迄今为止发现的最成功的生物控制试剂中。昆虫致病性也已归因于幼虫类芽孢杆菌（B. larvae）、缓病芽孢杆菌（B. lentimorbus）、球形芽孢杆菌（B. sphaericus）（Harwook，编辑（（1989）Bacillus（Plenum Press），306）、和蜡状芽孢杆菌（B. cereus）（WO 96/10083）的菌株。杀虫活性看起来集中于伴孢结晶蛋白质内含物，尽管杀虫蛋白质已也从芽孢杆菌属的营养生长阶段中分离。编码这些杀虫蛋白质的几种基因已得到分离和表征（参见例如美国专利号5,366,892和5,840,868）。

微生物杀昆虫剂特别是得自芽孢杆菌属菌株的那些，作为化学害虫控制的替代物已在农业中起重要作用。近来，通过基因工程改造作物植物以产生来自芽孢杆菌属的杀虫蛋白质，农业科学家已开发了具有增强的昆虫抗性的作物植物。例如，玉米和棉花植物已进行基因工程改造，以产生从Bt的菌株中分离的杀虫蛋白质（参见例如，Aronson（2002）Cell Mol. Life Sci. 59（3）:417-425；Schnepf等人（1998）Microbiol Mol Biol Rev. 62（3）:775-806）。这些基因工程改造的作物目前广泛用于美国农业中，并且已给农民提供了对传统昆虫控制方法的环境友好的替代物。此外，基因工程改造为包含杀虫Cry毒素的马铃薯已销售给美国农民。虽然它们已被证明是在经济上非常成功的，但这些基因工程改造的、昆虫抗性的作物植物仅提供针对狭窄范围的经济上重要的昆虫害虫的抗性。

因此，仍需要具有针对昆虫害虫的更广泛范围的杀昆虫活性的新Bt毒素，例如针对来自鳞翅目的更多种昆虫有活性的毒素。此外，仍需要具有针对多种昆虫害虫的活性的生物杀虫剂和具有改善的杀昆虫活性的生物杀虫剂。

发明概述

提供了用于影响昆虫害虫的组合物和方法。更具体而言，本发明的实施方案涉及利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列影响昆虫的方法，以产生表达实施方案的杀昆虫多肽的转化的微生物和植物。此种害虫包括农业上重要的昆虫，例如：玉米螟（玉米螟（Ostrinia nubilalis））和西南玉米杆草螟（西南玉米杆草螟（Diatraea grandiosella））。在一些实施方案中，核苷酸序列编码对于属于鳞翅目的至少一种昆虫是杀虫的多肽。

实施方案提供了核酸及其片段和变体，其编码具有针对昆虫害虫的杀虫活性的多肽（例如编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1）。得自Bt的实施方案的野生型（例如天然存在的）核苷酸序列编码新杀昆虫肽。实施方案进一步提供了所公开的核苷酸序列的片段和变体，其编码生物学活性（例如杀昆虫）多肽。

实施方案进一步提供了由实施方案的天然存在或修饰的（例如诱变处理或操作的）核酸编码的分离的杀虫（例如杀昆虫）多肽。在特定例子中，实施方案的杀虫蛋白质包括全长蛋白质和多肽的片段，其由设计为将特定氨基酸序列引入实施方案的多肽内的诱变处理的核酸产生。在特定实施方案中，相对于它们衍生自其的天然存在的多肽的活性，多肽具有增强的杀虫活性。

实施方案的核酸还可以用于产生转基因（例如转化的）单子叶或双子叶植物，其特征在于包括至少一种稳定掺入的核苷酸构建体的基因组，所述核苷酸构建体包括与启动子可操作地连接的实施方案的编码序列，所述启动子驱动所编码的杀虫多肽的表达。因此，还提供了转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。

在具体实施方案中，可以使用已对于在宿主植物中增加的表达最佳化的核酸产生转化的植物。例如，实施方案的杀虫多肽之一可以进行反翻译(back-translate)，以产生包括对于在特定宿主中的表达最佳化的密码子的核酸，例如作物植物例如玉米（玉蜀黍（Zea mays））植物。由此种转化的植物（例如双子叶植物或单子叶植物）的编码序列的表达将导致杀虫多肽的产生，且对植物赋予增加的昆虫抗性。一些实施方案提供了表达杀虫多肽的转基因植物，这在用于影响各种昆虫害虫的方法中有用。

实施方案进一步包括包含实施方案的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫组合物，并且可以任选包括进一步的杀昆虫肽。实施方案包含此种组合物对昆虫害虫环境的应用，以影响昆虫害虫。

发明详述

本发明的实施方案涉及用于影响昆虫害虫特别是植物害虫的组合物和方法。更具体而言，实施方案的分离的核酸及其片段和变体包括编码杀虫多肽（例如蛋白质）的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白质针对昆虫害虫例如但不限于鳞翅目的昆虫害虫是生物学活性的（例如杀虫的）。目的昆虫害虫包括但不限于：玉米螟（Ostrinia nubilalis）（玉米螟）、普通蛀茎夜蛾（Papaipema nebris）（普通蛀茎夜蛾）和西南玉米杆草螟（Diatraea grandiosella）（西南玉米杆草螟）。

实施方案的组合物包括分离的核酸及其片段和变体，其编码杀虫多肽，包括实施方案的核苷酸序列的表达盒，分离的杀虫蛋白质和杀虫组合物。一些实施方案提供了特征在于相对于相应野生型蛋白质的杀虫活性，针对鳞翅目改善的杀昆虫活性的修饰的杀虫多肽。实施方案进一步提供了用这些新核酸转化的植物和微生物，和涉及此种核酸、杀虫组合物、转化的生物及其产物在影响昆虫害虫中的使用的方法。

实施方案的核酸和核苷酸序列可以用于转化任何生物，以产生所编码的杀虫蛋白质。提供了涉及使用此种转化的生物来影响或控制植物害虫的方法。实施方案的核酸和核苷酸序列还可以用于转化细胞器例如叶绿体（McBride等人（1995）Biotechnology 13：362-365；和Kota等人（1999）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：1840-1845）。

实施方案进一步涉及天然存在的编码序列的片段和变体的鉴定，其编码生物学活性的杀虫蛋白质。实施方案的核苷酸序列在用于影响害虫的方法中直接有用，所述害虫特别是昆虫害虫，例如鳞翅目的害虫。因此，实施方案提供了用于影响昆虫害虫的新方法，其不依赖于传统的、合成化学杀昆虫剂的使用。实施方案涉及天然存在的、生物可降解的杀虫剂和编码其的基因的发现。

实施方案进一步提供了天然存在的编码序列的片段和变体，其也编码生物学活性（例如杀虫）多肽。实施方案的核酸包含已对于通过特定生物的细胞表达最佳化的核酸或核苷酸序列，例如基于具有增强的杀虫活性的多肽的氨基酸序列，已使用植物优选的密码子反翻译（即反向翻译）的核酸序列。实施方案进一步提供了对实施方案的多肽赋予改善或改变的性质的突变。参见例如，于2003年6月25日提交的共同未决的美国申请号10/606,320和于2003年12月24日提交的10/746,914。

在下文说明书中，广泛使用了许多术语。提供了下述定义以促进实施方案的理解。

单位、前缀和符号可以以其SI公认形式表示。除非另有说明，否则分别地，核酸以5'到3'方向从左往右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左往右书写。数字范围包括限定范围的数字。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会（Biochemical Nomenclature Commission）推荐的单字母符号提及。同样地，核苷酸可以通过其通常公认的单字母编码提及。上述术语通过参考就整体而言的说明书更全面地定义。

如本文使用的，“核酸”包括提及单或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有说明，否则包含具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物（例如肽核酸），因为它们以与天然存在的核苷酸的那种相似的方式与单链核酸杂交。

如本文使用的，术语“编码”或“编码的”当在特定核酸背景中使用时，意指核酸包括指导核苷酸序列翻译成特定蛋白质的必需信息。蛋白质由其编码的信息由密码子的使用指定。编码蛋白质的核酸可以包括在核酸的翻译区内的非翻译序列（例如内含子），或可以缺乏此种间插非翻译序列（例如如在cDNA中）。

如本文使用的，关于指定多核苷酸或其编码的蛋白质的“全长序列”意指具有自然（非合成）、内源序列的完整核酸序列或完整氨基酸序列。全长多核苷酸编码全长、催化活性形式的指定蛋白质。

如本文使用的，在核苷酸序列方向背景中使用的术语“反义”指以反义链被转录的方向与启动子可操作地连接的双链体多核苷酸序列。反义链与内源转录产物足够互补，从而使得内源转录产物的翻译经常被抑制。因此，当术语“反义”在特定核苷酸序列背景中使用时，该术语指参考转录产物的互补链。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，以指掺入蛋白质、多肽或肽（总起来说“蛋白质”）内的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限定，否则可以包含天然氨基酸的已知类似物，其可以以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

实施方案的多肽可以由本文公开的核酸或使用标准分子生物学技术产生。例如，实施方案的蛋白质可以通过实施方案的重组核酸在合适宿主细胞中的表达或可替代地通过先体外后体内程序的组合产生。

如本文使用的，术语“分离的”和“纯化的”可互换使用，以指实质上或基本上不含这样的组分的核酸或多肽或其生物学活性部分，所述组分正常伴随核酸或多肽或与核酸或多肽相互作用，如在其天然存在的环境中发现的。因此，分离或纯化的核酸或多肽当通过重组技术产生时，基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学试剂。

“分离的”核酸一般不含在核酸由其衍生的生物的基因组DNA中天然侧接核酸的序列（例如蛋白质编码序列）（即位于核酸5'和3'末端的序列）。例如，在各种实施方案中，分离的核酸可以包含小于约5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb核苷酸序列，其在核酸由其衍生的细胞的基因组DNA中天然侧接核酸。

如本文使用的，当其用于指实施方案的多肽时，术语“分离的”或“纯化的”指分离的蛋白质基本上不含细胞材料，并且包括具有小于约30％、20％、10％或5％（按干重计）污染蛋白质的蛋白质制剂。当实施方案的蛋白质或其生物学活性部分重组产生时，培养基相当于小于约30％、20％、10％或5％（按干重计）化学前体或非目的蛋白质化学试剂。

说明书自始至终，单词“包括”或其变形应理解为暗示包括所述元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤组。

如本文使用的，术语“影响昆虫害虫”指在任何发育阶段时实现昆虫摄食、生长和/或行为中的改变，包括但不限于：杀死昆虫；延缓生长；阻止生殖能力；拒食剂活性；等。

如本文使用的，术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义使用，以指生物或物质（例如蛋白质）的活性，这可以通过但不限于下述进行测量：在摄食和暴露合适时间长度后的害虫死亡率、害虫重量减轻、害虫驱性以及害虫的其他行为和身体改变。因此，具有杀虫活性的生物或物质不利地影响害虫适合度的至少一个可测量参数。例如，“杀虫蛋白质”是自身或与其他蛋白质组合展示出杀虫活性的蛋白质。

如本文使用的，术语“杀虫有效量”意味着当存在于害虫的环境中时，具有杀虫活性的物质或生物的量。对于每种物质或生物，杀虫有效量对于特定环境中受影响的每种害虫以经验为根据进行测定。类似地，“杀昆虫有效量”可以用于指当害虫是昆虫害虫时的“杀虫有效量”。

如本文使用的，术语“重组工程改造的”或“工程改造的”意味着利用重组DNA技术，以引入（例如工程改造）蛋白质结构中的变化，这基于蛋白质作用机制的理解和待引入、缺失或取代的氨基酸的考虑。

如本文使用的，术语“突变型核苷酸序列”或“突变”或“诱变处理的核苷酸序列”意味着已诱变处理或改变以包含一个或多个核苷酸残基（例如碱基对）的核苷酸序列，所述核苷酸残基不存在于相应野生型序列中。此种诱变或改变由核酸残基的一个或多个添加、缺失、或取代或置换组成。当突变通过添加、去除或置换蛋白酶解位点的氨基酸进行时，此种添加、去除或置换可以在蛋白酶解位点基序内或附近，只要达到突变目的（即只要改变在位点上的蛋白酶解）。

突变型核苷酸序列可以编码显示改善或减少的杀昆虫活性的突变型杀昆虫毒素，或对包含其的多肽赋予改善或减少的杀昆虫活性的氨基酸序列。如本文使用的，在蛋白质、多肽或氨基酸序列背景中，术语“突变型”或“突变”指已诱变处理或改变以包含一个或多个氨基酸残基的序列，所述氨基酸残基不存在于相应野生型序列中。此种诱变或改变由氨基酸残基的一个或多个添加、缺失、或取代或置换组成。突变型多肽显示改善或减少的杀昆虫活性，或代表对包含其的多肽赋予改善的杀昆虫活性的氨基酸序列。因此，术语“突变型”或“突变”指突变型核苷酸序列和编码的氨基酸之一或两者。突变型可以单独或与实施方案的其他突变型或其他突变型以任何相容组合使用。“突变型多肽”可以相反地显示杀昆虫活性中的减少。当超过一个突变加入特定核酸或蛋白质时，突变可以同时或顺次加入；如果顺次，那么突变可以以任何合适次序加入。

如本文使用的，术语“改善的杀昆虫活性”或“改善的杀虫活性”指实施方案的杀昆虫多肽，相对于其相应野生型蛋白质的活性，其具有增强的杀昆虫活性，和/或针对更广泛范围的昆虫有效的杀昆虫多肽，和/或对于昆虫具有特异性的杀昆虫多肽，所述昆虫对野生型蛋白质的毒性不易感。改善或增强的杀虫活性的发现要求相对于针对相同昆虫测定的野生型杀昆虫多肽的杀虫活性，显示针对昆虫靶至少10％的杀虫活性增加，或至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％或300％或更大的杀虫活性增加。

例如，提供了改善的杀虫或杀昆虫活性，其中相对于受野生型Bt毒素影响的昆虫范围，更广泛或更狭窄范围的昆虫受多肽影响。当需要通用性时，更广泛范围的影响可能是希望的，而当例如有益昆虫可能以其他方式受毒素的使用或存在影响时，更狭窄范围的影响可能是希望的。虽然实施方案不受任何特定作用机制的束缚，但改善的杀虫活性也可以通过多肽的一种或多种特征中的改变提供；例如相对于相应野生型蛋白质的稳定性或寿命，多肽在昆虫肠中的稳定性或寿命可以得到增加。

如本文使用的，术语“毒素”指显示杀虫活性或杀昆虫活性或改善的杀虫活性或改善的杀昆虫活性的多肽。“Bt”或“苏云金芽孢杆菌”毒素意欲包括在各种Bt菌株中发现的更广泛类别的Cry毒素，这包括此种毒素如例如Cry1s、Cry2s或Cry3s。

术语“蛋白酶解位点”或“切割位点”指这样的氨基酸序列，其赋予对于一类蛋白酶或特定蛋白酶的敏感性，从而使得包含氨基酸序列的多肽由该类蛋白酶或特定蛋白酶消化。蛋白酶解位点被说成对于识别该位点的一种或多种蛋白酶是“敏感的”。本领域认识到消化效率将变化，并且消化效率中的减少可以导致多肽在昆虫肠中的稳定性或寿命中的增加。因此，蛋白酶解位点可以赋予对于超过一种蛋白酶或一类蛋白酶的敏感性，但在那个位点由各种蛋白酶的消化效率可以不同。蛋白酶解位点包括例如胰蛋白酶位点、胰凝乳蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。

研究已显示鳞翅目的昆虫肠蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。参见例如，Lenz等人（1991）Arch. Insect Biochem. Physiol. 16 ： 201-212 ；和 Hedegus 等人（ 2003 ） Arch. Insect Biochem. Physiol. 53：30-47。例如，约18种不同胰蛋白酶已在棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫中肠中发现（参见Gatehouse等人（1997）Insect Biochem. Mol. Biol. 27：929-944）。这些蛋白酶的优选蛋白酶解底物位点已得到研究。参见例如，Peterson等人（1995）Insect Biochem. Mol. Biol. 25：765-774。

已做出努力以理解Bt毒素的作用机制并且工程改造具有改善性质的毒素。已显示昆虫肠蛋白酶可以影响Bt Cry蛋白质对昆虫的影响。一些蛋白酶通过将Cry蛋白质从“毒素原”形式加工成毒性形式或“毒素”而将其激活。参见Oppert（1999）Arch. Insect Biochem. Phys. 42：1-12；和Carroll等人（1997）J. Invertebrate Pathology 70：41-49。毒素的这种激活可以包括从蛋白质中去除N和C末端肽，并且还可以包括蛋白质的内部切割。其他蛋白酶可以降解Cry蛋白质。参见Oppert，同上。

具有不同特异性的Cry毒素的氨基酸序列比较揭示5个高度保守的序列区段(block)。在结构上，毒素包括3个独特结构域，其从N到C末端是：牵涉于孔形成的7α螺旋簇（被称为“结构域1”）、牵涉于细胞结合的3个反平行β折叠（被称为“结构域2”）、和β夹心（被称为“结构域3”）。这些结构域的位置和性质是本领域技术人员已知的。参见例如，Li等人（1991）Nature ，305:815-821和Morse等人（2001）Structure，9:409-417。当提及特定结构域例如结构域1时，应当理解就特定序列而言的结构域的确切终点并不关键，只要序列或其部分包括提供归因于特定结构域的至少一些功能的序列。因此，例如当提及“结构域1”时，意指特定序列包括7α螺旋簇，但就该簇而言使用或提及的序列的确切终点并不关键。本领域技术人员熟悉此种终点的测定和此种功能的评价。

在更佳表征且改善Bt毒素的努力中，研究了细菌Bt的菌株。发现由Bt菌株培养物制备的晶体制剂具有针对玉米螟的杀虫活性（参见例如实验实施例1）。采取努力以鉴定编码来自所选菌株的晶体蛋白质的核苷酸序列，并且从这些细菌菌株中分离实施方案的野生型（即天然存在的）核酸，克隆到表达载体内，并且转化到大肠杆菌（E coli）内。依赖于给定制剂的特征，认识到杀虫活性的证实有时需要胰蛋白酶预处理，以激活杀虫蛋白质。因此，应当理解一些杀虫蛋白质需要蛋白酶消化（例如通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等）用于激活，而其他蛋白质在不存在激活的情况下是生物学活性的（例如杀虫的）。

此种分子可以通过例如于2003年6月25日提交的美国申请号10/606,320和于2003年12月24日提交的10/746,914中所述的方法加以改变。此外，核酸序列可以工程改造为编码包含另外突变的多肽，相对于天然存在的多肽的杀虫活性，所述另外突变赋予改善或改变的杀虫活性。此种工程改造的核酸的核苷酸序列包括在野生型序列中未发现的突变。

实施方案的突变型多肽一般通过包括下述步骤的方法进行制备：获得编码Cry家族多肽的核酸序列；基于靶结构域在毒素作用方式中的提议功能的考虑，分析多肽的结构以鉴定基础基因序列用于诱变的特定“靶”位点；将一个或多个突变引入核酸序列中，以产生所编码多肽序列的一个或多个氨基酸残基中的所需改变；并且就杀虫活性测定产生的多肽。

许多Bt杀昆虫毒素通过其氨基酸序列和三级结构中的相似性相关至各种程度，并且用于获得Bt毒素的晶体结构的方法是众所周知的。Cry3A和Cry3B多肽的示例性高分辨率晶体结构解决在参考文献中可获得。Cry3A基因的解决的结构（Li等人（1991）Nature 353:815-821）了解了毒素的结构和功能之间的关系。Bt毒素所公开的结构分析和与特定结构、基序等相关的报道的功能的组合考虑指出毒素的特定区域与蛋白质作用方式的特定功能和分立的步骤相关。例如，从Bt中分离的许多毒素一般描述为包括3个结构域：与孔形成有关的7螺旋束、已牵涉于受体结合的3折叠结构域、和β夹心基序（Li等人（1991）Nature 305：815-821）。

如美国专利号7,105,332和于2003年12月24日提交的未决的美国申请号10/746,914中报道的，Cry蛋白质的毒性可以通过靶向位于毒素结构域1的α螺旋3和4之间的区域得到改善。这个理论的前提为关于杀昆虫毒素的大量知识，包括：1）已报道Cry3A毒素结构域1的α螺旋4和5插入衬在易感昆虫中肠里的细胞的脂双层内（Gazit等人（1998）Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95：12289-12294）；2）本发明人对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位点在野生型蛋白质的氨基酸序列内的位置的了解；3）在通过胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理的体外激活后，野生型蛋白质针对特定昆虫更有活性的观察；和4）毒素从3'末端消化导致对于昆虫的毒性减少的报道。

可以产生一系列突变且将其置于多种背景序列中，以产生具有增强或改变的杀虫活性的新多肽。参见例如，于2003年6月25日提交、现在放弃的美国申请号10/606,320；和于2003年12月24日提交的10/746,914。这些突变包括但不限于：在位于结构域1的螺旋3和4之间的区域中至少一个更加蛋白酶敏感的位点（例如胰蛋白酶切割位点）的添加；野生型序列中的原始蛋白酶敏感位点由不同蛋白酶敏感位点的置换；在特定位置中多个蛋白酶敏感位点的添加；接近一个或多个蛋白酶敏感位点的氨基酸残基的添加，以改变多肽的折叠且因此增强多肽在一个或多个蛋白酶敏感位点的消化；和添加突变以保护多肽不受减少毒性的降解性消化（例如制备一系列突变，其中野生型氨基酸由缬氨酸置换，以保护多肽不受消化）。突变可以单独或以任何组合使用，以提供实施方案的多肽。

以这种方式，实施方案提供了包括多种突变的序列，例如包括定位于所编码多肽结构域1的α螺旋3和4之间的另外或可替代蛋白酶敏感位点的突变。其为另外或可替代蛋白酶敏感位点的突变可以对几类蛋白酶或酶例如弹性蛋白酶敏感，所述几类蛋白酶例如丝氨酸蛋白酶，其包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。因此，其为另外或可替代蛋白酶敏感位点的突变可以这样设计，从而使得位点容易由一类蛋白酶识别和/或切割，所述蛋白酶例如哺乳动物蛋白酶或昆虫蛋白酶。蛋白酶敏感位点还可以设计为由已知在生物中产生的特定类别的酶或特定酶切割，例如由谷实夜蛾Heliothis zea产生的胰凝乳蛋白酶（Lenz等人（1991）Arch. Insect Biochem. Physiol. 16：201-212）。突变还可以赋予对于蛋白酶解消化的抗性，例如对于在肽的C末端通过胰凝乳蛋白酶的消化。

在所编码多肽的氨基酸序列中的另外和/或可替代蛋白酶敏感位点的存在可以改善由实施方案的核酸编码的多肽的杀虫活性和/或特异性。因此，实施方案的核苷酸序列可以进行重组工程改造或操作，以产生与未修饰的野生型毒素的那种相比较，具有改善或改变的杀昆虫活性和/或特异性的多肽。此外，本文公开的突变可以置于其他核苷酸序列中或与其他核苷酸序列结合使用，以提供改善的性质。例如，通过昆虫胰凝乳蛋白酶例如在蓓带夜蛾或谷实夜蛾中发现的胰凝乳蛋白酶（Hegedus等人（2003）Arch. Insect Biochem. Physiol. 53：30-47；和Lenz等人（1991）Arch. Insect Biochem. Physiol. 16：201-212）容易切割的蛋白酶敏感位点，可以置于Cry背景序列中，以提供对于那个序列改善的毒性。以这种方式，实施方案提供了具有改善的性质的毒性多肽。

例如，诱变处理的Cry核苷酸序列可以包括另外突变体，其包括将第二个胰蛋白酶敏感的氨基酸序列（除天然存在的胰蛋白酶位点外）引入所编码多肽内的另外密码子。实施方案的可替代添加突变体包括设计为将至少一个另外不同的蛋白酶敏感位点引入多肽内的另外密码子，例如紧接地位于天然存在的胰蛋白酶位点5'或3'的胰凝乳蛋白酶敏感位点。可替代地，可以产生取代突变体，其中破坏编码天然存在的蛋白酶敏感位点的核酸的至少一个密码子，并且将可替代密码子引入核酸序列内，以提供不同（例如取代）蛋白酶敏感位点。置换突变体也可以添加到Cry序列中，其中破坏存在于所编码多肽中的天然存在的胰蛋白酶切割位点，并且在其位置中引入胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶切割位点。

认识到可以使用编码其为蛋白酶解位点或推定的蛋白酶解位点的氨基酸序列（例如序列如NGSR、RR或LKM）的任何核苷酸序列，并且用于将这些切割位点中的任何一种引入变体多肽内的密码子的确切特性可以依赖于用途即在特定植物物种中的表达而改变。还认识到所公开突变中的任何一种可以引入实施方案的任何多核苷酸序列内，其包括关于氨基酸残基的密码子，所述氨基酸残基提供靶向用于修饰的自然胰蛋白酶切割位点。因此，全长毒素或其片段的变体可以进行修饰，以包含另外或可替代切割位点，并且这些实施方案预期由本文公开的实施方案的范围包含。

本领域技术人员将认识到任何有用突变可以添加到实施方案的序列中，只要所编码多肽保留杀虫活性。因此，序列还可以这样进行突变，从而使得所编码多肽对通过胰凝乳蛋白酶的蛋白酶解消化是抗性的。超过一个识别位点可以以任何组合添加到特定位置中，并且多个识别位点可以添加到毒素中或从毒素中去除。因此，另外突变可以包括3、4个或更多个识别位点。应认识到多个突变可以在任何合适多核苷酸序列中进行工程改造；因此，全长序列或其片段可以进行修饰，以包含另外或可替代切割位点，以及对于蛋白酶解消化是抗性的。以这种方式，实施方案提供了包含改善杀虫活性的突变的Cry毒素，以及使用其他Bt毒素用于影响害虫的改善的组合物和方法。

突变可以保护多肽不受蛋白酶降解，例如通过去除来自不同区域的推定的蛋白酶解位点，例如推定的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点。此种推定的位点中的一些或所有可以这样去除或改变，从而使得减少在原始位点的位置的蛋白酶解。通过比较突变型多肽与野生型毒素、或通过比较在其氨基酸序列中不同的突变型毒素，可以评估蛋白酶解中的变化。推定的蛋白酶解位点和蛋白酶解位点包括但不限于下述序列：RR，胰蛋白酶切割位点；LKM，胰凝乳蛋白酶位点；和NGSR，胰蛋白酶位点。这些位点可以通过任何数目和种类的氨基酸残基的添加或缺失加以改变，只要多肽的杀虫活性得到增加。因此，相对于自然或背景序列，由包括突变的核苷酸序列编码的多肽将包括至少一个氨基酸改变或添加，或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270或280个或更多个氨基酸改变或添加。多肽的杀虫活性还可以通过自然或全长序列的平截加以改善，如本领域已知的。

实施方案的组合物包括编码杀虫多肽的核酸、及其片段和变体。特别地，实施方案提供了分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，及其片段和变体。

还使人感兴趣的是编码实施方案的杀虫蛋白质的最佳化的核苷酸序列。如本文使用的，短语“最佳化的核苷酸序列”指对于在特定生物例如植物中的表达最佳化的核酸。最佳化的核苷酸序列可以使用本领域已知的方法对于任何目的生物进行制备。参见例如，于2003年6月25日提交、现在放弃的美国申请号10/606,320，和于2003年12月24日提交的10/746,914，其描述了编码所公开的杀虫蛋白质的最佳化的核苷酸序列。在这个例子中，核苷酸序列通过反向翻译蛋白质的氨基酸序列且改变核苷酸序列进行制备，以便包括玉蜀黍优选的密码子，同时仍编码相同氨基酸序列。这个程序由Murray等人（1989）Nucleic Acids Res. 17:477-498更详细地描述。最佳化的核苷酸序列在增加杀虫蛋白质在植物中的表达中有用，所述植物例如禾本科(Gramineae)（禾本科(Poaceae)）的单子叶植物，例如玉蜀黍或玉米植物。

实施方案进一步提供了由实施方案的天然存在或修饰的核酸编码的分离的杀虫（例如杀昆虫）多肽。更具体而言，实施方案提供了包括SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的多肽，和由本文描述的核酸编码的多肽，例如SEQ ID NO：1中所示的那些，及其片段和变体。

在特定实施方案中，实施方案的杀虫蛋白质提供了全长杀昆虫多肽、全长杀昆虫多肽的片段、和通过设计为将特定氨基酸序列引入实施方案的多肽内的诱变处理的核酸产生的变体多肽。在特定实施方案中，引入多肽内的氨基酸序列包括提供了关于酶例如蛋白酶的切割位点的序列。

本领域已知Bt毒素的杀虫活性一般通过肽在昆虫肠中由各种蛋白酶的切割得到激活。因为肽可能不总是以完全效率在昆虫肠中切割，所以与全长毒素自身相比较，全长毒素的片段可以具有增强的杀虫活性。因此，实施方案的一些多肽包括全长杀昆虫多肽的片段，并且相对于它们由其衍生的天然存在的杀昆虫多肽的活性，一些多肽片段、变体和突变将具有增强的杀虫活性，特别是如果在就活性筛选前天然存在的杀昆虫多肽在体外不由蛋白酶激活的话。因此，本申请包含序列的截短形式或片段。

突变可以置于任何背景序列内，包括此种截短的多肽，只要多肽保留杀虫活性。使用本领域已知或本文其他地方描述的测定，本领域技术人员可以关于杀虫活性容易地比较2种或更多种蛋白质。应当理解实施方案的多肽可以通过本文公开的核酸的表达或通过使用标准分子生物学技术产生。

认识到杀虫蛋白质可以是寡聚的，并且将在分子量、残基数目、组分肽、针对特定害虫的活性和其他特征方面不同。然而，通过本文阐述的方法，可以分离且表征针对多种害虫有活性的蛋白质。实施方案的杀虫蛋白质可以与其他Bt毒素或其他杀昆虫蛋白质组合使用，以增加昆虫靶范围。此外，实施方案的杀虫蛋白质与具有不同性质的其他Bt毒素或其他杀昆虫原理组合使用对于昆虫抗性的预防和/或管理具有特定效用。其他杀昆虫试剂包括蛋白酶抑制剂（丝氨酸和半胱氨酸类型）、α-淀粉酶和过氧化物酶。

核苷酸和由其编码的氨基酸序列及多肽的片段和变体也由实施方案包含。如本文使用的，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的部分或多肽的氨基酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以编码保留自然或相应全长蛋白质的生物学活性且因此具有杀虫活性的蛋白质片段。因此，认识到实施方案的一些多核苷酸和氨基酸序列可以被正确地称为片段和突变体。

应当理解术语“片段”当其用于指实施方案的核酸序列时，还包含作为杂交探针有用的序列。这类核苷酸序列一般不编码保留生物学活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段可以范围为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、和最高达编码实施方案的蛋白质的全长核苷酸序列。

编码实施方案的杀虫蛋白质的生物学活性部分的实施方案的核苷酸序列片段将编码至少15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100或1,200个邻接氨基酸，或最高达实施方案的杀虫多肽中存在的氨基酸总数目（例如对于SEQ ID NO：2的1058个氨基酸）。因此，应当理解实施方案还包含这样的多肽，其为实施方案的示例性杀虫蛋白质的片段，且具有至少15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100或1,200个邻接氨基酸，或最高达实施方案的杀虫多肽中存在的氨基酸总数目（例如对于SEQ ID NO：2的1058个氨基酸）的长度。作为杂交探针或PCR引物有用的实施方案的核苷酸序列片段一般无需编码杀虫蛋白质的生物学活性部分。因此，实施方案的核酸片段可以编码杀虫蛋白质的生物学活性部分，或它可以是可使用本文公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。杀虫蛋白质的生物学活性部分可以通过下述进行制备：分离实施方案的核苷酸序列之一的部分，表达杀虫蛋白质的编码部分（例如通过体外重组表达），且评估杀虫蛋白质的编码部分的活性。

其为实施方案的核苷酸序列片段的核酸包括至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1,000、1,200、1,400、1,600、1,800或2,000个核苷酸，或最高达本文公开的核苷酸序列中存在的核苷酸数目（例如对于SEQ ID NO：1的3174个核苷酸）。特定实施方案预想了衍生自（例如由其产生）实施方案的第一种核酸的片段，其中所述片段编码特征在于杀虫活性的截短的毒素。由实施方案的多核苷酸片段编码的截短多肽特征在于，相对于通过片段由其衍生的第一种核酸编码的相应全长多肽的活性，等价或改善的杀虫活性。预想实施方案的此种核酸片段可以在自然或相应全长编码序列的3'末端上截短。核酸片段还可以在自然或相应全长编码序列的5'和3'末端上截短。

术语“变体”在本文中用于指基本上相似的序列。对于核苷酸序列，保守变体包括由于遗传密码的简并性，编码实施方案的杀虫多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体例如这些可以借助于众所周知的分子生物学技术进行鉴定，例如如本文概述的聚合酶链反应（PCR）和杂交技术。

变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用位点定向诱变生成，但仍编码实施方案的杀虫蛋白质，例如突变型毒素的那些。一般地，实施方案的特定核苷酸序列的变体将与那种特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性，如通过本文其他地方描述的序列比对程序使用缺省参数测定的。实施方案的核苷酸序列的变体可以与那种序列相差少至1-15个核苷酸，少至1-10例如6-10，少至5，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

实施方案的特定核苷酸序列的变体（即示例性核苷酸序列）还可以通过比较由变体核苷酸序列编码的多肽和由参考核苷酸序列编码的多肽之间的百分比序列同一性进行评价。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO：2的多肽具有给定百分比序列同一性的多肽的分离的核酸。在任何2个多肽之间的百分比序列同一性可以使用本文其他地方描述的序列比对程序使用缺省参数进行计算。当实施方案的任何给定多核苷酸对通过由它们编码的2个多肽共享的百分比序列同一性比较进行评价时，2个所编码多肽之间的百分比序列同一性是至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％，一般至少约75％、80％、85％，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，或至少约98％、99％或更多序列同一性。

如本文使用的，术语“变体蛋白质”包含通过下述衍生自自然蛋白质的多肽：对于自然蛋白质的N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸的缺失（所谓的平截）或添加；在自然蛋白质中的一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的缺失或添加；或在自然蛋白质中的一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的取代。因此，术语“变体蛋白质”包含自然蛋白质的生物学活性片段，其包括足够数目的邻接氨基酸残基，以保留自然蛋白质的生物学活性，即具有杀虫活性。相对于自然蛋白质，此种杀虫活性可以是不同或改善的，或它可以是未改变的，只要杀虫活性被保留。

由实施方案包含的变体蛋白质是生物学活性的，即它们继续具有自然蛋白质的所需生物学活性，即如本文描述的杀虫活性。此种变体可以起因于例如遗传多态性或人为操作。实施方案的自然杀虫蛋白质的生物学活性变体将与自然蛋白质的氨基酸序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性，如通过本文其他地方描述的序列比对程序使用缺省参数测定的。实施方案的蛋白质的生物学活性变体可以与那种蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10例如6-10，少至5，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。

实施方案进一步包含用实施方案的至少一种核酸、包括核酸的表达盒、或包括表达盒的载体转化的微生物。在一些实施方案中，微生物是在植物上繁殖的那种。本发明的实施方案涉及被囊化的杀虫蛋白质，其包含能够表达实施方案的至少一种杀虫蛋白质的转化的微生物。

实施方案提供了包括实施方案的转化的微生物的杀虫组合物。在此种实施方案中，转化的微生物一般连同合适载体一起，以杀虫有效量存在于杀虫组合物中。实施方案还包含杀虫组合物，其包括连同合适的载体一起，以杀昆虫有效量，单独或与实施方案的转化的生物和/或实施方案的被囊化的杀虫蛋白质组合的实施方案的分离的蛋白质。

实施方案进一步提供了通过使用与至少一种其他或“第二种”杀虫蛋白质组合的实施方案的杀虫蛋白质增加昆虫靶范围的方法。本领域已知的任何杀虫蛋白质都可以在实施方案的方法中采用。此种杀虫蛋白质包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶和过氧化物酶。

实施方案还包含包括实施方案的至少一种核苷酸序列的转化的或转基因植物。在一些实施方案中，植物用核苷酸构建体稳定转化，所述核苷酸构建体包括与启动子可操作地连接的实施方案的至少一种核苷酸序列，所述启动子驱动在植物细胞中的表达。如本文使用的，术语“转化的植物”和“转基因植物”指在其基因组内包括异源多核苷酸的植物。一般地，异源多核苷酸在转基因或转化的植物的基因组内稳定整合，从而使得多核苷酸传递给连续世代。异源多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的部分整合到基因组内。

应当理解如本文使用的，术语“转基因的”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型已通过异源核酸的存在加以改变，包括最初如此改变的那些转基因生物以及通过有性杂交或无性繁殖由最初转基因生物产生的那些。如本文使用的，术语“转基因的”不包含通过常规植物育种方法或通过天然存在的事件的基因组改变（染色体或染色体外的），所述天然存在的事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

如本文使用的，术语“植物”包括全植物、植物器官（例如叶、茎、根等）、种子、植物细胞及其后代。转基因植物的部分在实施方案的范围内，并且包括例如源于先前用实施方案的DNA分子转化的转基因植物或其后代且因此至少部分由转基因细胞组成的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根。

如本文使用的，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和植物细胞，其在植物或植物的部分中是完整的，例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药等。可以在实施方案的方法中使用的植物类别一般与适合于转化技术的高等植物类别一样广泛，包括单子叶和双子叶植物。此种植物包括例如马铃薯（Solanum tuberosum）和玉蜀黍（Zea mays）。

虽然实施方案不依赖于特定生物学机制用于增加植物对植物害虫的抗性，但实施方案的核苷酸序列在植物中的表达可以导致实施方案的杀虫蛋白质的产生和植物对植物害虫的抗性中的增加。实施方案的植物在农业中在用于影响昆虫害虫的方法中有用。特定实施方案提供了转化的作物植物，例如玉蜀黍植物，其在用于影响植物的昆虫害虫例如玉米螟的方法中有用。

“主题植物或植物细胞”是其中已就目的基因而言实现遗传改变例如转化的那种，或由如此改变的植物或细胞遗传且包括改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量主题植物或植物细胞的表型中的改变的参考点。

对照植物或植物细胞可以包括例如：（a）野生型植物或细胞，即具有与用于遗传改变的原材料相同的基因型，所述遗传改变导致主题植物或细胞；（b）具有与原材料相同的基因型但已用无效构建体（即用对目的性状不具有已知作用的构建体，例如包括标记基因的构建体）转化的植物或植物细胞；（c）在主题植物或植物细胞的后代中其为非转化分离子的植物或植物细胞；（d）在遗传上等同于主题植物或植物细胞但不暴露于将诱导目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或（e）在其中目的基因不表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。

本领域技术人员将容易确认在分子生物学领域中的进展例如位点特异性和随机诱变、聚合酶链反应方法和蛋白质工程改造技术，提供了适合于用于改变或工程改造有农业价值的蛋白质的氨基酸序列和基础遗传序列的工具和规程的广泛集合。

因此，实施方案的蛋白质可以以各种方式加以改变，包括氨基酸取代、缺失、平截和插入。用于此种操作的方法是本领域一般已知的。例如，杀虫蛋白质的氨基酸序列变体可以通过将突变引入合成核酸（例如DNA分子）内进行制备。用于诱变和核酸改变的方法是本领域众所周知的。例如，设计的改变可以使用寡核苷酸介导的位点定向诱变技术引入。参见例如，Kunkel（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492；Kunkel等人（1987）Methods in Enzymol. 154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，编辑（1983）Techniques in Molecular Biology（MacMillan Publishing Company，New York）和其中引用的参考文献。

实施方案的诱变处理的核苷酸序列可以如此修饰，以便改变所编码的多肽的一级序列中存在的约1、2、3、4、5、6、8、10、12个或更多个氨基酸。可替代地，来自自然序列的甚至更多改变可以这样引入，从而使得与相应野生型蛋白质相比较，所编码的蛋白质可以具有至少约1％或2％，或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％，或甚至约13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％、21％、22％、23％、24％或25％、30％、35％或40％或更多改变或以其他方式修饰的密码子。以相同方式，与相应野生型蛋白质相比较，所编码的蛋白质可以具有至少约1％或2％，或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％，或甚至约13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％、21％、22％、23％、24％或25％、30％、35％或40％或更多另外的密码子。应当理解实施方案的诱变处理的核苷酸序列意欲包含生物学功能的等价肽，其具有杀虫活性，例如改善的杀虫活性，如通过针对玉米螟幼虫的拒食剂性质测定的。此种序列可以由于已知在核酸序列和因此编码的蛋白质内天然存在的密码子冗余和功能等价性而出现。

本领域技术人员可认识到氨基酸添加和/或取代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性氨基酸取代组是本领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

关于不影响目的蛋白质的生物学活性的合适氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人（1978）Atlas of Protein Sequence and Structure（Natl. Biomed. Res. Found.，Washington，D.C.）的模型中找到，其引入本文作为参考。可以进行保守取代例如用具有相似性质的另一个交换一个氨基酸。

因此，实施方案的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列和突变体形式。同样地，实施方案的蛋白质包含天然存在的蛋白质和其变异（例如截短的多肽）及修饰（例如突变体）形式。此种变体将继续具有所需杀虫活性。明显地，在编码变体的核苷酸序列中将进行的突变必须不将序列置于阅读框外，并且一般不产生将产生二级mRNA结构的互补区。参见，EP专利申请公开号75,444。

本文包含的蛋白质序列的缺失、插入和取代不期望产生蛋白质特征中的根本改变。然而，当在这样做之前难以预测取代、缺失或插入的确切作用时，本领域技术人员将认识到作用将通过常规筛选测定例如昆虫摄食测定进行评价。参见例如，Marrone等人（1985）J. Econ. Entomol. 78：290-293和Czapla和Lang（1990）J. Econ. Entomol. 83：2480-2485，其引入本文作为参考。

变体核苷酸序列和蛋白质还包含衍生自诱变和重组程序例如DNA改组的序列和蛋白质。用此种程序，一个或多个不同编码序列可以进行操作，以产生具有所需性质的新杀虫蛋白质。以这种方式，由包括序列区域的相关序列多核苷酸群体生成重组多核苷酸的文库，所述序列区域具有基本序列同一性，并且可以在体外或体内同源重组。例如，使用这种方法，全长编码序列、编码目的结构域的序列基序、或实施方案的核苷酸序列的任何片段可以在实施方案的核苷酸序列和其他已知Cry核苷酸序列的相应部分之间改组，以获得编码具有改善的目的性质的蛋白质的新基因。

目的性质包括但不限于杀虫活性/单位的杀虫蛋白质、蛋白质稳定性和对于表达实施方案的杀虫多肽的非靶物种的毒性，所述非靶物种特别是人、家畜以及植物和微生物。实施方案不受特定改组策略束缚，仅实施方案的至少一种核苷酸序列或其部分与此种改组策略有关。改组可以仅涉及本文公开的核苷酸序列，或可以另外涉及本领域已知的其他核苷酸序列的改组。用于DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如，Stemmer（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751；Stemmer（1994）Nature 370:389-391；Crameri等人（1997）Nature Biotech. 15:436-438；Moore等人（1997）J. Mol. Biol. 272:336-347；Zhang等人（ 1997 ） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509；Crameri等人（1998）Nature 391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

实施方案的核苷酸序列还可以用于分离来自其他生物的相应序列，所述其他生物特别是其他细菌，且更特别是其他芽孢杆菌属菌株。以这种方式，基于其与本文所述序列的序列同源性，诸如PCR、杂交等的方法可以用于鉴定此种序列。基于其与本文所述完整序列或其片段的序列同一性选择的序列由实施方案包含。此种序列包括其为所公开序列的直向同源物的序列。术语“直向同源物”指衍生自共同祖先基因和由于物种形成而在不同物种中发现的基因。当其核苷酸序列和/或其编码的蛋白质序列共享如本文其他地方定义的基本同一性时，在不同物种中发现的基因被视为直向同源物。直向同源物的功能在物种中经常是高度保守的。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于在PCR反应中使用，以扩增来自从任何目的生物中提取的cDNA或基因组DNA的相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域一般已知的，并且公开于Sambrook等人（1989）Molecular Cloning ： A Laboratory Manual（第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York），下文中 "Sambrook"中。还参见Innis等人，编辑（1990）PCR Protocols ： A Guide to Methods and Applications（Academic Press，New York）；Innis和Gelfand，编辑（1995）PCR Strategies（Academic Press，New York）；以及Innis和Gelfand，编辑（1999）PCR Methods Manual（Academic Press，New York）。PCR的已知方法包括但不限于使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配的引物等的方法。

在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分用作探针，其与来自所选生物的经克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群体（即基因组或cDNA文库）中存在的其他相应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，或可以用可检测基团例如³²P或任何其他可检测标记进行标记。因此，例如基于实施方案的序列，用于杂交的探针可以通过标记合成的寡核苷酸进行制备。用于制备探针用于杂交和用于构建cDNA和基因组文库的方法是本领域一般已知的且公开于Sambrook中。

例如，本文公开的完整序列或其一个或多个部分可以用作能够与相应序列和信使RNAs选择性杂交的探针。为了达到在多种条件下的特异性杂交，此种探针包括对于实施方案的序列独特且一般长度至少约10或20个核苷酸的序列。此种探针可以用于通过PCR扩增来自所选生物的相应Cry序列。这种技术可以用于从所需生物中分离另外的编码序列，或用作诊断测定以测定在生物中编码序列的存在。杂交技术包括铺平板的DNA文库的杂交筛选（蚀斑或菌落；参见例如Sambrook）。

此种序列的杂交可以在严格条件下执行。如本文使用的，术语“严格条件”或“严格杂交条件”指在其下探针将与其靶序列杂交至比与其他序列可检测地更大的程度（例如超过本底至少2倍、5倍或10倍）的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境中将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列（同源探测）。可替代地，可以调整严格条件，以允许序列中的一些错配，从而使得检测到更低程度的相似性（异源探测）。一般地，探针长度小于约1000或500个核苷酸。

一般地，严格条件将是这样的，其中盐浓度是在pH 7.0 - 8.3小于约1.5 M Na离子，一般约0.01 - 1.0 M Na离子浓度（或其他盐），并且温度对于短探针（例如10 – 50个核苷酸）是至少约30℃，并且对于长探针（例如大于50个核苷酸）是至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。示例性低严格条件包括在37℃用30 - 35％甲酰胺、1 M NaCl、1％SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液的杂交，和在50 – 55℃在1X - 2X SSC（20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M柠檬酸三钠）中的洗涤。示例性中等严格条件包括在37℃在40 - 45％甲酰胺、1.0 M NaCl、1％SDS中的杂交，和在55 – 60℃在0.5X - 1X SSC中的洗涤。示例性高严格条件包括在37℃在50％甲酰胺、1 M NaCl、1％SDS中的杂交，和在60 – 65℃在0.1X SSC中至少约20分钟的最终洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包括约0.1％- 约1％SDS。杂交的持续时间一般小于约24小时，通常约4小时 – 约12小时。

特异性一般是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交物，T_m（热解链温度）可以根据Meinkoth和Wahl（1984）Anal. Biochem. 138:267-284的等式约计：T_m = 81.5℃ + 16.6（log M）+ 0.41（％GC）- 0.61（％form）- 500/L；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，“％form”是杂交溶液中的甲酰胺百分比，并且L是以碱基对表示的杂交物长度。T_m是在其下50％互补靶序列与完全配对的探针杂交的温度（在限定离子强度和pH下）。洗涤一般执行至少直至达到平衡，并且达到杂交的低本底水平，例如2小时、1小时或30分钟。

T_m对于每1％的错配减少约1℃；因此，可以调整T_m、杂交和/或洗涤条件，以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有>90％同一性的序列，那么T_m可以降低10℃。一般地，严格条件选择为低于在限定离子强度和pH关于特异性序列及其互补体的T_m约5℃。然而，重度严格条件可以利用在低于T_m 1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在低于T_m 6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在低于T_m 11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。

使用等式、杂交和洗涤组成和所需T_m，普通技术人员将理解在杂交和/或洗涤溶液的严格性中的变异得到固有描述。如果所需错配程度导致低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液）的T_m，那么SSC浓度可以如此增加，从而使得可以使用更高的温度。关于核酸杂交的广泛指导在Tijssen（1993）Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes ，Part I，第2章（Elsevier，New York）；和Ausubel等人，编辑（1995）Current Protocols in Molecular Biology，第2章（Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York）中找到。还参见Sambrook。因此，编码实施方案的Cry蛋白质且在严格条件下与本文公开的Cry序列或其片段杂交的分离序列由实施方案包含。

下述术语用于描述2个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：（a）“参考序列”、（b）“比较窗”、（c）“序列同一性”、（d）“序列同一性百分比”和（e）“基本同一性”。

（a）如本文使用的，“参考序列”是用作用于序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的亚群或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段、或完整cDNA或基因序列。

（b）如本文使用的，“比较窗”提及多核苷酸序列的邻接和指定区段，其中对于2个序列的最佳比对与参考序列（其不包括添加或缺失）相比较，比较窗中的多核苷酸序列可以包括添加或缺失（即缺口）。一般地，比较窗长度是至少20个邻接核苷酸，并且任选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域技术人员理解为了避免由于在多核苷酸序列中包括缺口与参考序列的高相似性，一般引入缺口罚分且从匹配数目中扣除。

用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。因此，任何2个序列之间的百分比序列同一性的测定可以使用数学算法来完成。此种数学算法的非限制性例子是Myers和Miller（1988）CABIOS 4:11-17的算法；Smith等人（1981）Adv. Appl. Math. 2:482的局部比对算法；Needleman和Wunsch（1970）J. Mol. Biol. 48:443-453的总体比对算法；Pearson和Lipman（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448的探索局部比对(search-for-local alignment)方法；Karlin和Altschul（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264的算法，如Karlin和Altschul（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中修饰的。

这些数学算法的计算机实现可以用于比较序列以测定序列同一性。此种实现包括但不限于：PC/Gene程序（可从Intelligenetics，Mountain View，California获得）中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software Package，版本10（可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA获得）中的ALIGN程序（版本2.0）以及GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用缺省参数执行。CLUSTAL程序由Higgins等人（1988）Gene 73:237-244（1988）；Higgins等人（1989）CABIOS 5:151-153；Corpet等人（1988）Nucleic Acids Res. 16:10881-90；Huang等人（1992）CABIOS 8:155-65；和Pearson等人（1994）Meth. Mol. Biol. 24:307-331充分描述。ALIGN程序基于Myers和Miller（1988）同上的算法。当比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4可以与ALIGN程序一起使用。Altschul等人（1990）J. Mol. Biol. 215:403的BLAST程序基于Karlin和Altschul（1990）同上的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分= 100、字长(wordlength)= 12执行，以获得与编码实施方案的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分= 50、字长= 3执行，以获得与实施方案的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口比对，Gapped BLAST（在BLAST 2.0中）可以如Altschul等人（1997）Nucleic Acids Res. 25:3389中所述利用。可替代地，PSI-BLAST（在BLAST 2.0中）可用于执行迭代搜索，其检测分子之间的遥远关系。参见Altschul等人（1997）同上。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序的缺省参数（例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质）。参见在环球网上在ncbi.hlm.nih.gov的美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）网站。比对还可以通过检查手工执行。

除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10使用下述参数获得的值：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用缺口权重50和长度权重3、和nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性和％相似性，使用缺口权重8和长度权重2、和BLOSUM62评分矩阵；或其任何等价程序。如本文使用的，术语“等价程序”指任何序列比较程序，对于正被讨论的任何2个序列，当与通过GAP版本10生成的相应比对相比较时，其生成具有等同核苷酸或氨基酸残基匹配和等同百分比序列同一性的比对。

GAP使用Needleman和Wunsch（1970）同上的算法，以发现2个完整序列的比对，这使匹配数目达到最大且使缺口数目降到最低。GAP考虑所有可能比对和缺口位置，并且产生具有匹配碱基的最大数目和最少缺口的比对。它允许提供以匹配碱基为单位的缺口产生罚分和缺口延伸罚分。对于它插入的每个缺口，GAP必须在匹配的缺口产生罚分数目上获利。如果选择大于0的缺口延伸罚分，那么对于插入的每个缺口，GAP必须另外在缺口长度乘以缺口延伸罚分上获利。在GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中的缺省缺口产生罚分值和缺口延伸罚分值对于蛋白质序列分别是8和2。对于核苷酸序列，缺省缺口产生罚分是50，而缺省缺口延伸罚分是3。缺口产生和缺口延伸罚分可以表示为选自0 – 200的整数组的整数。因此，例如，缺口产生和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP呈现最佳比对家族的一个成员。可以存在这个家族的多个成员，但其他成员不具有更佳质量。GAP展示出用于比对的4个性能因数：质量、比率、同一性和相似性。质量是为了比对序列达到最大的量度。比率是质量除以较短区段中的碱基数目。百分比同一性是实际匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。忽略在缺口对面的符号。当对于符号对的评分矩阵值大于或等于0.50相似性阈值时，评分相似性。在GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵是BLOSUM62（参见Henikoff和Henikoff（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）。

（c）如本文使用的，在2个核酸或多肽序列背景中的“序列同一性”或“同一性”提及2个序列中的残基，当在指定比较窗上就最大限度对应性比对时，所述残基是相同的。当序列同一性的百分比在提及蛋白质中使用时，认识到并不等同的残基位置经常差别是保守氨基酸取代，其中氨基酸残基由具有相似化学性质（例如电荷或疏水性）的其他氨基酸残基取代，且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，百分比序列同一性可以向上调整，以校正取代的保守性质。差别是此种保守取代的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于做出这种调整的方法是本领域技术人员众所周知的。一般地，这涉及将保守取代评分为部分而不是完全错配，从而增加百分比序列同一性。因此，例如，当等同氨基酸给予得分1和非保守取代给予得分0时，保守取代给予0和1之间的得分。计算保守取代的得分，例如如程序PC/GENE（Intelligenetics，Mountain View，California）中实现的。

（d）如本文使用的，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗上比较2个最佳比对的序列测定的值，其中对于2个序列的最佳比对与参考序列（其不包括添加或缺失）相比较，比较窗中的多核苷酸序列部分可以包括添加或缺失（即缺口）。百分比通过下述进行计算：测定在其上等同核酸碱基或氨基酸残基在2个序列中出现的位置数目，以产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的位置总数目，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。

（e）（i）术语多核苷酸序列的“基本同一性”意指当使用所述比对程序之一使用标准参数与参考序列相比较时，多核苷酸包括具有至少70％、80％、90％或95％或更多序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当地调整这些值，以测定由2个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本同一性一般意指至少60％、70％、80％、90％或95％或更多序列同一性的序列同一性。

核苷酸序列基本等同的另一个指示是2个分子在严格条件下是否彼此杂交。一般地，严格条件选择为低于在限定离子强度和pH关于特定序列的T_m约5℃。然而，严格条件包含在低于T_m约1℃ - 约20℃范围中的温度，取决于如本文其他地方限定的所需严格程度。如果核酸编码的多肽是基本等同的，那么在严格条件下彼此不杂交的核酸仍是基本等同的。这可以例如在使用由遗传密码允许的最大限度密码子简并性产生核酸拷贝时发生。2个核酸序列基本等同的一个指示是当由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽在免疫学上交叉反应时。

（e）（ii）在肽背景中的术语“基本同一性”指出肽包括在指定比较窗上与参考序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或更多序列同一性的序列。用于这些目的的最佳比对可以使用Needleman和Wunsch（1970）同上的总体比对算法进行。2个肽序列基本上等同的指示是一个肽与针对第二个肽产生的抗体在免疫学上反应。因此，肽与第二个肽基本等同，例如在2个肽仅相差保守取代的情况下。“基本相似的”肽共享如上所述的序列，除并不等同的残基位置可以相差保守氨基酸改变外。

术语“核苷酸构建体”在本文中的使用不意欲将实施方案限制于包括DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到核苷酸构建体特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合组成的多核苷酸和寡核苷酸，也可以在本文公开的方法中采用。实施方案的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外包含此种构建体、分子和序列的所有互补形式。进一步地，实施方案的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列包含可以在用于转化植物的实施方案的方法中采用的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合的那些。此种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。实施方案的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还包含所有形式的核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

进一步实施方案涉及转化的生物，例如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物。转化的生物包括：实施方案的DNA分子、包括所述DNA分子的表达盒、或包括所述表达盒的载体，其可以稳定掺入转化的生物的基因组内。

实施方案的序列在DNA构建体中提供用于在目的生物中表达。构建体将包括与实施方案的序列可操作地连接的5'和3'调节序列。如本文使用的，术语“可操作地连接的”指启动子和第二个序列之间的功能连接，其中启动子序列起始且介导与第二个序列对应的DNA序列的转录。一般地，可操作地连接的意指被连接的核酸序列是邻接的，并且当需要连接2个蛋白质编码区时，邻接且在相同阅读框中。构建体可以另外包含待共转化到生物内的至少一种另外基因。可替代地，一种或多种另外基因可以在多个DNA构建体上提供。

此种DNA构建体配有多个限制位点用于插入Cry毒素序列，以在调节区的转录调节下。DNA构建体可以另外包含选择标记基因。

DNA构建体在转录的5'到3'方向中将包括：转录和翻译起始区（即启动子）、实施方案的DNA序列和在充当宿主的生物中起作用的转录和翻译终止区（即终止区）。转录起始区（即启动子）对于宿主生物和/或对于实施方案的序列可以是自然、类似、外来或异源的。另外，启动子可以是天然序列或可替代地合成序列。如本文使用的，术语“外来的”指示启动子在启动子引入其内的自然生物中未发现。当启动子对于实施方案的序列是“外来”或“异源的”时，它意指启动子对于可操作地连接的实施方案的序列不是自然或天然存在的启动子。如本文使用的，嵌合基因包括与转录起始区可操作地连接的编码序列，所述转录起始区对于编码序列是异源的。当启动子是自然或天然序列时，可操作地连接的序列的表达与野生型表达不同，这导致表型中的改变。

终止区对于转录起始区可以是自然的，对于可操作地连接的目的DNA序列可以是自然的，对于植物宿主可以是自然的，或可以衍生自另一个来源（即对于启动子、目的序列、植物宿主或其任何组合是外来或异源的）。

方便的终止区可从根癌土壤杆菌（A. tumefaciens）的Ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人（1991）Mol. Gen. Genet. 262:141-144；Proudfoot（1991）Cell 64:671-674；Sanfacon等人（1991）Genes Dev. 5:141-149；Mogen等人（1990）Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等人（1990）Gene 91:151-158；Ballas等人（1989）Nucleic Acids Res. 17:7891-7903；和Joshi等人（1987）Nucleic Acid Res. 15:9627-9639。

在合适时，核酸可以对于在宿主生物中增加的表达进行最佳化。因此，当宿主生物是植物时，合成核酸可以使用植物优选密码子合成用于改善的表达。关于宿主优选的密码子选择的讨论，参见例如，Campbell和Gowri（1990）Plant Physiol. 92:1-11。例如，尽管实施方案的核酸序列可以在单子叶和双子叶植物物种中表达，但序列可以进行修饰，以引起单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已显示不同（Murray等人（1989）Nucleic Acids Res. 17:477-498）。因此，关于特定氨基酸的玉蜀黍优选密码子可以衍生自来自玉蜀黍的已知基因序列。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子选择在Murray等人，同上的表4中列出。用于合成植物优选基因的方法是本领域可获得的。参见例如，引入本文作为参考的美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray等人（1989）Nucleic Acids Res. 17:477-498。

增强细胞宿主中的基因表达的另外序列修饰是已知的。这些包括编码假多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复和对于基因表达可能有害的其他充分表征的序列的消除。序列的GC含量可以调整至对于给定细胞宿主平均的水平，如通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算的。如本文使用的，术语“宿主细胞”指包含载体且预期支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌，或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的例子是玉蜀黍宿主细胞。在可能时，序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外包含5'前导序列。此种前导序列可以作用于增强翻译。翻译前导区是本领域已知的，并且包括：小RNA病毒前导区，例如EMCV前导区（脑心肌炎5'非编码区）（Elroy-Stein等人（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：6126-6130）；马铃薯Y病毒组前导区例如TEV前导区（烟草蚀斑病毒）（Gallie等人（1995）Gene 165（2）：233-238）、MDMV前导区（玉米矮花叶病毒）、人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）（Macejak等人（1991）Nature 353：90-94）；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的非翻译前导区（AMV RNA 4）（Jobling等人（1987）Nature 325：622-625）；烟草花叶病毒前导区（TMV）（Gallie等人（1989）in Molecular Biology of RNA，编辑Cech（Liss，New York），第237-256页）；和玉米褪绿斑驳病毒前导区（MCMV）（Lommel等人（1991）Virology 81：382-385）。还参见，Della-Cioppa等人（1987）Plant Physiol. 84：965-968。

在制备表达盒中，各种DNA片段可以如此操作，以便提供在正确方向中和合适时在正确阅读框中的DNA序列。为此，可以采用衔接子或接头以连接DNA片段，或可以包括其他操作以提供方便的限制位点、去除多余DNA、去除限制位点等。为了这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代例如转换和颠换。

许多启动子可以在实施方案的实践中使用。启动子可以基于所需结果进行选择。核酸可以与组成型、组织优选的、诱导型或其他启动子组合用于在宿主生物中表达。用于在植物宿主细胞中使用的合适组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及公开于WO 99/43838和美国专利号6,072,050中的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子（Odell等人（1985）Nature 313：810-812）；稻肌动蛋白（McElroy等人（1990）Plant Cell 2：163-171）；泛蛋白（Christensen等人（1989）Plant Mol. Biol. 12：619-632和Christensen等人（1992）Plant Mol. Biol. 18：675-689）；pEMU（Last等人（1991）Theor. Appl. Genet. 81：581-588）；MAS（Velten等人（1984）EMBO J. 3:2723-2730）；ALS启动子（美国专利号5,659,026）等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中讨论的那些。

依赖于所需结果，由诱导型启动子表达基因可能是有利的。对于调节实施方案的核苷酸序列在植物中的表达特别有价值的是伤口诱导型启动子。此种伤口诱导型启动子可以响应由昆虫摄食引起的伤害，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂（pin II）基因（Ryan（1990）Ann. Rev. Phytopath. 28：425-449；Duan等人（1996）Nature Biotechnology 14：494-498）；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2（Stanford等人（1989）Mol. Gen. Genet. 215：200-208）；系统素（McGurl等人（1992）Science 225：1570-1573）；WIP1（Rohmeier等人（1993）Plant Mol. Biol. 22：783-792；Eckelkamp等人（1993）FEBS Letters 323：73-76）；MPI基因（Corderok等人（1994）Plant J. 6（2）：141-150）；等，其引入本文作为参考。

另外，病原体诱导型启动子可以在实施方案的方法和核苷酸构建体中采用。此种病原体诱导型启动子包括来自致病相关蛋白质（PR蛋白质）的那些，其在通过病原体感染后诱导；例如PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1,3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参见例如，Redolfi等人（1983）Neth. J. Plant Pathol. 89：245-254；Uknes等人（1992）Plant Cell 4：645-656；和Van Loon（1985）Plant Mol. Virol. 4：111-116。还参见引入本文作为参考的WO 99/43819。

有价值的是在病原体感染部位或附近局部表达的启动子。参见例如，Marineau等人（1987）Plant Mol. Biol. 9:335-342；Matton等人（1989）Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331；Somsisch等人（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430；Somsisch等人（1988）Mol. Gen. Genet. 2:93-98；和Yang（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977。还参见Chen等人（1996）Plant J. 10:955-966；Zhang等人（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511；Warner等人（1993）Plant J. 3:191-201；Siebertz等人（1989）Plant Cell 1:961-968；美国专利号5,750,386（线虫诱导型）；和其中引用的参考文献。特别有价值的是用于玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达通过病原体串珠镰孢（Fusarium moniliforme）诱导（参见例如，Cordero等人（1992）Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200）。

化学调节的启动子可以通过外源化学调节剂的应用用于调节基因在植物中的表达。取决于目的，启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学试剂的应用诱导基因表达，或化学阻抑型启动子，其中化学试剂的应用阻抑基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍In2-2启动子、通过用作出苗前(pre-emergent)除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉蜀黍GST启动子、和通过水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其他有价值的化学调节的启动子包括类固醇应答启动子（参见例如，Schena等人（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425和McNellis等人（1998）Plant J. 14（2）:247-257中的糖皮质激素诱导型启动子）和四环素诱导型和四环素阻抑型启动子（参见例如Gatz等人（1991）Mol. Gen. Genet. 227:229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156），其引入本文作为参考。

组织优选的启动子可以用于靶向在特定植物组织内增强的杀虫蛋白质表达。组织优选的启动子包括在下述中讨论的那些：Yamamoto等人（1997）Plant J. 12（2）255-265；Kawamata等人（1997）Plant Cell Physiol. 38（7）:792-803；Hansen等人（1997）Mol. Gen Genet. 254（3）:337-343；Russell等人（1997）Transgenic Res. 6（2）:157-168；Rinehart等人（1996）Plant Physiol. 112（3）:1331-1341；Van Camp等人（1996）Plant Physiol. 112（2）:525-535；Canevascini等人（1996）Plant Physiol. 112（2）:513-524；Yamamoto等人（1994）Plant Cell Physiol. 35（5）:773-778；Lam（1994）Results Probl. Cell Differ. 20:181-196；Orozco等人（1993）Plant Mol Biol. 23（6）:1129-1138；Matsuoka等人（1993）Proc Natl. Acad. Sci. USA 90（20）:9586-9590；和Guevara-Garcia等人（1993）Plant J. 4（3）:495-505。若需要，则此种启动子可以进行修饰用于弱表达。

叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto等人（1997）Plant J. 12（2）:255-265；Kwon等人（1994）Plant Physiol. 105:357-67；Yamamoto等人（1994）Plant Cell Physiol. 35（5）:773-778；Gotor等人（1993）Plant J. 3:509-18；Orozco等人（1993）Plant Mol. Biol. 23（6）:1129-1138；和Matsuoka等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（20）:9586-9590。

根优选或根特异性启动子是已知的，并且可以选自可由参考文献获得和由多种相容物种从头分离的许多种。参见例如，Hire等人（1992）Plant Mol. Biol. 20（2）:207-218（大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因）；Keller和Baumgartner（1991）Plant Cell 3（10）:1051-1061（在菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件）；Sanger等人（1990）Plant Mol. Biol. 14（3）:433-443（根癌土壤杆菌的甘露碱合酶（MAS）基因的根特异性启动子）；和Miao等人（1991）Plant Cell 3（1）:11-22（编码胞质谷氨酰胺合成酶（GS）的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达）。还参见Bogusz等人（1990）Plant Cell 2（7）:633-641，其中描述了从来自固氮非豆科植物Parasponia andersonii和相关非固氮非豆科植物山黄麻（Trema tomentosa）的血红蛋白基因分离的2种根特异性启动子。使这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报道基因连接，并且引入非豆科植物烟草（Nicotiana tabacum）和豆科植物百脉根（Lotus corniculatus）内，并且在2种情况下，根特异性启动子活性被保持。Leach和Aoyagi（1991）描述了发根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子分析（参见Plant Science（Limerick）79（1）:69-76）。他们得出结论为增强子和组织优选的DNA决定子在这些启动子中是解离的。Teeri等人（1989）使用与lacZ的基因融合物，以显示编码章鱼碱合酶的土壤杆菌属（Agrobacterium）T-DNA基因尤其在根尖的表皮中是有活性的，并且TR2'基因在完整植物中是根特异性的，并且通过叶组织中的伤口刺激，用于与杀昆虫或杀幼虫基因一起使用的尤其希望的特征组合（参见EMBO J. 8（2）:343-350）。与nptII（新霉素磷酸转移酶II）融合的TR1'基因显示相似特征。另外的根优选启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子（Kuster等人（1995）Plant Mol. Biol. 29（4）:759-772）；和rolB启动子（Capana等人（1994）Plant Mol. Biol. 25（4）:681-691。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。

“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子（那些启动子在种子发育过程中有活性，例如种子贮存蛋白的启动子）以及“种子萌发”启动子（那些启动子在种子萌发过程中有活性）。参见引入本文作为参考的Thompson等人（1989）BioEssays 10:108。此种种子优选的启动子包括但不限于，Cim1（细胞分裂素诱导的信息）；cZ19B1（玉蜀黍19 kDa玉米醇溶蛋白）；和milps（肌醇-1-磷酸合酶）（参见引入本文作为参考的美国专利号6,225,529）。γ-玉米醇溶蛋白和Glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白（cruciferin）等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15 kDa玉米醇溶蛋白、22 kDa玉米醇溶蛋白、27 kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等。还参见，WO 00/12733，其中公开了来自end1 和 end2基因的种子优选的启动子；引入本文作为参考。在特定组织中具有“优选”表达的启动子在那种组织中表达至比在至少一种其他植物组织中更大的程度。一些组织优选的启动子显示在特定组织中几乎唯一的表达。

当需要低水平表达时，将使用弱启动子。一般地，如本文使用的，术语“弱启动子”指驱动编码序列以低水平表达的启动子。低水平预期约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平的表达。可替代地，认识到术语“弱启动子”还包含驱动仅在少数细胞中且不在其他中的表达的启动子，以给出总体低水平的表达。当启动子驱动处于不可接受的高水平的表达时，启动子序列的部分可以进行缺失或修饰，以降低表达水平。

此种弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子（WO 99/43838和美国专利号6,072,050）、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如引入本文作为参考的美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中公开的那些。

一般地，表达盒将包括用于选择转化的细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II（NEO）和潮霉素磷酸转移酶（HPT）的那些，以及赋予对于除草剂化合物的抗性的基因，所述除草剂化合物例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸盐（2,4-D）。合适选择标记基因的另外例子包括但不限于编码对于下述的抗性的基因：氯霉素（Herrera Estrella等人（1983）EMBO J.2:987-992）；氨甲蝶呤（Herrera Estrella等人（1983）Nature303:209-213；和Meijer等人（1991）Plant Mol. Biol.16:807-820）；链霉素（Jones等人（1987）Mol. Gen. Genet.210:86-91）；壮观霉素（Bretagne-Sagnard等人（1996）Transgenic Res.5:131-137）；博来霉素（Hille等人（1990）Plant Mol. Biol.7:171-176）；氨磺酰（Guerineau等人（1990）Plant Mol. Biol.15:127-136）；溴苯腈（Stalker等人（1988）Science 242:419-423）；草甘膦（Shaw等人（1986）Science 233:478-481；和美国申请系列号10/004,357；和10/427,692）；膦丝菌素（DeBlock等人（1987）EMBO J.6:2513-2518）。一般参见，Yarranton（1992）Curr. Opin. Biotech. 3：506-511；Christopherson等人（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ： 6314-6318 ； Yao 等人（ 1992 ） Cell 71 ： 63-72 ； Reznikoff （ 1992 ） Mol. Microbiol. 6：2419-2422；Barkley等人（1980）in The Operon，第177-220页；Hu等人（1987）Cell 48：555-566；Brown等人（1987）Cell 49：603-612；Figge等人（1988）Cell 52：713-722；Deuschle等人（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 ： 5400-5404 ； Fuerst 等人（ 1989 ） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 ： 2549-2553 ； Deuschle 等人（ 1990 ） Science 248 ： 480-483 ； Gossen （ 1993 ） Ph.D. Thesis ， University of Heidelberg ； Reines 等人（ 1993 ） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 ： 1917-1921 ； Labow 等人（ 1990 ） Mol. Cell. Biol. 10 ： 3343-3356 ； Zambretti 等人（ 1992 ） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ： 3952-3956 ； Baim 等人（ 1991 ） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 ： 5072-5076 ； Wyborski 等人（ 1991 ） Nucleic Acids Res. 19 ： 4647-4653 ； Hillenand-Wissman （ 1989 ） Topics Mol. Struc. Biol. 10 ： 143-162 ； Degenkolb 等人（ 1991 ） Antimicrob. Agents Chemother. 35：1591-1595；Kleinschnidt等人（1988）Biochemistry 27：1094-1104；Bonin（1993）Ph.D. Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547-5551；Oliva等人（1992）Antimicrob. Agents Chemother. 36：913-919；Hlavka等人（1985）Handbook of Experimental Pharmacology，Vol. 78（Springer-Verlag，Berlin）；和Gill等人（1988）Nature 334：721-724。此种公开内容引入本文作为参考。

选择标记基因的上述列表不意欲是限制性的。任何选择标记基因都可以用于实施方案中。

实施方案的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物内。“引入”意指以这样的方式给植物呈递多核苷酸或多肽，从而使得序列可以接近植物细胞的内部。实施方案的方法不取决于用于将多核苷酸或多肽引入植物内的特定方法，只是多核苷酸或多肽可以接近植物的至少一种细胞的内部。用于将多核苷酸或多肽引入植物内的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“稳定转化”意指引入植物内的核苷酸构建体整合到植物的基因组内，并且能够由其后代遗传。“瞬时转化”意指多核苷酸引入植物内并且不整合到植物的基因组内，或多肽引入植物内。

转化规程以及用于将核苷酸序列引入植物内的规程可以依赖于靶向用于转化的植物或植物细胞类型即单子叶植物或双子叶植物而改变。将核苷酸序列引入植物细胞内且随后插入植物基因组内的合适方法包括显微注射（Crossway等人（1986）Biotechniques 4：320-334）、电穿孔（Riggs等人（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83：5602-5606）、土壤杆菌属介导的转化（美国专利号5,563,055和5,981,840）、直接基因转移（Paszkowski等人（1984）EMBO J. 3：2717-2722）、和弹道粒子加速（参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；Tomes等人（1995）in Plant Cell ， Tissue ， and Organ Culture ： Fundamental Methods，编辑Gamborg和Phillips（Springer-Verlag，Berlin）；和McCabe等人（1988）Biotechnology 6：923-926）；和Lecl转化（WO 00/28058）。关于马铃薯转化，参见Tu等人（1998）Plant Molecular Biology 37：829-838和Chong等人（2000）Transgenic Research 9：71-78。另外的转化程序可以在下述中找到：Weissinger等人（1988）Ann. Rev. Genet. 22：421-477；Sanford等人（1987）Particulate Science and Technology 5：27-37（洋葱）；Christou等人（1988）Plant Physiol. 87：671-674（大豆）；McCabe等人（1988）Bio/Technology 6：923-926（大豆）；Finer和McMullen（1991）In Vitro Cell Dev. Biol. 27P ： 175-182 （大豆）； Singh 等人（ 1998 ） Theor. Appl. Genet. 96：319-324（大豆）；Datta等人（1990）Biotechnology 8：736-740（稻）；Klein等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：4305-4309（玉蜀黍）；Klein等人（1988）Biotechnology 6:559-563（玉蜀黍）；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人（1988）Plant Physiol. 91：440-444（玉蜀黍）；Fromm等人（1990）Biotechnology 8：833-839（玉蜀黍）；Hooykaas-Van Slogteren等人（1984）Nature （ London ）311：763-764；美国专利号5,736,369（谷物）；Bytebier等人（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：5345-5349（百合科(Liliaceae)）；De Wet等人（1985）in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues ，编辑Chapman等人（Longman，New York），第197-209页（花粉）；Kaeppler等人（1990）Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等人（1992）Theor. Appl. Genet. 84：560-566（颈须(whisker)介导的转化）；D'Halluin等人（1992）Plant Cell 4：1495-1505（电穿孔）；Li等人（1993）Plant Cell Reports 12：250-255和Christou和Ford（1995）Annals of Botany 75：407-413（稻）；Osjoda等人（1996）Nature Biotechnology 14：745-750（经由根癌土壤杆菌的玉蜀黍）；所有这些都引入本文作为参考。

在特定实施方案中，实施方案的序列可以使用多种瞬时转化方法提供给植物。此种瞬时转化方法包括但不限于将Cry毒素蛋白质或其变体和片段直接引入植物内或将Cry毒素转录物引入植物内。此种方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如，Crossway等人（1986）Mol Gen. Genet. 202：179-185；Nomura等人（1986）Plant Sci. 44：53-58；Hepler等人（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. 91：2176-2180和Hush等人（1994）The Journal of Cell Science 107：775-784，所有这些都引入本文作为参考。可替代地，Cry毒素多核苷酸可以使用本领域已知的技术瞬时转化到植物内。此种技术包括病毒载体系统和以排除DNA后续释放的方式的多核苷酸沉淀。因此，可以发生来自粒子结合的DNA的转录，但它由之释放以变得整合到基因组内的频率极大减少。此种方法包括用聚乙烯亚胺(polyethylimine)（PEI；Sigma #P3143）包被的粒子的使用。

用于将多核苷酸靶向插入植物基因组中的特定位置的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，多核苷酸在所需基因组位置的插入使用位点特异性重组系统来达到。参见例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853；所有这些都引入本文作为参考。简言之，实施方案的多核苷酸可以包含在侧面为2个非等同重组位点的转移盒中。将转移盒引入已将靶位点稳定整合到其基因组内的植物内，所述靶位点侧面为对应于转移盒位点的2个非等同重组位点。提供合适的重组酶并且将转移盒整合到靶位点上。目的多核苷酸从而整合到植物基因组中的特定染色体位置上。

已转化的细胞可以依照常规方法生长成植物。参见例如，McCormick等人（1986）Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物随后可以生长，并且用相同转化的品系或不同品系授粉，并且鉴定具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得到的杂种。可以生长2代或更多代，以确保所需表型特征的表达得到稳定维持且遗传，并且随后收获种子以确保已达到所需表型特征的表达。

通过使植物与病毒或病毒核酸接触，可以给植物提供实施方案的核苷酸序列。一般地，此种方法涉及将目的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。认识到实施方案的重组蛋白质可以最初作为病毒多蛋白的部分合成，这随后可以在体内或在体外通过蛋白酶解进行加工，以产生所需杀虫蛋白质。还认识到包括实施方案杀虫蛋白质的至少部分氨基酸序列的此种病毒多蛋白可以具有所需杀虫活性。此种病毒多蛋白和编码其的核苷酸序列由实施方案包含。用于提供具有核苷酸构建体的植物和在植物中产生所编码蛋白质的方法是本领域已知的，这涉及病毒DNA或RNA分子。参见例如，引入本文作为参考的美国专利号5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367；和5,316,931。

实施方案进一步涉及实施方案的转化的植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和枝条的插条。

实施方案可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的例子包括但不限于，玉米（玉蜀黍）、芸苔属物种（Brassica sp.）（例如欧洲油菜（B. napus）、芜菁（B. rapa）、芥菜（B. juncea））特别是作为种子油来源有用的那些芸苔属物种、苜蓿（紫苜蓿（Medicago sativa））、稻（稻（Oryza sativa））、黑麦（黑麦（Secale cereale））、高粱（两色蜀黍（Sorghum bicolor）、蜀黍（Sorghum vulgare））、粟（例如珍珠粟（御谷（Pennisetum glaucum））、稷（稷（Panicum miliaceum））、谷子（谷子（Setaria italica））、 子（子（Eleusine coracana）））、向日葵（向日葵（Helianthus annuus））、红花（红花（Carthamus tinctorius））、小麦（普通小麦（Triticum aestivum））、大豆（大豆（Glycine max））、烟草（烟草(Nicotiana tabacum)）、马铃薯（马铃薯（Solanum tuberosum））、花生（落花生（Arachis hypogaea））、棉花（海岛棉（Gossypium barbadense）、陆地棉（Gossypium hirsutum））、甘薯（甘薯（Ipomoea batatus））、木薯（木薯（Manihot esculenta））、咖啡（咖啡属物种（Coffea spp.））、椰子（椰子（Cocos nucifera））、菠萝（凤梨（Ananas comosus））、柑橘树（柑橘属物种（Citrus spp.））、可可（可可树（Theobroma cacao））、茶（茶（Camellia sinensis））、香蕉（芭蕉属物种（Musa spp.））、鳄梨（鳄梨（Persea americana））、无花果（无花果（Ficus casica））、番石榴（番石榴（Psidium guajava））、芒果（芒果（Mangifera indica））、油橄榄（油橄榄（Olea europaea））、番木瓜（番木瓜（Carica papaya））、腰果（腰果（Anacardium occidentale））、全缘叶澳洲坚果（全缘叶澳洲坚果（Macadamia integrifolia））、扁桃（扁桃（Prunus amygdalus））、甜菜（甜菜（Beta vulgaris））、甘蔗（甘蔗属物种（Saccharum spp.））、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄（番茄（Lycopersicon esculentum））、莴苣（例如莴苣（Lactuca sativa））、青豆（菜豆（Phaseolus vulgaris））、利马豆（利马豆（Phaseolus limensis））、豌豆（山黧豆属物种（Lathyrus spp.）），和香瓜属（Cucumis）的成员例如黄瓜（黄瓜（C. sativus））、罗马甜瓜（C. cantalupensis）和甜瓜（甜瓜（C. melo））。观赏植物包括杜鹃花（杜鹃花属物种（Rhododendron spp.））、绣球花（绣球（Macrophylla hydrangea））、芙蓉（朱槿（Hibiscus rosasanensis））、玫瑰花（蔷薇属物种（Rosa spp.））、郁金香（郁金香属物种（Tulipa spp.））、水仙花（水仙属物种（Narcissus spp.））、矮牵牛（碧冬茄（Petunia hybrida））、康乃馨（麝香石竹（Dianthus caryophyllus））、一品红（一品红（Euphorbia pulcherrima））和菊花。可以在实践实施方案中采用的针叶树包括例如松树例如火炬松（火炬松（Pinus taeda））、湿地松（湿地松（Pinus elliotii））、西黄松（西黄松（Pinus ponderosa））、小干松（小干松（Pinus contorta））、和辐射松（辐射松（Pinus radiata））；花旗松（花旗松（Pseudotsuga menziesii））；美国西部铁杉（加拿大铁杉（Tsuga canadensis））；北美云杉（白云杉（Picea glauca））；北美红杉（北美红杉（Sequoia sempervirens））；纯正冷杉例如银枞（太平洋银枞（Abies amabilis））和胶枞（胶枞（Abies balsamea））；和雪松例如北美乔柏（北美乔柏（Thuja plicata））和黄扁柏（黄扁柏（Chamaecyparis nootkatensis））。实施方案的植物包括作物植物（例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等），例如玉米和大豆植物。

草坪草包括但不限于：早熟禾（早熟禾（Poa annua））；一年生黑麦草（多花黑麦草（Lolium multiflorum））；加拿大早熟禾（加拿大早熟禾（Poa compressa））；Chewings羊茅（紫羊茅（Festuca rubra））；细弱剪股颖（细弱剪股颖（Agrostis tenuis））；匍匐剪股颖（匍茎剪股颖（Agrostis palustris））；冰草（沙生冰草（Agropyron desertorum））；扁穗冰草（冰草（Agropyron cristatum））；硬羊茅（长叶羊茅（Festuca longifolia））；草地早熟禾（草地早熟禾（Poa pratensis））；鸭茅（鸭茅（Dactylis glomerata）；）多年生黑麦草（黑麦草（Lolium perenne））；紫羊茅（Festuca rubra）；小糠草（小糠草（Agrostis alba））；普通早熟禾（普通早熟禾（Poa trivialis））；羊茅（羊茅（Festuca ovina））；无芒雀麦（无芒雀麦（Bromus inermis））；苇状羊茅（苇状羊茅（Festuca arundinacea））；梯牧草（梯牧草（Phleum pratense））；普通剪股颖（普通剪股颖（Agrostis canina））；碱茅（碱茅（Puccinellia distans））；蓝茎冰草（硬叶偃麦草（Agropyron smithii））；狗牙根草（狗牙根属物种（Cynodon spp.））；圣奥古斯丁草（偏序钝叶草（Stenotaphrum secundatum））；结缕草（结缕草属物种（Zoysia spp.））；百喜草(Bahia grass)（百喜草（Paspalum notatum））；地毯草（近缘地毯草（Axonopus affinis））；百足草（假俭草（Eremochloa ophiuroides））；隐花狼尾草（kikuyu grass）（铺地狼尾草（Pennisetum clandesinum））；海滨雀稗（海滨雀稗（Paspalum vaginatum））；格兰马草（格兰马草（Bouteloua gracilis））；野牛草（野牛草（Buchloe dactyloids））；垂穗草（垂穗草（Bouteloua curtipendula））。

目的植物包括提供目的种子的谷类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷类种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦、粟等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

在特定实施方案中，实施方案的核酸序列可以与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以产生具有所需表型的植物。例如，实施方案的多核苷酸可以与编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸堆叠，例如其他Bt毒性蛋白质（在美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人（1986）Gene 48:109中描述）、pentin（在美国专利号5,981,722中描述）等。所生成的组合还可以包括目的多核苷酸中的任何一种的多个拷贝。实施方案的多核苷酸还可以与任何其他基因或基因的组合堆叠，以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于对于动物饲料希望的性状，例如高油基因（例如美国专利号6,232,529）；平衡的氨基酸（例如hordothionins（美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,049）；大麦高赖氨酸（Williamson等人（1987）Eur. J. Biochem. 165：99-106；和WO 98/20122）和高甲硫氨酸蛋白质（Pedersen等人（1986）J. Biol. Chem. 261：6279；Kirihara等人（1988）Gene 71：359；和Musumura等人（1989）Plant Mol. Biol. 12：123））；增加的可消化性（例如修饰的贮存蛋白质（于2001年11月7日提交的美国申请系列号10/053,410）；和硫氧还蛋白（于2001年12月3日提交的美国申请系列号10/005,429）；其公开内容引入本文作为参考。

实施方案的多核苷酸还可以与对于疾病或除草剂抗性希望的性状堆叠（例如串珠镰孢菌素解毒基因（美国专利号5,792,931）；无毒性和疾病抗性基因（Jones等人（1994）Science 266:789；Martin等人（1993）Science 262：1432；和Mindrinos等人（1994）Cell 78:1089）；导致除草剂抗性例如S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶（ALS）突变体；谷氨酰胺合酶的抑制剂例如膦丝菌素或草铵膦（basta）（例如bar基因）；和草甘膦抗性（如美国申请系列号10/004,357；和10/427,692中公开的EPSPS基因和GAT基因）；和对于加工或加工产物希望的性状，例如高油（例如美国专利号6,232,529）；改性油（例如脂肪酸去饱和酶基因（美国专利号5,952,544；WO 94/11516））；改性淀粉（例如ADPG焦磷酸化酶（AGP酶）、淀粉合酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和淀粉脱支酶（SDBE））；和聚合物或生物塑料（bioplastics）（例如美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶（Schubert等人（1988）J. Bacteriol. 170：5837-5847）促进聚羟基链烷酸酯（PHAs）的表达），其公开内容引入本文作为参考。人们还可以组合实施方案的多核苷酸与提供农艺学性状的多核苷酸，所述农艺学性状例如雄性不育（例如参见美国专利号5.583,210）、茎强度、开花时间或转化技术性状例如细胞周期调节或基因靶向（例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821），其公开内容引入本文作为参考。

这些堆叠的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规或TOPCROSS®方法的杂交育种植物，或遗传转化。如果性状通过遗传转化植物进行堆叠，那么目的多核苷酸序列可以在任何时间和以任何次序组合。例如，包括一种或多种所需性状的转基因植物可以用作靶，以通过后续转化引入进一步性状。性状可以在共转化规程中与由转化盒的任何组合提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入2个序列，那么2个序列可以包含在分开的转化盒（反式）中或包含在相同转化盒（顺式）上。序列的表达可以通过相同启动子或不同启动子驱动。在特定情况下，可能希望引入将抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以组合其他抑制盒或超表达盒的任何组合，以生成植物中的所需性状组合。进一步认识到多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统在所需基因组位置上堆叠。参见例如，WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855和WO99/25853，所有这些都引入本文作为参考。

实施方案的组合物以多种方式在保护植物、种子和植物产物中有用。例如，组合物可以在涉及将有效量的杀虫组合物置于害虫环境中的方法中使用，其通过选自喷雾、撒粉、撒播或种子涂敷的程序实现。

在植物繁殖材料（果实、块茎、鳞茎、球茎、谷粒、种子）但尤其是种子作为商业产物销售前，它照例用保护剂涂料进行处理，所述保护剂涂料包括除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的几种的混合物，若需要则连同在配制领域中照例采用的进一步载体、表面活性剂或施用促进佐剂一起，以提供针对由细菌、真菌或动物害虫引起的损害的保护。为了处理种子，通过用液体制剂浸渗块茎或谷粒或通过用组合的湿或干制剂涂敷其，保护剂涂料可以应用于种子。此外，在特定情况下，对于植物的其他应用方法是可能的，例如针对芽或果实的处理。

包括编码实施方案的杀虫蛋白质的核苷酸序列的实施方案的植物种子可以用种子保护剂涂料进行处理，所述种子保护剂涂料包括种子处理化合物，例如克菌丹、萎锈灵、福美双、methalaxyl、虫螨磷和在种子处理中通常使用的其他化合物。在一个实施方案中，包括实施方案的杀虫组合物的种子保护剂涂料单独或与种子处理中照例使用的种子保护剂涂料之一组合使用。

认识到编码杀虫蛋白质的基因可以用于转化昆虫致病微生物。此种生物包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。

编码实施方案的杀虫蛋白质的基因可以经由合适载体引入微生物宿主内，并且将所述宿主应用于环境、或植物或动物。在将核酸插入细胞内的背景中的术语“引入的”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及核酸掺入真核或原核细胞内，其中核酸可以掺入细胞的基因组（例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA）内，转变成自主复制子或瞬时表达（例如转染的mRNA）。

可以选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”（叶面、叶圈、根际和/或根面（rhizoplana））的微生物宿主。这些微生物这样进行选择，以便能够在特定环境中与野生型微生物成功竞争，提供了表达杀虫蛋白质的基因的稳定维持和表达，并且希望地提供了杀虫剂不受环境降解和灭活的改善保护。

此种微生物包括细菌、藻类和真菌。特别有价值的是微生物例如细菌例如假单胞菌属（Pseudomonas）、欧文氏菌属（Erwinia）、沙雷氏菌属（Serratia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、链霉菌属（Streptomyces）、根瘤菌属（Rhizobium）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、Methylius、土壤杆菌属、醋杆菌属（Acetobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、固氮菌属（Azotobacter）、明串珠菌属（Leuconostoc）和产碱菌属（Alcaligenes），真菌特别是酵母例如糖酵母属（Saccharomyces）、隐球酵母属（Cryptococcus）、克鲁维氏酵母属（Kluyveromyces）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、红酵母属（Rhodotorula）和短柄霉属（Aureobasidium）。特别有价值的是此种植物圈细菌物种例如丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、木醋杆菌（Acetobacter xylinum）、土壤杆菌属、类球红球菌（Rhodopseudomonas spheroides）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）、苜蓿中华根瘤菌（Rhizobium melioti）、真养产碱菌（Alcaligenes entrophus）、木棍状杆菌（Clavibacter xyli）和维涅兰德固氮菌（Azotobacter vinelandii），和植物圈酵母物种例如深红酵母（Rhodotorula rubra）、胶粘红酵母（R. glutinis）、海滨红酵母（R. marina）、橙黄红酵母（R. aurantiaca）、浅白色隐球酵母（Cryptococcus albidus）、流散隐球酵母（C. diffluens）、罗仑氏隐球酵母（C. laurentii）、罗茜糖酵母（Saccharomyces rosei）、善地糖酵母（S. pretoriensis）、啤酒糖酵母（S. cerevisiae）、红色掷孢酵母（Sporobolomyces roseus）、香气掷孢酵母（S. odorus）、佛地克鲁维氏酵母（Kluyveromyces veronae）和出芽短柄霉（Aureobasidium pollulans）。特别有价值的是着色的微生物。

许多方法可用于在允许基因稳定维持和表达的条件下将表达杀虫蛋白质的基因引入微生物宿主内。例如，可以构建表达盒，其包括与用于表达核苷酸构建体的转录和翻译调节信号可操作地连接的目的核苷酸构建体，和与宿主生物中的序列同源的核苷酸序列，由此将发生整合，和/或在宿主中起作用的复制系统，由此将发生整合或稳定维持。

转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始开始位点、操纵基因、激活剂、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见例如，美国专利号5,039,523和4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook等人（1992）Molecular Cloning ： A Laboratory Manual，编辑Maniatis等人（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York），下文"Sambrook II"；Davis等人，编辑（1980）Advanced Bacterial Genetics（Cold Spring Harbor Laboratory Press），Cold Spring Harbor，New York；和其中引用的参考文献。

当处理的细胞应用于一种或多种靶害虫的环境时，其中含杀虫蛋白质的细胞将进行处理以延长杀虫蛋白质在细胞中的活性的合适宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，正常局限于不产生对于高等生物例如哺乳动物毒性的物质的那些细胞。然而，可以使用产生对于高等生物毒性的物质的生物，其中毒素不稳定或应用水平足够低，以便避免对于哺乳动物宿主的毒性的任何可能性。作为宿主，特别有价值的将是原核生物和低等真核生物例如真菌。革兰氏阴性和革兰氏阳性的举例说明性原核生物包括肠杆菌科（Enterobacteriaceae），例如埃希氏菌属（Escherichia）、欧文氏菌属、志贺氏菌属（Shigella）、沙门氏菌属（Salmonella）和变形菌属（Proteus）；芽孢杆菌科（Bacillaceae）；根瘤菌科（Rhizobiaceae）例如根瘤菌属（Rhizobium）；螺菌科（Spirillaceae）例如发光杆菌属（photobacterium）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、沙雷氏菌属、气单胞菌属（Aeromonas）、弧菌属（Vibrio）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、螺菌属（Spirillum）；乳杆菌科（Lactobacillaceae）；假单胞菌科（Pseudomonadaceae）例如假单胞菌属和醋杆菌属；固氮菌科（Azotobacteraceae）和硝化杆菌科（Nitrobacteraceae）。在真核生物中有真菌例如藻菌纲（Phycomycetes）和子囊菌纲（Ascomycetes），这包括酵母例如糖酵母属和裂殖糖酵母属（Schizosaccharomyces）；和担子菌纲（Basidiomycetes）酵母例如红酵母属、短柄霉属、掷孢酵母属等。

在选择用于杀虫蛋白质生产目的的宿主细胞中特别有价值的特征包括容易将杀虫蛋白质基因引入宿主内、表达系统的可用性、表达效率、蛋白质在宿主中的稳定性、和辅助遗传能力的存在。用于用作杀虫剂微囊的有价值特征包括关于杀虫剂的保护品质，例如厚细胞壁、着色和内含体的细胞内包装或形成；叶亲和性；哺乳动物毒性的缺乏；对于害虫摄食的吸引力；容易杀死和固定而不损害毒素；等。其他考虑包括容易配制和处理、经济学、贮存稳定性等。

特别有价值的宿主生物包括酵母，例如红酵母属物种、短柄霉属物种、糖酵母属物种（例如啤酒糖酵母）、掷孢酵母属物种，叶面生物例如假单胞菌属物种（例如铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、荧光假单胞菌），欧文氏菌属物种和黄杆菌属物种（Flavobacterium spp.）及其他此种生物，包括Bt、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。

编码实施方案的杀虫蛋白质的基因可以引入微生物内，所述微生物在植物（附生植物）上繁殖，以将杀虫蛋白质递送给潜在靶害虫。例如附生植物可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。

例如根定居细菌可以通过本领域已知的方法从目的植物中分离。特别地，定居根的蜡状芽孢杆菌菌株可以从植物的根中分离（参见例如，Handelsman等人（1991）Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718）。编码实施方案的杀虫蛋白质的基因可以通过本领域已知的标准方法引入根定居蜡状芽孢杆菌内。

编码杀虫蛋白质的基因可以例如借助于电转化引入根定居芽孢杆菌属内。特别地，编码杀虫蛋白质的基因可以克隆到穿梭载体例如pHT3101内（Lerecius等人（1989）FEMS Microbiol. Letts. 60：211-218。包含关于特定杀虫蛋白质基因的编码序列的穿梭载体pHT3101可以例如借助于电穿孔转化到根定居芽孢杆菌属内（Lerecius等人（1989）FEMS Microbiol. Letts. 60：211-218）。

表达系统可以如此设计，从而使得杀虫蛋白质分泌到革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌的细胞质外。使杀虫蛋白质分泌的优点是：（1）避免所表达的杀虫蛋白质的潜在细胞毒性作用；和（2）杀虫蛋白质的纯化效率中的改善，包括但不限于在每体积细胞培养液的蛋白质回收和纯化中的效率增加以及每单位蛋白质的回收和纯化的时间和/或成本减少。

杀虫蛋白质可以变得分泌到大肠杆菌中，例如通过使合适的大肠杆菌信号肽与杀虫蛋白质的氨基末端融合。由大肠杆菌识别的信号肽可以在已知在大肠杆菌中分泌的蛋白质中找到，例如OmpA蛋白质（Ghrayeb等人（1984）EMBO J ，3:2437-2442）。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白质，并且因此它的信号肽被认为在易位过程中是有效的。同样，OmpA信号肽无需在加工前进行修饰，可能与其他信号肽例如脂蛋白信号肽（Duffaud等人（1987）Meth. Enzymol. 153：492）的情况一样。

实施方案的杀虫蛋白质可以在细菌宿主中发酵，并且所得到的细菌以与已用作杀昆虫喷雾剂的Bt菌株相同的方式进行加工且用作微生物喷雾剂。在由芽孢杆菌属分泌的一种或多种杀虫蛋白质的情况下，分泌信号使用本领域已知的程序去除或突变。此种突变和/或缺失阻止一种或多种杀虫蛋白质在发酵过程期间分泌到生长培养基内。杀虫蛋白质保留在细胞内，并且细胞随后进行加工，以产生被囊化的杀虫蛋白质。任何合适的微生物都可以用于这个目的。假单胞菌属已用于表达作为被囊化的蛋白质的Bt毒素，并且所得到的细胞加工且作为杀昆虫剂喷雾（Gaertner等人（1993），in：Advanced Engineered Pesticides，编辑Kim）。

可替代地，杀虫蛋白质通过将异源基因引入细胞宿主内产生。异源基因的表达直接或间接地导致杀虫剂的细胞内产生和维持。当细胞应用于一种或多种靶害虫的环境时，这些细胞随后在延长在细胞中产生的毒素活性的条件下进行处理。所得到的产物保留毒素的毒性。这些天然被囊化的杀虫蛋白质随后可以依照常规技术进行配制用于应用于容纳靶害虫的环境，例如土壤、水和植物叶子。参见例如EPA 0192319和其中引用的参考文献。

在实施方案中，转化的微生物（其包括完整生物、细胞、一种或多种孢子、一种或多种杀虫蛋白质、一种或多种杀虫组分、一种或多种害虫影响组分、一种或多种突变体、活或死细胞和细胞组分，包括活和死细胞和细胞组分的混合物，并且包括破碎的细胞和细胞组分）或分离的杀虫蛋白质可以与可接受的载体一起配制成一种或多种杀虫组合物，其是例如悬浮液、溶液、乳剂、撒粉粉末、可分散颗粒或小丸、可湿性粉末和可乳化浓缩物、气溶胶或喷雾剂、浸渗颗粒、佐剂、可包被糊剂、胶体以及例如聚合物物质中的胶囊化。此种配制的组合物可以通过此种常规方法进行制备，例如包含多肽的细胞培养物的脱水、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉降或浓缩。

上文公开的此种组合物可以通过添加下述获得：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、摄食刺激剂、引诱剂、被囊化剂、粘合剂、乳化剂、染料、UV保护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养物供体或影响植物生长的其他制剂。一种或多种农用化学品包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、落叶剂(harvest aid)和肥料，可以与在配制领域中照例采用的载体、表面活性剂或佐剂或其他组分组合，以促进产物处理和应用于特定靶害虫。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于在配制技术中通常采用的物质，例如自然或再生矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。实施方案的活性成分正常以组合物的形式应用，并且可以应用于待处理的作物区域、植物或种子。例如，实施方案的组合物可以应用于在用于准备粮仓或地窑等或在粮仓或地窖等中的贮存过程中的谷物。实施方案的组合物可以与其他化合物同时或连续应用。应用实施方案的活性成分或实施方案的农用化学品组合物（其包含通过实施方案的细菌菌株产生的至少一种杀虫蛋白质）的方法包括但不限于叶应用、种子涂敷和土壤应用。应用数目和应用比率依赖于通过相应害虫的侵扰强度。

合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单或二酯或此种酯的盐；脂肪族醇的硫酸酯例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪族醇的硫酸酯；乙氧基化烷基酚硫酸酯；木素磺酸盐；石油磺酸盐；烷芳基磺酸盐例如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐例如丁基萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐例如酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯的磺酸钠。非离子型试剂包括脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪酸酰胺或脂肪-烷基-或链烯基-取代的酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酯例如失水山梨糖醇脂肪酸酯，此种酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐（sorbitar）脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔烃邻二醇例如2,4,7,9-四乙基-5-癸炔-4,7-二醇或乙氧基化炔烃邻二醇。阳离子型表面活性剂的例子包括例如脂族单、二或多胺，例如乙酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二或多胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。

惰性材料的例子包括但不限于无机矿物质例如高岭土、页硅酸盐(phyllosilicates)、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或植物材料例如软木塞、粉状玉米穗轴、花生壳、稻壳和胡桃壳。

实施方案的组合物可以以合适形式用于直接应用或作为基本组合物的浓缩物，这在应用前需要用合适量的水或其他稀释剂稀释。杀虫浓度将依赖于特定制剂的性质而改变，特别地依赖于它是浓缩物还是待直接使用。组合物包含1 - 98％固体或液体惰性载体，和0 - 50％或0.1 - 50％表面活性剂。这些组合物将以标记的比率对于商业产物施用，例如当以干燥形式时，约0.01 lb-5.0 lb/英亩，并且当以液体形式时，以约0.01 pts. - 10 pts. /英亩。

在进一步的实施方案中，当应用于靶害虫的环境时，实施方案的组合物以及转化的微生物和杀虫蛋白质可以在配制前进行处理，以延长杀虫活性，只要预处理对于杀虫活性无害。此种处理可以通过化学和/或物理方法，只要处理不会有害地影响一种或多种组合物的性质。化学试剂的例子包括但不限于卤化剂；醛例如甲醛和戊二醛；抗感染剂例如苯扎氯铵；醇例如异丙醇和乙醇；和组织学固定剂例如Bouin's固定剂和Helly's固定剂（参见例如，Humason（1967）Animal Tissue Techniques（W.H. Freeman and Co.）。

在其他实施方案中，用蛋白酶例如胰蛋白酶处理Cry毒素多肽可能是有利的，以在将实施方案的杀虫蛋白质组合物应用于靶害虫的环境前激活蛋白质。通过丝氨酸蛋白酶用于激活毒素原的方法是本领域众所周知的。参见例如，Cooksey（1968）Biochem. J. 6:445-454和Carroll和Ellar（1989）Biochem. J. 261:99-105，其教导引入本文作为参考。例如，合适的激活规程包括但不限于在20 nM NaHCO₃，pH 8中以蛋白质/胰蛋白酶的1/100重量比组合待激活的多肽例如纯化的新Cry多肽（例如具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列）和胰蛋白酶，并且使样品在36℃消化3小时。

在害虫已开始出现时或在害虫出现前作为防护措施，通过例如喷雾、雾化、撒粉、播散、涂敷或倾注、引入土壤内或上、引入灌溉水内、通过种子处理或一般应用或撒粉，组合物（包括实施方案的转化的微生物和杀虫蛋白质）可以应用于昆虫害虫的环境。例如，实施方案的杀虫蛋白质和/或转化的微生物可以与谷物混合，以保护在贮存过程中的谷物。一般重要的是获得在植物生长的早期阶段中害虫的良好控制，因为这是植物可以被最严重损害的时间。实施方案的组合物可以方便地包含另一种杀昆虫剂，如果认为这是必要的话。在一个实施方案中，组合物在种植时以组合物的颗粒形式直接应用于土壤，所述组合物具有载体和实施方案的芽孢杆菌属菌株或转化的微生物的死细胞。另一个实施方案是组合物的颗粒形式，所述组合物包括农用化学品例如除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体、和实施方案的芽孢杆菌属菌株或转化的微生物的死细胞。

本领域技术人员将认识到并非所有化合物在针对所有害虫中是同等有效的。实施方案的化合物展示出针对昆虫害虫的活性，这可以包括经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃、观赏植物、食物和纤维、公共和动物健康、家用和商业结构、家庭和贮存产物害虫。昆虫害虫包括选自下述目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目（Hymenoptera）、鳞翅目、食毛目（Mallophaga）、同翅目（Homoptera）、半翅目、直翅目（Orthoptera）、缨翅目（Thysanoptera）、革翅目（Dermaptera）、等翅目（Isoptera）、虱目（Anoplura）、蚤目（Siphonaptera）、毛翅目（Trichoptera）等，特别是鞘翅目和鳞翅目。

鳞翅目的昆虫包括但不限于夜蛾科（Noctuidae）中的黏虫、地老虎、尺蠖和heliothines小地老虎（Agrotis ipsilon Hufnagel）（小地老虎）；西方灰地老虎（A. orthogonia Morrison）（西方地老虎）、黄地老虎（A. segetum Denis & Schiffermüller）（黄地老虎）；A. subterranea Fabricius（粒肤地老虎）；棉叶夜蛾（Alabama argillacea Hübner）（棉叶夜蛾）；梨豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis Hübner）（梨豆夜蛾）；Athetis mindara Barnes and McDunnough（粗皮地老虎）；埃及金刚钻（Earias insulana Boisduval）（埃及金刚钻）；翠纹金刚钻（E. vittella Fabricius）（翠纹金刚钻）；Egira （ Xylomyges ） curialis Grote（柑橘地老虎）；暗缘地老虎（Euxoa messoria Harris）（暗缘地老虎）；棉铃虫（Helicoverpa armigera Hübner）（棉铃虫）；谷实夜蛾（H. zea Boddie）（谷实夜蛾或棉铃虫）；烟芽夜蛾（Heliothis virescens Fabricius）（烟芽夜蛾）；Hypena scabra Fabricius（苜蓿绿叶蛾）；蓓带夜蛾（Mamestra configurata Walker）（蓓带叶蛾）；甘蓝夜蛾（M. brassicae Linnaeus）（甘蓝夜蛾）；Melanchra picta Harris（斑马夜蛾）；粘虫（Pseudaletia unipuncta Haworth）（黏虫）；大豆尺夜蛾（Pseudoplusia includens Walker）（大豆尺夜蛾）；Richia albicosta Smith（西方豆夜蛾）；草地夜蛾（Spodoptera frugiperda JE Smith）（草地夜蛾）；甜菜夜蛾（S. exigua Hübner）（甜菜夜蛾）；斜纹夜蛾（S. litura Fabricius）（斜纹夜蛾、茶蚕）；粉纹夜蛾（Trichoplusia ni Hübner）（粉纹夜蛾）；来自螟蛾科（Pyralidae）和草螟科（Crambidae）的钻蛀虫、鞘蛾、结网毛虫、coneworms和雕叶虫例如小蜡螟（Achroia grisella Fabricius）（小蜡螟）；脐橙螟（Amyelois transitella Walker）（脐橙螟）；地中海粉斑螟（Anagasta kuehniella Zeller）（地中海粉斑螟）；干果斑螟（Cadra cautella Walker）（干果斑螟）；斑禾草螟（Chilo partellus Swinhoe）（斑禾草螟）；二化螟（C. suppressalis Walker）（条纹茎/稻钻蛀虫）；C. terrenellus Pagenstecher（二点螟）；米螟（Corcyra cephalonica Stainton）（米螟）；玉米根草螟（Crambus caliginosellus Clemens）（玉米根草螟）；牧草螟（C. teterrellus Zincken）（牧草螟）；稻纵卷叶野螟（Cnaphalocrocis medinalis Guenée）（稻纵卷叶野螟）；葡萄卷叶螟（Desmia funeralis Hübner）（葡萄卷叶螟）；甜瓜绢野螟（Diaphania hyalinata Linnaeus）（甜瓜绢野螟）；黄瓜绢野螟（D. nitidalis Stoll）（黄瓜绢野螟）；西南玉米杆草螟（Diatraea grandiosella Dyar）（西南玉米杆草螟）、小蔗杆草螟（D. saccharalis Fabricius）（小蔗杆草螟）；南美玉米苗斑螟（Elasmopalpus lignosellus Zeller）（南美玉米苗斑螟）；Eoreuma loftini Dyar（墨西哥稻螟）；烟草粉斑螟（Ephestia elutella Hübner）（烟草（可可）粉斑螟）；大蜡螟（Galleria mellonella Linnaeus）（大蜡螟）；甘蔗螟（Hedylepta accepta Butler）（甘蔗螟）；稻切叶野螟蛾（Herpetogramma licarsisalis Walker）（草螟）；向日葵同斑螟（Homoeosoma electellum Hulst）（向日葵同斑螟）；甜菜网野螟（Loxostege sticticalis Linnaeus）（甜菜网野螟）；豆荚螟（Maruca testulalis Geyer）（豆荚螟）；Orthaga thyrisalis Walker（茶树网蛾（tea tree web moth））；玉米螟（Ostrinia nubilalis Hübner）（玉米螟）；印度谷螟（Plodia interpunctella Hübner）（印度谷螟）；三化螟（Scirpophaga incertulas Walker）（三化螟）；温室结网野螟（Udea rubigalis Guenée）（温室结网野螟）；和卷蛾科（Tortricidae）中的卷蛾（leafrollers）、蚜虫、种子蠕虫和果实蠕虫西部黑头长翅卷蛾（Acleris gloverana Walsingham）（西部黑头长翅卷蛾）；东部黑头长翅卷蛾（A. variana Fernald）（东部黑头长翅卷蛾）；棉褐带卷蛾（Adoxophyes orana Fischer von Rösslerstamm）（棉褐带卷蛾）；黄卷蛾属物种（Archips spp.）包括果树黄卷蛾（A. argyrospila Walker）（果树黄卷蛾）和蔷薇黄卷蛾（A. rosana Linnaeus）（蔷薇黄卷蛾）；带卷蛾属物种（Argyrotaenia spp.）；Bonagota salubricola Meyrick（巴西苹果卷蛾）；色卷蛾属物种（Choristoneura spp.）；Cochylis hospes Walsingham（向日葵细卷蛾）；榛小卷蛾（Cydia latiferreana Walsingham）（榛小卷蛾）；苹果小卷蛾（C. pomonella Linnaeus）（苹果小卷蛾）；Endopiza viteana Clemens（浆果小卷蛾）；女贞细卷蛾（Eupoecilia ambiguella Hübner）（葡萄小卷蛾）；梨小食心虫（Grapholita molesta Busck）（梨小食心虫）；葡萄花翅小卷蛾（Lobesia botrana Denis & Schiffermüller）（葡萄花翅小卷蛾（European grape vine moth））；Platynota flavedana Clemens（杂色卷蛾）；荷兰石竹小卷蛾（P. stultana Walsingham）（杂食卷蛾）；苹白小卷蛾（Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller）（苹白小卷蛾）；和 Suleima helianthana Riley（向日葵草芽小卷蛾）。

在鳞翅目中选择的其他农业害虫包括但不限于，秋尺蠖（Alsophila pometaria Harris）（秋尺蠖）；桃条麦蛾（Anarsia lineatella Zeller）（桃条麦蛾）；栎黄条大蚕蛾（Anisota senatoria J.E. Smith）（栎黄条大蚕蛾）；柞蚕蛾（Antheraea pernyi Guérin-Méneville）（柞蚕蛾（Chinese Oak Silkmoth））；家蚕（Bombyx mori Linnaeus）（家蚕）；棉潜蛾（Bucculatrix thurberiella Busck）（棉潜蛾）；美洲苜蓿粉蝶（Colias eurytheme Boisduval）（美洲苜蓿粉蝶）；核桃舟蛾（Datana integerrima Grote & Robinson）（核桃舟蛾）；落叶松毛虫（Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov）（西伯利亚松毛虫（Siberian silk moth））、榆角尺蠖蛾（Ennomos subsignaria Hübner）（榆角尺蠖蛾）；菩提尺蠖（Erannis tiliaria Harris）（菩提尺蠖）；Erechthias flavistriata Walsingham（蔗芽谷蛾）；黄毒蛾（Euproctis chrysorrhoea Linnaeus）（黄毒蛾）；葡萄叶烟翅斑蛾（Harrisina americana Guérin-Méneville）（葡萄叶烟翅斑蛾）；Heliothis subflexa Guenée；行列大蚕蛾（Hemileuca oliviae Cockrell）（行列大蚕蛾）；美国白蛾（Hyphantria cunea Drury）（美国白蛾）；茄茎麦蛾（Keiferia lycopersicella Walsingham）（茄茎麦蛾）；东方铁杉尺蠖（Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst）（东方铁杉尺蠖）；西方铁杉尺蠖（L. fiscellaria lugubrosa Hulst）（西方铁杉尺蠖）；雪毒娥（Leucoma salicis Linnaeus）（雪毒娥）；舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）（舞毒蛾）；天幕毛虫属物种（Malacosoma spp.）；Manduca quinquemaculata Haworth（五点天蛾、番茄天蛾）；烟草天蛾（M. sexta Haworth）（番茄天蛾、烟草天蛾）；冬尺蠖蛾（Operophtera brumata Linnaeus）（冬尺蠖蛾）；古毒蛾属物种（Orgyia spp.）；春尺蠖（Paleacrita vernata Peck）（春尺蠖）；北美黄斑大黑凤蝶（Papilio cresphontes Cramer）（巨凤蝶、北美黄斑大黑凤蝶）；加州槲蛾（Phryganidia californica Packard）（加州槲蛾）；桔潜蛾（Phyllocnistis citrella Stainton）（桔潜蛾）；斑幕潜叶蛾（Phyllonorycter blancardella Fabricius）（斑幕潜叶蛾（spotted tentiform leafminer））；大菜粉蝶（Pieris brassicae Linnaeus）（大菜粉蝶）；小菜粉蝶（P. rapae Linnaeus）（小菜粉蝶）；绿脉菜粉蝶（P. napi Linnaeus）（绿脉菜粉蝶）；洋葱羽蛾（Platyptilia carduidactyla Riley）（洋葱羽蛾）；菜蛾（Plutella xylostella Linnaeus）（菜蛾）；红铃麦蛾（Pectinophora gossypiella Saunders）（红铃麦蛾）；Pontia protodice Boisduval & Leconte（北美菜粉蝶）；Sabulodes aegrotata Guenée（杂食尺蠖）；红山背舟蛾（Schizura concinna J.E. Smith）（红山背舟蛾）；麦蛾（Sitotroga cerealella Olivier）（麦蛾）；松异舟蛾（Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller）（松异舟蛾）；幂谷蛾（Tineola bisselliella Hummel）（幂谷蛾）；番茄斑潜蝇（Tuta absoluta Meyrick）（番茄斑潜蝇（tomato leafminer））和苹果巢蛾（Yponomeuta padella Linnaeus）（苹果巢蛾）。

使人感兴趣的是鞘翅目的幼虫和成虫包括来自长角象科（Anthribidae）、豆象科（Bruchidae）和象甲科（Curculionidae）的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象（Anthonomus grandis Boheman）（墨西哥棉铃象）；Cylindrocopturus adspersus LeConte（向日葵茎象鼻虫）；蔗根非耳象（Diaprepes abbreviatus Linnaeus）（蔗根非耳象）；三叶草叶象（Hypera punctata Fabricius）（三叶草叶象）；稻根象（Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel）（稻根象）；西印度蔗象指名亚种（Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus）（西印度蔗象指名亚种）；蔗象（M. hemipterus sericeus Olivier）（蔗象）；谷象（Sitophilus granarius Linnaeus）（谷象）；米象（S. oryzae Linnaeus）（米象）；红色种子象（Smicronyx fulvus LeConte）（红色向日葵种子象鼻虫）；灰色种子象（S. sordidus LeConte）（灰色向日葵种子象鼻虫）；玉米隐喙象（Sphenophorus maidis Chittenden）（玉米隐喙象）；新几内亚甘蔗象（Rhabdoscelus obscurus Boisduval）（新几内亚甘蔗象）；叶甲科（Chrysomelidae）中的跳甲、黄瓜甲虫、根虫、叶甲、马铃薯甲虫和潜叶虫，包括但不限于：荒地玉米跳甲（Chaetocnema ectypa Horn）（荒地玉米跳甲）；玉米铜色跳甲（C. pulicaria Melsheimer）（玉米铜色跳甲）；葡萄肖叶甲（Colaspis brunnea Fabricius）（葡萄肖叶甲）；Diabrotica barberi Smith & Lawrence（长角叶甲）；黄瓜十一星叶甲食根亚种（D. undecimpunctata howardi Barber）（黄瓜十一星叶甲食根亚种）；玉米根叶甲（D. virgifera virgifera LeConte）（玉米根叶甲）；马铃薯叶甲（Leptinotarsa decemlineata Say）（马铃薯叶甲）；黑角负泥虫（Oulema melanopus Linnaeus）（黑角负泥虫）；蔬菜黄条跳甲（Phyllotreta cruciferae Goeze）（玉米跳甲）；向日葵叶甲（Zygogramma exclamationis Fabricius）（向日葵叶甲）；来自瓢虫科（Coccinellidae）的甲虫，包括但不限于：墨西哥大豆瓢虫（Epilachna varivestis Mulsant）（墨西哥大豆瓢虫）；来自金龟子科（Scarabaeidae）的金龟子和其他甲虫，包括但不限于：Antitrogus parvulus Britton（Childers cane grub）；北方圆头犀金龟（Cyclocephala borealis Arrow）（北方圆头犀金龟、蛴螬）；南方圆头犀金龟（C. immaculata Olivier）（南方圆头犀金龟、蛴螬）；蔗灰背鳃角金龟（Dermolepida albohirtum Waterhouse）（蔗灰背鳃角金龟）；Euetheola humilis rugiceps LeConte（糙头蔗犀金龟）；Lepidiota frenchi Blackburn（French’s cane grub）；Tomarus gibbosus De Geer（胡萝卜甲虫）；T. subtropicus Blatchley（sugarcane grub）；Phyllophaga crinita Burmeister（蛴螬）；P. latifrons LeConte（June甲虫）；日本弧丽（Popillia japonica Newman）（日本弧丽）；欧洲切根鳃金龟（Rhizotrogus majalis Razoumowsky）（欧洲金龟子）；来自皮蠹科（Dermestidae）的皮蠹；来自叩头虫科（Elateridae）的金针虫，拟步甲属物种（Eleodes spp.），梳爪叩头虫属物种（Melanotus spp.），包括M. communis Gyllenhal（金针虫）；宽胸叩头虫属物种（Conoderus spp.）；叩头虫属物种（Limonius spp.）；Agriotes spp.；Ctenicera spp.；Aeolus spp.；来自小蠹科（Scolytidae）的树皮甲虫；来自拟步甲科（Tenebrionidae）的甲虫；来自天牛科（Cerambycidae）的甲虫，例如但不限于，天牛（Migdolus fryanus Westwood）（天牛）；和来自吉丁虫科（Buprestidae）的甲虫，包括但不限于Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger（leaf-mining buprestid beetle）。

双翅目的成虫和未成年虫是使人感兴趣的，包括潜叶虫玉米斑潜叶蝇（Agromyza parvicornis Loew）（玉米斑潜叶蝇）；蠓包括但不限于：高粱瘿蚊（Contarinia sorghicola Coquillett）（高粱瘿蚊）；小麦瘿蚊（Mayetiola destructor Say）（小麦瘿蚊）；向日葵籽瘿蚊（Neolasioptera murtfeldtiana Felt）,（向日葵籽瘿蚊）；麦红吸浆虫（Sitodiplosis mosellana Géhin）（麦红吸浆虫）；果蝇（实蝇科（Tephritidae））、瑞典麦秆蝇（Oscinella frit Linnaeus）（瑞典麦秆蝇）；蛆包括但不限于：地种蝇属物种（Delia spp.）包括灰地种蝇（Delia platura Meigen）（灰地种蝇）；D. coarctata Fallen（麦瘦种蝇）；夏厕蝇（Fannia canicularis Linnaeus）、F. femoralis Stein（小家蝇）；美洲秆蝇（Meromyza americana Fitch）（美洲秆蝇）；家蝇（Musca domestica Linnaeus）（家蝇）；厩螫蝇（Stomoxys calcitrans Linnaeus）（厩螫蝇））；秋家蝇、西方角蝇、丽蝇、金蝇属物种（Chrysomya spp.）；伏蝇属物种（Phormia spp.）；和其他家蝇（muscoid fly）害虫、马蝇虻属物种（Tabanus spp.）；狂蝇胃蝇属物种（Gastrophilus spp.）；狂蝇属物种（Oestrus spp.）；牛皮蝇皮蝇属物种（Hypoderma spp.）；虻斑虻属物种（Chrysops spp.）；羊蜱蝇（Melophagus ovinus Linnaeus）（羊蜱蝇）；和其他直裂部（Brachycera），蚊伊蚊属物种（Aedes spp.）；按蚊属物种（Anopheles spp.）；库蚊属物种（Culex spp.）；蚋原蚋属物种（Prosimulium spp.）；蚋属物种（Simulium spp.）；蠓、毛蠓、尖眼蕈蚊及其他直裂部（Nematocera）。

作为目的昆虫包括的是半翅目的那些，例如但不限于下述科：球蚜科（Adelgidae）、粉虱科（Aleyrodidae）、蚜科（Aphididae）、链蚧科（Asterolecaniidae）、沫蝉科（Cercopidae）、叶蝉科（Cicadellidae）、蝉科（Cicadidae）、菱蜡蝉科（Cixiidae）、蚧科（Coccidae）、缘蝽科（Coreidae）、全粉蚧科（Dactylopiidae）、飞虱科（Delphacidae）、盾蚧科（Diaspididae）、绒蚧科（Eriococcidae）、蛾蜡蝉科（Flatidae）、蜡蝉科（Fulgoridae）、短头叶蝉科（Issidae）、长蝽科（Lygaeidae）、珠蚧科（Margarodidae）、角蝉科（Membracidae）、盲蝽科（Miridae）、旌蚧科（Ortheziidae）、蝽科（Pentatomidae）、战蚧科（Phoenicococcidae）、根瘤蚜科（Phylloxeridae）、粉蚧科（Pseudococcidae）、木虱科（Psyllidae）、红蝽科（Pyrrhocoridae）和网蝽科（Tingidae）。

来自半翅目的农业上重要的成员包括但不限于：拟缘蝽（Acrosternum hilare Say）（拟缘蝽）；豌豆蚜（Acyrthisiphon pisum Harris）（豌豆蚜）；球蚜属物种（Adelges spp.）（球蚜）；捷苜蓿盲蝽（Adelphocoris rapidus Say）（捷苜蓿盲蝽）；南瓜缘蝽（Anasa tristis De Geer）（南瓜缘蝽）；豆蚜（Aphis craccivora Koch）（豆蚜）；豆卫茅蚜（A. fabae Scopoli）（豆卫茅蚜）；棉蚜（A. gossypii Glover）（棉蚜、棉蚜）；玉米根蚜（A. maidiradicis Forbes）（玉米根蚜）；苹果蚜（A. pomi De Geer）（苹果蚜）；绣线菊蚜（A. spiraecola Patch）（绣线菊蚜）；Aulacaspis tegalensis Zehntner（甘蔗贵盾蚧）；茄沟无网蚜（Aulacorthum solani Kaltenbach）（茄沟无网蚜）；木薯粉虱（Bemisia tabaci Gennadius）（木薯粉虱、甘薯粉虱）；银叶粉虱（B. argentifolii Bellows & Perring）（银叶粉虱）；美洲谷长蝽（Blissus leucopterus leucopterus Say）（美洲谷长蝽）；负子蝽科物种（Blostomatidae spp.）；甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae Linnaeus）（甘蓝蚜）；梨木虱（Cacopsylla pyricola Foerster）（梨木虱）；Calocoris norvegicus Gmelin（马铃薯盲蝽）；草莓钉蚜（Chaetosiphon fragaefolii Cockerell）（草莓钉蚜）；臭虫科物种（Cimicidae spp.）；缘蝽科物种（Coreidae spp.）；棉网蝽（Corythuca gossypii Fabricius）（棉网蝽）；Cyrtopeltis modesta Distant（番茄虫）；黑斑烟盲蝽（C. notatus Distant）（黑斑烟盲蝽）；Deois flavopicta Stål（沫蝉）；柑桔粉虱（Dialeurodes citri Ashmead）（柑桔粉虱）；Diaphnocoris chlorionis Say（honeylocust plant bug）；麦双尾蚜（Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko）（麦双尾蚜（Russian wheat aphid））；Duplachionaspis divergens Green（盾蚧）；车前圆尾蚜（Dysaphis plantaginea Paaserini）（车前圆尾蚜）；美棉红蝽（Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer）（美棉红蝽）；甘蔗粉蚧（Dysmicoccus boninsis Kuwana）（甘蔗粉蚧）；蚕豆微叶蝉（Empoasca fabae Harris）（蚕豆微叶蝉）；苹果绵蚜（Eriosoma lanigerum Hausmann）（苹果绵蚜）；斑叶蝉属物种（Erythroneoura spp.）（葡萄斑叶蝉）；Eumetopina flavipes Muir（岛甘蔗飞虱（Island sugarcane planthopper））；扁盾蝽属物种（Eurygaster spp.）；烟草蝽（Euschistus servus Say）（烟草蝽）；一点蝽（E. variolarius Palisot de Beauvois）（一点蝽）；红腺长蝽属物种（Graptostethus spp.）（complex of seed bugs）；和梅大尾蚜（Hyalopterus pruni Geoffroy）（梅大尾蚜）；吹绵蚧（Icerya purchasi Maskell）（吹绵蚧）；洋葱盲蝽（Labopidicola allii Knight）（洋葱盲蝽）；灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）（灰飞虱）；Leptoglossus corculus Say（leaf-footed pine seed bug）；Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer（甘蔗网蝽）；萝卜蚜（Lipaphis erysimi Kaltenbach）（萝卜蚜）；绿缺盲蝽（Lygocoris pabulinus Linnaeus）（绿缺盲蝽）；美国牧草盲蝽（Lygus lineolaris Palisot de Beauvois）（美国牧草盲蝽）；豆荚草盲蝽（L. Hesperus Knight）（西方牧草盲蝽）；牧草盲蝽（L. pratensis Linnaeus）（common meadow bug）；L. rugulipennis Poppius（欧洲牧草盲蝽）；马铃薯长管蚜（Macrosiphum euphorbiae Thomas）（马铃薯长管蚜）；翠菊叶蝉（Macrosteles quadrilineatus Forbes）（二点叶蝉）；晚秀蝉（Magicicada septendecim Linnaeus）（晚秀蝉）；Mahanarva fimbriolata Stål（甘蔗沫蝉）；高粱蚜（Melanaphis sacchari Zehntner）（高粱蚜）；粉蚧（Melanaspis glomerata Green）（乌盔蚧）；麦无网蚜（Metopolophium dirhodum Walker）（麦无网蚜）；桃蚜（Myzus persicae Sulzer）（桃-马铃薯蚜、桃蚜）；莴苣衲长管蚜（Nasonovia ribisnigri Mosley）（莴苣衲长管蚜）；黑尾叶蝉（Nephotettix cinticeps Uhler）（黑尾叶蝉）；二条黑尾叶蝉（N. nigropictus Stål）（稻叶蝉）；稻绿蝽（Nezara viridula Linnaeus）（稻绿蝽）；褐飞虱（Nilaparvata lugens Stål）（褐飞虱）；小长蝽（Nysius ericae Schilling）（小长蝽）；Nysius raphanus Howard（小长蝽）；美洲稻缘蝽（Oebalus pugnax Fabricius）（美洲稻缘蝽）；美洲脊胸长蝽（Oncopeltus fasciatus Dallas）（美洲脊胸长蝽）；泛奥盲蝽（Orthops campestris Linnaeus）；瘿绵蚜属物种（Pemphigus spp.）（根蚜和根瘤蚜）；玉米短头飞虱（Peregrinus maidis Ashmead）（玉米短头飞虱）；蔗飞虱（Perkinsiella saccharicida Kirkaldy）（蔗飞虱）；美核桃旱矮蚜（Phylloxera devastatrix Pergande）（美核桃旱矮蚜）；桔臀纹粉蚧（Planococcus citri Risso）（桔臀纹粉蚧）；苹果新盲蝽（Plesiocoris rugicollis Fallen）（苹果新盲蝽）；四纹盲蝽（Poecilocapsus lineatus Fabricius）（四纹盲蝽）；棉序盲蝽（Pseudatomoscelis seriatus Reuter）（棉序盲蝽）；粉蚧属物种（Pseudococcus spp.）（其他粉蚧复合物）；Pulvinaria elongata Newstead（cottony grass scale）；蔗短足蜡蝉（Pyrilla perpusilla Walker）（蔗短足蜡蝉）；红蝽科物种（Pyrrhocoridae spp.）；梨圆盾蚧（Quadraspidiotus perniciosus Comstock）（梨圆盾蚧）；猎蝽科物种（Reduviidae spp.）；玉米蚜（Rhopalosiphum maidis Fitch）（玉米蚜）；禾谷缢管蚜（R. padi Linnaeus）（禾谷缢管蚜）；糖粉蚧（Saccharicoccus sacchari Cockerell）（糖粉蚧）；麦二叉蚜（Schizaphis graminum Rondani）（麦二叉蚜）；美甘蔗伪毛蚜（Sipha flava Forbes）（美甘蔗伪毛蚜）；麦长管蚜（Sitobion avenae Fabricius）（麦长管蚜）；白背飞虱（Sogatella furcifera Horvath）（白背飞虱）；纵条飞虱（Sogatodes oryzicola Muir）（纵条飞虱）；Spanagonicus albofasciatus Reuter（白纹盲蝽（whitemarked fleahopper））；苜蓿彩斑蚜（Therioaphis maculata Buckton）（苜蓿彩斑蚜）；谷蛾科物种（Tinidae spp.）；桔声蚜（Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe）（桔声蚜）；和桔蚜（T. citricida Kirkaldy）（桔蚜）；苘麻粉虱（Trialeurodes abutiloneus）（苘麻粉虱）和温室粉虱（T. vaporariorum Westwood）（温室粉虱）；柿尖翅木虱（Trioza diospyri Ashmead）（柿尖翅木虱）；和苹白小叶蝉（Typhlocyba pomaria McAtee）（苹白小叶蝉）。

还包括的是蜱螨目（Acari）（螨）的成虫和幼虫，例如小麦瘤瘿螨（Aceria tosichella Keifer）（麦瘿螨）；榆全爪螨（Panonychus ulmi Koch）（榆全爪螨）；潜岩螨（Petrobia latens Müller）（潜岩螨）；甘蔗茎螨（Steneotarsonemus bancrofti Michael）（甘蔗茎螨）；叶螨科（Tetranychidae）中的叶螨和恙螨（red mites），Oligonychus grypus Baker & Pritchard、印度小爪螨（O. indicus Hirst）（印度小爪螨）、草地小爪螨（O. pratensis Banks）（草地小爪螨）、O. stickneyi McGregor（甘蔗叶螨）；棉叶螨（Tetranychus urticae Koch）（棉叶螨）；迈叶螨（T.mcdanieli McGregor）（迈叶螨）；红叶螨（T. cinnabarinus Boisduval）（红叶螨）；草莓叶螨（T. turkestani Ugarov & Nikolski）（草莓叶螨）、细须螨科（Tenuipalpidae）中的flat mites、葡萄短须螨（Brevipalpus lewisi McGregor）（葡萄短须螨）；瘿螨科（Eriophyidae）中的锈螨和芽螨（bud mites）和其他食叶螨以及在人和动物健康中重要的螨，即在科Epidermoptidae中的尘螨，蠕形螨科（Demodicidae）中的蠕形螨，食甜螨科（Glycyphagidae）中的谷螨，硬蜱科（Ixodidae）目中的蜱，肩突硬蜱（Ixodes scapularis Say）（鹿蜱）；全环硬蜱（I. holocyclus Neumann）（澳大利亚麻痹蜱）；变异革蜱（Dermacentor variabilis Say）（变异革蜱）；美洲花蜱（Amblyomma americanum Linnaeus）（美洲花蜱）；以及痒螨科（Psoroptidae）、蒲螨科（Pyemotidae）和疥螨科（Sarcoptidae）中的马痒螨和疥螨。

缨尾目（Thysanura）的昆虫害虫是使人感兴趣的，例如衣鱼（Lepisma saccharina Linnaeus）（衣鱼）；小灶衣鱼（Thermobia domestica Packard）（小灶衣鱼）。

涵盖的另外节肢动物害虫包括：蜘蛛目（Araneae）中的蜘蛛，例如棕隐士蛛（Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik）（棕隐士蛛）；和黑寡妇蛛（Latrodectus mactans Fabricius）（黑寡妇蜘蛛）；和蚰蜒目（Scutigeromorpha）中的蜈蚣例如蚰蜒（Scutigera coleoptrata Linnaeus）（家蚰蜒）。此外，等翅目的昆虫害虫是使人感兴趣的，包括白蚁科（termitidae）的那些，例如但不限于Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren和好斗拟棘白蚁（Pseudacanthotermes militaris Hagen）（甘蔗白蚁）。缨翅目（Thysanoptera）的昆虫也是使人感兴趣的，包括但不限于蓟马例如Stenchaetothrips minutus van Deventer（甘蔗蓟马）。

昆虫害虫可以就实施方案的组合物在早期发育阶段，例如幼虫或其他未成熟形式中的杀虫活性进行测试。昆虫可以在约20℃ - 约30℃和约30％ - 约70％相对湿度在完全黑暗中饲养。生物测定可以如Czapla和Lang（1990）J. Econ. Entomol. 83（6）：2480-2485中所述进行。饲养昆虫幼虫和执行生物测定的方法是本领域普通技术人员众所周知的。

广泛多样的生物测定技术是本领域技术人员已知的。一般程序包括将实验化合物或生物添加到封闭容器中的饮食来源。杀虫活性可以通过但不限于下述进行测量：在摄食和暴露合适时间长度后的死亡率中的改变、重量减轻、吸引力、驱性以及其他行为和身体改变。本文描述的生物测定可以对于幼虫或成虫期中的任何摄食昆虫害虫使用。

下述实施例为了举例说明而不是限制而呈现。

实验

实施例1： 用于测试苏云金芽孢杆菌毒素针对所选择的昆虫的杀虫活性的生物测定

进行生物测定以评价SEQ ID NO：2中所示的Bt 杀昆虫毒素肽对所选择的昆虫害虫的作用，如表1中所示。摄食测定在包含杀昆虫蛋白质的人工饮食上进行。使用鳞翅目特异性人工饮食局部应用杀昆虫蛋白质。毒素以0.3 μg/25 μL样品/孔的比率应用且允许其干燥。蛋白质在处于pH 10的10 mM碳酸盐缓冲液中。将一个新生幼虫置于每个孔中，以随意摄食5天。对于幼虫反应例如发育障碍和或死亡率，结果表示为阳性的。如果幼虫类似于摄食仅应用上述缓冲液的饮食的阴性对照，那么结果表示为阴性的。

表1： 关于SEQ ID NO：2的摄食生物测定的结果

测试的昆虫	结果
		玉米螟（Ostrinia nubilalis）	+
草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）	-
		小地老虎（Agrotis ipsilon）	-
谷实夜蛾（Heliothis zea）	-
		西南玉米杆草螟（Diatraea grandiosella）	+

实施例2： 通过粒子轰击的玉蜀黍转化和转基因植物的再生

来自温室供体植物的未成熟玉蜀黍胚用包含毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO：1）的DNA分子进行轰击，所述毒素核苷酸序列与泛蛋白启动子和选择标记基因PAT（Wohlleben等人（1988）Gene70：25-37）可操作地连接，所述选择标记基因PAT赋予对于除草剂双丙氨酰膦的抗性。可替代地，选择标记基因在分开的DNA分子上提供。转化如下执行。培养基配方如下。

靶组织的制备

使穗除掉外壳且在30％CLOROX0.5％Micro去污剂中表面灭菌20分钟，并且用无菌水漂洗2次。切除未成熟胚且将胚轴侧向下（小盾片侧向上）放置在560Y培养基上4小时，25个胚/板，并且随后在2.5 cm靶区内在制剂中对齐用于轰击。

DNA 的制备

制备包括与泛蛋白启动子可操作地连接的毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO：1）的质粒载体。例如，合适的转化载体包括来自玉蜀黍的UBI1启动子、来自UBI1的5' UTR和UBI1内含子，与PinII终止子组合。载体另外包含由CAMV35S启动子驱动的PAT选择标记基因并且包括CAMV35S终止子。任选地，选择标记可以位于分开的质粒上。使用如下的CaCl₂沉淀程序，将包括毒素核苷酸序列以及PAT选择标记的DNA分子沉淀到1.1 μm（平均直径）钨小丸上：

100 μL在水中制备的钨粒

10 μL在Tris EDTA缓冲液中的（1 μg）DNA（1 μg总DNA）

100 μL 2.5 M CaC1₂

10 μL 0.1 M亚精胺

将每种试剂顺次添加到钨粒悬浮液中，同时维持在多管涡旋仪(vortexer)上。使最终混合物短暂超声处理，并且允许其在恒定涡旋下温育10分钟。在沉淀时间段后，使管短暂离心，去除液体，用500 mL 100％乙醇洗涤，并且离心30秒。再次去除液体，并且将105 μL 100％乙醇添加到最终钨粒小丸中。对于粒子枪轰击，使钨/DNA粒子短暂超声处理，并且将10 μL点在每个巨载体中心上，并且在轰击前允许其干燥约2分钟。

粒子枪处理

样品板在粒子枪#HE34-1或 #HE34-2中以水平#4进行轰击。所有样品接受650 PSI的单发射击，其中从制备的粒子/DNA的每个管获得总共10个等分试样。

后续处理

在轰击后，使胚维持在560Y培养基上2天，随后转移至包含3 mg/升双丙氨酰膦的560R选择培养基，并且每2周进行传代培养。在选择约10周后，将选择抗性的愈伤组织克隆转移至288J培养基，以起始植物再生。在体细胞胚成熟（2-4周）后，将发育良好的体细胞胚转移至培养基用于萌发，且转移至照亮的培养室。约7-10天后，将发育中的小植物转移至在管中的272V无激素培养基7-10天，直至小植物充分确立。随后将植物转移至包含盆栽土壤的浅苗床中的插入物（inserts in flat）（等价于2.5″罐），并且在生长室中生长1周，随后在温室中生长另外1-2周，随后转移至标准的600罐（1.6加仑）中，并且生长至成熟。通过本领域已知的测定或如上所述监控植物并且就毒素的表达评分。

轰击和培养基

轰击培养基（560Y）包括4.0 g/L N6基础盐（SIGMA C-1416）、1.0 mL/L Eriksson's Vitamin Mix（1000x SIGMA-1511）、0.5 mg/L盐酸硫胺素、120.0 g/L蔗糖、1.0 mg/L 2,4-D和2.88 g/L L-脯氨酸（在用KOH调整至pH 5.8后用dI H₂0达到体积）；2.0 g/L GelritedI H₂0达到体积后添加）；和8.5 mg/L硝酸银（在使培养基灭菌且冷却至室温后添加）。选择培养基（560R）包括4.0 g/L N6 基础盐（SIGMA C-1416）、1.0 mL/L Eriksson's Vitamin Mix（1000x SIGMA-1511）、0.5 mg/L盐酸硫胺素、30.0 g/L蔗糖和2.0 mg/L 2,4-D（在用KOH调整至pH 5.8后用dI H₂0达到体积）；3.0 g/L GelritedI H₂0达到体积后添加）；以及0.85 mg/L硝酸银和3.0 mg/L双丙氨酰膦（两者在使培养基灭菌且冷却至室温后添加）。

植物再生培养基（288J）包括4.3 g/L MS盐（GIBCO 11117-074）、5.0 mL/L MS维生素母液（0.100 g烟酸、0.02 g/L盐酸硫胺素、0.10 g/L盐酸吡哆醇和0.40 g/L甘氨酸，用精加工的D-I H₂0达到体积）（Murashige和Skoog（1962）Physiol. Plant. 15：473）、100 mg/L肌醇、0.5 mg/L玉米素、60 g/L蔗糖和1.0 mL/L 0.1 mM脱落酸（在调整至pH 5.6后用精加工的dI H₂0达到体积）；3.0 g/L GelritedI H₂0达到体积后添加）；以及1.0 mg/L吲哚乙酸和3.0 mg/L双丙氨酰膦（在使培养基灭菌且冷却至60℃后添加）。

无激素培养基（272V）包括4.3 g/L MS盐（GIBCO 11117-074）、5.0 mL/L MS维生素母液（0.100 g/L烟酸、0.02 g/L盐酸硫胺素、0.10 g/L盐酸吡哆醇和0.40 g/L甘氨酸，用精加工的D-I H₂0达到体积）、0.1 g/L肌醇和40.0 g/L蔗糖（在调整至pH 5.6后用精加工的dI H₂0达到体积）；和6 g/L 细菌培养用琼脂（在用精加工的dI H₂0达到体积后添加），灭菌且冷却至60℃。

实施例3：土壤杆菌属介导的玉蜀黍转化和转基因植物的再生

对于土壤杆菌属介导的用毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO：1）的玉蜀黍转化，可以使用Zhao的方法（美国专利号5,981,840和PCT专利公开WO98/32326；其内容在此引入作为参考）。简言之，从玉蜀黍中分离未成熟胚，并且在由此细菌能够将毒素核苷酸序列（SEQ ID NO：1）转移给至少一个未成熟胚的至少一个细胞的条件下，使胚与土壤杆菌属悬浮液接触（步骤1：感染步骤）。在这个步骤中，未成熟胚可以浸入土壤杆菌属悬浮液中用于起始接种。使胚与土壤杆菌属共培养一段时间（步骤2：共培养步骤）。在感染步骤后未成熟胚可以在固体培养基上培养。在这个共培养时间段后，预期任选的“静止”步骤。在这个静止步骤中，在已知抑制土壤杆菌属生长的至少一种抗生素的存在下温育胚，而不添加用于植物转化体的选择剂（步骤3：静止步骤）。未成熟胚可以在含抗生素但不含选择剂的固体培养基上培养，用于消除土壤杆菌属和用于关于受感染细胞的静止期。接下来，使未成熟胚在包含选择剂的培养基上培养，并且回收生长中的转化的愈伤组织（步骤4：选择步骤）。未成熟胚在含选择剂的固体培养基上培养，从而导致转化的细胞的选择性生长。随后使愈伤组织再生成植物（步骤5：再生步骤），并且在选择培养基上生长的愈伤组织可以在固体培养基上培养，以再生植物。

实施例4： 大豆胚的转化

如下用质粒轰击大豆胚，所述质粒包含与pinII启动子可操作地连接的、SEQ ID NO：1的毒素核苷酸序列。为了诱导体细胞胚，从合适的大豆栽培种的表面灭菌的未成熟种子中切开的长度3-5 mm的子叶在光或暗中在26℃在合适的琼脂培养基上培养6 – 10周。随后切开产生次生胚的体细胞胚且置于合适的液体培养基内。在作为早期、球形期胚繁殖的体细胞胚簇的反复选择后，如下所述维持悬浮液。

大豆胚发生悬浮培养物可以维持在35 mL液体培养基中在旋转振荡器、150 rpm上在26℃，伴随以16:8 小时日/夜时间表的开花期光。通过将约35 mg组织接种到35 mL液体培养基内，每2周使培养物传代培养。

随后通过粒子枪轰击的方法（Klein等人（1987）Nature （ London ）327：70-73，美国专利号4,945,050），可以转化大豆胚发生悬浮培养物。Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪器（氦改型）可以用于这些转化。

可以用于促进大豆转化的选择标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子（Odell等人（1985）Nature 313：810-812）、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因（来自大肠杆菌；Gritz等人（1983）Gene 25：179-188）、和来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3'区域组成的转基因。包括与pinII启动子可操作地连接的毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO：1）的表达盒可以作为限制片段分离。这个片段随后可以插入携带标记基因的载体的独特限制位点内。

向50 µL 60 mg/mL 1 µm金颗粒悬浮液中添加（按次序）：5 µL DNA（1 µg/µL）、20 µL亚精胺（0.1 M）和50 µL CaCl₂（2.5 M）。随后使粒子制剂搅拌3分钟，在微量离心机(microfuge)中旋转10秒，并且去除上清液。DNA包被的粒子随后在400 µL 70％乙醇中洗涤1次，并且重悬浮于40 µL无水乙醇中。DNA/粒子悬浮液可以超声处理3次，每次1秒。随后将5微升DNA包被的金颗粒装载到每个巨载体盘上。

将约300-400 mg 2周大的悬浮培养物置于空的60 x 15 mm培养皿中，并且用移液管从组织中去除残留液体。对于每次转化实验，正常轰击约5-10 板组织。将膜破裂压设为1100 磅/英寸²（psi），并且随后使室抽真空至28英寸汞的真空。将组织放置在离开阻滞筛(retaining screen)约3.5英寸，且轰击3次。在轰击后，组织可以分成两半，并且放回到液体内并且如上所述培养。

轰击后5 – 7天，液体培养基可以用新鲜培养基交换，并且轰击后7 – 12天用包含50 mg/mL潮霉素的新鲜培养基交换。这种选择培养基可以每周更新。轰击后7 – 8周，可以观察到绿色转化的组织从未转化的、坏死的胚发生簇的生长。取出分离的绿色组织且接种到个别瓶，以生成新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。每个新系可以作为独立的转化事件进行处理。这些悬浮液随后可以进行传代培养，并且作为未成熟胚的簇维持，或通过个别体细胞胚的成熟和萌发再生成全植物。

说明书中提及的所有公开物、专利和专利申请指示本发明所属领域技术人员的技术水平。所有公开物、专利和专利申请都引入本文作为参考，其程度如同每个个别公开物、专利和专利申请特别且个别指出引入作为参考。

尽管为了清楚理解的目的，本发明已通过举例说明和例子略微详细地进行描述，但将显而易见的是可以在实施方案的范围内实践特定改变和修饰。

序列表

<110> Pioneer Hi-Bred International, Inc.

<120> 具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因

<130> 3103-PCT

<150> 61/146,676

<151> 2009-01-23

<160> 2

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 3174

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）

<220>

<221> misc_feature

<222> (0)...(0)

<223> GS090

<400> 1

atgaatcgaa ataatcaaaa tgaatatgaa gttattgacg cttccacttg tggttgttcg 60

tcagatgatg ttgttcaata ccctttggca agagatccga atgctgtatt ccaaaatatg 120

cattataaag attatttgca aacgtatgat ggagactata caggttctct tataaatcct 180

aacttatcta ttaatcctag agatgtactg caaactggaa ttaatattgt gggaagatta 240

ctaggatttc taggtgttcc atttgctggt cagttagtta ctttctatac ctttctttta 300

aatcaactgt ggccaacaaa tgataatgca gtatgggaag cttttatggc acaaatagag 360

gagcttatta atcaaagaat atccgaagca gtagtaggga cagcagcgga tcatttaacg 420

ggattacacg ataattatga gttatatgta gaggcattgg aggaatggct ggaaagaccg 480

aatgctgcta gaactaatct actttttaat agatttacca ccctagatag tctttttaca 540

caatttatgc caagctttgg tactggacct ggaagtcaaa actacgcagt tccattactt 600

acagtatacg cacaagcagc gaaccttcat ttgttattat taaaggatgc tgaaatatat 660

ggagcaagat ggggactgaa ccaaaatcag attaactcat tccatacgcg ccaacaagaa 720

cgtactcaat attatacaaa tcattgcgta acgacgtata ataccggttt agatagatta 780

agaggcacaa atactgaaag ttggttaaat tatcatcgtt tccgtagaga gatgacatta 840

atggcaatgg atttagtagc gctattccca tattataatg tacgacaata tccaaatgga 900

gcaaatcctc agcttacacg tgaaatatat acggatccaa ttgtatttaa tccaccagct 960

aatgtgggat tatgtagacg ttggggcaat aacccatata atagattttc tgaactagaa 1020

aacgctttta tccgcccgcc acatcttttt gatagattga ataccttaac aattagtaga 1080

aatagatttg acgttgggtc aaactttata gaaccgtggt ctggacatac gttacgccgt 1140

agttattcga ataattcgac agtatatgaa gatagttatg gccaaattac agccacaaga 1200

acaacaatta atctgccggc taatggaact ggccgagtag aatcaacagc agtagatttt 1260

cgtagcgcgc ttgtggggat atacggtgtt aatagagctt cttttattcc aggtggtgtg 1320

tttagtggca cgactcagcc ttctactgga ggatgtagag atttgtatga ttcaagtgat 1380

gaattaccac cagacgaaag tactggaagt tttgcccata gactatctca tgttaccttt 1440

ttaagtttta caactaatca ggccggatcc atagccaatt caggacgcgt ccctacttat 1500

gtctggaccc atcgcgatgt ggactttaat aatacaatta accccaatag aattactcaa 1560

ataccagtgg taaaggcata tgagctaagt agtggtgcta ctgtcgtgaa aggtccagga 1620

ttcacaggag gagatgtaat ccgaagaaca aatattggtg ggttcggagc aataagggtg 1680

tcggtcactg gaccgctaac acaacgatat cgcataaggt tccgttatgc ttcgacaata 1740

gattttgatt tctttgtaac acgtggagga actactataa ataattttag atttacacgt 1800

acaatgaaca ggggacagga atcaagatat gaatcctatc gtactgtaga gtttacaact 1860

ccttttaact ttacacaaag tcaagatata attcgaacat ctatccaggg acttagtgga 1920

aatggggaag tataccttga tagaattgaa atcatccctg taaatccaac acgagaagcg 1980

gaagaggatc tagaagcagc gaagaaagcg gtggcgagct tgtttacacg tacaagggac 2040

ggattacaag taaatgtgac agattatcaa gtcgatcaag cggcaaattt agtgtcatgc 2100

ttatcagatg aacaatatgg gcatgacaaa aagatgttat tggaagcggt aagagcggca 2160

aaacgcctca gccgagaacg caacttactt caggatccag attttaatac aatcaatagt 2220

acagaagaaa atggatggaa agcaagtaac ggcgttacta ttagcgaggg cggtccattc 2280

tataaaggcc gtgcgcttca gctagcaagc gcaagagaaa attacccaac atacatttat 2340

caaaaagtaa atgcatcaga gttaaagccg tatacacgtt atagactgga tgggttcgtg 2400

aagagtagtc aagatttaga aattgatctc attcaccatc ataaagtcca tctcgtgaaa 2460

aatgtaccag ataatttagt atccgatact tactcggatg gttcttgcag tggaatgaat 2520

cgatgtgagg aacaacagat ggtaaatgcg caactggaaa cagaacatca tcatccgatg 2580

gattgctgtg aagcggctca aacacatgag ttttcttcct atattaatac aggcgatcta 2640

aattcaagtg tagatcaagg catttgggtt gtattgaaag ttcgaacaac cgatggttat 2700

gcgacgctag gaaatcttga attggtagag gtcggaccgt tatcgggtga atctctagaa 2760

cgtgaacaaa gggataatgc gaaatggagt gcagagctag gaagaaagcg tgcagaaaca 2820

gatcgcgtgt atcaagatgc caaacaatcc atcaatcatt tatttgtgga ttatcaagat 2880

caacaattaa atccagaaat agggatggca gatattattg acgctcaaaa tcttgtcgca 2940

tcaatttcag atgtgtatag cgatgcagta ctgcaaatcc ctggaattaa ctatgagatt 3000

tacacagagc tatccaatcg cttacaacaa gcatcgtatc tgtatacgtc tcgaaatgcg 3060

gtgcaaaatg gggactttaa cagcggtcta gatagttgga atgcaacagg gggggctacg 3120

gtacaacagg atggcaatac gcatttctta gttctttccc attgggatga agcc 3174

<210> 2

<211> 1058

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (0)...(0)

<223> GS090

<400> 2

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Val Ile Asp Ala Ser Thr

1 5 10 15

Cys Gly Cys Ser Ser Asp Asp Val Val Gln Tyr Pro Leu Ala Arg Asp

20 25 30

Pro Asn Ala Val Phe Gln Asn Met His Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Thr

35 40 45

Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile

50 55 60

Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Leu

65 70 75 80

Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr

85 90 95

Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp

100 105 110

Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Val Val Gly Thr Ala Ala Asp His Leu Thr Gly Leu His Asp

130 135 140

Asn Tyr Glu Leu Tyr Val Glu Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro

145 150 155 160

Asn Ala Ala Arg Thr Asn Leu Leu Phe Asn Arg Phe Thr Thr Leu Asp

165 170 175

Ser Leu Phe Thr Gln Phe Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser

180 185 190

Gln Asn Tyr Ala Val Pro Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn

195 200 205

Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp

210 215 220

Gly Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asn Ser Phe His Thr Arg Gln Gln Glu

225 230 235 240

Arg Thr Gln Tyr Tyr Thr Asn His Cys Val Thr Thr Tyr Asn Thr Gly

245 250 255

Leu Asp Arg Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His

260 265 270

Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu

275 280 285

Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln

290 295 300

Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala

305 310 315 320

Asn Val Gly Leu Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Arg Phe

325 330 335

Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg

340 345 350

Leu Asn Thr Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Phe Asp Val Gly Ser Asn

355 360 365

Phe Ile Glu Pro Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Ser Asn

370 375 380

Asn Ser Thr Val Tyr Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ala Thr Arg

385 390 395 400

Thr Thr Ile Asn Leu Pro Ala Asn Gly Thr Gly Arg Val Glu Ser Thr

405 410 415

Ala Val Asp Phe Arg Ser Ala Leu Val Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg

420 425 430

Ala Ser Phe Ile Pro Gly Gly Val Phe Ser Gly Thr Thr Gln Pro Ser

435 440 445

Thr Gly Gly Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Pro

450 455 460

Asp Glu Ser Thr Gly Ser Phe Ala His Arg Leu Ser His Val Thr Phe

465 470 475 480

Leu Ser Phe Thr Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ser Gly Arg

485 490 495

Val Pro Thr Tyr Val Trp Thr His Arg Asp Val Asp Phe Asn Asn Thr

500 505 510

Ile Asn Pro Asn Arg Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys Ala Tyr Glu

515 520 525

Leu Ser Ser Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly

530 535 540

Asp Val Ile Arg Arg Thr Asn Ile Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val

545 550 555 560

Ser Val Thr Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr

565 570 575

Ala Ser Thr Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr Arg Gly Gly Thr Thr

580 585 590

Ile Asn Asn Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Ser

595 600 605

Arg Tyr Glu Ser Tyr Arg Thr Val Glu Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe

610 615 620

Thr Gln Ser Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly

625 630 635 640

Asn Gly Glu Val Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro

645 650 655

Thr Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Ala

660 665 670

Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp

675 680 685

Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu

690 695 700

Gln Tyr Gly His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala

705 710 715 720

Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn

725 730 735

Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val

740 745 750

Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu

755 760 765

Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asn

770 775 780

Ala Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe Val

785 790 795 800

Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val

805 810 815

His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Ser

820 825 830

Asp Gly Ser Cys Ser Gly Met Asn Arg Cys Glu Glu Gln Gln Met Val

835 840 845

Asn Ala Gln Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys Glu

850 855 860

Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp Leu

865 870 875 880

Asn Ser Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg Thr

885 890 895

Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly

900 905 910

Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala Lys

915 920 925

Trp Ser Ala Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Val Tyr

930 935 940

Gln Asp Ala Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp

945 950 955 960

Gln Gln Leu Asn Pro Glu Ile Gly Met Ala Asp Ile Ile Asp Ala Gln

965 970 975

Asn Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu Gln

980 985 990

Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu Ile Tyr Thr Glu Leu Ser Asn Arg Leu

995 1000 1005

Gln Gln Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Ser Arg Asn Ala Val Gln Asn Gly

1010 1015 1020

Asp Phe Asn Ser Gly Leu Asp Ser Trp Asn Ala Thr Gly Gly Ala Thr

1025 1030 1035 1040

Val Gln Gln Asp Gly Asn Thr His Phe Leu Val Leu Ser His Trp Asp

1045 1050 1055

Glu Ala

Claims (24)

1.一种分离的核酸分子，其选自：

a）SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的核酸分子或其全长互补体；和

b）编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，所述核酸分子不包括a）中的核酸分子或其全长互补体。

2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已设计用于在植物中表达的合成序列。

3.一种DNA构建体，其包括权利要求1的核酸分子。

4.权利要求3的DNA构建体，其进一步包括编码异源多肽的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求3的DNA构建体，所述宿主细胞不为植物细胞。

6.权利要求5的宿主细胞，其为细菌细胞。

7.一种具有杀虫活性的分离的多肽，其为SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽。

8.一种组合物，其包括权利要求7的多肽。

9.权利要求8的组合物，其中所述组合物为粉末。

10.权利要求8的组合物，其中所述组合物为粉屑。

11.权利要求8的组合物，其中所述组合物为小丸。

12.权利要求8的组合物，其中所述组合物为颗粒。

13.权利要求8的组合物，其中所述组合物为喷雾剂。

14.权利要求8的组合物，其中所述组合物为乳剂。

15.权利要求8的组合物，其中所述组合物为胶体。

16.权利要求8的组合物，其中所述组合物为溶液。

17.权利要求8的组合物，其中所述组合物通过苏云金芽孢杆菌细胞的培养物的脱水、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉降或浓缩进行制备。

18.权利要求8的组合物，其包括以重量计1％ - 99％的所述多肽。

19.一种用于控制昆虫害虫群体的方法，其包括使所述群体与杀虫有效量的权利要求7的多肽接触，其中，所述的昆虫害虫为玉米螟（Ostrinia nubilalis）和西南玉米杆草螟（Diatraea grandiosella）。

20.一种用于杀死昆虫害虫的方法，其包括使所述害虫与杀虫有效量的权利要求7的多肽接触，其中，所述的昆虫害虫为玉米螟和西南玉米杆草螟。

21.权利要求20的方法，其包括给所述害虫喂食杀虫有效量的权利要求7的多肽。

22.一种用于产生具有杀虫活性的多肽的方法，其包括在其中表达编码多肽的核酸分子的条件下，培养权利要求5的宿主细胞，所述多肽为SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽。

23.一种用于保护植物不受害虫的方法，其包括将包括核苷酸序列的至少一种表达载体引入所述植物或其细胞内，所述害虫为玉米螟和西南玉米杆草螟，所述核苷酸序列编码杀虫多肽，其中所述核苷酸序列选自：

a）SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的核酸分子；和

b）编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，所述核酸分子不包括a）中的核酸分子。

24.权利要求23的方法，其中所述植物产生具有针对昆虫害虫的杀虫活性的杀虫多肽，所述的昆虫害虫为玉米螟和西南玉米杆草螟。