CN101842384A - 对鳞翅目具有活性的新型苏云金杆菌基因 - Google Patents

对鳞翅目具有活性的新型苏云金杆菌基因 Download PDF

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Abstract

本发明提供了来源于编码某种多肽的苏云金杆菌菌株的核酸及其变体和片段，所述多肽具有针对包括鳞翅目在内的昆虫害虫的杀虫活性。本发明的具体实验方案提供了编码杀虫蛋白的分离的核酸、杀虫组合物、DNA构建体以及含有所述实施方案的核酸的转化微生物和转化植物。这些组合物适用于防治害虫，尤其是植物害虫的方法。

Description

对鳞翅目具有活性的新型苏云金杆菌基因
发明领域
本发明涉及天然存在和重组的核酸，所述核酸来源于编码某种杀虫多肽的新型苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)基因，所述杀虫多肽具有针对昆虫害虫的杀虫活性特征。本发明的组合物和方法利用公开的核酸及其编码的杀虫多肽来防治植物害虫。
发明背景
昆虫害虫是全球农作物损失的一个主要因素。例如粘虫取食、小地老虎(black cutworm)损害或欧洲玉米螟的损害可对农业生产者造成极大的经济损失。昆虫害虫相关的农作物损失是由欧洲玉米螟袭击农田造成的，仅甜玉米在损失和防治方面的花费就达到约十亿美元每年。
传统上用于防治昆虫害虫种群(例如小地老虎种群)的主要方法是应用广谱的化学杀虫剂。然而，消费者和政府管理部门都越来越关注合成化学杀虫剂的生产和使用所造成的环境危害。正因如此，管理部门已禁止或限制某些危险性较大的杀虫剂的使用。因此，开发备选的杀虫剂引起很大的关注。
利用微生物剂(例如真菌、细菌或另外种类的昆虫)对农业上重要的昆虫害虫的生物防治提供了可替代合成化学杀虫剂的、环保又经济的选择。一般来说，使用生物杀虫剂表现出污染和危害环境的风险更低，而且比起传统的广谱化学杀虫剂的特点，生物杀虫剂提供了更好的靶标特异性。此外，生物杀虫剂往往生产成本更底，因此提高了很多品种的农作物的经济产量。
杆菌属的某些种类的微生物具有针对广范围昆虫害虫的杀虫活性，所述昆虫害虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)及其它。苏云金杆菌(Bt)和日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus papilliae)是目前发现最成功的生物防治药物。以下菌株也可使昆虫致病：幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓死芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)(Harwook编辑，((1989)Bacillus(Plenum Press)，306)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)(WO 96/10083)。虽然从营养生长阶段的杆菌也分离到杀虫蛋白，但发现杀虫活性集中在伴胞晶体蛋白包涵体中。已分离并表征数个编码这些杀虫蛋白的基因(参见例如美国专利第5,366,892号和第5,840,868号)。
微生物杀虫剂(特别是来源于杆菌菌株的那些微生物杀虫剂)作为化学害虫防治的替代物在农业中起重要作用。最近，农学家已通过遗传改造农作物使其产生杆菌杀虫蛋白，开发出具有增强的昆虫抗性的农作物。例如，玉米和棉花作物经遗传改造可产生分离自菌株Bt的杀虫蛋白(参见例如Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.59(3)：417-425；Schnepf等(1998)Microbiol Mol Biol Rev.62(3)：775-806)。这些遗传改造的农作物现已在美国农业中广泛使用，为农民提供了可替代传统的昆虫防治方法的环保方法。此外，含有杀虫Cry毒素的经遗传改造的马铃薯已面对美国农民销售。虽然已证明这些遗传工程改造的抗虫农作物在商业上非常成功，但它们仅对很小范围的经济上重要的昆虫害虫有抗性。
因此，仍存在对昆虫害虫具有更大范围的杀昆虫活性的新型Bt毒素(例如有效针对更多种鳞翅目昆虫的毒素)的需要。此外，仍存在具有有效针对多种昆虫害虫的生物杀虫剂以及具有增强的杀昆虫活性的生物杀虫剂的需要。
发明概述
本文提供了用于对昆虫害虫起作用的组合物和方法。更具体地，本发明的实施方案涉及以下对昆虫起作用的方法：该方法利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列来产生能表达本实施方案的杀虫多肽的转化微生物和植物。这样的害虫包括农业上重要的害虫，例如三化螟(Scirpophaga incertulas Walker)。在一些实施方案中，核苷酸序列编码可杀灭属于鳞翅目的至少一种昆虫的多肽。
本发明实施方案提供了一种核酸及其片段和变体，其编码对昆虫害虫有杀虫活性的多肽(例如编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)。本发明实施方案的来源于Bt的野生型(例如天然存在的)核苷酸序列编码新型杀昆虫肽。本发明实施方案进一步提供了公开的核苷酸序列的片段和变体，其编码具有生物活性的(例如杀昆虫的)多肽。
本发明实施方案进一步提供了分离的杀虫(例如杀昆虫)多肽，该多肽由本实验方案中天然存在的或修饰的(例如诱变的或操作的)核酸编码。在具体的实例中，本发明实施方案的杀虫蛋白包含全长蛋白和多肽的片段，所述片段通过诱变的核酸产生，所述核酸经设计而在本发明实施方案的多肽中引入了特定的氨基酸序列。在特定的实施方案中，所述多肽的杀虫活性高于该多肽所来源的天然存在的多肽的活性。
本发明实施方案的核酸还可用于制备转基因的(例如转化的)单子叶植物或双子叶植物，这些植物的特征为基因组中包含至少一种稳定引入了含有本发明实施方案的编码序列的核苷酸构建体，所述构建体可操作地与驱动所编码的杀虫多肽表达的启动子连接。因此，本发明还提供了转化的植物细胞、植物组织、植株及种子。
在具体的实施方案中，可使用经优化以增强在宿主植物中表达的核酸来制备转化植物。例如，可使本发明实施方案的杀虫多肽之一反翻译，以产生包含优化用于在特定宿主(例如农作物如水稻(Oryzasativa))中表达的密码子的核酸。由这样的转化植物(例如双子叶或单子叶植物)表达编码序列将产生杀虫多肽，并赋予该植物提高的抗虫性。一些实施方案提供了表达杀虫多肽的转基因植物，所述杀虫多肽适用于对各种昆虫害虫起作用的方法。
本发明实施方案进一步包括含有本发明实施方案的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫的组合物，并可任选地包含另外的杀昆虫肽。本发明实施方案涵盖对昆虫害虫环境施用这样的组合物以对昆虫害虫起作用。
发明详述
本发明的实施方案涉及作用于昆虫害虫、特别是植物害虫的组合物和方法。更具体地，本发明实施方案的分离的核酸及其片段和变体包含编码杀虫多肽(例如杀虫蛋白)的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白具有针对昆虫害虫(例如但不限于鳞翅目的昆虫害虫)的生物活性(例如能杀灭上述害虫)。靶标昆虫害虫包括但不限于：三化螟(例如三化螟(Scirpophaga incertulas))；欧洲玉米螟(例如Ostrinia nubilalis)；谷实夜蛾(例如谷实夜蛾(Helicoverpa zeae))；普通蛀茎夜蛾(例如(Papiapema nebris))；粘虫(例如白点粘虫(Pseudaletia unipuncta))；玉米草螟(例如Diatraea grandiosella)；小地老虎(例如小地老虎(Agrotisipsilon))；秋夜蛾(例如Spodoptera frugiperda)；贪夜蛾(例如贪夜蛾(Spodoptera exigua))和小菜蛾(例如小菜蛾(Plutella xylostella))。
本发明实施方案的组合物包括：编码杀虫多肽的分离的核酸及其片段和变体、包含所述实施方案的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白以及杀虫组合物。有些实施方案提供了经修饰的杀虫多肽，其特征在于与相应的野生型蛋白的杀虫活性相比针对鳞翅目的杀昆虫活性增强。本发明实施方案进一步提供转化有这些新核酸的植物和微生物、以及涉及这样的核酸、杀虫组合物、转化生物及其产物在作用于昆虫害虫中的应用的方法。
本发明实施方案的核酸和核苷酸序列可用于转化任何生物以制备所编码的杀虫蛋白。本文提供了涉及使用这样的转化生物作用于植物害虫或防治植物害虫的方法。本发明实施方案的核酸和核苷酸序列还可用于转化细胞器如叶绿体(McBride等.(1995)Biotechnology 13：362-365和Kota等.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1840-1845)。
本发明实施方案进一步涉及鉴定编码有生物活性的杀虫蛋白的天然存在的编码序列的片段和变体。本发明实施方案的核苷酸序列直接适用于作用于害虫(尤其是昆虫害虫例如鳞翅目害虫)的方法。因此，本发明实施方案提供了用于对昆虫害虫起作用、但不依赖于使用传统的合成化学杀虫剂的新方法。本发明实施方案涉及天然存在的生物可降解的杀虫剂和编码所述杀虫剂的基因的开发。
本发明实施方案进一步提供了一种天然存在的编码序列的片段和变体，该编码序列也编码有生物活性的(例如杀虫的)多肽。本发明实施方案的核酸包括经优化以由特定生物的细胞表达的核酸或核苷酸序列，例如，根据有提高的杀虫活性的多肽的氨基酸序列，用植物偏爱的密码子反翻译(即反向翻译)的核酸序列。本发明实施方案进一步提供了能赋予本发明实施方案的多肽提高或改变的性能的突变，参见例如同时审查的于2003年6月25日提交的美国专利申请第10/606,320号和于2003年12月24日提交的美国专利申请第10/746,914号。
以下的说明中广泛地使用了大量术语。提供以下的定义有助于理解本发明实施方案。
单位、前缀和符号可用其SI公认形式表示。除非另外说明，否则核酸是按5’-3’的方向从左至右书写，氨基酸序列是按从氨基到羧基的方向从左至右书写。数字范围包括界定该范围的数字在内。本文可通过普遍已知的三字母符号或由IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission推荐的单字母符号表示氨基酸。核苷酸同样可由其普遍公认的单字母码表示。以上定义的术语是通过参考整体说明来更充分界定的。
本文所用“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的多聚体，并且除非另外说明，否则包括具有天然核苷酸基本特性的已知类似物(例如肽核酸)，所述类似物按类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。
本文所用术语“编码”或“所编码的”当在特定核酸的情况下使用时，意指所述核酸包含了指导核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。编码蛋白的信息是通过使用密码子来指定。编码蛋白的核酸可包含在该核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)，或者可缺少这样的间插非翻译序列(例如在cDNA的情况中)。
本文所用的“全长序列”在表示特定的多核苷酸或其编码的蛋白时，意指具有天然的(非合成的)内源序列的全部核酸序列或全部氨基酸序列。全长的多核苷酸编码全长的、催化活性形式的特定蛋白。
本文所用术语“反义”用于核苷酸序列方向的情况中，是指双链体多核苷酸序列以其中反义链被转录的方向与启动子可操作地连接。该反义链足以与内源转录产物互补，致使内源转录产物的翻译往往被抑制。因此，当在特定核苷酸序列的情况中使用术语“反义”时，该术语是指参考转录产物的互补链。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合体。该术语适用于其中一种或多种氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的合成化学类似物的氨基酸聚合体，也适用于天然存在的氨基酸聚合体。
本文可互换使用的术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”是指引入蛋白、多肽或肽(合称“蛋白”)的氨基酸。该氨基酸可为天然存在的氨基酸，除非另外限制，否则该氨基酸可包括天然氨基酸的已知类似物，该类似物可如天然存在的氨基酸的类似方式起作用。
本发明实施方案的多肽可由本文公开的核酸产生或使用标准的分子生物学技术来制备。例如，本发明实施方案的蛋白可通过在合适的宿主细胞中表达本发明实施方案的重组核酸产生，或作为选择可通过离体程序的组合来制备。
本文可互换使用的术语“分离的”和“纯化的”是指大体上或基本上没有其他组分的核酸或多肽或其生物活性部分，所述其他组分通常与所述核酸或多肽在其天然存在的环境中共存或接触。因此，当分离的或纯化的核酸或多肽通过重组技术制备时，大致上没有其它的细胞物质或培养基，或者当用化学方法合成时，大致上没有化学前体或其它的化学品。
“分离的”核酸通常不含在所述核酸所来源的生物的基因组DNA中天然地位于所述核酸侧翼的序列(例如蛋白编码序列)(即位于所述核酸的5’端和3’端的序列)。例如在不同的实施方案中，所述分离的核酸可含有在所述核酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地位于所述核酸侧翼的核苷酸序列，所述核苷酸序列少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb。
本文所用术语“分离的”或“纯化的”在用于提及本发明实施方案的多肽时，意指分离的蛋白基本不含细胞物质并且包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重的)污染蛋白的蛋白制备物。当本发明实施方案的蛋白或其生物活性部分通过重组方式制备时，培养基表示少于约30％、20％、10％或5％(干重)的化学前体或非目标蛋白的化学品。
本说明书中各处的用词“包含”或变型(例如“含有”或“包括”)应理解为暗示包括所陈述的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的集合，但不排除任何其它的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的集合。
本文所用术语“作用于昆虫害虫”是指引起昆虫在发育的任何阶段的取食、生长和/或行为方面的变化，这些变化包括但不限于：杀灭昆虫；妨碍生长；阻碍繁殖力；拒食活性等。
本文作为同义词使用的术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”是指生物体或物质(例如蛋白)的活性，所述活性通过(但不限于)以下各项来测量：在喂饲并暴露合适的一段时间后，害虫死亡率、害虫体重减轻、害虫驱避性以及害虫的其它的行为变化和生理变化。因此，具有杀虫活性的生物体或物质对害虫适度中至少一种可测量的参数有不利影响。例如“杀虫蛋白”是通过自身或与其它蛋白联合表现出杀虫活性的蛋白。
本文所用术语“杀虫有效量”意指当存在于害虫的环境中时具有杀虫活性的物质或生物体的量。对于每种物质或生物体而言，杀虫有效量是针对特定的环境中受影响的每种害虫根据经验来决定的。同样地，当害虫为昆虫害虫时，“杀昆虫有效量”可用于表示“杀虫有效量”。
本文所用术语“重组改造的”或“改造的”意指基于对蛋白的作用机制的理解并考虑被插入、缺失或取代的氨基酸，利用重组DNA技术在蛋白结构中引入(例如改造)变化。
本文所用术语“突变的核苷酸序列”或“突变”或“诱变的核苷酸序列”意指诱变或改变成含有相应的野生型序列中并不存在的一个或多个核苷酸残基(例如碱基对)的核苷酸序列。这样的诱变或改变是由一个或多个核酸残基的添加、缺失或取代或置换组成。当通过添加、去除或置换蛋白水解位点的氨基酸来进行突变时，只要能达到突变的目的(即只要改变该位点处的蛋白水解作用)，可在蛋白水解位点基序之内或附近进行这样的插入、去除或置换。
突变的核苷酸序列可编码显示出增强或减弱的杀虫活性的突变的杀昆虫毒素，或编码赋予含氨基酸序列的多肽增强或减弱的杀昆虫活性的氨基酸序列。在蛋白、多肽或氨基酸序列的情况中，本文所用术语“突变体”或“突变”是指诱变或改变成含有一个或多个在相应野生型序列中不存在的氨基酸残基的序列。这样的诱变或改变由一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代或置换组成。突变的多肽显示出增强或减弱的杀昆虫活性，或表示赋予含氨基酸序列的多肽增强的杀昆虫活性的氨基酸序列。因此，术语“突变体”或“突变”是指突变的核苷酸序列和其编码的氨基酸之一或两者。突变体可单独使用或与本发明实施方案的其它突变体或另外的突变体以任何合适的组合使用。“突变的多肽”可相反地表现出杀昆虫活性的降低。当在特定的核酸或蛋白中添加不止一个突变时，该突变可同时或序贯地添加；若序贯地添加，则突变可以任何合适的次序添加。
本文所用术语“增强的杀昆虫活性”或“增强的杀虫活性”是指：相对于其相应的野生型蛋白具有增强的杀昆虫活性的本发明实施方案的杀昆虫多肽，和/或有效针对更大范围的昆虫的杀昆虫多肽，和/或具有特异性针对对野生型蛋白的毒性不敏感的昆虫的杀昆虫多肽。得出杀虫活性增强或提高的结论需要证明针对靶昆虫的杀虫活性，相对于野生型的杀昆虫多肽针对相同昆虫所确定的杀虫活性，增大至少10％，或增大至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％或300％或更多。
例如，当相对于野生型Bt毒素影响的昆虫范围而言多肽能作用于范围更宽或更窄的昆虫时，所述肽提供了增强的杀虫或杀昆虫活性。当需要多样性时，更宽的作用范围可能是所需的；而当例如使用或存在毒素可能会另外地影响有益昆虫时，更窄的作用范围可能是所需的。当本发明实施方案不受任何特定的作用机制限制时，还可通过改变多肽的一种或多种特性提供增强的杀虫活性，例如昆虫消化道中多肽的稳定性或存活力相对于相应野生型蛋白的稳定性或存活力可能增强。
本文所用术语“毒素”是指表现出杀虫活性、杀昆虫活性、增强的杀虫活性或增强的杀昆虫活性的多肽。“Bt”或“苏云金杆菌”毒素意指包括了存在于不同Bt菌株中更广种类的Cry毒素，包括例如Cry1s、Cry2s或Cry3s等毒素。
术语“蛋白水解位点”或“切割位点”是指一种氨基酸序列，其赋予对一类蛋白酶或特定的蛋白酶的敏感性，致使含有所述氨基酸序列的多肽被这类蛋白酶或特定的蛋白酶消化。蛋白水解位点被认为对识别该位点的一种或多种蛋白酶是“敏感的”。为本领域所理解的是，消化的效率可变化，并且消化效率的降低可导致多肽在昆虫消化道中稳定性或存活力增大。因此，蛋白水解位点可赋予对不止一种或不止一类蛋白酶的敏感性，但不同的蛋白酶对该位点消化的效率可能不同。蛋白水解位点包括例如胰蛋白酶位点、胰凝乳蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。
研究显示，鳞翅目的昆虫消化道蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶，参见例如Lenz等.(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212和Hedegus等.(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47。例如，在棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫的中肠中已发现约18种不同的胰蛋白酶(参见Gatehouse等.(1997)InsectBiochem.Mol.Biol.27：929-944)。这些蛋白酶偏爱的蛋白水解底物位点已经过研究，参见例如Peterson等.(1995)Insect Biochem.Mol.Biol.25：765-774。
人们已着力研究Bt毒素的作用机制并将其改造成具有增强的性能的毒素。研究显示昆虫消化道的蛋白酶可影响Bt Cry蛋白对该昆虫的作用。有些蛋白酶通过将Cry蛋白从“原毒素”形式加工成毒性形式或“毒素”来活化Cry蛋白。参见Oppert(1999)Arch.Insect Biochem.Phys.42：1-12和Carroll等.(1997)J.Invertebrate Pathology 70：41-49。毒素的此类活化可包括去除蛋白的N端和C端肽，还可包括蛋白的内部剪切。可降解Cry蛋白的其它蛋白酶参见Oppert，ibid。
特异性不同的Cry毒素氨基酸序列的比较结果显示了五个高度保守的序列段(sequence block)。就结构上来说，该毒素包含了三个不同的结构域，从N端到C端为：涉及孔形成的7个α螺旋的簇(称为“结构域1”)、涉及细胞结合的3个反向平行的β片层(称为“结构域2”)和一个β夹层(称为“结构域3”)。这些结构域的位置和性质为本领域技术人员所已知。参见例如Li等.(1991)Nature，305：815-821和Morse等.(2001)Structure，9：409-417。当提及特定的结构域(例如结构域1)时，应理解对于具体序列而言结构域的确切端点并不重要，只要该序列或其部分包含能提供该特定结构域的至少某些功能的序列即可。因此，例如当提及“结构域1”时，意指包含7个α螺旋的簇的特定序列，但对于该簇而言所用或所提及的序列的确切确端点并不重要。本领域的技术人员熟知如何确定上述端点以及如何评价上述功能。
为了更好地表征并改良Bt毒素，已对细菌Bt菌株做出了研究。结果发现，自Bt菌株的培养物制备的晶体制备物具有针对欧洲玉米螟的杀虫活性(参见例如实验性实施例1、2和3)。经过努力鉴定了编码所选菌株的晶体蛋白的核苷酸序列，并从这些细菌菌株中分离出本发明实施方案的野生型(即天然存在的)核酸，将其克隆进表达载体并转化至大肠杆菌(E.coli)中。根据既定制备物的特性，认识到证明杀虫活性有时需要进行胰蛋白酶预处理，以活化杀虫蛋白。因此，应理解有些杀虫蛋白需要蛋白酶的消化(例如通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等消化)得以活化，而其它蛋白在不需要活化的情况下具有生物活性(例如杀虫活性)。
可通过例如于2003年6月25号提交的美国申请第10/606,320号和于2003年12月24号提交的美国申请第10/746,914号中所述方法来改变这样的分子。此外，可将核酸序列改造成编码含有另外的突变的多肽，所述突变赋予了与天然存在的多肽的杀虫活性相比增强或改变的杀虫活性。这样改造的核酸的核苷酸序列包含野生型序列中不存在的突变。
本发明实施方案的突变多肽通常用包括以下步骤的方法来制备：获得编码Cry家族多肽的核酸序列；基于对靶结构域在毒素作用方式中拟定的功能的考虑，分析该多肽结构以确定用于诱变潜在的基因序列的具体“靶”位点；将一个或多个突变引入核酸序列中，使所编码的多肽序列中的一个或多个氨基酸残基产生所需改变；测定所制备多肽的杀虫活性。
Bt的杀昆虫毒素中有许多因它们的氨基酸序列及三级结构的相似性而不同程度地相关，用于获得Bt毒素的晶体结构的方法是已知的。在文献中可找到Cry3A和Cry3B多肽两者的例示性高分辨率晶体结构。已了解清楚的Cry3A基因结构(Li等.(1991)Nature 353：815-821)使得能了解该毒素的结构和功能之间的关系。综合考虑已公布的Bt毒素结构分析和已报道的与特定结构、基序等相关的功能，表明该毒素的特定区域与其特定功能和该蛋白作用模式的各别的步骤相关。例如，分离自Bt的很多毒素一般被描述为包含以下三个结构域：涉及孔形成的7-α螺旋束、涉及受体结合的3片层结构域、以及β夹层基序(Li等.(1991)Nature 305：815-821)。
如美国专利第7,105,332号和于2003年12月24号提交的审查中的美国申请第10/746,914号中报道，Cry蛋白的毒力可通过靶向位于该毒素的结构域1中α螺旋3和4之间的区域而增强。该理论是依据许多与杀虫毒素有关的认识而提出的，包括：1)研究报道，Cry3A毒素的结构域1中α螺旋4和5会插入到易感昆虫中肠的衬细胞的脂质双层中(Gazit等.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：12289-12294)；2)发明人对野生型蛋白的氨基酸序列内胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位点的位置的认识；3)野生型蛋白在体外用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理活化后更有效地针对某些昆虫的观察结果；以及4)从3′端开始消化毒素导致对昆虫毒力的降低的报道。
可产生一系列突变并将其置于多种背景序列中，以产生具有增强或改变的杀虫活性的新型多肽。参见例如于2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号(现已撤回)和于2003年12月24日提交的美国申请第10/746,914号。这些突变包括但不限于：在位于结构域1的螺旋3和4之间区域中添加至少一种或多种蛋白酶敏感位点(例如胰蛋白酶切割位点)；用不同的蛋白酶敏感性位点置换野生型序列中原有的蛋白酶敏感性位点；在特定位置添加多个蛋白酶敏感性位点；在一个或多个蛋白酶敏感性位点附近添加氨基酸残基以改变多肽的折叠，从而提高在一个或多个蛋白酶敏感性位点处对多肽的消化；添加突变以保护多肽免受使毒力下降的降解消化(例如作一系列突变，其中用缬氨酸置换野生型氨基酸以保护多肽免受消化)。可单独或以任何组合使用突变来提供本发明实施方案的多肽。
本发明实施方案以这种方式提供了含有多个突变的序列，例如含有位于所编码多肽的结构域1中α螺旋3和4之间的另外的或备选的蛋白酶敏感性位点的突变。在另外的或备选的蛋白酶敏感性位点处的突变可能对几类蛋白酶是敏感的，例如包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在内的丝氨酸蛋白酶或例如弹性蛋白酶的酶。因此，可设计在另外的或备选的蛋白酶敏感性位点处的突变，使该位点易于被一类蛋白酶(例如哺乳动物蛋白酶或昆虫蛋白酶)识别和/或切割。还可将蛋白酶敏感性位点设计成被生物体中产生的一类或一种特定的酶切割，例如由棉铃虫(Heliothis zea)产生的胰凝乳蛋白酶(Lenz等.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16：201-212)。突变还可赋予对蛋白水解消化的抗性，例如对胰凝乳蛋白酶在多肽C端的消化作用的抗性。
编码多肽的氨基酸序列中存在另外的和/或备选的蛋白酶敏感性位点可提高本发明实施方案的核酸编码的多肽的杀虫活性和/或特异性。因此，本发明实施方案的核苷酸序列可经过重组改造或操作，以产生较未修饰的野生型毒素具有提高或改变的杀虫活性和/或特异性的多肽。此外，本文公开的突变可置于其它的核苷酸序列中或与其它的核苷酸序列联合使用以提供增强的性能。例如，易于被昆虫的胰凝乳蛋白酶(例如披肩粘虫或谷实夜蛾中存在的胰凝乳蛋白酶)切割的蛋白酶敏感性位点(Hegedus等.(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47和Lenz等.(1991)Arch.Insect Biochem.PhysioL.16：201-212)可置于Cry背景序列中，以向该序列提供增强的毒力。本发明实施方案以这种方式提供了具有增强性质的毒性多肽。
例如，诱变的Cry核苷酸序列可包括添加突变，所述突变含有将第二个胰蛋白酶敏感性氨基酸序列(除天然存在的胰蛋白酶位点之外)引入所编码多肽的添加密码子。本发明实施方案的备选的添加突变包括添加码子，所述添加密码子经过设计以将至少一个另外不同的蛋白酶敏感性位点(例如位于紧接在天然存在的胰蛋白酶位点的5′或3′的胰凝乳蛋白酶敏感性位点)引入多肽中。或者，可产生取代突变，其中破坏编码天然存在的蛋白酶敏感性位点的核酸中至少一个密码子，并且将另外的密码子引入核酸序列中以提供不同的(例如取代的)蛋白酶敏感性位点。还可向Cry序列中添加置换突变，其中破坏在编码多肽中存在的天然存在的胰蛋白酶切割位点，并将胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶切割位点引入该位置中。
应认识到的是，可使用编码作为蛋白水解位点或推测的蛋白水解位点(例如序列NGSR、RR或LKM)的氨基酸序列的任何核苷酸序列，而且向不同的多肽中引入任何这些切割位点所使用的确切的密码子可根据应用(即在特定的植物种类中表达)而变化。还应认识到，可将任何公开的突变引入到本发明实施方案的任何多核苷酸序列中，所述核苷酸序列包含提供靶向修饰的天然胰蛋白酶切割位点的氨基酸残基所对应的密码子。因此，全长毒素或其片段的变体可修饰成含有另外的或备选的切割位点，而且这些实施方案旨在包含在本文公开的实施方案的范围之内。
本领域的技术人员应理解的是，只要编码的多肽能保留杀虫活性，可在本发明实施方案的序列中添加任何有用的突变。因此，还可突变序列使所编码的多肽能抵抗胰凝乳蛋白酶的蛋白水解消化作用。可在特定位置以任何组合添加不止一个识别位点，并且可向毒素添加或从毒素去除多个识别位点。因此，添加突变可包括三个、四个或更多个识别位点。应认识到在任何合适的多核苷酸序列中可改造产生多个突变；因此，可将全长序列或其片段修饰成含有另外的或备选的切割位点并且能抵抗蛋白水解的消化。本发明实施方案以这种方式提供了含有能提高杀虫活性的突变的Cry毒素、改良的组合物和用其它的Bt毒素作用于害虫起的方法。
突变可保护多肽免受蛋白酶的降解，例如通过去除推测的蛋白水解位点，例如不同区域的推测的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点。这样的推测位点可部分或全部去除或改变，致使原位点处的蛋白水解作用减少。可通过比较突变多肽与野生型毒素，或比较氨基酸序列不同的突变毒素来评价蛋白水解的变化。蛋白水解位点和推测的蛋白水解位点包括但不限于以下序列：RR(胰蛋白酶切割位点)；LKM(胰凝乳蛋白酶位点)和NGSR(胰蛋白酶位点)。只要能增强多肽的杀虫活性，可通过添加或缺失任何数目和种类的氨基酸残基来改变这些位点。因此，含有突变的核苷酸序列所编码的多肽与天然或背景序列相比，应包含至少一个氨基酸的改变或添加，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、32个、35个、38个、40个、45个、47个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个或更多个氨基酸的改变或添加。正如本领域所已知，还可通过截短天然或全长的序列来提高多肽的杀虫活性。
本发明实施方案的组合物包括编码杀虫多肽的核酸及其片段和变体。具体而言，本发明实施方案提供了分离的核酸分子及其片段和变体，其包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1中所述的核苷酸序列)及其片段和变体。
还感兴趣的是编码本发明实施方案的杀虫蛋白的优化的核苷酸序列。本文所用短语“优化的核苷酸序列”是指优化用于在特定生物体(例如植物)中表达的核酸。可利用本领域已知的方法为任何感兴趣的生物体制备优化的核苷酸序列。参见例如2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号(现已撤回)以及于2003年12月24日提交的美国申请第10/746,914号，以上两个申请描述了编码所公开杀虫蛋白的优化核苷酸序列。在该实例中，如下制备核苷酸序列：通过反向翻译蛋白的氨基酸序列并改变该核苷酸序列，使其含有玉米偏爱密码子但仍编码相同的氨基酸序列。该方法详见Murray等.(1989)Nucleic AcidsRes.17：477-498。优化的核苷酸序列适用于提高杀虫蛋白在植物(例如禾本科(Gramineae，Poaceae)的单子叶植物，例如玉米或谷类植物)中的表达。
本发明实施方案进一步提供了由本发明实施方案的天然存在或修饰的核酸编码的分离的杀虫(例如杀昆虫)多肽。更特别地，本发明实施方案提供了包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的多肽，以及由本文所述的核酸(例如SEQ ID NO：1中所述的核酸)编码的多肽，以及它们的片段和变体。
在具体的实施方案中，本发明实施方案的杀虫蛋白提供了全长的杀昆虫多肽、全长杀昆虫多肽的片段及变体多肽，所述变体多肽产生自设计以将特定的氨基酸序列引入本发明实施方案的多肽中的诱变的核酸。在具体的实施方案中，引入到多肽中的氨基酸序列包括为酶(例如蛋白酶)提供切割位点的序列。
本领域已知Bt毒素的杀虫活性通常是在昆虫消化道中由各种蛋白酶切割肽而被活化。由于肽在昆虫消化道中并不总是完全有效地被切割，因此全长毒素的片段相对于全长毒素本身可能具有增强的杀虫活性。因此，本发明实施方案的某些多肽含有全长杀虫多肽的片段，并且多肽的片段、变体和突变体中的某些与其所来源的天然存在的多肽相比杀虫活性增强，特别是如果在筛选活性前天然存在的杀昆虫多肽在体外不被蛋白酶活化。因此，本申请包含了序列的截短形式或片段。
突变可存在于任何背景序列(包括上述的截短多肽)中，只要多肽能保留杀虫活性即可。利用本领域已知的或本文其它地方所述的测定法，本领域的技术人员可很容易地对两种或更多种蛋白的杀虫活性进行比较。应理解本发明实施方案的多肽可通过表达本文公开的核酸或使用标准的分子生物学技术来制备。
已知杀虫蛋白可为寡聚体，并且在分子量、残基数目、组成肽、对特定害虫的活性和其它特征方面可不同。然而，可根据本文所述的方法，将有效针对多种害虫的蛋白分离并表征。本发明实施方案的杀虫蛋白可与其它Bt毒素或其它杀虫蛋白联合使用，以扩大昆虫靶标的范围。此外，本发明实施方案的杀虫蛋白与其它Bt毒素或不同特性的其它杀昆虫成分联合使用，具有预防和/或治理昆虫抗性的特殊功效。其它的杀虫物质包括蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸型)、α-淀粉酶和过氧化物酶。
本发明实施方案还包括所述核苷酸及其编码的氨基酸序列和多肽的片段及变体。本文所用术语“片段”是指本发明实施方案的多核苷酸的部分核苷酸序列或多肽的部分氨基酸序列。核苷酸序列的片段可编码保留了天然或相应的全长蛋白的生物学活性因此具有杀虫活性的蛋白片段。因此，应认识到本发明实施方案的多核苷酸和氨基酸序列中有些可合理地称为片段和突变体。
应理解当术语“片段”用于提及本发明实施方案的核酸序列时，还包括可用作杂交探针的序列。此类核苷酸序列通常并不编码保留生物学活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸并且多至编码本发明实施方案的蛋白的全长核苷酸序列。
编码本发明实施方案的杀虫蛋白的生物学活性部分的本发明实施方案的核苷酸序列的片段编码至少15个、25个、30个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个或1200个邻接的氨基酸，或多至本发明实施方案的杀虫多肽中的氨基酸总数(例如，对于SEQ ID NO：2而言为670个氨基酸)。因此，应理解本发明实施方案还包括以下多肽：所述多肽为本发明实施方案的例示性杀虫蛋白片段，并具有长度为至少15个、25个、30个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个或1200个邻接的氨基酸，或多至本发明实施方案的杀虫多肽中的氨基酸总数(例如，对于SEQ ID NO：2而言为670个氨基酸)。用作杂交探针或PCR引物的本发明实施方案核苷酸序列的片段通常不需要编码杀虫蛋白的生物活性部分。因此，本发明实施方案的核酸片段可编码杀虫蛋白的生物活性部分，或者所述片段可以是利用本文公开的方法可用作杂交探针或PCR引物的片段。杀虫蛋白的生物活性部分可通过以下方法制备：分离本发明实施方案的核苷酸序列之一的一部分，表达该杀虫蛋白的编码部分(例如通过体外重组表达)并评价该杀虫蛋白的编码部分的活性。
作为本发明实施方案的核苷酸序列片段的核酸包含至少16个、20个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个或2000个核苷酸，或多至本文公开的核苷酸序列中的核苷酸数目(例如对于SEQ ID NO：1而言为1902个核苷酸)。具体的实施方案的构想片段来源于(例如产生自)本发明实施方案的第一核酸，其中该片段编码具有杀虫活性特征的截短毒素。本发明实施方案的多核苷酸片段所编码的截短多肽具有杀虫活性的特征，该杀虫活性与该片段所来源的第一核酸编码的相应全长多肽的活性相等或较之增强。应预见的是，本发明实施方案中这样的核酸片段可在天然或相应的全长编码序列的3′端处截短。核酸片段还可同时在天然或相应的全长编码序列的3′或5′端处截短。
本文所用术语“变体”是指基本相似的序列。对于核苷酸序列，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而编码本发明实施方案的杀虫多肽之一的氨基酸序列的那些序列。例如上述这些的天然存在的等位基因变体可通过使用已知的分子生物学技术(例如本文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)来鉴定。
变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，例如通过利用定点诱变得到但仍编码本发明实施方案的杀虫蛋白(例如突变的毒素)的核苷酸序列。通常，根据本文其它地方所述的比对程序并使用默认参数所确定，本发明实施方案的特定核苷酸序列的变体应具有与所述特定核苷酸序列至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。本发明实施方案的核苷酸序列的变体可与该序列相差少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)、少至5个核苷酸、少至4个、3个、2个或甚至1个核苷酸。
本发明实施方案的特定核苷酸序列的变体(即例示性核苷酸序列)还可通过比较变体核苷酸序列所编码的多肽和参考核苷酸序列所编码的多肽之间的序列同一性百分比来评价。因此，例如本发明公开了一种分离的核酸，其编码的多肽具有与多肽SEQ ID NO：2的既定的序列同一性百分比。任何两条多肽之间的序列同一性百分比可利用本文其它地方所述的序列比对程序并使用默认参数来计算。任何一对既定的本发明实施方案的多核苷酸是通过比较它们所编码的两条多肽共有的序列同一性百分比来评价，两条编码多肽的序列同一性百分比为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％，通常为至少约75％、80％、85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或至少约98％、99％或更大的序列同一性。
本文所用术语“变体蛋白”包括按以下方式由天然蛋白衍生的多肽：在天然蛋白的N端和/或C端缺失(所谓的截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白中的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白中的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸。因此，术语“变体蛋白”包括天然蛋白的生物活性片段，所述片段含有足以保留天然蛋白的生物学活性(即具有杀虫活性)的数目的邻接氨基酸残基。只要能保留杀虫活性，这样的杀虫活性可与其天然蛋白不同或较之增强或可不变。
本发明实施方案包含的变体蛋白是有生物活性的，亦即它们仍具有所需的天然蛋白的生物活性，即本文所述的杀虫活性。这样的变体可由例如遗传多态性或人为操作产生。根据本文其它地方所述的序列比对程序并使用默认参数所确定，本发明实施方案的天然杀虫蛋白的生物活性的变体，与所述天然蛋白的氨基酸序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。本发明实施方案的蛋白的生物活性变体可与所述蛋白相差少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(例如6-10个)、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。
本发明实施方案进一步包括一种微生物，所述微生物转化了：本发明实施方案的至少一种核酸、包含所述核酸的表达盒、或含有所述表达盒的载体。在一些实施方案中，所述微生物为在植物上繁殖的微生物。本发明的实施方案涉及包囊的杀虫蛋白，其包括能表达至少一种本发明实施方案的杀虫蛋白的转化微生物。
本发明实施方案提供了包含本发明实施方案的转化微生物的杀虫组合物。在这样的实施方案中，所述转化微生物通常连同合适的载体以杀虫有效量存在于杀虫组合物中。本发明实施方案还包括以下杀虫组合物：所述组合物包含杀虫有效量的单独或与本发明实施方案的转化生物体联合的分离的本发明实施方案的蛋白、和/或包囊的本发明实施方案的杀虫蛋白、以及合适的载体。
本发明实施方案进一步提供了扩大昆虫靶标范围的方法，该方法通过联用本发明实施方案的杀虫蛋白与至少一种其它的或“第二种”杀虫蛋白。本领域已知的任何杀虫蛋白可用于本发明实施方案的方法中。这样的杀虫蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶和过氧化物酶。
本发明实施方案还包括含有本发明实施方案的至少一种核苷酸序列的转化植物或转基因植物。在一些实施方案中，植物稳定转化了核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包含本发明实施方案的至少一种核苷酸序列，所述序列与在植物细胞中驱动表达的启动子可操作地连接。本文所用术语“转化植物”和“转基因植物”是指基因组内含有异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合在转基因或转化植物的基因组中，以至于所述多核苷酸可传代至连续世代中。异源多核苷酸可单独或作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。
应理解本文所用术语“转基因”包括其基因型由于异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初就被如此改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖得到的那些转基因体。本文所述术语“转基因”并不包括通过传统的植物育种方法或通过自然界中发生的事件(例如随机的异花受精)、非重组的病毒感染、非重组的细菌转化、非重组的转座或自发突变来改变基因组(染色体基因组或染色体外基因组)。
本文所用术语“植物”包括整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞以及它们的子代。转基因植物的部分落入本发明实施方案的范围之内，并包括例如转基因植物或其子代来源的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，它们先前已转化了本发明实施方案的DNA分子并因此由至少部分转基因细胞组成。
本文所用术语植物包括能再生为植株的植物细胞、植物原生质体和植物细胞组织培养物，以及在植物中完整的植物的愈伤组织、植物块和植物细胞，或植物的一部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、谷穗、穗轴、壳、杆、根、根尖和花药等。可用于本发明实施方案的方法中的此类植物一般可宽至适用于转化技术的高等植物类别(包括单子叶植物和双子叶植物)。这样的植物包括例如马铃薯(Solanum tuberosum)和玉米(Zea mays)。
虽然本发明实施方案并不依赖特定的生物学机制来提高植物对植物害虫的抗性，但在植物中表达本发明实施方案的核苷酸序列可导致本发明实施方案的杀虫蛋白的产生，并提高植物对植物害虫的抗性。本发明实施方案的植物适用于农业中作用于昆虫害虫的方法。某些实施方案提供了转化的农作物(例如玉米植物)，其适用于对植物的昆虫害虫(例如欧洲玉米螟)起作用的方法。
“受试的植物或植物细胞”是指其中因目标基因而发生遗传改变(例如转化)的植物或植物细胞，或者如此改变的植物或细胞或所繁衍的并且包含所述改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”为检测受试的植物或植物细胞的表型变化提供了参考点。
对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型的植物或细胞，即与用于遗传改变以得到受试植物或细胞的原材料具有相同基因型的植物或细胞；(b)与原材料具有相同基因型但已转化了无效构建体(即转化了对目标性状没有已知影响的构建体，例如含有标记基因的构建体)的植物或植物细胞；(c)从受试植物或植物细胞的子代中分离的非转化的植物或植物细胞；(d)与受试的植物或植物细胞在遗传上相同，但并不暴露在能诱导目标基因表达的条件或刺激物下的植物或植物细胞；或(e)在目标基因并不表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。
本领域的技术人员应很容易理解，分子生物学领域的前沿技术(例如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白质工程技术)提供了适用于改变或改造农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在基因序列的一系列广泛的工具和实验方案。
因此，本发明实施方案的蛋白可以以多种方式(包括氨基酸的取代、缺失、截短和插入)改变。用于这些操作的方法通常为本领域所已知。例如，可通过将突变引入合成的核酸(例如DNA分子)中来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。用于诱变和改变核酸的方法为本领域所已知。例如，可利用寡核苷酸介导的定点诱变技术引入所设计的改变。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利第4,873,192号；Walker和Gaastra编辑.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)，以上文献在此引作参考。
可对本发明实施方案的诱变的核苷酸序列进行修饰，使所编码多肽的原始序列改变约1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、12个或更多个氨基酸。或者，可在天然序列中引入甚至更多个改变，使所编码蛋白与相应野生型蛋白相比，可具有至少约1％或2％、或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、或甚至约13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％、21％、22％、23％、24％、或25％、30％、35％、或40％或更多的改变或修饰的密码子。同样地，所编码蛋白与相应野生型蛋白相比，可具有至少约1％或2％、或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、或甚至约13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％、21％、22％、23％、24％、或25％、30％、35％、或40％或更多的添加密码子。应理解的是，本发明实施方案的诱变的核苷酸序列旨在包括具有杀虫活性的生物功能相当的肽，杀虫活性例如为由针对秋夜蛾幼虫拒食性确定的增强的杀虫活性。这样的序列可能产生自已知天然存在于核酸序列及其编码蛋白中的密码子冗余和功能等效。
本领域的技术人员应认识到的是，氨基酸的添加和/或取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性(例如取代基的疏水性、电荷、大小等)。考虑了以上的各种特征的例示性氨基酸取代基团为本领域技术人员所已知，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
不影响目标蛋白的生物活性的合适氨基酸取代的有关指南可参见Dayhoff等的模型：(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，其在此引作参考。可进行保守取代，例如用具有相似性质的一种氨基酸交换另一种氨基酸。
因此，本发明实施方案的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列及突变形式两者。同样地，本发明实施方案的蛋白包括天然存在的蛋白及其变体(例如截短多肽)和修饰形式(例如突变形式)。这些的变体仍应具有所需的杀虫活性。显然，对编码变体的核苷酸序列作出的突变决不能安排在阅读框之外的序列中，而且一般来说不应产生能引起mRNA二级结构的互补区。参见欧洲专利申请公开第75,444号。
本文包含的蛋白序列的缺失、添加和取代并不期需使该蛋白的特性产生根本变化。然而，在进行上述取代、缺失或添加之前很难预测它们的确切效果，本领域的技术人员应理解该效果可通过常规的筛选测定法(例如昆虫饲喂测定法)来评价。参见例如Marrone等.(1985)J.Econ.Entomol.78：290-293以及Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485，上述文献在此引作参考。
变体核苷酸序列和蛋白还包括通过诱变方法和重组方法(例如DNA改组(DNA shuffling))得到的序列和蛋白。可使用这样的方法操作一种或多种不同的编码序列，从而得到具有所需性能的新型杀虫蛋白。重组多核苷酸文库是以这种方式由一群相关序列的多核苷酸产生，所述多核苷酸包含具有基本的序列同一性并可在体内外同源重组的序列区。例如，可使用该方法，在本发明实施方案的核苷酸序列和其它已知的Cry核苷酸序列的相应部分之间，对本发明实施方案的全长编码序列、编码目的结构域的序列基序或核苷酸序列的任何片段进行改组，以得到编码具有增强的目标性能的新基因。
目标性能包括但不限于：每单位杀虫蛋白的杀虫活性、蛋白稳定性以及对非靶向物种(特别是人、家畜和表达本发明实施方案的杀虫多肽的植物和微生物)的毒性。本发明实施方案并不受特定的改组策略的限制，只要这样的改组策略涉及本发明实施方案的至少一种核苷酸序列或其部分即可。改组可涉及仅在本文公开的核苷酸序列或可还涉及本领域已知的其它核苷酸序列的改组。DNA改组的策略为本领域已知。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等.(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等.(1998)Nature 391：288-291以及美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。
本发明实施方案的核苷酸序列还可用于从其它生物体、特别是其它细菌、更特别是其它的杆菌菌株中分离相应的序列。据此，可使用诸如PCR、杂交等方法基于这样的序列与本文所述序列的序列同源性来鉴定这样的序列。基于序列与本文所述完整序列或其片段的序列同一性选择的序列包括在本发明实施方案中。这样的序列包括所公开的序列的直向同源物。术语“直向同源物”是指来源于共同的祖先基因但由于物种形成导致在不同的物种中存在的基因。当不同物种中的基因的核苷酸序列和/或其编码的蛋白序列共有本文其它地方所定义的基本同一性时，这些基因被认为是直向同源物。直向同源物的功能在各物种之间往往是高度保守的。
在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以扩增从任何的目标生物体中提取的cDNA或基因组DNA的相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常为本领域已知并公开于以下文献中：Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)，下文中简称″Sambrook″。还参见Innis等编辑(1990)PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编辑(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand编辑(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于利用以下引物的方法：配对引物、嵌套引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等。
在杂交技术中，已知的核苷酸序列的全部或部分可用作探针，所述探针与选定的生物体中一群克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)中存在的其它相应的核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它的寡核苷酸，并且可用可检测基团(例如32P)或任何其它的可检测标记物来标记。因此，例如可通过基于本发明实施方案的序列来标记合成的寡核苷酸，以制备用于杂交的探针。用于杂交的探针的制备方法以及构建cDNA和基因组文库的方法通常为本领域所已知并公开于Sambrook中。
例如，本文公开的完整序列或其一个或多个部分可用作能特异性地与相应的序列和信使RNA杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这样的探针包含本发明实施方案的序列中特有的序列并且通常长度为至少约10或20个核苷酸。这样的探针可用于通过PCR由选定的生物体扩增相应的Cry序列。该技术可用于从所需生物体中分离另外的编码序列，或用作诊断测定以确定生物体中编码序列的存在情况。杂交技术包括平板DNA文库的杂交筛选(噬菌斑或菌落，参见例如Sambrook)。
这样的序列的杂交可在严格条件下进行。本文所用术语“严格条件”或“严格的杂交条件”指的是在该条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍、5倍或10倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下将会不同。可通过控制杂交的严格性和/或洗涤条件，确定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调整严格条件以允许序列中存在一些错配，致使可检测更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000或500个核苷酸。
通常，严格条件应为：盐的浓度少于约1.5M钠离子，通常是约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)浓度，pH在7.0-8.3，对于短探针(例如10-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，而对于长探针(例如大于50个核苷酸)，温度为至少约60℃。严格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺现实。例示性的低严格条件包括在37℃下用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并在50-55℃下用1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。例示性的中度严格条件包括在37℃下用40-45％甲酰胺、1.0M NaCl和1％SDS的缓冲溶液杂交，并在55-60℃下用0.5X-1X SSC洗涤。例示性的高度严格条件包括在37℃下用50％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS的缓冲溶液杂交，并最终在60-65℃下用0.1X SSC洗涤至少约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％-约1％的SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，通常约4-约12小时。
特异性通常与杂交后洗涤相关，关键因素是最终洗涤液的离子强度和温度。对于DNA之间的杂交，其Tm(热解链温度)可由Meinkoth和Wahl的方程式(1984)Anal.Biochem.138：267-284粗略计算得到：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M为一价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比；“％甲酰胺”为杂交液中甲酰胺的百分比，而L是杂交体的碱基对长度。Tm是(在限定的离子强度和pH条件下)50％的互补靶序列与完全配对的探针杂交下的温度。洗涤通常至少进行到达到平衡并且实现低水平的本底杂交(例如持续2小时、1小时或30分钟)。
对于每1％的错配可使Tm减少约1℃；因此可调整Tm、杂交和/或洗涤的条件，使所需同一性的序列杂交。例如，若寻找具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，在限定的离子强度和pH下，所选择的严格条件比特异性序列及其互补序列的Tm低约5℃。不过，非常严格的条件可用比Tm低约1、2、3或4℃的温度进行杂交和/或洗涤；中度严格的条件可用比Tm低约6、7、8、9或10℃的温度进行杂交和/或洗涤；低度严格的条件可用比Tm低约11、12、13、14、15或20℃的温度进行杂交和/或洗涤。
在使用所述方程式、杂交和洗涤组合物和所需Tm时，本领域的技术人员应理解的是，本文原本就描述了杂交液和/或洗涤液的严格性的变型。若所需错配的程度使Tm少于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则可增大SSC的浓度致使可使用更高的温度。核酸杂交的详尽指南参见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)和Ausubel等编辑.(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。还参见Sambrook。因此，编码本发明实施方案的Cry蛋白并且在严格条件下与本文公开的Cry序列或与其片段杂交的分离的序列包括在本发明实施方案中。
以下术语用于描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列(reference sequence)”、(b)“比较窗口(comparisonwindow)”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“基本同一性”。
(a)本文所用“参考序列”是用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可为特定序列的子集或全部，例如全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。
(b)本文所用“比较窗口”是指多核苷酸序列的邻接的特定区段，其中比较窗口中的多核苷酸序列可包含相对于参考序列(其不包含添加或缺失)的添加或缺失(即缺口)，实现两条序列的最佳比对。通常，比较窗口的长度为至少20个邻接的核苷酸，并且任选长度可为30个、40个、50个、100个或更长。本领域的技术人员理解的是，为了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而与参考序列高度相似，通常引入空位罚分并将其从配对数目中减去。
用于比较序列的比对方法为本领域所已知。因此，用数学算法可确定任何两个序列之间的序列同一性百分数。这样的数学算法的非限制性实例为：Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部搜索比对法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中被改进。
这些数学算法的计算机执行程序可用于比较序列以确定序列同一性。这样的执行程序包括但不限于：PC/Gene程序的CLUSTAL(购自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(2.0版)和第10版GCG Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(购自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA)。可用默认参数进行这些程序的比对。CLUSTAL程序参见Higgins等(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等(1992)CABIOS 8：155-65和Pearson等(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序是以上文所述的Myers和Miller(1988)的算法为基础的。当比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12、空位罚分4的ALIGN程序。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序是以上文所述的Karlin和Altschul(1990)的算法为基础的。可用分值＝100、字长＝12的BLASTN程序进行BLAST核苷酸的搜索，获得与编码本发明实施方案的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可用分值＝50、字长＝3的BLASTX程序进行BLAST蛋白的搜索，获得与本发明实施方案的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了进行以比较为目的的空位比对，可使用Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389所述的Gapped BLAST(BLAST 2.0中)。或者，可使用PSI-BLAST(BLAST 2.0中)进行迭代搜索，检测分子间的远缘关系。参见上文的Altschul等(1997)。当使用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可使用各程序中的默认参数(例如对于核苷酸序列为BLASTN，而对于蛋白为BLASTX)。参见网址为ncbi.hlm.nih.gov的生物技术信息国际中心(National Center forBiotechnology Information)网站。还可通过手动检查进行比对。
除非另外说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP第10版并使用以下参数得到的值：使用空位权值(GAP Weight)为50和长度权值(Length Weight)为3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵得到核苷酸序列的同一性％和相似性％；利用空位权值为8和长度权值为2和BLOSUM62评分矩阵得到氨基酸序列的同一性％和相似性％；或任何等效程序。本文所用术语“等效程序”是指用于任何两个比较序列(sequence in question)的任何序列比较程序，当与用GAP第10版产生的相应比对进行比较时，所述比较程序产生的比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基配对和相同的序列同一性％。
GAP使用上文所述的Needleman和Wunsch(1970)的算法，以寻找使配对数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的对比情况。GAP考虑了所有可能的对比情况和缺口位置，并产生具有最大配对碱基数和最少缺口数的比对。它允许提供以配对碱基为单位的空位生成罚分和空位延伸罚分。GAP必须为插入的每个空位产生配对的空位建立罚分数。若选定空位延伸罚分大于零，则GAP还必须为插入的每个空位获得空位长度乘以空位延伸罚分。在第10版的GCG WisconsinGenetics软件包中，默认的空位生成罚分和空位延伸罚分对于蛋白质序列而言分别为8和2。对于核苷酸序列而言，缺省的空位生成罚分为50而缺省的空位延伸罚分为3。空位生成罚分和空位延伸罚分可表示为由0-200的组成的整数之一。因此，例如，空位生成罚分和空位延伸罚分可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP代表最佳比对家族的成员之一。虽然该家族中可能有很多成员，但没有其它成员具有更好的性质。GAP展示了对比的四个品质因数：有效性(Quality)、比率(Ratio)、同一性(Identity)和相似性(Similarity)。有效性是为了比对序列而最大化的度量因数。比率是将有效性除以较短的片区段的碱基数。同一性百分比是实际配对的符号的百分比。相似性百分比是相似的符号的百分比。忽略空位对面的符号。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性的阈值)时，则将分值计入相似性中。第10版GCG Wisconsin Genetics软件包中所用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
(c)本文所用术语“序列同一性”或“同一性”在两个核酸或多肽序列的情况下是指：当在规定的比较窗口中作最大对应性比对时，两个序列中相同的残基。应认识到的是，当用序列同一性百分比提及蛋白时，不相同的残基位置往往在于保守的氨基酸取代基的不同，即氨基酸残基被具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的其它的氨基酸残基所取代，因此并不改变分子的功能性。当序列之间在于保守取代的不同时，可向上调序列同一性百分比，以校正取代的保守特性。因这样的保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这样调整的方法为本领域技术人员所已知。通常这涉及将保守取代作为部分错配而非完全错配来评分，从而提高了序列同一性百分比。因此，例如当相同的氨基酸得1分而非保守取代得0分时，保守取代得到0-1之间的分数。保守的取代的评分例如如系统PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所用方法来执行。
(d)本文所用术语“序列同一性百分比”意指在比较窗口内通过比较两个最佳比对序列所确定的值，其中比较窗口中的多核苷酸序列的一部分与参考序列(其并不包含添加或缺失)相比可包括添加或缺失(即缺口)，以实现两个序列的最佳比对。以上的百分比通过以下方法计算：确定两个序列中存在的相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数，得到配对的位置数；将配对的位置数除以比较窗口的位置总数；将结果乘以100得到序列同一性百分比。
(e)(i)术语多核苷酸序列的“基本同一性”意指：当使用所述比对程序之一并使用标准参数与参考序列进行比较时，多核苷酸包含具有至少70％、80％、90％、或95％或更大的序列同一性。本领域的技术人员应知道，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、可读框定位等，可适当地调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白的相应同一性。为了这些目的，氨基酸序列的基本同一性通常意指至少60％、70％、80％、90％、或95％或更大的序列同一性。
核苷酸序列具有基本同一性的另外的指征为两个分子是否能在严格条件下彼此杂交。通常，在限定的离子强度和pH下，对特定序列而言，严格条件选定为比Tm低约5℃。然而，根据本文其它地方限定的所需严格程度，严格条件包括范围在比Tm低约1℃-约20℃的温度。在严格条件下彼此不杂交的核酸，若其编码的多肽具有基本同一性，则所述核酸仍具有基本同一性。例如当利用遗传密码所允许的最大程度的密码子简并性来产生核酸拷贝时，这种情况可能发生。当由第一核酸编码的多肽能与第二核酸编码的多肽发生免疫交叉反应时，则表示这两个核酸序列具有基本同一性。
(e)(ii)术语肽的“基本同一性”表示在特定的比较窗口中包含具有与参考序列至少70％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性的序列的肽。可使用上文所述的Needleman和Wunsch(1970)的全局比对算法来进行为了这些目的的最佳比对。两个肽序列具有基本同一性的指征是一个肽与针对第二个肽所产生的抗体可发生免疫反应。因此，例如当两个肽区别仅在于保守取代时，那么其中一个肽与第二个肽具有基本同一性。“基本相似的”肽共有如上所述的序列，只是不相同的残基位置可能区别在于保守氨基酸改变。
本文所用术语“核苷酸构建体”并不旨在将本发明实施方案限制为包含DNA的核苷酸构建体。本领域技术人员应认识到的是，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合组成的多核苷酸和寡核苷酸，也可应用于本文所公开的方法中。本发明实施方案中的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还包括这样的构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，本发明实施方案的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖了所有可以在用于转化植物的本发明实施方案的方法中使用的核苷酸构建体、分子和序列，其包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合组成的那些。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明实施方案的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖了所有形式的核苷酸构建体，其包括但不限于：单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。
另一个实施方案涉及转化的生物体，例如选自以下的生物体：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类。所述转化的生物体包含：本发明实施方案的DNA分子、包含所述DNA分子的表达盒或包含所述表达盒的载体，它们可稳地掺入到转化生物体的基因组中。
本发明实施方案的序列在用于在目标生物体中表达的DNA构建体中提供。该构建体应包含与本发明实施方案的序列可操作地连接的5′和3′的调节序列。本文所用术语“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间功能性连接，其中启动子序列引发并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。通常，可操作地连接意指被连接的核酸序列是邻接的，并且当必要时连接两个邻接的并且在相同的可读框中的蛋白编码区。构建体还可含有至少一种被共转化至生物体的另外的基因。或者，在多种DNA构建体上可提供一种或多种另外的基因。
所提供的这样的DNA构建体具有多个限制性位点，所述位点用于插入Cry毒素序列并使其受到调控区的转录调节。DNA构建体还可包含选择性标记基因。
DNA构建体以5’至3’的转录方向包含：转录和翻译起始区(即启动子)、本发明实施方案的DNA序列以及在作为宿主的生物体中起作用的转录和翻译的终止区(即终止区)。对于宿主生物体和/或本发明实施方案的序列而言，转录起始区(即启动子)可为天然的、类似的、外源的或异源的。或者，启动子可为天然序列或合成序列。本文所用术语“外源的”表示启动子并不存在于被引入启动子的天然生物中。当启动子对于本发明实施方案的序列而言为“外源的”或“异源的”时，意味着对于被可操作地连接的本发明实施方案的序列而言，所述启动子并非天然的或天然存在的启动子。本文所用嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，所述转录起始区对于编码序列来说是异源的。当启动子是天然或自然的序列时，被可操作地连接的序列的表达与野生型的表达相比有所改变，这导致了表型的改变。
终止区可对于转录起始区、被可操作地连接的目标DNA序列、或植物宿主而言是天然的，或者可来自另一来源(即相对于启动子、目标序列、植物宿主或其任何组合而言是外源或异源的)。
合适的终止区来自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶的终止区。参见例如Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91：151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi等(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。
如果合适的话，可优化核酸以增强在宿主生物中的表达。因此，当宿主生物为植物时，可用植物偏爱的密码子来合成核酸以增强表达。参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11关于使用宿主偏爱的密码子的论述。例如，尽管本发明实施方案的核酸序列可同时在单子叶植物和双子叶植物品种中表达，但可修饰序列以满足单子叶植物或双子叶植物中特定的密码子偏爱和GC含量偏爱，因为研究显示这些偏爱是不同的(Murray等.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498)。因此，对于特定的氨基酸而言，玉米偏爱的密码子可来源于已知的玉米基因序列。玉米植物中28个基因的玉米密码子的使用在上述Murray等的表4中列出。用于合成植物偏爱基因的方法为本领域所已知。参见例如美国专利第5,380,831号和第5,436,391号，以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，其在此引作参考。
另外的序列修饰方法已知用于增强细胞宿主中基因的表达。这些修饰包括：消除编码假多腺苷酸化信号(spurious polyadenylation signal)的序列、消除编码外显子-内含子剪接位点信号的序列、消除转座子样重复序列和消除其它可能对基因表达不利的充分表征的序列。可根据通过参考宿主细胞中表达的已知基因所计算，将序列的GC含量调整至既定细胞宿主的平均水平。本文所用术语“宿主细胞”是指含有载体并支持目标表达载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可为原核细胞(例如大肠杆菌)、或真核细胞(如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞)、或单子叶植物或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例为玉米宿主细胞。如果可能的话，对序列进行修饰以避免产生预测的mRNA二级发夹结构。
表达盒还可包含5’前导序列。这样的前导序列可用于增强翻译。翻译的前导序列为本领域所已知并包括：小RNA病毒前导序列(例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Stein等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130))；马铃薯Y病毒前导序列(例如TEV前导序列(烟草蚀斑病毒)(Gallie等.(1995)Gene 165(2)：233-238)、MDMV(玉米矮花叶病毒)的前导序列、人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等.(1991)Nature 353：90-94)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等.(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列(Gallie等.(1989)在Molecular Biology of RNA中，Cech编辑(Liss，New York)，第237-256页)；以及玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)的前导序列(Lommel等.(1991)Virology 81：382-385)。还参见Della-Cioppa等.(1987)PlantPhysiol.84：965-968。
在制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以便以合适方向(如果合适的话，在合适的可读框中)提供DNA序列。为此，可用衔接物或接头连接DNA片段或其它可能有关的操控序列，以提供合适的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为了该目的，可涉及体外诱变、引物修复、限制性、退火、置换(例如转换和颠换)。
许多启动子可用于本发明实施方案的实践中。启动子可基于所需结果来选择。核酸可与组成型、组织偏爱性的、诱导型或其它的启动子联合用于在宿主生物体中表达。用于在植物宿主细胞中表达的合适组合型启动子包括：例如Rsyn7启动子的核心启动子和其它组成型启动子(于WO 99/43838和美国专利第6,072,050号中公开)；CaMV 35S核心启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等。其它的组成型启动子包括例如以下的美国专利中详述的那些启动子：5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
根据所需结果，用诱导型启动子表达基因可能是有利的。其中特别感兴趣的是用于调节本发明实施方案的核苷酸序列在植物中表达的创伤诱导型启动子。这样的创伤诱导型启动子可对由昆虫取食所造成的损伤作出反应，其包括：马铃薯蛋白酶抑制因子(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等(1996)NatureBiotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美国专利第5,428,148号；win1和win2(Stanford等(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(McGurl等(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok等(1994)Plant J.6(2)：141-150)等，以上文献在此引作参考。
此外，病原体诱导型启动子可用于本发明实施方案的核苷酸构建体和所述方法。这样的病原体诱导型启动子包括致病相关蛋白(PR蛋白)的那些启动子，其通过病原体的感染诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如Redolfi等(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等(1992)Plant Cell 4：645-656和VanLoon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。还参见WO 99/43819，其在此引作参考。
感兴趣的是在病原体感染部位或附近局部表达的启动子。参见例如Marineau等(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton等(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch等(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14972-14977。还参见Chen等(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner等(1993)PlantJ.3：191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利第5,750,386号(线虫诱导型启动子)并在此引作参考。特别感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰孢(Fusariummoniliforme)诱导(参见例如Cordero等(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。
化学调节型启动子可用于通过应用外源的化学调节物来调节植物中的基因的表达。根据不同的目的，启动子可为化学诱导型启动子，其中应用化学品能诱导基因表达；或者启动子可为化学抑制型启动子，其中应用化学品能抑制基因表达。化学诱导型启动子为本领域所已知并包括但不限于玉米In2-2启动子(由苯磺酰胺类除草剂安全剂来活化)、玉米GST启动子(由用作萌发前除草剂的疏水性亲电化合物来活化)以及烟草PR-1a启动子(由水杨酸活化)。其它感兴趣的化学调节型启动子包括类固醇反应性启动子(参见例如Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237，以及美国专利第5,814,618号和第5,789,156号)，以上文献在此引作参考。
组织偏爱型启动子可用于靶向特定的植物组织中杀虫蛋白的增强表达。组织偏爱型启动子包括以下文献中论述的那些启动子：Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)255-265；Kawamata等(1997)PlantCell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3)：495-505。若有需要，这样的启动子可修饰用于减弱表达。
叶片偏爱型启动子为本领域所已知，参见例如Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138以及Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。
根偏爱型或根特异性启动子是已知的，并且可选自文献中论述的许多启动子或者可从各种适合的物种中重新分离。参见例如Hire等(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根癌农杆菌甘露碱合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao等(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见Bogusz等(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了分离自固氮非豆科植物Parasponia andersonii和相关的非固氮非豆科植物山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因的两种根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸酶报告基因连接并引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)中，在以上两个实例中保留了根特异性的启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中高度表达的rolC和rolD根诱导型基因的启动子分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们总结了这些启动子中分离的增强子和组织偏爱型DNA决定子。Teeri等(1989)将与lacZ融合的基因用于表明：农杆菌T-DNA基因编码的章鱼碱合成酶特别在根尖的表皮中有活性，并且TR2′基因在完整的植株中是根特异性的而在叶片组织中会受到损伤的刺激，这是适用于杀虫或杀幼虫基因的特别需要的特性组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示出类似的特性。另外的根偏爱型启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)和rolB启动子(Capana等(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691。还参见美国专利第5,837,876号、第5,750,386号、第5,633,363号、第5,459,252号、第5,401,836号、第5,110,732号和第5,023,179号。
“种子偏爱型”启动子包括“种子特异性”启动子(这些启动子在种子发育过程中有活性，例如种子贮藏蛋白启动子)和“种子萌发”启动子(这些启动子在种子萌发过程中有活性)。参见Thompson等(1989)BioEssays 10：108，在此引作参考。这样的种子偏爱型启动子包括但不限于：Cim1(细胞分裂素诱导型信息启动子)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白启动子(19kDa zein))以及milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶启动子)(参见美国专利第6,225,529号，在此引作参考)。γ-玉米醇溶蛋白启动子(Gamma-zein)和Glob-1为胚乳特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于：菜豆β-菜豆蛋白启动子(β-phaseolin)、油菜籽蛋白启动子(napin)、β-羽扇豆球蛋白启动子(β-conglycinin)、大豆凝集素启动子(soybean lectin)、cruciferin等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于：玉米的15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1启动子(globulin 1)等。还参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏爱型启动子，该文献在此引作参考。特定组织中“偏爱地”表达的启动子是指在该组织中比在至少一种其它的植物组织中表达的程度更大。某些组织偏爱型启动子显示出几乎是在特定组织中专一性地表达。
当需要低水平表达时，应使用弱启动子。通常，本文所用术语“弱启动子”是指驱动编码序列以低水平表达的启动子。低水平表达是指在约1/1000转录物-约1/100000转录物-约1/500000转录物的水平。或者，应认识到的是，术语“弱启动子”还包括仅在极少细胞但不在其它细胞中驱动表达从而得到低的总体表达水平的启动子。当启动子以难以接受的高水平驱动表达时，可去除或修饰启动子序列的一部分以降低表达的水平。
这样的弱组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利第6,072,050号)、35S CaMV核心启动子等。其它的组成型启动子包括，例如美国专利第5,608,149号、第5,608,144号、第5,604,121号、第5,569,597号、第5,466,785号、第5,399,680号、第5,268,463号、第5,608,142号和第6,177,611号等公开的那些，以上文献在此引作参考。
通常，表达盒应包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因；以及能赋予对除草剂抗性的基因，例如草铵膦(glufosinate ammonium)、溴草腈(bromoxynil)、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸盐(2，4-D)。合适的选择性标记基因的另外的实例包括但不限于编码对以下抗性素的抗性基因：氯霉素(chloramphenicol)(HerreraEstrella等(1983)EMBO J.2：987-992)；甲氨喋呤(methotrexate)(HerreraEstrella等(1983)Nature 303：209-213和Meijer等(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820)；链霉素(streptomycin)(Jones等(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)；壮观霉素(spectinomycin)(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.5：131-137)；博来霉素(bleomycin)(Hille等(1990)PlantMol.Biol.7：171-176)；氨磺酰(sulfonamide)(Guerineau等(1990)PlantMol.Biol.15：127-136)；溴草腈(bromoxynil)(Stalker等(1988)Science242：419-423)；草甘膦(glyphosate)(Shaw等(1986)Science 233：478-481以及美国专利申请系列10/004,357和10/427,692)；草丁膦(phosphinothricin)(DeBlock等(1987)EMBO J.6：2513-2518)。通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等(1980)在The Operon中第177-220页；Hu等(1987)Cell 48：555-566；Brown等(1987)Cell 49：603-612；Figge等(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)博士论文，University of Heidelberg；Reines等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956；Baim等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)博士学位论文，University of Heidelberg；Gossen等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等(1985)实验药理学手册(Handbook ofExperimental Pharmacology)，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)以及Gill等(1988)Nature 334：721-724。这些公开内容在此引作参考。
以上所列举的选择性标记基因并不旨在限制。任何选择性标记基因可用于本发明实施方案。
本发明实施方案的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物中。“引入”意指以使序列能进入细胞内部的这样的方式将多核苷酸或多肽提呈到植物中。本发明实施方案的方法并不依赖用于将多核苷酸或多肽引入植物的特定的方法，只要多核苷酸或多肽能进入植物的至少一个细胞内部即可。用于将多核苷酸或多肽引入植物的方法为本领域所已知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
“稳定转化”意指核苷酸构建体被引入植物并整合至植物基因组中，并能通过其子代遗传。“瞬时转化”意指多核苷酸被引入植物中但并不整合进植物的基因组，或指将多肽引入植物中。
转化方法以及用于将核苷酸序列引入植物的方法可根据靶向转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶或双子叶)而变化。将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入到植物基因组中的合适的方法包括显微注射(Crossway等(1986)Biotechniques4：320-334)、电穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利第5,563,055号和第5,981,840号)、直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2717-2722)以及弹道粒子加速法(参见例如美国专利第4,945,050号；第5,879,918号；第5,886,244号和第5,932,782号；Tomes等(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：FundamentalMethods，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；以及McCabe等(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lecl转化(WO00/28058)。对于马铃薯的转化参见Tu等(1998)Plant Molecular Biology37：829-838和Chong等(2000)Transgenic Research 9：71-78。另外的转化方法可参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In VitroCell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利第5,240,855号；第5,322,783号和第5,324,646号；Klein等(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利第5,736,369号(谷物)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等(1985)在胚珠组织的实验操作(The Experimental Manipulation of Ovule Tissues)中，Chapman等编辑.(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等(1990)PlantCell Reports 9：415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(噬菌体颈须介导的转化)；D′Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔法)；Li等(1993)Plant Cell Reports 12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米经由根癌农杆菌)；以上所有在此引作参考。
在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化方法将本发明实施方案的序列提供给植物。这样的瞬时转化方法包括但不限于将Cry毒素蛋白或其变体和片段直接引入植物或将Cry毒素转录物引入植物中。这样的方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura等(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180和Hush等(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784，以上所有文献在此引作参考。或者，可利用本领域已知的方法将Cry毒素的多核苷酸瞬时转化至植物中。这样的技术包括病毒载体系统和以妨碍DNA随后释放的方式使多核苷酸沉淀。因此，与粒子结合的DNA可发生转录，但该DNA被释放并整合进基因的频率却极大地减小。这样的方法包括使用涂覆有聚乙基亚胺的颗粒(PEI；Sigma #P3143)。
用于在植物基因组中特定位置的靶向插入多核苷酸的方法为本领域已知。在一个实施方案中，使用位点特异性重组系统在所需基因组位置处插入多核苷酸。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上所有文献在此引作参考。简单地说，本发明实施方案中的多核苷酸可包含在两侧有两个不相同的重组位点的转移盒中。被引入植物的转移盒稳定整合至基因组中的靶位点，该位点两侧有与该转移盒对应的两个不相同的重组位点。提供合适的重组酶并使转移盒整合到靶位点上。目标多核苷酸由此整合至植物基因组的特定染色体位置中。
可用常规方法使已转化的细胞长成植株。参见例如McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。可继续培育这些植物并可用相同的转化品系或不同品系授粉，并鉴定具有所需表型特性的组成型或诱导型表达的杂种。可培育两代或更多代以确保所需表型特性的表达被稳定保留并且可遗传，然后收获种子以确保已实现所需表型特性的表达。
通过将植物与病毒或病毒核酸接触可向该植物提供本发明实施方案的核苷酸序列。通常，这样的方法涉及引入含有目标核苷酸构建体的病毒DNA或RNA分子。应认识到的是，本发明实施方案的重组蛋白最初可作为病毒多蛋白的一部分来合成，随后重组蛋白可通过体内或体外的蛋白水解处理来产生所需的杀虫蛋白。还应认识到的是，这样的病毒多蛋白(包含至少一部分本发明实施方案的杀虫蛋白的氨基酸序列)可能具有所需的杀虫活性。这样的病毒多蛋白及编码所述蛋白的核苷酸序列包括在本发明实施方案中。用于向植物提供核苷酸构建体以及在植物中产生编码蛋白的方法(其涉及病毒的DNA或RNA分子)为本领域所已知。参见例如美国专利第5,889,191号；第5,889,190号；第5,866,785号；第5,589,367号以及第5,316,931号，以上所有文献在此引作参考。
本发明实施方案进一步涉及实施方案中的转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、叶、以及根和枝的插条。
本发明实施方案可用于转化任何植物品种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目标植物的实例包括但不限于：玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica sp.)(例如欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油料来源的芸苔种)，苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高梁(Sorghumbicolor、Sorghum vulgare)、黍属(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、禾参(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属(Coffea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑桔(柑桔属(Citrus spp.))、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、芭蕉(芭蕉属(Musaspp.))、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(油橄榄Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属(Saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松柏类植物。
蔬菜包括：番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豆(山黧豆属(Lathyrus spp.))；以及香瓜属(Cucumis)的成员，例如黄瓜(C.sativus)、罗马甜瓜(C.cantalupensis)和香瓜(C.melo)。观赏植物包括：杜鹃属Rhododendron spp.、绣球(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属Tulipa spp.)、水仙(水仙属(Narcissus spp.))、碧冬茄(Petunia hybrida)、香石竹(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。可用于实践本发明实施方案的松柏类植物包括：例如松(例如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、扭叶松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、异叶铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))、白云杉(Piceaglauca)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、冷杉(例如温哥华冷杉(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea))；以及香柏(例如北美香柏(Thujaplicata)和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。本发明实施方案的植物包括农作物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、落花生、高梁、小麦、黍、烟草等)，例如玉米和大豆植物。
草坪草包括但不限于：早熟禾(Poa annua)；一年生黑麦草(多花黑麦草(Lolium multiflorum))；加拿大早熟禾(Poa compressa)；紫羊茅(Chewings fescue)(Festuca rubra)；细弱剪股颖(Agrostis tenuis)；匍匐剪股颖(Agrostis palustris)；沙生冰草(Agropyron desertorum)；冰草(Agropyron cristatum)；硬羊茅(Festuca longifolia)；草地早熟禾(Poapratensis)；鸭茅(Dactylis glomerata)；Lolium perenne；紫羊茅(Festucarubra)；小糠草(Agrostis alba)；普通早熟禾(Poa trivialis)；羊茅(Festucaovina)；无芒麦草(Bromus inermis)；苇状羊茅(Festuca arundinacea)；梯牧草(Phleum pratense)；绒毛剪股颖(Agrostis canina)；碱茅(Puccinellia distans)；蓝茎冰草(Agropyron smithii)；狗牙根(狗牙根属(Cynodon spp.))；钝叶草(Stenotaphrum secundatum)；结缕草属(Zoysiaspp.)；百喜草(Paspalum notatum)；近缘地毯草(Axonopus affinis)；假俭草(Eremochloa ophiuroides)；隐花狼尾草(Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(Paspalum vaginatum)；格兰马草(Bouteloua gracilis)；野牛草(Buchloe dactyloids)；垂穗草(Bouteloua curtipendula)。
目标植物包括提供目标种子的谷类植物、油料种子植物和豆科植物。目标种子包括谷类种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高梁、黑麦、黍等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括菜豆类和豌豆类。菜豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、豌豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆和鹰嘴豆等。
在某些实施方案中，本发明实施方案的核酸序列可与目标多核苷酸序列的任何组合叠加，得到具有所需表型的植物。例如，本发明实施方案的多核酸可与编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其它多核苷酸叠加，例如其它的Bt毒性蛋白(参见美国专利第5,366,892号；第5,747,450号；第5,736,514号；第5,723,756号；第5,593,881号；以及Geiser等(1986)Gene 48：109)、pentin(参见美国专利第5,981,722号)等。所产生的组合还可包括任何一种目标多核苷酸的多个拷贝。本发明实施方案的多核苷酸还可与任何其它基因或基因组合叠加，以得到具有多种所需性状组合的植物，这些性状联合包括但不限于动物饲料所需的性状，例如高油基因(例如美国专利第6,232,529号)；平衡型氨基酸(例如hordothionins(美国专利第5,990,389号；第5,885,801号；第5,885,802号和第5,703,049号)；大麦高赖氨酸(Williamson等(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等(1988)Gene 71：359和Musumura等(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增强消化性(例如，修饰的贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的美国专利申请系列10/053,410)以及硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国专利申请系列10/005,429))，其公开内容在此引作参考。
本发明实施方案的多核苷酸还可与用于疾病抗性或除草剂抗性的所需性状叠加(例如烟曲霉毒素(fumonisin)解毒基因(美国专利第5,792,931)；无毒性和抗病基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science 262：1432；和Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)；乙酰乳酸合酶(ALS)的突变导致除草剂抗性，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合成酶的抑制剂(例如草丁膦(phosphinothricin)或basta(例如bar基因)))；以及草甘膦抗性(如美国专利申请系列10/004,357和10/427,692中公开的EPSPS基因和GAT基因)；以及处理或加工产物所需的性状，例如高油(例如美国专利第6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))以及能促进聚羟基烷酸酯(PHA)表达的聚合物或生物塑料(例如美国专利第5.602,321号；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸合酶以及乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847))，以上文献的公开内容在此引作参考。还可将本发明实施方案的多核苷酸与具有提供以下性状的多核苷酸组合：农艺性状(例如雄性不育(例如参见美国专利第5.583,210号)，茎杆强度、开花时间)；或转化技术性状(例如调控细胞周期或基因寻靶(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821))，以上文献的公开内容在此引作参考。
这些叠加的组合可通过任何方法得到，包括但不限于通过任何常规方法或
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法的杂交育种植物，或遗传转化。若通过遗传转化植物来叠加性状，则目标多核苷酸序列可在任何时间、以任何顺序叠加。例如，含有一种或多种所需性状的转基因植物可用作通过随后的转化引入另外的性状的靶标。在共转化的实验方案中，可用转化盒的任何组合所提供的目标多核苷酸来同时引入所述性状。例如，若要引入两个序列，则可使两个序列包含于单独的转化盒(反式)或包含于相同的转化盒(顺式)中。可通过相同或不同的启动子驱动序列的表达。在某些情况下，引入阻抑目标多核苷酸表达的转化盒也是所需的。该转化盒还可与其它阻抑盒或过量表达盒的任何组合联合，以在植物中产生所需的性状组合。还应认识到的是，可用位点特异性重组系统在所需的基因组位置叠加多核苷酸序列。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，其全部在此引作参考。
本发明实施方案的组合物适用于以多种方式保护植物、种子和植物产物。例如所述组合物可用于以下方法：该方法涉及将有效量的杀虫组合物通过选自以下的方法置于害虫环境中：喷洒(spraying)、撒粉(dusting)、撒播(broadcasting)或种子包衣(seed coating)。
在植物的繁殖材料(果实、块茎、球茎(bulb)、球根(corm)、谷粒、种子)尤其是种子作为商品出售之前，通常用保护剂包衣处理以提供免受细菌、真菌或动物害虫损害的保护，所述保护剂包括：除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀软体动物剂或这些制剂中的几种的混合物，若有需要，还连同制剂领域中常用的载体、表面活性剂或有助于施用的辅料。为了处理种子，可对种子施用保护剂包衣，即通过将块茎或谷粒浸入液体制剂中，或通过用湿或干的联合制剂包衣种子。此外，在具体情况下，可以使用其它施用于植物的方法，例如直接对芽或果实进行处理。
含有编码本发明实施方案的杀虫蛋白的核苷酸序列的本发明实施方案的植物种子可用种子保护剂包衣来处理，所述包衣含有种子处理化合物如克菌丹(captan)、萎锈录(carboxin)、福美双(thiram)、甲霜灵(methalaxyl)、嘧啶硫磷(pirimiphos-methyl)和常用于处理种子的其它化合物。在一个实施方案中，含有本发明实施方案的杀虫组合物的种子保护包衣单独使用或与常规用于处理种子的种子保护剂包衣之一联合使用。
应认识到编码杀虫蛋白的基因可用于转化昆虫的致病生物体。这样的生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。
可将编码本发明实施方案的杀虫蛋白的基因经由合适的载体引入微生物宿主中，并将所述宿主施用于环境、植物或动物。在将核酸插入细胞的情况中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括将核酸引入真核或原核细胞，其中所述核酸可掺入细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)；转换为自主复制子；或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
可选择已知占据了一种或多种目标农作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物是为了能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争；提供表达杀虫蛋白的基因的稳定保留和表达；并且提供增强的保护作用使杀虫剂免受环境降解和失活。
这样的微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，例如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏杆菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷白氏酵母属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Methylius、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮杆菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alealigenes)；真菌，尤其是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短柄霉属(Aureobasidium))。特别感兴趣的是植物圈细菌种，例如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木质醋杆菌(Acetobacter xylinum)、土壤杆菌(Agrobacteria)、假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、田野黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、产碱杆菌(Alcaligenesentrophus)、木根状杆菌(Clavibacter xyli)和棕色固氮杆菌(Azotobactervinlandir)；和植物圈酵母种，例如深红酵母(Rhodotorula rubra)、胶粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦氏隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomycesrosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维氏酵母(Kluyveromyces veronae)和出芽短柄霉(Aureobasidiumpollulans))。特别感兴趣的是有色微生物。
在允许基因稳定保留和表达的条件下，可用许多方式将表达杀虫蛋白的基因引入微生物宿主中。例如，可将表达盒构建成包含：与用于表达核苷酸构建体的转录和翻译的调节信号序列可操作地连接的目标核苷酸构建体、以及与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列(由此可发生整合)和/或在宿主中发挥作用的复制系统(由此可发生整合或稳定保留)。
转录和翻译的调节信号序列包括但不限于：启动子、转录起始位点、操纵子、激活子、增强子、其它的调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号序列等。参见例如美国专利第5,039,523号和第4,853,331号；EPO 0480762A2；Sambrook等(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Maniatis等编辑(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)，下文中简称″Sambrook II″；Davis等编辑(1980)Advanced Bacterial Genetics(Cold Spring HarborLaboratory Press)，Cold Spring Harbor，New York；以上文献在此引作参考。
合适的宿主细胞可包括原核生物细胞或真核生物细胞，通常仅限于不产生对高等生物体(例如哺乳动物)有毒的物质的那些细胞，其中当将含杀虫蛋白的细胞施用于一种或多种靶害虫的环境中时，应对所述细胞进行处理以延长杀虫蛋白在细胞中的活性。然而当毒素不稳定或者施用水平足够低，从而避免了对哺乳动物宿主的任何可能的毒性时，可使用产生对高等生物体有毒的物质的生物体。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和低等真核生物(例如真菌)。例示性原核生物(革兰氏阴性和革兰氏阳性原核生物)包括：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(例如埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏杆菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella))和变形菌属(Proteus))；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)(例如根瘤菌属(Rhizobium))；螺菌科(Spirillaceae)(例如光合细菌纲、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和螺菌属(Spirillum))；乳芽孢杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(例如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)、固氮杆菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae))。例示性真核生物为真菌，例如藻状菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括例如酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等酵母；以及担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，例如红酵母属(Rhodotorula)、短柄霉属(Aureobasidium)和掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。
为了制备杀虫蛋白，在选择宿主细胞方面特别感兴趣的特性包括：易于将杀虫蛋白引入宿主中、表达系统的有效性、表达效率、蛋白在宿主中的稳定性以及辅助的遗传能力的存在情况。对于用作杀虫微囊而言，感兴趣的特性包括：对杀虫剂的保护特性(例如厚细胞壁、色素形成、以及胞内包装或形成包涵体)、叶片亲和力、对哺乳动物无毒性、对害虫取食的吸引力、在不损失毒素的情况下易于杀灭和固定等。其它的考虑因素包括易于配制和处理、是否经济、储藏稳定性等。
特别感兴趣的宿主生物体包括：酵母，例如红酵母属(Rhodotorulaspp.)、短柄霉属(Aureobasidium spp.)、酵母属(Saccharomyces spp.)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、掷孢酵母属(Sporobolomyces spp.)；叶面生物体，例如假单胞菌属(Pseudomonas spp.)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluorescens))、欧文氏杆菌属(Erwinia spp.)和黄杆菌属(Flavobacterium spp.)；以及其它生物体，包括苏云金杆菌(Bt)、大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
编码本发明实施方案的杀虫蛋白的基因可引入到在植物(附生植物)上繁殖的微生物中，以向潜在的靶害虫递送杀虫蛋白。附生植物可为例如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
例如，可通过本领域已知的方法从目标植物中分离根部定殖的细菌。具体而言，可从植物根部分离出定殖于根部的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(参见例如Handelsman等(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713-718)。编码本发明实施方案的杀虫蛋白的基因可通过本领域已知的标准方法引入根部定殖的蜡状芽孢杆菌中。
编码杀虫蛋白的基因可例如通过电转化的方法引入到根部定殖的杆菌中。具体而言，可将编码杀虫蛋白的基因克隆到穿梭载体例如pHT3101中Lerecius等(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218。含有特定杀虫蛋白基因编码序列的穿梭载体pHT3101可例如通过电转化的方法引入到根部定殖的杆菌中(Lerecius等(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218)。
可设计表达系统使杀虫蛋白分泌到革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌)的胞质外。使杀虫蛋白分泌的优点在于：(1)避免所表达的杀虫蛋白的潜在细胞毒效应；以及(2)提高了杀虫蛋白的纯化效率，包括但不限于提高了每体积细胞液体培养基中蛋白的回收及纯化效率，并减少了每单位蛋白回收和纯化的时间和/或成本。
可使杀虫蛋白从大肠杆菌中分泌，例如通过将合适的大肠杆菌信号肽与杀虫蛋白的氨基末端融合。被大肠杆菌识别的信号肽存在于已知被大肠杆菌分泌的蛋白中，例如OmpA蛋白(Ghrayeb等(1984)EMBO J，3：2437-2442)。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白，因此其信号肽被认为在转运过程中是有效的。此外，如其它的信号肽例如脂蛋白信号肽的情况一样，OmpA的信号肽在加工前并不需要修饰(Duffaud等(1987)Meth.Enzymol.153：492)。
可在细菌宿主中发酵本发明实施方案的杀虫蛋白，处理所得细菌，并将其以与用作杀虫喷雾剂的Bt菌株的相同方式用作微生物喷雾剂。在从杆菌分泌的一种或多种杀虫蛋白的情况下，用本领域已知的方法将分泌信号序列去除或突变。这样的突变和/或缺失防止了一种或多种杀虫蛋白在发酵过程中分泌至生长培养基中。杀虫蛋白保留在细胞内，因此处理所述细胞便可得到包裹的杀虫蛋白。任何合适的微生物可用于此目的。假单胞菌已用于表达作为包裹蛋白的Bt毒素，所得细胞经过处理可作为杀虫剂喷洒(Gaertner等(1993)在AdvancedEngineered Pesticides中，Kim编辑)。
或者，通过将异源基因引入细胞宿主中来制备杀虫蛋白。异源基因的表达将直接或间接地导致胞内产生和保留杀虫剂。然后，当将细胞施用于一种或多种靶害虫的环境中时，在延长细胞所产生毒素的活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留了毒素的毒力。随后，可按照传统技术来配制这些天然包裹的杀虫蛋白，以施用于靶害虫所寄宿的环境(例如，土壤、水和植物的叶)。参见例如EPA 0192319，其在此引作参考。
在本发明实施方案中，转化的微生物(其包括完整的生物体、细胞、一种或多种孢子、一种或多种杀虫蛋白、一种或多种杀虫组份、一种或多种作用于害虫的组份、一种或多种突变体、活细胞或死细胞及细胞组分，包括活细胞和死细胞及细胞组分的混合物，并且包括破碎的细胞及细胞组分)或分离的杀虫蛋白可与可接受的载体一起配制成一种或多种杀虫组合物，所述组合物例如为：混悬剂、溶液剂、乳剂、粉剂、可分散颗粒剂或片剂、可湿性粉剂、乳化原液、气溶胶或喷雾剂、浸渍颗粒剂、辅剂、可包衣膏剂、胶体以及包裹在例如聚合物材料中。这样配制的组合物可通过常规方法来制备，例如将包含多肽的细胞培养物脱水、冻干、匀浆化、萃取、过滤、离心、沉淀或浓缩。
以上公开的这些组合物可通过加入以下成分得到：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、润湿剂、取食刺激剂、引诱剂、成胶囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线保护剂、缓冲剂、助流剂或肥料、微量营养素原料或其它影响植物生长的制剂。一种或多种农用化学品(包括但不限于：除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体生物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获剂以及肥料)可与制剂领域常用的载体、表面活性剂或辅料、或方便产物处理和应用于特定的靶害虫的其它组分结合。合适的载体和辅料可为固体或液体，并符合配制技术中常用的物质，例如：天然或改造的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明实施方案的有效成分通常以组合物的形式施用，并可施用于农田、植株或待处理的种子。例如，可向制备用于在谷箱或谷仓等中贮藏的谷物或贮藏过程中的谷物施用本发明实施方案的组合物。本发明实施方案的组合物可与其它化合物同时或贯序施用。施用本发明实施方案的有效成分或本发明实施方案的农用化学品组合物(其含有由本发明实施方案的细菌菌株产生的至少一种杀虫蛋白)的方法包括但不限于：叶施用、种子包衣或土壤施用。施用次数和施用速率视相应害虫感染的程度而定。
合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物，例如金属羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰肌氨酸盐；脂肪醇乙氧基化合物与磷酸的单酯酯或二酯或这些酯的盐；脂肪醇硫酸盐例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐例如烷基苯磺酸盐；或低级烷基萘磺酸盐；例如丁基萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐例如酰胺磺酸盐，例如油酸和甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或磺基琥珀酸二烷基酯的盐，例如琥珀酸二辛酯的磺酸钠。非离子型表面活性型包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪烷基或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物、多元醇醚的脂肪酸酯(例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯)，这样的酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、炔二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇或乙基化的炔二醇。阳离子表面活性剂的实例包括：例如脂肪族的单-、二-或多胺例如醋酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺例如聚氧化亚乙基烷基胺的胺氧化物；由羧酸与二-或多元胺缩合制成的酰胺连接的胺；或季铵盐。
惰性材料的实例包括但不限于无机矿物质(例如高岭土、层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐)或植物材料(例如软木、玉米穗轴粉末、花生壳、稻壳和胡桃壳)。
本发明实施方案的组合物可以直接施用的合适的形式，或者作为在施用前需要与合适量的水或其它稀释液稀释的原组合物的浓缩液。具体而言，不论杀虫剂是浓缩液还是直接使用，杀虫剂的浓度应随着特定制剂的特性而变化。所述组合物含有1-98％的固体或液体惰性载体，以及0-50％或0.1-50％的表面活性剂。这些组合物应以商品标记的比例给予，例如在无水形式的情况中，约0.01lb-5.0lb每英亩，而在固体形式的情况中，约0.01pts-10pts每英亩。
在另一个实施方案中，只要预处理不会对杀虫活性不利，就可在配制前对本发明实施方案的组合物以及转化的微生物或杀虫蛋白进行处理，以延长在施用于靶害虫环境中时的杀虫活性。只要处理不会有害地影响一种或多种组合物的性质，就可通过化学和/或物理方法进行这样的处理。化学试剂的实例包括但不限于卤化剂、醛(例如甲醛和戊二醛)、抗感染剂(例如洁而灭(zephiran chloride))；醇(例如异丙醇和乙醇)；以及组织学固定剂(例如布安固定液(Bouin′s fixative)和海利氏固定液(Helly′s fixative))(参见例如Humason(1967)Animal TissueTechniques(W.H.Freeman and Co.))。
在另外的实施方案中，可是有利的是，用蛋白酶(例如胰蛋白酶)处理Cry毒素多肽，以在向靶害虫环境施用本发明实施方案的杀虫蛋白组合物之前活化该蛋白。用于通过丝氨酸蛋白酶来活化原毒素的方法为本领域已知。参见例如Cooksey(1968)Biochem.J.6：445-454和Carroll和Ellar(1989)Biochem.J.261：99-105，其教导在此引作参考。例如，合适的活化方法包括但不限于将待活化的多肽例如纯化的新型Cry多肽(例如具有SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列)与胰蛋白酶以1/100重量比的蛋白/胰蛋白酶在pH 8的20nM NaHCO3中混合，并在36℃下消化样品3小时。
可向昆虫害虫所在的环境中施用组合物(包括本发明实施方案的转化微生物和杀虫蛋白)，例如通过喷洒、喷雾(atomizing)、撒粉、散播(scattering)、包衣或倾倒、引入土壤内部或表明、引入灌溉水中、当害虫开始出现时在害虫出现之前作为保护性措施处理种子、或常规施用或撒粉。例如，本发明实施方案的杀虫蛋白和/或转化微生物可与谷物混合以在储藏期间保护谷物。在植物生长的早期阶段提供良好的害虫防治通常是重要的，因为这是植物可能受到损害最严重的时期。若有需要，本发明实施方案的组合物可很合宜地包含另外的杀虫剂。在一个实施方案中，在播种时，以含载体和本发明实施方案的杆菌菌株或转化微生物的死细胞的组合物颗粒形式，将组合物直接施用于土壤。另一个实施方案是含有以下物质的的粒状组合物：农用化学品(例如除草剂、杀虫剂、肥料、惰性载体)和本发明实施方案的杆菌菌株或转化微生物的死细胞。
本领域的技术人员应认识到的是，并非所有的化合物针对所有害虫是同样地有效。本发明实施方案的化合物表现了针对昆虫害虫的活性，所述昆虫害虫可包括经济上重要的农业害虫、林业害虫、温室害虫、园艺业害虫、观赏植物害虫、食品及纤维制品害虫、有关公共及动物健康的害虫、家用和商业设施害虫、住宅害虫、储藏物害虫。昆虫害虫包括选自以下各目害虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鞘翅目和鳞翅目。
鳞翅目的幼虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘虫、地老虎、步曲和heliothines：秋夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(fallarmyworm)；贪夜蛾(S.exigua Hübner)(beet armyworm)；斜纹贪夜蛾(S.litura Fabricius)(tobacco cutworm，cluster caterpillar)；披肩粘虫(Mamestra configurata Walker)(bertha armyworm)；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)(cabbage moth)；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(black cutworm)；西部灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(westerncutworm)；粒肤地虎(A.subterranea Fabricius)(granulate cutworm)；棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübner)(cotton leaf worm)；粉斑夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)(cabbage looper)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusiaincludens Walker)(soybean looper)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalisHübner)(velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(green cloverworm)；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(tobaccobudworm)；白点粘虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(armyworm)；糙肤切根虫(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough)(rough skinnedcutworm)；暗缘地蚕(Euxoa messoria Harris)(darksided cutworm)；埃及金钢钻(Earias insulana Boisduval)(spiny bollworm)；鼎点金刚钻(E.vittella Fabricius)(spotted bollworm)；棉铃虫(Helicoverpa armigeraHübner)(American bollworm)；谷实夜蛾(H.zea Boddie)(corn earworm或cotton bollworm)；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(zebracaterpillar)；Egira(Xylomyges)curialis Grote(citrus cutworm)；螟蛾科(Pyralidae)的钻心虫、鞘蛾、webworms、coneworms和凋叶虫：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner)(European corn borer)；脐橙螟(Amyelois transitella Walker)(naval orangeworm)；地中海斑螟(Anagastakuehniella Zeller)(Mediterranean flour moth)；干果斑螟(Cadra cautellaWalker)(almond moth)；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(rice stemborer)；斑禾草螟(C.partellus)(sorghum borer)；米螟(Corcyracephalonica Stainton)(rice moth)；玉米根网螟(Crambus caliginosellusClemens)(corn root webworm)；早熟禾草螟(C.teterrellusZincken)(bluegrass  webworm)；稻纵卷叶野螟(Cnaphalocrocismedinalis Guenée)(rice leaf roller)；葡萄小卷叶野螟(Desmia funeralisHübner)(grape leaffolder)；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinataLinnaeus)(melon worm)；瓜野螟(D.nitidalis Stoll)(pickleworm)；巨座玉米螟(Diatraea grandiosella Dyar)(southwestern corn borer)；小蔗杆草螟(D.saccharalis Fabricius)(surgarcane borer)；Eoreuma loffiniDyar(Mexican rice borer)；烟草粉斑螟(Ephestia elutellaHübner)(tobacco(cacao)moth)；蜡螟(Galleria mellonellaLinnaeus)(greater wax moth)；Herpetogramma licarsisalis Walker(草螟亚科sod webworm)；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellumHulst)(sunflower moth)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellusZeller)(lesser cornstalk borer)；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(lesserwax moth)；网锥额野螟(Loxostege stiticalis Linnaeus)(beetwebworm)；Orthaga thyrisalis Walker(tea tree web moth)；豆荚野螟(Maruca testulalis Geyer)(bean pod borer)；印度谷斑螟(Plodiainterpunctella Hübner)(Indian meal moth)；三化螟(Scirpophagaincertulas Walker)(yellow stem borer)；芹菜网螟(温室野螟Udearubigalis Guenée)(celery leaftier)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、卷叶蛾、seed worms和fruit worms：西黑头长翅卷蛾(Aclerisgloverana Walsingham)(Western blackheaded budworm)；黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(Eastern blackheaded budworm)；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(fruit tree leaf roller)；玫瑰黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(European leaf roller)；以及其它的黄卷蛾(Archips)种：棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana Fischer von
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)(summerfruit tortrix moth)；向日葵细卷蛾(Cochylis hospes Walsingham)(bandedsunflower moth)；榛小卷叶蛾(Cydia latiferreanaWalsingham)(filbertworm)；苹果皮小卷蛾(C.pomonellaLinnaeus)(coding moth)；杂色斑叶蝉(Platynota flavedanaClemens)(variegated leafroller)；荷兰石竹小卷蛾(P.stultanaWalsingham)(omnivorous leafroller)；Lobesia botrana Denis&Schiffermüller(European grape vine moth)；苹白小卷蛾(Spilonotaocellana Denis&Schiffermüller)(eyespotted bud moth)；葡萄小卷蛾(Endopiza viteana Clemens)(grape berry moth)；女贞细卷蛾(Eupoeciliaambiguella Hübner)(vine moth)；Bonagota salubricola Meyrick(Brazilianapple leafroller)；东方蛀果蛾(Grapholita molesta Busck)(oriental fruitmoth)；Suleima helianthana Riley(sunflower bud moth)；带卷蛾属(Argyrotaenia spp.)；色卷蛾属(Choristoneura spp.)。
所选的其它鳞翅目的农业害虫包括但不限于：波林尺蛾(Alsophilapometaria Harris)(fall cankerworm)；桃条麦蛾(Anarsia lineatella Zeller)(peach twig borer)；栎黄条大蚕蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(orangestriped oakworm)；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Méneville)(ChineseOak Silkmoth)；家蚕蛾(Bombyx mori Linnaeus)(Silkworm)；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(cotton leaf perforator)；苜蓿粉蝶(Coliaseurytheme Boisduval)(alfalfa caterpillar)；核桃配片舟蛾(Datanaintegerrima Grote&Robinson)(walnut caterpillar)；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(Siberian silk moth)；榆秋黄尺蛾(Ennomos subsignaria Hübner)(elm spanworm)；菩提松尺蛾(Erannistiliaria Harris)(linden looper)；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(browntail moth)；葡萄叶烟翅斑蛾(Harrisina americanaGuérin-Méneville)(grapeleaf skeletonizer)；行列半白大蚕蛾(Hemileucaoliviae Cockrell)(range caterpillar)；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)(fall webworm)；番茄茎麦蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham)(tomato pinworm)；东部铁杉尺蛾(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(Eastern hemlock looper)；西部铁杉尺蛾(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(Western hemlock looper)；雪毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(satinmoth)；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)(gypsy moth)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)(five spotted hawk moth，tomatohornworm)；烟草天蛾(M.sexta Haworth)(tomato hornworm，tobaccohornworm)；果园秋尺蛾(Operophtera brumata Linnaeus)(winter moth)；苹尺蛾(Paleacrita vernata Peck)(spring cankerworm)；橙体凤蝶(Papiliocresphontes Cramer)(giant swallowtail，orange dog)；加州栎石蛾(Phryganidia californica Packard)(California oakworm)；柑橘叶潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(citrus leafminer)；Phyllonorycterblancardella Fabricius(spotted tentiform leafminer)；欧洲粉蝶(Pierisbrassicae Linnaeus)(large white butterfly)；菜粉蝶(P.rapaeLinnaeus)(small white butterfly)；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(greenveined white butterfly)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactylaRiley)(artichoke plume moth)；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)(diamondback moth)；红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella Saunders)(pinkbollworm)；南美菜粉碟(Pontia protodice Boisduval&Leconte)(Southerncabbageworm)；杂食尺蛾(Sabulodes aegrotata Guenée)(omnivorouslooper)；红山背舟蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(red humpedcaterpillar)；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier)(Angoumois grain moth)；松黄蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(pine processionarycaterpillar)；幕谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(webbing clothesmoth)；Tuta absoluta Meyrick(tomato leafminer)；苹果巢蛾(Yponomeutapadella Linnaeus)(ermine moth)；Heliothis subflexa Guenée；天幕毛虫属(Malacosoma spp.)和古毒蛾属(Orgyia spp.)。
目标鞘翅目的幼虫和成虫包括：长角象科(Anthribidae)、豆象亚科(Bruchidae)和象虫科(Curculionidae)的象虫(包括但不限于：棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(boll weevil)；稻水象(Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)(rice water weevil)；谷象(Sitophilus granariusLinnaeus)(granary weevil)；米象(S.oryzae Linnaeus)(rice weevil)；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(clover leaf weevil)；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(sunflower stem weevil)；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(red sunflower seed weevil)；S.sordidusLeConte(gray sunflower seed weevil)；玉米尖隐喙象(Sphenophorusmaidis Chittenden)(maize billbug))；叶甲科(Chrysomelidae)中的小跳甲、黄守瓜、根虫、叶甲、马铃薯甲虫和潜叶虫(包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(Colorado potato beetle)；玉米幼芽根叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(western cornrootworm)；长角叶甲(D.barberi Smith&Lawrence)(northern cornrootworm)；瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardi Barber)(southern corn rootworm)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicariaMelsheimer)(corn flea beetle)；十字花菜跳甲(Phyllotreta cruciferaeGoeze)(corn flea beetle)；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea Fabricius)(grapecolaspis)；黑角负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(cereal leaf beetle)；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(sunflower beetle))；瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis Mulsant)(Mexican bean beetle))；金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其它甲虫(包括但不限于：日本弧丽金龟(Popillia japonicaNewman)(Japanese beetle)；圆头独角仙(Cyclocephala borealis Arrow)(圆头独角仙、蛴螬)；圆头无斑独角仙(C.immaculata Olivier)(圆头无斑独角仙、蛴螬)；欧金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(Europeanchafer)；鳃金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(white grub)；胡萝卜犀金龟(Ligyrus gibbosus De Geer)(carrot beetle)；皮蠹科(Dermestidae)；叩甲科(Elateridae)的金针虫：伪金针虫属(Eleodes spp.)；叩头虫属(Melanotus spp.)；宽胸金针虫(Conoderus spp.)；Limonius spp.；Agriotes spp.；Ctenicera spp.；Aeolus spp.；小蠹科(Scolytidae)和拟步甲科(Tenebrionidae)。
目标双翅目的成虫和幼虫包括：潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyzaparvicornis Loew)(corn blotch leafminer)；蠓(包括但不限于：高梁康瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(sorghum midge)；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor Say)(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana Géhin)(wheat midge)；向日葵籽瘿蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana Felt)(sunflower seed midge))；实蝇科(Tephritidae)；瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(frit flies)；蛆(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(seedcorn maggot)；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(wheat bulb fly)；以及其它的属(Delia spp.)：美洲麦秆蝇(Meromyzaamericana Fitch)(wheat stem maggot)；家蝇(Musca domestica Linnaeus)(house flies)；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)；F.femoralis Stein(lesser house flies)；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus)(stable flies))；秋家蝇、骚扰角蝇、丽蝇科、金蝇属(Chrysomya spp.)；伏蝇属(Phormiaspp.)以及其它的蝇属害虫，虻属(horse fly)(Tabanus spp.)；胃蝇属(botfly)(Gastrophilus spp.)；狂蝇属(Oestrus spp.)；皮蝇属(cattle grub)(Hypoderma spp.)；斑虻属(Chrysops spp.)；羊蜱蝇(Melophagus ovinusLinnaeus)(keds)；以及其它的短角亚目，伊蚊属(Aedes spp.)；按蚊属(Anopheles spp.)；库蚊属(Culex spp.)；原蚋属(Prosimulium spp.)；蚋属(Simulium spp.)；拟蚊蠓属、毛蠓科、眼菌蚊以及其它的长角象属(Nematocera)。
目标昆虫包括半翅目和同翅目的成虫和蛹，例如包括但不限于：球蚜科(Adelgidae)，盲蝽科(Miridae)、蝉科(Cicadidae)、叶蝉、小绿叶蝉属(Empoasca spp.)；叶蝉科(Cicadellidae)、蜡蝉科：菱蜡蝉科(Cixiidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和飞虱科(Delphacidae)、角蝉科(Membracidae)、木虱科(Psyllidae)、粉虱科(Aleyrodidae)、蚜科(Aphididae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧、链蚧科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、胭蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、毡蚧科(Eriococcidae)、旌蚧科(Ortheziidae)、战蚧科(Phoenicococcidae)以及珠蚧科(Margarodidae)、网蝽科(Tingidae)、蝽科(Pentatomidae)、麦长蝽、杆长蝽属(Blissus spp.)；以及来自长蝽科(Lygaeidae)的其它长蝽、沫蝉科(Cercopidae)、缘蝉科(Coreidae)以及来自红蝽科(Pyrrhocoridae)和棉蝽。
农业上重要的同翅目成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)(pea aphid)；豆蚜(Aphis craccivora Koch)(cowpea aphid)；豆卫矛蚜(A.fabae Scopoli)(black bean aphid)；棉蚜(A.gossypii Glover)(cotton aphid，melon aphid)；玉米根蚜(A.maidiradicisForbes)(corn root aphid)；苹果蚜(A.pomi De Geer)(apple aphid)；异绣线菊蚜(A.spiraecola Patch)(spirea aphid)；土豆沟无网蚜(Aulacorthumsolani Kaltenbach)(foxglove aphid)；草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefoliiCockerell)(strawberry aphid)；麦双尾蚜(Diuraphis noxiaKurdjumov/Mordvilko)(Russian wheat aphid)；车前西圆尾蚜(Dysaphisplantaginea Paaserini)(rosy apple aphid)；苹绵蚜(Eriosoma lanigerumHausmann)(woolly apple aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicaeLinnaeus)(cabbage aphid)；梅大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(mealyplum aphid)；萝卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach)(turnip aphid)；麦无网蚜(Metopolophium dirrhodum Walker)(cereal aphid)；马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(potato aphid)；桃蚜(Myzus persicaeSulzer)(peach-potato aphid，green peach aphid)；莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley)(lettuce aphid)；瘿棉蚜属(Pemphigus spp.)(根蚜和瘿蚜)；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch)(corn leaf aphid)；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus)(bird cherry-oat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani)(greenbug)；美甘蔗伪毛蚜(Sipha flavaForbes)(yellow sugarcane aphid)；麦长管蚜(Sitobion avenaeFabricius)(English grain aphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculataBuckton)(spotted alfalfa aphid)；橘声蚜(Toxoptera aurantii Boyer deFonscolombe)(black citrus aphid)；以及褐橘声蚜(T.citricida Kirkaldy)(brown citrus aphid)；球蚜属(Adelges spp.)(adelgids)；美洲山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(pecan phylloxera)；甘薯粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(tobacco whitefly，sweetpotato whitefly)；B.argentifolii Bellows&Perring(silverleaf whitefly)；柑橘粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)(citrus whitefly)；结翅粉虱(Trialeurodesabutiloneus)(bandedwinged whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorumWestwood)(greenhouse whitefly)；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabaeHarris)(potato leafhopper)；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)(smallerbrown planthopper)；六点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes)(asterleafhopper)；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)(green leafhopper)；二条黑尾叶蝉(N.nigropictus
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)(rice leafhopper)；褐飞虱(Nilaparvatalugens
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)(brown planthopper)；玉米花翅飞虱(Peregrinus maidisAshmead)(corn planthopper)；白背飞虱(Sogatella furciferaHorvath)(white-backed planthopper)；美洲稻飞虱(Sogatodes orizicolaMuir)(rice delphacid)；空白苹果叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(white apple leafhopper)；(Erythroneoura spp.)(葡萄斑叶蝉grapeleafhoppers)；晚秀蝉(Magicicada septendecim Linnaeus)(periodicalcicada)；澳洲吹绵蚧(Icerya purchasi Maskell)(cottony cushion scale)；梨笠圆盾蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock)(San Jose scale)；橘臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(citrus mealybug)；粉蚧属(Pseudococcus spp.)(其它的粉蚧复合种)；梨黄木虱(Cacopsyllapyricola Foerster)(pear psylla)；柿个木虱(Trioza diospyri Ashmead)(persimmon psylla)。
半翅目的农业上重要目标种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternumhilare Say)(green stink bug)；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(squashbug)；美洲谷杆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(chinch bug)；棉网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(cotton lace bug)；Cyrtopeltismodesta Distant(tomato bug)；小棉红蝽(Dysdercus suturellusHerrich-
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)(cotton stainer)；褐美洲蝽(Euschistus servusSay)(brown stink bug)；一点美洲蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)(one-spotted stink bug)；红腺长蝽属(Graptostethus spp.)(长蝽科的复合种)；松籽喙缘蝽(Leptoglossus corculus Say)(leaf-footed pine seed bug)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)(tarnished plantbug)；豆荚草盲蝽(L.Hesperus Knight)(Western tarnished plant bug)；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus)(common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius)(European tarnished plant bug)；原丽盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(common green capsid)；稻绿蝽(Nezaraviridula Linnaeus)(southern green stink bug)；美洲稻缘蝽(Oebaluspugnax Fabricius)(rice stink bug)；乳草长蝽(Oncopeltus fasciatusDallas)(large milkweed bug)；棉伪斑腿盲蝽(Pseudatomoscelis seriatusReuter)(cotton fleahopper)。
此外，本发明的实施方案可有效针对半翅目，例如：马铃薯盲蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(strawberry bug)；Orthops campestrisLinnaeus；皱胸始盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)(apple capsid)；Cyrtopeltis modestus Distant(tomato bug)；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltisnotatus Distant)(suckfly)；白纹黑盲蝽(Spanagonicus albofasciatusReuter)(whitemarked fleahopper)；Diaphnocoris chlorionisSay(honeylocust plant bug)；洋葱盲蝽(Labopidicola allii Knight)(onionplant bug)；棉伪斑腿盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(cottonfleahopper)；捷苜蓿盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)(rapid plant bug)；四纹盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(four-lined plant bug)；谷长蝽(Nysius ericae Schilling)(false chinch bug)；谷长蝽(Nysius raphanusHoward)(false chinch bug)；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(Southerngreen stink bug)；扁盾蝽属(Eurygaster spp.)；缘蝽科(Coreidae spp.)；红蝽科(Pyrrhocoridae spp.)；网蝽科(Tinidae spp.)；负子蝽科(Blostomatidae spp.)；猎蝽科(Reduviidae spp.)和臭虫科(Cimicidaespp.)。
蜱目(Acari)(螨)的成虫和幼虫也包括在内，例如郁金香瘤瘿螨(Aceria tosichella Keifer)(wheat curl mite)；麦岩螨(Petrobia latensMüller)(brown wheat mite)；叶螨科(Tetranychidae)的叶螨和茶红叶螨，苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(European red mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)(two spotted spider mite)；麦克氏叶螨(T.mcdanieli McGregor)(McDaniel mite)；朱砂叶螨(T.cinnabarinusBoisduval)(carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski)(strawberry spider mite)；细须螨科(Tenuipalpidae)、刘氏短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor)(citrus flat mite)、瘿螨科(Eriophyidae)以及其它食叶螨和对人及动物来说健康重要的螨类，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)、食甜螨科(Glycyphagidae)硬蜱科的蜱。黑足蓖小硬蜱(Ixodes scapularis Say)(deer tick)；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(Australian paralysis tick)；变异革蜱(Dermacentor variabilis Say)(American dog tick)；美国花蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(lone star tick)；以及瘙螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)、疥螨科(Sarcoptidae)的马瘙螨和疥螨科。
目标缨尾目的昆虫害虫例如为：台湾衣鱼(Lepisma saccharinaLinnaeus)(silverfish)；家衣鱼(Thermobia domestica Packard)(firebrat)。
另外涵盖的节肢动物害虫包括蜘蛛目(Araneae)的蜘蛛例如褐平甲蛛(Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik)(brown recluse spider)；以及红斑蛛(Latrodectus mactans Fabricius)(black widow spider)；以及蚰蜒目(Scutigeromorpha)的蜈蚣例如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)(house centipede)。
检测本发明实施方案的组合物的杀虫活性可用早期发育阶段的昆虫害虫(例如幼虫或其它的未成熟形式)。昆虫可在完全黑暗的环境下，在约20℃-约30℃以及约30％-约70％的相对湿度下饲养。可按Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83(6)：2480-2485所述的方法进行生物测定。饲养昆虫幼虫以及进行生物测定的方法为本领域的技术人员所已知。
大量的生物测定技术为本领域的技术人员所已知。一般方法包括在密闭的容器中向食物源中加入实验化合物或实验生物体。杀虫活性可通过(但不限于)以下各项来检测：在喂饲或暴露一段合适的时间后，死亡率、体重减轻、引诱性、驱避性方面的变化以及其它的行为及生理变化。本文所述的生物测定可用于幼虫或成虫阶段的任何取食的昆虫害虫。
以下的实施例是以阐述而非限制的方式展示。
实验
实施例1：检测苏云金杆菌对所选昆虫的杀虫活性的生物测定
生物测定是为了评价SEQ ID NO：2中所述的Bt杀昆虫毒素肽对欧洲玉米螟、谷实夜蛾、小地老虎、秋夜蛾、大豆尺夜蛾和黎豆夜蛾的杀虫作用。用含杀昆虫蛋白的人工饲料进行喂饲测定。用鳞翅目特异性的人工饲料局部施用杀昆虫蛋白。毒素按0.3μg/25μL样品/孔的比例饲喂给并允许其干燥。蛋白在pH为10的10mM碳酸盐缓冲液中。在各孔中放一只新生幼虫并无限制地喂养5天。若幼虫的反应为发育障碍或死亡，则结果表示为阳性。若幼虫与阴性对照(其饲料中仅加入上述缓冲液)相似，则结果表示为阴性。
表1：SEQ ID NO：2的喂饲生物测定的结果
  受试昆虫   结果
  欧洲玉米螟   +
  谷实夜蛾   +
  小地老虎   +
  秋夜蛾   -
  大豆尺夜蛾   +
  黎豆夜蛾   +
实施例2：检测苏云金杆菌对三化螟的杀虫活性的生物测定
新生昆虫的制备
从稻田收集(ARS Mandya和Tattaguppe农场)三化螟成虫并关在用水稻植株制成的笼中。在这样的条件下存活3-4天的成虫会在叶片上产下卵群。将叶片小心地切成段以分离卵群，室温下在密封的塑料培养皿中单独培养孵化。将孵化出来的新生幼虫立即用于进行生物测定。
制备茎段
用本发明实施方案的Bt毒素制备转基因水稻植物。水稻的转化方法为本领域所已知，例如Hiei等(Plant Journal 1994，6(2)，271-282)中所述的方法。
将生长约55-60天的Bt水稻植株(每株为一个事件)的每个分蘖从底部切断并分成尺寸相等(约2cm)的五段。将所有分蘖段放在铺有无菌滤纸的培养皿中并用蒸馏水保湿。用同样方法培养非Bt对照作为比较。两天后从各个实验组中取2-3段喂给三化螟。
生物测定
用小刷小心地将三化螟按每个事件五只释放至各个平皿中。用塑料封膜封住平皿，以防止幼虫逃走。将所有平皿放在支架上，并将支架置于更大的含水槽中并保持室温条件。每天小心地打开所有平皿，直到完成最后观察后再将其密封，以提供新鲜空气，并且如果存在冷凝水(condensation)的话则将其去除。
观察
5天后观察幼虫的死亡率及生长情况。首先，检查每个平皿中所有茎段表面上所有死亡的幼虫。然后，用刀片逐层(逐个叶鞘)纵向切割茎段，并观察组织内活幼虫或死亡幼虫的存在情况。存活的幼虫保留在蛀道内而死亡幼虫为黑色且扁平。目测比较存活幼虫相对于非Bt对照中的幼虫的生长情况。结果在表2中出示。
表2：在14个事件中三化螟生物测定的结果
 ＊幼虫接种数   幼虫存活数   死亡率％   备注
  5   0   100％   死亡幼虫变黑
  3   0   100％   死亡幼虫变黑，2只幼虫逃走
  3   0   100％   死亡幼虫变黑，2只幼虫逃走
  2   0   100％   死亡幼虫变黑，3只幼虫逃走
  5   0   100％   死亡幼虫变黑
  4   0   100％   死亡幼虫变黑，1只幼虫逃走
  5   0   100％   死亡幼虫变黑
  5   0   100％   死亡幼虫变黑
  5   2   60％   死亡幼虫变黑，存活幼虫生长受阻
4 2 50％   死亡幼虫变黑，存活幼虫生长受阻，1只幼虫逃走
  5   3   40％   死亡幼虫变黑，存活幼虫生长未受影响
 3  0   100％  死亡幼虫变黑，2只幼虫逃走
 5  0   100％  死亡幼虫变黑
 3  0   100％  死亡幼虫变黑，2只幼虫逃走
*所有的生物测定最初接种了5只幼虫，但为了反映逃走的幼虫对数目进行了调整。
总结
释放了五只幼虫用于所有测定；有些幼虫在测定过程中逃走；因此测定结束时只能根据平皿中存留的幼虫计算死亡率％。14个事件中有11个事件显示出100％的死亡率。有两个事件显示出存活幼虫的死亡率为50-60％。其中观察到40％的死亡率的一个事件中存活的幼虫发育正常。
实施例3：测定LC50和EC50
进行生物测定以检测SEQ ID NO：2所述的Bt杀昆虫毒素肽对欧洲玉米螟、谷实夜蛾、小地老虎和秋夜蛾的LC50和EC50。基于含杀昆虫蛋白的人工饲料进行喂饲测定。杀昆虫蛋白用pH为10的10mM碳酸盐缓冲液和昆虫饲料稀释，得到终毒素浓度为10000、1000、100、10和1ppm。在各孔中放一只初生幼虫并无限制地喂养5天。每个生物测定在每个剂量下设八个重复，并重复生物测定三次。通过加权(weighting)每个毒素浓度的存活幼虫，将结果表示为LC50(对于死亡率)和/或EC50。
表3：LC50和EC50的结果
  受试昆虫   LC50ng/cm2   EC50ng/cm2
  欧洲玉米螟   0.42   0.2
  谷实夜蛾   122.3   31.25
  小地老虎   ＞10000   60.57
  秋夜蛾   无活性   无活性
实施例4：通过粒子轰击法转化玉米及转基因植物的再生
用含有毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1)的DNA分子轰击温室玉米供体植株的幼胚，所述核苷酸序列与泛素启动子和赋予对除草剂双丙氨磷(Bialaphos)的抗性的选择性标记基因PAT(Wohlleben等(1988)Gene 70：25-37)可操作地连接。或者，用单独的DNA分子提供选择性标记基因。转化如下进行。培养基配方在下文中描述。
制备靶组织
剥去玉米穗的包皮，用30％CloroxTM漂白剂加上0.5％Micro去污剂消毒表面20分钟，并用无菌水洗涤两次。切取幼胚并将胚轴面朝下放置(盾盖面朝上)，每个平皿25个胚，用560Y培养基培养4小时，然后在2.5cm的靶区内排列好准备轰击。
制备DNA
制备含有与泛素启动子可操作地连接的毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1)的质粒载体。例如，合适的转化载体包含玉米的UBI1启动子、UBI1的5′UTR和UBI1内含子，以及PinII终止子。载体还含有由CAMV35S启动子驱动的PAT选择性标记基因并含有CAMV35S终止子。任选地，选择性标记可存在于单独的质粒中。用如下的CaCl2沉淀法，将含毒素核苷酸序列和PAT选择性标记的DNA分子沉淀于1.1μm(平均直径)的钨颗粒上：
100μL制好的含钨颗粒的水
10μL含(1μg)DNA的Tris EDTA缓冲液(总DNA 1μg)
100μL 2.5M CaCl2
10μL 0.1M亚精胺
将上述各种试剂按顺序加入钨颗粒悬浮液中，同时保持在多管涡旋混合器上。将最终的混合液进行简单的超声处理并在持续涡旋下温育10分钟。沉淀后，将离心管作简单离心并移除液体，用500mL 100％的乙醇洗涤，并离心30秒。再次移除液体，向最终的钨颗粒沉淀加入105μL 100％的乙醇。为了进行基因枪轰击，将钨/DNA颗粒作简单的超声处理，取10μL点样在每个大载体(macrocarrier)的中心并在轰击前使其干燥2分钟。
基因枪处理
用基因枪#HE34-1或#HE34-2的第4档轰击样品平皿。从每管配制好的颗粒/DNA取总共十等份，以650 PSI对所有的样品进行单次轰击。
后续处理
轰击后，将胚放在560Y培养基中培养2天，然后转移至含有3mg/升双丙氨磷的560R选择培养基中，每2周继代一次。经过大概10周的选择后，将有选择抗性的愈伤组织克隆转移至288J培养基中使植株开始再生。体细胞胚成熟(2-4周)后，将完全发育的体细胞胚转移至用于出芽的培养中，并将其转移至光培养室中。约7-10天后，将正在发育的小植株转移至无激素272V培养基的管培养7-10天，直至长成小植株。然后将植物转移至含栽培土的苗床嵌入物(相当于2.5″的盆)中，并在培养室中培养1周，然后在温室再培养1-2周，随后转移至常规600盆(1.6加仑)中并培育直至成熟。监测植株并用本领域已知或如上所述的测定法记录毒素的表达情况。
轰击和培养基
轰击培养基(560Y)包含4.0g/L N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000x SIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺素、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L 2，4-D和2.88g/L L-脯氨酸(用蒸馏水补足至一定体积后用KOH调整至pH 5.8)；2.0g/L GelriteTM(用蒸馏水补足至一定体积后加入)和8.5mg/L硝酸银(灭菌培养基并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)含有4.0g/L N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000xSIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺素、30.0g/L蔗糖和2.0mg/L 2，4-D(用蒸馏水补足至一定体积后用KOH调整至pH 5.8)；3.0g/LGelriteTM(用蒸馏水补足至一定体积后加入)；和0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙氨磷(两者均在灭菌培养基并冷却至室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0mL/L MS维生素贮存液(0.100g烟酸、0.02g/L烟酸硫胺素、0.10g/L盐酸吡哆醇和0.40g/L甘氨酸用精制蒸馏水补足至一定体积)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L 0.1mM脱落酸(调整pH至5.6后用精制蒸馏水补足至一定体积)；3.0g/L GelriteTM(用蒸馏水补足至一定体积后加入)；和1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L双丙氨磷(在将培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。
无激素培养基(272V)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0mL/L MS维生素贮存液(0.100g/L烟酸、0.02g/L烟酸硫胺素、0.10g/L烟酸吡哆醇和0.40g/L甘氨酸用精制蒸馏水补足至一定体积)、0.1g/L肌醇和40.0g/L蔗糖(调整pH至5.6后用精制蒸馏水补足至一定体积)；6g/L细菌培养用琼脂(Bacto-agar)(用蒸馏水补足至一定体积后加入)、灭菌并冷却至60℃。
实施例5：农杆菌介导的玉米转化及转基因植物的再生
用毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1)对玉米进行农杆菌介导的转化，可采用Zhao的方法(美国专利第5,981,840和PCT专利出版物WO98/32326；其内容在此引为参考)。简单来说，从玉米中分离幼胚，在细菌能将毒素核苷酸序列(SEQ ID NO：1)转移至至少一个幼胚的至少一个细胞中的条件下将胚与农杆菌悬浮液接触(步骤1：感染步骤)。在该步骤中可将幼胚浸入农杆菌悬浮液中进行接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，可将幼胚放在固体培养基上培养。在共培养期后，可考虑任选“休息”步骤。在该休息步骤中，在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下培养幼胚，但不加入植物转化体的选择剂(步骤3：休息步骤)。可在含有抗生素但不含选择剂的固体培养基上培养幼胚，以消除农杆菌并为已感染的细胞提供休息期。然后，在含有选择剂的培养基上培养已接种的胚，并回收生长中的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含有选择剂的固体培养基(能使转化的细胞选择性生长)上培养幼胚。然后将愈伤组织再生为植株(步骤5：再生步骤)，可将选择培养基上生长的愈伤组织培养在固体培养基上，再生成植株。
实施例6：大豆胚的转化
如下所述，用含SEQ ID NO：1的毒素核苷酸序列的质粒轰击大豆胚，所述核苷酸序列与pinII启动子可操作地连接。为了诱导体细胞胚，从合适的大豆栽培种的表面消毒的未成熟种子中分离长度为3-5mm的子叶，在26℃下，在合适的琼脂培养基上在光照或黑暗下培养所述子叶6-10周。然后切取产生体细胞胚的次生胚，并放置于合适的液体培养基中。反复选择繁殖成早期球状胚的体细胞胚簇后，按如下所述维持悬浮液。
可将大豆胚发生悬浮培养物保持在26℃下、150rpm的旋转摇床上的35mL液体培养基中，光照按16:8小时的昼/夜时间表。通过将约35mg的组织接种至35mL液体培养基中，每2周继代培养物一次。
然后可通过基因枪轰击法转化大豆胚发生悬浮培养物(Klein等(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利第4,945,050号)。可用Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪(氦改良型)进行这些转化。
可用来帮助大豆转化的选择性标记基因是由以下部分组成的转基因：花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)、质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等(1983)Gene 25：179-188)的潮霉素磷酸转移酶基因和根癌农杆菌的Ti质粒中T-DNA的胭脂碱合成酶基因的3’区。含与pinII启动子可操作地连接的毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1)的表达盒可作为限制性片段分离。然后可将该片段插入到携带标记基因的载体的独特限制性位点中。
向含60mg/mL 1μm金颗粒的50μL悬浮液中(按顺序)加入：5μL DNA(1μg/μL)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl2(2.5M)。然后搅动颗粒制剂三分钟，在微量离心机中离心10秒并去掉上清液。然后用400μL 70％乙醇洗涤覆盖DNA的颗粒一次，并将颗粒重悬在40μL的无水乙醇中。可将DNA/颗粒悬浮液超声三次，每次一秒。然后取5微升覆盖DNA的金颗粒装入各大载体皿中。
将约300-400mg生长两周的悬浮培养物置于空的60x15mm培养皿中，用移液枪移除组织中残留的液体。每次转化实验通常轰击约5-10个皿的组织。膜破裂压设为1100psi，室内设为28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡栅约3.5英寸处并轰击三次。轰击后可将组织一分为二，并放回液体中，如上所述进行培养。
轰击后5-7天，可用新鲜培养基更换液体培养基，轰击后7-12天用含50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。此选择培养基可每周更换一次，轰击后7-8周可观察到从未转化的坏死胚发生簇中长出绿色的转化组织。移出分离的绿色组织并接种在单独的烧瓶中，得到新的、克隆繁殖的、转化胚发生悬浮培养物。每个新株系可作为独立的转化事件处理。然后可将这些悬浮物继代，并作为幼胚簇维持或使单独的体细胞胚成熟并出芽，再生成整个植株。
本说明书提及的所有出版物、专利和专利申请表明了本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请在本文引作参考，其程度如同每个独立的出版物、专利或专利申请具体并单独地表明通过参考引入到本文中。
虽然为了达到清楚理解的目的以阐述和例示的方式详述了上述发明，但显然可在本发明实施方案的范围内作出某些改变和修改。
序列表
<110>先锋高级育种国际公司
<120>对鳞翅目具有活性的新型苏云金杆菌基因
<130>2376-PCT
<140>11/957,893
<141>2007-12-17
<150>60/946,216
<151>2007-06-26
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1902
<212>DNA
<213>苏云金杆菌
<220>
<221>其他特征
<222>(0)...(0)
<223>Cry2Adshi
<400>1
atgaatagtg tattgaatag cggaagaact actatttgtg atgcgtataa tgtagtggtt 60
catgatccat ttagttttca acataaatca ttagatacca tacaaaaaga atggatggag 120
tggaaaaaag ataatcatag tttatatgta gatcctattg ttggaactgt ggctagtttt 180
ctgttaaaga aattagggag ccttattgga aaacggatac tgagtgaatt acggaattta 240
atatttccta gtggcagtac aaatctaatg gaagatattt taagagagac agaaaaattc 300
ctaaatcaaa aacttaatac agacactctt tcccgtgtaa atgcggaatt ggcagggctg 360
caagcaaatg tagaagagtt taatcgacaa gtagataatt ttttgaaccc taaccgaaac 420
gctgttcctt tatcaataac ttcttcagtt aatacaatgc agcaattatt tctaaataga 480
ttatcccagt tccagatgca aggataccaa ctgttattat tacctttatt tgcacaggca 540
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tcagcagcaa cattacgtac gtatcaaaat cacctgagaa attatacaag agattactct 660
aattattgta tagatacgta tcaaactgcg tttagaggtt taaacacccg tttacacgat 720
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ttgtttaaat atcaaagtct tctagtatct tctggcgcta atttatatgc aagtggtagt 840
ggaccacagc agacccaatt atttacttca caagactggc catttttata ttctcttttc 900
caagttaatt cgaattatgt attatccggc tttagtgggg ctagtctttt tactaccttt 960
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ggttcagatc gacagggcgt taataccgtt acaaattggc aaacagagtc ctttgagaca 1200
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tattttatcc gtaatatttc tggtgtttct ttagttctta gaaatgaaga cttaaaaaga 1320
ccgttatact ataacgaaaa aaggaatata gaaagccctt caggaacacc tggtggagca 1380
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ggtactatga ttcatttagc gccggaagat aatacaggat ttactatatc accgatacat 1500
gccactcaag tgaataatca aacgcgaaca tttatttccg aaaaatttgg aaatcaaggt 1560
gattccttaa gatttgaaca aagcaacacg acagctcgtt atacccttag agggaatgga 1620
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ataaacggta gagtttatac tgcttcaaat gttaatacta ctacaaataa cgatggagtt 1740
aatgataacg gagctcgttt ttcagatatt aatatcggta atgtagtagc aagtagtaat 1800
tctgatgtac cattagatat aaatgtaaca ttaaactccg gtactcaatt tgatcttatg 1860
aatattatgc ttgtaccaac taatatttca ccactttatt aa                    1902
<210>2
<211>633
<212>PRT
<213>苏云金杆菌
<220>
<221>肽
<222>(0)...(0)
<223>Cry2Adshi
<400>2
Met Asn Ser Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala Tyr
 1               5                  10                  15
Asn Val Val Val His Asp Pro Phe Ser Phe Gln His Lys Ser Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ile Gln Lys Glu Trp Met Glu Trp Lys Lys Asp Asn His Ser Leu
        35                  40                  45
Tyr Val Asp Pro Ile Val Gly Thr Val Ala Ser Phe Leu Leu Lys Lys
    50                  55                  60
Leu Gly Ser Leu Ile Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asn Leu
65                  70                  75                  80
Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Glu Asp Ile Leu Arg Glu
                85                  90                  95
Thr Glu Lys Phe Leu Asn Gln Lys Leu Asn Thr Asp Thr Leu Ser Arg
            100                 105                 110
Val Asn Ala Glu Leu Ala Gly Leu Gln Ala Asn Val Glu Glu Phe Asn
        115                 120                 125
Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Arg Asn Ala Val Pro Leu
    130                 135                 140
Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu Phe Leu Asn Arg
145                 150                 155                 160
Leu Ser Gln Phe Gln Met Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu
                165                 170                 175
Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile
            180                 185                 190
Leu Asn Ala Glu Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Leu Arg Thr Tyr
        195                 200                 205
Gln Asn His Leu Arg Asn Tyr Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile
    210                 215                 220
Asp Thr Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp
225                 230                 235                 240
Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val
                245                 250                 255
Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Val Ser Ser Gly
            260                 265                 270
Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Leu Phe
        275                 280                 285
Thr Ser Gln Asp Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser
    290                 295                 300
Asn Tyr Val Leu Ser Gly Phe Ser Gly Ala Ser Leu Phe Thr Thr Phe
305                 310                 315                 320
Pro Asn Ile Gly Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr Gln Ala Leu Leu
                325                 330                 335
Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Gly Ser Ile Gly
            340                 345                 350
Gly Ser Asn Phe Asn Gln Asn Phe Asn Cys Asn Thr Ile Ser Pro Pro
        355                 360                 365
Leu Ser Thr Ser Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Ser Asp Arg
    370                 375                 380
Gln Gly Val Asn Thr Val Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Glu Thr
385                 390                 395                 400
Thr Ser Gly Leu Arg Cys Gly Ala Phe Thr Pro Arg Gly Asn Ser Asn
                405                 410                 415
Tyr Tyr Pro Gly Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Ser Leu Val
            420                 425                 430
Leu Arg Asn Glu Asp Leu Lys Arg Pro Leu Tyr Tyr Asn Glu Lys Arg
        435                 440                 445
Asn Ile Glu Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr Met
    450                 455                 460
Val Ser Val His Asn Lys Lys Asn Asn Ile Tyr Ala Val His Glu Asn
465                 470                 475                 480
Gly Thr Met Ile His Leu Ala Pro Glu Asp Asn Thr Gly Phe Thr Ile
                485                 490                 495
Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe Ile
            500                 505                 510
Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln Ser
        515                 520                 525
Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Asn
    530                 535                 540
Leu Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val Thr
545                 550                 555                 560
Ile Asn Gly Arg Val Tyr Thr Ala Ser Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn
                565                 570                 575
Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile
            580                 585                 590
Gly Asn Val Val Ala Ser Ser Asn Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Asn
        595                 600                 605
Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Gln Phe Asp Leu Met Asn Ile Met Leu
    610                 615                 620
Val Pro Thr Asn Ile Ser Pro Leu Tyr
625                 630

Claims (23)

1.一种分离的核酸分子，其选自：
(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其全长互补序列的核酸分子；
(b)编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；
(c)与(a)的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；
(d)与(a)的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列；
(e)编码包含某种氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与(b)的氨基酸序列有至少70％的序列同一性；或
(f)编码包含某种氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与(b)的氨基酸序列有至少75％的序列同一性。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是设计用于在植物中表达的合成序列。
3.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含权利要求1的核酸分子。
4.权利要求3的DNA构建体，所述DNA构建体进一步包含编码异源多肽的核酸分子。
5.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求3的DNA构建体。
6.权利要求5的宿主细胞，所述宿主细胞为细菌细胞。
7.权利要求5的宿主细胞，所述宿主细胞为植物细胞。
8.一种转基因植物，所述转基因植物含有权利要求7的宿主细胞。
9.权利要求8的转基因植物，其中所述植物选自：玉米、高梁、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和芸苔。
10.权利要求9的植物的转化种子，其中该种子包含上述的DNA构建体。
11.一种具有杀虫活性的分离的多肽，其选自：
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；
(b)由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码的多肽；
(c)与(a)或(b)的多肽序列具有至少80％序列同一性的多肽序列；或
(d)与(a)或(b)的多肽序列具有至少85％序列同一性的多肽序列。
12.权利要求11的多肽，所述多肽进一步包含异源氨基酸的序列。
13.一种组合物，所述组合物包含权利要求11的多肽。
14.权利要求13的组合物，其中所述组合物选自散剂、粉剂、片剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。
15.权利要求13的组合物，其中所述组合物通过将苏云金杆菌细胞的培养物脱水、冻干、匀浆化、萃取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备。
16.权利要求13的组合物，所述组合物包含约1％-约99％重量的所述多肽。
17.一种用于防治鳞翅目或鞘翅目害虫群体的方法，其包括将所述群体与杀虫有效量的权利要求11的多肽接触。
18.一种用于杀灭鳞翅目或鞘翅目害虫的方法，其包括将所述害虫与杀虫有效量的权利要求11的多肽接触，或向所述害虫饲喂杀虫有效量的权利要求11的多肽。
19.一种制备具有杀虫活性的多肽的方法，其包括在编码所述多肽的核酸分子能表达的条件下培养权利要求4的宿主细胞，所述多肽选自：
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；
(b)由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码的多肽；
(c)与(a)或(b)的多肽序列具有至少80％序列同一性的多肽序列；或
(d)与(a)或(b)的多肽序列具有至少85％序列同一性的多肽序列。
20.一种在基因组中稳定掺入了DNA构建体的植物，所述DNA构建体包含编码具有杀虫活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与驱动编码序列在植物细胞中表达的启动子可操作地连接，所述核苷酸序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其全长互补序列的核酸分子；
(b)编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；
(c)与(a)的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；
(d)与(a)的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列；
(e)编码包含某种氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与(b)的氨基酸序列有至少70％的序列同一性；或
(f)编码包含某种氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与(b)的氨基酸序列有至少75％的序列同一性。
21.权利要求20的植物，其中所述植物为植物细胞。
22.一种保护植物抵御害虫的方法，其包括向所述植物或其细胞引入包含编码杀虫多肽的核苷酸序列的至少一种表达载体，其中所述核苷酸序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其全长互补序列的核酸分子；
(b)编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；
(c)与(a)的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；
(d)与(a)的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列；
(e)编码包含某种氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与(b)的氨基酸序列有至少70％的序列同一性；或
(f)编码包含某种氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与(b)的氨基酸序列有至少75％的序列同一性。
23.权利要求22的方法，其中所述植物产生具有针对鳞翅目或鞘翅目害虫的杀虫活性的杀虫多肽。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100922