BRPI0721812A2 - molécula de ácido nucléico isolada, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transforma, polipeptìdeo isolado com atividade pesticida, composição, método para controlar uma polulação de praga de lepidópteros ou de coleópteros, método para matar uma praga de lepidópteros ou coleópteros, método para produzir um polipeptìdeo com atividade pesticida, planta, método para proteger uma planta contra uma praga - Google Patents

Abstract

MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO ISOLADA, CONSTRUTO DE DNA, CéLULA HOSPEDEIRA, PLANTA TRANSGENICA, SEMENTE TRANSFORMADA, POLIPEPTìDEO ISOLADO COM ATIVIDADE PESTICIDA, COMPOSIçãO, MáTODO PARA CONTROLAR UMA POPULAçãO DE PRAGA DE LEPIDóPTEROS OU DE COLEóPTEROS, MéTODO PARA MATAR UMA PRAGA DE LEPìDOPTEROS OU COLEóPTEROS, MéTODO PARA PRODUZIR UM POLIPéPTIDEO COM ATIVIDADE PESTICIDA, PLANTA, MéTODO PARA PROTEGER UMA PLANTA CONTRA UMA PRAGA. A invenção fornece ácidos nucléicos, e variantes e fragmentos destes, obtidos a partir de linhagens de Bacílius thuringíensís codificando polipeptídeos que tenham atividade pesticida contra pragas de insetos, incluindo Lepidáptera. Concretizações particulares da invenção fornecem ácidos nucléicos isolados que codificam proteínas pesticidas, composições pesticidas, construtos de DNA, microorganismos e plantas transformados contendo um ácido nucléico dos melhoramentos. Estas composições encontram uso de métodos para controlar pragas, especialmente pragas de plantas.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, CONSTRUTO DE DNA, CÉLULA HOSPEDEIRA, PLANTA TRANSGÊNICA, SEMENTE TRANSFORMADA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO COM ATIVIDADE PESTICIDA, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA CONTROLAR UMA POPULAÇÃO DE PRAGA DE LEPIDÓPTEROS OU DE COLEÓPTEROS, MÉTODO PARA MATAR TJMA PRAGA DE LEPIDÓPTEROS OU COLEÓPTEROS, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE PESTICIDA, PLANTA, MÉTODO PARA PROTEGER UMA PLANTA CONTRA UMA PRAGA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a ácidos nucléicos naturalmente ocorrentes e recombinantes obtidos a partir de novos genes de Bacillus thuringiensis que codificam polipeptídeos pesticidas caracterizados pela atividade pesticida contra pragas de insetos. As composições e métodos da invenção utilizam os ácidos nucléicos divulgados, e seus polipeptídeos codificados como pesticidas, para controle de pragas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os insetos constituem um fator importante na perda das culturas agrícolas no mundo. Por exemplo, a alimentação da lagarta-do-cartucho, o dano da lagarta-rosca ou o prejuízo da broca-do-milho-europeu podem ser economicamente devastadores para os produtores agrícolas. A perda de cultura relacionada com praga de inseto e proveniente de ataques da broca-do- miIho-europeu no campo e em milho doce apenas atinge cerca de um bilhão de dólares por ano em prejuízos e despesas de controle.

Tradicionalmente, o principal método para impactar as populações de insetos pragas, como populações de lagarta- rosca, é a aplicação de inseticidas químicos de amplo espectro. No entanto, consumidores e reguladores do governo estão igualmente cada vez mais preocupados com os riscos ambientais associados à produção e com uso de pesticidas químicos sintéticos. Devido a essas preocupações, os reguladores têm proibido ou limitado o uso de alguns dos pesticidas mais perigosos. Assim, existe um grande interesse no desenvolvimento de pesticidas alternativos.

O controle biológico de pragas de insetos de importância agrícola através de agentes microbianos, tais como fungos, bactérias ou outra espécie de inseto, oferece uma alternativa amigável com o ambiente e comercialmente atraente aos inseticidas químicos sintéticos. De um modo geral, o uso de biopesticidas apresenta um risco menor de poluição e de danos ambientais, e os bioinseticidas proporcionam maior especificidade ao alvo do que a caracteristicamente encontrada em inseticidas químicos de amplo espectro tradicionais. Além disso, a produção dos bioinseticidas custa freqüentemente menos e, assim, estes melhoram o rendimento econômico para uma grande variedade de culturas.

Certas espécies de microrganismos do gênero Bacillus são conhecidas por possuir atividade pesticida contra uma ampla gama de insetos, incluindo Lepidóptera, Díptera, Coleóptera, Hemiptera, e outros. Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus papilliae estão entre os mais bem sucedidos agentes de controle biológico descobertos até o presente momento. A patogenicidade de inseticidas também tem sido atribuída às linhagens de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus (Harwook, ed. , ((1989) Bacillus (Plenum Press), 306) e B. cereus (WO 96/10083). A atividade pesticida parece estar concentrada em inclusões protéicas cristalinas ou cristais parasporais, apesar de que, proteínas pesticidas também já terem sido isoladas a partir do estágio de crescimento vegetativo de Bacillus. Vários genes que codificam estas proteínas pesticidas têm sido isolados e caracterizados (ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,366,892 e 5,840,868 ).

Inseticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de linhagens de Bacillus, têm desempenhado um papel importante na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas. Recentemente, os cientistas desenvolveram plantas agrícolas de culturas com resistência a insetos reforçada por engenharia genética de plantas cultivadas para a produção de proteínas pesticidas de Baeillus. Por exemplo, plantas de milho e de algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas de cepas de Bt (ver, por exemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sei. 59 (3) : 417-425; Schnepf et al. (1998 ) Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3) :775-806). Estes cultivar geneticamente modificados são agora amplamente utilizados na agricultura norte- americana e tem provido o agricultor com uma alternativa ecológica aos métodos tradicionais de controle de insetos. Além disso, as batatas geneticamente modificadas para conter toxinas Cry pesticidas foram vendidas para o fazendeiro americano. Estas plantas inseto-resistentes de culturas geneticamente modificadas, apesar de terem sido provadas como comercialmente muito bem sucedidas, oferecem resistência à apenas uma faixa estreita de pragas de insetos economicamente importantes.

Assim, a necessidade de novas toxinas Bt, com uma gama mais ampla de atividade inseticida contra pragas, permanece, como por exemplo, as toxinas que são ativas contra uma variedade maior de insetos da ordem Lepidóptera. Além disso, ainda há uma necessidade de biopesticidas que tenham atividade contra uma variedade de insetos e de biopesticidas que tenham a atividade inseticida melhorada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Composições e métodos para impactar pragas de insetos são fornecidos. Mais especificamente, os melhoramentos da presente invenção referem-se aos métodos para se afetar insetos utilizando seqüências de nucleotideos que codificam peptídeos inseticidas para produzir microorganismos e plantas transformadas que expressem um polipeptídeo inseticida dos melhoramentos. Estas pragas incluem pragas importantes para a agricultura, tais como, por exemplo: lagarta-amarela-do- colmo, Scirpophaga incertulas (Walker). Em alguns melhoramentos, as seqüências de nucleotideos que codificam polipeptídeos pesticidas são para, pelo menos, um inseto pertencente à ordem Lepidóptera.

Os melhoramentos fornecem um ácido nucléico e fragmentos e variantes deste, que codificam polipeptídeos que possuem atividade pesticida contra pragas de insetos (por exemplo, SEQ ID NO: 1 codificando SEQ ID NO: 2). A seqüência nucleotídica tipo-selvagem do melhoramento (por exemplo, naturalmente ocorrente), que foi obtida a partir de Btl codifica um peptídeo inseticida. Os melhoramentos ainda fornecem fragmentos e variantes da seqüência de nucleotideos divulgada, que codificam polipeptídeos biologicamente ativos (por exemplo, inseticidas).

Os melhoramentos ainda fornecem polipeptídeos pesticidas isolados (por exemplo, inseticidas) codificados por um ácido nucléico do melhoramento tanto naturalmente ocorrente ou modificado (por exemplo, mutagenizado ou manipulado). Nos exemplos particulares, as proteínas pesticidas do melhoramento incluem fragmentos ou proteínas de comprimento integral e polipeptídeos que são produzidos a partir de ácidos nucléicos mutagenizados, concebidos para introduzir seqüências de aminoácidos particulares nos polipeptídeos dos melhoramentos. Em melhoramentos particulares, os polipeptídeos pesticidas têm atividade reforçada em relação à atividade do polipeptídeo que ocorre naturalmente e a partir do qual estes são derivados.

Os ácidos nucléicos dos melhoramentos também podem ser usados para produzir plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas transformadas (por exemplo, transgênicos) que se caracterizam por genomas que compreendem pelo menos um construto de nucleotídeo estavelmente incorporado constituído por uma seqüência de codificação dos melhoramentos operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão do polipeptídeo pesticida codificado. Assim, as células vegetais, tecidos vegetais, plantas e sementes transformadas a partir desta, também são fornecidas.

Em um melhoramento específico, uma planta transformada pode ser produzida usando-se um ácido nucléico que foi otimizado para a expressão aumentada em uma planta hospedeira. Por exemplo, um dos polipeptídeos pesticidas dos melhoramentos pode ser retro-traduzido para produzir um ácido nucléico compreendendo códons otimizados para a expressão em um determinado hospedeiro, por exemplo, uma planta de cultivo, como uma planta de arroz (Oryza sativa) . A expressão de uma seqüência de codificação por uma destas plantas transformadas (por exemplo, uma dicotiledônea ou monocotiledônea) irá resultar na produção de um polipeptídeo pesticida e conferir à planta uma resistência contra insetos aumentada. Alguns melhoramentos fornecem plantas transgênicas expressando polipeptideos pesticidas para os quais se encontram métodos de uso para impactar várias pragas de insetos.

Os melhoramentos incluem ainda composições de pesticidas ou inseticidas contendo os polipeptideos inseticidas do melhoramento e podem opcionalmente, incluir outros peptideos inseticidas. Os melhoramentos englobam a aplicação de tais composições ao ambiente de pragas de insetos, com a finalidade de impactar estas pragas de insetos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os melhoramentos da invenção são conduzidos para as composições e métodos de impacto de pragas de insetos, particularmente pragas de plantas. Mais especificamente, o ácido nucléico isolado dos melhoramentos, e fragmentos e variantes deste, incluem seqüências de nucleotideos que codificam polipeptideos pesticidas (por exemplo, proteínas). As proteínas pesticidas divulgadas são biologicamente ativas (por exemplo, pesticidas) contra as pragas de insetos, tais como, mas não se limitando a, insetos-praga da ordem Lepidóptera. Os insetos de interesse incluem, mas não estão limitados a: lagarta-amarela-do-colmo, por exemplo, Scirpophaga incertulas; broca-do-milho-europeu, por exemplo, Ostrinia nubilalis; lagarta-da-espiga, por exemplo, Helicoverpa zeae; broca-comum-do-pedúnculo, por exemplo, broca-do-caule-comum, por exemplo, Papiapema nebris; lagarta- do-cartucho, por exemplo, Pseudaletia unipuncta; broca-do- milho-do-sudoeste, por exemplo, Diatraea grandiosella; lagarta-rosca, por exemplo, Agrotis ipsilon; lagarta-da- beterraba, por exemplo, Spodoptera frugiperda, lagarta- cartucho-do-outono, por exemplo, Spodoptera exigua e mariposa-dorso-de-diamante, por exemplo, Plutella xylostella.

As composições dos melhoramentos incluem ácidos nucléicos isolados e fragmentos e variantes dos mesmos, que codificam polipeptídeos pesticidas, cassetes de expressão compreendendo as seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos, proteínas pesticidas isoladas, e composições pesticidas. Alguns melhoramentos fornecem polipeptídeos pesticidas modificados, caracterizados por conter uma atividade inseticida contra lepidópteros melhor em relação à atividade pesticida da proteína tipo selvagem correspondente. Os melhoramentos ainda fornecem plantas e microorganismos transformados com estes novos ácidos nucléicos, e métodos que envolvem a utilização desses ácidos nucléicos, composições pesticidas, organismos transformados e produtos destes no impacto de pragas de insetos.

Os ácidos nucléicos e seqüências de nucleotideos dos melhoramentos podem ser utilizados para transformar todo o organismo para produzir as proteínas pesticidas codificadas. Métodos que envolvem o uso desses organismos transformados são fornecidos para impacto ou controle de pragas de plantas. Os ácidos nucléicos e seqüências de nucleotideos dos melhoramentos também podem ser usados para transformar organelas como os cloroplastos (McBride et al. (1995) Biotechnology 13: 3 62-365; e Kota et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 1840-1845).

Os melhoramentos ainda dizem respeito à identificação de fragmentos e variantes da seqüência de codificação naturalmente ocorrente que codificam proteínas pesticidas biologicamente ativas. As seqüências de nucleotideos dos melhoramentos encontram uso direto em métodos para afetar as pragas, principalmente insetos, como as pragas da ordem Lepidóptera. Desta forma, os melhoramentos providenciam novas abordagens para se impactar insetos praga as quais não dependem do uso dos inseticidas químicos sintéticos tradicionais. Os melhoramentos envolvem a descoberta de pesticidas biodegradáveis naturalmente ocorrentes e dos genes que codificam estes. Os melhoramentos ainda fornecem fragmentos e variantes da seqüência de codificação naturalmente ocorrente que também codificam polipeptídeos biologicamente ativos (por exemplo, pesticidas). Os ácidos nucléicos dos melhoramentos abrangem ácidos nucléicos ou seqüências de nucleotídeos que foram otimizados para expressão pelas células de um organismo em particular, por exemplo, seqüências de ácido nucléico que foram retro-traduzidas (ou seja, traduzidos de forma invertida), utilizando-se códons preferenciais de plantas e baseados na seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo com atividade pesticida reforçada. Os melhoramentos ainda prevêem mutações que conferem propriedades melhoradas ou alteradas aos polipeptídeos dos melhoramentos. Ver, por exemplo, U.S.

Application Nos. 10/606,320 pendente, arquivada em 25 de junho de 2003, e 10/746,914, arquivada em 24 de dezembro de 2003 .

Na descrição que se segue, uma série de termos é usada extensivamente. As seguintes definições são fornecidas para facilitar a compreensão dos melhoramentos.

Unidades, prefixos e símbolos podem ser notados em seus formulários SI aceitos. Salvo indicação em contrário, os ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita em orientação 5' para 3'; seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi, respectivamente. Intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem o intervalo. Os aminoácidos podem ser aqui referidos tanto pelos seus símbolos comumente conhecidos de três letras ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica (Biochemical Nomenclature Commission) IUPAC-IUB. Nucleotídeos, de igual modo, podem ser referidos por seus códigos de letras simples comumente aceitos. Os termos acima definidos são mais plenamente definidos por referência a especificação como um todo.

Como usado aqui, "ácido nucléico" inclui referência a um polímero de ribonucleótídeo ou desoxirribonucleotídeo, seja na forma de fita simples ou de fita dupla, e, salvo se limitado, englobando análogos conhecidos (por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeos), tendo a natureza essencial dos nucleotídeos naturais, no contexto em que, estes hibridizam com ácidos nucléicos de fita simples de uma maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural.

Conforme utilizado aqui, os termos "codificação" ou "codificado" quando usados no contexto de um determinado ácido nucléico, significa que o ácido nucléico compreende as informações necessárias à tradução direta da seqüência de nucleotídeos em uma proteína especificada. A informação pela qual xima proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Um ácido nucléico que codifica uma proteína pode conter seqüências não-traduzidas (por exemplo, íntrons) dentro de regiões traduzidas do ácido nucléico ou podem não conter estas seqüências não-traduzidas de intervenção (como no cDNA por exemplo).

Como usado aqui, "seqüência de tamanho integral", refere-se a um polinucleotídeo especificado ou a sua respectiva proteína codificada, e significa ter-se a seqüência de ácido nucléico inteira ou a seqüência de aminoácidos inteira de uma seqüência nativa (não sintética) endógena. Um polinucleotídeo de tamanho integral codifica a forma cataliticamente ativa e integral de uma proteína especificada.

Conforme utilizado aqui, o termo "antisenso" usado no contexto da orientação de uma seqüência de nucleotídeos se refere a uma seqüência de polinucleotídeo duplex que é operacionalmente ligada a um promotor em uma orientação onde a fita antisenso é transcrita. A fita antisenso é suficientemente complementar para um produto da transcrição endógena, de tal forma que a tradução do produto da transcrição endógena é normalmente inibida. Assim, quando o termo "antisenso" é utilizado no contexto de uma seqüência de nucleotídeos especifica, o termo se refere à fita complementar do produto de transcrição referência. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteínas" são utilizados aqui alternadamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um análogo químico artificial de um aminoácido naturalmente ocorrente correspondente, assim como a polímeros de aminoácidos naturalmente ocorrentes.

Os termos "resíduo" ou "resíduo de aminoácido" ou "aminoácidos" são utilizados alternadamente aqui para se referir a um aminoácido que é incorporado em uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo (coletivamente "proteína"). 0 aminoácido pode ser um aminoácido que ocorre naturalmente e, a menos que de outra forma limitado, pode abranger análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de forma semelhante aos aminoácidos que ocorrem naturalmente.

Polipeptídeos dos melhoramentos podem ser produzidos a partir de um ácido nucléico aqui divulgado, ou através do uso de técnicas padronizadas de biologia molecular. Por exemplo, uma proteína do melhoramento pode ser produzida pela expressão de um ácido nucléico recombinante do melhoramento em uma célula hospedeira apropriada, ou, alternadamente, por uma combinação de procedimentos ex vivo.

Conforme utilizado aqui, os termos "isolado" e "purificado" são utilizados indiferentemente para designar os ácidos nucléicos e polipeptídeos biologicamente ativos ou partes dos mesmos, que são substancialmente ou essencialmente livres de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o ácido nucléico ou polipeptídeo na forma em que este se encontra em seu ambiente natural. Assim, um isolado ou purificado de ácido nucléico ou polipeptídeo é substancialmente isento seja de material celular seja de meio de cultura, quando produzidos por técnicas de recombinação, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados.

Um "ácido nucléico isolado" é geralmente livre de seqüências (como, por exemplo, das seqüências codificadoras de proteínas) que naturalmente cercam o ácido nucléico (ou seja, seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucléico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucléico é derivado. Por exemplo, em vários melhoramentos, os ácidos nucléicos isolados podem conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeos que naturalmente circundam o ácidos nucléico no DNA genômico da célula a partir do qual o ácido nucléico é derivado.

Conforme utilizado aqui, o termo "isolado" ou "purificado", conforme ele é usado para se referir a um polipeptídeo dos melhoramentos, significa que a proteína isolada é praticamente isenta de material genético e inclui preparados de proteínas com menos de cerca de 30%, 20% , 10%, ou 5% (em peso seco) de proteínas contaminantes. Quando a proteína do melhoramento ou sua porção biologicamente ativa recombinante é produzida, o meio de cultura representa menos cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) dos precursores químicos ou químicos não-proteínas-de-interesse.

Para toda a especificação da palavra "compreender", ou variações como "compreende" ou "compreendendo", deverá ser implicado a inclusão de um elemento indicado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.

Conforme aqui utilizado, o termo "impactando pragas de insetos" refere-se a efetuação de mudanças na alimentação do inseto, crescimento e/ou comportamento em qualquer fase de desenvolvimento, incluindo mas não se limitando a: matar o inseto, retardar o crescimento e prevenir a capacidade reprodutiva, atividade anti-alimentar e assim por diante.

Conforme utilizado aqui, os termos "atividade pesticida" e "atividade inseticida" são usados como sinônimos para se referir à atividade de um organismo ou de uma substância (como, por exemplo, uma proteína) que pode ser medida pelo, mas não está limitada a, mortalidade de pragas, perda de peso de pragas, repelência de pragas e outras alterações comportamentais e físicas de uma praga após a alimentação e exposição por um período de tempo adequado. Assim, um organismo ou substância com atividade pesticida impacta negativamente pelo menos um parâmetro mensurável de aptidão de pragas. Por exemplo, "proteínas pesticidas" são proteínas que mostram atividade pesticida por si só ou em combinação com outras proteínas.

Conforme utilizado aqui, o termo "quantidade pesticida ativa" conota uma quantidade de uma substância ou de organismo que tem atividade como pesticida quando presente no ambiente de uma praga. Para cada substância ou organismo, a quantidade pesticida efetiva é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. Da mesma forma, "quantidade de inseticida eficaz" pode ser utilizada para se referir a uma quantidade "pesticida eficaz" quando a praga é uma praga de insetos.

Conforme utilizado aqui, o termo "modificado por recombinação" ou "modificado" conota a utilização da tecnologia de DNA recombinante para introduzir (por exemplo, por engenharia genética) uma mudança na estrutura de proteínas com base em uma compreensão do mecanismo de ação da proteína e sobre uma consideração dos aminoácidos a serem introduzidos, deletados ou substituídos. Conforme utilizado aqui, o termo "seqüência de nucleotídeos mutante" ou "mutação" ou "seqüência de nucleotídeos mutagenizada" denota uma seqüência de nucleotídeos que foi mutagenizada ou alterada para conter um ou mais resíduos de nucleotídeos (por exemplo, pares de bases) que não está presente na seqüência tipo selvagem correspondente. Mutagênese ou alteração consiste em uma ou mais adições, exclusões ou substituições ou reposições de resíduos de ácido nucléico. Quando as mutações são feitas através da adição, remoção ou substituição de um aminoácido de um sítio proteolítico, essa adição, remoção ou substituição pode ser dentro ou adjacente ao motivo do sítio proteolítico, com tanto que o objeto da mutação seja realizado (ou seja, com tanto que a proteólise no local seja alterada).

Uma seqüência de nucleotídeos pode codificar uma toxina inseticida mutante mostrando uma atividade inseticida aumentada ou diminuída, ou uma seqüência de aminoácidos que confira aumento ou diminuição da atividade inseticida em um polipeptídeo que a contenha. Conforme utilizado aqui, o termo "mutante" ou "mutação" no contexto de uma proteína, um polipeptídeo ou uma seqüência de aminoácidos, se refere a uma seqüência que tenha sido mutagenizada ou alterada para conter um ou mais resíduos de aminoácidos que não estão presentes na seqüência correspondente do tipo selvagem. Mutagênese ou alteração consiste em uma ou mais adições, exclusões, substituições ou reposições de resíduos de aminoácidos. Um polipeptídeo mutante mostra aumento ou diminuição da atividade inseticida, ou representa uma seqüência de aminoácidos que confere a melhor atividade inseticida em um polipeptídeo que a contenha. Assim, o termo "mutante" ou "mutação" refere-se a uma ou ambas as seqüências de nucleotídeos mutantes e aminoácidos codificados. Mutantes podem ser usados sozinhos ou em qualquer combinação compatível com outros mutantes dos melhoramentos ou com outros mutantes. Um "polipeptídeo mutante" pode inversamente mostrar uma diminuição na atividade inseticida. Quando mais de uma mutação é adicionada a um ácido nucléico ou proteína em particular, as mutações podem ser adicionadas ao mesmo tempo ou seqüencialmente, se seqüencialmente, as mutações podem ser adicionadas em qualquer ordem adequada.

Conforme utilizado aqui, o termo "melhor atividade inseticida" ou "melhor atividade pesticida" refere-se a um polipeptídeo inseticida dos melhoramentos que realçou a atividade inseticida em relação à atividade de sua proteína tipo selvagem correspondente, e/ou um polipeptídeo inseticida que é eficaz contra uma ampla gama de insetos e/ou um polipeptídeo inseticida tendo especificidade para um inseto que não é suscetível à toxicidade da proteína tipo selvagem.

Um achado de melhor ou aumentada atividade pesticida, exige a demonstração de um aumento da atividade pesticida contra os insetos-alvo, de pelo menos 10%, ou de pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 %, 60%, 70%, 100%, 150%, 200% ou 300% ou mais de aumento de atividade pesticida em relação à atividade pesticida do determinado polipeptídeo inseticida tipo selvagem contra o mesmo inseto.

Por exemplo, uma atividade inseticida ou pesticida melhorada é fornecida, onde uma gama mais ampla ou mais estreita de insetos é afetada pelo polipeptídeo em relação à variedade de insetos que é afetada por uma toxina Bt tipo- selvagem. Uma ampla gama de impacto pode ser desejável, onde a versatilidade é desejada, enquanto que um leque restrito de impacto pode ser desejável, quando, por exemplo, insetos benéficos poderiam de outra forma, ser impactados pelo uso ou presença da toxina. Enquanto os melhoramentos não estão vinculados a qualquer mecanismo específico de ação, uma melhora na atividade pesticida também pode ser fornecida por mudanças em uma ou mais das características de um polipeptídeo, por exemplo, a estabilidade ou a longevidade de um polipeptídeo em um intestino de inseto pode ser aumentada em relação a estabilidade ou a longevidade de uma proteína tipo selvagem correspondente.

O termo "tóxico", usado aqui se refere a um polipeptídeo que mostra atividade pesticida ou atividade inseticida ou, atividade pesticida melhorada ou atividade inseticida melhorada. " Bt" ou toxina de "Bacillus thuringiensis" destina-se a incluir a classe mais ampla de toxinas Cry encontradas em várias linhagens de Bt, que incluem toxinas, como, por exemplo, Cryls, Cry2s, ou Cry3s.

Os termos "sítio proteolítico" ou "clivagem" referem-se a uma seqüência de aminoácidos que confere a sensibilidade para uma classe de proteases ou uma protease específica, de forma que um polipeptídio que contem a seqüência de aminoácidos é digerido pela classe de proteases ou protease em particular. Um sítio proteolítico é dito "sensível" para a protease (s) que reconhece(m) esse sítio. É apreciado na arte que a eficiência da digestão irá variar, e que uma diminuição na eficiência de digestão pode levar a um aumento na estabilidade ou longevidade do polipeptídeo no intestino de um inseto. Assim, um sítio proteolítico pode conferir a sensibilidade para mais de uma protease ou classe de proteases, mas a eficiência da digestão nesse local por várias proteases pode variar. Sítios proteolíticos incluem, por exemplo, sítios de tripsina, sítios de quimotripsina e sítios de elastase.

A pesquisa mostrou que as proteases do intestino de insetos lepidópteros incluem tripsinas, quimotripsinas e elastases. Veja, por exemplo, Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212; e Hedegus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47. Por exemplo, cerca de 18 diferentes tripsinas foram encontradas no intestino médio de larvas de Helicoverpa armigera (ver Gatehouse et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 929-944). Os sítios proteolíticos de substrato preferidos destas proteases têm sido investigados. Veja, por exemplo, Peterson et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 765-774.

Esforços têm sido feitos para se compreender o mecanismo de ação das toxinas Bt e das toxinas modificadas com propriedades melhoradas. Tem sido demonstrado que as proteases do intestino de insetos podem afetar o impacto das proteínas Cry de Bt sobre o inseto. Algumas proteases ativam as proteínas Cry, através do processamento delas a partir de uma forma protoxina em uma forma tóxica ou uma "toxina." Veja, Oppert (1999) Arch.. Insect Biochem. Phys. 42: 1-12; e Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. Essa ativação da toxina pode incluir a remoção dos peptídeos N- e C-terminal da proteína e pode incluir também a clivagem interna da proteína. Outras proteases podem degradar as proteínas Cry. Veja Oppert, ibid.

A comparação das seqüências de aminoácidos das toxinas Cry de diferentes especificidades revela cinco blocos de seqüência altamente conservados. Estruturalmente, as toxinas compreendem três áreas distintas que são a partir do N- para o C-terminal: um grupo de sete alfa-hélices envolvidas na formação de poros (referidas como "domínio 1"), três folhas beta anti-paralelas implicadas na ligação celular (designadas por "domínio 2"), e um sanduíche beta (designado por "domínio 3"). A localização e as propriedades desses domínios são conhecidas daqueles com habilidade na arte. Veja, por exemplo, Li et al. (1991) Nature, 305:815-821 e Morse et al. (2001) Structure, 9:409-417. Quando é feita referência a um determinado domínio, como o domínio 1, entende-se que os parâmetros exatos do domínio em relação a uma determinada seqüência não são críticos, desde que a seqüência ou a parte destas incluam a seqüência que fornece pelo menos alguma função atribuída ao domínio em particular. Assim, por exemplo, quando se refere ao domínio "1", pretende-se que uma determinada seqüência inclua um conjunto de sete alfa- hélices, mas os pontos finais exatos da seqüência utilizada ou referida a qual se relaciona este conjunto não são críticos. Aquele com habilidades na arte está familiarizado com a determinação de tais parâmetros e a avaliação de tais funções.

Em um esforço para melhor caracterizar e melhorar as toxinas Btl linhagens da bactéria Bt foram estudadas. Descobriu-se que preparações cristal preparadas a partir de culturas de linhagens de Bt tinham atividade pesticida contra a broca-do-milho-europeu (ver, por exemplo, exemplos experimentais 1, 2 e 3). Um esforço foi feito para se identificar as seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas de cristal de variedades selecionadas e os ácidos nucléicos do tipo selvagem (isto é, naturalmente ocorrente) dos melhoramentos foram isolados de linhagens bacterianas, clonados em um vetor de expressão, e transformados em E coli. Dependendo das características de uma dada preparação, foi reconhecido que a demonstração da atividade pesticida, por vezes, necessita de um pré-tratamento com tripsina para ativar as proteínas pesticidas. Assim, entende-se que algumas proteínas pesticidas requerem digestão por protease (por exemplo, tripsina, quimotripsina, etc) para a ativação, enquanto outras proteínas são biologicamente ativas (por exemplo, pesticidas), na ausência de tal ativação.

Tais moléculas podem ser alteradas por meios descritos, por exemplo, nas U.S. Application Nos. 10/606,320, arquivada 25 de junho de 2003, e 10/746,914, arquivada em 24 de dezembro de 2003. Além disso, seqüências de ácido nucléicos podem ser projetadas para codificar polipeptídeos que contêm mutações adicionais que conferem atividade pesticida melhoradas ou alteradas em relação à atividade pesticida do polipeptídeo naturalmente ocorrente. As seqüências nucleotídicas dos ácidos nucléicos de tais engenharias compreendem mutações não encontradas nas seqüências do tipo selvagem.

Os polipeptídeos mutantes dos melhoramentos são geralmente preparados por um processo que envolve as etapas de: obtenção de uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da família Cry, analise da estrutura do polipeptídeo para identificação de determinados sítios "alvo" para mutagênese da seqüência do gene subjacente com base na ponderação da função proposta para o domínio alvo no modo de ação da toxina; introdução de uma ou mais mutações na seqüência de ácido nucléico para produzir uma mudança desejada em um ou mais resíduos de aminoácidos da seqüência do polipeptídeo codificado e testar o polipeptídeo produzido para a atividade pesticida.

Muitas das toxinas Bt inseticidas estão relacionadas em vários graus de semelhança em suas seqüências de aminoácidos e estrutura terciária e, meios para se obter as estruturas de cristais das toxinas Bt são bem conhecidos. Soluções de alta resolução da estrutura cristalina exemplar para ambos os polipeptídeos Cry3A e Cry3B estão disponíveis na literatura. A estrutura resolvida do gene Cry3A (Li et al. (1991) Nature 353:815-821) fornece compreensões sobre a relação entre a estrutura e a função da toxina. Uma consideração combinada das análises de estrutura de toxinas Bt publicadas, e da função associada às estruturas, motivos, ou similares particularmente reportados, indica que regiões específicas da toxina são correlacionadas com funções específicas e etapas distintas do modo de ação da proteína. Por exemplo, muitas toxinas isoladas de Bt são geralmente descritas como compostas por três domínios: um pacote de sete-hélices que está envolvido na formação de poros, um domínio de três folhas de que tem sido relacionado à ligação ao receptor, e um motivo beta-sanduíche (Li et al. (1991) Nature 305: 815- 821).

Conforme relatado na U.S. Patent No. 7,105,332, e na U.S. Application No. 10/746,914 pendente, arquivada em 24 de dezembro de 2003, a toxicidade das proteínas Cry pode ser melhorada, alvejando-se a região localizada entre as alfa- hélices 3 e 4 do domínio 1 da toxina . Esta teoria era embasada em um corpo de conhecimento sobre toxinas inseticidas, incluindo: 1) foi reportado que as alfa hélices 4 e 5 do domínio 1 das toxinas Cry3A se inserem na bicamada lipídica das células do epitélio do intestino médio de insetos suscetíveis (Gazit et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 12289-12294), 2) o conhecimento dos inventores sobre a localização dos sítios de clivagem da tripsina e quimotripsina dentro da seqüência de aminoácidos da proteína do tipo selvagem, 3) a observação de que a proteína de tipo selvagem foi mais ativa contra certos insetos após a ativação in vitro através do tratamento com tripsina ou quimotripsina e 4) relato de que a digestão de toxinas a partir do 3' terminal resultou na diminuição da toxicidade para insetos.

Uma série de mutações pode ser criada e colocada em uma variedade de seqüências de base para se criar novos polipeptídeos tendo atividade pesticida melhorada ou alterada. Ver, por exemplo, U.S. Application Nos. 10/606,320, arquivada em 25 de junho de 2003, agora abandonada, e 10/746,914, arquivada em 24 de dezembro de 2 003. Estes mutantes incluem, mas não estão limitados a: a adição de pelo menos mais um sítio sensível a protease (por exemplo, clivagem por tripsina) na região localizada entre as hélices de 3 e 4 do domínio 1, a substituição de um sítio sensível da protease original na seqüência do tipo selvagem, por um sítio sensível de uma protease diferente, a adição de múltiplos sítios sensíveis a protease em um determinado local, a adição de resíduos de aminoácidos próximos do sítio sensível a protease (s) a alteração do dobramento do polipeptídeo para, assim, melhorar a digestão do polipeptídeo no sítio protease- sensível (s), e a adição de mutações para proteger o polipeptídeo da digestão de degradação, que reduz a toxicidade (por exemplo, fazendo uma série de mutações nas quais o aminoácido do tipo selvagem é substituído pelo aminoácido valina para proteger o polipeptídio da digestão). As mutações podem ser utilizadas separadamente ou em qualquer combinação para fornecer polipeptídeos dos melhoramentos.

Desta forma, os melhoramentos fornecem seqüências que compreendem uma variedade de mutações, como, por exemplo, uma mutação que compreende um sítio protease-sensível adicional, ou alternativo, localizado entre as alfa-hélices 3 e 4 do domínio 1 do polipeptídeo codificado . Uma mutação que é um sítio protease-sensível adicional ou alternativo pode ser sensível a várias classes de proteases, tais como proteases de serina, o que inclui tripsina e quimotripsina, ou enzimas como a elastase. Assim, uma mutação que é um sitio protease- sensivel adicional ou alternativo pode ser projetada de modo que o sitio seja prontamente reconhecido e/ou clivado por uma categoria de proteases, como as proteases de mamíferos ou proteases de insetos. Um sitio protease-sensível pode também ser concebido para ser clivado por uma determinada classe de enzimas ou por uma enzima em particular conhecida por ser produzida em um organismo, como, por exemplo, uma quimotripsina produzida pela lagarta-da-espiga Heliothis zea (Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201- 212). As mutações podem conferir resistência à digestão proteolítica, por exemplo, a digestão por quimotripsina na região C-terminal do peptídeo.

A presença de um sítio protease-sensível adicional ou alternativo na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pode melhorar a atividade pesticida e/ou a especificidade do polipeptídeo codificado pelos ácidos nucléicos dos melhoramentos. Assim, as seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos podem ser recombinantes ou geneticamente manipuladas para produzir polipeptídeos tendo a atividade inseticida e/ou a especificidade melhorada ou alterada quando comparada com a de uma toxina tipo selvagem inalterada. Além disso, as mutações divulgadas aqui podem ser colocadas ou utilizadas em conjunto com outras seqüências de nucleotídeos para fornecer as propriedades melhoradas. Por exemplo, um sítio protease-sensível, que é rapidamente clivado por quimotripsina de inseto, por exemplo, uma quimotripsina encontrada na lagarta-cartucho bertha ou na lagarta-cartucho-de-milho (Hegedus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47; e Lenz et al. (1991) Arch.

Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212), pode ser colocada em uma seqüência Cry base para fornecer toxicidade melhorada a essa seqüência. Desta forma, os melhoramentos fornecem polipeptídeos tóxicos com propriedades melhoradas.

Por exemplo, uma seqüência de nucleotideos Cry mutagenizada pode incluir mutantes adicionais que compreendem códons adicionais que introduzem uma segunda seqüência de aminoácido tripsina-sensível (além do sítio de tripsina natural) no polipeptídeo codificado. Um mutante adicional alternativo dos melhoramentos compreende códons adicionais destinados a introduzir, pelo menos, um diferente sítio protease-sensível adicional para o polipeptídeo, por exemplo, um sítio quimotripsina-sensível localizado imediatamente a 5' ou a 3' do sítio de tripsina que ocorre naturalmente.

Alternativamente, mutantes de substituição podem ser criados em que pelo menos um códon do ácido nucléico que codifica o sítio protease-sensível naturalmente ocorrente é destruído e códons alternativos são introduzidos na seqüência de ácido nucléico, a fim de proporcionar um sítio protease-sensível diferente (por exemplo, substituto). Um mutante de substituição também pode ser adicionado a uma seqüência Cry na qual o sítio de clivagem de tripsina naturalmente ocorrente presente no polipeptídeo codificado é destruído e um sítio de clivagem para quimotripsina ou elastase é introduzido em seu lugar.

É sabido que qualquer seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência de aminoácidos que são sítios proteolíticos ou sítios proteolíticos hipotéticos (por exemplo, grupos como NGSR, RR, ou LKM) pode ser utilizada e que a identidade exata dos códons utilizados para introduzir qualquer um destes sítios de clivagem em um polipeptídeo variante pode variar dependendo da utilização, ou seja, expressão de uma determinada planta. Também é reconhecido que qualquer uma das mutações divulgadas pode ser introduzida em qualquer seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos que compreendem os códons para resíduos de aminoácidos que fornecem o sítio de clivagem de tripsina nativo que é alvo de modificação. Assim, as variantes tanto de uma toxina de tamanho integral ou fragmentos desta podem ser modificadas para conter sítios de clivagem adicionais ou alternativos, e esses melhoramentos se destinam a ser abrangidos pelo âmbito de aplicação dos melhoramentos aqui divulgados.

Será apreciado por aqueles com habilidade na arte que qualquer mutação útil pode ser adicionada às seqüências dos melhoramentos, desde que os polipeptídeos codificados mantenham a atividade pesticida. Assim, seqüências também podem ser transformadas de modo a que os polipeptídeos codificados sejam resistentes à digestão proteolitica pela quimotripsina. Mais de um sítio de reconhecimento pode ser adicionado em um local especial em qualquer combinação, e múltiplos sítios de reconhecimento podem ser adicionados ou removidos da toxina. Assim, mutações adicionais podem incluir três, quatro ou mais sítios de reconhecimento. É preciso reconhecer que mutações múltiplas podem ser projetadas em qualquer seqüência de polinucleotídeo adequada; em conformidade, seqüências integrais ou fragmentos destas podem ser modificados para conter sítios de clivagem adicionais ou alternativos, bem como ser resistente à digestão proteolitica. Desta forma, os melhoramentos fornecem toxinas Cry contendo mutações que melhoram a atividade de pesticidas, bem como composições melhoradas e métodos para impactar as pragas utilizando outras toxinas Bt.

As mutações podem proteger o polipeptídeo da degradação por protease, por exemplo, retirando-se os sítios proteolíticos hipotéticos como sítios de serina protease hipotéticos e sítios de reconhecimento de elastase de diferentes áreas. Alguns ou todos esses sítios hipotéticos podem ser removidos ou alterados de modo que a proteólise no local do sítio original é diminuída. Alterações na proteólise podem ser avaliadas comparando-se um polipeptídeo mutante com toxinas do tipo selvagem ou comparando-se toxinas mutantes que diferem em sua seqüência de aminoácidos. Sítios proteolíticos e sítios proteolíticos hipotéticos incluem, mas não estão limitados a, as seguintes seqüências: RR, um sítio de clivagem da tripsina; LKM, um sítio de quimotripsina e NGSR, um sítio de tripsina. Esses sítios podem ser alterados pela adição ou supressão de qualquer número e tipo de resíduos de aminoácidos, enquanto a atividade pesticida do polipeptídeo é aumentada. Assim, polipeptídeos codificados por seqüências de nucleotídeos compreendendo mutações incluirão, pelo menos, uma mudança ou adição de aminoácidos em relação ao nativo ou seqüência de base, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, ou 280 ou mais alterações ou adições de aminoácidos.

Em melhoramentos particulares, as proteínas pesticidas dos melhoramentos fornecem polipeptídeos inseticidas de tamanho integral, fragmentos dos polipeptídeos inseticidas de tamanho integral, e polipeptídeos variantes que são produzidos a partir de ácidos nucléicos mutagenizados especialmente desenhados para introduzir seqüências de aminoácidos em polipeptídeos dos melhoramentos. Em melhoramentos particulares, as seqüências de aminoácidos que são introduzidas nos polipeptídeos compreendem uma seqüência que fornece um sítio de clivagem para uma enzima, como uma protease. Sabe-se na arte que a atividade pesticida de toxinas Bt é normalmente ativada por clivagem do peptídeo no intestino do inseto por diferentes proteases. Uma vez que os peptídeos podem nem sempre ser clivados com total eficiência no intestino do inseto, os fragmentos de uma toxina integral podem ter a atividade pesticida aumentada, em comparação com a toxina integral em si. Assim, alguns dos polipeptideos dos melhoramentos incluem fragmentos de um polipeptídeo inseticida de tamanho integral, e alguns dos fragmentos do polipeptídeo, variantes e mutações terão a atividade pesticida reforçada em relação à atividade do polipeptídeo inseticida naturalmente ocorrente a partir do qual estes são derivados, especialmente se o polipeptídeo inseticida naturalmente ocorrente não é ativado in vitro com uma protease antes do rastreamento para atividade. Assim, o presente pedido abrange versões truncadas ou fragmentos das seqüências.

As mutações podem ser colocadas em qualquer seqüência base, incluindo tais polipeptideos truncados, enquanto o polipeptídeo mantém a atividade pesticida. Aquele com habilidade na arte pode facilmente comparar duas ou mais proteínas no que diz respeito à atividade pesticida, utilizando testes conhecidos na arte ou descritos neste contrato. É preciso entender que os polipeptideos dos melhoramentos podem ser produzidos tanto pela expressão de um ácido nucléico divulgado aqui, ou pelo uso de técnicas padronizadas de biologia molecular.

É reconhecido que as proteínas pesticidas podem ser oligoméricas e irão variar em peso molecular, número de resíduos, componentes peptídeos, atividade contra uma determinada praga, e outras características. No entanto, segundo os métodos aqui previstos, proteínas ativas contra uma variedade de pragas podem ser isoladas e caracterizadas.

As proteínas pesticidas dos melhoramentos podem ser usadas em combinação com outras toxinas Bt ou outras proteínas inseticidas para aumentar a faixa de insetos alvo. Além disso, o uso das proteínas pesticidas dos melhoramentos em combinação com outras toxinas inseticidas Bt ou outros princípios inseticidas de uma natureza distinta tem particular utilidade para a prevenção e/ou gestão de resistência a insetos. Outros agentes inseticidas incluem inibidores da protease (de ambos os tipos serina e cisteína), α-amilase e peroxidase.

Fragmentos e variantes de seqüências de nucleotídeo e de aminoácidos e os polipeptídeos codificados, assim, também são abrangidos pelos melhoramentos. Conforme utilizado aqui o termo "fragmento" se refere a uma parte de uma seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo ou uma parte de uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo dos melhoramentos. Fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos podem codificar fragmentos de proteínas que mantêm a atividade biológica da proteína nativa ou de comprimento integral correspondente e, portanto, possuem atividade pesticida. Assim, reconhece-se que alguns dos polinucleotídeos e seqüências de aminoácidos dos melhoramentos podem corretamente ser referidos a ambos os fragmentos e mutantes.

É preciso entender que o termo "fragmento", como ele é usado para se referir a seqüências de ácido nucléico dos melhoramentos, abrange também as seqüências que são úteis como sondas de hibridização. Esta classe de seqüências de nucleotídeos geralmente não codifica fragmentos protéicos que retenham a atividade biológica. Assim, fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, e até o tamanho completo da seqüência de nucleotídeos que codificam as proteínas dos melhoramentos.

Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida dos melhoramentos irá codificar, pelo menos, 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100 ou 1.200 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo pesticida dos melhoramentos (por exemplo, 670 aminoácidos para a SEQ ID NO: 2). Assim, entende-se que os melhoramentos também englobam polipeptídeos que são fragmentos das proteínas pesticidas exemplares dos melhoramentos e tendo comprimentos de pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100 ou 1.200 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo pesticida dos melhoramentos (por exemplo, 670 aminoácidos para a SEQ ID Nos: 2). Os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos que são úteis como sondas de hibridização ou iniciadores de PCR em geral, não precisam codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida. Assim, um fragmento de ácido nucléico das incorporações pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR utilizando-se métodos aqui divulgados. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida pode ser obtida por isolamento de uma parte de uma das seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos, expressando a porção da proteína pesticida codificada (por exemplo, pela expressão de recombinação in vitro), e avaliando-se a atividade da porção da proteína pesticida codificada.

Os ácidos nucléicos que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos incluem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1.000, 1.200, 1.400, 1.600, 1.800 ou 2.000 nucleotídeos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma seqüência de nucleotídeos aqui divulgada (por exemplo, 1.902 nucleotídeos para a SEQ ID NO: 1). Fragmentos de melhoramentos particulares vislumbrados a parir de (por exemplo, produzido a partir de) um primeiro ácido nucléico dos melhoramentos, onde o fragmento codifica uma toxina truncada caracterizada por atividade pesticida. Polipeptídeos truncados codificados pelos fragmentos de polinucleotídeos dos melhoramentos são caracterizados pela atividade pesticida que é equivalente a, ou melhorada, em relação a atividade do polipeptídeo integral correspondente codificado pelo primeiro ácido nucléico a partir do qual o fragmento é derivado. Prevê-se que tais fragmentos de ácido nucléico dos melhoramentos podem ser truncados na extremidade 3' da seqüência de codificação nativa ou de tamanho integral correspondente. Fragmentos de ácidos nucléicos também podem ser truncados, tanto a 5' quanto no final 3' da seqüência de codificação nativa ou de comprimento integral correspondente.

O termo "variantes" é aqui utilizado para se referir a seqüências muito semelhantes. Para as seqüências de nucleotídeos, variantes conservadas incluem as seqüências que, por causa da degeneração do código genético, codificam a seqüência de aminoácidos de um dos polipeptídeos pesticidas dos melhoramentos. Variantes alélicas como estas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas conhecidas de biologia molecular, como, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme aqui descrito.

As seqüências de nucleotídeos variantes também incluem seqüências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, como as geradas, por exemplo, usando-se mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codificam uma proteína pesticida dos melhoramentos, como uma toxina mutante. Geralmente, as variantes de uma seqüência de nucleotídeos específica dos melhoramentos terão pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de seqüência a estas seqüências de nucleotídeos em particular conforme determinado por programas de alinhamento de seqüência descritos no presente documento utilizando-se parâmetros predefinidos. A variante de uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos pode diferir desta seqüência por apenas 1-15 nucleotídeos, por apenas: 1-10, tais como, 6-10, ou somente 5, somente 4, 3, 2, ou mesmo 1 nucleotídeo.

As variantes de uma seqüência de nucleotídeos específica dos melhoramentos (ou seja, uma seqüência de nucleotídeos exemplar) também podem ser avaliadas através da comparação do percentual de identidade de seqüência entre o polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeos variante e o polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeos de referência. Assim, por exemplo, ácidos nucléicos isolados que codificam um polipeptídeo com um dado percentual de identidade de seqüência ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 são divulgados. O percentual de identidade de seqüência entre dois polipeptídeos pode ser calculado usando-se programas de alinhamento da seqüência descritos aqui e utilizando-se parâmetros predefinidos. Sempre que um dado par de polinucleotídeos dos melhoramentos é avaliado por comparação do percentual de identidade de seqüência partilhada pelos dois polipeptídeos que eles codificam, o percentual de identidade de seqüência entre os dois polipeptídeos codificados é de, pelo menos, cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, geralmente, pelo menos, cerca de 75%, 80%, 85%, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, ou pelo menos cerca de 98%, 99% ou mais identidade de seqüência.

Conforme aqui utilizado, o termo "proteína variante" engloba polipeptídeos que são derivados de uma proteína nativa por: exclusão (o chamado truncamento) ou adição de um ou mais aminoácidos na porção N- terminal e/ou C-terminal da proteína nativa, supressão ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa, ou a substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa. Assim, o termo "proteína variante" engloba fragmentos biologicamente ativos de uma proteína nativa que compreendem um número suficiente de resíduos de aminoácidos contíguos para se manter a atividade biológica da proteína nativa, ou seja, para se ter atividade pesticida. Tal atividade pesticida pode ser diferente ou melhorada em relação à proteína nativa ou pode ser inalterada, enquanto a atividade pesticida é mantida.

As proteínas variantes englobadas pelos melhoramentos são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, que é a atividade como pesticida, como aqui descrito. Tais variações podem resultar a partir de, por exemplo, polimorfismo genético ou manipulação humana. Variantes biologicamente ativas de uma proteína pesticida nativa dos melhoramentos terão pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da proteína nativa, como determinado pelos programas de alinhamento da seqüência descritos aqui e usando-se parâmetros padronizados. Uma variante biologicamente ativa da proteína dos melhoramentos pode diferir da proteína por somente 1-15 resíduos de aminoácidos, por somente: 1-10, tais como, 6-10, somente 5, somente 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.

Os melhoramentos ainda englobam um microorganismo que é transformado com pelo menos um ácido nucléico dos melhoramentos, com um cassete de expressão compreendendo o ácido nucléico, ou com um vetor que inclui o cassete de expressão. Em alguns melhoramentos, o microorganismo é aquele que se multiplica em plantas. Um melhoramento da invenção refere-se a uma proteína pesticida encapsulada que compreende um microorganismo transformado capaz de expressar, pelo menos, uma proteína pesticida dos melhoramentos.

Os melhoramentos fornecem composições pesticidas compreendendo um microorganismo transformado dos melhoramentos. Em tais melhoramentos, o microorganismo transformado é geralmente presente na composição de pesticidas em uma quantidade de eficácia pesticida, juntamente com um carreador adequado. Os melhoramentos abrangem também composições pesticidas compreendendo uma proteína isolada dos melhoramentos, isoladamente ou em combinação com um organismo transformado dos melhoramentos e/ou uma proteína pesticida encapsulada dos melhoramentos, em uma quantidade de eficácia inseticida, juntamente com um carreador adequado.

Os melhoramentos prevêem ainda um método de aumentar a gama de insetos-alvo, usando-se uma proteína pesticida dos melhoramentos em combinação com, pelo menos, uma outra ou "segunda" proteína pesticida. Qualquer proteína pesticida conhecida na arte pode ser empregada nos métodos dos melhoramentos. Essas proteínas pesticidas incluem, mas não estão limitadas a, toxinas Bt, inibidores da protease, a- amilases e peroxidases. Os melhoramentos também englobam plantas transformadas ou transgênicas compreendendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos. Em alguns melhoramentos, a planta é estavelmente transformada com um construto de nucleotídeo compreendendo pelo menos, uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal. Como aqui utilizado, a expressão "planta transformada" e "plantas transgênicas" referem-se a uma planta que compreende dentro do seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é estavelmente integrado no genoma de uma planta transgênica ou transformado, de modo que o polinucleotídeo é transmitido às gerações sucessivas. 0 polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão recombinante.

É preciso entender que o termo "transgênico" utilizado aqui inclui qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte da planta, ou planta da qual o genótipo foi alterado pela presença de um ácido nucléico heterólogo, incluindo os transgênicos inicialmente tão alterados bem como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada do transgênico inicial. 0 termo "transgênico", usado aqui, não abrange a alteração do genoma (cromossômicas ou extra- cromossômicas) por métodos convencionais de melhoramento de plantas que ocorrem naturalmente ou por eventos como a fecundação cruzada aleatória, infecção viral não- recombinante, transformação bacteriana não-recombinante, transposição não-recombinante, ou uma mutação espontânea.

Conforme utilizado aqui, o termo "planta" inclui a planta inteira e órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc), sementes, células vegetais e descendentes dos mesmos. Partes de plantas transgênicas estão dentro do escopo dos melhoramentos e incluem, por exemplo, as células vegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, caules, frutos, folhas e raízes originárias de plantas transgênicas ou de seus descendentes previamente transformados com uma molécula de DNA dos melhoramentos e, portanto, constituído pelo menos em parte de células transgênicas.

Como utilizado aqui, o termo planta inclui células vegetais, protoplastos de plantas, culturas de células do tecido vegetal a partir do qual as plantas podem ser regeneradas, calos de plantas, touceiras de plantas e células vegetais que estão intactas em plantas ou partes de plantas, como os embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutos, caroços, orelhas, espigas, as cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras, e assim por diante. A classe de plantas que pode ser utilizada nos métodos dos melhoramentos geralmente é tão ampla quanto a classe de plantas superiores passíveis de técnicas de transformação, incluindo as plantas de ambas as monocotiledôneas e dicotiledôneas. Tais plantas incluem, por exemplo, Solanum tuberosum e Zea mays.

Enquanto os melhoramentos não dependem de um mecanismo biológico em particular para aumentar a resistência de uma planta a uma praga de planta, a expressão das seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos em uma planta pode resultar na produção das proteínas pesticidas dos melhoramentos e num aumento na resistência da planta a uma praga de plantas. Encontra-se uso para as plantas dos melhoramentos na agricultura, em métodos para impactar as pragas de insetos. Determinados melhoramentos fornecem plantas de cultivo transformadas, como, por exemplo, plantas de milho, que são úteis em métodos para impactar as pragas da planta, como, por exemplo, a broca-do-milho-europeu.

Uma "planta ou célula vegetal submetida" é uma na qual tenha sido realizada alteração genética, como transformação, em um gene de interesse, ou é uma planta ou célula de planta, que é descendente de uma planta ou célula de planta alterada e que compreende as alterações. Um "controle" ou "unidade de controle" ou "célula vegetal controle" fornece um ponto de referência para se medir as mudanças fenotípicas da planta ou célula vegetal submetida. A planta ou célula vegetal controle pode incluir, por exemplo: (a) uma planta ou célula do tipo selvagem, que seja do mesmo genótipo do material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou célula vegetal sujeita, (b) um planta ou célula de planta de mesmo genótipo do material de partida, mas que foi transformada com a construção de um nulo (isto é, com uma construção que não tem qualquer efeito sobre a característica de interesse, como uma construção que compreende um gene marcador), (c) uma planta ou célula vegetal, que é um segregante não-transformado entre a progênie de uma planta ou célula vegetal submetida, (d) uma planta ou célula vegetal geneticamente idêntica à planta de ou de células vegetal submetida, mas que não seja exposta a condições ou estímulos que induziriam a expressão do gene de interesse, ou (e) a planta ou de células vegetal em si, mas em condições em que o gene de interesse não é expresso.

Aqueles com habilidade na arte prontamente reconhecem que os avanços no campo da biologia molecular, tais como mutagênese sítio-específicas e aleatórias, metodologias de reação em cadeia da polimerase e técnicas de engenharia de proteínas fornecem uma extensa coleção de ferramentas e protocolos apropriados para uso para alteração ou modificação tanto da seqüência de aminoácidos quanto as seqüências genéticas subjacentes para proteínas de interesse agrícola. Assim, as proteínas dos melhoramentos podem ser alteradas de várias maneiras, incluindo substituições de aminoácidos, exclusões, truncamentos, e inserções. Métodos de tais manipulações são geralmente conhecidas na arte. Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácidos das proteínas pesticidas podem ser preparadas através da introdução de mutações em um ácido nucléico sintético (por exemplo, uma molécula de DNA). Métodos de mutagênese e alterações de ácido nucléico são bem conhecidos na arte. Por exemplo, as alterações projetadas podem ser introduzidas usando-se uma técnica de mutagênese sítio-dirigida mediada por oligonucleotídeo. Veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. Patent No. 4,873,192; Walker e Gaastra, eds. (19 83) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), e as referências aí citadas.

As seqüências de nucleotídeos mutagenizados dos melhoramentos podem ser modificadas de modo a alterar cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 ou mais dos aminoácidos presentes na seqüência primária do polipeptídeo codificado. Alternativamente, ainda mais mudanças podem ser introduzidas a partir da seqüência nativa de forma que a proteína codificada pode ter, ao menos, cerca de 1% ou 2%, ou cerca de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, ou até mesmo cerca de 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ou 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ou 25%, 30%, 35%, ou 40% ou mais dos códons alterados, modificados ou não, em comparação com a proteína do tipo- selvagem correspondente. Da mesma forma, a proteína codificada pode ter menos de 1% ou 2%, ou cerca de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, ou até mesmo cerca de 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ou 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ou 25%, 30%, 35% , ou 40% ou mais códons adicionais em comparação com a proteína tipo-selvagem correspondente. Deve ser entendido que as seqüências de nucleotídeos mutagenizados dos melhoramentos visam abranger peptídeos equivalentes e biologicamente funcionais, que têm atividade pesticida, tais como uma atividade pesticida melhorada, conforme determinado por propriedades anti-alimentares contra a larva da lagarta- do-cartucho-de-outono. Tais seqüências podem surgir como conseqüência da redundância de códon e equivalência funcional que são conhecidas por ocorrer naturalmente dentro de seqüências de ácidos nucléicos e das proteínas assim codificadas.

Aquele com habilidades na arte seria capaz de reconhecer que as adições de aminoácidos e/ou substituições são geralmente embasadas na similaridade relativa da cadeia lateral do aminoácido-substituinte, por exemplo, sua hidrofobicidade, carga, tamanho, e assim por diante. Grupos de substituição de aminoácidos exemplares que tomam várias das características precedentes em consideração são bem conhecidos para aqueles com habilidade na arte e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato, serina e treonina, glutamina e asparagina e valina, leucina e isoleucina.

Orientações quanto às substituições de aminoácidos adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), aqui incorporado pela referência. Substituições conservadas, como a troca de um aminoácido por outro de propriedades semelhantes, podem ser feitas.

Assim, os genes e as seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos incluem tanto as seqüências que ocorrem naturalmente e formas mutantes. Da mesma forma, as proteínas dos melhoramentos abrangem tanto as proteínas naturais e formas variantes (por exemplo, os polipeptídeos truncados) e modificadas (por exemplo, mutante) desta. Essas variantes continuam a possuir a atividade pesticida desejada. Obviamente, as mutações que serão feitas na seqüência de nucleotídeos que codifica a variação não devem colocar a seqüência fora do quadros de leitura e, geralmente, não vão criar regiões complementares que poderiam produzir estrutura secundária do mRNA. Veja, EP Patent Application Publication No. 75.444. Não se espera que as deleções, inserções e substituições das seqüências de proteína aqui englobadas produzam mudanças radicais nas características das proteínas. No entanto, quando é difícil se prever o efeito exato da substituição, exclusão ou inserção antes de fazê-lo, um profissional do ramo compreenderá que o efeito será avaliado por testes de rastreio de rotina, como ensaios de alimentação de inseto. Veja, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293 e Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485, aqui incorporados pela referência.

Seqüências de nucleotídeos variantes e proteínas também englobam seqüências e proteínas derivadas de um processo mutagênico e recombinogênico como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais seqüências de codificação diferentes podem ser manipuladas para se criar uma nova proteína pesticida, possuindo as propriedades desejadas. Desta forma, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de seqüências de polinucleotídeos relacionados compreendendo regiões de seqüência que têm identidade de seqüência substancial e podem ser recombinadas por homologia in vitro e in vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, seqüências de codificação integrais, motivos de seqüência de codificação de um domínio de interesse, ou qualquer fragmento de uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos podem ser embaralhadas entre as seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos e as porções correspondentes dos outras seqüências de nucleotídeos Cry conhecidas para se obter um novo gene que codifica para uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada.

Propriedades de interesse incluem, mas não estão limitadas a, atividade de pesticidas por unidade de proteína pesticida, a estabilidade da proteína, e a toxicidade para espécies não-alvo, em especial os seres humanos, animais, plantas e microorganismos que expressam os polipeptídeos pesticidas dos melhoramentos. Os melhoramentos não estão vinculados a uma estratégia de embaralhamento particular, só que pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dos melhoramentos, ou parte dela, está envolvida numa estratégia de embaralhamento. 0 embaralhamento pode envolver apenas as seqüências de nucleotídeos aqui divulgadas ou pode incluir, adicionalmente, embaralhamento de outras seqüências de nucleotídeos conhecidas na arte. Estratégias para o embaralhamento de DNA são conhecidas na arte. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747- 10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288- 291; e U.S. Patent Nos. 5,605,793 e 5,837,458.

As seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos também podem ser usadas para se isolar as seqüências correspondentes de outros organismos, especialmente outras bactérias, e mais particularmente outras linhagens de Bacillus. Desta forma, métodos como PCR, hibridização e similares podem ser usados para se identificar tais seqüências com base em sua homologia de seqüência com as seqüências aqui enunciadas. Seqüências que são selecionados com base em sua identidade de seqüência para as seqüências inteiras aqui enunciadas ou fragmentos destas não são abrangidos pelos melhoramentos. Tais seqüências incluem seqüências que são ortólogos das seqüências divulgadas. O termo "ortólogos" refere-se aos genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies, como resultado de especiação. Genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando suas seqüências de nucleotídeos e/ou suas seqüências codificadoras de proteína partilham identidade substancial, tal como definido no presente trabalho. As funções dos ortólogos são normalmente altamente conservadas entre as espécies.

Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser projetados para o uso em reações de PCR para amplificar seqüências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou de DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para a concepção de iniciadores de PCR e para clonagem por PCR são geralmente conhecidos na arte e são divulgados em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova York), denominado a seguir como "Sambrook". Veja também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas não estão limitados a, métodos utilizando iniciadores pareados, iniciadores aninhados (nested), iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores gene específicos, iniciadores vetor específicos, iniciadores parcialmente incompatíveis, e assim por diante.

Nas técnicas de hibridização, a totalidade ou uma parte de uma seqüência de nucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que, seletivamente, hibridiza a outras seqüências de nucleotídeos correspondentes e presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (ou seja, bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos, e pode ser rotulados com um grupo detectável como 32P ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, as sondas de hibridização podem ser feitas através da marcação de oligonucleotídeos sintéticos baseados nas seqüências dos melhoramentos. Métodos de preparação de sondas para hibridização e para a construção de bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na arte e são divulgados no Sambrook.

Por exemplo, uma seqüência integral aqui divulgada, ou uma ou mais partes dela, pode ser usada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com as seqüências e RNA mensageiro correspondentes. Para se realizar a hibridação especifica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem seqüências que são únicas para as seqüências dos melhoramentos e são geralmente, pelo menos, entre cerca de 10 ou 20 nucleotídeos de comprimento. Essas sondas podem ser utilizadas para amplificar seqüências Cry correspondentes a partir de um organismo escolhido por PCR. Esta técnica pode ser usada para se isolar seqüências de codificação de um organismo desejado ou como um teste de diagnóstico para se determinar a presença de seqüências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridização incluem rastreamento por hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (tanto placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook).

As hibridações destas seqüências podem ser realizadas em condições estringentes. 0 termo "condições estringentes" ou "condições estringentes de hibridação", usado aqui se refere a condições na qual uma sonda irá hibridizar com a sua seqüência alvo a um grau detectável maior do que a outras seqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes, 5 vezes, ou 10 vezes acima da base). Condições estringentes são dependentes da seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Ao controlar a estringência da hibridação e/ou as condições de lavagem, grupos-alvo que são 100% complementar es a sonda podem ser identificados (marcação ou sondagem de homólogos).

Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguns pareamentos errôneos entre as seqüências para que menores graus de similaridade sejam detectados (marcação ou sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é inferior a cerca de 1000 ou 500 nucleotídeos em comprimento.

Normalmente, as condições restritivas serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íons de Na, tipicamente entre cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons Na (ou outros sais) em pH 7,0 para 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 3 0°C para sondas de curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas de longas (por exemplo, superior a 50 nucleotídeos). Condições de alta estringência também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, tais como formamida. Condições de baixa estringência exemplares incluem a hibridação com uma solução tampão de formamida 30 a 35%, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC =3,0 M NaCl/0,3 M citrato trissódico) a 50 até 55°C. Condições de estringência moderada exemplares incluem a hibridação em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0. 5X a IX SSC em 55 a 60°C. Condições de alta estringência exemplares incluem a hibridação em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem final em 0.1X SSC a 60 até 65°C durante pelo menos 20 minutos. Opcionalmente, tampões de lavagem podem incluir cerca de 0,1% para cerca de 1% de SDS. A duração da hibridação é geralmente inferior a cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

A especificidade é tipicamente a função das lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para os híbridos DNA-DNA, a Tm (ponto ou temperatura de fusão térmica) pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% de forma) - 500/L, onde M é a molaridade de cátions monovalentes,% GC é a porcentagem de nucleotídeos guanina e citosina no DNA, "% de forma" é a percentagem de formamida na solução de hibridação, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) , na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente alinhada. As lavagens normalmente são realizadas pelo menos até que o equilíbrio seja alcançado e um baixo nível de ruído da hibridação é alcançado, como, por 2 horas, 1 hora ou 30 minutos. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de pareamento errôneo, assim, a Tm, a hibridação e/ou as condições de lavagem podem ser ajustadas para a hibridização com seqüências de identidade desejada. Por exemplo, se as seqüências com mais de 90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser reduzida em 10°C. Geralmente, as condições restritivas são selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixas do que a Tm para a seqüência especifica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições extremamente rigorosas podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C mais baixa do que o Tm; condições moderadamente severas podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C mais baixa do que o Tm,- e condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C mais baixa do que a Tm.

Usando-se a equação, composições de hibridação e de lavagem, e Tm desejada, aqueles com habilidades ordinárias irão entender que as variações na estringência de hibridação e/ou das soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de pareamento errôneo resulte em uma Tm inferior a 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), a concentração do SSC pode ser aumentada de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al. , eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Veja também Sambrook. Assim, grupos isolados que codificam uma proteína Cry dos melhoramentos e hibridizam sob condições severas nas seqüências Cry divulgadas aqui, ou a fragmentos destas, não são abrangidos pelos melhoramentos.

Os termos a seguir são usados para descrever as relações entre as seqüências de dois ou mais ácidos nucléicos ou polinucleotídeos: (a) "seqüência referência", (b) "janela de comparação", (c) " identidade de seqüência", (d) "percentagem de identidade de seqüência", e (e) "identidade substancial".

(a) Como usado aqui, "seqüência referência" é uma seqüência definida usada como uma base para comparação de seqüência. Uma seqüência referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma seqüência específica, por exemplo, como um segmento de um cDNA ou seqüência gênica de tamanho integral, ou o cDNA ou seqüência gênica completos.

(b) Como usado aqui, "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e específico de uma seqüência de nucleotídeos, em que a seqüência de nucleotídeos na janela de comparação pode incluir acréscimos ou supressões (ou seja, lacunas) em relação à seqüência referência (que não contém os acréscimos ou supressões) para o melhor alinhamento das duas seqüências. Geralmente, a janela de comparação é pelo menos de 2 0 nucleotídeos contíguos em comprimento, e, opcionalmente, pode ser de 30, 40, 50, 100, ou mais. Aqueles com habilidade na arte entenderão que, para se evitar uma alta similaridade a uma seqüência referência devido à inclusão de lacunas na seqüência polinucleotídeo, uma penalidade de lacuna {gap penalty) geralmente é introduzida e é subtraída do número de casamentos ou alinhamentos.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte. Assim, a determinação do percentual de identidade de seqüência entre as duas seqüências pode ser feita usando-se um algoritmo matemático. Exemplos não- limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; o método de procura-por- alinhamento local de Pearson e Lipman (19 88) Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 872264, alterado em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90: 5873-5877 .

Implementações computacionais destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para a comparação de seqüências para se determinar a identidade de seqüência. Tais implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível pela Intelligenetics, Mountain View, Califórnia), o programa ALIGN (versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no pacote GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível pela Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, USA) . Alinhamentos usando esses programas podem ser feitos usando-se os parâmetros padronizados. 0 programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. 0 programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usados com o programa ALIGN quando se compara seqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 é baseado no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. Pesquisas de nucleotídeos no BLAST podem ser realizadas com o programa blastn, pontuação (score)= 100, tamanho de palavra (wordlength) = 12, para se obter as seqüências de nucleotídeos homólogos para uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína dos melhoramentos. Pesquisas de proteína no BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3, para se obter seqüências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo dos melhoramentos. Para se obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2,0) pode ser utilizado como descrito no Altschul et al.

(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, o PSI- BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado para se executar uma busca reiterativa que detecta as relações distantes entre moléculas. Veja Altschul et al. (1997) supra. Quando se está utilizando o BLAST, Gapped BLAST, ou PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, blastn para seqüências de nucleotídeos, BLASTX de proteínas) podem ser usados. Veja o endereço eletrônico da National Center for Biotechnology Information na world wide web em ncbi.hlm.nih.gov. 0 alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

Salvo disposição contrária, a identidade de seqüência/similaridade contidas neste documento refere-se ao valor obtido utilizando-se GAP versão 10 utilizando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de semelhança para uma seqüência de nucleotídeos utilizando Peso de Lacuna (GAP Weight) de 50 e Peso de Comprimento (Length Weight) de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de semelhança para uma seqüência de aminoácidos usando-se Peso de Lacuna de 8 e Peso de Comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62, ou qualquer outro programa equivalente. O termo "programa equivalente", usado aqui se refere a qualquer programa de comparação de seqüência que, para quaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamento tendo casamento de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos idênticos e um percentual de identidade de seqüência idêntico quando comparado com o alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.

O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) supra, para encontrar o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de igualdades e minimiza o número de lacunas. 0 GAP considera todos os possíveis alinhamentos e posições de lacuna e cria o alinhamento com o maior número de bases e o menor número de lacunas correspondente. Ele permite a prestação de uma penalidade de criação de lacuna e uma penalidade de extensão de lacuna em unidades de bases alinhadas. O GAP deve fazer um lucro do número de penalidade de criação de lacuna por alinhamento para cada lacuna que insere. Se uma penalidade de extensão de lacuna maior que zero é escolhida, o GAP deve, além disso, fazer um lucro para cada lacuna inserida do tamanho do tempo da lacuna e da penalidade de extensão de lacuna. Valores de criação de penalidade de lacuna padronizados e valores de penalidade de extensão de lacuna na versão 10 do pacote GCG Wisconsin Genetics Software Package para seqüências protéicas são de 8 e 2, respectivamente. Para seqüências de nucleotídeos o padrão de penalidade de criação de lacuna é de 50, enquanto o padrão de penalidade de extensão de lacuna é 3. A criação de lacuna e penalidade de extensão de lacuna pode ser expressa como um número inteiro selecionado do grupo composto de números inteiros de 0 a 200. Assim, por exemplo, a criação de lacuna e penalidade de extensão de lacuna pode ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou superior.

O GAP apresenta um membro da família dos melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros desta família, mas nenhum outro membro tem uma qualidade melhor. O GAP mostra quatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade, Relação, Identidade e semelhança. A qualidade é a métrica maximizada com a finalidade de alinhar as seqüências. A razão é a qualidade, dividido pelo número de bases no segmento mais curto. A porcentagem de identidade é a porcentagem dos símbolos que realmente correspondem. A similaridade percentual é a porcentagem dos símbolos que são semelhantes. Os símbolos que estão sobre as lacunas são ignorados. A semelhança é marcada quando o valor Matriz de pontuação para um par de símbolos é maior ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação utilizada na versão 10 do pacote GCG IVisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. E.U.A. 89 :10915).

(c) Como usado aqui, "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de ácido nucléico ou de polipeptídeos faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. Quando o percentual de identidade de seqüência é usado em referência às proteínas, é reconhecido que as posições de resíduos que não são idênticas, muitas vezes diferem por substituições de aminoácidos conservados, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservadas, o percentual de identidade de seqüência pode ser ajustado para corrigir para a natureza conservadora da substituição. Seqüências que diferem por tais substituições conservadas são ditas como tendo "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Os meios para se fazer este ajuste são bem conhecidos por aqueles com habilidade na arte. Normalmente, isso envolve pontuar-se uma substituição conservada como uma discordância parcial, ao invés de um pareamento completamente errôneo, aumentando-se assim o percentual de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, onde a pontuação de 1 é dada a um aminoácido idêntico e, a uma substituição não-conservada é atribuída a pontuação de zero, a uma substituição conservador é atribuída uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservadas é calculada, por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).

(d) Como usado aqui, "percentual de identidade de seqüência", significa o valor determinado através da comparação de duas seqüências perfeitamente alinhadas sobre uma janela de comparação, em que a parte da seqüência de nucleotídeos na janela de comparação pode incluir acréscimos ou supressões (ou seja, as lacunas) conforme comparada com a seqüência de referência (que não inclui os acréscimos ou supressões) para o melhor alinhamento das duas seqüências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais uma base de ácido nucléico ou resíduo de aminoácidos idêntico ocorre em ambas às seqüências para gerar o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para render o percentual de identidade de seqüência.

(e) (i) O termo "identidade substancial" de seqüências de nucleotídeos significa um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que tenha pelo menos 70%. 80%, 90%, ou 95% ou mais de identidade de seqüência quando comparado a uma seqüência de referência usando-se um dos programas de alinhamento descritos e usando-se parâmetros padronizados. Aqueles com habilidade na arte vão reconhecer que estes valores podem ser devidamente ajustados para determinação da identidade correspondente das proteínas codificadas por duas seqüências de nucleotídeos, tendo em conta a degenerescência do códon, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento de quadro de leitura, e afins. A identidade substancial das seqüências de aminoácidos para esses fins geralmente significa identidade de seqüência de pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% ou mais de identidade de seqüência.

Outro indício de que as seqüências de nucleotídeos são substancialmente idênticas é se as duas moléculas hibridizam uma com a outra em condições de alta estringência. Geralmente, condições de estringência são selecionadas para serem em torno de 5 0C mais baixas do que a Tm para a seqüência específica sob uma força iônica e pH definidos. No entanto, as condições de estringência abrangem as temperaturas na faixa de cerca de 1°C a cerca de 2O0C mais baixas do que a Tm, dependendo do grau de estringência desejado, conforme de outra forma aqui qualificado. Os ácidos nucléicos que não hibridizam uns com os outros em condições de alta estringência são ainda substancialmente idênticos, se os polipeptídeos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isto pode ocorrer, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando-se a máxima degeneração do códon permitida pelo código genético. Uma indicação de que duas seqüências de ácidos nucléicos são substancialmente idênticas, é quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucléico tem reação imunológica cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico.

(e) (ii) O termo "identidade substancial" no contexto de um peptídeo indica que um peptideo compreende uma seqüência de pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais de identidade de seqüência para uma seqüência referência e sobre uma janela de comparação especificada. O alinhamento ideal para estes efeitos pode ser realizado utilizando-se o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) supra. Uma indicação de que duas seqüências de peptideos são substancialmente idênticas é quando um peptideo é imunologicamente reativo aos anticorpos gerados contra um segundo peptideo. Assim, um peptideo é substancialmente idêntico a um segundo peptídeo, por exemplo, quando os dois peptideos diferem apenas por uma substituição conservada. Peptideos que são "substancialmente similares" compartilham seqüências, como observado acima, exceto pelo fato de que, as posições de resíduos que não são idênticas podem diferir por mudanças de aminoácidos conservados.

Aqui o uso do termo "construto de nucleotídeo" não se destina a limitar os melhoramentos para construtos de nucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles com competências normais na arte reconhecerão que construtos de nucleotídeo, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, também podem ser empregados nos métodos aqui divulgados. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucléicos, e as seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos abrangem adicionalmente todas as formas complementares de tais construtos, moléculas, e seqüências. Além disso, os construtos de nucleotídeo, moléculas de nucleotídeo e seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos abrangem todos os construtos, moléculas, e seqüências de nucleotídeos que podem ser utilizados nos métodos dos melhoramentos para transformar plantas, incluindo, mas não se limitando a, aqueles compostos de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combinações destes. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem naturalmente as moléculas e seus análogos sintéticos.

Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucléicos, e as seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos também englobam todas as formas de construções de nucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, formas de fita simples, formas dupla fita, grampos (hairpins), estruturas de tronco e laço (steam- and-loop), e assim por diante.

Outro melhoramento diz respeito a um organismo transformado, tal qual um organismo selecionado do grupo consistindo de células vegetais e insetos, bactérias, leveduras, baculovírus, protozoários, nematóides, e algas. 0 organismo transformado compreende: uma molécula de DNA dos melhoramentos, um cassete de expressão compreendendo a dita molécula de DNA, ou um vetor compreendendo o dito cassete de expressão, que pode ser incorporado de forma estável no genoma do organismo transformado.

As seqüências dos melhoramentos são providas em construtos de DNA para a expressão no organismo de interesse. O construto irá incluir seqüências regulatórias a 5' e a 3' operacionalmente ligadas a uma seqüência dos melhoramentos. O termo "operacionalmente ligado", como utilizado aqui se refere a uma articulação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência, onde a seqüência promotora inicia e medeia a transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as seqüências de ácidos nucléicos sendo ligadas são contíguas e, se for necessário juntar duas regiões codificantes de proteínas, contínuas e no mesmo quadro de leitura. A construção pode conter ainda, pelo menos, um gene adicional a ser co-transformado no organismo. Alternativamente, o gene (s) adicional pode ser fornecido em várias construções de DNA.

Um destes construtos de DNA é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para a inserção da seqüência de toxina Cry sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O construto de DNA pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis. O construto de DNA vai incluir na direção 5 'para 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução (ou seja, um promotor), uma seqüência de DNA dos melhoramentos, e uma região de terminação da transcrição e tradução (isto é, região de terminação,) funcional no organismo que serve de hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (ou seja, o promotor) pode ser nativo, análogo, estrangeiro ou heterólogo ao organismo hospedeiro e/ou a seqüência dos melhoramentos. Além disso, o promotor pode ser uma seqüência natural ou, alternativamente, uma seqüência sintética. O termo "estrangeiro", conforme usado aqui indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo em que o promotor é introduzido. Quando o promotor está "estrangeiro" ou "heterólogo" para a seqüência dos melhoramentos, pretende- se que o promotor não é um promotor nativo ou natural para a seqüência operacionalmente ligada dos melhoramentos. Conforme utilizado aqui, um gene quimérico compreende uma seqüência de codificação operacionalmente ligada a uma região de inicio de transcrição que é heteróloga para a seqüência de codificação. Sempre que o promotor é uma seqüência nativa ou natural, a expressão da seqüência operacionalmente ligada é alterada a partir da expressão do tipo selvagem, o que resulta em uma alteração no fenótipo.

A região de terminação pode ser nativa com a região de inicio de transcrição, pode ser nativa com a seqüência de DNA operacionalmente ligada de interesse, pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, estrangeira ou heteróloga para o promotor, a seqüência de interesse, ou a planta hospedeira, ou qualquer combinação destas).

As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261- 1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Aeid Res. 15:9627-9639.

Se for o caso, um ácido nucléico pode ser otimizado para a expressão aumentada no organismo hospedeiro. Assim, quando o organismo hospedeiro é uma planta, os ácidos nucléicos sintéticos podem ser sintetizados utilizando-se códons preferenciais de plantas para uma expressão melhorada. Veja, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de utilização de códon preferencial de hospedeiro. Por exemplo, apesar de que as seqüências de ácido nucléico dos melhoramentos possam ser expressas tanto em espécies de plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, as seqüências podem ser modificadas para conter os códons preferências e conteúdo GC preferencial específicos de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, uma vez que, têm-se demonstrado que estas preferências diferem (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Assim, o códon preferencial de milho para um determinado aminoácido pode ser derivados de seqüências de genes conhecidas a partir de milho. A utilização de códon do milho de 28 genes de plantas de milho está listada na Tabela 4 de Murray et al. supra. Os métodos são disponíveis na arte de síntese de genes preferenciais de plantas. Veja, por exemplo, em U.S. Patent Nos. 5,380,831, e 5,436,391, e Murray et al. (1989) Nucleic Aeids Res. 17:477-49 8, aqui incorporadas pela referência.

Seqüências de modificação adicionais são conhecidas por aumentar a expressão do gene em um hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais de local de emendo (splieing) de exon-íntron, repetições tipo transposon, e outras seqüências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão do gene. O conteúdo GC da seqüência pode ser ajustado para níveis médio para um determinado hospedeiro celular, conforme calculado por referência aos genes conhecidos e expressos na célula hospedeira. O termo "célula hospedeira", conforme usado aqui se refere a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão destinado. Células do hospedeiro podem ser células procarióticas como E. eoli ou células eucarióticas como leveduras, insetos, anfíbios, ou células de mamíferos, ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira de monocotiledôneas é uma célula hospedeira de milho. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar estrutura secundária prevista de grampo no mRNA.

Os cassetes de expressão podem conter ainda seqüências 5' líder. Tais seqüências líder podem atuar para melhorar a tradução. Traduções de líderes são conhecidas na arte e incluem: os líderes picornavírus, por exemplo, líder EMCV (região não codificante 5' de Encefalomiocardite) (Elroy- Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130) líderes potivirus, por exemplo, líder do TEV (vírus da cauterização do tabaco, Tobacco Etch Virus) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), líder MDMV (vírus-do-mosaico- anão-do-milho, Maize Dwarf Mosaic Virus), proteína de ligação da cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); líder não traduzido do mRNA da proteína capsidial do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA1 ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírus da mancha clorótica de milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Veja também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968. Na construção do cassete de expressão, vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer seqüências de DNA na orientação correta e, quando apropriado, no quadro de leitura adequado. Para este fim, adaptadores ou conectores podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA, ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, retirada de sítios de restrição, ou similares. Para esse propósito, podem estar envolvidos mutagêneses in vitro, reparo por iniciadores, restrição, anelamento e re- substituições, como por exemplo, transições e transversões.

Um número de promotores pode ser utilizado na prática dos melhoramentos. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucléicos podem ser combinados com promotores constitutivos, tecido- preferenciais, induzíveis, ou outros de expressão no organismo hospedeiro. Promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados no WO 99/43838 e U.S. Patent No. 6,072,050; o promotor CaMV 35S central (Odell et al. ( 1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (E.U. Patent No. 5.659.026), e assim por diante. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas patentes U.S. Patent Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121;

5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; e 6,177,611.

Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico se expressar o gene a partir de um promotor induzível. Os promotores induzíveis por ferida são de particular interesse para a regulação da expressão de seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos em plantas. Esses ferida-induzíveis podem responder a danos causados pela alimentação de inseto, e incluem o gene inibidor de protease de batata (PIN II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498); wunl e wun2, US Patent No. 5,428,148; winl e win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200-208); Sistema Único (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573); WIPl (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76); o gene MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2): 141-150); e afins, aqui incorporados pela referência.

Além disso, os promotores induzíveis por patógeno podem ser empregados nos métodos e construtos de nucleotídeos dos melhoramentos. Tais promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles provenientes de proteínas relacionadas à patogênese (PR) , que são induzidas após uma infecção por um patógeno, por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3- glucanase, quitinase, etc. Veja, por exemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116.Veja também WO 99/43819, aqui incorporados por referência.

Os promotores de interesse são aqueles que são expressos localmente ou perto do local de infecção do patógeno. Veja, por exemplo, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:33 5- 342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; e Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:14972-14977. Veja também, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; U.S. Patent No. 5,750,386 (induzível por nematóide) e as referências aí citadas. De particular interesse é o promotor induzível para os genes PRms de milho, cuja expressão é induzida pelo fungo Fusarium moniliforme (ver, por exemplo, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

A regulação química dos promotores pode ser usada para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um. regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor produto químico- induzível, quando a aplicação do produto químico induz a expressão do gene, ou um promotor produto químico- repressível, onde a aplicação do produto químico reprime a expressão do gene. Promotores quimicamente induzíveis são conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, promotor In2-2 de milho, que é ativado por fitotoxicidade de herbicidas benzenossulfonamida, o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e promotor PR-Ia do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados por produtos químicos de interesse incluem promotores esteróide-responsivos (ver, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticóide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2): 247-257) e induzíveis por tetraciclina e promotores reprimidos por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e U.S. Patent Nos. 5,814,618 e 5,789,156), aqui incorporados pela referência.

Promotores tecido-preferenciais podem ser utilizados para direcionar melhor a expressão da proteína pesticida dentro de um tecido vegetal particular. Os promotores tecido- pref erenciais incluem aqueles discutidos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et ai. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2) :525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181- 196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23 (6) :1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90(20) :9586- 9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

Promotores preferenciais para folha são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2) :2 5 5-2 6 5; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6): 1129-113 8; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90 (20): 9586-9590.

Promotores preferenciais para raiz ou específicos para raiz são conhecidos e podem ser selecionados entre os muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo a partir de várias espécies compatíveis. Veja, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene glutamina sintetase de raiz de soja específico); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10): 1051-1061 (elemento de controle raiz específico no gene GRP1.8 de feijão francês); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor raiz- específico de genes da manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) ; e Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clone de cDNA de tamanho integral codificando glutamina sintetase citosólica, que se expressa nas raízes e nódulos de raiz de soja). Veja também Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2 (7) : 633-641, onde são descritos dois promotores específicos de raiz isolados de genes da hemoglobina a partir da Parasponia andersonii não leguminosa e fixadora de nitrogênio e de Trema tomentosa não-fixadoras de nitrogênio e não leguminosas relacionada. Os promotores destes genes foram ligados a um gene β-glucuronidase repórter e introduzidos tanto a Nicotiana tabacum não leguminosas quanto em Lotus corniculatus leguminosa e, e em ambos os casos, a atividade do promotor raiz-específico foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem a análise dos promotores dos genes raiz- induzíveis altamente expressos rolC e rolD de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Eles concluíram que determinantes de DNA potenciadores e tecido- preferenciais são dissociados nos promotores. Teeri et al. (1989) utilizaram fusão gênica ao IacZ para mostrar que o gene que codifica a enzima octopina de T-DNA de Agrobacterium é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2 é raiz-específico na planta intacta e estimulado por ferimento em tecido foliar, uma combinação especial de características desejáveis para uso com um gene inseticida ou larvicida (ver EMBO J. 8 (2): 343-350) . O gene TRl1 fundido a nptll (neomicina fosfotransferase II) apresentaram características semelhantes. Promotores preferenciais de raiz adicionais incluem o promotor do gene VfEN0D-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29 (4) :759-772); e o promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol . 25 (4) :681-691. Veja também as patentes U.S. Patent Nos. 5,837,87 6; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; e 5,023,179.

Promotores "raiz-preferenciais" incluem tanto as promotores "específicos" de sementes (os promotores ativos durante o desenvolvimento da semente, tais como promotores de proteínas de armazenamento de sementes), bem como promotores "de germinação de semente" (os promotores ativos durante a germinação das sementes). Veja Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, aqui incorporados por referência. Tais promotores preferenciais de sementes incluem, mas não estão limitados a, Ciml (mensagem citocinina-induzida); CZ19B1 (milho 19 kDa Zein) e milps (mio-inositol-l-fosfato sintase) (ver U.S. Patent No. 6,225,529, aqui incorporadas pela referênc ia). Gama—Zein e Glob-I sao promotores específicos de endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos de sementes incluem, mas não estão limitados a, β-faseolina de feijão, napin, β-conglicinina, lecitina de soja, cruciferina, e similares. Para monocotiledôneas, os promotores específicos de sementes incluem, mas não estão limitados a, milho 15 kDa zein, 22 kDa zein, 27 kDa zein, g-Zein, cerosa, encolhido 1, encolhido 2, globulina 1, etc. Veja também WO 00/12733, em que os promotores preferenciais de sementes dos genes endl e end2 são divulgados; aqui incorporados por referência. 0 promotor que tem expressão "preferecial" em um determinado tecido é expresso neste tecido em um grau maior do que, pelo menos, em um outro tecido da planta. Alguns promotores tecido-preferenciais mostram expressão quase exclusiva no tecido específico.

Onde deseja-se uma expressão de baixo nível, serão utilizados promotores fracos. Geralmente, o termo "promotor fraco" utilizado aqui se refere a um promotor que conduz a expressão de uma seqüência de codificação em um nível baixo. Para expressão de nível baixo entende-se níveis de cerca de 1/1000 transcritos para cerca de 1/100, 000 transcritos, para cerca de 1/500, 000 transcritos. Como alternativa, é reconhecido que o termo "promotores fracos" abrange também os promotores que dirigem a expressão a apenas algumas células e não a outras, de forma a gerar um baixo nível total de expressão. Sempre que um promotor dirige a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da seqüência do promotor podem ser excluídas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão. Esses promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 (WO 99/43 83 8 e U.S. Patent No. 6,072,050), o promotor 35S CaMV central, e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles divulgados nas patentes U.S. Patent Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; e 6,177,611; aqui incorporadas por referência.

Geralmente, o cassete de expressão compreende um gene marcador de seleção para a seleção de células transformadas. Genes marcadores de seleção são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam a resistência a antibióticos, como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como os genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, como o glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D). Outros exemplos de genes marcadores de seleção adequados incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam a resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:981- 992), metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; e Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807- 820), estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423), glifosato (Shaw et al. (1986)Science 233:478-481; e U.S. Application Serial Nos. 10/004,357, e 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock et al.

(1987) EMBO J. 5:2513-2518). Ver em geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419- 2422; Barkley et al. (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) tese de doutorado, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand- Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094- 1104; Bonin (1993) tese de doutorado, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); e Gill et al. (1988) Nature 334: 721-724. Tais divulgações são aqui incorporadas por referência.

A lista acima de genes marcadores de seleção não pretende ser uma limitação. Qualquer gene marcador de seleção pode ser usado nos melhoramentos.

Os métodos dos melhoramentos implicam a introdução de um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introdução" significa apresentar o polinucleotídeo ou polipeptídeo para a planta de tal forma que a seqüência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos dos melhoramentos não dependem de um método específico para a introdução de um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que os polinucleotídeos ou polipeptídeos ganhem acesso ao interior, de pelo menos, uma célula da planta. Métodos de introdução de nucleotídeos ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na arte, incluindo, mas não se limitando a, os métodos de transformação estável, métodos de transformação transitória e métodos mediados por vírus.

"Transformação estável" deve significar que o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pelos descendentes da mesma. Por "transformação transitória" entende-se que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma desta planta, ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta.

Protocolos de transformação, bem como os protocolos para a introdução de seqüências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, ou seja, monocotiledônea ou dicotiledônea, alvejada para a transformação. Métodos adequados de introdução de seqüências de nucleotídeos em células vegetais e posterior inserção no genoma da planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium ((U.S. Patent Nos. 5,563,055 e 5,981,840), a transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), e aceleração, ou bombardeamento de partículas balísticas (ver , por exemplo, , U.S. Patent Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; e 5,932,782; Tomes et al. (1995) em Plant Cell, Tissue, e Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); e transformação de Lecl (WO 00/28058). Para transformação de batata ver Tu et al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 e Chong et al. (2000) Transgenic Research 9: 71-78. Processos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebola); Christou et ai. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja); McCabe et ai. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); U.S. Patent Nos. 5,240,855; 5,322,783 e 5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; U.S. Patent No. 5,736,369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proe. Natl. Acad. Sei. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por whisker); D1Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (eletroporação) ; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); os quais são aqui incorporados por referência.

Em melhoramentos específicos, as seqüências dos melhoramentos podem ser fornecidas a uma instalação usando-se uma variedade de métodos de transformação transitória. Tais métodos de transformação transitória incluem, mas não estão limitados a, a introdução da proteína da toxina Cry ou variantes e fragmentos destas diretamente na planta, ou a introdução do transcrito da toxina Cry na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, a microinjeção ou bombardeamento de partículas. Veja, por exemplo, Crossway et al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura et al. (1986) Plant Sei. 44: 53-58; Hepler et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 2176-2180 e Hush et al. (1994) The Journal of Cell Science 107: 77 5-7 84, os quais são aqui incorporados por referência. Alternativamente, o polinucleotídeo da toxina Cry pode ser transformado transitoriamente em planta utilizando- se técnicas conhecidas na arte. Essas técnicas incluem sistemas de vetores virais e a precipitação dos polinucleótidos de um modo que impede a posterior liberação do DNA. Assim, a transcrição do DNA ligado a partícula pode ocorrer, mas a freqüência com a qual ele é liberado para integrar-se no genoma é extremamente reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilenoimina (PEI; Sigma # P3143).

Os métodos são conhecidos na arte para a inserção de um polinucleotídeo alvejado em um local específico do genoma da planta. Em um melhoramento, a inserção do polinucleotídeo em um local desejado do genômica é conseguida usando-se um sistema de recombinação sítio-específica. Veja, por exemplo, W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, e W099/25853, todos os quais são aqui incorporados por referência. Resumidamente, o polinucleotídeo dos melhoramentos pode ser colocado em um cassete de transferência ladeado por dois sítios de recombinação não-idênticos. 0 cassete de transferência é introduzido em uma planta que tenha estavelmente incorporado em seu genoma um sítio alvo circundado que é ladeado por dois sítios de recombinação não- idênticos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase adequada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no sítio alvo. 0 polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.

As células que foram transformadas podem ser crescidas em plantas de acordo com as formas convencionais. Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Estas plantas podem então ser crescidas, e até polinizadas com a mesma linhagem ou com diferentes linhagens transformadas, e o híbrido resultante, tendo a expressão constitutiva ou induzida da característica fenotípica desejada, identificado. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para se garantir que a expressão da característica fenotípica desejada é mantida de forma estável e herdada e, em seguida, as sementes podem ser colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. As seqüências de nucleotídeos dos melhoramentos podem ser fornecidas para a planta através da colocação da planta em contato com um vírus ou com os ácidos nucléicos virais.

Geralmente, esses métodos envolvem a incorporação de nucleotídeos de interesse na construção de um DNA viral ou molécula de RNA. É reconhecido que as proteínas recombinantes dos melhoramentos podem inicialmente ser sintetizadas como parte de uma poliproteína viral, que posteriormente pode ser processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína pesticida desejada. Também é reconhecido que tal poliproteína viral, incluindo pelo menos uma parte da seqüência de aminoácidos de uma proteína pesticida dos melhoramentos, pode ter a atividade pesticida desejada. Tais poliproteínas virais e as seqüências de nucleotídeos que codificam para estas não são abrangidas pelos melhoramentos. Métodos de fornecimento de plantas com construtos de nucleotídeos e produzindo as proteínas codificadas nas plantas, que envolvem o DNA viral ou de moléculas de RNA são conhecidas na arte. Veja, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; e 5,316,931; aqui incorporados por referência.

Os melhoramentos posteriormente relacionados com os materiais de propagação de plantas de uma planta transformada dos melhoramentos incluem, mas não estão limitados a, sementes, tubérculos, rizomas, bulbos, folhas e cortes de raízes e brotos.

Os melhoramentos podem ser utilizados para a transformação de qualquer espécie vegetal, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a, Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milho (por exemplo, milheto (Pennisetum glaucum), painço (Panicum miliaceum), painço-da-Itália (Setaria italica), Panicum-de- dedo ou capim-pé-de-galinha (Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Tritieum aestivum), soja (Glyeine max), tabaco {Nicotiana tabaeum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Araehis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot eseulenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nueifera), abacaxi (Ananas eomosus), citros (Citrus spp.), cacau (Theobroma eaeao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus easica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus) , beterraba (Beta vulgaris) , cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, legumes, plantas ornamentais, e coníferas.

Legumes incluem tomate (Lycopersicon esculentum) , alface (por exemplo, Laetuea sativa), feijão (Phaseolus vulgaris) , feijão-de-lima {Phaseolus limensis), ervilha (Lathyrus spp.), E os membros do gênero Cueumis, tais como pepino (C. sativus ), melão (C. eantalupensis), almíscar-melão (C. melo). Plantas ornamentais incluem Azaléia (Rhododendron spp.), Hortênsia (Maerophylla hydrangea), hibisco (Hibiseus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), Tulips (Tulipa spp.), Narcisos (Narciso spp.), Petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus earyophyllus), poinsétia (Euphorbia puleherrima) , e crisântemo. Coniferas que podem ser empregadas na prática dos melhoramentos incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro- amarelo (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotti) , pinheiro-ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de Lodgepole (Pinus eontorta), pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata) ; pinheiro Douglas fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta- ocidental (Tsuga eanadensis); cedro Sitka (Pieea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens); pinheiros verdadeiros, como o Abeto-prateado (Abies amabilis) e abeto-balsâmico (Abies balsamea); e cedros como o cedro-vermelho-ocidental (Thuja plicata) e cedro-amarelo-do-Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). As plantas dos melhoramentos incluem plantas de cultivo (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milho, tabaco, etc), tais como plantas de milho e soja.

Gramineas incluem, mas não estão limitados a: capim-do- campo-anual (Poa annua); azevém (Lolium multiflorum); capim- do-campo-do-Canadá (Poa compressa); festuca-vermelha (Festuca rubra); agrostis (Agrostis tenuis); grama-rasteira (Agrostis palustris); grama-de-trigo-cristada (Agropyron desertorum) ; grama-de-trigo fairway (Agropyron cristatum) ; festuca-dura (Festuca longifolia); agrostis-de-Kentucky (Poa pratensis); dátilo-dos-pomares (Dactylis glomerata); azevém-perene (Lolium perenne), Festuca (Festuca rubra); gramado-vermelho (Agrostis alba); agrostis-bruto (Poa trivialis) ; festuca-de- ovelha (Festuca ovina); agrostis-liso (Bromus inermis); sargasso-bravo (Festuca arundinacea), erva-dos-prados (Phleum pratense); agrostis-veludo (Agrostis canina); alkaligrass chorando (Puccinellia distans); grama-de-trigo-ocidental (Agropyron smithii); grama-Bermuda (Cynodon spp.); grama-St. Augustine (Stenotaphrum secundatum); grama-esmeralda (Zoysia spp.); capim-Bahia (Paspalum notatum), grama-tapete (Axonopus affinis); grama-centopéia (Eremochloa ophiuroides); capim- quicuio (Pennisetum clandesinum); paspalum-de-praia (Paspalum vaginatum); grama-azul (Bouteloua gracilis) ; capim-búfalo (Buchloe dactyloids); grama sideoats (Bouteloua curtipendula). Plantas de interesse incluem plantas que fornecem as sementes de grãos de interesse, oleaginosas e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grãos, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milho, etc. Oleaginosas incluem algodão, soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, linho, mamona, plantas de oliva etc. Vagem incluem feijões e ervilhas. Feijão inclui feijão, alfarroba guar, feno, soja, feijão jardim, caupi, feijão mungbean, fava, feijão fava, lentilha, grão de bico, etc.

Em determinados melhoramentos as seqüências de ácido nucléico dos melhoramentos podem ser empilhadas com qualquer combinação de seqüências de polinucleótidos de interesse, a fim de se criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucléotídeos dos melhoramentos podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos codificando polipeptídeos com atividade pesticidas e/ou inseticida, tais como outras proteínas Bt tóxicas (descritas nas patentes U.S. Patent Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; e em Geiser et al. (1986) Gene 48:109), Pentin (descrito no U.S. Patent No. 5,981,722) e similares. As combinações geradas também podem incluir várias cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos dos melhoramentos também podem ser empilhados com qualquer outro gene ou uma combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de características desejadas, incluindo, mas não se limitando a características desejáveis para a alimentação animal, tais como genes de oleosidade elevadas (por exemplo, U.S. Patent No. 6,232,529); aminoácidos equilibrados (por exemplo, hordotioninas (U.S. Patent Nos. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; e 5,703,049); cevada com lisina alta (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; e WO 98/20122) e proteínas com metionina elevada (Pedersen et al. (19 86) J. Biol. Chem. 2 61: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 3 59; e Musumura et al. (19 89) Plant Mol. Biol. 12: 123)); digestibilidade aumentada (por exemplo, as proteínas de armazenamento modificadas (U.S. Application Serial No. 10/053,410, preenchida em 7 de Novembro, 2001) e tiorredoxinas (U.S. Application Serial No. 10/005,429, preenchida em 3 de dezembro, 2001)), as divulgações dos quais são aqui incorporadas pela referência.

Os polinucleotídeos dos melhoramentos também podem ser empilhados com características desejáveis para a doença ou resistência a herbicidas (por exemplo, os genes de destoxificação de fumonisinas (U.S. Patent No. 5,792,931); genes de avirulência e de resistência à doença (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; e Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); acetolactato sintase (ALS) mutantes que levam à resistência a herbicidas, como o S4 e/ou mutações HRA; inibidores de glutamina sintetase como fosfinotricina ou basta (por exemplo, genes bar) e resistência ao glifosato (gene EPSPS e gene GAT conforme divulgado em U.S. Application Serial Nos. 10/004,357; e 10/427,692); e características desejáveis para processamento e transformação de produtos, tais como óleo elevado, (por exemplo, U.S. Patent No. 6,232,529), óleos modificados (por exemplo, genes de ácidos graxos desaturase (U.S. Patent No. 5,952,544; WO 94/11516); amidos modificados (por exemplo, pirofosforilases ADPG (AGPase), amido sintases (SS) , enzimas de ramificação do amido (SBE) e enzimas amido desramificadoras (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, U.S. patent No. 5.602,321; beta-sintase, cetotiolase polihidroxibutirato e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitação da expressão de polihidroxialcanoatos (PHAs)), as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência. Pode-se também combinar os polinucleotídeos dos melhoramentos com polinucleotídeos que fornecem características agronômicas, tais como a esterilidade masculina (por exemplo, ver U.S. Patent No. 5.583,210), força de talo, tempo de floração, ou características da tecnologia de transformação, como a regulação do ciclo celular ou alvejamento de gene (por exemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), as divulgações de que são aqui incorporadas por referência.

Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método, incluindo, mas não se limitando a cruzar plantas reprodutoras por qualquer metodologia convencional ou Top Cross®, ou por transformação genética. Se as características são empilhadas através de transformação genética das plantas, as seqüências de nucleotídeos de interesse podem ser combinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica que compreende uma ou mais características desejadas pode ser usada como o destino para introdução de novas características através de posterior transformação. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de co- transformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação dos cassetes de transformação. Por exemplo, se duas seqüências serão introduzidas, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de transformação (eis). A expressão das seqüências pode ser conduzida pelo promotor ou mesmo por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável se introduzir um cassete de transformação que irá suprimir a expressão da polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes ou supressão ou cassetes de super-expressão para gerar a combinação desejada de características na planta. Reconhece-se também que as seqüências de polinucleotídeos podem ser empilhadas em um sítio genômico desejado utilizando-se um sistema de recombinação sítio-específica. Veja, por exemplo, W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, e W099/25853, todos os que estão aqui incorporados por referência. As composições dos melhoramentos encontram uso na proteção de plantas, sementes e produtos vegetais em uma variedade de maneiras. Por exemplo, as composições podem ser usadas em um método que envolve a colocação de uma quantidade eficaz da composição pesticida no ambiente da praga através de um procedimento selecionado do grupo consistindo de pulverização, varredura, radiodifusão, ou revestimento de sementes.

Antes do material de propagação vegetal (frutas, tubérculos, bulbos, rizomas, grãos, sementes), mas, sobretudo sementes, ser vendido como um produto comercial, este é habitualmente tratado com um revestimento protetor incluindo herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, ou misturas de várias dessas preparações, se desejado, juntamente com outros carreadores, surfactantes, ou adjuvantes promotores de aplicação, habitualmente utilizados na arte da composição para proporcionar proteção contra danos causados por bactérias, fungos ou pestes de animais. A fim de se tratar as sementes, o revestimento protetor pode ser aplicado às sementes seja por impregnação dos tubérculos ou grãos com uma formulação liquida ou revestindo-os com uma formulação combinada molhada ou seca. Além disso, em casos especiais, outros métodos de aplicação para as plantas são possíveis, por exemplo, tratamento dirigido a botões ou aos frutos. As sementes de plantas dos melhoramentos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida dos melhoramentos podem ser tratadas com um revestimento protetor de semente compreendendo um composto de tratamento de sementes, como, por exemplo, captan, carboxina, Tiram, metalaxil, pirimifós-metílico, e outros que são comumente usados no tratamento de sementes. Em um melhoramento, um revestimento protetor de sementes compreendendo uma composição pesticida dos melhoramentos é usado sozinho ou em combinação com um dos revestimentos protetores de semente habitualmente utilizados no tratamento de sementes.

É reconhecido que os genes que codificam proteínas pesticidas podem ser usados para transformar os organismos de inseto patogênicos. Tais organismos incluem baculoviroses, fungos, protozoários, bactérias e nematóides.

Um gene que codifica uma proteína pesticida dos melhoramentos pode ser introduzido através de um vetor adequado em um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro aplicado ao meio ambiente, ou a plantas ou animais. 0 termo "introduzido" no contexto de inserção de um ácido nucléico em uma célula significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui referência à incorporação de um ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica, onde o ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossomos, plasmídeos, plastídeo, ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo ou expressa transitoriamente (por exemplo, mRNA transfectado).

Hospedeiros microorganismos que são conhecidos para ocupação da "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera, e/ou rizoplano) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados. Esses microorganismos são escolhidos de forma que sejam capazes de competir com sucesso com os microorganismos tipo-selvagem no ambiente específico, fornecendo a manutenção estável e a expressão do gene expressando a proteína pesticida e, desejavelmente, fornecendo uma proteção melhorada deste pesticida a partir da degradação e inativação ambiental.

Tais microorganismos incluem bactérias, algas e fungos. De particular interesse são os microorganismos como bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella Xanthomonas,Streptomyces,Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobaeter, Azotobaeter, Leueonostoe, e Alealigenes, fungos, especialmente leveduras, por exemplo, Saceharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium. De particular interesse são as espécies de bactérias da fitosfera, tais como a Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluoreseens, Serratia mareeseens, Aeetobaeter xylinum, Agrobaeterium, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas eampestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli e Azotobacter vinlandir e espécies de leveduras dacfitosfera como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. Marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. Iaurentii, Saccharomyees rosei, S. pretoriensis, S. eerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans. De particular interesse são os microorganismos pigmentados.

Várias formas para se introduzir um gene que expressa uma proteína pesticida nos microorganismos hospedeiros em condições que permitam a manutenção estável e expressão do gene estão disponíveis. Por exemplo, cassetes de expressão podem ser construídos, de forma que incluam os construtos de nucleotídeo de interesse operacionalmente ligados com os sinais de regulação de transcrição e tradução para a expressão dos construtos de nucleotídeo, e uma seqüência de nucleotídeos homóloga a uma seqüência no organismo hospedeiro, aonde a integração irá ocorrer, e/ou um sistema de replicação que é funcional no hospedeiro onde a integração ou de manutenção estável irá ocorrer.

Sinais de regulação transcricional e traducional incluem, mas não estão limitados a, promotores, sítio inicial de iniciação de transcrição, operadores, ativadores, potencializadores, outros elementos de reguladores, sítios de ligação ribossomal, um códon de iniciação, sinais de terminação, e assim por diante. Veja, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,039,523 e 4,853,331; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), daqui em diante como "Sambrook II"; Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, New York; e as referências aí citadas.

Células hospedeiras adequadas, onde as células contendo proteína pesticida serão tratadas para prolongar a atividade das proteínas pesticidas na célula quando a célula tratada é aplicada ao ambiente da praga alvo (s), podem incluir tanto procariontes quanto eucariontes, normalmente sendo limitado às células que não produzem substâncias tóxicas para os organismos superiores, como os mamíferos. No entanto, os organismos que produzem substâncias tóxicas para os organismos superiores poderiam ser usados, quando a toxina é instável ou o nível de aplicação é suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de uma toxicidade para mamíferos. Procariotos e eucariotos inferiores, como os fungos são hospedeiros de particular interesse. Procariontes ilustrativos, tanto Gram-negativos quanto gram-positivos, incluem Enterobacteriaceae, como Eseheriehia eoli, Erwinia, Shigella, Salmonella, Proteus e; Baeillaeeae; Rhizobiaceae, como Rhizobium; Spirillaeeae, como Photobaeterium, Zymomonasr Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tais como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraeeae e Nitrobaeteraeeae. Entre os eucariontes estão os fungos, como Phyeomyeetes e Ascomyeetes, que incluem leveduras, como Saccharomyees eerevisiae e Schizosaccharomyces e levedura Basidiomyeetes como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, e similares.

As características de interesse em especial na seleção de uma célula hospedeira para fins de produção de proteína pesticida incluem a facilidade de introdução do gene da proteína pesticida dentro do hospedeiro, a disponibilidade de sistemas de expressão, a eficiência de expressão, a estabilidade das proteínas no hospedeiro, e a presença de capacidades genéticas auxiliares. As características de interesse para uso como uma micro-cápsula pesticida incluem qualidades protetoras para o pesticida, tais como paredes celulares espessas, pigmentação e embalagem intracelular ou formação de corpos de inclusão, afinidade em folha, ausência de toxicidade em mamíferos; atratividade para ingestão por parte das pragas; facilidade de matar e fixar sem danos à toxina, e similares. Outras considerações incluem facilidade de formulação e gestão, economia, estabilidade no armazenamento, e similares.

Organismos hospedeiros de particular interesse incluem leveduras, como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp. Saccharomyces spp. (tal como S. cerevisiae) , Sporobolomyces spp., organismos filoplanos como Pseudomonas spp. (tais como P. aeruginosa, P. fluoreseens), Erwinia spp. e Flavobacterium spp., e outros organismos, incluindo BT, E. eoli, Baeillus subtilis, e similares.

Genes que codificam as proteínas pesticidas dos melhoramentos podem ser introduzidos em microorganismos que se multiplicam em plantas (epífitas) para entrega das proteínas pesticidas às potenciais pragas alvo. Em epífitas, por exemplo, podem ser bactérias gram-positivas ou gram- negativas.

As bactérias colonizadoras de raiz, por exemplo, podem ser isolada a partir da planta de interesse por métodos conhecidos na arte. Especificamente, uma linhagem de Baeillus eereus que coloniza raízes pode ser isolada de raízes de uma planta (ver, por exemplo, Handelsman et ai. (1991) Appl.

Environ. Mierobiol. 56:713-718). Os genes que codificam as proteínas pesticidas dos melhoramentos podem ser introduzidos em um Baeillus eereus colonizador de raiz por métodos padronizados e conhecidos na arte.

Os genes que codificam proteínas pesticidas podem ser introduzidos, por exemplo, dentro do Baeillus colonizador de raiz por meio de eletrotransformação. Especificamente, os genes que codificam as proteínas pesticidas podem ser clonados em um vetor shuttle, por exemplo, pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218. O vetor shuttle pHT3101 contendo a seqüência de codificação para o gene da proteína pesticida em particular pode, por exemplo, ser transformado no Bacillus colonizador de raiz por meio de eletroporação (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218).

Sistemas de expressão podem ser concebidos de modo que as proteínas pesticidas são secretadas para fora do citoplasma de bactérias gram-negativas, como E. coli, por exemplo. As vantagens de ter proteínas pesticidas secretadas são: (1) prevenção de potenciais efeitos citotóxicos da proteína pesticida expressa e (2) melhoria da eficiência de purificação da proteína pesticida, incluindo mas não se limitando a, um aumento na eficiência na recuperação e purificação da proteína pelo volume de cultura de células e diminuição do tempo e/ou custos na recuperação e purificação por unidade da proteína.

As proteínas pesticidas podem ser feitas para serem secretadas em E. coli, por exemplo, através da fusão de um peptídeo sinal adequado de E. coli ao final amino-terminal da proteína pesticida. Peptídeos sinal reconhecidos por E. coli podem ser encontrado em proteínas já conhecidas por serem secretadas em E. coli, por exemplo, a proteína OmpA (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J, 3:2437-2442). OmpA é uma proteína majoritária na membrana externa de E. coli e, portanto, seu peptídeo sinal é tido como sendo eficiente no processo de translocação. Além disso, o peptídeo sinal de OmpA não precisa ser modificado antes do processamento como pode ser o caso de outros peptídeos sinal, por exemplo o peptídeo sinal de lipoproteína (Duffaud et al. (1987) Meth. Enzymol. 153: 492).

As proteínas pesticidas dos melhoramentos podem ser fermentadas em uma bactéria hospedeira e a bactéria resultante processada e usada como um spray microbiano da mesma forma que as linhagens de Bt foram usadas como sprays de inseticida. No caso de uma proteína pesticida (s) que é secretada por Bacillus, o sinal de secreção é removido ou transformado através de procedimentos conhecido na arte. Tais mutações e/ou supressões impedem a secreção da proteína pesticida (s) no meio de crescimento durante o processo de fermentação. As proteínas pesticidas são mantidas dentro da célula e as células são então processadas para produzir as proteínas pesticidas encapsuladas. Qualquer microorganismo adequado pode ser usado para esta finalidade. Pseudomonas tem sido usada para expressar toxinas Bt encapsuladas como as proteínas e as células resultantes processadas e pulverizadas como um inseticida (Gaertner et al. (1993), in: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim). Alternativamente, as proteínas pesticidas são produzidas pela introdução de um gene heterólogo em um hospedeiro celular. A expressão do gene heterólogo resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção dos pesticidas. Estas células são então tratadas em condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula guando a célula é aplicada ao ambiente das pragas-alvo (s). O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Estas proteínas pesticidas naturalmente encapsuladas podem então ser formuladas de acordo com as técnicas convencionais para aplicação em um ambiente de hospedagem das pragas alvo, por exemplo, solo, água e folhagem das plantas. Veja, por exemplo EPA 0192319, e as referências aí citadas.

Nos melhoramentos, um microorganismo transformado (que inclui o organismo inteiro, células, esporos (s), proteína pesticida (s), componente pesticida (s), componentes de impacto de pragas (s), mutante (s), células vivas ou mortas e componentes das células, incluindo misturas de células vivas e mortas e componentes celulares, incluindo células quebradas e componentes celulares) ou uma proteína pesticida isolada podem ser formulados com um carreador aceitável em uma composição pesticida (s) que é, por exemplo, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó, grânulos dispersíveis ou um precipitado, um pó molhável, e um concentrado emulsionável, um aerossol ou spray, um grânulo impregnado, um adjuvante, uma pasta revestidora, um colóide, e também encapsulações sobre, por exemplo, substâncias poliméricas. Essas composições formuladas podem ser preparadas por meios convencionais, tais como desidratação, Iiofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, decantação, ou concentração de uma cultura de células que compõem o polipeptídeo.

Tais composições divulgadas acima podem ser obtidas pela adição de um agente superfície-ativo, um veículo inerte, um conservante, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificante, um corante, um protetor UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante, doadores de micronutrientes, ou outras preparações que influenciem o crescimento das plantas. Um ou mais agrotóxicos, incluindo, mas não se limitando a, herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaricidas, reguladores de crescimento vegetal, aditivos de cultivo, e fertilizantes, podem ser combinados com os carreadores, surfactantes ou adjuvantes habitualmente utilizados na arte de formulação ou outros componentes para facilitar o manuseio do produto e aplicação para pragas-alvo particulares. Carreadores e adjuvantes apropriados podem ser sólidos ou líquidos, e correspondem à substâncias normalmente empregadas na tecnologia da formulação, por exemplo, substâncias minerais, naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes de molhamento, melhoradores, ligantes, ou fertilizantes. Os ingredientes ativos dos melhoramentos são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área da cultura, nas plantas ou sementes a serem tratadas. Por exemplo, as composições dos melhoramentos podem ser aplicadas nos grãos em preparação ou durante o armazenamento em um escaninho ou silo de grãos, etc. As composições dos melhoramentos podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo dos melhoramentos ou uma composição agroquímica dos melhoramentos que contenha pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas linhagens de bactérias dos melhoramentos incluem, mas não estão limitadas a, aplicação foliar, revestimento de sementes e aplicação do solo. 0 número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade de infestação pela praga correspondente.

Agentes superfície-ativos adequados incluem, mas não estão limitados a, compostos aniônicos como um carboxilato de, por exemplo, um metal, um carboxilato de um ácido graxo de cadeia longa; um N-acilsarcosinato; mono ou di-ésteres de ácido fosfórico com alcoóis graxos etoxilados ou sais de tais ésteres; alcoóis graxos sulfatados, tais como dodecil sulfato de sódio, octadecil sulfato de sódio ou cetil sulfato de sódio, sulfatos álcool graxo etoxilado; sulfatos alquilfenóis etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; aril alquil sulfonatos, tais como os sulfonatos de alquil- benzeno ou sulfonatos alquilnaftaleno inferiores, por exemplo, butil naftaleno sulfonato; sais formaldeído- naftalenos sulfonados condensados; sais de fenol-formaldeído sulfonado condensados; sulfonatos mais complexos, tais como sulfonatos de amido, por exemplo, o produto da condensação sulfonada de ácido oléico e N-metil taurina, ou os dialquil sulfo-succinatos, por exemplo, o sulfonato de sódio ou dioctil succinato. Os agentes não-iônicos incluem produtos da condensação de ésteres de ácidos graxos, alcoóis graxos, amidas de ácidos graxos ou fenóis alquenila-alquil- ou alquenil-substituidos com óxido de etileno, ésteres graxos de éteres de alcoóis polihídricos, por exemplo, ésteres de ácido graxos de sorbitano, produtos de condensação de tais ésteres com óxido de etileno, por exemplo, ésteres de ácidos graxos sorbitar polioxietileno, os copolimeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos como 2,4,7,9-tetraetila-5-decin-4,7-diol, ou glicóis acetilênicos etoxilados. Exemplos de agentes superfície-ativos catiônicos incluem, por exemplo, um alifáticos mono-, di- ou poliamina como um acetato, naftaleno ou oleato, ou aminas contendo oxigênio como um óxido de amina de alquilamina polioxietileno; uma amina amida-ligada preparada pela condensação de um ácido carboxílico com um di-ou poliamina, ou um sal de amônio quaternário.

Exemplos de materiais inertes incluem mas não estão limitados aos minerais inorgânicos tais como caulim, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, ou materiais botânicos como a cortiça, espigas de milho em pó, casca de amendoim, casca de arroz e cascas de noz.

As composições dos melhoramentos podem estar em uma forma adequada para aplicação direta ou como um concentrado de composição primária que requer diluição com uma quantidade adequada de água ou outro diluente antes da aplicação. A concentração de pesticida, pode variar dependendo da natureza da formulação especial, especificamente, se ele é um concentrado ou para ser usado diretamente. A composição contém 1 a 98% de um veículo inerte sólido ou líquido, e de 0 a 50% ou 0,1 a 50% de um surfactante. Essas composições serão administradas à taxa rotulada para o produto comercial, por exemplo, cerca de 0,01 Ib-5.0 Ib por acre quando na forma seca e em cerca de 0,01 pts. - 10 pts. por acre quando na forma líquida.

Em um melhoramento adicional, as composições, bem como os microorganismos transformados e proteínas pesticidas dos melhoramentos, podem ser tratadas antes da formulação para prolongar a atividade pesticida, quando aplicada ao meio ambiente de uma praga alvo, desde que o pré-tratamento não seja prejudicial para a atividade dos pesticidas. Esse tratamento pode ser por processos químicos e/ou processos físicos, enquanto o tratamento não afeta de forma deletéria as propriedades da composição (s). Exemplos de reagentes químicos incluem, mas não estão limitados aos agentes de halogenização; aldeídos tais como formaldeído e glutaraldeído; anti-infecciosos, tais como o cloreto de Zefiran; alcoóis, como etanol e isopropanol e fixadores histológicos, como fixador de Bouin e fixador Helly (ver , por exemplo, Hiimason (19 67) Animal Tissue Technigues (WH Freeman and Co.).

Em outros melhoramentos, pode ser vantajoso se tratar os polipeptídeos de toxinas Cry com uma protease, por exemplo tripsina, para ativar a proteína previamente à aplicação de uma composição de proteína pesticida dos melhoramentos ao ambiente da praga alvo. Métodos para a ativação de inseticida por uma serina protease são bem conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 e Carroll e Ellar (1989) Biochem. J. 261:99-105, os ensinamentos dos quais são aqui incorporados por referência. Por exemplo, um protocolo de ativação adequada inclui, mas não está limitado a, combinar-se um polipeptídeo para ser ativado, por exemplo, um novo polipeptideo Cry purificado (por exemplo, com a seqüência de aminoácidos demonstrada na SEQ ID NO: 2), e tripsina a uma razão de peso de 1/100 de proteína/tripsina em 20 NaHCO3 nM, pH 8 e digerindo a amostra a 36°C por 3 horas.

As composições (incluindo os microorganismos transformados e proteínas pesticidas dos melhoramentos) podem ser aplicadas no ambiente de uma praga de insetos através de, por exemplo, pulverização, atomização, espalhamento, dispersão, revestindo ou derramando, dentro ou sobre o solo, introduzindo na água de irrigação, pelo tratamento de sementes ou por aplicação geral ou se espalhando o pó no momento em que a praga tenha começado a aparecer, ou antes do aparecimento de pragas, como medida de proteção. Por exemplo, a proteína pesticida e/ou microorganismos transformados dos melhoramentos podem ser misturados com grãos para proteger os grãos durante o armazenamento. Em geral, é importante se obter um bom controle de pragas nas fases iniciais de crescimento da planta, pois este é o momento em que a planta pode ser mais severamente danificada. As composições dos melhoramentos podem, convenientemente, conter outro inseticida, se isso for considerado necessário. Em um melhoramento, a composição é aplicada diretamente ao solo, em uma época de plantio, na forma granular de uma composição de células carreadoras e mortas de uma linhagem de Bacillus ou microorganismo transformado dos melhoramentos. Outro melhoramento é uma forma granular de uma composição compreendendo um agroquímico, como, por exemplo, um herbicida, um inseticida, um fertilizante, um veículo inerte, e as células mortas de uma linhagem de Bacillus ou microorganismo transformado das incorporações.

Aqueles hábeis na arte vão reconhecer que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Compostos de melhoramentos exibem atividades contra pragas de insetos, que podem incluir agronômicos economicamente importantes, florestas, estufa, viveiro, plantas ornamentais, alimentos e fibras, saúde pública e animal, a estrutura comercial e doméstica, membros de família, e pragas de produtos armazenados. Os insetos selecionados incluem insetos das ordens Coleóptera, Diptera, Himenóptera, Lepidóptera, Mallophaga, Homóptera, Hemíptera, Ortóptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., principalmente Coleóptera e Lepidóptera.

As larvas da ordem Lepidóptera incluem, mas não estão limitadas a, lagartas-cartucho, lagartas-roscas, mede-palmos e mariposas da família Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-cartucho-de-outono); S. exigua Hübner (lagarta-cartucho-da-beterraba); S. Iitura Fabricius (lagarta-do-tabaco, lagarta-de-grupo, cluster Caterpillar); Mamestra configurata Walker (lagarta-cartucho Bertha); M. brassicae Linnaeus (traça-do-repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-do- oeste); A. subterranea Fabricius (lagarta-granulada, granulated cutworm); Alabama argillacea Hübner (lagarta-de- folha-de-algodão); Trichoplusia ni Hübner (lagarta-mede- palmo-de-repolho), Pseudoplusia includens Walker (lagarta-da- soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (lagarta-de-mucuna); Hypena scabra Fabricius (lagarta-verde-do-trevo, green cloverworm), Heliothis virescens Fabricius (lagarta-da-maça, tobacco budworm); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta- cartucho); Athetis mindara Barnes e McDunnough (lagarta-de- pele-áspera, rough skinned cutworm); Euxoa messoria Harris (lagarta-de-lateral-escura, darksided cutworm); Earias insulana Boisduval (lagarta-espinhosa, spiny bollworm); E. vittella Fabricius (lagarta-manchada, spotted bollworm); Helicoverpa armigera Hübner (lagarta-americana); H. zea Boddie (lagarta-da-espiga-de-milho ou lagarta-do-algodão) ; Melanchra picta Harris (lagarta-zebra, zebra Caterpillar); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-de-citros) ; perfuradores, mariposas, mariposas-de-teia (webworms), vermes-coniferos (coneworms) e lepidópteros da família Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (broca-do-milho-europeu); Amyelois transitella Walker (lepdóptero-de-laranja, naval orangeworm), Anagasta kuehniella Zeller (mariposa-farinha-do- Mediterrâneo); Cadra cautella Walker (mariposa-da-amêndoa); Chilo suppressalis Walker (broca-do-colmo-do-arroz); C. partellus (broca-do-sorgo), Corcyra cephalonica Stainton (mariposa-de-arroz); Crambus caliginosellus Clemens (mariposa-da-teia-de-raíz-de-milho, com root webworm); C. teterrellus Zincken (mariposa-da-teia-de-agrostis, webworm bluegrass); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (enrolador-de- folha-de-arroz, riee leaf roller); Desmia funeralis Hübner (cigarrinha-dobrador-de-folha-de-uva, grape leaffolder); Diaphania hyalinata Linnaeus (mariposa-do-melão, melon worm); D. nitidalis Stoll (cucurbitáceas); Diatraea grandiosella Dyar (broca-do-milho-do-sudoeste, southwestern com borer), D. saccharalis Fabricius (broca-de-cana-de-açucar, surgarcane borer); Eoreuma loftini Dyar (broca-de-arroz-mexicano); Ephestia elutella Hübner (mariposa-do-tabaco (cacau)); Linnaeus mellonella Galleria (traça-da-cera) ; Herpetogramma licarsisalis Walker (mariposa-da-teia-do-relvado, sod webworm); Homoeosoma electellum Hulst (mariposa-do-girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (lagarta-de-elasmo, lesser cornstalk borer); Achroia grisella Fabricius (mariposa-da- cera, lesser wax moth); Loxostege sticticalis Linnaeus (mariposa-de-teia-da-beterraba, beet webworm); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa-de-teia-da-árvore-do-chá, tea tree web moth); Maruca testulalis Geyer (broca-da-vagem-do- feijão); Plodia interpunctella Hübner (mariposa-de-refeição indiana, Indian meai moth); Scirpophaga incertulas Walker (broca-da-haste amarela); Udea rubigalis Guenée (mariposa- laçadora-de-folha-de-aipo, celery Ieaftier) e lagartas- enroladeiras, lagartas-de-broto (budworms), lagartas-de- sementes, lagartas-de-frutas na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (tortricídeo-de-broto-da-cabeça-preta- ocidental); A. variana Fernald (tortricideo-de-broto-de- cabeça-preta-oriental); Archips argyrospila Walker (tortricídeo-enrolador-de-folhas de árvores frutíferas); A. Rosana Linnaeus (tortricídeo-enrolador-de-folha-europeu) e outras espécies de Arehips, Adoxophyes orana Fischer von Rõsslerstamm (mariposa-tortricídeo-de-fruta-de-verão); Coehylis hospes Walsingham (mariposa-listrada-do-girassol, banded sunflower moth); Cydia latiferreana Walsingham (mariposa-do-avelã, filbertworm); C. pomonella Linnaeus (mariposa-de-codificação, coding moth); Platynota flavedana Clemens (cigarrinha-enroladeira-variegada, variegated leafroller); P. stultana Walsingham (cigarrinha-enroladeira- onívora, omnivorous leafroller) ; Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (mariposa-de-vinhedo-européia, European grape vine moth); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (mariposa-do-olho-manchado, eyespotted moth); Endopiza viteana Clemens (mariposa-da-uva, grape berry moth); Eupoecilia ambiguella Hübner (mariposa-da-vinha, vine moth);

Bonagota salubricola Meyrick (lagarta-enroladeira-de-folha- de-maça-Brasileira); Grapholita molesta Busek (mariposa-da- fruta-oriental); Suleima helianthana Riley (mariposa-de- broto-de-girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp ..

Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidóptera incluem, mas não estão limitadas a, Alsophila pometaria Harris (lagarta-de-necrose-de-outono, fali cankerworm); Anarsia lineatella Zeller (broca-de-galho-de- pêssego); Anisota senatoria JE Smith (lagarta-de-carvalho- com-listras-laranja, orange striped oakworm); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (traça-da-seda-de-carvalho-chinês); Bombyx mori Linnaeus (traça-da-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (mariposa-perfuradora-de-folhas-de- algodão); Colias eurytheme Boisduval (lagarta-da-alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta-da-nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (mariposa-de-seda-da- Sibéria), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta-mede-palmo-de- ulmeiro, elm spanworm); Erannis tiliaria Harris (lagarta- mede-palmo-de-tília, linden looper); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (mariposa-de-extremidade-marron, browntail moth); Harrisina americana Guérin-Méneville (lepdóptero-de-folha-de- uva, grapeleaf skeletonizer); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta-intervalo); Hyphantria cunea Drury (mariposa-de- teia-de-outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (traça- do-tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (lagarta- mede-palmo-de-cicuta-oriental, Eastern hemlock looper); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta-mede-palmo-de-cicuta- ocidental IVestern hemlock looper) ; Leucoma salicis Linnaeus (mariposa-de-cetim) ; Lymantria dispar Linnaeus (mariposa- cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (traça-falcão-de- cinco-pontos, mandarová-de-tomate); M. sexta Haworth (mandarová-de-tomate, mandarová-de-tabaco) ; Operophtera brumata Linnaeus (mariposa-do-inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta-de-necrose-da-primavera, springer cankerworm) ; Papilio cresphontes Cramer (papilionideo-andorinha-gigante, giant swallowtail, orange dog); Phryganidia californica Packard (lagarta-de-carvalho-da-Califórnia), Phyllocnistis citrella Stainton (lepdóptero-minador-dos-citros); Fabricius blancardella Phyllonorycter (lepdóptero-minador-tentiforme- manchado, spotted tentiform leafminer); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta-branca-grande); P. rapae Linnaeus (borboleta-branca-pequena); P. napi Linnaeus (borboleta- branea-de-nervuras-verdes); Platyptilia carduidactyla Riley (mariposa-da-alcachofra, artichoke plume moth), Plutella xylostella Linnaeus (traça-das-crucíferas); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta-rosada); Pontia protodice Boisduval Sc Leconte (lagarta-do-repolho-do-sul, Southern cabbageworm); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta-mede-palmo- onívora); Schizura concinna JE Smith (lagarta-da-corcunda- vermelha, red humped Caterpillar); Sitotroga cerealella Olivier (traça-de-grãos-de-Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta-processionária-do- pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (mariposa-desfiadora- de-roupa, webbing clothesmoth); Tuta absoluta Meyrick (traça- do-tomateiro); Yponomeuta padella Linnaeus (traça-do- arminho); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.

De interesse são larvas e adultos da ordem Coleóptera, incluindo besouros da família Cerambycidae, Bruehidae e Cureulionidae (incluindo, mas não se limitando a: Anthonomus grandis Boheman (bicudo); Lissorhoptrus Kusehel oryzophilus (gorgulho-aquático); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho- de-celeiro); S. oryzae Linnaeus (gorgulho-do-arroz); Hypera punetata Fabricius (gorgulho-do-trevo); Cylindrocopturus adspersus Leconte (gorgulho-do-caule-de-girassol); Smieronyx fulvus Leconte (gorgulho-de-semente-de-girassol-vermelho); S. sordidus Leconte (gorgulho-de-semente-de-girassol-cinza); Sphenophorus maidis Chittenden (curculionidae-de-milho)); besouros pulga, besouros do pepino, crisomelídeo, besouros de folhas, besouros de batata e larvas da família Chrysomelidae (incluindo, mas não se limitando a: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro-de-batata-do-Colorado); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (crisomelídeo-do-milho); D. barberi Smith & Lawrence (crisomelídeo-do-milho-do-norte) ; D. undecimpunetata howardi Barber (vaquinha-do-sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga-de-milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro-pulga-de-milho); Colaspis brunnea Fabricius (besouro-de-uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro-de- folha-de-cereais); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro-de-girassol)); besouros da família Coceinellidae (incluindo, mas não se limitando a: Epilachna varivestis Mulsant (besouro-de-feijão-mexicano)); besouros chafers e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, mas não se limitando a: Popillia japonica Newman (besouro-japonês); Cyclocephala borealis Arrow (besouro-mascarado-do-norte); C. immaculata Olivier (besouro-mascarado-do-sul); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (besoro-europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (corós), Ligyrus gibbosus De Geer (besouro-de- cenoura)); besouros de tapete da família Dermestidae; vermes- de-cabo (wireworms) da família Elateridae, Eleodes spp. Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; coleópteros de casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.

Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo minadores Agromyza parvicornis Loew (minador- manchado-de-milho); mosquitos (incluindo, mas não se limitando a: Contarinia sorghicola Coquillett (mosquito-de- sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca-Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosquito de trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt (mosquito-de-semente-de- girassol)); moscas de frutas (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas, frit flies), vermes (incluindo, mas não limitados a: Delia platura Meigen (larva-de-trâmite) ; D. coarctata Fallen (mosca-de-bulbo-de-trigo) e outros Delia spp., Meromyza americana Fitch (larva-do-caule-de-trigo), Musca domestica Linnaeus (mosca-doméstica); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas-doméstica- menor, lesser house flies); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas-estável, stable flies)); mosca-de-rosto, mosca-de- chifre (horn flies), moscas-de-sopro (blow flies) , Chrysomya spp.; Phormia spp.; e outras pragas voadoras muscóides, mutucas, Tabanus spp.; moscas bot Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas-de-gado Hipoderma spp.; moscas-de-veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outros Brachycera, os mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas-pretas Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos-mordedores, moscas-de-areia, ascarídeos, Nematocera e outros.

Incluídos como insetos de interesse estão adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera, tais como, mas não se limitando a, adelgídeos da família Adelgidae, insetos de planta da família Miríade, cigarras da família Cicadídea, cigarrinhas, Empoasca spp.; da família Cicadellidae, percevejos das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas da família Membracidae, psilídeo da família Psyllidae, moscas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, filoxera da família Phylloxeridae, cochonilhas do família Pseudococcidae, hemípteros das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Daetylopiidae, Diaspididae, Eriococeidae, Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, insetos-de-renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos, Blissus spp.; e outros insetos de sementes da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae insetos-de-polpa (squash bugs) da família Coreidae, e insetos-vermelhos e manchadores-de-algodão (cotton stainers) da família Pyrrhocoridae.

Membros da ordem Homóptera agronomicamente importantes incluem ainda, mas não estão limitados a: Acyrthisiphon pisum Harris (pulgões-de-ervilha); Aphis craccivora Koeh (pulgões- de-caupi); A. fabae Scopoli (pulgões-de-feijão-preto); A. gossypii Glover (pulgão-de-algodão, pulgão-de-melão); A. maidiradicis Forbes (pulgão-de-raiz-de-milho); A. pomi De Geer (afídeo-da-maçã); A. spiraecola Patch (afídeo-de- ulmeira); Aulacorthum solani Kaltenbach (pulgão-de- dedaleira); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgão-de- morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/MordviIko (pulgão-de- trigo-russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (pulgão-rosado- da-maçã); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo-lanoso); Brevicoryne brassicae Linnaeus (pulgão-do-repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgão-pálido-da-ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (pulgão-do-nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afídeo-de-cereal), Macrosiphum euphorbiae Thomas (pulgões-de-batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo-da- batata-pêssego, pulgão-do-pêssego-verde); Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgões-de-alface); Pênfigo spp. (pulgões- de-raiz e pulgões-esfoladores, root aphids and gall aphids), Rhopalosiphum maidis Fitch (pulgões-de-folha-de-milho); R. padi Linnaeus (pulgão-de-carvalho-cereja-de-pássaro, bird cherry-oat aphid); Schizaphis graminum Rondani (pulgão- verde); Sipha fiava Forbes (pulgão-de-cana-de-açúcar- amarelo); Sitobion avenae Fabricius (pulgão-de-grão-Inglês); Therioaphis maculata Buekton (pulgão-manchado-da-alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (pulgão-preto-do- citrus) e T. citricida Kirkaldy (pulgão-preto); Adelges spp. (adelgids); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera-de-noz- pecã), Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca-do-tabaco, mosca-branca-da-batata-doce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosea-branca-da-folha-prateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca-branca-dos-citros); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca-da-asa-bandeada, bandedwinged whitefly) e T . vaporariorum Westwood (mosca-branca-das-estufas); Empoasca fabae Harris (cigarrinha-da-batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha-marrom-menor); Maerolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha-Aster); Nephotettix eintieeps Uhler (cigarrinha-verde); Ν. nigropictus Stâl (cigarrinha-verde-do- arroz); Nilaparvata lugens Stâl (cigarrinha-marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha-de-milho); Sogatella furei fera Horvath (cigarrinha-de-costas-branca); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo-do-arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha-da-maçã-branca); Erythroneoura spp. (cigarrinhas-da-uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra-periódica); Icerya purchasi Maskell (homóptero-de- almofada-de-algodão); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (homóptero-de-San Jose); Planococcus eitri Risso (cochonilha- branca); Pseudococcus spp. (grupo de cochonilha-branca); Cacopsylla pyrieola Foerster (psila-de-pêra); Trioza diospyri Ashmead (psila-de-caqui).

Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemíptera incluem, mas não estão limitadas a: Acrosternum hilare Say (percevejo-verde); Anasa tristis De Geer (percevejo-de-abóbora); Blissus leueopterus Say (percevejo-das-gramíneas); Corythuea gossypii Fabricius (percevejo-de-renda); Cyrtopeltis modesta Distant (percevejo- do-tomate); Dysdereus suturellus Herrich-Schaffer (manchadores-do-algodão); Euschistus servus Say (percevejo- marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo-de- uma-mancha, one-spotted stink bug ); Graptostethus spp. (grupo de percevejos-de-semente); Leptoglossus eoreulus Say (percevejo-de-sementes-de-pinheiro-de-folha-pisada, leaf- footed pine seed bug); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (percevejo-manchado-de-planta, tarnished plant bug); L. hesperus Knight (percevejo-manchado-de-planta-ocidental, Western tarnished plant bug); L. pratensis Linnaeus (percevejo-comum-de-campo); L. rugulipennis Poppius (percevejo-manchado-de-planta-europeu, European tarnished plant bug); Lygocoris pabulinus Linnaeus (hemíptero-verde- comum, commom green capsid), Nezara viridula Linnaeus (percevejo-verde-do-sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo-de-arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (percevejo- grande-das-Asclepiadáceas); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (cigarrinha-de-algodão).

Além disso, melhoramentos da presente invenção podem ser eficazes contra Hemiptera, Calocoris norvegicus Gmelin (percevejo-de-morango, strawberry bug) ; Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (hemiptero-de-maça, apple capsid); Cyrtopeltis modestus Distant (percevejo-de- tomate, tomato bug); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca- sugadora, suckfly); Spanagonicus albofasciatus Reuter (cigarrinha-de-marca-branca,whitemarked fleahopper);

Diaphnocoris chlorionis Say (honeylocust plant bug) ; Labopidicola allii Knight (percevejo-da-planta-da-cebola, onion plant bug); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (cigarrinha-de-algodão); Adelphocoris rapidus Say (percevejo- rápido-de planta, rapid plant bug); Poecilocapsus lineatus Fabricius (percevejo-fitofago-de-quatro-listras, four-lined plant bug); Nysius ericae Schilling (percevejo-falso, false chinch bug); Nysius raphanus Howard (percevejo-falso, false chinch bug); Nezara viridula Linnaeus (percevejo-verde); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp. ; Reduviidae spp.; e Cimicidae spp.

Também estão incluídos os ácaros adultos e as larvas da ordem Acari (ácaros), tais como Aceria tosichella Keifer (ácaro-do-enrolamento-do-trigo); Petrobia latens Müller (ácaro-do-bronzeamento-do-trigo, brown wheat mi te); ácaros- aranha e os ácaros-vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro-vermelho-europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro-rajado); (T. Mcdanieli McGregor (ácaro- McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro-do-morango) ; ácaros-lisos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro- liso-do-citrus, citrus fiat mi te); ácaros-ferrugem e ácaros- de-broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importante na saúde humana e animal, ou seja, os ácaros da família Epidermoptidae, ácaros do folículo da família Demodicidae, ácaros de grãos da família Glycyphagidae, e carrapatos na ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato-de-veado); I. holocyclus Neumann (carrapato-da-paralisia-australiano); Dermaeentor variabilis Say (carrapato-americano-do-cão); Amblyomma amerieanum Linnaeus (carrapato-da-estrela-solitária) e sarna e ácaros de coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae. Os insetos da ordem Thysanura são de interesse, tais como Lepisma saccharina Linnaeus (silverfish); Thermobia domestica Packard (firebrat).

Pestes adicionais de artrópodes cobertas incluem: aranhas na ordem Araneae, como Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (aranha-castanha-solitária) e a aranha Latrodectus Fabricius (aranha-viúva-negra) e centopéias na ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopéias-caseiras) .

Os insetos podem ser testados para a atividade pesticida de composições dos melhoramentos no início de estágios de desenvolvimento, por exemplo, como larvas ou outras formas imaturas. Os insetos podem ser criados em total escuridão em cerca de 20°C a 30°C e de cerca de 30% para cerca de 70% de umidade relativa. Os bioensaios podem ser realizados conforme descrito no Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485. Os métodos de criação de larvas de insetos e realização de bioensaios são bem conhecidos daqueles com competências normais na arte.

Uma grande variedade de técnicas de bioensaio é conhecida por um perito na arte. Os procedimentos gerais incluem adição de um composto ou organismo experimental para a fonte de alimentação em um recipiente fechado. A atividade pesticida pode ser medida por, mas não está limitada a, mudanças na mortalidade, perda de peso, atração, repelência e outras alterações físicas e comportamentais após a alimentação e exposição por um período de tempo adequado. Os bioensaios aqui descritos podem ser usados com qualquer praga de insetos na alimentação das larvas ou da fase adulta.

Os exemplos a seguir são apresentados a título de ilustração, e não por meio de limitação.

EXPERIMENTOS

Exemplo 1: Bioensaio para testar a atividade pesticida da toxina de B. thuringiensis contra insetos selecionados

Os bioensaios foram conduzidos para se avaliar os efeitos do peptídeo toxina inseticida Bt, estabelecido na SEQ ID NO: 2, contra broca-do-milho-europeu (Ostrinia nubilalis), lagarta-da-espiga-de-milho (Helicoverpa zea), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) da lagarta-do-cartucho-de-outono (Spodoptera frugiperda), lagarta-da-soja (Pseudoplusia includens) e lagarta-da-mucuna (Anticarsia gemmatalis). Os ensaios de alimentação foram realizados em uma dieta artificial contendo a proteína inseticida. A proteína inseticida foi aplicada topicamente usando-se uma dieta artificial lepidópteros-específica. A toxina foi aplicada a uma taxa de 0.3yg por 25μL; de amostra por poço e deixada para secar. A proteína está em tampão 10 mM de carbonato e pH de 10. Uma larva recém-nascida foi colocada em cada poço para alimentação ad Iibitum, durante 5 dias. Os resultados foram expressos como positivo para reações de larvas como desnutrição e/ou mortalidade. Os resultados foram expressos como negativos, se as larvas foram semelhantes ao controle negativo que é a dieta alimentar na qual o tampão acima foi aplicado sozinho.

Tabela 1: Resultados do bioensaio de alimentação para SEQ ID NO: 2

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Exemplo 2: Bioensaio para testar a atividade pesticida da Toxina de B. thuringiensis contra Broca-amarela-do-caule

Preparação de insetos recém-nascidos

Adultos da broca-amarela-do-caule (Scirpophaga incertulas Walker) são recolhidos a partir dos campos de arroz (ARS Mandya e Tattaguppe farm) e engaiolados com plantas de arroz. Os adultos que sobrevivem por 3-4 dias, nestas condições postam ovos em massas em lâminas foliares. As massas de ovos são cuidadosamente cortadas com uma parcela da folha, e mantidas separado para incubação à temperatura ambiente em placas de Petri de plástico seladas. Os neonatos, imediatamente após a eclosão, são utilizados para a realização dos bioensaios.

Preparação de segmentos de caule

As plantas de arroz transgênicas foram preparadas usando-se a toxina Bt dos melhoramentos. Os métodos de transformação de arroz são conhecidos na arte, tais como os protocolos estabelecidos no Hiei et al.(Plant Journal 1994, 6(2),271-282) .

Um perfilho de cada planta de arroz Bt (cada planta é um evento) de cerca de 55-60 dias de idade foi cortado na base e feito em cinco segmentos de igual tamanho (cerca de 2 centímetros). Todos os segmentos foram mantidos em uma placa de Petri com discos de papel de filtro estéril e umedecidos com água destilada. Da mesma forma, um controle não-Bfc foi mantido para a comparação. Depois de dois dias 2-3 segmentos de eventos respectivos foram fornecidos à broca.

Bioensaios

Cinco broca-da-haste recém-nascidas foram cuidadosamente liberadas por evento com uma pequena escova em cada prato. As placas foram seladas com filme plástico para impedir a fuga das larvas. Todas as placas foram mantidas em uma bandeja, que foi colocada em uma grande cuba contendo água e mantida em condições de temperatura ambiente. Cada dia, todas as placas foram cuidadosamente abertas e seladas até o final da observação para fornecer ar fresco e para remover o excesso de condensação, se houver.

Observações

As observações de mortalidade e crescimento larval foram feitas após 5 dias. Inicialmente, em cada prato, todos os segmentos de caule foram inspecionados para qualquer larva morta na superfície. Posteriormente, os segmentos de caule foram cortados longitudinalmente com uma lâmina de camada- sábia (bainha por bainha) e observados para a presença de larvas vivas ou mortas no interior do tecido. As larvas sobreviventes permaneceram dentro dos túneis enquanto as larvas mortas eram pretas e lisas. O crescimento de larvas sobreviventes foi comparado visualmente para aquelas do controle não-Bt. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2: Resultados para 14 eventos de bioensaios com broca- amarela-de-caule

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2 Todos os bioensaios foram inicialmente inoculados com 5 larvas, no entanto, os números são ajustados para refletir as larvas que escaparam.

Resumo

Cinco larvas foram liberadas para todos os ensaios e algumas larvas escaparam durante o ensaio, e o % de mortalidade foi calculado apenas com base nas larvas ainda no prato, no final do ensaio. Onze dos 14 eventos demonstraram 100% de mortalidade. Dois eventos apresentaram 50-60% de mortalidade com morbidade nas larvas sobreviventes. Um evento onde foi observada 40% de mortalidade também permitiu que as larvas sobreviventes se desenvolvessem normalmente.

Exemplo 3: Determinação da CL50 e EC50 Bioensaios foram conduzidos para se determinar uma LC50 e EC50 do peptideo toxina inseticida, estabelecidos na SEQ ID NO: 2, em broca-do-milho-europeu (Ostrinia nubilalis), lagarta-da-espiga-de-milho (Helicoverpa zea), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) e lagarta-cartucho-de-outono(Spodoptera frugiperda) . Os ensaios de alimentação foram realizados em uma dieta artificial contendo a proteína inseticida. A proteína inseticida foi diluída com tampão 10 mM de carbonato pH 10 e com uma dieta de inseticida para dar uma concentração final de toxinas de 10000, 1000, 100, 10 e 1 ppm. Uma larva recém-nascida foi colocada em cada poço para alimentação ad libitum, durante 5 dias. Cada bioensaio foi feito com oito cópias de cada dose e o bioensaio foi repetido três vezes. Os resultados foram expressos em CL50 para a mortalidade e/ou EC50 por pesagem das larvas sobreviventes em cada concentração de toxinas.

Tabela 3 : Resultados de LC50 e EC50

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Exemplo 4: Transformação de milho por bombardeamento de partículas e Regeneração de Plantas Transgênicas Embriões imaturos de milho provenientes a partir de plantas de estufa doadoras são bombardeados com uma molécula de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos da toxina (por exemplo, SEQ ID NO: 1) operacionalmente ligada a um promotor da ubiquitina e ao gene marcador PAT selecionável (Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25-37), que confere resistência ao herbicida Bialaphos. Alternativamente, o gene marcador de seleção é fornecido em uma molécula de DNA separada. A transformação é feita como segue. As receitas de meios seguem abaixo.

Preparação do tecido-alvo

As espigas são descascadas e desinfestadas em 3 0% de alvejante Clorox bleach™ mais 0,5% de detergente Micro por 20 minutos, e lavadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são retirados e colocados com o lado do eixo do embrião para baixo (lado do escutelo para cima), 2 5 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e em seguida, alinhados dentro da zona-alvo de 2,5 cm na preparação para o bombardeio.

Preparação de DNA

Um vetor plasmidial compreendendo uma seqüência de nucleotídeos da toxina (por exemplo, SEQ ID NO: 1) operacionalmente ligado a um promotor da ubiquitina é feito. Por exemplo, um vetor de transformação adequado compreendendo um promotor UBIl de Zea mays, uma UTR 5' de UBIl e um íntron UBIl, em combinação com um terminador PinII. Além disso, o vetor contém um gene marcador PAT selecionável dirigido por um promotor CAMV3 5S e inclui um terminador CAMV35S.

Opcionalmente, o marcador de seleção pode residir em um plasmídeo separado. Uma molécula de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos da toxina, bem como um marcador selecionável PAT é precipitada para sobre pastilhas de tungstênio de 1,1 μητι (diâmetro médio) utilizando-se um procedimento de precipitação com CaCl2 como segue:

100 μL particulas de tungstênio preparadas em água

10 μL (1 μg) de DNA em tampão Tris EDTA (1 μg de DNA total)

100 μL de 2,5 M de CaCl2

10 μL de 0,1 M de espermidina

Cada reagente é adicionado seqüencialmente para uma suspensão de particulas de tungstênio, enquanto mantidas no vortex multitubo. A mistura final é sonicada brevemente e deixada para incubação sobre agitação constante por 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido retirado, e os precipitados lavados com 500 mL de etanol 100% e centrifugados por 30 segundos. Mais uma vez o líquido é removido, e 105 μΐι de etanol 100% é adicionado ao precipitado final de partículas de tungstênio. Para o bombardeamento de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são brevemente sonicadas e 10μL· são pingados no centro de cada macro- carreador e deixados para secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeio.

Tratamento da Arma de partículas

As placas de amostra são bombardeadas no nível # 4 em arma de partículas HE34 #-1 ou # HE34-2. Todas as amostras recebem um único tiro de 650 PSI, com um total de dez alíquotas retiradas de cada tubo de preparação partículas/DNA.

Tratamento subseqüente

Na seqüência dos bombardeamentos, os embriões são mantidos em meio 560Y por 2 dias, em seguida, transferidos para meio de seleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialaphos e repicadas a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, os calos de clones seleção-resistentes são transferidos para meio 2 88 J para iniciar a regeneração em plantas. Na seqüência de maturação de embriões somáticos (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para um meio para a germinação e transferidos para a sala de cultura iluminada. Cerca de 7-10 dias depois, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio 272V livre de hormônio em tubos por 7-10 dias até as mudas estarem bem estabelecidas. As plantas são então transferidas para inserção em apartamentos (equivalente a pote de 2,5") contendo solo de envasamento e crescidas por 1 semana em uma câmara de crescimento, e subseqüentemente, crescidas por um período adicional de 1-2 semanas em casa de vegetação, e em seguida, transferidas para os vasos 600 clássicos (galão de 1,6) e crescidas até a maturidade. As plantas são monitoradas e marcadas para a expressão da toxina por ensaios conhecidos na arte ou como descritos acima.

Bombardeamento e Meios de Cultura

O meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/L de sais basal N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de vitamina Eriksson's Mix (1000x SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 120,0 g/L de sacarose, 1,0 mg/L de 2,4-D, e 2,88 g/L de L-prolina (trazendo-se para o volume com H2O destilada após ajuste de pH para 5,8 com KOH) ; 2,0 g/L de Gelrite™ (adicionada depois de se levar o volume com H2O destilada) e 8,5 mg/L de nitrato de prata (adicionados após a esterilização do meio e à temperatura ambiente). Meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/L de sais basal N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de vitamina Eriksson's Mix (lOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 30,0 g/L de sacarose e 2,0 mg/L de 2,4-D (trazendo-se o volume com H2O destilada após ajuste de pH para 5,8 com KOH); 3,0 g/L de Gelrite™ (adicionado depois de se levar o volume com H2O destilada) e 0,85 mg/L de nitrato de prata e 3,0 mg/L de Bialaphos (ambos adicionados após a esterilização do meio e à temperatura ambiente). Meio de regeneração de planta (288J) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl, e 0,40 g/L de Glicina, trazendo-se o volume com H2O D.I) (Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473), 100 mg/L de mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarose e 1,0 mL/L de 0,1 mM de ácido abscísico (trazendo-se o volume com H2O destilada após o ajuste do pH para 5,6), 3,0 g/L de Gelrite™ (adicionado-se depois de se levar o volume com H2O destilada) e 1,0 mg/L de ácido indolacético e 3,0 mg/L de Bialaphos (adicionados após a esterilização do meio e resfriado a 60 aC) .

O meio livre de hormônios (272V) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de vitaminas MS (0,100 g/L de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl e 0,40 g/L de Glicina, trazendo-se o volume com H2O destilada), 0,1 g/L de mio-inositol, e 40,0 g/L de sacarose (trazendo-se o volume com H2O destilada após o ajuste do pH para 5,6) e 6 g/L de Bacto-ágar (adicionado depois de se levar o volume com H2O destilada), esterilizado e resfriado a 609C.

Exemplo 5: Transformação de Milho Mediada por

Agrobacterium e Regeneração de Plantas Transgênicas Para a transformação genética de milho mediada por Agrobacterium com uma seqüência de nucleotideos de toxinas (por exemplo, SEQ ID NO: 1), pode ser usado o método de Zhao (U.S. Patent No. 5,981,840, e publicação de patente PCT W098/32326, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência). Resumidamente, embriões imaturos são isolados de milho e os embriões colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium sob condições em que as bactérias são capazes de transferir a seqüência de nucleotideos da toxina (SEQ ID NO: 1) a pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos podem ser imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempo com o Agrobacterium (Etapa 2: a etapa de co-cultivo). Os embriões imaturos podem ser cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Na seqüência deste período de co-cultivo uma etapa de descanso "opcional" é contemplada. Nesta etapa de descanso, os embriões são incubados na presença de, pelo menos, um antibiótico que inibe o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para plantas transformantes (Passo 3: etapa de descanso). Os embriões imaturos podem ser cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para a eliminação de Agrobaeterium e para uma fase de descanso par as células infectadas. Em seguida, os embriões inoculados são cultivados em meio contendo um agente seletivo e o calo transformado crescido é recuperado (Passo 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo das células transformadas. 0 calo é, então, regenerado em planta (Passo 5: a etapa de regeneração) e calos cultivados em meio seletivo podem ser cultivados em meio sólido para regeneração das plantas.

Exemplo 6: Transformação de Embriões de Soja

Embriões de soja são bombardeados com um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotideos de toxina da SEQ ID NO: 1 operacionalmente ligada a um promotor pinll como se segue. Para se induzir embriões somáticos, cotilédones, 3-5 mm em comprimento dissecados de sementes imaturas esterilizadas na superfície, de um cultivar de soja apropriado são cultivadas na luz ou no escuro a 26°C em meio ágar apropriado por seis a dez semanas. Embriões somáticos produzindo embriões secundários são excisados e colocados em um meio líquido adequado. Após seleção repetida para grupos de embriões somáticos que se multiplicam como embriões prematuros de estágio globular, as suspensões são mantidas como descrito abaixo.

Culturas embriogênicas de soja em suspensão podem ser mantidas em 35 mL de meio líquido em um agitador rotativo, a 150 rpm, a 26°C com luzes fluorescentes em uma programação de 16:8 horas dia/noite. As culturas são repicadas a cada duas semanas pela inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 mL de meio líquido.

Culturas embriogênicas de soja em suspensão podem então ser transformadas pelo método de arma de bombardeamento de partículas (Klein et al. (1987) Nature (London) 327: 70-73, U.S. Patent No. 4,945,050). Um instrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (retro-ajuste de hélio) pode ser usado para estas transformações.

Um gene marcador de seleção que pode ser utilizado para facilitar a transformação de soja é um transgene composto do promotor 3 5S do vírus do mosaico da couve-flor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), o gene da higromicina fosfotransferase do plasmídeo pJR225 (de E. coli, Gritz et al. (1983) Gene 25: 179-188), e a região 3' do gene da nopalina sintase a partir do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. 0 cassete de expressão compreende uma seqüência de nucleotídeos de toxina (por exemplo, SEQ ID NO: 1) operacionalmente ligada ao promotor pinll pode ser isolado como um fragmento de restrição. Este fragmento pode ser inserido em -um sítio de restrição único do vetor portador do gene marcador.

Para 50 uL de uma suspensão a 60 mg/mL de partículas de ouro de 1 um é acrescentado (em ordem) : 5 uL de DNA (1 Ug/UL) , 20 uL de espermidina (0,1 M) e 50 uL de CaCl2 (2,5 Μ). A preparação de partículas é, então, agitada por três minutos, centrifugada em uma microcentrífuga por 10 segundos e o sobrenadante removido. As partículas revestidas de DNA são então lavadas uma vez em 400 uL de etanol 70% e ressuspensas em 40 uL de álcool anidro. A suspensão DNA/partículas pode ser sonicada três vezes por um segundo cada. Cinco microlitros das partículas de ouro revestidas com DNA são então carregados em cada disco transportador macro.

Cerca de 300-400 mg de uma suspensão de cultura de duas semanas é colocado em uma placa de Petri 60 χ 15 mm vazia e o líquido residual removido do tecido com uma pipeta. Para cada experimento de transformação, aproximadamente 5-10 placas de tecidos são normalmente bombardeadas. A pressão de ruptura de membrana é de 1100 psi, e a câmara é evacuada para um vácuo de 2 8 polegadas de mercúrio. O tecido é colocado cerca de 3,5 centímetros de distância da tela de retenção e bombardeado três vezes. Na seqüência de bombardeamentos, o tecido pode ser dividido ao meio e colocado de volta em líquido e cultivado como descrito acima.

Cinco a sete dias após o bombardeio, o meio líquido pode ser trocado por novos meios, e onze a doze dias após o bombardeio com meios frescos contendo 50 mg/mL de higromicina. Este meio seletivo pode ser atualizado semanalmente. Sete a oito semanas após o bombardeio, o tecido transformado verde, pode ser observado crescendo de aglomerados embriogênicos necróticos não transformados. Isolados de tecido verde são removido e inoculado em frascos individuais para gerar novas culturas de suspensões embriogênicas transformadas como propagados clonais. Cada nova linhagem pode ser tratada como um evento de transformação independente. Estas suspensões podem ser repicadas e mantidas como "grupos" de embriões imaturos ou regenerados em plantas inteiras através da maturação e germinação dos embriões somáticos individuais.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados no caderno de especificações são indicativas do nível daqueles hábeis na arte à qual pertence esta invenção. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes estão aqui incorporadas por referência, na mesma medida, como se cada uma das publicações individuais, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Embora a invenção que precede tenha sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será óbvio que determinadas alterações e modificações podem ser praticadas no âmbito dos melhoramentos.

Claims (23)

1. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada por ser selecionada do grupo constituído por: (a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência complementar integral da mesma; (b) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (c) uma seqüência de nucleotídeos que tenha pelo menos 8 0% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos (a); (d) uma seqüência de nucleotídeos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos (a); (e) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos caracterizada por pelo menos 70% de identidade seqüência com uma seqüência de aminoácidos de (b); (f) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos caracterizada por pelo menos 75% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos de (b).

2. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência de nucleotídeos é uma seqüência sintética que foi concebida para a expressão em uma planta.

3. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico da reivindicação 1.

4. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que inclui ainda uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptideo heterólogo.

5. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que contém o construto de um DNA da reivindicação 3.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma célula bacteriana.

7. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma célula vegetal.

8. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende a célula hospedeira de acordo com a reivindicação

9. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita planta é selecionada do grupo constituído por milho, sorgo, trigo, couve, girassol, tomate, crucíferas, pimentão, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, tabaco, cevada, e colza.

10. Semente transformada da planta de acordo com reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o construto de DNA.

11. Polipeptideo isolado com atividade pesticida, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo que é codificado pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; (c) uma seqüência de polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de polipeptídeos de acordo com (a) ou (b); (d) uma seqüência de polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de seqüência com uma seqüência polipeptídica de acordo com (a) ou (b).

12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender ainda seqüências heterólogas de aminoácidos.

13. Composição caracterizada por compreender o polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a dita composição é selecionada a partir do grupo que consiste de um pó, poeira, pastilhas, granulados, spray, emulsões, colóides e solução.

15. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a dita composição é preparada por secagem, Iiofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, decantação, ou concentração de uma cultura de células de Bacillus thuringiensis.

16. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por compreender de cerca de 1% a cerca de 99% em peso do referido polipeptídeo.

17. Método para controlar uma população de praga de lepidópteros ou de coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma dita população em contato com uma quantidade de atividade pesticida eficaz de um polipeptideo de acordo com a reivindicação 11.

18. Método para matar uma praga de lepidópteros ou coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a dita praga em contato com, ou alimentar a dita praga com uma quantidade de atividade pesticida eficaz de um polipeptideo de acordo com a reivindicação 11.

19. Método para produzir um polipeptideo com atividade pesticida, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira da reivindicação 5, em condições em que uma molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptideo é expressa, o dito polipeptideo sendo selecionado a partir do grupo que consiste de: (a) um polipeptideo compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptideo que é codificado pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; (c) uma seqüência de polipeptideo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de polipeptideos de (a) ou (b) ; e (d) lima seqüência polipeptideo tendo pelo menos 85% de identidade de seqüência com uma seqüência polipeptídica de (a) ou (b) .

20. Planta caracterizada por ter estavelmente incorporado em seu genoma um construto de DNA constituído por uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína com atividade pesticida, onde a dita seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo constituído por: (a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência complementar integral da mesma; (b) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (c) uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeos de (a) ; (d) uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeos de (a) ; (e) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos caracterizada por pelo menos 7 0% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos de (b); e (f) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos caracterizada por pelo menos 7 5% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos de (b), em que a dita seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão de uma seqüência de codificação em uma célula vegetal.

21. Planta de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma célula vegetal.

22. Método para proteger uma planta contra uma praga, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na dita planta ou célula vegetal desta, ao menos um vetor de expressão que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo pesticida, onde a dita seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo constituído por: (a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência complementar integral da mesma; b) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (c) uma seqüência de nucleotídeos que tenha pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeos de (a) ; (d) uma seqüência de nucleotídeos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeos de (a); (e) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos caracterizada por pelo menos 70% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos de (b); (f) uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos caracterizada por pelo menos 7 5% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos de (b).

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a dita planta produz um polipeptídeo pesticida tendo atividade pesticida contra pragas de lepidópteros e coleópteros.