MX2011002651A - Nuevo gen bacillus thuringiensis con actividad en lepidopteros. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona ácidos nucleicos, y variantes y fragmentos de los mismos, obtenidos a partir de cepas de Bacillus thuringiensis codificando polipéptidos que tienen actividad pesticida contra insectos nocivos, incluyendo Lepidópteros. Modalidades particulares de la invención proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas pesticidas, composiciones pesticidas, construcciones de ADN y microorganismos transformados y plantas que comprenden un ácido nucleico de las modalidades. Estas composiciones encuentran uso en métodos para controlar plagas, especialmente plagas de plantas.

Description

i |l MUEVO GEN BACILLUS THURINGIENSIS CON ACTIVIDAD EN LEPIDÓPTEROS i DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con ácidos I nucleicos , de formación natural y recombinantes obtenidos a partir de los genes Baciílus thuringiensis que codifican polipéptidos pesticidas caracterizados por una actividad pesticida ' contra insectos nocivos. Las composiciones y métodos de la invención ' utilizan los ácidos nucleicos descritos,; y sus polipéptidi os pesticidas codificados, para controlar 'plagas en plantas .| 'Los insectos nocivos son un factor principal en la pérdida de cultivos agrícolas alrededor del mundo. Por ejemplo, la ingestión de la gusano soldado, el daño por la oruga grasienta, o el daño, por la oruga taladradora pueden devastar 'económicamente a1 los productores agrícolas. La pérdida de cultivos relacionados con insectos nocivos a partir de ataques en el campo y al maíz dulce completamente por orugas taladradoras ijia ; alcanzado aproximadamente un billón de dólares al año en ¡daño y gastos de control.

Tradicionalmente, íel método principal para impactar las poblaciones de insectos: nocivos es la aplicación de insecticidas químicos de amplio espectro. Sin embargo, los consumidores y reguladores i gubernamentales por igual están cada vez 1 más interesados i en los peligros para el medio ! ¡ ; í '¦ : i ' I I ambiente asociados con la producción y el uso de pesticidas químicos sintéticos. Debido a tales preocupaciones, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los pesticidas más peligrosos. De este modo, existe un interés sustancial para desarrollar pesticidas alternativos.

El control biológico de insectos nocivos de importancia agrícola al utilizar un agente microbiano, tal como hongo, bacteria u otra especie de insecto produce una alternativa ecológica y 1 comercialmente atractiva para pesticidas químicos sintéticos. Generalmente hablando, el uso de biopesticidas presenta un riesgo menor de contaminación y peligros para el medio ambiente, y los biopesticidas proporcionan mayor especificidad objetivo que es característica de insecticidas químicos de amplio espectro tradicionales. Además, los biopesticidas a menudo cuestan menos para producir y de este modo mejorar el rendimiento económico para una amplia variedad de cultivos.

Se sabe que ciertas especies de microorganismos del género Bacillus poseen actividad pesticida contra un amplio intervalo de insectos nocivos incluyendo Lepidóptero, Díptera, Coleóptera, Hemiptera y otros. Bacillus thuringiensis (Bt) y Bacillus papilliae se encuentran entre los agentes de control biológico más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenicidad de los insectos ha sido también atribuida a las cepas de B . larvae, B. lenti orbus, 23. sphaericus (Harwook, ed. , ((1989) Bacillus (Plenum Press) , 306) y B: cereus (WO 96/10083) . Parece que la actividad pesticida se concentra en inclusiones de proteínas cristalinas parasporales, aunque las proteínas pesticidas han sido también aisladas de la etapa de crecimiento vegetativa del Bacillus . Diversos genes que codifican estas proteínas pesticidas. han sido aislados y caracterizados (véase por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,366,892 y 5,840,868)·.

Insecticidas microbianos, particularmente aquellos obtenidos de las cepas Bacillus , han jugado un papel importante en la agricultura como alternativas para el control químico de plagas. Recientemente, científicos agrícolas han desarrollado plantas de cultivo con resistencia mejorada a insectos diseñando genéticamente plantas de cultivo que producen proteínas pesticidas a partir del Bacillus . Por e emplo, plantas de maíz y algodón han sido diseñadas genéticamente para producir proteínas pesticidas aisladas de las cepas del Bt (véase por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci . 59 ( 3 ) : 417-42 ; Schnepf et al. (1998) Microbiol Mol Biol Rev . 62 (3 ) : 775-806 ) . Estos cultivos genéticamente diseñados se utilizan ahora ampliamente en la agricultura americana y han provisto al granjero con una alternativa ecológica para métodos para el control de insectos tradicionales. Además, se ha vendido al granjero americano papas genéticamente diseñadas para contener toxinas Cry pestieidas. Aunque se ha probado que son comercialmente muy exitosas, estas plantas de cultivo, resistentes a insectos diseñadas genéticamente, proporcionan resistencia únicamente en un margen estrecho económicamente importante de insectos nocivos.

Por consiguiente, existe una necesidad de nuevas toxinas del Bt con un margen más amplio de actividad insecticida contra insectos ; nocivos , por ejemplo toxinas las j cuales son activas contra una gran variedad de insectos del orden Lepidóptero . Además, sigue habiendo una necesidad para biopesticidas que tienen actividad contra una variedad de insectos nocivos y para biopesticidas los cuales han mejorado la actividad insecticida.

Se proporcionan composiciones y métodos para impactar ¦ insectos nocivos. Más específicamente, las modalidades de la presente invención se relacionan con métodos para impactar insectos utilizando secuencias de nucleótidos que codifican péptidos insecticidas que producen microorganismos transformados y plantas que expresan un polipéptido insecticida de las modalidades. Tales plagas incluyen plagas agrícolamerite significativas, tal como por ejemplo: gusano soldado, por ejemplo, barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis Hübner) y gusano elotero {Heliothis zea). En algunas modalidades, las secuencias de nucleótidos codifican polipéptidos que son pesticidas para al menos un insecto que pertenece al orden Lepidóptero .

Las modalidades proporcionan un ácido nucleico y fragmentos y variantes de las mismas, las cuales codifican polipéptidos que poseen actividad pesticida contra insectos nocivos (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 que codifica la SEQ ID NO: 2) . La secuencia de nucleótidos de tipo silvestre (por ejemplo, de origen natural) de las modalidades, la cual fue obtenida del Bt, codifica un, nuevo péptido insecticida. Las modalidades además proporcionan fragmentos y variantes de la secuencia de nucleótidos descrita que codifica polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, insecticidas).

Las modalidades además proporcionan pesticidas aislados (por ejemplo, insecticidas) polipéptidos codificados ya sea por ácido nucleico de origen natural o modificado (por ejemplo, mutagenizado o manipulado) de las modalidades. En ejemplos particulares, proteínas pesticidas de las modalidades incluyen fragmentos y proteínas de longitud total y polipéptidos que son producidos a partir de ácidos nucleicos mutagenizados diseñados para introducir secuencias de aminoácidos particulares dentro de polipéptidos de las modalidades. En modalidades particulares, los polipéptidos han mejorado la actividad pesticida con relación a la actividad del polipéptido de origen natural a partir del cual se derivan.

Los ácidos nucleicos de las modalidades pueden también utilizarse para producir plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas transgénicas (por ejemplo, transformadas), que se caracterizan por genomas que comprenden por lo menos una construcción de nucleótidos establemente incorporados que comprenden una secuencia de codificación de las modalidades operablemente enlazadas a un promotor que conduce una expresión del polipéptido pesticida codificado. Por consiguiente, se proporcionan también células vegetales transformadas, tejidos de plantas, plantas y semillas de las mismas .

En una modalidad particular, una planta transformada puede ser producida utilizando un ácido nucleico que ha sido optimizado para expresión incrementada en una planta huésped. Por ejemplo, uno de los polipéptidos pesticidas de las modalidades puede volver a traducirse para producir un ácido nucleico que comprende codones optimizados para expresión en un huésped particular, por ejemplo, una planta de cultivo tal como una planta de maíz (Zea mays) . La expresión de una secuencia' de codificación para una planta transformada (por ejemplo, dicotiledónea o monocotiledónea) resultará en la producción de un polipéptido pesticida y confiere resistencia incrementada a los insectos para la planta. Algunas modalidades proporcionan plantas transgénicas que expresan polipéptidos pesticidas que encuentran uso en métodos para impactar diversos insectos nocivos .

Las modalidades ¡ además incluyen composiciones pesticidas o insecticidas 1 que contienen los polipéptidos insecticidas de las modalidades, y pueden comprender además opcionalmente polipéptidos1 insecticidas. Las modalidades abarcan la aplicación de tales composiciones para el ambiente de insectos nocivos con el fin de impactar los insectos nocivos .

Se representan las modalidades de la invención para composiciones y métodos para impactar insectos nocivos, particularmente plagas en plantas. Más específicamente, el ácido nucleico aislado de las modalidades, y fragmentos y variantes de las mismas, comprenden secuencias de nucleotidos que codifican polipéptidos pesticidas (por ejemplo, proteínas),. Las proteínas pesticidas descritas son biológicamente activas (por ejemplo, pesticidas) contra insectos nocivos tales como; aunque sin limitarse a, insectos nocivos del orden Lepidóptero. Los insectos nocivos de interés incluyen, aunque no se limitan a barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis Hübner) y gusano elotero {Heliothis zea) .

Las composiciones de las modalidades comprenden ácidos nucleicos aislados, \ y fragmentos y variantes de los mismos, los cuales codifican polipéptidos pesticidas, casetes de expresión que comprenden secuencias de nucleotidos de las modalidades, proteínas pesticidas aisladas y composiciones pesticidas. Algunas modalidades proporcionan polipéptidos pesticidas modificados caracterizados por una actividad insecticida mejorada contra Lepidópteros con relación a la actividad pesticida de la proteína de tipo silvestre correspondiente. Las modalidades además proporcionan plantas y microorganismos transformados con estos ácidos nucleicos novedosos, y métodos que implican el uso de tales ácidos nucleicos,, composiciones pesticidas, organismos transformados I y productos de los mismos para impactar insectos nocivos.

Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las modalidades pueden utilizarse para transformar cualquier organismo para producir las proteínas pesticidas codificadas. Se proporcionan métodos que implican el uso de tales organismos transformados para impactar o controlar plagas en plantas . Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las modalidades pueden también utilizarse para transformar organelos tal como cloroplastos (McBride et al. (1995) Biotechnology 13:362-365; y Kota et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:1840-1845).

Las modalidades i además se relacionan con la identificación de fragmentos y variantes de la secuencia de codificación de origen natural que codifica proteínas pesticidas biológicamente activas . Las secuencias de nucleótidos de las modalidades encuentran uso directo en métodos para impactar plagas, particularmente insectos nocivos tal como plagas del orden Lepidóptero. Por consiguiente, las modalidades proporcionan nuevos procedimientos para impactar insectos nocivos que no dependen del uso de insecticidas químicos sintéticos, tradicionales. Las modalidades implican el descubrimiento de pesticidas biodegradables , de origen natural y los genes que los codifican.

Las modalidades además proporcionan fragmentos y variantes de la secuencia de codificación de origen natural que también codifica polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, pesticidas). Los ácidos nucleicos de las modalidades abarcan secuencias de ácidos nucleicos o nucleótidos que han sido optimizados para expresión mediante células de un organismo particular, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que se han vuelto a traducir (es decir, traducción inversa) utilizando codones de plantas preferidos, basados en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene una actividad pesticida mejorada. Las modalidades además proporcionan mutaciones, las cuales confieren propiedades mejoradas o alteradas en los polipéptidos de las modalidades. Véanse por ejemplo, las Solicitudes Estadounidenses co-pendientes Nos. 10/606,320, presentada el 25 de junio de 2003, y la 10/746,914, presentada el 24 de diciembre de 2003.

En la descripción que sigue, se usa ampliamente una serie de términos. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar el entendimiento de las modalidadés .

Unidades, prefijos y símbolos pueden describirse en su forma SI aceptada. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi , respectivamente. Los intervalos numéricos están incluidos en los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden referirse en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, así mismo, pueden referirse por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los términos definidos anteriormente se definen más completamente para referencia a la especificación de manera general.

Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye referencia a un polímero desoxiribonucleótido o ribonucleótido en cualquier forma de hebra sencilla o doble, y a menos que se limite de otra manera, abarca análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos) que tienen la naturaleza esencial: de nucleótidos naturales debido a que se hibridizan para ácidos nucleicos de hebra sencilla en una manera similar a aquella de nucleótidos de origen natural .

Como se utiliza en la presente, los términos "que codifica" o "codificado" cuando se utilizan en el contexto de un ácido nucleico específico significa que el ácido nucleico comprende ;la información necesaria para la traducción directa de la secuencia de nucleótidos dentro de una proteína específica. La información por la cual se codifica una proteína se especifica por el uso de codones . Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de regiones traducidas del ácido nucleico o pueden carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo, como en A Dc) .

Como se utiliza [ en la presente, "secuencia de longitud total" con referencia a un polinucleótido específico o su proteína codificada significa que tiene la secuencia de ácido nucleico completa o la secuencia de aminoácidos completa de una secuencia endógena, nativa (no sintética) . Un polinucleótido de longitud total codifica la forma catalíticamente activa de longitud total de la proteína específica .

Como se utiliza en la presente, el término "antisentido" utilizado en l> contexto de orientación de una secuencia de nucleótidos se refiere a una secuencia de polinucleótidos dúplex que se enlaza operablemente a un promotor en una orientación en donde se transcribe la hebra antisentido. La hebra antisentido es apropiadamente complementaria a un producto de trascripción endógena de manera que la traducción del producto de trascripción endógeno se inhibe a menudo. De este modo, en el caso en donde se utiliza el término "antisentido" en el contexto de una secuencia de nucleótidos particular, el término se refiere a la hebra complementaria del producto de trascripción de referencia.

!Los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural.

Los términos "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un aminoácido que se incorpora dentro de una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se limite de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar en una manera similar como aminoácidos de origen natural.

Los polipéptidos de las modalidades pueden producirse ya sea a partir de un ácido nucleico descrito en la presente, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándar. Por ¡ejemplo, una proteína de las modalidades puede producirse mediante expresión de un ácido nucleico recombinante de las modalidades en una célula huésped apropiada, o alternativamente mediante una combinación de procedimientos ex vivo.

Como se utiliza en la presente, los términos "aislado" ,y "purificado" se! utilizan intercambiablemente para referirse como ácidos nucleicos o polipéptidos o porciones biológicamente activas de los mismos que están sustancial o esencialmente libres de componentes que normalmente se asocian o interactúan con el ácido nucleico o polipéptido tal como se encuentran en su ambiente de origen natural. De este modo, un ácido nucleico o polipéptido aislado o purificado está sustancialmente libre Ide otro material celular o medio de cultivo, cuando se produce mediante técnicas recombinantes , o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos, cuando se sintetiza químicamente.

Un ácido nucleico "aislado" está generalmente libre de secuencias (tal como por ejemplo, secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas én los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genomico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas modalidades, los ácidos nutcleicos aislados pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente los ácidos nucleicos en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico.

Como se utiliza en la presente, el término "aislado" o "purificado" como se utiliza para referirse a un polipéptido de las modalidades, significa que la proteína aislada está sustancialmente libre de material celular e incluye preparaciones de la proteína teniendo menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de la proteína contamínate. Cuando la proteína de las modalidades o la porción biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de los precursores químicos o químicos sin proteína de interés.

En toda la especificación, la palabra "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento establecido, número; entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, aunque no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros ó etapas.

Como se utiliza en la presente, el término "impactar insectos nocivos" se refiere a efectuar cambios en la alimentación, crecimiento y/o comportamiento de los insectos en cualquier etapa! de desarrollo, incluyendo aunque sin limitarse a: eliminar el insecto; retardar el crecimiento; evitar la capacidad reproductiva; actividad anti-alimentaria; y similares.

Como se utiliza en la presente, los términos "actividad pesticida" y "actividad insecticida" se utilizan con sinónimos para referirse a una actividad de un organismo o una sustancia (tal como, por ejemplo, una proteína) que puede medirse mediante, aunque sin limitarse a mortalidad de plagas, pérdida de peso de plagas, repelencia a plagas y otros cambios de comportamiento y físicos de una plaga después de la alimentación y exposición durante una cantidad de tiempo apropiada. De este modo, un organismo o sustancia que tiene actividad pesticida impacta adversamente por lo menos un parámetro medióle de adaptabilidad de plagas. Por ejemplo, Las "proteínas pesticidas" son proteínas que despliegan actividad pesticida por sí mismas o en combinación con otras proteínas .

Como se utiliza en la presente, el término "cantidad pesticidamente efectiva" implica una cantidad de una sustancia u organismo que tiene actividad pesticida cuando se presenta en el ambiente de una plaga. Para cada sustancia u organismo, la cantidad pesticidamente efectiva se determina empíricamente para cada plaga afectada en un ambiente específico. Similarmente, una "cantidad insecticidamente efectiva" puede utilizarse para referirse como una "cantidad pesticidamente efectiva" cuando la plaga es un insecto nocivo.

Como se utiliza en la presente, el término "recombinantemente diseñado" o "diseñado" implica la utilización de tecnología de ADN recombinante para introducir (por ejemplo, diseñar) un cambio en la estructura proteica basada en un entendimiento del mecanismo de la proteína de acción y, una consideración de los aminoácidos que se introducen, eliminan o sustituyen.

Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de nucleótido mutante" o "mutación" o "secuencia de nucleótido mutagenizada" implica una secuencia de nucleotidos que ha sido mutagenizada o alterada para contener uno o más!residuos de nucleotidos (por ejemplo, par de bases) que no se presenta en la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Tal mutagénesis o alteración consiste de una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones o reemplazos de residuos de ácido nucleico. Cuando se hacen las mutaciones agregando, removiendo o reemplazando un aminoácido o sitio proteolítico, tal adición, ¡remoción o reemplazo puede estar dentro o adyacente al motivo del sitio proteolítico, siempre que el objeto de la mutación se complete (es decir, siempre que la proteolisis en el sitio se cambie) .

Una secuencia de nucleótidos mutante puede codificar una toxina insecticida mutante que muestra una i actividad insecticida mejorada o disminuida, o una secuencia de aminoácidos la cual confiere actividad insecticida mejorada o disminuida en un polipéptido que la contiene. Como se utiliza en la presente, el término "mutante" o "mutación" en el contexto de una proteína o polipéptido o secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia, la cual ha sido mutagenizada o alterada para contener uno o más residuos de aminoácidos, que no se presentan en la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Tal mutagénesis o alteración consiste de una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones o reemplazos de residuos de aminoácidos. Un polipéptido mutante muestra una actividad insecticida mejorada o disminuida, o representa una secuencia de aminoácidos, la cual confiere actividad insecticida mejorada en un polipéptido que la contiene. De este modo, el término "mutante" o "mutación" se refiere a cualquiera o ambas de las secuencias imitantes de nucleótidos y a los aminoácidos codificados. Los mutantes pueden utilizarse solos o en cualquier combinación compatible con otros mutantes de las modalidades o con otros mutantes. Un "polipéptido mutante" puede mostrar inversamente ; una disminución en la actividad insecticida. En el caso en donde se agrega más de una mutación a un ácido nucleico o proteína particular, pueden agregarse mutaciones al mismo tiempo o secuencialmente; si es secuencialmente, las mutaciones pueden agregarse en cualquier orden adecuado.

Como se utiliza en la presente,, el término "actividad insecticida mejorada" o "actividad pesticida mejorada" se refiere a un polipéptido insecticida de las modalidades que tiene una actividad insecticida mejorada con relación a la actividad de su proteína de tipo silvestre correspondiente, y/o un polipéptido insecticida que es i ; efectivo contra un intervalo más amplio de insectos, y/o un polipéptido insecticida qüe tiene especificidad para un insecto que no es susceptible a la toxicidad de la proteína de tipo silvestre. Un hallazgo de una actividad pesticida mejorada ' o acentuada requiere una demostración de un incremento de la actividad pesticida de por lo menos 10%, contra el insecto objetivo, o por lo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200% o 300% o un incremento mayor de la actividad pesticida con relación a la actividad pesticida del polipéptido insecticida de tipo silvestre determinado contra el mismo insecto.

Por ejemplo, se proporciona una actividad pesticida o insecticida mejorada en donde un intervalo más amplio o más estrecho de insectos se impacta por el polipéptido con relación al intervalo de insectos que es afectado por una toxina de tipo silvestre. Puede ser deseable un intervalo más amplio de impacto, en caso! én donde se desee versatilidad, mientras un intervalo más j estrecho de impacto puede ser deseable, ! en caso en donde por ejemplo, insectos útiles puedan ser impactados de ; otra forma mediante el uso o presencia de la toxina. Aunqué las modalidades no se unen por i ningún mecanismo de acción particular, puede también proporcionarse una actividad pesticida mejorada mediante cambios en una o más características de un polipéptido; por ejemplo, la estabilidad o longevidad de un polipéptido en el intestino de un insecto puede incrementarse con relación a la estabilidad o longevidad dé una proteína de tipo silvestre correspondiente.

El término "toxina" como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido \ que muestra actividad pesticida o actividad : insecticida o 'actividad pesticida mejorada o I t actividad; insecticida mejorada. La toxina del "Bt" o "Bacillus thuringiensis" se pretende para incluir la clase más amplia de toxinas Cry encontradas en diversas cepas del I 1 Bt, las cuales incluyen tjales toxinas como, por ejemplo, Cryls, Cry2s o Cry3s. \ Los términos "sitio proteolítico" o "sitio de desdoblamiento" se refieren i¡a una secuencia de aminoácidos la i cual confiere sensibilidad ' a una clase de proteasas o una proteasa particular de manera! que un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos se digiere mediante la clase de proteasas o proteasa particular. Se dice que un sitio proteolítico es "sensible" a la o las proteasas que reconocen aquel sitio. Se aprecia en la técnica que la eficiencia de digestión variará, y que una disminución en la eficiencia de digestión ; uede conducir a un incremento en la estabilidad o longevidad del polipéptido en el intestino de un insecto. De este modo, un sitio proteolítico puede conferir sensibilidad a más de una proteasa o clase de proteasas, aunque la eficiencia de la digestipn en ese sitio por diversas proteasas puede variar. Los sitios proteolíticos incluyen, por ejemplo, sitios tripsina y sitios elastasa.

La investigación ha demostrado que las proteasas de intestino de insectos de Lepidópteros incluyen tripsinas, quimiotripsinas y elastasas!. Véase por ejemplo, Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212; y Hedegus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53:30-47. Por ejemplo, aproximadamente 18 diferentes tripsinas han sido encontradas en el intestino medio de la larva Helicoverpa armígera (véase Gatehouse et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27:929-944). Se han investigado los sitios del sustrato proteolítico preferidos de estas proteasas. Véase, por ejemplo, Peterson et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25:765-774. i .

Se han hecho esfuerzos para entender el mecanismo de acción de las toxinas del Bt y para diseñar toxinas con propiedades mejoradas. Se há demostrado que las proteasas del intestino del insecto pueden afectar el impacto de las proteínas , Cry del Bt en el insecto. Algunas proteasas activan las proteínas Cry procesándolas desde una forma de "protoxina" en una forma tóxica o "toxina". Véase, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys . 42: 1-12; y Carroll et al. (1997) J. invertebrate Pathology 70: 41-49. Esta activación de la toxina puede incluir la remoción de los péptidos N y C terminales a partir de la proteína y puede también incluir desdoblamiento interno de la. proteína. Otras proteasas pueden degradar las proteínas Cry. Véase Oppert, ibid.

Una comparación de las secuencias de aminoácidos de toxinas Cry de diferentes especificidades revela cinco bloques de secuencias altamente conservados. Estructuralmente, las toxinas comprenden tres distintos dominios los cuales son, desde el término N al C: un grupo de siete alfa-hélices implicadas en la formación de poros (indicada como "dominio 1"), tres láminas beta anti-paralelo implicadas en la unión celular (indicada como "dominio 2") y un beta sándwich (indicado como "dominio 3"). La ubicación y propiedades de estos dominios se conocen por aquellos expertos en la técnica. Véase por ejemplo, Li et al. (1991) Nature, 305:815-821 y Morsé et al. (2001) Structure, 9:409-417. Cuando se hace referencia a un dominio particular, tal como el dominio 1, se entiende que los parámetros exactos del dominio con respecto a una secuencia particular no son críticos siempre y cuando la secuencia o porción de la misma incluya una secuencia que proporcione por lo menos alguna función atribuida al dominio particular. De este modo, por ejemplo, cuando se refiere al "dominio 1", se pretende que una secuencia particular incluya un grupo de siete alfa-hélices, aunque los parámetros exactos de la secuencia utilizados o referidos con respecto a aquel grupo no son críticos. Un experto en la técnica está familiarizado con la determinación de tales parámetros y la evaluación de tales funciones .

En un esfuerzo para caracterizar mejor y mejorar las toxinas del Bt, se estudiaron las cepas de la bacteria del Bt. Las preparaciones cristalinas preparadas a partir del cultivo de las cepas del Bt fueron descubiertas por tener actividad pesticida contra barrenador europeo del maíz y gusano elotero (véase por ejemplo, Ejemplos Experimentales 1, 2, 3). Se llevó a cabo un esfuerzo para identificar las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas cristalinas a partir de las cepas seleccionadas, y los ácidos nucleicos de tipo silvestre (es decir, de origen natural) de las modalidades se aislaron a partir de estas cepas bacterianas, se clonaron en un vector de expresión y se transformaron en E. coli. Dependiendo de las características de una preparación dada, se reconoció que la demostración de ( f I la actividad pesticida algunas veces requiere un pre-tratamiento de tripsina | para activar las proteínas pesticidas. De este modo, se entiende que algunas proteínas pesticidas requieren digestión de proteasas (por e emplo, mediante ; tripsina, quimiotripsina y similares) para activación, mientras otras proteínas son biológicamente i activas (por ejemplo, pesticidas) en la ausencia de activación. ', .Tales moléculas pueden alterarse mediante medios descritos,; por ejemplo, en las Solicitudes Estadounidenses Nos. 10/606,320, presentada el 25 de junio de 2003, y 10/746,914, presentada el 24' de diciembre de 2003. Además, las secuencias de ácido ¡ nucleico pueden diseñarse para i codificar : polipéptidos que j contienen mutaciones adicionales que confieren actividad pesticida mejorada o alterada con relación a la actividad pesticida del polipéptido de origen natural. Las secuencias de: nucleótidos de tales ácidos nucleicos ' diseñados comprenden mutaciones no encontradas en las secuencias de tipo silvestre.

¡ ;Los polipéptidos ; imitantes de las modalidades, se preparan generalmente mediante un proceso el cual implica las ; i etapas de: obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica ,un polipéptido de la familia Cry, analizando la estructura del polipéptido para identificar sitios "objetivo" particulares para mutagéiiesis de la secuencia de gen i i subyacente con base en una consideración de la función propuesta del dominio objetivo en el modo de acción de la toxina; introduciendo una j o más mutaciones dentro de la secuencia, de ácidos nucleicos > para producir un cambio deseado en uno o más residuos de: aminoácidos de la secuencia de polipéptidos codificados; ¡ ¡y evaluando el polipéptido producido : para actividad pesticida.

Muchas de las toxinas insecticidas del Bt se relacionan con diversos grados por similaridades en sus secuencias de aminoácidos y; estructura terciaria y medios para obtener las estructuras; cristalinas de toxinas del Bt ; „ i bien conocidas. La solución de estructura cristalina de alta resolución ejemplar de ambos : olipéptidos Cry3A y Cry3B se encuentran disponibles en la literatura. La estructura solucionada del gen Cry3A ;(Li et al. (1991) Nature 353:815-821) proporciona una visión de la relación entre la estructura y la función de la toxina. Una consideración combinada' del análisis estructural publicado de toxinas del Bt y la; función reportada asociada con las estructuras particulares, motivos y similares indica que las regiones específicas de la toxina ' se correlacionan con funciones particulares y etapas discretas del modo de acción de la proteína.: Por ejemplo, muchas toxinas aisladas a partir del Bt se des.criben generalmente al comprender tres dominios: un grupo de siete hélices que ¡está implicado en la formación de ¡ ; i I 1 poro, un dominio de tres láminas que ha estado implicado en la unión de receptor, y un motivo de beta sándwich (Li et al. (1991) Nature 305:815-821) .

Como se reportó en la Patente Estadounidense No. 7,105,332, y la Solicitud Estadounidense pendiente No. 10/746,914, presentada el 24 de diciembre de 2003, la toxicidad de las proteínas Cry puede mejorarse seleccionando la región ubicada entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 de la toxina. La teoría partió de un conjunto de conocimientos con relación a toxinas insecticidas, incluyendo: 1) que las hélices alfa 4 y 5 del dominio 1 de las toxinas Cry3A se han reportado para insertar dentro de la bicapa de lípidos del revestimiento celular del intestino medio de insectos susceptibles (Gazit et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 12289-12294); 2) el conocimiento de la ubicación de sitios de desdoblamiento de la tripsina y la quimiotripsina dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína de tipo silvestre; 3) la observación de que la proteína de tipo silvestre fue más activa contra ciertos insectos después de la activación in vitro mediante tratamiento con tripsina o quimiotripsina; y 4) reporta que la digestión de toxinas a partir del extremo 3' resultó en toxicidad , disminuida en insectos.

Puede crearse una serie de mutaciones y colocarse en una variedad de secuencias de fondo para crear polipéptidos novedosos que tienen actividad pesticida mejorada o alterada. Véase, por ejemplo, las Solicitudes Estadounidenses Nos. 10/606i 320, presentada el 25 de junio de 2003, ahora abandonada, y la 10/746,914, presentada el 24 de diciembre de 2003. Estos mutantes incluyen, aunque no se limitan a: la adición de por lo menos uno o más sitios sensibles a proteasa (por ejemplo, sitio de desdoblamiento de tripsina) en la región ubicada entre las hélices 3 y 4 del dominio 1; el reemplazo de un sitio sensible a proteasa, original en la secuencia de tipo silvestre con un sitio sensible a proteasa diferente; la adición de múltiples sitios sensibles a proteasa en una ubicación particular; la adición de residuos de aminoácidos; cerca del o de los sitios sensibles a proteasa para alterar el pliegue del polipéptido y de este modo mejorar la digestión del polipéptido en el o los sitios sensible a proteasa; y agregando mutaciones para proteger el polipéptido a partir de la digestión degradativa que reduce toxicidad (por ejemplo, realizando una serie de mutaciones en donde el aminoácido de tipo silvestre se reemplaza mediante valina para proteger el polipéptido de la digestión) . Pueden utilizarse mutaciones individualmente o en cualquier combinación para proporcionar polipéptidos de las modalidades.

De esta manera, las modalidades proporcionan secuencias que comprenden una variedad de mutaciones, tal como, por ejemplo, una mutación que comprende un sitio sensible a la proteasa, adicional o alternativo ubicado entre alfa-hélices 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado. Una mutación la cual es un sitio sensible a la proteasa adicional o alternativo puede ser sensible a diversas clases de proteasas tal como proteasas de serina, las cuales incluyen tripsina y quimiotripsina, o enzimas tal como elastasa. De este modo, puede diseñarse una mutación la cual es un sitio sensible a la proteasa adicional o alternativo de manera que el sitio se reconozca y/o desdoble fácilmente mediante una categoría de iproteasas, tal como proteasas de mamífero o proteasas de insectos. Un sitio sensible a la proteasa puede también diseñarse para desdoblarse mediante una clase particular de enzimas o una enzima particular conocida para ser producida en un organismo, tal como, por ejemplo, una quimiotripsina producida mediante el gusano elotero Heliothis zea (Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212). Las mutaciones pueden también conferir resistencia a la digestión proteolítica, por ejemplo, para digestión mediante quimiotripsina en el término C del péptido.

La presencia de 'un sitio sensible a la proteasa adicional y/o alternativo en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado puede mejorar la actividad pesticida y/o la especificidad del ; polipéptido codificado por los ácidos nucleicos de las modalidades. Por consiguiente, las secuencias de nucleotidos de las modalidades pueden diseñarse o manipularse recombinantemehte para producir polipéptidos que tienen una actividad insecticida mejorada o alterada y/o una especificidad en comparáción con aquella de una toxina de tipo silvestre no modificada. Además, las mutaciones descritas ' en la presente pueden colocarse en o utilizarse junto con otras secuencias¦ de nucleotidos para proporcionar propiedades mejoradas. Por ejemplo, un sitio sensible a la proteasa que es fácilmente desdoblada mediante quimiotripsina de insecto, por ejemplo, una quimiotripsina encontrada en el gusano soldado o el gusano elotero (Hegedus et al. (2003) Arch. Inséct Biochem. Physiol. 53:30-47; y Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212), puede colocarse en una secuencia de fondo ; Cry para proporcionar toxicidad mejorada a aquella secuencia .' De esta manera, las modalidades proporcionan polipéptidos tóxicos con propiedades mejoradas.

Por ejemplo, una secuencia de nucleótido Cry mutagenizada puede comprender mutantes adicionales que comprenden codones adicionales que introducen una segunda secuencia.de aminoácidos sensible a la tripsina (además del sitio de tripsina de origen natural) en el polipéptido codificado. Una mutante de adición alternativa de las modalidades comprende codones adicionales diseñados para introducir por lo menos un diferente sitio sensible a la proteasa adicional en el polipéptido, por ejemplo, un sitio sensible a quimiotripsina ubicado inmediatamente 5' o 3' del sitio de tripsina de origen | natural . Alternativamente, pueden crearse los mutantes de sustitución, en los cuales por lo menos un codón del ácido nucleico que codifica el sitio sensible a la proteasa de origen natural se destruye y los codones alternativos se introducen dentro de la secuencia de ácido nucleico con el fin de proporcionar un diferente sitio sensible ,a la proteasa (por ejemplo, sustituto). Puede también agregarse un mutanté de reemplazo a una secuencia Cry en la cual el sitio de desdoblamiento de tripsina de origen natural presente en el polipéptido codificado se destruye y se introduce un sitio de desdoblamiento de quimiotripsina o elastasa en su lugar.

Se reconoce que cualquier secuencia de nucleótido que codifica las secuencias de aminoácidos que son sitios proteoliticos o supuestos sitios proteoliticos (por ejemplo, secuencias tales como NGSR, RR o LKM) pueden utilizarse y que la identidad exacta de los codones utilizados para introducir cualquiera de estos sitios de desdoblamiento dentro de un polipéptido variante pueden variar dependiendo del uso, es decir, la expresión en una especie vegetal particular. Se reconoce también que cualesquiera mutaciones descritas pueden introducirse en cualquier sécuencia de polinucleotidos de las modalidades que comprende los codones para residuos de aminoácidos que proporcionan el sitio de desdoblamiento de tripsina nativa que está dirigida mediante modificación. Por consiguiente, variantes de toxinas de longitud total o de fragmentos de las mismas, pueden modificarse para contener sitios de desdoblamiento adicionales o alternativos, y estas modalidades se pretenden para estar incluidas por el alcance de las modalidades descritas en la presente.

;Se apreciará por , aquellos expertos en la técnica que puede¦ agregarse cualquier mutación útil a las secuencias de las modalidades siempre y cuando los polipéptidos codificados retengan la actividad pesticida. De este modo, las secuencias pueden también mutarse de manera que los polipéptidos codificados sean resistentes a digestión proteolítica mediante quimiotripsina . Más de un sitio de reconocimiento puede agregarse en una ubicación particular en cualquier combinación, y múltiples sitios de reconocimiento pueden agregarse a o removerse desde la toxina. De este modo, mutaciones adicionales pueden comprender tres, cuatro o más sitios de reconocimiento. Se reconocerá que múltiples mutaciones pueden diseñarse en cualquier secuencia de polinucleótido adecuada; por consiguiente, cualesquiera secuencias o fragmentos dé longitud total de las mismas pueden modificarse para contener sitios de desdoblamiento adicionales o alternativos asi como son resistentes a digestión proteolítica. De esta manera, las modalidades I proporcionan toxinas Cry que contienen mutaciones que mejoran la actividad pesticida así como composiciones y métodos mejorados para impactar plagas utilizando otras toxinas del Bt.

Las mutaciones pueden proteger al polipéptido de la degradación de la proteasa, por ejemplo, removiendo supuestos sitios proteolíticos tal como supuestos sitios de proteasas de serina ' y sitios de reconocimiento de elastasa a partir de diferentes áreas. Algunos o ' todos los supuestos sitios pueden removerse o alterarse de manera que la proteolisis en la ubicación del sitio original se disminuya. Pueden evaluarse cambios en proteolisis comparando un polipéptido mutante con toxinas de tipo silvestre o comparando toxinas mutantes las cuales difieren en su secuencia de aminoácidos. Los supuestos sitios proteolíticos y sitios proteolíticos incluyen, aunque no se limitan a, las siguientes secuencias: RR, un sitio de desdoblamiento de tripsina; LKM, un sitio de quimiotripsina; y NGSR, un sitio de tripsina. Estos sitios pueden alterarse mediante la adición o eliminación de cualquier número o clase de residuos de aminoácidos, siempre y cuando la actividad pesticida del polipéptido se, incremente. De este modo, los polipéptidos codificados mediante secuencias de nucleótido que comprenden mutaciones comprenderán por lo menos un cambio i o adición de aminoácidos con relación a la secuencia nativa o de fondo, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, i 250, 260, 270, ó 280 o más cambios o adiciones de aminoácidos. La actividad pesticida de un polipéptido puede también mejorarse mediante truncamiento de la secuencia nativa o de longitud total, como se conoce en la técnica.

Las composiciones de las modalidades incluyen ácidos nucleicos, y fragmentos y variantes de los mismos, que codifican polipéptidos pesticidas. En particular, las modalidades determinan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, o las secuencias de nucleotidos que codifican la secuencia de aminoácidos, por ejemplo,. la secuencia de nucleotidos establecida en la SEQ ID NO: 1, y fragmentos y variantes de los mismos. ¡ También, de forma interesante, se optimizan secuencias de nucleotidos que codifican las proteínas pesticidas de las modalidades. Como se utiliza en la presente, la frase "secuencias de nucleotidos optimizadas" se refiere a los ácidos nucleicos que se optimizan para expresión^ en un organismo particular, por ejemplo, una planta. Pueden prepararse' secuencias de nucleotidos optimizadas para cualquier; organismo de interés utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, las Solicitudes Estadounidenses Nos. 10/606,320, presentada el 25 de junio de 2003, ahora abandonada, y 10/746,914, presentada el 24 de diciembre de 2003, las cuales describen una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica una proteína pesticida descrita. En este ejemplo, se preparó la secuencia de nucleótido al traducir de forma inversa la secuencia de aminoácidos de la proteína y cambiando la secuencia de nucleótidos de manera que comprenda codones de maíz preferidos, mientras se codifica aún la misma secuencia de aminoácidos. Este procedimiento se describe en más detalle por Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477,498. Las secuencias de nucleótidos optimizados encuentran uso al incrementar la expresión de una proteína pesticida en una planta, por ejemplo, las plantas monocotiledóneas de la familia de las Gramíneas (Poaceae) tal como, por ejemplo, una planta de maíz o gramínea.

Las modalidades además proporcionan polipéptidos pesticidas aislados (por ejemplo, insecticida) codificados mediante cualquier ácido nucleico de origen natural o modificado de las modalidades. Más específicamente, las modalidades proporcionan polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos establecidos en la SEQ ID NO: 2, y los polipéptidos codificados mediante ácidos nucleicos descritos en la presente, por ejemplo, aquellos establecidos en la SEQ ID NO: 1, y fragmentos y variantes de los mismos.

En las modalidades particulares, las proteínas pesticidas de las modalidades proporcionan polipéptidos insecticidas de longitud total, fragmentos de polipéptidos insecticidas de longitud total, y polipéptidos variantes que se producen a partir de ácidos nucleicos mutagenizados diseñados ; para introducir secuencias de aminoácidos particulares en polipéptidos de las modalidades. En modalidades particulares, las secuencias de aminoácidos que se introducen en los polipéptidos comprenden una secuencia que proporciona un sitio de desdoblamiento para una enzima tal como una proteasa.

Se conoce en la técnica que la actividad pesticida de toxinas del Bt se activa típicamente mediante el desdoblamiento del péptido en el intestino del insecto mediante varias proteasas . Debido a que los péptidos no pueden desdoblarse siempre con eficiencia completa en el intestino del insecto, los fragmentos de una toxina de longitud total pueden tener actividad pesticida mejorada en comparación con la toxina de longitud total misma. De este modo, algunos de los polipéptidos de las modalidades incluyen fragmentos de un polipéptido insecticida de longitud total, y algunos de los fragmentéis polipeptídicos , variantes, y mutaciones tendrán una actividad pesticida mejorada con relación a la actividad del ¡ polipéptido insecticida de origen natural a partir del cual se derivan, particularmente si el polipéptido insecticida de ' origen natural no se activa in vi tro con una proteasa antes de una selección para actividad. De este modo, la presente solicitud abarca versiones truncadas o fragmentos de las secuencias .

Las mutaciones pueden colocarse en cualquier secuencia de fondo, incluyendo tales polipéptidos truncados, siempre y cuando el polipéptido retenga una actividad pesticida. Alguien con experiencia en la técnica puede fácilmente comparar dos o más proteínas con respecto a la actividad pesticida utilizando ensayos conocidos en la técnica o descritos en algún otro lado en la presente. Se entenderá que los polipéptidos de las modalidades pueden producirse ya sea mediante expresión de un ácido nucleico descrito en la presente, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándar.

Se reconoce que las proteínas pesticidas pueden ser oligoméricas y variarán en peso molecular, número de residuos, péptidos componentes, actividad contra plagas particulares y otras características. Sin embargo, mediante métodos establecidos en la presente, pueden aislarse y caracterizarse proteínas activas contra una variedad de plagas. Las proteínas pesticidas de las modalidades pueden utilizarse en combinación con otras toxinas del Bt u otras proteínas insecticidas para incrementar un intervalo recomendado. Además, el uso de las proteínas pesticidas de las modalidades en combinación con otras toxinas del Bt u otros principios insecticidas de una distinta naturaleza tiene utilidad particular para la prevención y/o manejo de resistencia a insectos. Otros agentes insecticidas incluyen inhibidores de proteasa (tanto tipos serina como cisteína) , a-amilasa y peroxidasa.

Los fragmentos y \ variantes de las secuencias de nucleotidos y aminoácidos y¡lós polipéptidos codificados, por lo que también están abarcados mediante las modalidades. Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia de nucleotidos de un polinucleótido o una porción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de las modalidades. Los fragmentos de una secuencia de nucleotidos pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína nativa o de longitud total correspondiente y por lo tanto posee actividad pesticida. De este modo, se reconoce que algunas de las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de las modalidades pueden referirse correctamente tanto a fragmentos como a mutantes.

Se entenderá que: el término "fragmento" como se j utiliza para referirse a secuencias de ácido nucleico de las modalidades, también abarca secuencias que son útiles como sondas de hibridización. Esta clase de secuencias de nucleotidos generalmente no codifican proteínas de fragmentos que retienen una actividad biológica. De este modo, los fragmentos de una secuencia de nucleotidos pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleotidos, aproximadamente 50 nucleotidos, aproximadamente 100 nucleotidos y hasta la secuencia de nucleotidos de longitud total que codifica las proteínas de las modalidades.

Un fragmento de una secuencia de nucleotidos de las modalidades que codifica una porción biológicamente activa de una proteína pesticida de las modalidades codificará por lo menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100 ó 1,200 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido pesticida de las modalidades (por ejemplo, 1163 aminoácidos para la SEC de IDENT. NO: 2) . De este modo, se entiende que las modalidades también abarcan polipéptidos que son fragmentos de las proteínas pesticidas ejemplares de las modalidades y teniendo longitudes de por lo menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100 ó 1,200 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido pesticida de las modalidades (por ejemplo, 711 aminoácidos para la SEC. DE IDENT. NOs : 2). Los fragmentos de una secuencia de nucleotidos de las modalidades que son útiles como sondas de hibridización o cebadores de PCR no necesitan generalmente I codificar una porción biológicamente activa de una proteína pesticida. De este modo, un fragmento de ácido nucleico de las modalidades puede codifica una porción biológicamente activa de una proteína pesticida, o puede ser un fragmento que puede utilizarse como: una sonda de hibridización o cebador de PCR utilizando métodos descritos en la presente. Puede prepararse una porción biológicamente activa de una proteína pesticida aislando una porción de una de las secuencias de nucleotidos de las modalidades, expresando la porción codificada de la proteína pesticida (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la poción codificada de la proteína pesticida.

Los ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleotidos de ; las modalidades comprenden por lo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 1,800 ó 2,000 nucleotidos, o hasta el número de nucleotidos presente en una secuencia de nucleotidos i descrita en la presente (por ejemplo, 2,136 nucleotidos para la SEQ ID NO: 1). Modalidades particulares visualizan fragmentos derivados de (por ejemplo, producidos de) un primer ácido nucleico de las modalidades, en donde el fragmento codifica una toxina truncada caracterizada por una actividad pesticida. Los polipéptidos truncados codificados mediante los fragmentos de polinucleótidos de las modalidades se caracterizan mediante actividad pesticida que es ya sea equivalente a, o se mejora, con relación a la actividad del polipéptido de longitud total correspondiente codificado por el primer ácido nucleico a partir del cual se deriva el fragmento. Se visualiza que tales fragmentos de ácido nucleico de las modalidades pueden truncarse en el extremo 3' de la secuencia de codificación de longitud total nativa o correspondiente. Los fragmentos de ácido nucleico pueden también truncarse en ambos extremos 5' y 3' de la secuencia del codificación de longitud total correspondiente.

El término "variantes" se utiliza en la presente para referirse a secuencias sustancialmente similares. Para secuencias de nucleótidos, las variantes moderadas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degradación del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos pesticidas de las modalidades. Variantes alélicas de origen natural como éstas pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tal como, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de hibridizacion como se describe en la presente.

Secuencias de , nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas, tal como aquellas generadas, por ejemplo, utilizando mutagénesis sitio-dirigida, aunque codificará una proteína pesticida de las modalidades, tal como una toxina mutante.

Generalmente, variantes de la secuencia de nucleótidos particular de las modalidades tendrán por lo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia para aquella secuencia de nucleótidos particular como se determina mediante programas de alineación de secuencia descritos en algún otro lugar en la presente utilizando parámetros implícitos. Una variante de una secuencia de nucleótidos de las modalidades puede diferir de aquella secuencia tan sólo como 1-15 nucleótidos, tan sólo 1-10, tal sólo 6-10, tan sólo 5, tan sólo 4, 3, 2 o incluso 1 nucleótido .

Las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de las modalidades (es decir, una secuencia de nucleótidos ejemplar) pueden también evaluarse contrario al porcentaje de identidad de secuencias entre el polipéptido codificado mediante una secuencia de nucleótidos variante y el polipéptido codificado mediante la secuencia de nucleótidos de referencia.; De este modo, por ejemplo, se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido con un porcentaje dado de identidad de secuencia al polipéptido de la SEQ ID NO: 2. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualquiera de los dos polipéptidos puede calcularse utilizando programas de alineación de secuencia descritos en algún lugar en: la presente utilizando parámetros implícitos. En el caso en donde cualquier par dado de polinucleótidos de las modalidades se evalúa contrario del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% en general por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, 99% o más de identidad de secuencia.

Como se utiliza en la presente, el término "proteína variante" abarca polipéptidos que son derivados de una proteína nativa mediante: eliminación (supuestamente truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos del extremo N terminal y/o C terminal de la proteína nativa; la eliminación o adición de urto o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Por consiguiente, el término "proteína variante" abarca fragmentos biológicamente activos de una proteína nativa que comprende un número suficiente de residuos de aminoácidos contiguos para retener la actividad biológica de la proteína nativa, es decir, tiene actividad pesticida. Tal actividad pesticida puede ser diferente o mejorarse con relación a la proteína nativa o puede ser inalterada, siempre y cuando se retenga la actividad pesticida.

Las proteínas variantes abarcadas mediante las modalidades son biológicamente activas, es decir, siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad pesticida como se describe en la presente. Tales variantes pueden resultar a partir de, por ejemplo, un polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína pesticida ; nativa de las modalidades tendrá por lo menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a: la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa como se determina mediante programas de alineación de secuencia descritos en algún lugar en la presente utilizando parámetros implícitos. Una variante biológicamente activa de una proteína de las modalidades puede diferirse de aquella proteína tan sólo 1-15 residuos de aminoácidos, tan sólo 1-10, tal como 6-10, tan sólo 5, tan sólo 4, 3, 2 o incluso 1 residuo de aminoácido.

Las modalidades además abarcan un microorganismo que se transforma con por lo menos un ácido nucleico de las modalidades, con un cásete de expresión que comprende el ácido nucleico, o con un vector que comprende el cásete de expresión. En algunas modalidades, el microorganismo es aquel que se multiplica en las plantas. Una modalidad de la invención se relaciona con una proteína pesticida encapsulada, la cual comprende un microorganismo transformado capaz de expresar por lo menos una proteína pesticida de las modalidades .

Las modalidades proporcionan composiciones pesticidas que comprenden un microorganismo transformado de las modalidades. En tales modalidades, el microorganismo transformado se presenta ! en general en la composición pesticida en una cantidad pesticidamente efectiva, junto con un portador adecuado. Las ; modalidades también abarcan composiciones pesticidas que comprenden una proteína aislada de las modalidades, solas o en combinación con un organismo transformado de las modalidades y/o una proteína pesticida encapsulada de las modalidades, en una cantidad insecticidamente efectiva, junto con un portador adecuado.

Las modalidades además proporcionan un método para incrementar el intervalo determinado de insectos utilizando una proteína pesticida de las modalidades en combinación con por lo menos otra o una "segunda" proteína pesticida. Cualquier proteína pesticida conocida en la técnica puede emplearse en los métodos de1 las modalidades. Tales proteínas pesticidas incluyen, aunque' rio se limitan a toxinas del Bt, I inhibidores de proteasa, a-ámilasa y peroxidasas .

Las modalidades también abarcan plantas transformadas o transgénicas que comprenden por lo menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades. En algunas modalidades, la planta se transforma establemente con una construcción de nucleótidos que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades operablemente enlazadas a un promotor que conduce expresión en una célula vegetal. Como se utiliza en la presente, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" se refieren a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra establemente dentro del genoma de una planta transgénica o transformada de manera que el polinucleótido sea transferido a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede ser integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante.

Se debe entender que como se utiliza en la presente, el término " transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte vegetal o planta del genotipo el cual ha sido alterado mediante la presencia del ácido nucleico heterólogo incluyendo aquellos transgénicos inicialmente así alterados, así como aquellos creados mediante cruzamiento sexual o propagación asexual desde el transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente, no abarca la alteración del genoma (cromosomal o extra-cromosomal ) mediante métodos de reproducción convencional de plantas o mediante eventos de origen natural tales como fertilización cruzada al azar, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante , transposición no recombinante o mutación espontánea .

Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye plantas completas, partes de las plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales y progenie de las mismas. Partes de las plantas transgénicas están dentro del alcance de las modalidades y comprende, por ejemplo, células vegetales, protoplastos , tejidos, callos, embriones así como flores, tallos, frutos, hojas y raíces que se originan en plantas transgénicas o su progenie previamente transformada con una molécula de ADN de las modalidades y por lo tanto consisten por lo menos en parte de células transgénicas.

Como se utiliza en la presente, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales pueden regenerarse las plantas, callos de las plantas, arbustos y células vegetales que están intactas en plantas o partes de las plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, fruto, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, puntas radiculares, anteras, y similares. La clase de plantas que puede utilizarse en los métodos de las modalidades es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores sensibles a técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Tales plantas incluyen, por ejemplo, Solanu tuberosum y Zea mays .

Aunque las modalidades no dependen de un mecanismo biológico particular para incrementar la resistencia de una planta a una plaga en la planta, la expresión de las secuencias de nucleótidos de las modalidades en una planta pueden resultar en la producción de las proteínas pesticidas de las modalidades y en un incremento en la resistencia de la planta a una plaga en la planta. Las plantas de las modalidades encuentran uso en la agricultura en métodos para impactar insectos nocivos. Ciertas modalidades proporcionan plantas de cultivos transformados, tal como por ejemplo, plantas de maíz, las cuales encuentran uso en métodos para impactar insectos nocivos de la planta, tal como por ejemplo, barrenador europeo del maíz y gusano elotero.

Una "planta objeto o célula vegetal" es aquella en la cual la alteración genética, tal como la transformación, ha sido efectuada como a un gen de interés, o es una planta o célula vegetal, la cual es descendiente de una planta o célula así alterada y la cual comprende la alteración. Un "control" o "planta control" o "célula de planta control" proporciona un punto de referencia para medir cambios en el fenotipo de la planta objeto o la célula vegetal.

! ; Una planta control o célula vegetal puede comprender, por ejemplo: (ja ) una planta o célula de tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo como el material de partida para la alteración j genética, la cual resulta en la planta o célula objeto; (b)1 una planta o célula vegetal del i mismo genotipo como el material de partida, aunque el cual se ha transformado con una construcción inválida (es decir, con una construcción la cual noj tiene efecto conocido en el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador; (c) una planta p célula vegetal la cual es un segregante no transformado entre la progenie de una planta objeto o célula vegetal; ,(d) una planta o célula vegetal genéticamente idéntica a la planta objeto o célula vegetal, aunque la cual no está expuésta a condiciones o estímulos que podrían inducir expresión dél , gen de interés; o (e) la planta objeto o célula vegetal misma, bajo condiciones en las cuales el gen de : interés no se expresa.

Alguien con experiencia en la técnica reconocerá fácilmente que los avances en el campo de la biología molecular' tales como una! mutagénesis sitio-específica y aleatoria,; metodologías de reacción en cadena de polimerasa, y técnicas de diseño de proteínas proporcionan una amplia recopilación de herramientas y protocolos adecuados para su uso para alterar o diseñar ¡tanto la secuencia de aminoácidos como las : secuencias genéticas subyacentes de proteínas de i ' interés agrícola. ¡ De este modo, las proteínas de las modalidades 1 pueden alterarse en varias formas incluyendo sustituciones de i ! aminoácidos, eliminaciones,! truncamientos e inserciones. Se conocen generalmente en lia técnica métodos para tales : i manipulaciones. Por ejemplo; variantes de secuencias de i aminoácidos de las proteínas pesticidas pueden prepararse introduciendo mutaciones en, un ácido nucleico sintético (por ejemplo, molécula de ADN) .¡ Los métodos para mutagénesis y alteraciones de ácido nucl Ieico son bien conocidos en la i técnica. Por ejemplo, puedén1 introducirse cambios diseñados utilizando una técnica de mutagénesis sitio-dirigida mediada por oligonucleótidos . Véase, por ejemplo, Kunkel ( 1985 ) Proc. Nati. Acaá. Sci . USA 82 : 488 ^- 492 ; Kunkel et al. ( 1987 ) Methods in Enzymol . 154 : 367 - 382 ; Patente Estadounidense No. j 4 , 873 , 192 ; Walker y Gaastra eds . ( 193 ) Techniques in Molecular . Biology (MacMillan ublishing Company, New York) y las referencias citadas en la presente.

|Las secuencias dei nucleótidos mutagenizados de las modalidades pueden modificarse de manera que cambian aproximadamente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 8 , 10 , 12 o más de los aminoácidos presentes eri 1 la secuencia primaria del polipéptido codificado. Alternativamente, pueden introducirse incluso más cambios de la secuencia nativa de manera que la I proteína codificada pueda t|ener por lo menos aproximadamente 1% o 2% o aproximadamente 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12% o incluso aproximadámente 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25%, 30%, 35% o 40% o más de los codones alterados, o de otra manera modificados en I comparación con la próteína de tipo silvestre correspondiente. De la misma manera, la proteína codificada puede tener por lo menos aproximadamente 1% o 2%, o aproximadamente 3%, 4%, 5%,: 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12% o incluso aproximadamente 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25%, 30%, 35% o 40% o más codones adicionales en comparación con la proteína de tipo silvestre correspondiente. Se debe entender que las secuencias de nucleótidos mutagenizadas de las modalidades se pretenden para abarcar péptidos ', equivalentes, biológicamente funcionales, los cuales tienen actividad pesticida, tal como una actividad pesticida mejorada como se determina mediante propiedades anti-alimentarias contra las larvas de insectos. Tales secuencias pueden originarse como una consecuencia de exceso de codones y equivalencia funcional que se sabe tienen lugar naturalmente dentro dé las secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas.

Alguien con experiencia en la técnica podrá reconocer que las adiciones y/o sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similaridad relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su carácter hidrofóbico, carga, tamaño y similares. Los grupos de sustitución de aminoácidos ejemplares que toman en cuenta, diversas de las características anteriores son bien, conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

La guía en cuanto a sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína .de interés, puede encontrarse en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protei Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found. Washington, D.C.), incorporado en la presente para referencia. Pueden hacerse sustituciones moderadas, tal como intercambiando un aminoácido con otro que tiene propiedades similares.

De este modo, los genes y secuencias de nucleótidos de las modalidades incluyen tanto secuencias de origen natural como formas mutantes. Así mismo, las proteínas de las modalidades abarcan tanto proteínas de origen natural como variaciones (por ejemplo, polipéptidos truncados) y formas modificadas (por ejemplo, mutantes) de las mismas. Tales variantes siguen poseyendo la actividad pesticida deseada. Obviamente, las mutaciones que se harán en la secuencia de i nucleótidos que codifican :1a variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y generalmente no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de AR m secundaria. Véase, Publicación de Solicitud de Patente EP No. ' 75, 44.

I Las eliminaciones|, inserciones y sustituciones de i las secuencias de proteínas abarcadas en la presente no se espera que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargó,: cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, eliminación o inserción antes de hacerlo, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante ensayos de selección rutinarios, tal como ensayos de alimentación de insectos. i , Véase por¡ ejemplo, Marronei et al. (1985) J. Econ. Entomol . 78: 290-293 y Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485, incorporados en la présente para referencia.

:Las secuencias de ! nucleótidos variantes y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y trecombinante tal como mezclado de ADN. Con :tal procedimiento,! una o más diferentes secuencias de codificación pueden manipularse para crear una nueva proteína pesticida que posee las propiedades deseadas. De ! esta manera, se generan ¡ quimiotecas de polinucleotidos recombinantes a partir de una población de polinucleotidos de secuencias relacionadas que( comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de; secuencia sustancial y pueden recombinarse homólogamente \in vi tro o in vivo. Por ejemplo, al utilizar este proceidimiento, las secuencias de i I j : ? ; i codificación de longitud total, motivos de secuencia que i codifican un dominio de interés, o cualquier fragmento de una secuencia de nucleotidos de las modalidades, pueden mezclarse entre las secuencias de nucleotidos de las modalidades y porciones correspondientes de otras secuencias de nucleotidos Cry conocidas para obtener una nueva codificación genética para una prote na con una propiedad mejorada de interés.

Las propiedades de interés incluyen, aunque no se limitan a, la actividad pesticida por unidad de proteína pesticida, estabilidad de proteínas, y toxicidad a especies no objetivo particularmente humanas, ganado y plantas y microbios ' que expresan los polipéptidos pesticidas de las modalidades. Las modalidades no se unen mediante estrategia de mezclado particular, sólo que por lo menos una secuencia de nucleotidos de las modalidades o parte de las mismas, está implicada en tal estrategia de mezclado. El mezclado puede implicar sólo secuencias de nucleotidos descritas en la presente o pueden implicar adicionalmente el mezclado de otras secuencias de nucleotidos conocidas en la técnica. Se conocen en la técnica estrategias para mezclado de ADN. Véase por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) j. Mol. Biol . 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288- 291; y las Patentes Estadounidenses Nos. 5,605,793 y 5, 837, 458.

Las secuencias de nucleótidos de las modalidades pueden también utilizarse para aislar secuencias correspondientes a partir de otros organismos, particularmente otras bacteri .as, y más particularmente otras cepas Bacillus. De esta manera, métodos tales como PCR, hibridización y similares pueden utilizarse para identificar tales secuencias con base en su homología de secuencias a las secuencias establecidas en la presente. Las secuencias que se seleccionan con base en su identidad de secuencias a las secuencias completas establecidas en la presente o a fragmentos de los mismos están abarcadas mediante las modalidades. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descritas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivadqs de un gen ancestral común y los cuales se¡ encuentran en diferentes especies como un resultado de especiación. Los genes encontrados en diferentes especies son considerados ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas comparten identidad sustancial como se define en algún otro lado en la presente. Las funciones de ortólogos son a menudo altamente conservadas entre las especies.

En un procedimiento de PCR, los cebadores oligonucleótidos pueden diseñarse para su uso en reacciones PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores PCR y clonación de PCR se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), más adelante "Sambrook". Véase también Innis et al., eds . (1990) PCR Protocole: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York) ; and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Métodos conocidos de PCR incluyen, aunque no se limitan a, métodos que utilizan cebadores en pares, cebadores anidados, cebadores específicos sencillos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente incompatibles, y similares.

En técnicas de hibridización, se utiliza toda o parte de una secuencia de nucleotidos conocida como una sonda que se hibridiza selectivamente a otras secuencias de nucleotidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómicos clonados o fragmentos de ADNc (es decir, quimiotecas genómicas o ADNc) a partir del organismo elegido. Las sondas de hibridización pueden ser fragmentos de i ADN genómicos, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos , y pueden etiquetarse con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. De este modo, por ejemplo, las sondas para hibridización pueden hacerse etiquetando con oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias de las modalidades. Los métodos para preparación de sondas para hibridización y para construcción de ADNc y quimiotecas genómicas se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook.

Por ejemplo, una secuencia completa descrita en la presente, o una o más porciones de la misma, puede utilizarse como una sonda capaz de hibridizar específicamente a secuencias correspondientes y ARNs mensajeros. Para lograr la hibridización específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas a las secuencias de las modalidades y son generalmente por lo menos aproximadamente 10 ó 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas pueden utilizarse para ampliar secuencias Cry correspondientes a partir de un organismo seleccionado mediante PCR. Esta técnica puede utilizarse para aislar secuencias de codificación adicionales desde un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. Técnicas de hibridización incluyen selección de hibridización de quimiotecas de ADN formadas en placas (ya sea placas o colonias; véase por ejemplo, Sambrook).

La hibridizacion de tales secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones rigurosas. El término "condiciones de rigor" o "condiciones de hibridizacion rigurosas" como se utiliza en la presente se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará a su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que las otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces, 5 veces o 10 veces sobre el fondo) . Condiciones rigurosas son dependientes de secuencias y serán diferentes en distintas circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridizacion y/o condiciones de lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda, pueden identificarse (sondeo homólogo) .

Alternativamente pueden ajustarse las condiciones rigurosas para permitir alguna desigualdad en las secuencias, de modo que se detectan grados menores de similitud (sonda heteróloga) . Generalmente, una sonda es menor de aproximadamente 1000 ó 500 nucleotidos de longitud.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la ¡concentración salina es menor de aproximadamente 1.5 M de ión de Na, típicamente, alrededor de 0.01 a 1.0 M de concentración de ión de Na (u otras sales), en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleotidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor de 50 nucleotidos) . Las condiciones rigurosas pueden también lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Condiciones de bajo rigor ejemplar 'incluyen hibridización con una solución de tampón de 30 a 35% de formamida, 1M de NaCl, 1% de SDS (dodecilsulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20 x SSC = 3.0 M de NaCl/0.3 M de citrato trisódico) de 50 a 55°C. Las condiciones de rigor moderadas ejemplares incluyen hibridización en 40 a 45% de formamida, 1.0 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0.5X a IX de SSC de 55 a 60°C. Las condiciones de alto rigor ejemplares incluyen la hibridización en 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C y un lavado final en 0. IX de SSC de 60 a 65°C durante por lo menos aproximadamente 20 minutos. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1% de SDS. La duración de la hibridización es generalmente menor ;dé aproximadamente 24 horas, usualmente, alrededor de 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de lavados post-hibridización, , los factores críticos que son la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, el Tm (punto de fusión térmico) puede ser aproximadamente desde la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (% de GC) - 0.61 (% de form) -500/L; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleotidos de guanosina y citosina en el ADN, "% de form" es 1 el porcentaje de formamida en la solución de hibridización, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica definida y pH) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria hibridiza a una sonda perfectamente acoplada. Los lavados se realizan típicamente por lo menos hasta que se alcance el equilibrio y se logre un nivel de bajo fondo de hibridización, tal como durante 2 horas, 1 hora o 30 minutos.

La Tm se reduce aproximadamente 1°C para cada 1% de incompatibilidad; de este modo, Tm, la hibridización y/o condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridizar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con =90% de identidad, la Tm puede disminuirse 10°C. Generalmente, se seleccionan las condiciones de rigor que son aproximadamente 5°C más bajas que la Tm para la secuencia específica y su complemento en una resistencia iónica definida y pH. Sin. embargo, condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridización y/o lavado en 1, 2, 3 ó 4°C más bajo que la Tm; condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridización y/o un lavado en 6, 7, 8, 9, 10°C más bajo que la Tm; condiciones de rigor bajo pueden utilizar una hibridización y/o lavado en 11, 12, 13, 14, 15 ó 20°C más bajo qué la Tm.

Al utilizar la ecuación, la hibridización y composiciones de lavado, y la Tm deseada, aquellos con experiencia ordinaria en la técnica entenderán que variaciones en el rigor de hibridización y/o soluciones de lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado de incompatibilidad resulta en: una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , la concentración de SSC puede incrementarse de manera que puede utilizarse una temperatura más elevada. Una amplia guía para la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds . (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Véase también Sambrook. De este modo, secuencias aisladas que codifican una proteína Cry de las modalidades e hibridizan bajo condiciones rigurosas para las secuencias Cry descritas en la presente, o para fragmentos de las mismas, están abarcadas por las modalidades.

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos : (a) ¡"secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial " . (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, como un segmento de un ADNc o secuencia genética de longitud total, o el ADNc completo o secuencia genética. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótidos , en donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones ó eliminaciones (es decir, gaps (o huecos)) en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o eliminaciones) para alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es por lo menos de 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser 30, 40, 50, 100 o más largo. Aquellos expertos en la técnica entenderán que para evitar una alta similaridad a una secuencia de referencia debido a que para inclusión gaps en la secuencia de polinucleótidos se introduce típicamente una penalidad gap y se sustrae a partir del numéro de coincidencias.

Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. De este modo, la determinación del porcentaje de identidad de secuencias entre cualesquiera de dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de yers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith et al. (1981) Adv. Appl . Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol . 48:443-453; el método de alineación de consulta local de 48:443-453; el método de alineación de consulta local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de alineación de consulta local de Pearson y Lipman (1988) Proc . Nati. Acad. Sci . 85.-2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, como se modificó en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 : 5873-5877.

Pueden utilizarse implementaciones por computadora de estos algoritmos matemáticos para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencias. Tales implementaciones incluyen, aunque no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Inteligenetics , Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT , BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de programas GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA) . Las alineaciones que utilizan estos programas pueden realizarse utilizando los parámetros implícitos. El programa CLUSTAL se describe adecuadamente por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. ¡(1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids \ Res . 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y ¡Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol . 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) súpra. Una tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud gap de 12, y una penalidad i gap de 4 pueden utilizarse con el programa ALIGN cuando se compara con secuencias de aminoácidos . Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el ! ! algoritmo1 de Karlin yj Altschul (1990) supra. Las investigaciones de nucleotidos BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, i para obtener secuencias de nucleotidos homologas a una secuencia: de nucleotidos que codifica una proteína de las modalidades. Las investigaciones de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa j BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de las modalidades. Para obtener alineaciones gap para propósitos de comparación, Gapped BLAST (en BLAST '2.(0) pueden utilizarse como se 1 describe en Altschul et j al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente,; PSI-BLAST (en BLAST 2.0) puede i utilizarse para realizar µ??? investigación repetitiva que detecta relaciones de distancias entre las moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, pueden utilizarse los parámetros implícitos de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, | BLASTX para proteínas). Véase el sitio web del Centro ; Nacional de Información de Biotecnológica en la red mundial en ncbi.hlm.nih.gov. La alineación puede realizarse; manualmente mediante inspección.

;A menos que se ¡establezca de otra manera, los valores de identidad/similáridad de secuencias determinados en la presente, se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de ? identidad: y % de similaridad para una secuencia de nucleótidos utilizando Peso GAP de 50 y Peso de Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna . cmp; % de identidad y % de similaridad para una secuencia de aminoácidos que utiliza Peso GAP de 8 y Peso de Longitud de 2 , y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de la misma. El término "programa equivalente" como se utiliza en Í la presente, se refiere a jcualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene equivalencias de residuos ' de nucleótidos ¡ o aminoácidos idénticas y un porcentaje de identidad de i secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10 .

GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ( 1970 ) supra, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximizan el número de equivalencias y minimiza el número de gaps . GAP considera todas las posibles alineaciones y posiciones gap y crea la alineación con el número más grande de bases equivalentes y pocos gaps . Se permite la provisión de una penalidad de creación gap y una penalidad de extensión gap én unidades de bases equivalentes. GAP debe hacer una serie de ganancia de penalidad de creación gap de equivalencias para ¡cada gap que se inserta. Si una penalidad de extensión gap es mayor de cero, se elige, GAP debe, además, hacer una ganancia para cada gap insertado de la longitud del tiempo ga 1 a la penalidad de extensión gap. Los valores de penalidad de creación de gap implícitos y los valores de penalidad de extensión gap en Versión 10 del Paquete de Programas GCG wísconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2 , respectivamente. Para secuencias de nucleótidos, la penalidad de creación gap implícita es 50 mientras la penalidad de extensión gap implícita es 3 . Las penalidades de creación gap y de extensión gap pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 0 a 200 . De este modo, por ejemplo, las penalidades de creación gap y de extensión gap i ; ? pueden ser O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor.

GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Existen muchos miembros de esta familia, aunque ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP despliega cuatro figuras de ventajas para alineaciones: Calidad, i Relación, ' Identidad y Similaridad. La calidad es la medida maximizadá con el fin de alinear las secuencias. La relación en la calidad dividida por ¡el número de bases en el segmento más corto. El porcentaje de1 identidad es el porcentaje de ! i símbolos que en realidad coinciden. El porcentaje de similaridad es el porcentaje de los símbolos que son similares. Se ignoran los ¡símbolos que se cruzan desde los gaps . Ona- similaridad se clasifica cuando el valor de matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor de o igual a 0.50, el' umbral de similaridad. La matriz de puntuación utilizada en la Versión 10 del Paquete de Programas GCG Wisconsin1 Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sei . , USA 89:10915) . (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en1 el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación específica. Cua'ndo el porcentaje de identidad de : i ; ¡ j ; i secuencia se utiliza con referencia a las proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos, las cuales no son idénticas, a menudo difieren de sustituciones de aminoácidos conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos son sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o carácter hidrofílico) y por lo tanto no se cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren de tales sustituciones conservadoras se dice que tienen "similaridad de secuencia" o "similaridad". Medios para realizar este ajuste 1 son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Típicamente, esto implica clasificar una sustitución conservadora como parcial en lugar de una incompatibilidad total, por lo que se incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. De este modo, por ejemplo, en el caso en donde un aminoácido idéntico da una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora da una puntuación de cero, una sustitución conservadora da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, cuando se implementa en el programa PC/GENE ¡(Intelligenetics, Mountain View, California) . '. (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en , donde la porción de la secuencia de polinucleótidós en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (por ejemplo, gaps) cuando se compara con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o eliminaciones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica o el residuo de aminoácidos tiene lugar en ambas secuencias para producir el número de posiciones equivalentes, dividiendo el número de posiciones equivalentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. (e) (i) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidós significa que un polinucleotido comprende una secuencia que tiene por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% o más de identidad de secuencia, cuando se compara con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos utilizando parámetros estándares. Alguien cón experiencia en; la técnica reconocerá que estos valores puedan ajustarse apropiadamente para determinar una identidad correspondiente de . proteínas codificadas mediante ; i I dos secuencias de nucleotidos, teniendo en cuenta una degeneración de codón, similaridad de aminoácidos, colocación i í del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos generalmente significa identidad de secüericias de por lo menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% o más de identidad de secuencia. i ' :Otra indicación j de que las secuencias de ? nucleótidcs son sustancialmente idénticas, es si dos moléculas hibridizan entrej sí bajo condiciones rigurosas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C más¡ bajas que la Tm para la secuencia específica en una resistencia iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones rigurosas abarcan temperaturas en el I intervalo de aproximadamente 1°C a aproximadamente 20°C más baja que la Tm, dependiendo del grado deseado de rigor como se califica en la presente. Los ácidos nucleicos que no hibridizan entre sí bajo · condiciones rigurosas, son aún sustancialmente idénticos si los polipéptidos codificados son sustancialmente idénticos, i Esto puede ocurrir, por ejemplo cuando sei crea una copia dé un ácido nucleico utilizando la i degeneración de codón máxima permitida por el código genético. , Una indicación 'de que dos secuencias de ácido nucleico , son sustancialmente idénticas es cuando el i ; polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente de reacción cruzada con el polipéptido I I ; i ii codificado por el segundo ácido nucleico. (e)(ii) El término^ "identidad sustancial" en el contexto del péptido indica que un péptido comprende una secuencia con por lo menos '70%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad: de secuencia a una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación' específica. La alineación óptima para estos propósitos pueide ser conducida utilizando el algoritmo; de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) supra. Una indicación de que dos secuencias peptídicas son sustancialmente idénticas; es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos planteados contra el segundo péptido. De' este modo, un péptido es sustancialmente idéntico a i un segundo péptido, por ejemplo, en el caso en donde los dos.' péptidos difieren sólo por una sustitución conservadora: Los péptidos que son "sustancialmente similares'' comparten secuencias como se observa anteriormente, excepto que las posiciones de residuos que no son idénticas pueden diferir mediante cambios de aminoácidos conservadores . j El uso del término "construcciones de nucleótidos" en la presente no se pretende para limitar las modalidades a las construcciones de nucleótidos que comprenden ADN. Aquellos con experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que las construcciones !de nucleótidos, particularmente polinucleótidos y oligonucleótidos compuestos de I : : I , I ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxiribonucleotidos, pueden también emplearse en los métodos descritos en la jpresente. Las construcciones de nucleotidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleotidos de las modalidades abarcan adicionalmente todas las formas complementarias de tales construcciones, moléculas y secuencias. Además, las construcciones de nucleotidos, moléculas de nucleotidos y secuencias de nucleotidos de las modalidades abarcan todas .las construcciones, moléculas y secuencias de nucleotidos, las cuales pueden emplearse en los métodos de las modalidades para transformar plantas incluyendo, aunque si limitarse a, aquellas comprendidas de desoxiribonucleotidos, ribonucleótidos y combinaciones de los mismos. Tales desoxiribonucleotidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de origen natural como análogos sintéticos. Las construcciones de nucleotidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleotidos de las modalidades también abarcan todas las formas de construcciones de nucleotidos incluyendo, aunque sin limitarse a, formas de una sola hebra, formas de doble hebra, horquillas, estructuras de tallo y bucle y similares.

Una modalidad adicional se relaciona con un organismo transformado tal como un organismo seleccionado del grupo que consiste de células vegetales y de insectos, bacterias, levaduras, baculovirus, protozoarios , nemátodos y algas. El organismo transformado comprende: una molécula de ADN de las modalidades, un cásete de expresión que comprende la molécula de ADN, o un vector que comprende el cásete de expresión/ el cual puede incorporarse establemente en el genoma del organismo transformado.

Las secuencias de las modalidades se proporcionan en las construcciones de ADN para expresión en el organismo de interés. La construcción incluirá secuencias reguladoras 5 ' y 3 ' enlazadas operablemente a una secuencia de las modalidades. El término "operablemente enlazado" como se utiliza en la presente, se refiere a una conexión funcional entre un ; promotor y una | segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la trascripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácido ¡nucleico que se enlazan están contiguas y, en el caso en donde es necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. La construcción puede contener adicionalmente por lo menos un gen adicional que se co-transforma en el organismo. Alternativamente, el o los genes de adición pueden proporcionarse en múltiples construcciones de ADN.

Se proporciona tal construcción de ADN con una pluralidad de sitios de restricción para inserción de la secuencia de toxina Cry que está bajo la regulación de trascripción de las regiones reguladoras. La construcción de ADN puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables .

La construcción de ADN incluirá en la dirección 5' a 3 ' de trascripción: una región de inicio de trascripción y de traducción (es decir, un promotor) , una secuencia de ADN de las modalidades, y una región de terminación de trascripción y de traducción (es decir, región de terminación) funcional en el organismo que sirve como un huésped. La región de inicio de trascripción (es decir, el promotor) puede ser nativo, análogo, extraño o heterólogo para el organismo huésped y/o para la secuencia de las modalidades. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. El término "extraño" como se utiliza en la presente indica que el promotor no se encuentra en el organismo nativo al cual el promotor se introduce. En el caso en donde el promotor es "extraño" o "heterólogo" para la secuencia de las modalidades, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o de origen natural para la secuencia operablemente enlazada de las modalidades. Como se utiliza en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia de codificación operablemente enlazada a una región de inicio de trascripción que es heteróloga a la secuencia de codificación. En el caso en donde el promotor es uña secuencia nativa o natural, la expresión de la secuencia operablemente enlazada se altera a partir de la expresión de tipo silvestre, lo cual resulta en una alteración en el fenotipo.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de trascripción, puede ser nativa con la secuencia de interés de AD operablemente enlazada, puede ser nativa con el huésped vegetal o puede derivarse de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga para el promotor, la secuencia de interés, el huésped vegetal o cualquier combinación de los mismos) .

Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. turnefaciens , tal como las regiones de terminación octopina sintasa y la nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, puede optimizarse un ácido nucleico para expresión incrementada en el organismo huésped. De este modo, en el caso en donde el organismo huésped es una planta, pueden sintetizarse los ácidos nucleicos sintéticos utilizando codones preferidos de plantas para expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol, 92:1-11 para una discusión del uso del codón preferido de huésped. Por ejemplo, aunque las secuencia de ácido nucleico de las modalidades pueden expresarse en ambas especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para justificar las preferencias de codón específicas y las preferencias de contenido GC de monocotiledóneas y dicotiledóneas ya que estas preferencias han demostrado que difieren (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). De este modo, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular puede derivarse de las secuencias del gen conocidas de maíz. El uso del codón de maíz para 28 genes de plantas de maíz se listan en la Tabla 4 de Murray ét al., supra. Los métodos están disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Véase por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,380,831: y 5,436,391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en la presente para referencia.

Se conocen modificaciones de secuencias adicionales para mejorar la expresión genética en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares a transposones y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser nocivas para la expresión genética. El contenido de GC de la secuencia puede ajustarse a niveles promedio para un huésped celular dado, cuando se calcula mediante referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. El término "célula huésped" como se utiliza en la presente, se refiere a una célula la cual contiene un, vector y mantiene la replicación y/o se pretende la expresión del vector de expresión. Las células huéspedes pueden ser células procarióticas tal como E. coli o células eucarióticas tal como células de levadura, de insecto, anfibio o mamífero, o células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Un ejemplo de una célula huésped monocotiledónea es una célula huésped del maíz. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla previstas .

Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias 5' líderes. Tales secuencias líderes pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción se conocen en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus , por ejemplo, líder EMCV (región 5' no codificante de encefalomiocarditis ) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86:6126-6130); líderes de potivirus, por ejemplo, líder TEV (Virus del Grabado del Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), líder MDMV (Virus del Mosaico Enanizante del Maíz) , proteína de unión (BiP) de cadena pesada de inmunoglobulina humana (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder no traducido del ARNm de la envoltura proteica del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al . (1987) Nature 325:622- 625) ; líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biólogy of RNA, ed. Cech (Liss, New York) , pp;. 237-256) ; y líder del virus del moteado clorotico del maíz ' (MCMB) l- (1991) Virology 81:382-385) .

Véase también De a-C oppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968.

; Para preparar el :casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse de manera que proporcionen secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando sea apropiado, en ei marco de lectura apropiado. Con I este fin, los adaptadores o: enlazadores pueden emplearse para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones pueden estar implicadas para proporcionar sitios de restricción convenientes, la remoción de ADN superfluo, la remoción de sitios dé restricción, o ¡similares. Para este propósito, pueden estar implicadas la; mutagénesis in vitro, reparación cebadora,; restricción, endurecimiento, re-sustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Puede utilizarse ; una serie de promotores en la práctica de las modalidades. Los promotores pueden seleccionarse con base en el resultado deseado. Los ácidos nucleicos : pueden combinarse con promotores constitutivos, preferidos de tejidos, indu'cibles o diferentes para expresión en el organismo huésped. Promotores constitutivos adecuados para su uso en una célula huésped vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor mínimo del promotor Rsyn7 y los otros promotores constitutivos descritos en la WO 99/43838 y la Patente Estadounidense No.. 6,072,050; el promotor CaMV 35S mínimo (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen al. (1989) Plant Mol. Biol . 12:619-632 y Christensen al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl . Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente Estadounidense No. 5,659,026) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,608,149; 5 , 608 , 144 ; : 5 , 604 , 121 ; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; y 6,177,611.

Dependiendo del resultado deseado, puede ser benéfico expresar el gen a partir de un promotor inducible. De interés particular para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de las modalidades en plantas son promotores inducibles por heridas. Tales promotores inducibles por heridas, pueden responder a daño causado por alimentación de insectos, e incluyen el gen inhibidor de proteinasa de papa (pin II) del gen (Ryan (1990) Ann. Rev.

Phytopath. 28: 425-449; , Duan et al. (1996) Nature i Biotechnology 14: 494-498); Patente Estadounidense No. 5,428,148; winl y win2 5,428,148; winl y win2 (Stanford et al . (1989) Mol. Gen. Genet . 215: 200-208); systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al . (1993) Plant Mol. Biol . 22: 783-792; Eckelkamp et al . (1993) FEBS Letters 323: 73-76); MPI gene (Corderok et al . (1994) Plant J. 6(2): 141-150); y similares, incorporados en la presente para referencia.

Adicionalmente, los promotores inducibles por patógenos pueden emplearse en los métodos y construcciones de nucleótidos de las modalidades. Tales promotores inducibles por patógenos incluyen aquellos de las proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR) , las cuales son inducidas después de la infección mediante un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 , 3-glucanasa, quitinasa, etc. Véase por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol . 4: 111-116. Véase también la WO 99/43819, incorporada en la presente para referencia.

De interés son promotores que se expresan localmente en o cerca del sitio de infección patogénica. Véase, por ejemplo, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 83 : 2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen.

Genet. 2:93-98; e Yang (1996) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93.-14972-14977. Véase también, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al . (1994) Proc. Nati . Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; No. de Patente Es adounidense 5,750,386 (inducible por nemátodos) ; y las referencias citadas en la presente. De interés particular es el promotor inducible para el gen PRMs de maíz, cuya expresión es inducida mediante el patógeno Fusarium moniliforine (véase por ejemplo, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

; Los promotores ; regulados por químicos pueden utilizarse para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación ¡de un regulador químico exógeno . Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible por químicos, en donde la aplicación de un químico induce expresión genética, o un promotor reprimible por químicos, en donde la aplicación de la expresión genética reprime la química. Se conocen en la técnica promotores inducibles por químicos e incluyen, aunque no se limitan a, el promotor In2-2 de maíz, el cual se activa mediante antídotos de herbicidas de bencensulfonamida, el promotor GST de maíz, el cual se activa mediante compuestos electrofílieos hidrofóbicos que se utilizan como herbicidas pre-emergentes , y el promotor PR-la de tabaco, el cual se activa mediante ácido salicílico. Otros promotores regulados por químicos de interés incluyen promotores1 sensibles a esteroides (véase por ejemplo, glucocorticoid-inducible promoter en Schena et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88:10421-10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14 ( 2 ): 247-257 ) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimible por tetraciclina (véase por ejemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y Nos. de Patentes Estadounidenses 5,814,618 y 5,789,156), incorporada en la presente para referencia.

Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7 ): 792-803 ; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 ( 3 ): 337-343 ; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2 ): 157-168 ; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3 ): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 ( 2 ): 525-535 ; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2) : 513-524 ; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778 ; Lam (1994) Results Probl .

Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol . 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Nati . Acad. Sci. USA 90 (20) : 9586-9590; y Gueyara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 ( 3 ) : 495-505. Tales promotores pueden modificarse, si es necesario, para expresión débil.

Se conocen en lai técnica promotores preferidos de hojas. Véase por ejemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) . - 773 - 778 ; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6 ): 1129-1138 ; y Matsuoka et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (20) : 9586-9590.

Se conocen y pueden seleccionarse promotores preferidos de raíces o específicos de raíces a partir de muchos disponibles a partir de la literatura o aislarse de novo de varias especies compatibles. Véase por ejemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2 ): 207-218 (gen de glutamina sintetasa específica de raíz de soya) ; Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) : 1051-1061 (elemento control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de judía verde); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14 (3 ): 433-443 (promotor especificó de raíz del gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) ; y Miao et al. (1991) Plant Cell 3(l):ll-22 (clon de ADNc de longitud total que codifica glutamina sintetasa (GS) citosólica, la cual se expresa en raíces y nodulosidades de , raíz de la soya) . Véase también Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2 (7) : 633-641 , en donde se describen dos promotores específicos de raíz aislados de genes de hemoglobina a partir de la no legumbre con fijación de nitrógeno Parasponia andersonii y la no legumbre sin fijación de nitrógeno Trema tomentosa . Los promotores de estos genes se enlazaron a un gen reportero ß-glucuronidasa y se introdujeron tanto en la no legumbre Nicotiana tabacum como en la legumbre Lotus corniculatus, y en ambos casos, la actividad promotora especifica de raíz se conservó. Leach y Aoyagi (1991) describen sus análisis de los promotores de los genes que inducen raíz roIC y roID altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (véase Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Se concluyó que el mejorador y los determinantes de ADN preferidos de tejidos se describen en aquellos promotores. Teeri ét al. (1989) utilizaron fusión genética para lacZ para mostrar que el gen de ADN-T de Agrobacterium que codifica octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2 ' es específico de raíz en la planta intacta y se estimula mediante laceración en el tejido de la hoja, una combinación especialmente deseable de características para su uso con un gen insecticida o larvicida (véase EMBO J. 8 (2) : 343-350) . El gen TRl ' fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II) demostró características similares. Promotores preferidos de raíz, adicionales incluyen el promotor genético VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol . 29 ( 4 ): 759-772 ) ; y el promotor roIB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25 (4 ): 681-691. Véanse también las patentes Estadounidenses Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5, 110, 732; y 5, 023, 179. ' Promotores "preferidos de semillas" incluyen tanto promotores "específicos de semillas" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tal como promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) así como promotores "de germinación de semillas" (aquellos promotores activos durante la germinación de la semilla) . Véase Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la presente para referencia. Tales promotores preferidos de semillas incluyen, aunque no se limitan a Ciml (mensaje inducido por citoquinina) ; CZ19B1 (19 kDa de zeína de maíz) ; y milps (mio-inositol-l-fosfato sintasa) (véase la Patente Estadounidense No. 6,225,529, incorporada en la presente para referencia) . Gamma-zeína y Glob-1 son promotores específicos de endospermo. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, aunque no se limitan a ß-faseolina de frijol, napina, ß-conglicinina, lecitina de soya, cruciferina, y similares. Para monocotiledóneas , promotores específicos de semillas incluyen, aunque no se limitan a 15 kDa de zeína de maíz, 22 kDa de zeína, 27 kDa de zeína, g-zeína, cerosa, encogida 1, encogida 2, globulina 1, etc. Véase también la O 00/12733, en donde los promotores preferidos de semillas de genes endl y end2 se describen; incorporados en la presente para referencia. Un promotor que tiene expresión "preferida" en un tejido particular se expresa én ese tejido a un mayor grado que en por lo menos otro tejido vegetal. Algunos promotores preferidos de tejido muestran una expresión casi exclusivamente en el tejido particular.

En el caso en donde se desea un nivel de expresión bajo, se utilizarán promotores débiles. Generalmente, el término "promotor débil" como se utiliza en la presente se refiere a un promotor que conduce la expresión de una secuencia de codificación en un nivel bajo. Por expresión de nivel bajo en niveles de aproximadamente, se pretende 1/1000 transcripciones a aproximadamente 1/100,000 transcripciones a aproximadamente 1/500,000 transcripciones. Alternativamente, i se reconoce que el término "promotores débiles" también abarca promotores que conducen la expresión en únicamente pocas células y no en otras para dar un nivel de expresión bajo. En el caso en donde un promotor conduce la expresión en niveles inaceptablemente elevados, porciones de la secuencia promotora pueden eliminarse o modificarse para reducir los niveles de expresión.

Tales promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo, el promotor mínimo del promotor Rsyn7 ( O 99/43838 y la Patente Estadounidense No. 6,072,050) , el promotor mínimo 35S CaMV, y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,;466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; y 6,177,611; incorporadas en la presente para referencia. 1 Generalmente, el cásete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores selecciónateles se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia antibiótica, tal como aquellos que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT) , asi como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tal como glufosinato amonio, bromoxinilo, ! imidazolinonas , y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-0). Ejemplos adicionales de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, aunque no se limitan a, genes que codifican resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; y eijer et al. (1991) Plant Mol. Biol . 16:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481· y Solicitud Estadounidense Nos. de Series1 10/004,357; y 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Véase generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89: 6314-6318; Yao et al . (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al . (1980) en The Operon, pp. 177-220; Hu et al . (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al . (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al . (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86: 5400-5404; Fuerst et al . (1989) Proc . Natl. Acad. Sci . USA 86:2549-2553; Deuschle ét al. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Za bretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Bai et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5075; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Bioche istry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol . 78 (Springer-Verlag, Berlín); y Gilí et al. (1988) Nature 334: 721-724. Tales descripciones se incorporan i en la presente para referencia.

La lista anterior de genes marcadores selecciónateles no significa que sean limitantes. Cualquier gen marcador seleccionable puede utilizarse en las modalidades .

Los métodos de las modalidades implican introducir un polipeptido o polinucleótido en una planta. Se pretende que "introducir" signifique que se presente a la planta el polinucleótido o polipeptido de tal manera que la secuencia obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de las modalidades no dependen de un método particular para introducir un polinucleótido o polipéptido en una planta, sólo que el polinucleótido o polipéptido obtenga acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Se conocen en la técnica métodos para introducir el polinucleótido o polipéptidos en las plantas incluyendo, aunque sin limitarse a métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus .

Se pretende que la "transformación estable" signifique que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integre en el genoma de la planta y sea capaz de ser heredada por la progenie de la misma. Se pretende que la "transformación transitoria" signifique que un polinucleótido se introduce dentro de la planta y no se integre al genoma de la planta o un polipéptido se introduce en una planta.

Los protocolos de transformación, así como protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir', monocotiledónea, dicotiledónea seleccionada para transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células vegetales y la inserción subsiguiente en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway efci al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc . Nati. Acad.

Sci. USA 83: 5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Patentes Estadounidenses Nos. 5,563,055 y 5,981,840), transferencia genética directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), y aceleración de partículas balísticas (véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; y 5,932,782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); y Lecl transformation (WO 00/28058) . Para transformación de papa véase Tu et al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 y Chong et al. (2000) Transgenic Research 9: 71-78. Procedimientos de transformación adicionales pueden encontrarse en Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet . 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soya); McCabe et al. (1988) Bio/'Technology 6: 923-926 (soya); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol . 27P: 175-182 (soya); Singh et al. (1998) Theor. Appl . Genet . '96: 319-324 (soya); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85: 4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); las Patentes Estadounidenses No. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 ( aize) ; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (hondón) 311: 763-764; Patente Estadounidense No. 5,736,369 (cereales) ; Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chap an] et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformación mediada por bigotes) ; D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporación) ; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 and Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens) ; todos los cuales se incorporan en la presente para referencia: En las modalidades específicas, pueden proporcionarse secuencias de las modalidades a una planta utilizando una variedad de métodos de transformación transitoria. Tales métodos de transformación transitoria incluyen, . aunque no se limitan a, la introducción de la proteína de toxina Cry o variantes y fragmentos de la misma directamente en la planta o la introducción de la trascripción de toxina Cry en la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo de partículas. Véase por ejemplo, Crossway et al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura et al. (1986) Plant Sci . 44: 53-58; Hepler et al. (1994) Proc . Nati. Acad. Sci. 91: 2176-2180 y Hush et al. (1994) The Journal of Cell Science 107: 775-784, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia. Alternativamente, el polinucleótidos de toxina Cry puede transformarse en forma transitoria en la planta utilizando técnicas conocidas en el arte. Tales técnicas incluyen un sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido en una manera que imposibilita la liberación subsiguiente del ADN. De este modo, la trascripción a partir del ADN ¦ unido a partículas puede ocurrir, aunque la frecuencia con la cual se libera para ser integrado en el genoma se reduce en gran medida. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma #P3143) . , i Los métodos se conocen en la técnica para la inserción identificada de un polinucleotido en una ubicación especifica en el genoma de la planta. En una modalidad, se logra la inserción del polinucleotido en una ubicación genómica deseada utilizando un sistema de recombinación sitio especifico. Véase por ejemplo, W099/25821, W099/25854, O99/25840, W099/25855, y W099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia. Brevemente, el polinucleotido de las modalidades puede estar contenido en el cásete de transferencia ! flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos^. El cásete de transferencia se introduce en una planta que ha incorporado establemente en su genoma un sitio objetivo, el cual se flanquea por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. El polinucleotido de interés se integra por consiguiente en una posición cromosomal específica en el genoma de la planta.

Las células que han sido transformadas pueden desarrollarse en plantas de acuerdo con las formas convencionales. Véase por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cel.l Reports 5: 81-84. Estas plantas pueden entonces desarrollarse y polinizarse ya sea con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva o inducible de la característica fenotípica deseada identificada. Dos o más generaciones i pueden entonces desarrollarse para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga establemente y se herede y entonces las semillas se cosechen para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada.

Pueden proporcionarse las secuencias de nucleótidos de las modalidades a la planta poniendo en contacto la planta con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos implican incorporar la construcción de nucleótidos de interés dentro de una molécula de ADN o A N viral . Se reconoce que las proteínas, recombinantes de las modalidades pueden sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína viral, la cual posteriormente puede procesarse mediante proteolisis in vivo o in vi tro para producir la proteína ' pesticida deseada. Se reconoce también que tal poliproteína viral, que comprende por lo menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína pesticida de las modalidades, puede tener la actividad pesticida deseada. Tales polipróteínas virales y las secuencias de nucleótidos que las codifican están abarcadas por las modalidades. Se conocen en la técnica métodos para proporcionar plantas con construcciones de nucleótidos y para producir las proteínas codificadas en las plantas, los cuales implican moléculas de ADN o ARN viral. Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; y 5,316,931; incorporadas en la presente para referencia.

Las modalidades además se relacionan con un material de propagación de plantas de una planta transformada de las modalidades, incluyendo, aunque sin limitarse a semillas, tubérculos, cormos, bulbos, hojas y recortes de raíces y brotes .

Las modalidades pueden utilizarse para transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo aunque sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, aunque no se limitan a, maíz (Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B . napus, B. rapa, B. júncea) , particularmente aquellas especies Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa {Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeno (Sécale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perla ( Pennisetu glaucum) , mijo mayor (panicum miliaceum) , mijo menor (Setaria itálica) , mijo africano (Eleusine coracana) ) , girasol (Helianthus annuus) , cártamo (Cartha us tinctorius) , trigo (Triticum aestivu ) , soya (Glycine max) , tabaco (Nücotiana tabacu ) , papa (Solanu tuberosum) , cacahuate (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote (Ipomoea ba ta tus ) , yuca (Manihot esculenta) , café (Coffea spp.) , coco (Cocos nucífera) , piña (Ananas co osus) , árboles cítricos (Citrus spp.)/ cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica) , oliva (Olea europaea) , papaya (Carica papaya) , anacardo (AnacardiuíT] occidentale) , macadamia (Macadamia integri folia) , almendra (Prunus amygdalus) , remolacha azucarera (Beta vulgaris) , caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas.

Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentu ) , lechuga (por ejemplo, Lactuta sativa) , frijoles verdes (Phaseolus vulgaris) , frijol de lima (Phaseolus limensis) , chicaros (Lathyrus spp. ) , y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) , y melón almizcleño (C. eló) . Plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea) , hibisco (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel (Dianthus caryophyllus) , Nochebuena (Euphorbia pulcherrima) , y crisantemo. Coniferas que; pueden emplearse al practicar las modalidades incluyen, por ejemplo, pinos tal como pino de incienso (Pinus taeda) , pino antellano (Pinus ellioti), pino amarillo (Pinus ponderosa),' pino torcido (Pinus contorta) y pino radiata {Pinus radiata) ; abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); tsuga heterófila {Tsuga canadensis) ; pícea de Stika (Picea glauca); secoya {Sequoia sempervirens) ; abetos tales como abeto plateado {Abies amabilis) y abeto balsámico {Abies balsamea) ; y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis) . Plantas de las modalidades incluyen plantas de cultivo (por ejemplo, maíz ,¦, alfalfa, girasol, Brassica, soya, algodón, cártamo, cacahuate; sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.) tal como plantas de maíz y soya.

Los céspedes incluyen, aunque no se limitan a: espiguilla anual (Poa annua) ; raigrás anual (Lolium multiflorum) ; espiguilla del Canadá (Poa compressa) ; festuca roja falaz (Festuca rubra) ; agrostis común (Agrostis tenuis) ; agrostis estolonifera (Agrostis palustris) ; pasto de trigo con cresta (Agropyron desertorum) , pasto de trigo de canal (Agropyron cristatum) , barcea (Festuca longi folia) ; poa de los prados (Poa pratensis) ; dáctilo (Dactylis glomerata) ; bacillo inglés (Lolium perenne) ; festuca roja (Festuca rujra) ; agrostis blanca (Agrostis alba) ; poa áspera (Poa trivialis) ; cañuela de oveja (Festuca ovina) ; bromo liso (Bromus inermis) ; festuca alta (Festuca arundinacea) ; festuca roja (Phleum pratense); agrostis canina (Agrostis canina); .hierba álcali (Puccinellia distans); triguillo occidental (Agropyron smithii); grada canadiense (Cynodon spp.); pasto de San Agustín (Stenotaphrum secundatum); pasto zoysia (Zoysia spp.); Gramilla blanca (Paspalum notatum) ; zacate amargo (Axonopus affinís); grama ciempiés (Eremochloa ophiuroides) ; pasto kikuyo (Pennisetum clandesinum) ; grama de agua (Paspalum vaginatum) ; \ grama azul (Bouteloua gracilis) ; grama de búfalo (Buchloe dactyloids) ; grama de avena (Bouteloua curtipendula) .

Las plantas de interés incluyen plantas gramíneas que proporcionan semillas ;de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, tal como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen, algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica , maíz, alfalfa, palma, coco, lino, ricino, oliva, etc. Las plantas leguminosas incluyen frijoles y chícharos. Los frijoles incluyen guar, algarrobo, fenogreco, soya, alubias, guisante pinto, frijol mungo, frijol de lima, haba, lentejas, garbanzo, etc.

? En ciertas modalidades, las secuencias de ácido nucleico de las modalidades pueden apilarse con cualquier combinación de secuencias de polinucléótidos de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucléótidos de las! modalidades pueden apilarse con cualesquiera otros polinucléótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad pesticida y/o insecticida, tal como otras proteínas tóxicas del Bt (descritas en las Patentes Estadounidenses Nos. 5, 366, 892; 5, 747, 450; 5, 736, 514; 5,723,756; 5, 593, 881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109) , pentina (descrita en la Patente Estadounidense No. 5, 981,722) y similares. Las combinaciones generadas pueden también incluir múltiples copias de; cualquiera de los polinucleotidos de interés. Los polinucleotidos de las modalidades pueden también apilarse con cualquier otro gen o combinación de genes para producir plantas» con una variedad de combinaciones I de rasgos; deseados incluyendo, aunque sin limitarse a rasgos deseables para comida para¦ animales tal como genes altos en aceite (por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,232, 529) ; aminoácidos equilibrados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes Estadounidenses Nos. 5, 990, 389; 5, 885, 801; 5, 885, 802; y 5,703, 049) ; cebada alta en lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas elevadas en metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359; y Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123) ) ; asimilabilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de ? almacenamiento mejoradas (Solicitud Estadounidenses No. de Serie 10/053,410, presentada el 7 de noviembre del 2001) ; y i tioredoxinas (Solicitud | Estadounidenses No. de Serie 10/005, 429, presentada el ; 3 de diciembre del 2001) ) , las descripciones de las cuales; se incorporan en la presente para referencia.

Los polinucleótidos de las modalidades pueden también apilarse con rasgos deseables para resistencia a enfermedades o herbicidas (por ejemplo, genes de desintoxicación por fumonisina (Patente Estadounidense No. 5,792,931); genes de avirulencia y resistencia a enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS que conducen a resistencia herbicida tal como mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) ; y resistencia a glifosato (gen EPSPS y gen GAT como se describe en las Solicitudes Estadounidenses Nos. de Serie 10/004,357; y 10/427,692); y rasgos deseables para productos de procesamiento o proceso tal como alta concentración de aceite (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes desaturasa del ácido graso (Patente Estadounidense No. 5,952,544; O 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPase) , almidón sintasas (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SBE) y enzimas de des-ramificación de almidón (SDBE) ) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente Estadounidense No. 5,602,321; beta-quetotiolasa , polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J.

Bacteríol . 170: 5837-5847) facilita la expresión de los polihidroxialcanoatos (PHAs)), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Se podría también combinar los polinucleotidos de las modalidades con polinucleotidos proporcionando rasgos agronómicos tal como esterilidad masculina (por ejemplo, véase la Patente Estadounidense No. 5,583,210), resistencia i del tallo, tiempo de florecimiento, o rasgos de tecnología de transformación tal como regulación del ciclo celular o genosustitución (por ejemplo, WO 99/61619; O 00/17364; WO 99/25821), las descripciones ; de las cuales se incorporan en la presente para referencia.

Estas combinaciones apiladas pueden crearse mediante cualquier método incluyendo, aunque sin limitarse a plantas de inseminación mediante cualquier metodología convencional o TOPCROSS® o transformación genética. Si los rasgos se apilan transformando genéticamente las plantas, las secuencias de polinucleotidos de interés pueden combinarse en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más rasgos deseados puede utilizarse como el 1 objetivo para introducir además rasgos mediante transformación subsiguiente. Los rasgos pueden introducirse simultáneamente en un protocolo de co-transformación con los¡ polinucleotidos de interés I determinados por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidos en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias puede conducirse por el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto puede combinarse con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación de rasgos deseada en la planta. Se reconoce además que las secuencias de polinucleótidos pueden apilarse en una ubicación genómica deseada utilizando un sistema de recombinación sitio-espec fica. Véase por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855, y W099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia .

Las composiciones de las modalidades encuentran uso al proteger plantas, semillas y productos vegetales en una variedad de formas. Por ejemplo, las composiciones pueden utilizarse en un método que implica colocar una cantidad efectiva de la composición pesticida en el ambiente de la ¡ plaga mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de aspersión,i espolvoreo, transmisión o recubrimiento de semillas.

Antes del material de propagación de plantas (fruto, tubérculo, bulbo, cormo, granos, semilla), aunque especialmente semilla, se vende como un producto comercial, se trata habitualmente con un recubrimiento protector que comprende herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea junto con portadores, tensoactivos o adyuvantes adicionales que promueven la aplicación empleada habitualmente en la técnica de formulación para proporcionar protección contra daño causado por plagas bacterianas, fúngicas o animales. Con el fin de tratar la semilla, el recubrimiento protector puede ser aplicado a las semillas impregnando ya sea los tubérculos o granos con una formulación liquida o recubriéndolos con una formulación húmeda o seca combinada. Además, en casos especiales, otros métodos de aplicación a plantas son posibles, por ejemplo, tratamiento dirigido en los brotes o el fruto.

La semilla de la planta de las modalidades que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina pesticida de las modalidades puede tratarse con un recubrimiento protector de semillas que comprende un compuesto de tratamiento de semillas, tal como, por ejemplo, captano, carboxina, tiram, metalaxilo, pirimifosmetilo y otros que se utilizan comúnmente en tratamiento de semillas. En una modalidad, se utiliza un recubrimiento protector de semilla que comprende una composición pesticida de las modalidades solo o en combinación con uno de los recubrimientos protectores de semillas habitualmente usados en el tratamiento de semillas.

Se reconoce que los genes que codifican las proteínas pesticidas pueden utilizarse para transformar organismos patogénicos de insectos. Tales organismos incluyen baculovirús, hongos, protozoarios , bacterias y nemátodos .

Puede introducirse un gen que codifica una proteína pesticida de las modalidades a través de un vector adecuado en un huésped microbiano, y el huésped se aplica al ambiente, o a plantas o animales. El término "introducido" en el contexto para insertar un ácido nucleico en una célula, significa " transfección" o "transformación" o " transducción" e incluye referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica en donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial ) , convertido en un replicó autónomo, o expresado en forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado) .

Pueden seleccionarse microorganismos huéspedes que se conocen para ocupar la v fitoesfera" (filoplano, filoesfera, rizosfera y/o rizóplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera que son capaces de competir exitosamente en el ambiente particular con los microorganismos de tipo silvestre, determinados por mantenimiento estable y expresión del gen que expresa la proteína pesticida, y deseablemente, determinados por protección mejorada del pesticida a partir de degradación e inactivación ambiental.

Tales microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De interés particular son microorganismos tal como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobiu , Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, fungí, particularmente levadura, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De interés particular son especies fi toesferas bacterianas tal como Pseudomonas syringae, : Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli y Azotobacter vinlandir y especise fitoesfera de levadura tal como Rhodotorula ruJra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii , Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans . De interés particular son los microorganismos pigmentados .

Varias formas están disponibles para introducir un gen que expresa la proteína pesticida en el microorganismo huésped bajo condiciones ; que permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Por ejemplo, pueden construirse casetes de expresión los cuales incluyen las construcciones de nucleotidos de interés operablemente enlazadas ' con las señales ¡reguladoras de trascripción y de traducción para expresión de las construcciones de nucleotidos, y una secuencia de nucleotidos homologa con una secuencia en el organismo huésped, por lo que tendrá lugar la integración, y/o un sistema de replicación que es funcional en el huésped, por lo que tendrá lugar la integración o mantenimiento estable. ; Las señales reguladoras de trascripción y traducción incluyen, aunque no se limitan a promotores, sitios de partida de inicio de trascripción, operadores, activadores, mej oradores, otros elementos reguladores, sitios de unión ribosomal, un codón de inicio, señales de terminación y similares. Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,039,523 y 4,853,331; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), hereinafter "Sambrook II"; Davis et al., eds . (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, New York; y las referencias citadas en la presente.

Se tratarán células huéspedes adecuadas, en el caso en donde las células que contienen proteínas pesticidas para prolongar la actividad de las proteínas pesticidas en la célula, cuando la célula tratada se aplica al ambiente de la o las plagas objetivo, puede incluir ya sea células procarióticas o eucarióticas , que se limitan normalmente por aquellas células que no producen sustancias toxicas para organismos superiores, tal como mamíferos. Sin embargo, podrían utilizarse organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores, en el caso en donde la toxina es inestable o el nivel de aplicación es suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamífero. Como los huéspedes, de interés particular serán las células procarióticas y las células eucarióticas inferiores tal como hongos. Las células procarióticas ilustrativas, tanto gram-negativas como gram-positivas , incluyendo EnteroJacteriaceae, tal como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, tal como Rhizobium; Spirillaceae, tal como photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tal como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae . Entre los eucariotes están hongos, tal como Phycomycetes y Ascomycetes , los cuales incluyen levaduras, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces ; y levadura Basidiomycetes , tal como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, y similares.

Características de interés particular para seleccionar una célula huésped para propósitos de producción de proteínas pesticidas incluyen facilidad para introducir el gen de proteínas pesticidas; en el huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, ! la eficiencia de expresión, la estabilidad de la proteína en el huésped, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Características de interés para su uso como microcápsula pesticida incluyen calidades protectoras para el pesticida, tal como paredes celulares espesas, pigmentación y embalaje o formación intracelular de cuerpos de inclusión; afinidad de hoja; falta de toxicidad de mamíferos, atracción de plágas para la ingestión; facilidad de eliminación y fijación sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y manejo, economía, estabilidad de almacenamiento y similares.

Organismos huéspedes de interés particular incluyen levadura, tal como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp. , Saccharomyces spp. (tal como S. cerevisiae) , Sporobolomyces spp., organismos filoplanos tal como Pseudomonas spp. (tal como P. aeruginosa, P. . fluorescens) , Erwinia spp. , y Flavobacteriu spp., y otr¡os organismos, incluyendo Bt, E. coli, Bacillus subtilis y similares.

Genes que codifican las proteínas pesticidas de las modalidades pueden introducirse en microorganismos que multiplican las plantas (epífitas) para suministrar proteínas pesticidas a plagas objetivo, potenciales. Las epífitas, por ejemplo, pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas .

Bacterias colonizantes de raíz, por ejemplo, pueden aislarse a partir de plantas de interés mediante métodos conocidos en la técnica. Específicamente, puede aislarse una cepa de Bacillus cereus que coloniza raíces a partir de raíces de una planta (véase por ejemplo, Handelsman et al. (1991) Appl . Environ, Microbiol . 56:713-718). Genes que codifican las proteínas pesticidas de las modalidades pueden introducirse en un Bacillus cereus colonizante de raíz mediante métodos estándares, conocidos en la técnica.

Pueden introducirse genes que codifican proteínas pesticidas, por ejemplo, en el Bacillus colonizante de raíz mediante medios de electrotransformación . Específicamente, los genes que codifican las proteínas pesticidas pueden clonarse en un vector transportador, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol . Letts. 60:211-218. El vector transportador pHT3101 que contiene la secuencia de codificación para el gen de proteína de pesticida particular puede, por ejemplo, ser transformado en el Bacillus colonizante de raíz por medio de electroporacion (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218).

Pueden diseñarse sistemas de expresión de manera que las proteínas pesticidas se secreten fuera del citoplasma de bacterias gram negativas, por ejemplo, tal como E. coli. Ventajas de tener proteínas pesticidas secretadas son: (1) rechazo de efectos citotóxicos potenciales de la proteína pesticida expresada; y (2) mejora en la eficiencia de purificación de la proteína ; pesticida, incluyendo, aunque sin limitarse a, la eficiencia incrementada en la recuperación y purificación de la proteína por volumen de caldo celular y tiempo reducido y/o costos de recuperación y purificación por unidad de proteína.

Las proteínas pesticidas pueden hacerse para ser secretadas en E. coli, por ejemplo, fusionando un péptido de señal de E. coli apropiado ál extremo amino terminal de la proteína pesticida. Los péptidos de señal reconocido por E. coli pueden encontrarse en proteínas ya conocidas para ser secretadas en E. coli, por ejemplo, la proteína OmpA (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J, 3:2437-2442). OmpA es una proteína mayor de la membrana externa de E. coli y de este modo se cree que su péptido de señal es eficiente en el proceso de desplazamiento. También, el péptido de señal OmpA no necesita ser modificado antes del procesamiento como puede ser el caso para otros péptidos de señal, por ejemplo, péptido de señal de lipoproteína (Duffaud · et al. (1987) Meth. Enzymol . 153:492) .

Las proteínas pesticidas de las modalidades pueden fermentarse en un huésped bacterial y la bacteria resultante procesarse y utilizarse como un aerosol microbiano en la misma manera que las cepas del Bt que han sido utilizadas como aerosoles insecticidas. En el caso de una o más proteínas pesticidas que se secretan a partir de Bacillus, la señal de secreción se remueve o muta utilizando procedimientos conocidos en! la técnica. Tales mutaciones y/o eliminaciones evitan la secreción de la o las proteínas pesticidas en el medio de crecimiento durante el proceso de fermentación. Las proteínas pesticidas son retenidas dentro de la célula, y las células entonces se procesan para producir las proteínas pesticidas encapsuladas . Puede utilizarse para este propósito cualquier microorganismo adecuado. Se han utilizado , Pseudomonas para expresar toxinas del Bt como proteínas encapsuladas y las células resultantes procesarse y rociarse como un insecticida (Gaertner et al. (1993), en: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim) .

Alternativamente, se producen proteínas pesticidas al introducir un gen heterólogo en un huésped celular. La expresión del gen heterólogo resulta, directa o indirectamente, en la ¡producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Estas células se tratan entonces bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de la o las plagas objetivo. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estas proteínas pesticidas encapsuladas en forma natural pueden entonces formularse de acuerdo con técnicas convencionales para aplicación al ambiente alojando una plaga objetivo, por ejemplo, tierra, agua y follaje de plantas. Véase, por ejemplo, la EPA 0192319, y las referencias Citadas en la presente.

En las modalidades, un microorganismo transformado (el cual incluye organismos completos, células, una o más esporas, una o más proteínas pesticidas, uno o más componentes pesticidas, uno o más componentes que impactan a las plagas, uno o más mutantes, células vivas o muertas y componentes celulares, incluyendo mezclas de células vivas y muertas y componentes celulares, e incluyendo células desintegradas y componentes celulares) o una proteína pesticida aislada puede formularse con un portador aceptable en una o composiciones pesticidas es decir, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo medicinal, un gránulo o comprimido dispersable, un polvo humectable, y un concentrado emulsionable, un aerosol o atomizador, un gránulo impregnado, un adyuvante, una pasta recubrible, un coloide, y también encapsulaciones en por ejemplo, sustancias de polímeros . Tales composiciones formuladas pueden prepararse mediante tales medios convencionales como desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido.

Tales composiciones descritas anteriormente pueden ser obtenidas mediante la adición de un agente de superficie activa, un portador inerte, un conservador, un humectante, un estimulante alimenticio, una sustancia atrayente, un agente de encapsulación, un aglutinante, un emulsionante, un tinte, un protector UV, un tampón, un agente de flujo o fertilizantes, donadores ; de micronutrientes , u otras preparaciones que influyen en el crecimiento vegetal. Uno o más agroquímicos incluyendo, aunque sin limitarse a, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas , acaricidas, reguladores de crecimiento vegetal, auxiliar de cosechas y fertilizantes, pueden combinarse con portadores, tensoactivos o adyuvantes habitualmente empleados en la técnica de formulación u otros componentes para facilitar el manejo y la aplicación del producto para plagas objetivo particulares. Portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias normalmente empleadas en tecnología de formulación, |por ejemplo, sustancias naturales o minerales regeneradas, 'solventes, dispersantes, agentes humectantes, espesantes, aglutinantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de las modalidades se aplican normalmente en la forma de; composiciones y pueden aplicarse al área de cultivo, la planta o la semilla que se trata. Por ejemplo, las composiciones de las modalidades pueden aplicarse al grano en preparación para o durante el almacenamiento en un tanque: o silo, etc. Las composiciones de i las modalidades pueden aplicarse simultáneamente o en sucesión con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo de las modalidades o una composición agroquímiea de las modalidades que contiene por lo menos una de las proteínas pesticidás producidas mediante cepas bacterianas de las modalidades incluyen, aunque no se limitan a, aplicación foliar, recubrimiento de semillas y aplicación de tierra. El número de aplicaciones y el índice de i aplicación dependen de la ¡intensidad de infestación por la plaga correspondiente. ; Agentes de superficie activa adecuados incluyen, aunque no se limitan a compuestos aniónicos tal como un carboxilato de, por ejempló, un metal; un carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o í diésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso o sales de tales ésteres; sulfatos de alcohol graso tal como dodecilsulfato de sodio; sulfato de octadecilo de sodio o sulfato de cetilo de sodio; sulfatos de alcohol graso etoxilado; sulfatos de alquilfenol etoxilado; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; alquilarilsulfonatos tal I como alquilbencensulfonat¡os o alquilnaftalensulfonatos i inferiores; por ejemplo, butil-naftalensulfonato; sales de condensados de naftalen-formaldehído sulfonados; sales de condensados de fenol-formaljdehído sulfonados; sulfonados más complejos tal como los sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto de condensación sülfonado de ácido oleico y N-metil taurina; b los sulfosuccin tos de dialquilo, por ejemplo, el sulfonato; de sodio de succinato de dioctilo. Agentes no iónicos incluyen productor de condensación de ésteres de ácido graso, alcoholes grasos, amidas del ácido graso o fenoles sustituidos con alquilo o alquenilo graso con óxido de etileno, ésteres grasos |de éteres de alcohol polihídrico, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, productos de condensación de tales éjsteres con óxido de etileno, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, copolímeros en bloque de1 óxido de etileno y óxido de propileno; glicoles acetilénicos , tal como 2 , , 7 , 9-tetraetil- 5-decin-4 , 7-diol , o glicoles acetilénicos etoxilados . Ejemplos ' de un agente ele superficie activa catiónica incluyen, por ejemplo, una mono, di o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato¡ u oleato; o amina que contiene oxígeno tal como un! - óxido de amina de la polioxietilenalquilamina; runa amina enlazada con amida preparada mediante la condensación de un ácido carboxílico con una di o poliamina; o una sal de amonio cuaternario. : i ! ¡ i ; I , Ejemplos de materiales inertes incluyen aunque no se limitan a minerales \ inorgánicos tal como caolín, filosilicatos , carbonatos, sulfatos, fosfatos o materiales botánicos tal como corcho, mazorcas pulverizadas, cáscaras de cacahuete, cáscaras de arroz y cáscaras de nuez.

Las composiciones de las modalidades pueden estar en una forma adecuada para aplicación directa o como un concentrado de la composición primaria que requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración pesticida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación, específicamente, si es un concentrado o va a utilizarse directamente. La composición contiene 1 a 98% de un portador inerte sólido o líquido, y 0 a 50% o 0.1 a 50% de un tensoactivo. Estas composiciones serán administradas en el índice de etiquetado para el producto comercial, por ejemplo, aproximadamente 0.005 kg-2.26 kg (0.01 libras-5 libras) por acre cuando está en forma seca y aproximadamente 0.01 puntos - 10 puntos por acre cuando está en forma líquida.: En una modalidad adicional, las composiciones, así como los microorganismos transformados y proteínas pesticidas de las modalidades, pueden tratarse antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida cuando se aplica al ambiente de una plaga objetivo siempre y cuando el pre-tratamiento no sea nocivo ¡para la actividad pesticida. Tal ¡ i tratamiento puede ser mediante medios químicos y/o físicos siempre y cuando el tratamiento no afecte perniciosamente las propiedades de la o las composiciones. Ejemplos de reactivos químicos incluyen, aunque: no se limitan a agentes de halogenación; aldehidos ¡ tal como formaldehído y glutaraldehído ; anti-patógenos , tal como cloruro de zefirán,-alcoholes; tal como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tal como fijador de Bouin como fijador de Helly (véase por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.). ! En otras modalidades, puede ser ventajoso tratar .i ? los polipéptidos de toxina Cry con una proteasa, por ejemplo, tripsina, 'para activar la proteína antes de la aplicación de una composición de proteínas pésticida de las modalidades para el ambiente conocido en la técnica. Se conocen bien en la técnica métodos para la activación de protoxina mediante una t . proteasa de serina. Véase¦ por ejemplo, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 y Cárroll y Ellar (1989) Biochem. J. 261:99-105, las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente para referencia.: Por ejemplo, un protocolo de activación adecuado incluye, aunque no se limita a combinar un polipéptido que se activa, por ejemplo, un polipéptido de Cry novedoso purificado (por ejemplo, teniendo la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2) y tripsina en una relación de 1/100 en peso de proteína/ tripsina en 20 nM ¡ I ' 1 Ij de NaHC03, pH 8 y digiriendo la muestra a 36°C durante 3 horas .

Las composiciones (incluyendo los microorganismos transformados y proteínas pesticidas de las modalidades) pueden aplicarse al ambiente de un insecto nocivo por ejemplo, mediante aspersión, atomización, espolvoreo, diseminación, recubrimiento o vertido, introduciendo en o sobre la tierra, introduciendo en agua de riego, mediante tratamiento de semillas o aplicación general o espolvoreo en el momento cuando la plaga ha empezado a aparecer o antes de la aparición de plagas como una medida protectora. Por ejemplo, la proteína pesticida y/o microorganismos transformados de las modalidades pueden mezclarse con el grano para proteger el grano durante el almacenamiento. Es generalmente importante obtener un buen control de plagas en las etapas tempranas del desarrollo de la planta, ya que es el momento cuando la planta puede ser dañada más severamente. Las composiciones de las modalidades pueden contener convenientemente otro insecticida si éste se considera necesario. En una modalidad, la composición se aplica directamente a la tierra, en el momento de la plantación, en forma granular de una composición de un portador y células muertas de una cepa Bacillus o microorganismo transformado de las modalidades. Otra modalidad es una forma granular de una composición que comprende un agroquímico tal como, por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, un portador inerte, y células; muertas de una cepa Bacillus o microorganismo transformado de las modalidades.

Aquellos expertos en la técnica reconocerán que no todos los compuestos son igualmente efectivos contra todas las plagas. Los compuestos de las modalidades despliegan actividad contra insectos nocivos, los cuales pueden incluir plagas agronómicas económicamente importantes, en bosque, invernadero, guarderías infantiles, plantas ornamentales, alimentos y fibras, salud pública y de animales, estructura doméstica y comercial, hogar y en productos almacenados. Los insectos nocivos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptero, Dípteros, Himenópteros , Lepidópteros, Malofaga, Homópteros, Hemípteros, Ortópteros, Tisanópteros , Dermápteros, Isópteros, Anoplura, Sifonápteros , Tricópteros, etc., particularmente Coleóptero y Lepidópteros.

Las larvas del orden de Lepidópteros incluyen, aunque no se limitan a, gusano de la polilla, gusano gris, gusanos medidores y orugas del tomate en la familia Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (gusano cogollero) ; S. exigua Hübner (gusano verde cogollero); S. litura Fabricius (rosquilla negra, mayata de la papa) ; Mamestra configurata Walker (polilla de la ropal) , M. brassicae Linnaeus (polilla de la col); Agrotis ípsilon Hufnagel (gusano cortador grasiento) ; A. orthogonia Morrison (agrotis occidental) ; A. subterránea Fabricius (gusano trozador) ; Alabama argillacea Hübner (gusano medidor del t algodón) ; Trichoplusia ni Hübner (falso medidor) ; Pseudoplusia includens Walker (medidor de la soya) ; Anticarsia ge matalis Hübner (langosta del cacahuate) ; Hypena scabra Fabricius (gusano verde del trébol); Heliothis virescens Fabricius (gusano j bellotero) ; Pseudaletia unipuncta Haworth (gusano de la polilla) ; Athetis mindara Barnes and Mcdunnough (rosquilla de piel rugosa); Euxoa messoria Harris (oruga de, lado oscuro) ; Earias insulana Boisduval (taladro del algodonero) ; E. vittella Fabricius (bellotero moteado) ; Helicoverpa armígera Hübner (bellotero americano) ; H. zea Boddie (gusano elotero o bellotero del algodón) ; Melanchra picta Harris (oruga zebra) ; Egira (Zylomyges) curialis Grote (cortadora de cítricos); barrenadores, orugas de la vaina, orugas tejedoras, gusanos del cono, y esqueletonizadores de la familia Pyralidae Ostrínia nubilalis Hübner (barrenador europeo del maíz); Amyelois transitella Walker (gusano naranjero navel) ; Anagasta kuehniella Zeller (polilla de la harina) ; Cadra cautella Walker (polilla del almendro) ; Chilo suppressalis Walker (barrenador del arroz) ; C. partellus , (barrenador del sorgo) ; Corcyra cephalonica Stainton (polilla del arroz) ; Crambus caliginosellus Clements (tejedores de raíz del maíz); C. tet'errellus Zincken (tejedores de espiguilla) ; Cnaphalocrocis medinalis Guenée (gusano enrollador de hoja de arroz) ; Desmia funeralis Hübner (esqueletonizador de la vid) ; Diaphania hyalinata Linnaeus (gusano del melón); D. nitidalis Stoll (barrenador del pepino) ; Diatraea grandiosella Dyar (barrenador del maíz del suroeste) , D. saccharalis Fabricius (barrenador de la caña de azúcar) ; Eoreuma loftini Dyar (barrenador mexicano del arroz) ; Ephestía elutella Hübner (polilla del tabaco (cacao) ) ; Gallería ellonella Linnaeus (polilla mayor de las abajeas) ; Herpetogramma licarsisalis Walker (palomilla) ; Homoeosoma electellum Hulst (polilla de la cabezuela) ; Elasmopalpus lignosellus Zeller (gusano picador de la hoja) ; Achroia grisella Fabricius ;(pequeña polilla de las abejeas); Loxostege sticticalis Linnaeus (gusano teleranero) ; Orthaga thyrisalis Walker (polilla tejedora del árbol de té) ; Maruca testulalis Geyer (maruca de las vainas); Plodia interpunctella Hübner (palomilla bandeada del trigo) ; Scirpophaga incertulas Walker (barrenador de tallo amarillo) ; Udea rubigalis Guenée (cigarrero del apio) ; y enrolladores de hojas, orugas, gusanos de las semillas y gusanos de los frutos en la familia Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (orugas de cabeza negra occidental); A. variana Fernald (oruga de cabeza negra oriental); Archips argyrospila Walker (enrollador de hoja de frutales); A. Rosana Linnaeus (enrollador de hoja europeo) ; y otras especies Archips, Adoxophyes orana Fischer vpn Rósslerstamm (tortrix de fruta del verano) ; Cochylis hospes Walsingham (palomilla de la cabazuela de franja) ; Cydia latiferreana Walsingham (anarsia) ; C. pomonella Linnaeus (polilla de la manzana) ; Platynota flavedana Clemens (enrollador abigarrado) ; P. stultana Walsingham (enrollador omnívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (polilla europea de la vid) ; Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (tritox moteado); Endopiza viteana Clemens (polilla del racimo); Eupoecilia ambiguella Hübner (polilla de las uvas) ; Bonagota salubricola Meyrick (enrollador de hojas de manzana del Brasil); Grapholita molesta Busck (gusano del duraznero) ; Suleima helianthana Riley (polilla del girasol); Argyrotaenia sp . ; Choristoneura spp.

Otras plagas agronómicas seleccionadas en el orden Lepidóptera incluyen, aunque no se limitan a, Alsophila pometaria Harris (Oruga Ulcerosa del Otoño); Anarsia lineatella Zeller (polilla del melocotonero) ; Anisota senatoria J. E. S ith (gusano del roble con rayas anaranjadas); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (gusano de seda del roble); Bombyx mori Linnaeus (gusano de seda), Bucculatrix thurberiella Busck (minador de la hoja del algodón) ; Colias eurytheme Boisduval (gusano de la alfalfa) ; Datana integérri a Grote & Robinson (orugas del nogal); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (gusano de seda siberiano) , Ennomos subsignaria Hübner (enno o del olmo); Erannis tiliaria Harris (medidor tilero) ; Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (polilla cola café); Harrisina americana Guérin-Méneville (oruga occidental de la parra); Hemileuca oliviae Cockrell (oruga de campo); Hyphantria cunea Drury (oruga tejedora del, otoño); Keiferia lycopersicella Walsingham (polilla del ! tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (medidor oriental del abeto); L . fiscellaria lugubrosa Hulst (medidor occidental del abeto); Leucoma salicis Linnaeus (polilla satinada) ; Lymantria dispar Linnaeus (polilla gitana) ;\ Manduca quinquemaculata Haworth (cabeza de muerto de cinco lunares, gusano de cuerno del tomate); M. sexta Haworth (gusano de cuerno del tomate, gusano de cuerno del tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (falena invernal); Paleacrita vernata Peck (oruga ulcerosa de la primavera) ; Papilio cresphontes Cramer (cola de golondrina gigante, garrapata anaranjada) ; Phryganidia cali fornica Packard (gusano del roble de California) ; Phyllocnistis citrella Stainton (minador de los cítricos); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minadora) ; Pieris brassicae Linnaeus (mariposa grande de la col); P. rapae Linnaeus (pequeña mariposa de la col); P. napi Linnaeus (mariposa blanca con venas verdes); Platyptilia carduidactyla Riley (polilla penacho de la alcachofa); Plutella xylostella Linnaeus (palomilla de dorso diamante) ; Pectinophora gossypiella Saunders (oruga rosada); pontia protodice Boisduval & Leconte (oruga de la col del sureste); Sabulodes aegrotata Guenée (medidor omnívoro) ; Schizura concinna, J. E. Smith (oruga roja jorobada) ; Sitotroga cerealella Olivier (palomilla del granero) ; Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (procesionaria de los pinos); Tineola bisselliella Hummel (polilla de los tejidos); Tuta absoluta Meyrick (minador de las hojas del tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (Arañuela) ; Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. y Orgyia spp.

Las larvas y adultos del orden Coleópteros incluyen gorgojos de las familias Antríbidos, Bruchidae y Curculiónidos (incluyendo, aunque sin limitarse a: Kanthonomus grandis Bohéman (picudo del algodonero) ; Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (picudo acuático) ; Sitophilus granarius Linnaeus (gorgojo de los graneros); S. oryzae Linnaeus (gorgojo del arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgojo del trébol) ; Cylindrocopturus adspersus LeConte (ceutorrinco del girasol) ; Smicronyx fulvus LeConte (apión rojo del girasol) ; Si sordidus LeConte (apión gris del girasol); Sphenophorus maidis Chittenden (pulgón del maíz)); escarabajo saltón; escarabajo de la col; gusano de la raíz, escarabajo de hojas, escarabajo de la papa y minadores de hojas en la familia Chrysomelidae (incluyendo, aunque sin limitarse a Leptinotarsa décemlineata Say (escarabajo de la papa) ; Diabrotica virgifera virgifera LeConte (crisomela del maíz); D. barberi Smith & Lawrence (gusano de la raíz del i : norte) ; D. undecimpunctata howardi Barber (gusano de la raíz del sur) ; Chaetocnema pulicaria Melsheimer (pulguilla del maíz) ; Phyllotreta cruciferae Goeze (pulguilla del maíz) ; Colaspis brunnea Fabricius (esqueletonizador de la vid) ; Oulema melanopus Linnaeus (criocero de los cereales); Zygogramma exclamationis Fabricius (escarabajo del girasol) ) ; escarabajos de la familia Coccinellidae (incluyendo, aunque sin limitarse a: epilachna varivestis Mulsant (tortugilla del frijol) ) ; anisoplias y otros escarabajos a partir de la familia Scarabaeidae (incluyendo, aunque sin limitarse a: Popillia japónica Ne man (escarabajo japonés) ; Cyclocephala borealis Arrow (anisoplia enmascarada del norte, gusano blanco) ; C. immaculata Olivier (anisoplia enmascarada del sur, gusano blanco) ; Rhizotrogus majalis Razoumowsky (anisoplia europea); Phyllophaga crinita Burmeister (gusano blanco) ; Ligyrus gibbosus De Geer (escarabajo de la zanahoria) ) ; antreno de la familia Dermestidae; gusano del alambre de la familia Elatteridae, Eleodes spp., Melanotus spp. ; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; barrenador de la corteza de la familia Scolytidae y escarabajos de: la familia Tenebrionidae .

Son de interés adultos e inmaduros del orden Díptera incluyen : minadores de hojas Agromyza parvicornis Loew (minador de hojas de maíz); mosquitos (incluyendo, aunque sin limitarse a: Contarinia sorghicola Coquillett (mosquito del sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca de Hesse) ; Sitodiplosis mosellana Géhin (mosquito del trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosquito de la semilla del girasol)); moscas de la fruta (Tephiritidae) , Oscinella frit Linnaeus (moscas frit); gusanillos (incluyendo, aunque sin limtiarse a: Delia platura Meigen (mosca del frijol); D. coarctata Fallen (mosca gris del trigo); y otras Delia spp. , Meromyza americana Fitch (mosca del tallo de trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas', domésticas) ; Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas caseras pequeñas) ; Stomoxys calcitrans Linnaeus' (moscas estables); moscas con trompa, moscas de los cuernos, mosca azul, Chrysomya spp.; Phormia spp.; y otras plagas de moscas muscoides, tábanos Tabanus spp.; estros Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; moscardones Hupoderma spp. ; mosca del venado Chrysops spp. ; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) ; y otros Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; pulgones negros Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquinas; flebómotos, sciáridas y otros Nematocera.

Incluidos como insectos adultos y ninfas de los órdenes Hemíptera y Homoptera tales como, aunque sin limitarse, a adélgidos de la familia Adelgidae, chinches de la familia Miridae, cigarras de la familia Cicadidae, loritos, Empoasca spp.; de la familia Cicadellidae, saltahojas de las familias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae y I Delphacidae, insectos del las espinas de la familia i Membracidae, psilas de la familia Psyllidae, moscas blancas ¡ de la familia Aleyrodidae, pulgones de la familia Aphididae, filoxera de la familia Phylloxeridae, chinches harinosas de la familia Pseudococcidae', ' cochinillas de las familias Asterolecanidae, Coccidae, ; Dactylopiidae, Díaspididae, Eriococcidae, Ortheziidae, ' Phoenicococcidae y Margarodidae, i insecto de encaje de la familia Tingidae, Chinche apestosa de la familia Pentato idae, chinche de campo, Blissus spp. ; y otras chinches de los cereales de la familia Lygaeidae, ! afróforas de la familia Cercopidae chinches de la calabaza de la familia Coreidae, y j chinches tintóreas y chinches manchadoras algodoneras de la familia Pyrrhocoridae . i Miembros agronómicamente importantes del orden Homóptera' además incluyen, aunque no se limitan a: i Acyrthisiphon pisum Harris [(pulgón verde del chícharo) ; Aphis i craccivora Koch (áfido del guisante) ; A. fabae Scopoli (piojo del frijol negro); A. gossypii Glover (pulgón del algodón, pulgón del melón); A. maidlradicis Forbes (pulgón de la raíz del maíz); A. pomi De Geer ; (pulgón verde del manzano) ; A. spiraecola Patch (pulgón dé la espirea) ; Aulacorthum solani Kaltenbach (pulgón de la j papa); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgón delj fresal); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvi Iko (pulgón , Ruso del trigo) ; Dysaphis plantaginéa Paaserini (pulgón rojo del manzano) Eriosoma j ! I . ¡ lanigerum Hausmann (pulgón I lanígero) ; Brevicoryne brassicae Linnaeus (pulgón de la cpl) ; Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgón ceroso del ciruelo) ; Lipaphis erysi i Kaltenbach (pulgón dé los nabos); Metopolophium dirrhodum Walker (pulgón de los cereales); Macrosiphum euphorbiae Thomas (áfido de las papas); Myzus persicae Sulzer (pulgón verde del duraznero; pulgón gris del melocotón) ; Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgón de la lechuga) ; Pemphigus spp. (pulgones de raíz y pulgones galícolas); Rhopalosiphum maidis Fitch (pulgón de cogollo) R. padi Linnaeus . (pulgón verde de la avena); Schizaphis graminum Rondani (chinche verde); Sipha flava Forbes (pulgón amarillo de la caña de azúcar); Sitobion avenae Fabricius (pulgón de la espiga); Therioaphis maculata Buckton (pulgón manchado de la alfalfa) ; Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (adélgidos) ; y T. citricida Kirkalde (aldégido de cítrico café) aldeges ssp.; (adélgidos) Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera pecanera) ; Bemisia tabaci Gennadius (mosca blanca del tabaco, mosca blanca de la papa dulce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca blanca de hojas plateadas) ; Dialeurodes citri Ashmead (mosca blanca de los cítricos) ; Trialeurodes abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas) y T. vaporariorum Westwood (mosca blanca de invernadero) ; Empoasca fabae Harris (salta hojas de la papa). Laodelphax striatellus Fallen (salta hojas café pequeño) ; Macrolestes quadri1ineatus¦ Forbes (salta hojas del áster); Nephotettix cinticeps Uhler (salta hojas verdes); N. nigropictus Stál (salta hojas del arroz); Nilaparvata lugens Stál (salta hojas café); Peregrinus maidis Ashmead (salta hojas del maíz); Sogatella furcifera Horvath (salta hojas de dorso blanco); Sogatodes orizicola Muir (cincharritas) ; Typhlocyba pomaria McAtee (salta hojas blanco del manzano) ; Erythroneoura spp. (salta, hojas de la vid); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica) ; Icerya purchasi Maskell (cochinilla acanalada) ; Quadraspidiotus perniciosus Comstock , (Piojo de San l\José) ; Planococcus citri Risso (cochinilla algodonosa) ; Pséudococcus spp. (otro complejo de piojo blanco); Cacopsylla ' pyricolaFoerster (pulguilla del i peral); Trioza siospyri Ashmead (pulguilla caqui).

Especies agronómicamente importantes de interés del orden Hemíptera incluyen, aunque no se limitan a: Acrosternum hilare Say (chinche hedionda verde); Anasa tristis De Geer (chinche de la calabaza) ; . Blissus leucopterus leucopterus Say (chinche de campo); Corythuca gossypii Fabricius (insecto de encaje); Cyrtopeltis modesta Distant (chinche del tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Scháffer (chinche manchadora del algodón) ; Euschistus servus Say (chinche café hedionda); E. variolarius Palisot de Veauvois (chinche hedionda de una mancha); Graptostethus spp,. , (complejo de chinches de los i cereales) ; Leptoglossus corculus Say (chinche de los piñones con patas de hojas); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (chinche manchadora) ; L. Hétsperus Knight (chinche manchadora I occidental) ; L, pratensisl Linnaeus (chinche común); L. j rugulipenúis Poppus (chinche manchadora europea) ; Lygocoris pabulinus Linnaeus (chinche del manzano) ; Nezara viridula i Linnaeus (chinche hedionda ¡verde); Oebalus pugnax fabricius (chinche -hedionda del arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (chinche del algodónenlo grande); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulguilla del algodón) .

Además, las modalidades déla presente invención i pueden ser efectiva contra Hemiptera tal, Calocoris norvegicus G elin (chinche] del fresal); Orthops campestris Linnaeus; ' Plesiocoris rugicollis Fallen (chinche del ¦ I manzano) ; · Cyrtopeltis modes'püs Distant (chinche del tomate); Cyrtopeltis notatus Distant .(mosca chupadora) ; Spanagonicus i albofasciatus Reuter (p lguilla de mancha blanca); i Diaphnocoris chlorionis Sáy (chinche de la hoja de la acacia) ; Labopidicola allii Knight (chinche de la hoja de la cebolla) , ; Pseudatomoscelis \ seriatus Reuter (pulguilla del algodón); : Adelphocoris rapidus Say (chinche rápida); Poecilocapsus lineatus Fabricius (chinche de cuatro bandas); í Nysius ericae Schilling (chinche falsa); Nysius raphanus Howard (chinche falsa), Nezara viridula Linnaeus (chinche hedionda . verde); Euryga' ster spp . ; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tini'dae spp.; Blostomatidae spp.; j Reduviidae spp.; y Cimicidae spp.

Incluidos también! son adultos y larvas del orden Acari (ácaros) tal como Acería tosichella Keifer (ácaro del tulipán) ; Petrobia latens Müller (ácaro pardo del trigo); arañuelas y ácaros rojos en la familia Tetranychidae, Panonychus ul i Koch (ácaro rojo europeo) ; Tetranychus urticae Koch (arañuela roja de la patata); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel) ; T. cinnabarinus Boisduval (arañuela roja del clarel); T. turkestani Ugarov & Nikolski (arañuela del fresal); ácaros planos de la familia Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de los cítricos); ácaros del moho de la familia Eriophyidae y otros ácaros de alimentación foliar y ácaros importantes en la salud humana y animal, es decir, ácaros del polvo de la familia Epidermoptidae, ácaros de los folículos en la familia Demodicidae, ácaros de la harina en la familia Glycyphagidae, garrapatas del orden Ixodidae. Ixodes scapularis Say (garrapatas de ciervos); I. holocyclus Neumann (garrapata Australiana que provoca parálisis) ; Dermacentor variabilis Say (garrapata de perro americano) ; Amblyomma americanum Linnaeus (garrapata estrella solitaria) ; y arador de sarna y tiña de las familias Psoroptidae, Pyemotidae y Sarcoptidae .

Insectos nocivos del orden Thysanura son de interés tal como Lepisma: saccharina Linnaeus (lepisma) ; Thermobia doméstica Packard ,(insecto del fuego).

Plagas de artrópodos adicionales cubiertas incluyen: arañas del orden Araneae tal como Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (araña parda reclusa) ; y Latrodectus mactans Fabricius (araña viuda negra), y ciempiés del orden Scutigeromorpha tal como Scutigera coleoprata Linnaeus (ciempiés casero) .

Pueden examinarse; insectos nocivos para actividad pesticida de composiciones de las modalidades en etapas de desarrollo tempranas, por ejemplo, como larvas u otras formas inmaduras . Los insectos pueden criarse en la oscuridad total de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C y de aproximadamente 30% a aproximadamente 70% de humedad relativa. Los bioensayos pueden realizarse como se describe en Czapla y Lang ( 1990 ) J. Econ. Entomol. 83 ( 6 ) : 2480 -2485 . Los métodos para criar larvas de insectos y realizar bioensayos son bien conocidos por alguien con experiencia en la técnica. | Se conocen por alguien con experiencia en la técnica una amplia variedad de técnicas de bioensayos. Procedimientos generales incluyen la adición del compuesto u organismo experimental a la ; fuente dietética en un contenedor cerrado. Puede medirse la actividad pesticida mediante, aunque no se limita a cambios en la mortalidad, pérdida de peso, atracción, repelencia i y otros cambios de comportamiento y físicos después de la alimentación y exposición durante un periodo apropiado. Los bioensayos descritos en la presente pueden utilizarse con cualquier alimento de insecto nocivo en la etapa de larva o etapa adulta.

Se presentan los siguientes ejemplos a modo de ilustración, no a modo de limitación.

EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Bioensayo para Probar la Actividad Pesticida de la Toxina del B. thuringiensis Contra Insectos Seleccionados Los bioensayos fueron conducidos para evaluar los efectos del péptido de toxina insecticida del Bt, establecido en la SEQ ID NO: 2, en una variedad de especie lepidópteros como se muestra en la Tabla 1. Se condujeron ensayos de alimentación en una dieta artificial que contiene la proteína insecticida. La proteína insecticida se aplicó tópicamente utilizando una dieta artificial específica de lepidópteros. La toxina fue aplicada en un índice de 0.3 ug por 25 uL de la muestra por pozo y se dejó secar. La proteína está en 10 mM de tampón de carbonato en un pH de 10. Se colocó una larva recién nacida en cada pozo para alimentar ad libitum durante 5 días. Los resultados se expresaron como positivos para las reacciones de las larvas tales como aturdimiento y o mortalidad. Los resultados se expresaron como negativos si las larvas eran similares al control negativo que tiene la dieta de alimentación a la cual sólo se ha aplicado la regulación anterior.

Tabla 1. Resultados de bioensayo de alimentación para la SEQ ID NO: 2 Ejemplo 2: Transformación de Maíz Mediante Bombardeo de Partículas y Regeneración de Plantas Transgénicas Los embriones de maíz inmaduro a partir de plantas donadoras del invernadero, son bombardeados con una molécula de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de toxinas (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) operablemente enlazada a un promotor de ubiquitina y el gen PAT marcador seleccionable (Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25-37), el cual confiere resistencia al herbicida : Bialaphos . Alternativamente, se proporciona el gen marcador seleccionable en una molécula de ADN separada. Se realiza la transformación como sigue. A continuación siguen las fórmulas intermedias.

Preparación de Tejido Objetivo Se descascaran las espigas y se esterilizan superficialmente en 30% de blanqueador CLOROX™ más 0.5% de detergente Micro durante 20 minutos y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y colocan en el eje embrionario hacia abajo (escutelo hacia arriba) , 25 embriones por , placa, un medio 56 OY durante 4 horas y luego se alinearon dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en la preparación por bombardeo.

Preparación de ADN Se realiza un vector plásmido que comprende una secuencia de nucleotidos de toxina (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1) operablemente enlazada a un promotor de ubiquitina. Por ejemplo, un vector de transformación adecuado comprende un promotor UBI1 de Zea mays , un 5'UTR de UBI1 y un intrón UBIl, en combinación con el terminador Pinll. El vector adicionalmente contiene un gen marcador seleccionable PAT conducido por un promotor CAMV35S e incluye un terminador CAMV35S. Opcionalmente, el marcador seleccionable puede residir en un plásmido separado. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleotidos de toxina así como un marcador seleccionable PAT se precipita sobre 1.1 µ?? (diámetro promedio) de gránulos de tungsteno utilizando un procedimiento de precipitación de CAC12 como sigue: 100 \iL de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 uL (1 pg) de ADN en tampón Tris EDTA (1 ig de ADN total) 10 uL de 0.1 M de espermidina Se agrega cada reactivo secuencialmente a una ? ; I ' suspensión de partículas dé tungsteno, mientras se mantiene en el vibrador de tubos múltiples. La mezcla final se somete a ultrasonido brevemente y se deja incubar bajo vórtice constante; durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se les remueve el líquido, se lavan con 500 mL de 100% de etanol y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente, se remueve el líquido, y se agrega 105 u¿ de 100% de etanol al gránulo de partículas de tungsteno final. Para bombardeo con pistola genética, - las partículas j de tungsteno/ADN se someten a ultrasonido brevemente y se: tiñe el centro con 10 pL en cada macroportador y se deja secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. j Tratamiento con Pistola Genética ¡Las placas de muestra se bombardean en el nivel #4 ? con pistola genética #HE34^1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un disparo sencillo! en 650 PSI, con un total de diez alícuotas1 tomadas a partir de cada tubo de partículas /ADN preparadas . | Tratamiento Subsiguiente j Después del bombardeo, los embriones se mantienen en un medio 560Y durante 2 días, luego se transfieren a un medio de selección 560R conteniendo 3 mg/litros de Bialaphos, í ¦ y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callos resistentes a i i I ; la selección se transfieren a un medio 288J para iniciar la regeneración vegetal. Después de la maduración embrionaria somática (2-4 semanas)', embriones somáticos bien desarrollados se transfieren a un medio para germinación y se transfirieron al cuarto de cultivo. Aproximadamente 7-10 días después, se transfirieron las plántulas en desarrollo a un medio libre de hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas estuvieran bien arraigadas . Las plantas se transfieren entonces a insertos en plataformas (equivalentes de macetas de 6.35 cm (2.51 pulgadas)) conteniendo tierra de abono y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, cultivadas subsiguientemente 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren en 600 macetas clásicas (6.05 litros) (1.6 galones) y se cultivaron hasta la madurez. Las plantas se monitorearon y se clasificaron para expresión de la toxina mediante ensayos conocidos en la técnica o cómo se describen anteriormente. Bombardeo y Medio de Cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416) , 1.0 mL/L de la Mezcla de Vitaminas de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0.5 mg/L de HC1 de tiamina, 120.0 g/L de sacarosa, 1.0 mg/L de 2,4-D, y 2.88 g/L de L-prolina (incorporada en un volumen con di de H20 después del ajuste de pH 5.8 con KOH) ; 2.0 g/L de Gelrite™ (agregada después de conseguir un volumen con di de H20) ; y 8.5 mg/L de nitrato dé plata (agregado ídespués de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiehte) . El medio de selección (560R) comprende : 4.0 g/L de sales ¡básales de ?ß (SIGMA C-1416), 1.0 mL/L de Mezcla de Vitaminas ;de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0.5 mg/L de HC1 de tiamina,* 30.0 g/L de sacarosa, y 2.0 mg/L i de 2,4-D (incorporada en un volumen con di de H20 después del ajuste al pH 5.8 con KOH), ; 3.0 g/L de Gelrite™ (agregado después de conseguir un volumen con di de H20) ; y 0.85 mg/1 de nitrato de plata y 3.0 mg/L de Bialaphos (ambos se agregan después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) .

El medio de regeneración de plantas (288J) comprende1 4.3 g/L de sales i MS (GIBCO 11117-074), 5.0 mL/L de una solución concentrada de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotínico, 0.02 g/L de HCl de tiamina, 0.10 g/L de HC1 de piridoxiná, y 0.40 g/L de Glicina se consigue un volumen con D-I H20 refinado (Murashigé y Skoog (1962) Physiol, Plant. 15:473), ;100 mg/L de mio-inositol , 0.5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarosa, y 1.0 mL/L de 0.1 M de ácido abscísico (se consigue un volumen con di j H20 refinado después de ajustar a pH 5.6); 3.0 g/L de Gelrite™ (agregado después de conseguir un volumen con di H20) ; y 1.0 mg/L de ácido indoleacético y 3.0 mg/L de Bialaphos (agregado después de esterilizar el medio y el enfriamiento a 60°C) .

El medio libre de' hormonas (272V) comprende 4.3 g/L de sales' MS (GIBCO 5.0 mL/L de solución concentrada de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotínico, 0.02 g/L de HCl de tiamina, 0.10 g/L de HC1 de piridoxina, 0.40 g/L de Glicina incorporada a volumen con di H20 refinado), 0.1 g/L de mio-inositol , y 40.0 g/L de sacarosa (incorporáda a volumen con di1 H20 refinado después de ajustar el pH a 5.6); y 6 g/L de' Bacto-agar (agregado después de conseguir1 volumen con di: H20 refinado), esterilizado y i enfriado a 60°C. 1 I Ejemplo 3: Transformación Mediada por Agrobacterium de Maíz y Regeneración dé Plantas Transgénicas i Para la transformación mediada por Agrobacterium de maiz con una secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1) puede utilizarse el método de Zhao (Patente Norteamericana No. 5,981,84,0 y la publicación de patente PCT W098/32326; los contenidos !de los cuales se incorporan en la presente para referencia). Brevemente, se aislan los embriones' inmaduros a partir de maíz y los embriones en contacto con una suspensión! de Agrobacterium bajo condiciones I por lo que las bacterias son capaces de transferir la secuencia de nucleótidos de toxina (SEQ ID NO: 1) por lo menos para una célula de por lo menos uno de los embriones i inmaduros (etapa 1: la etápa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros pueden sumergirse en suspensión de Agrobacterium para el inicio de inoculación. Los embriones se i .

I . co-cultivan durante un tiempo con Agrobacterium (etapa 2: la etapa dé co-cultivo) . Ijos embriones inmaduros pueden cultivarse en un medio sólido después de la etapa de j infección. Después de este periodo de co-cultivo, se contempla una etapa de "reiposo" opcional. En esta etapa de i reposo, l,os embriones se incuban en la presencia de por lo i menos un antibiótico conocido para inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para las plantas transformables (e,tapa 3: etapa de reposo). Los embriones, inmaduros pueden jser cultivados en un medio sólido i con un antibiótico, aunque¡sin un agente de selección, para eliminación de Agrobacteriúm y para una fase de reposo, para las células infectadas. Después, se cultivan los embriones i inoculados en un medio conteniendo un agente selectivo y se recupera el crecimiento de ¡callos transformados (etapa 4: la : i , i etapa de selección) . Los embriones inmaduros se cultivaron en un medio¦ solido con un agente selectivo resultando en el crecimiento selectivo de células transformadas. Los callos se regeneran entonces en plantas (etapa 5: la etapa de regeneración) y el crecimiento de callos en el medio selectivo puede cultivarse ¡en un medio sólido para regenerar las plantas . ! Ejemplo 4: Transformación de Embriones de Soya Se bombardean los! embriones de soya con un plásmido que contiene la secuencia de: nucleótidos de la toxina de la SEQ ID NO: 1, operablemente enlazada a un promotor pinll como sigue. Para inducir embriones somáticos, cotiledóneas, de 3-5 mm de largo extirpadas desde las semillas inmaduras de superficie esterilizada de un cultivo de soya apropiado se cultivan en la luz o en la oscuridad a 26°C en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas . Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se extirpan entonces y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida para racimos de embriones somáticos que se multiplican como embriones en etapa globular temprana, las suspensiones se mantienen como se describe posteriormente .

Los cultivos de suspensión embriogénica de la soya pueden mantenerse en 35 mL de un medio líquido en un agitador giratorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes en un horario de 16:8 horas día/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de un medio liquidó.

Los cultivos de suspensión embriogénica de la soya pueden entonces transformarse mediante el método de bombardeo de pistola genética (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, Patente Estadounidense No. 4,945,050). Un instrumento PDS1000/HE de ¡ Du Pont Biolistic (adaptado con helio) puede utilizarse para estas transformaciones.

Un gen marcador seleccionable que puede utilizarse para facilitar la transformación de la soya, es un transgen compuesto del promotor 35S del Virus de Mosaico de la Coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), el gen de la higromicina fosfotransferasa a partir del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz et al.' (1983) Gene 25: 179-188), y la región 3' del gen de la nopalina sintasa a partir del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium turnefaciens . El cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de la toxina (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1) enlazada operablemente al promotor pinll puede aislarse como un fragmento de restricción. Este fragmento puede entonces insertarse en un único sitio de restricción del vector que porta el gen marcador .

Se agrega a 50 uL de una suspensión de partícula dorada de 60 mg/mL de 1 µ?? (en orden) : 5 L de ADN (1 µg µL) , 20 uL de espermidina (0.1 ¡M) y 50 de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas se agita entonces durante tres minutos, girando en una microcentrifugadora durante 10 segundos y se remueve el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan entonces una vez en 400 ]íh de 70% de etanol y se vuelven a suspender en 40 uL de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas puede someterse a ultrasonido tres veces durante un segundo cada una. Cinco microlitros de las partículas doradas recubiertas con ADN se cargaron entonces en cada disco macro portador.

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas se coloca en un plato petri vacio de 60 x 15 mm y el líquido residual se remueve desde el tejido con una pipeta1. Para cada experimento de transformación, se introducen normalmente alrededor de 5-10 placas de tejidos. La presión de ruptura de membrana se establece en 1100 psi, y la cámara se evacúa a un vacío de 71.12 centímetros de mercurio (28 pulgadas de mercurio). El tejido se coloca aproximadamente 8.89 cm (3.5 pulgadas) lejos de la malla de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido puede dividirse a la mitad y colocarse de nuevo en líquido y se cultiva como se describe anteriormente .

Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido puede intercambiarse con un medio recién preparado, y once a doce días después del bombardeo con un medio recién preparado conteniendo 50 mg/mL de higromicina. El medio selectivo puede volver a prepararse cada semana. Siete a ocho semanas después del bombardeo, puede observarse el crecimiento del tejido transformado, verde a partir de racimos embriogénicos necróticos no transformados. El tejido verde aislado se remueve e inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénica transformados, clonalmente propagados. Cada nueva línea puede ser tratada como un evento de transformación independiente.

Estas suspensiones pueden éntonces subcultivarse y mantenerse como racimos de embriones inmaduros o regenerarse en plantas completas mediante madurapión y germinación de embriones somáticos individuales.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente se indicara específica e individualmente para ser incorporada para referencia.

Aunque se ha descrito la invención anterior en algún detalle a manera de ilustración y de ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las modalidades.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, seleccionada del grupo caracterizada porque consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o un complemento de longitud total de la misma; b) una molécula de ácido nucleico la cual codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ; c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en donde por lo menos 90% de identidad de secuencias a la secuencia de aminoácidos de (b) ; y d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una , secuencia de aminoácidos en donde por lo menos 95% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácido de (b) .

2. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para expresión en una planta.

3. La construcción de ADN caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.

4. La construcción1 de ADN de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizada además porque comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

5. La célula huésped caracterizada porque contiene la construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3.

6. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula bacteriana.

7. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula vegetal.

8. Una planta transgénica, caracterizada porque comprende la célula huésped de conformidad con la reivindicación 7.

9. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, cruciferas, pimiento, papa, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, !caña de azúcar, tabaco, cebada y cañóla.

10. La semilla ; transformada de la planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la semilla comprende la construcción de ADN.

11. Un polipéptido aislado con actividad pesticida, seleccionado del grupo caracterizado porque consiste de: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO- 2 ; y b) un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1;

12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque comprende secuencias de aminoácidos heterólogas .

13. La composición, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 11.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la composición se selecciona del grupo que consiste de un polvo, masilla, gránulo, comprimido, aerosol, emulsión, coloide y solución.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la composición se prepara mediante disecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células Bacillus thuringiensis .

16. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso del polipéptido.

17. El método para controlar una población de lepidópteros nocivos, caracterizado porque comprende poner en contacto tal población con una cantidad pesticidamente efectiva de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 11.

18. El método para eliminar lepidópteros nocivos, caracterizado porque comprende poner en contacto la plaga, o alimentar a la plaga, con una cantidad pesticidamente efectiva de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 11.

19. El método para producir un polipéptido con actividad pesticida, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 4, bajo condiciones en las cuales se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO i 2; b) un polipéptido: que se codifica por la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID,NO: 1; c) una secuencia de nucleotidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de polipéptido de (a) o (b) ; ?· d) una secuencia de nucleotidos que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a una secuencia de polipéptido de (a) o (b) .

20. Una planta que ha incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad pesticida, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2; \ c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en donde por lo menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de (b) ; y ; d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácido en donde por lo menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de (b) ; en donde la secuencia de nucleótidos se enlaza operablemente con un promotor que conduce la expresión de una secuencia de codificación en una célula vegetal.

21. La planta de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la planta es una célula vegetal.

22. Un método para proteger a una planta de una plaga, que comprende introducir en la planta o célula de la misma, por lo menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipéptido pesticida, caracterizado porque la secuencia de nucleotidos se selecciona del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1; b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2; e) una secuencia! de nucleotidos que codifica una proteina que comprende una secuencia de aminoácido en donde por lo menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de (b) ; y f) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteína que comprende una' secuencia de aminoácido en donde por lo menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de (b) .

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la planta produce un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida contra lepidópteros nocivos.