TW200900008A - Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity - Google Patents

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200900008 九、發明說明： 本發明主張在2007年6月26日申請之美國專利申請 案第60/946,216號的優先權，以及2007年12月18曰申 請之泰國專利申請案第071006503號的優先權。前述這些 申請案之全部内容係併入本文作為參考文獻。 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於得自新穎蘇力菌（万ac/Z/ws ⑼6^) 基因之天然核酸及重組核酸，其編碼具有抗害蟲之殺蟲活 性之殺蟲多肽。本發明之組成物及方法係利用所揭示之核 酸及其所編碼之殺蟲多肽來防治植物害蟲。 【先前技術】 害蟲是造成全球農作物損失之主要因素。例如夜盜蛾 (armyworm)的進食、球菜夜蛾（black cutworm)的破壞或歐 洲玉米螟的損害都可能在經濟上重創農業生產者。單單來 自於歐洲玉米螟攻擊田間及甜玉米所造成的害蟲相關農作 物損失，就損害與防治費用上而言，已經達到每年約10 億美元。 傳統上，主要來攻擊害蟲族群諸如球菜夜蛾族群的方 法係施用廣效性化學殺蟲劑。但消費者以及政府管理者逐 漸擔憂有關合成化學殺蟲劑的製造及使用上對環境所帶來 的危害。由於此等擔憂，管理者已經禁止或限制某些危害 程度較高之殺蟲劑的使用。因此，發展替代性殺蟲劑為實 質上所需。 使用微生物製劑諸如真菌、細菌或其它種昆蟲以生物 5 94306 200900008 防治農業重要害蟲，係提供作為合成化學殺蟲劑之環保友

V 善且具有經濟吸引力之替代品。概略言之，使用生物殺蟲 劑之污染風險及環境危害低，且生物殺蟲劑與傳統廣效性 化學殺蟲劑之特性相較具有較高標把特異性。此外，生物 殺蟲劑的製造上通常較為價廉，如此改良多種農作物之經 濟產量。 某些芽孢桿菌屬之微生物已知具有殺蟲活 性，可對抗廣泛害蟲包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅 目及其它害蟲。蘇力菌i/zwrkg/e似z_«s(Bt))及乳突 芽孢桿菌尤其為至今所發現之最成功 的生物控制劑。幼蟲芽孢桿菌（及、緩病芽抱桿菌（5. 似）、球形芽抱桿菌（5. •s'p/zflerz’cwsXHarwook 編 輯，（（1989)Bacillus(伯楠出版社（Plenum Press)，306)及堪 狀芽孢桿菌〇5.“1^似)('\¥0 96/10083)係造成昆蟲致病。殺 蟲活性係集中於伴孢晶體蛋白質包涵體（parasporal crystalline protein)，但殺蟲蛋白質已經由芽孢桿菌之營養 生長期分離出。若干編碼此等殺蟲蛋白質之基因已經分離 及定性（例如參考美國專利案第5,366,892及5,840,868號）。 微生物殺蟲劑，特別是得自芽孢桿菌品系之微生物殺 蟲劑，它們已於農業中扮演重要角色而作為化學害蟲防治 的替代品。晚近農業科學家已經發展出具有增強之抗蟲性 之農作物，其係經由對農作物進行基因工程加工來製造得 自芽孢桿菌之殺蟲蛋白質。例如玉米植株及棉植株已經過 基因工程以製造分離自Bt品系之殺蟲蛋白質（例如參考 6 94306 200900008

Aronson (2002) cell Mol. Life Sci. 59 (3):417-425 ； Schnepf 等人（1998) Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3):775-806)。此等 基因工程作物現已廣泛用於美國農業，且其提供農夫替代 傳統昆蟲防治法之對環保友善之方法。此外，經過基因工 程而含有殺蟲Cry毒素之馬鈐薯已經販售給美國農人。雖 然證實在商業上極為成功，但這些經過基因工程之抗蟲性 農作物只對狹窄範圍之經濟重要害蟲提供抗性。 如此，仍然需要對害蟲具有廣泛殺蟲活性範圍之新穎 Bt毒素，例如對來自鱗翅目（Lepidoptera)之廣泛昆蟲具有 活性之毒素。此外，仍然需要對多種害蟲具有活性之生物 殺蟲劑以及具有改良之殺蟲活性之生物殺蟲劑。 【發明内容】 本發明係提供對抗害蟲之組成物及方法。更特別，本 發明之實施例係關於對抗昆蟲之方法，係利用編碼殺蟲胜 肽之核苷酸序列來製造表現實施例之殺蟲多肽之轉形 (transformed)植物。此等害蟲包括農業重要害蟲，例如： 黃莖模例如；Walker。於若干實施例 中，該核苷酸序列編碼對屬於鱗翅目之至少一種昆蟲具有 殺蟲性質之多肽。 實施例提供編碼具有對抗害蟲之殺蟲活性之多肽之核 酸及其片段及變體（例如編碼SEQ ID NO:2之SEQ ID ΝΟ:1)。實施例中得自Bt之野生型（例如天然發生）核酸序 列係編碼新穎殺蟲胜肽。實施例進一步提供所揭示之編碼 生物活性（例如殺蟲）多肽之核酸序列之片段及變體。 7 94306 200900008 實施例進一步提供由實施例之天然發生核酸或經修改 (例如經突變或經操作）核酸所編碼之經分離之殺蟲（例如 殺昆蟲）多肽。於特定實例中，實施例之殺蟲蛋白質包括由 設計來將特殊胺基酸序列導入實施例之多肽之突變核酸所 製造之全長蛋白質及多肽之片段。於特定實施例中，與自 其中衍生實施例之多肽之天然多肽活性相較，實施例多肽 具有較高殺蟲活性。 實施例之核酸亦可用來製造基因轉殖（例如轉形 (transformed))單子葉植物或雙子葉植物，該植物特徵為基 因體包含至少一個穩定組合之核苷酸構成體（construct)， 該構成體包含實施例之編碼序列，其操作式聯結至驅動所 編碼之殺蟲多肽表現之啟動子。如此，本發明亦提供轉形 植物細胞、植物組織、植株及其種子。 於一特定實施例中，使用已經對宿主植物體内增加表 現進行最佳化之核酸以製造轉形植物。例如，實施例之殺 蟲多肽之一可反向轉譯來製造於特定宿主中表現為最佳化 之包含密碼子之核酸，該宿主例如為農作物，例如稻 植株。藉此種轉形植物（例如雙子葉植物或單子葉植 物）表現編碼序列將導致製造殺蟲多肽，而對植物賦予較高 抗蟲性。若干實施例提供表現殺蟲多肽之基因轉殖植物， 其可用於對抗多種害蟲之方法。 實施例復包括含有實施例之殺蟲多肽之殺蟲組成物或 殺昆蟲組成物，視需要可包含額外殺蟲胜肽。實施例涵蓋 將此等組成物施用至害蟲環境來對抗害蟲之應用。 8 94306 200900008 【實施方式】 本發明之實施例係為用於對抗害蟲，特別為植物害蟲 之組成物及方法。尤其是，實施例之經分離之核酸及其片 段及變體包含編碼殺蟲多肽（例如蛋白質）之核酸序列。所 揭示之殺蟲蛋白質對害蟲諸如但非限於鱗翅目害蟲，具有 生物活性（例如殺蟲性）。目標害蟲包括但非限於黃莖螟， 例如三化模（Scr/pop/zagfl kceriw/as);歐洲玉米模例如 Ostrinia nubilalis ’，玉米德義例如 Helicoverpa zeae .，常尤 "莖煩例如尸印/apewfl狀心以；夜盜蛾例如Pseudaletia ;西南玉米模例如 ;球菜 夜蛾例如 Agrotis⑽；秋夜蛾例如办 介;甜菜夜蛾例如;及小菜蛾例 如 Plutella xylostella。 實施例之組成物包含經分離之核酸及其片段及變體， 其編碼殺蟲多肽、包含實施例之核酸之表現卡匣 、（expression cassette)、經分離之殺蟲蛋白質及殺蟲組成 物。若干實施例提供經修改之殺蟲多肽，其特徵為相較於 對應野生型蛋白質之殺蟲活性，對鱗翅目具有改良之殺蟲 活性。實施例進一步提供以此等新穎核酸轉形之植物及微 生物’以及涉及此等核酸、殺蟲組成物、經轉形有機體及 其產物之應用之用於對抗害蟲之方法。 實施例之核酸及核苷酸片段可用來轉形任何有機體以 製造經編碼之殺蟲蛋白質。本發明提供之方法涉及使用此 等轉形有機體來對抗或防治植物害蟲。實施例之核酸及核 9 94306 200900008 芽酸序列也可用來轉形胞器，諸如葉綠體⑽We等人 (1995)Biotechnol〇gy 13:362-365； ^ Kota f Λ(1999) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 96:1840-1845)。 貫施例復關於對編碼生物活性殺蟲蛋白質之天然編碼 序列之片段及憂體之識別。實施例之核普酸序列可直接用 於對抗害蟲，特別為有害昆蟲諸如鱗翅目害蟲之方法。如 此丄實施例提供無須仰賴傳統合成化學殺蟲劑之使用而對 广抗害蟲之新穎方法。實施例涉及發現天然、可生物分解之 殺虫*劑及編碼這些殺蟲劑的基因。 實施例復提供亦編碼生物活性多肽（例如殺蟲多肽）之 天然編碼序列之片段及變體。實施例之核酸涵蓋已經為了 於特定有機體細胞表;見而最佳化之核酸或核普酸序列，例 如已經使用基於具有提升之殺蟲活性之多肽之胺基酸序列 之該植物較佳密碼子而反相轉譯（亦即.為反轉譯）之核酸序 列。實施例復提供可對實施例之多肽賦予改良性質或變更 焊質之突變。例如參考共同審查中之美國申請案第 麗06,320號，申請日·3年6月25日及第助46，叫 號’申請曰2003年12月24曰。 ’ 後文說明中，使用大量術語。提供下列定義來協助 解實施例。 單位、前標及符號係以SI所接受的形式標示。除非另 行指示’否則核酸係以5,至3,方向由左至右撰寫；胺基酸 序列分別以胺基至羧基方向由左至右撰寫。數值範圍係包 含界定該範圍之數目。胺基酸於此處係以常用的三字母= 94306 10 200900008 ，標示，或以IUPAC-IUB生物化學命名委員會所推薦的一 字母符號標示。同樣地，核苷酸可以一般所接受的單一字 母代碼標示。前文定義之術語係由參照說明書全文更完敕 定義。 i _如此處使用，「核酸」包括呈單股形式或雙股形式之去 氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物，除非另行限 制’否則涵蓋具有天然核㈣主要性質之已知類似物（例如 肽核酸)，原因在於其係以類似於天然核苷酸之雜交方式而 雜交單股核酸。 々'如此處使用，當用於特定核酸時，「編碼」或「經編碼」 =詞表示核酸包含指示核㈣序列直接轉譯成為特定蛋白 質之所需#訊。蛋白質之經編碼資訊係使用密碼子具體指 明。編碼蛋白質之核酸可包含於核酸轉譯區內部之非轉譯 序列（例如插人序列），或·^缺乏此種穿插其中的非轉 列（例如於cDNA)。 、「如此處使用，述及特定多核苦酸或其編碼蛋白質時， 「全長序列」表示具有天然（非合成）内生序列之完整核酸 序列或完整胺基酸序列。全長多核普酸編碼特定蛋 全長、催化活性形式。 貝之 「如此處使用，於核㈣序列之方向性内文中所使用之 巧ntiSense)」一詞係指一種以反義股會被在轉錄之 :而刼作式地連接至啟動子之雙股多核苷酸序列。 股係與内生轉錄產物充分互補，故内生轉纟f # 縈為七丘丨, 又門玍轉錄產物之轉譯經 ㊉又抑制。如此’ t「反義」—詞用於特定核㈣序列之 94306 11 200900008 内文時，該術語係指該所述轉錄產物之互補股。 「多肽」、「胜肽」及「蛋白質」等詞於本文可互換使 用來指胺基酸絲之聚合物。該等術語應料胺基酸聚合 物’其中-個或多個胺基酸殘基為對應之天然胺基酸二 造化學類似物，以及天然胺基酸聚合物。 「殘基」或「胺基酸殘基」或「胺基酸」等詞於本文 可互換用來指結合成為蛋白質、多肽或胜肽（合稱為「蛋白 質」）之胺基酸。胺基酸可為天然胺基酸，除非另行限制， 否則涵蓋可以天然胺基酸之類似方式發揮功能之天然胺芙 酸之已知類似物。 & 實施例之多肽可由此處揭示之核酸製造，戋使用俨 分子生物學技術製造。舉射之，實關之蛋自質可:由 於適當宿主細胞表現實施例之重組核酸而製造，或另外， 可經由於活體外程序之組合而製造。 如此處使用，「經分離」及「經純化」等詞可互換用來 指實質上或大致上不含如於天然環境中所出現般之伴隨著 核酸或多肽之成分或與該等核酸或多狀交互作用之成分之 核酸、或多肽或其生物活性部分。如此，經分離或經純化 之核酸或多肽當藉重組技術製造時，實質上不含呈它细胞 :質^養基，·或當藉化學合成時，實質上不含化學前驅 物或其它化學物。 之某酸大致上不含於衍生該核酸之有機體 而及 '之序列）之序列（例如蛋白f編瑪序列）。舉例言 94306 12 200900008 之’在不同實施例中八座 • 列〒刀離之核酸可含有少於約s , kb、3 kb、2 kb、1 kb、〇 5 处 kb ' 4 之細胞基因體DNA中i i 5 之於何生該核酸 如此處使用Λ及f 4之核苦酸序列。 田k及貫苑例之多肽使用「钿八 經純化」等詞時，表示經分離之蛋白質 或 物質，且包括含有少於約3〇%、2〇%、1〇%、、^細， 重計算)污染蛋白質之蛋白質製劑 之=(以乾 生物活性部分係重組製造時，培養基表示二其 …目標蛋白質之化學物係低於約3〇%、 或非 乾重計算）。 〇/°、或5% (以 全文說明書中，「包合七甘你" 式「4人 3」或其毚化術語諸如「包含右 $ 」須了解暗示含括所陳述之元件、敕」 元件、整體或步驟組群，但未排除任何其它=或，或 或步驟或元件、整體、或步驟組群。、正體、 如此處使用，「對抗宝* 之昆蟲進食、生長及/^1」一巧表示對於任何發育階段 、死= ^的造歧變，包括但非限於. -死:蟲;延遲生長，·妨礙繁道能力 如此處使用，「殺蟲活性」及厂殺Θ虫 JA14專。 同義詞用來指有機體、、舌性$胳哲,％棘/性」等詞係為 Μ有機體活性或物質（例如蛋白質 猎由但非限於在昆蟲進食 _ /、了 亡率、害蟲體重減輕、：==時間長度後之害蟲死 化而測里。如此，具有殺蟲活性 里支 :可:量之害蟲適應參數造成不良影 貝」為本身顯示或組合其它蛋白質而顧示殺蟲活性=白 94306 13 200900008 質。 士如此處使用，「殺蟲有效量」〆詞表示當存在於产 有殺蟲活性之物質或有機體的量。對各物質或有： =同：=境中各害蟲受襲之殺蟲有效量係憑經: 、疋5 5 救蟲有效量」於害蟲為有害昆蟲時可用來_ 「殺昆蟲有效量」。 水才曰 如此處使用，「重h程處理」或「工程處理」等 「不土於對蛋白質作用機轉的了解、及考量所導人、刪除或 胺基酸，利用重組崎技術來導入（例如工程處理 蛋白質結構的改變。 } 如此處使用，「突變核普酸序列」或「突變」或「突變 么f核普酸序列」係指經突變發生或經改變而含有非存在 於相對應之野生型序列φ + . ^ ^ 子在 臉基*:)之核⑽列。此種突變發生或改變係由-個二 =核心殘基之添加、刪除或取代或置換雜成。當突變係 二加、移除、或置換蛋白f分解位置之胺基酸進行時^ 加、移除或置換可於蛋白f分解位置模體（刪之 内部或相鄰於蛋白質分解位置模體進行，只要可完成突變 目的即可（亦即，只要兮你¥ (卩㈣位置之蛋白質分解被改變即可）。 ^變核㈣序列可編碼顯示改良的錢低的殺蟲活性 之大隻殺蟲毒素，或編碼對含有該胺基酸序列之多肽賦予 改良:或減低的殺蟲活性之胺基酸序列。如此處使用，於 =白質、多肽或胺基酸序列内文巾「㈣# 相係指已經錢發生或改“含有不存在於對應之野1 94306 14 200900008 型序列中之一個或多個胺基酸殘基之序列。此種 或改變包含-個或多個胺基酸殘基之添加、删除或料或 置換。突變株多肽顯示改良的或降低的殺蟲活性，或表示 可對含有該胺基酸序列之多肽賦予改良之殺蟲活性之胺其 酸序列。如此，「突變株」或「突變」等詞係指突變核苦ς 序列及編碼胺基酸中之任—者或二者。突變株可單獨使 用，或以任何可相容之組合而與實施例之其它突變株或其 它突變株組合使用。「突變株多肽」可相反地顯示殺蟲活性 的降低。當對特定核酸或蛋白質施加多於一種突變時，突 變可同時施加或循序施加；若循序施加，職變可以任何 適當順序施加。 如域使用，「改良之殺昆蟲活性」或「改良之殺蟲活 性」係指實施例之殺蟲多肽與其相對應之野生型蛋白質活 f生相對具有提升之殺蟲活性；及/或可有效對抗更廣泛昆蟲 ，殺蟲多肽；及/或對野生型蛋白質毒性不敏感之昆蟲具有 Γ異'ϋ之殺蟲多肽。殺蟲活性改良或提升須比較對相同昆 触之野生型殺蟲多肽之殺蟲活性，且驗證對昆蟲標的 之权蟲活性增高至少10%，或至少20%、25%、鄕、35%、 40/。45/。、50%、60%、70%、1〇〇〇/0、15〇%、200%、或 300°/。或以上。 舉例言之，當相對於受野生型Bt毒素所影響之昆蟲範 受該多肽影響之昆蟲範圍較寬或較窄時，提供改良之 f蟲或殺昆蟲活性。當期望為多樣化時，希望較寬的有效 祀圍’當期望益蟲不會由於使用該毒素或該毒素的存在而 15 94306 200900008 .受影響時，期望較窄之有效範圍 特定作用機轉所限，但改良之殺蟲活二 :罐之改變而提供;例如多敗於昆蟲腸 持績時間與相對應之野生型蛋白質 — 較係為增高。 1王及持續％•間比 、「毒素」一詞用於此處係指顯示殺蟲活 性或改良之殺蟲活性或改良 ' nc；；；"77 ry 毒素。 Cry2、或Cry3之這類 立赋予「：，：解位置」或「切位」等詞係指胺基酸序列， ^胺美於序二白酶或一種特定蛋白酶敏感性，而讓含有 ===列之多肽可由該類蛋白酶或特定蛋白酶消化。 =:=據稱對可辨識該位置之蛋白酶「敏感」。本 技術湏域須了解消化效率會改 致多肽於昆蟲腸道中之安定性卞拉病士效率的減低可能導 白=置可物多於一種蛋白酶或 ； 度，但不同蛋白酶於該位置之消化功效會不同。蛋白y 白酶位置。鱗位置礼糜蛋白酶位置及彈力蛋 研究顯示鱗翅目昆蟲腸道蛋白酶包 蛋白酶及彈力蛋白酶。例如參考Lenz二=

Insect Biochem. Physiol. 16*201-212* A Η Η -eh. insect Bi〇chem. Physi〇1 ^ ysiol. 53.30-47。例如，於蕃茄夜 94306 16 200900008 蛾arwz’gera)幼蟲的中腸發現約18種不同的 胰蛋白酶（參考 Gatehouse 等人（1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27:929-944)。此等蛋白酶之較佳蛋白質分解受質位置 已被研究。例如參考Peterson等人（1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25:765-774)。 致力於了解Bt毒素之作用機轉及工程處理具有改良 性質之毒素。已顯示昆蟲腸蛋白酶可影響Bt Cry蛋白質對 昆蟲的作用。若干蛋白酶經由將Cry蛋白質由「前毒素」 形式處理轉成為有毒形式或「毒素」來活化Cry蛋白質。 參考 Oppert(1999) Arch. Insect Biochem· Phys. 42:1-12 ;及 Carroll 荨人（1997) (1997) J. Invertebrate Pathology, 70:41-49。此種毒素之活化包括由蛋白質移除n端胜肽及 C端胜肽，且也可包括蛋白質之内部裂解。其它蛋白酶可 分解Cry蛋白質。參考〇ppert(同上文)。 比較具有不同特異性之Cry毒素之胺基酸序列，顯示 有五個高度保留性序列段。於結構上，毒素包含三個不同 的功能部位（domain) ’由N端至C端為：暗示孔洞的形成 之七個α-螺旋之組（cluster)(稱作為「功能部位1」）；暗示 細胞的結合之三個逆平行β平板（稱作為「功能部位2」）； 及β夾層（SandwiCh)(稱作為「功能部位3」）。這三個功能 部位之所在位置及性質係為熟習本領域技藝人士所知。例 如參考 Li 等人（1991)Nature，305:815-821 及 Morse 等人 pOOUSmiCture，9:409-417。當述及一個特定功能部位， 諸如功能部位1時，須了解有關特定序列之功能部位之確 17 94306 200900008 切終點並不具關鍵性，只要該序列或复$八七 m ^ ^ ^ , 文X汁幻又八邻分包括可提供歸 因I:特疋功能部位之至少若干功能之序列即可。如此 例如當述及「功能部位 如此 至少一紐夺/、心才曰—個特定序列包括 ' 00-螺旋，但就該組所述或所使用之序列之 確切終點並不具關鍵性。 序列之 點之測定及此等功能之評^本找技勢人士熟悉此種終 =1佳特徵化與改良m毒素，已研究細菌扮品系。 ，右二 系培養所製備之晶體製劑對歐洲玉米蛵且 有叙蛛活性（例如參考實驗例卜2及 二 細菌品系分==之纖序列，以及已由此等 * ^ ^ 、 予生亦即天然發生）核酸，轉殖 性較，成了 形入大腸桿菌。依據—給定製劑之特 處理來活化殺蟲蛋… ’于而由胰蛋白酶别 要蛋白酶消化（例師胰以 若干殺蟲蛋白質需 化，而其它、乳靡蛋白酶等消化）來活 、性）。八 貝於無須活化即具有生物活性（例如殺蟲活 專利==下列手段改變，該等手段例如述於美國 斤 ” 〇6,320號，申請曰2003年6月25曰， 及第10/746 914缺 Λ 日 核酸序列可經工程:J::33年12月24曰。此外， 突變可提供較天秋Γ狀Γ 外突變之多狀，該等 活性。此種經過:程4咸蟲活性更為改良或變更之殺蟲 生型序列中發現的^核酸之㈣酸序列包含未於野 94306 18 200900008 實：例之突變株多肽通常係藉涉及下列步驟之方法製 以其於“主主 核酸序列；分析該多肽結構 素作用模式中之標_能部位之預計功能之 Γ個因序列突變發生之特定「標乾」位置; 導入該核酸序列，來於所編碼之多敗序 折絲酸絲產生所欲較變；以及檢定分 析所製造之多肽之殺蟲活性。 刀 f 售的殺蟲毒素由於在它們的胺基酸序列及三級結 構之具某種程度之關聯’且獲得m毒素之晶體結 ^ 為4人所周知。邮八及Cry3B多肽二者之高解析 度晶體結構實例可於參考文獻獲得。 =等人⑽咖则咖⑽）提供透視毒素之= ^力能間之關係。別毒素公開之結構分析以及與特定社 ^拉體專相關之功能報告之組合考量，指示毒素之特定 區域與蛋白質作用模式之特定功能及分開步驟有關。例 如夕種刀離自出之毒素通常被描述為包含三個功能部 位么/步及孔洞形成之七螺旋束；暗示於受體結合之三平板 功月包部位，及Θ水思#祕/T . A/r a 拉體（乙1 專人（i991)Nature 305 : 815. 821)。 如美國專利案第7，1〇5,332號及審查中之美國專 請案第：46,914號，申請日細3年12月％曰報告， y蛋白貝之母性可藉由把於毒素之功能部位i之“螺旋3 與4間之區域作為目標來改良。此項理論之先決條件為對 有關殺蟲毒素之大量知識的，其了解包括：i)Cry3A毒素 19 94306 200900008 -之功能部位1之α螺旋4及5已經報告可插入敏感昆蟲中 腸襯墊之細胞脂質雙層（Gazit等人（1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12289-12294) ; 2)發明人了解於野生型蛋白質 之胺基酸序列内部，胰蛋白酶及乳糜蛋白酶裂解位置之切 位，3)觀察到於試管内藉胰蛋白酶或乳糜蛋白酶處理活化 後，野生型蛋白質對某些昆蟲之活性較高；以及4)由毒素 3知之消化作用結果導致對昆蟲之毒性降低之報告。 在多種背景序列上可形成一系列突變，來形成具有提 升的或變更的殺蟲活性之新穎多肽。例如參考美國專利申 請案第10/606,302號，申請日2003年6月25日（現已放棄） 及第10/746,914號，申請日2003年12月24日。此等突 變株包括但非限於：添加至少—個更佳蛋白酶敏感位置（例 如胰蛋白酶裂解位置）於功能部位2之螺旋3與4中間區 域；以不同蛋白酶敏感位置置換於野生型序列之原蛋白酶 敏感位置；添加多個蛋白酶敏感位置於特定位置；添加胺 、基^殘基於接近蛋白酶敏感位置，來改變多肽的擅疊，如 此促進於蛋白酶敏感位置之多肽的消化；以及添加突變來 1濩多肽免於會降低毒性之降解消化（例如製造一系列突 义/、中野生型胺基酸由纈胺酸所置換來保護多肽免於消 化作用）。突變可單獨使用或以任一種組合使用來提供實施 例之多肽。 、 > 此方式，實施例提供包含各式突變之多個序列，該 等^例如位於編碼多狀之功能部位1之以螺旋3與4間， 卜或#代之蛋白酶敏感位置之突變。屬於額外或替 94306 20 200900008 * ，代之蛋白酶敏感位置之突變可能對數類蛋白酶敏感，諸如 絲胺酸蛋白酶，其包括胰蛋白酶及乳糜蛋白酶，或諸如彈 力蛋白酶。如此屬於額外或替代蛋白酶敏感位置之突變可 經設計’讓該位置易藉某類蛋白酶諸如哺乳動物蛋白酶或 昆蟲蛋白酶辨識及/或裂解。蛋白酶敏感位置可經 已知於有機體製造之特定酶種類或特定酶，例如由玉米穗 蟲好ζα所製造之乳糜蛋白酶裂解（Lenz等人（1991) f Arch.InSectBiochem.Physi〇1. 16:2〇1_212)。突變也可賦予 :對蛋白質分解消化之抗性’例如於胜肽c端由乳糜蛋白酶 消化之抗性。 於所編碼多肽之胺基酸序列中存在之額外及/或替代 蛋白酶敏感位置，可改良由實施例之核酸所編碼之多肽之 殺蟲活性及/或特異性。如此，實施例之核酸序列可經過重 組工程處理或操作.，來製造較未經改性之野生型毒素具有 改良之或變更之殺蟲活性及/或特異性之多肽。此外，此處 揭示之突變可置於或用於與其它核㈣序列組合來提供改 良之性質。例如易由昆蟲乳糜蛋白酶裂解之蛋白酶敏感位 置（例如於寬領夜蛾（bertha armyw〇rm)或玉米稳蟲發現之 乳糜蛋白酶（Hegedus等人（2003) ArchInsect

Physiol. 53:30_47 ;及 _ 等人（ΐ99ι)入灿 hsect

Physi〇1. 16:2〇1_212))，可置於 w 背景序列中來 提t、對該序列之改良毒性。藉此方式，實施例提供具有改 良性質之毒性多肽。 J如犬4叙生Cry核苷酸序列可包含額外突變株，該 94306 21 200900008 突變株包含將第_ 蛋白酶位置之外㈣敏感胺基酸序列（除了天然胰 之另一添加 二、烏碼夕肽内部之额外密碼子。實施例 酶敏感= = 計來將至少—個額外不同之蛋白 胰蛋白酶位置之二=，额外密碼子，例如位置緊鄰於天然 形成取代突變株::之乳糜蛋白酶敏感位置。另外，可 之核酸之密…诞一個編碼天然蛋白酶敏感位置 夂之在碼子被摧毁，而替代 列，俾便据供兀R。 丁俽命入邊核酸序 f 〜W (替代的)蛋白酶敏感位置。置換 犬變株也可添加至C庠 直直挟 然胰蛋白酶切位被摧：序曲⑽^ 白酶裂解位置被導入:位置而肅白嶋 位置於蛋白質分解位置或推定之蛋白質分解

::之咖序列(例如NGSR、RR或L 酸序列皆可使用；而用來υ之核苷 之密碼子確切身份可依據用導入變異株多狀 屬表現而。Α彡f 了)^ ，亦即於特定植物種 、夕Μ幻何所揭示之突變皆可導入實施 二1: 酸序列’其包含提供為了修改而經靶定之 二 ^裂解位置之胺基酸殘基之密碼子。如此，全 =素，段之變體可經修改來含有額外或替代的裂解 ^立置’此寺貫施例思圖由此處所揭示之實施例之範圍所涵 „藝人士須了解任何有用之突變皆可添加 只要所編崎之多肽保有殺蟲活性即可。 如此，序列也可經突變，讓所έ ㉖所編瑪之多肽對於由乳糜胰蛋 94306 22 200900008 白酶之蛋白質分解消化具有抗性。多於一個辨識位置可以 任種組合添加至特定位置，且多個辨識位置可添加至毒 素或自毒素移除❶如此，額外突變可包含三、四、或多個 辨識位置。須了解多個突變可以於任何適當之多核苷酸序 列中工程處理；如此，全長序列或其片段可經修改來含有 額外或替代之裂解位置，以及對蛋白質分解消化具有抗 性。藉此方式，實施例提供含有改良殺蟲活性之突變之c ry 毒素，以及改良的組成物’及使用其它出毒素來對抗害蟲 之方法。 。突變可保護多肽免於被蛋白酶分解，例如經由從不同 區移除推定之蛋白酶分解位置，諸如推定之絲胺酸蛋白酶 位置及彈力蛋白酶辨識位置。若干或全部此等推定之位置 可經移除或變更，讓於原先位置所在處之蛋白質分解降 低:蛋白質分解之變化可經由比較突變株多肽與野生型毒 2來評估，或經由比較胺基酸序列不同之多個突變型毒素 …t評估。推定之蛋白f分解位置及蛋白質分解位置包括但 非限於下列序列：RR，胰蛋白酶裂解位置；lkm，乳摩蛋 白：位置；及NGSR’胰蛋白酶位置。此等位置可經由添 ^刪除任何數目或任何種類之絲酸縣來改變，只要 性提高即可。如此，由包含突變之核《序 -個胺基酸改變或添加或2、3、4、5、 1 J : ” m 0、7、8、9、10、 2/、13、14、15、16、17、18、19、20、2卜22、23、 26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、 94306 23 200900008 50、60、70、80、90、100、110、120、130、HO、150、 160 、 170 、 180 、 190 、 200 、 210 、 220 、 230 、 240 、 250 、 2 6 Ο、2 7 0或2 8 0個或以上之胺基酸改變或添加。如本技術 領域已知，多肽之殺蟲活性也可藉由將天然序列或全長序 列截斷來改良。 實施例之組成物包含編碼殺蟲多肽之核酸及其片段及 變體。特別是，實施例提供經分離之核酸分子，其包含編 碼如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列之核苷酸序列，或編 碼該胺基酸序列之核苷酸序列，例如SEq m N〇:1所示之 核苷酸序列，及其片段及變體。 也令人感興趣者為編碼實施例之殺蟲蛋白質之最佳化 核苷酸序列。如此處使用，「最佳化核苦酸序列」一詞係指 為於知·定有機體例如植物表現而最佳化之核酸。可使用本 技術領域已知方法針對任何感興趣之有機體製備最佳化核 普酸序列。例如參考美國專利中請案第麗⑽卿號，申 明曰2003年6月25日（現已放棄）及第1〇/746,914號，申 ' 〇G3年12月24日’其說明編碼所揭示之殺蟲蛋白質 之最佳化核苦酸岸歹丨丨。# 士本/ t + 斤幻於本實例中，核苷酸序列係經由反 轉譯蛋白質之胺基酸序列’以及改變核㈣序列而製備， 因而於仍然編碼相同胺基酸序列之同時包含偏好玉米之密 碼子·。本程序之進—步細節說明於Μ刪〆等人（1989) :: Γ·17:477,8。最佳化核苦酸序列可用於增 白質於植物之表現，例如禾 ㈣㈣)之早子葉植物，例如玉米或玉米植株。 94306 24 200900008 實施例進一步提供由實施例之天然或經修改之核酸所 編碼之經分離之殺害蟲（例如殺昆蟲）多肽。特別是，實施 例提供包含SEQ ID NO:2所示胺基酸序列之多肽，及由此 處所述核酸（例如SEQ ID ΝΟ:1所示之核酸）及其片段及變 體所編碼之多狀。 於特定實施例中，實施例之殺蟲蛋白質提供由設計來 將特定胺基酸序列導入實施例之多肽之經突變發生核酸所 製造之全長殺蟲多肽、全長殺蟲多肽之片段及變體多肽。 (1於特定實施例中，被導入多肽之胺基酸序列包含可提供酶 (諸如蛋白酶）之裂解位置之序列。 本技術領域已知Bt毒素之殺蟲活性典型係於昆蟲腸 道中藉多種蛋白酶裂解胜肽來活化。由於胜肽於昆蟲腸道 中並非總是可以完全有效率被裂解，故全長毒素之片段較 之全長毒素本身具有較高殺蟲活性。如此，實施例之若干 多肽包括全長殺蟲多肽之片段，若干多肽片段、變體及突 變與它們的衍生來源（天然殺蟲多肽）之活性相較，前者有 較高殺蟲活性，特別於篩選活性之前，天然殺蟲多肽於試 管内以蛋白酶處理並未活化時尤為如此。如此，本申請案 涵蓋序列之截斷版本或片段。 突變可位於任何背景序列，包括截斷多肽，只要多肽 保有殺蟲活性即可。熟習本領域技藝人士易於使用本技術 領域已知或本文所述之有關殺蟲活性之檢定分析來就殺蟲 活性比較兩種或多種蛋白質。須了解實施例之多肽可藉表 現此處揭示之核酸來製造，或使用標準分子生物學技術製 25 94306 200900008 造。 f% 須了解殺蟲蛋白質可為寡聚物，且其分子量、殘基數 目、成份胜肽、對特定害蟲之活性及其它特性方面 化。但經由此處所述方法，對多種害蟲具有活性之ς 可經分離及特徵化。實施例之殺蟲蛋白質可組合其〜貝 毒素或其它殺蟲蛋白質使用來提高害蟲標靶範圍？又匕= 用實施例之殺蟲蛋白質與Bt毒素或是與其它具有不同性 質之殺蟲原理之組合應用對用於抗蟲性之預防及/或管理 上有特殊用途。其它殺蟲劑包括蛋白酶抑制劑（絲胺酸類及 半胱胺酸類）、α澱粉酶及過氧化酶。 核苦酸序列及胺基酸序列之片段及變體及由該等序列 所編碼之多肽也涵蓋於實施例。如此處使用，「片严一 係指多核㈣之核皆酸序列之一部分，或實u 絲酸序狀-部分。核酸則U段可編 =該蛋白質片段保有天然或相對應之全長蛋白質之生物 因而具有殺蟲活性。如此，咸了解實施例之若干多 核托及胺基酸序列可正確稱作為片段及突變株。 也二：：片段」—詞當用來指實施例之核酸序列時， 也涵盍可用作為雜交探飪夕皮幻 , . 編石馬保有生物活性以段蛋白核酸序列通常並未 之範圍可自至少約2。個;二貝。如此’刪 個㈣酸至高達編碼實二約;:。 編碼實施例之殺蟲蛋白 aU列 酸序列片段將編瑪至少=5生，分之實敵 25、30、50、1〇〇、200、300、 94306 26 200900008 400、500、_、700、800、900、1，000、u〇〇 或 uoo 個連續胺基酸，或高達實施例之殺蟲多肽中所存在之胺基 酸總數（例如SEQIDN0..2為670個胺基酸）。如此，須^ 解實施例也涵蓋屬於實施例之殺蟲蛋白質實例及片段且具 有至少 15、25、30、50、100、200、300、400、5〇〇、6〇〇二 700 800、900、1，〇〇〇、1，1〇〇或ι，2〇〇個連續胺基酸之長 度，或高達實施例之殺蟲多肽中所存在之胺基酸總數（例如 p對SEQ ID NO:2為670個胺基酸）之多肽。可用作為雜交探 (:或PCR引子之實施例之核苷酸序列片段通常無需編碼 权触蛋白質之生物活性部分。如此實施例之核酸片段可編 碼权蛾蛋白質之生物活性部分，或可為使用此處揭示之方 法用作為雜交探針或PCR引子之片段。殺蟲蛋白質之生物 活性部分係經由分離實施例之核酸序列中之一者之一部 刀表現衩蛛蛋白質之經編碼部分（例如於試管内藉重組表 現），以及評估殺蟲蛋白質之經編碼部分之活性而製備。 為實施例之核苷酸序列片段之核酸包含至少16、2〇、 〇 75 100、150、200、250、300、350、400、450、500、 600、700、800、L000、1，2〇〇、1，400、1，600、1，800 或 2,000 個核苷酸，或高達存在於此處所揭示之核苷酸序列中之核 =酸數目（例如對SEQ ID ΝΟ:1為1，902個核普酸）。特定 只加=相像片段包含衍生自（例如製自）實施例之第一核酸 片丰又其中該片段編碼由以殺蟲活性為特徵之截斷毒 素。由實施例之多核芽酸片段所編碼之截斷多狀係以其比 孝乂 /、衍生n亥片段之該第一核酸所編碼之相對應全長多肽活 94306 27 200900008 !·相匕所_之相等或改良之殺蟲活性為特徵。預期實施例 之，種核酉文片段可於天然或相對應之全長編碼序列之3,端 截斷。核酸片段也可於天然或相對應之全長編碼序列之5, 端及3’端兩端截斷。 「變體」—詞用於此處係指實質上類似之序列。用於 核芽酸序列，保留性變體包括由於遺傳密碼的簡併性，而 編碼實施例之殺蟲多肽中之—者之胺基酸序狀該等序 如天㈣偶基因變體的這類序列’可使用幕所周知 =分子生物技術例如如此處摘述之聚合酶連鎖反應Ο 技術及雜交技術識別。 _變體核普酸序列也包括合成衍生之核芽酸序列，例如 經由使用定點突變產生者，但仍然編碼實施例之殺蟲蛋白 質：諸如突變型毒素。大致上，實施例之特定核苷酸序列 之變異株’藉此處所述序列校準程式，使用内設參數測定， 具有至少約 70%、75%、8〇%、85%、86%、87%、眺、 、慨、91%、92%、93%、94%、95%、㈣、Μ、 嫩二州、或更多與該特定㈣酸㈣㈣之序列相同 性。貫施例之核苷酸序列之變體與該序列之差異係少至工 至15個核芽酸，少至i至1〇個，諸如6至ι〇個，少至$ 個’少至4個、3個、2個核㈣或甚至！個核苦酸。 實施例之特定核普酸序列之變體（亦即核苦酸序列實 例）也可經由比較由-變體核苷酸序列所編喝之多狀與由 參考核普酸序列所編碼之多肽間之序列相同性百分㈣比 較來評估。如此’揭示經分離之核酸，其編碼具有與剛 94306 28 200900008 ID N0.2之多肽之給定之序列相同性百分比之多肽。任兩 種多肽間之序列相同性百分比可使用揭示於本文其它段落 之序列杈準（sequence a〗ignmem)程式，使用内設參數求 出。若實施例之任何給定《對多肖苷酸係經由比較它們編 碼之兩個多肽所共享之序列相同性百分比來評估，則兩個 編碼多肽之序列相同性百分比至少為約概、桃、5〇%、 55%、60%、65%、70% ’·通常至少約 75%、8〇%、85% ; p至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% ; 或至少約98%、99%或以上序列相同性。 如此處使用’「變體蛋白質」一詞涵蓋經由下列步驟而 衍生自天然蛋白質之多肽：刪除（所謂的截斷）或添加一個 或多個胺基酸至天然蛋白質之N端及/或c端；於天然蛋 白質之一個或多個位置刪失或添加一個或多個胺基酸；或 於天然蛋白質之一個或多個位置取代一個或多個胺基酸。 如此，「變體蛋白質」一詞涵蓋天然蛋白質之生物活性片 段，其包含足夠數目之連續胺基酸殘基來保有天然蛋白質 之生物活性，亦即具有殺蟲活性。相較於天然蛋白質，此 種殺蟲活性可能不同或改良或可不變’只要保有殺蟲活性 即可。 由實施例所涵蓋之變體蛋白質為生物活性，換言之， 該變體蛋白質持續擁有天然蛋白質期望之生物活性，亦即 如此處所述之殺蟲活性。此種變體可由例如遺傳多樣性辦 得或由人為插作獲付。藉本文所述序列校準程式，使用内 設參數測定’實施例之天然殺蟲蛋白質之生物活性變體將 94306 29 200900008 具有與天然蛋白質之胺基酸序列至少約6〇%、65%、7〇%、 75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、9〇%、91%、 92%、93%、94%、95〇/〇、96%、97%、98%、99%或以上之 序列相同性如同使用揭示於本文其它段落之序列校準 (sequence alignment)程式，使用内設參數求出者。實施例 之蛋白質之生物活性變體與該蛋白質之差異少至丨至Μ 個胺基酸殘基，少至丨至10個諸如6至1〇個，少至5個， p少至4個、3個、2個或甚至1個胺基酸殘基。 、 實施例復涵蓋一種微生物，其係以實施例之至少一種 核苦酸轉形、以包含該核酸之表現卡匿轉形、或以包含該 表現卡E之-載體轉形。於若干實施例中，該微生物為^ 植物體繁瘦之微生物。本發明之實施例係有關囊封之殺蟲 蛋白質，其包含可表現至少一種實施例之殺蟲蛋白質之轉 形微生物。 實施例提供包含實施例之轉形微生物之殺蟲組成物。 、於此^施例中’轉形微生物通常係連同適當載劑，以殺蟲 有效量存在於殺蟲組成物。實施例也涵蓋殺蟲組成物，其 包含以殺蟲有效量存在之實施例之經分離之蛋白質，其可 單獨’或可組合實施例之轉形有機體及/或實施例之經囊封 之殺蟲蛋白質，連同一適當載劑。 '二、 實施例復提供增加昆蟲標革巴範圍之方法，係經用 實施例之殺蟲蛋白質組合至少另一種殺蟲蛋白質或「第二 種」殺蟲蛋白質。本技術領域已知之任一種殺蟲蛋白質; 可用於實施例之方法。此種殺蟲蛋白質包括但非限於、二 94306 30 200900008 毒素、蛋白酶抑制劑、α澱粉酶及過氧化酶。 實施例也涵蓋轉形植株或基因轉殖植株，係包含至少 一種實施例之核苷酸序列。於若 ^係匕3至乂 ^ ' 只色例中，植株係以核 托構成“讀形，該核㈣構成體包含 =核㈣相，該序列工作式聯W動於植物細胞 Ιί現之啟動子。如此處使用，「轉形植株」及「基因轉殖 植株」係指於基因體内包含異源性多核㈣之植株。通常， =性多核㈣穩定嵌合於基_殖植株或轉形植株之基 大，内，、讓多核苦酸可傳遞至接續世代。異源性多核苦酸 可早獨或作為重組表現卡匣之一部分嵌合入基因體。 須了解如此處使用，「基因轉殖」—詞包括任何細胞、 細胞株：癒傷組織㈣us)、組織、植物部分或植物，其基 ，型已經經由異源性核酸的存在而改變，包括初步如此改 Μ之基因轉殖體’以及由初步基因轉㈣有性交配或無性 繁殖所形成者。「基因轉殖」—詞用於此處並未涵蓋藉習知 植物月種方法或藉天然事件’諸如隨機異花受精、非重組 2毒感染、非重組細菌轉形、非重組轉位或自生突變來改 變基因體（染色體基因體或染色體外基因體）者。 ^如此處使用，「植物」一詞包括全株、植物器官（例如 葉、里、根等）、種子、植物細胞、及其子代。基因轉殖植 物之部分也屬於實施例之範圍，例如包含源自於先以實施 例之DNA分子轉形之基因轉殖植物或其子代’因而由至 乂 —部分基因轉殖細胞所組成之植物細胞、原生質體、組 織、癒傷組織、胚以及花、莖、果實、葉、及根。 94306 31 200900008 如此處使用，植物一詞包括植物細胞、植物原生質體、 可再生植物之植物細胞組織培養、植物癒傷組織、植物團 塊、以及植物或植物部分之完好之植物細胞諸如胚、花粉、 胚珠、種子、葉、花、枝、果實、種仁、果稳、果稳轴、 莢、葉柄、根、根尖、花藥等。可用於實施例之方法之植 物類別通常廣達適合轉形技術之高等植物類別，包括單子 葉植物及雙子葉植物。此等植物例如包括馬鈴薯⑻，㈣細 tuberosum)及玉米（Zea mays)。 2然實施例並未仰賴特定生物機轉來提高植物對植物 病蟲害之抗性，於植物體内實施例之核苷酸序列之表現可 ，致實施例之殺蟲蛋白質之生成，以及導致植物對植物病 蟲害抗性的提高。實施例之植物可用於對抗害蟲方法之農 業^若干實施例提供轉形農作物，例如玉米植株，可用於 對抗植物病蟲害例如歐洲玉米頌之方法。 目標植物或植物細胞」為對標的基因已經進行基因 改變諸如轉形之植物或植物細胞；或為經過此改變之植物 或植物細胞之後代植物或植物細胞且包含該項改變。 照」或「對照植物」或「對照植物細胞」提供於測量目標 植物或植物細胞之表型改變時之參考點。 T 么對照植物或對照植物細胞包含例如：⑷野生型植 二月亦即具有導致目標植物或植物細胞基因改變之如 2料之相同基因型；（b)與起始物料相同基因❹已口 ^設構成體(nuu construct)(亦即使用 響之構成體，諸如包含標記基因之構成體)轉‘植 94306 32 200900008 胞；（C)於目標植物或植物細胞之後代中未經轉形之單離株 之植物或植物細胞；（d)基因上與目標植物或植物細胞相 同，但未暴露於可誘導標的基因表現之條件或刺激之植物 或植物細胞；或（e)於標的基因未表現之條件下之目標植物 或植物細胞本身。 熟習本領域技藝人士容易了解分子生物學領域的進展 諸如定點及隨機突變發生、聚合酶連鎖反應方法及蛋白質 工程技術，提供適合用來改變或工程處理胺基酸序列及潛 ^在之農業上感興趣之蛋白質序列之全面性工具集合及方案 集合。 如此，實施例之蛋白質可以多種方式改變，包括胺基 酸取代（substitution)、刪失（deletion)、截斷（truncation)及 插入。此等操作方法為本技術領域習知。例如殺蟲蛋白質 之胺基酸序列變體可經由將突變導入合成核酸（例如DNA 分子）而製備。突變發生方法及核酸改變方法為本技術領域 眾所周知。例如可使用募核苷酸媒介之定點突變技術來導 入所設計之改變。例如參考Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 ; Kunkel 等人（1987)Methods in Enzymol. 154:367-382 ;美國專利案 4,873,192 ; Walker 及 Gaastra 編輯（1983)Techniques in Molecular Biology(麥克 米蘭出版公司，紐約）及其中引述之參考文獻。 實施例之經突變的核苷酸序列可經修改，因而改變存 在於所編碼多肽之一級序列中之約1、2、3、4、5、6、8、 10、12個或以上之胺基酸。另外，甚至更多個自天然序列 33 94306 200900008 之k化也可‘入其中，讓編碼蛋白質與相對應之野生型蛋 白質比較具有至少約1%或2%，或約3%、4%、5%、6%、 7/〇、8/〇、9/〇、1〇〇/0、11%、12%或甚至約 14%、、 16/。、17/。、18%、19〇/〇、或 20%、21%、22%、23%、24%、 或25%、30%、35%、或40%或以上之密碼子變更或其它 改f生以相同方式，經編碼蛋白質比較相對應之野生型蛋 白貝，刖者至少有約1〇/0或2%，或約3%、4%、5%、6%、 f、7/〇、8/〇、9/°、1〇%、11%、12%或甚至約 13%、14%、15%、 、16%、17〇/〇、18%、19%、或 20%、21%、22%、23%、24%、 或25/。、30/〇、35%、或40%或以上之額外密碼子。須了 解實施例之經突變發生的核普酸序列意圖〉、函蓋具有殺蟲活 性之生物功能相當之胜肽，諸如藉對抗秋夜蛾幼蟲之抗進 食性質測定之改良之殺蟲活性。此等序列可能由於已知天 $會發生於核酸序列之.密碼子重複（redundancy)及功能相 當的後果而產生，而蛋白質隨之被編碼。 熟習本領域技藝人士了解胺基酸加成及/或取代大致 上係基於胺基酸支鏈取代之相對相似度，例如其斥水性、 電荷尺寸等。將則述多項特徵列入考量之胺基酸取代基 :實例為熟諳技藝人士眾所周知，且包括精胺酸及離胺 酸；麵胺酸及天冬胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩醯胺及天冬 醯胺；及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。 對於不影響標的蛋白質之生物活性之適當胺基酸取代 之指南可參考 Dayhoff 等人（1978)Atlas 〇f Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found. 94306 34 200900008 質:胺:酸…如將-個胺基酸改變成另-個有類似性 如此，實施例之基因及核苦酸序列包括天欽序列及突 變形式二同理，實施例之蛋白質涵蓋天然蛋白質及其變體 =如截斷多二太）及修改形々例如突變型）。此等變體將持續 期望之殺蟲活性。顯然於編碼變體之核苦酸序列進行 突變不會將序列置於讀取框外側，且通常不會形成產生 7一5:二广結構之互補區。參4 EP專利申請公開案第 、此處涵蓋之蛋白質序狀刪失、插人及取代並未預期 :w成蛋白貝特性之根本變化。但當難以事先預測該取 Γ二刪失或插入之確切效應時，熟習本領域技藝人士了解 可藉由例行篩仏檢定分析諸如晃蟲進食檢定分析來評估該 效應。例如參考 Marr〇ne #人〇985) j· Ec〇n. Ent〇m〇i. ,78:290-293 ^ Czapla Λ Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485，以引用方式併入此處。 雙體核苷酸序列之蛋白質也涵蓋由突變發生程序及重 且矛王序諸如DNA調換（Shuffiing)所衍生之序列及蛋白質。 使用此種知序，_種或多種不同編碼序列可經操作來形成 二有d望貝之新穎殺蟲蛋白質。藉此方式，由包含具有 貫質上序列相同性且可於試管内或於活體内同源性重組之 序列區之相關序列多核皆酸族群來產生重組多肖苷酸庫。 'J使用此種辦法，實施例之全長編碼序列、編碼標的功 94306 35 200900008 能部位之序列模體、或任何核苷酸序列片段可於實施例之 核苷酸序列與其它已知Cry核苷酸序列之相對應部分間調 換，來獲得可編碼具有改良之標的性質之蛋白質之新穎基 因。 標的性質包括但非限於每單位殺蟲蛋白質之殺蟲活 性、蛋白質安定性以及對非目標種屬特別為人類、牲畜、 及表現實施例之殺蟲多肽之植物及微生物之毒性。實施例 並未受特定調換策略所限，只要至少一個實施例之核苷酸 1序列或其部分係涉及此種調換策略。調換可只涉及此處揭 示之核苷酸序列，或可額外涉及本技術領域已知之其它核 苷酸序列之調換。DNA調換策略為本技術領域所已知。例 如參考 Stemmer(l 994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747- 10751 ； Stemmer (1994)Nature 370:389-391 ； Crameri 等人（1997)Nature Biotech 15:436-438; Moore 等人 (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347 ; Zhang 等人（1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4'509 ; Crameri 等人 (1998) Nature 391:288-291 ;及美國專利案第 5,605,793 及 5,837,458 號。 實施例之核苷酸序列也可用來從其它有機體分離相對 應之序列，該有機體特別為其它細菌，更特別為其它芽孢 桿菌品系。藉此方式諸如PCR、雜交等方法可用來識別此 等序列，這是基於它們對於此處所述序列之序列同源性。 基於其序列與此處列舉之整個序列或其片段相同而選用之 序列也涵蓋於實施例。此等序列包括所揭示序列之直系同 36 94306 200900008 源基因座（orthologs)之序列。「直系同源基因座」一詞係指 由共同祖先的基因衍生而得之基因，但由於物種形成結果 而出現於不同的種屬。出現於不同種屬的基因當其核苷酸 序列及/或其編碼蛋白質序列共享如本文其它段落所定義 之實質相同性時，被視為直系同源基因座。直系同源基因 座之功能通常於種屬間有高度保留性。 於PCR辦法中，寡核苷酸引子可設計來用於PCR反 應，擴大萃取自任何標的有機體之cDNA或基因體DNA (1之相對應DNA序列。PCR引子之設計方法及PCR選殖為 本技術領域所習知，且係揭示於Sambrook等人（1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第 2 版，冷泉港實 驗室出版社，紐約州普藍維），後文稱作為「Sambrook」。 也參考 Innis 等人編輯（1990) PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications 學術出版社，组約）；Innis 及 Gelfand編輯（1995) PCR Strategies(學術出版社，紐約）；及 Innis 及 Gelfand 編輯（1999) PCR Methods Mannual(學術出 版社，紐約）。已知PCR方法包括但非限於使用成對引子、 巢式引子、單一特異性引子、簡併性引子（degenerate primer)、基因特異性引子、載體特異性引子、部分錯配引 子等之方法。 於雜交技術中，全部或部分已知核苷酸序列用作為探 針，探針選擇性雜交至得自所選有機體之經選殖基因體 DNA片段或cDNA片段（亦即基因體庫或cDNA庫）族群之 其它相對應之核苷酸序列。雜交探針可為基因體DNA片 37 94306 200900008 * _段=NA片段、RNA片段或其它寡核普酸，雜交 以可檢測基團諸如32P或任 ^ 、十可 ,,,} , 了，、匕可才双測標記加標記。如 此例如，可基於實施例 如 雜六田抻处 斤夕1 2己合成寡核苷酸而製迭 ==太雜交用探針之製法及―庫及基因體庫： 建構：法：本技術領域所習知且係揭示於〜一。之 了用作A <此處揭不之整個序列或其-個或多個部八 ==㈣性雜交於相對應之序列及信使rna = 〜施例之序列為獨特之序列，=探針包括對 或2。個㈣酸。此種探針可==度至少約為H) 機體之相對應之Cry序列。本:末二⑶擴大得自選定有 分離額外編碼序列=二2=用來由期望之有機體 溶菌斑或為菌落；例如k 7 1之舰庫（或為 考a—.)之雜交篩檢。 此種序列之雜交可於苛刻條件下進行。 94306 38 1 =:」二苛刻雜交條件」等詞係指探針將雜交宜目； == 其它序列可檢测之更大程度：背= 少2倍、5倍或1〇倍）之條件。苛刻 至 (sequence-dependent)，於不 ，、有序列相依性 經由控制雜交條件及/或、先^ T，苛刻條件為不同。 針麵互補之目掉序列^條件之苛刻程度，可識別與探 經調整來允許序列源探測）°另外，苛刻條件可 度（異源探·_1QgQUS _ = 2相似 2 約1000或500個核苷酸。 A致上‘針長度少於 200900008 典型地，苛刻條件為其中鹽濃度㈣約Μ Μ納離 子’典型於pH 7.0至8 3為约π s ’、、’、力〇.01 M至1 .〇 Μ鈉離子濃度 (或其匕細’以及料探針（例如lQ至％個核 溫

約為赃，對長探針（例如大於％核㈣）之溫度至 =、勺為6GC。可刻條件也可藉添加去穩劑例如甲醯胺來達 二低苛刻度條件之實例包括以3〇%至35%甲酸胺、im 祕、1%啊十二院基硫自_於坑雜交；以及於1X 广sSC (2GX SSC=3.G M Naa/G 3 m 檸檬酸三則於 〇 C至55 C洗務。t苛刻度條件之實例包括以辦。至45% 甲酿胺、⑽㈣、1%⑽於VC雜交；以及於〇.5χ 至IX SSC於55 c至60 c洗蘇。高苛刻度條件之實例包括 以50%甲醯胺、…、心抓於抓雜交：以及最 終於0.1XSSC於60t至65t：至少洗蘇約2〇分鐘。視需要， 洗滌緩衝液可包含約〇.1%SDs至約1%SDS。雜交時間通 常少於約24小時，通常約4小時至約12小時。 、特異性典型為雜交後洗務之功能，關鍵因素為最終洗 滌溶液之離子強度及溫度。用於dna_dna雜合體熱 熔點）可由 Meinkoth 及 Wahl (1984) Anal. Biochem 138、. 抓284 之方程式估算·· Tm=8l 5t + l6 6 (i〇g m) + 〇 4ι (%=C)-0.61% (% form>5〇〇/L ;此處M為一價陽離子之莫 耳/辰度，％GC為DNA巾鳥苦及胞苦核苦酸百分比，「％ form」為雜交溶液中之甲醯胺百分比，l為雜交體之驗基 對長度。4為50%互補目標序列雜交至完美匹配探針之溫 度（於所界定之離子強度及PH下）。洗滌典型係進行至至少 94306 39 200900008 .達到平衡，且達到低背景雜交度為止，例如歷時2小時、】 小時或30分鐘。 對每1%之不匹配’ Tm降低約n ;如此Tm、雜交、 及/或洗滌條件可調整來雜交至具有期望相同性之序列。舉 例言之例如尋求具有>90%相同性之序列，Tm可降至1〇 c。通常於經過界定之離子強度及pH，對特定序列及其補 體，苛刻條件係選擇& T』、約5t>但重度苛刻條件可利 f用於比Tm低1 c、2〇C、3。(：或4°c之雜交及/或洗滌；中等 ^ =刻條件可利用於比T』代、代、代、代或呢雜 父及/或洗滌，低度苛刻條件可利用於比Tm低丨i 、丨2。〇、 13°C、14°C、15。(：或20〇C雜交及/或洗滌。 使用該方程式、雜交及洗滌組成物及期望之，熟習 本領域技藝人士了解已說明雜交及/或洗滌溶液之苛刻程 度之變化。若期望之錯配程度結果導致Tm小於d(水溶 液）或32°C(甲醯胺溶液），則可提高ssc濃度，故可使用較 v高溫度。核酸雜交之综合指南可參考Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular

Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes ,第 I 部， 第2章（愛塞維爾（Elsevier)，紐約）；及Ausubel等人編輯 (1995)Current Protocols in Molecular Biology，第 2 章（格 林出版公司及威利科技公司，紐約）。也參考Sa?nbr〇〇k。 如此，編碼實施例之Cry蛋白質且於苛刻條件下雜交至此 處揭示之Cry序列或其片段之分離序列皆係涵蓋於實施例 之範圍。 94306 40 200900008 下列術§吾用來說明兩夕 列關係：（a)「參考序種或夕核酸或多核苷酸間之序 window)」，⑷「序列相同1」’ (b)「「比㈣（咖Parsi0n 及⑷「實質相同性」。」⑷序列相同性百分比」， (a)如此處使用，「來 ^

較基礎所定義序列。參考tj」係定義為用作為序列比 整體；例如呈全hDNA^J可為一個特定序列之子集或 或基因序列。 或基因序列之片段，或完整cDNA 處使用’「比較窗」係涉及多核普酸序列之接 二=特定節段，其中於比較窗中之多刪序列可包 列之最佳校準而言’與參考序列（不含加成或删幻 包3加成或刪失(亦即間隙)。大致上比較窗長度為至 v 20個連續核㈣’視需要可為3〇、4〇、5〇、_個核苦 酸或更長。熟習本領域技藝人士了解為了避免於多核㈣ 序列含括間隙而與參考序列間有高度類似性，典型導入間 %隙補償值’且由匹配數目中扣除。 供比較用序列之校準方法為本技術領域眾所周知。如 此任一序列之序列相同性百分比之測定可使用數學演繹 法則來完成。此種數學演繹法則之非限制性實例為Myers 及 Miller (1988) CABI0S 4:11_17 之演繹法則；Smhh 等人 0981) Adv. APP1. Math. 2:482之局部校準演繹法則；

Needleman 及 Wunsch (1970) J. Mol· Biol. 48:443-453 之通 用校準演繹法則；Pearson 及 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448之搜尋局部校準方法；Kariin及 94306 41 200900008

Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264 之演、嘩 法則，修改於 Karlin 及 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad.

Sci· USA 90:5873-5877 ° 此等數學演繹法則之電腦實作可用來比較序列而判定 序列相同性。此等實作包括但非限於：CLUSTAL於 PC/Gene程式（得自英特吉财特（Intelligenetics)，加州山景 市）；ALIGN 程式（2.0 版）及 GAP、BESTFIT、BLAST、 FASTA、及 TFASTA 於 GCG Wisconsin Genetics Software Package第10版（得自亞綏里司公司（Accelrys Inc.)，美國 加州聖地牙哥史克蘭同路9685號）。使用此等程式之校準 可使用内設參數進行。CLUSTAL程式明確說明於Higgins 等人（1988)Gene 73:237-244 (1988) ; Higgins 等人（1989) CABIOS 5:151-153 ; Corpet 等人（1988)Nucleic Acid Res.16:10881-90 ; Huang 等人（1992) CABIOS 8:155-65 ;及 Pearson 等人（1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331。ALIGN 程式係基於參見上文Myers及Miller (1988)之演繹法則。 當比較胺基酸序列時，ΡΑΜΙ20加權殘值表、間隙長度補 償值12及間隙補償值4可用於ALIGN程式。Altschul等 人（1990) J· Mol. Biol. 215:403 之 BLAST 程式係基於參見 上文Karlin及Altschul (1990)之演繹法則。BLAST核苷酸 搜尋可使用BLASTN程式，分數=1〇〇，字長=12進行， 來獲得與編碼實施例之蛋白質之核苷酸序列同源之核苷酸 序列。BLAST蛋白質搜專可使用BLASTX程式，分數二 50，字長=3進行，來獲得與實施例之蛋白質或多肽同源 42 94306 200900008 之胺基酸序列。為了獲得比較用之有間隙之校準，可利用 有間隙之 BLAST (於 BLAST 2.0)，如 Altschul 等人（1997)

Nucleic Acids Res. 25:3389 所述。另外，psi-BLAST(於 BLAST 2.0)可用來進行迭代搜尋，檢測分子間之非近親 (distant)關係。參考參見上文Aitschul等人（1997)。當利用 BLAST、有間隙之BLAST、PSI-BLAST時，可使用個別程 式之内設參數（例如BLASTN用於核苷酸序列，blastx 用於蛋白質）。參考全球資訊網之國家生技中心資訊網站， 於ncbi.hlm.nih.gov。也可藉檢視來進行手動校準。 除非另行陳述，否則此處提供之序列相同性/類似度數 值係指經由使用下列參數而利用GAp第1〇版所得之數 值：對核普酸序列之相同性％及類似度％，係、使用⑽權 值50及長度權值3及nwsgapdna cmp評分矩陣；對胺基酸 序列之相同性·％及類似度％係使用GAp權值8及長度權值 2及「BL〇SUM62評分矩陣；或其任何相#程式。如此處使 用「相當程式」-詞係指任何序列比較程式，對感興趣之 列，產生當與由GAP第10版所產生之相對應校準 "父時’具有相同核苷酸殘基匹配或胺基酸殘基匹配以及 相同序列相同性百分比之校準。 GAP使用參見上文Needleman及Wunsch㈦切之演 個完整序狀校準，該校準係最大化匹配 致目及最小化間隙數目。gap者卢入却-Γ & GAP考慮王柯能的校準及間隙 挺置，形成有最大匹配驗基數目及最少間隙之校準。允許 供間隙形成補償值及間隙擴大補償值，以匹配之鹼基單 94306 43 200900008 位表不。GAP必須對其插入之各個間隙之匹配數目獲得 隙形成補償值之效果。若選用間隙擴大補償值大於〇，則 GAP必須對各個所插人的間隙獲得間隙長度乘以間隙擴 大補償值的效果。於GCG Wisc〇nsin以⑽心套震軟體第 10版對蛋白質序列之内設間隙形成補償值及間隙擴大補 償值分別為8及2。對核苦酸序列，内設間隙形成補償值 為50,而内設間隙擴大補償值為3。間隙形成 厂隙擴大漏值可表現為由W所組叙整數選出之」 整數。如此例如間隙形成補償值及間隙擴大補償值可為 ο、1、2、3、4、5、6、7、8”，，，、”、％: 35、40、45、50、55、60、65 或以上。 。間隙呈現最佳校準家族令之一員。此家族有多個成 貝，但無其它成員有較佳品質。GAp顯示四個校準之優 值唯^、比例、相同性及類似度。品質為最大化尺規來 权準序列。比例為品質除以較短節段之驗基數目。相同性 百分比為實際匹配之符號百分比。類似度百分比為類似之 符號百分比。跨間隙之符號被忽略。當對一對符號之呼分 矩陣值係大於或等☆ 0.50時（臨界值），對類似度作出評 为。GCG Wisconsin Genetics套裝軟體第ι〇版所使用之 分矩陣為則讀62 (參考Henik〇ff及取仙咐（娜

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)。 ⑷如此處使用，兩個核酸序列或兩個多肽序列所使用 之「序列相同性」《「相同性」係指當二序列以特定比較 窗為獲得最大相對應程度而校準時時’二序列中相同之殘 94306 44 200900008 基。當序列相同性百分比用來指蛋白質時，須了解不同的 ‘殘基位置經常有保留性胺基酸取代之差異，此處胺基酸殘 基取代其它有類似之化學性質（例如電荷或厭水性）之胺基 酸殘基’因此不會改變分子之功能性質。當序列之保留^ 取代不同時’序列相同性百分比可向上調整來校正保留之 取代性質。藉此保留取代區別之序列可稱作為具有「序列 類似度」或「類似度」。進行此項調整之手段為熟習本領域 ，技藝人士眾所周知。典型地，涉及評分保留取代為部分不 匹配，而非完全不匹配，藉此提高序列相同性百分比。如 此例如，當相同胺基酸被評分為丨，而非保留取代被評分 為〇時，保留取代之評分為介於〇分至丨分間。例如以程 式PC/GENE(英特吉耐特公司，加州山景市）實作，計管保 留取代之評分。 ^ •(d)如此處使用，「序列相同性百分比」表示於一比較 窗比較兩個最佳化校準序列測定之數值，其中於比較窗之 、多核苷酸序列部分與參考序列（不含加成或刪失）比較可包 含加成或刪失（亦即間隙）來獲得二序列間之最佳校準。百 =比之計算方式，係經由測定二序列出現相同核酸鹼基或 胺基酸殘基之位置數目，將匹配位置數目除以於該比較窗 之位置總數，結果乘以100，獲得序列相同性百分比。 (e)⑴多核苷酸序列之「實質相同性」一詞表示當使 二,準參數利用所述校準程式之一而與參考序列比較;， 一多核苷酸包含具有至少观、⑼％、9G%、或95%或以 上序列相同性之序列。熟習本領域技藝人士了解此等數值 94306 45 zuuwuuos •可經適當調整，經由考慮密碼 讀取框定位等，可判定由二核苷酸、胺基酸類似度、 相對應相同性。用於此等 U所編碼之蛋白質之 表示至少6。％、7()%、8()%、9()%二酸相之實質相同性 上之序列相同性。 °或95%序列相同性或以 核苦酸序列為實質上相同之 件下兩個分子是否彼此雜交。 Μ不為，於苛刻條 f過界定之離子強度及ΡΗ，比特定序二^ 依據此處定性之期望苛刻程度決定，苛二:然 m低約代至約2代範圍之溫度。若广盖比 同，則於苛刻條件下彼此不合雜右夕肽貫質上相 同。例如可能發生於使用遺傳 二，貝相 性，形成核酸之禎太, 〇最大捃碼子簡併 -或山〜 複本$。兩個核酸序列實質相同之-項# 二Γ核酸所編碼之多肽與第二核酸所編碼之多肽： 有免疫父又反應性。 m 定比文中相同性」一詞係指示於特 90。/、乂二參考序列’包含具有至少7〇%、8〇%、85%、 的之最序肋同性之序列之胜肽。用於此等目 的之爾準可使用參見上文Ν__及Wunsch (】97〇) ^用权率演繹法則進行。兩個胜肽序列實質相同之指示 二。個胜肽與對第二胜肽所產生出之抗體具有免疫反應 如此’，一胜肽係與第二胜肽實質相同，例如，此處兩 :胜：之差異只有保留取代之差異。「實質類似」之胜肽共 享如月）述序列’但不同之殘基位置可能有保留胺基酸改變 46 94306 200900008 差異。 此處使用「核苷酸構成體」一詞並非意圖限制實施例 於包含DNA之核苷酸構成體。熟習本領域技藝人士了解 核苷酸構成體，特別為由核糖核苷酸所組成及核糖核苷酸 與去氧核糖核苷酸所結合組成之多核苷酸及寡核苷酸也可 用於此處揭示之方法。實施例之核苷酸構成體、核酸及核 苷I序列額外涵盍此等構成體、分子及序列之全部互補形 f，式此外，貫施例之核苷酸構成體、核苷酸分子及核苷酸 序列涵盍可用於實施例中來轉形植物之全部核苷酸構成 體、分子及序列，包括但非限於包含去氧核糖核苦酸、核 糖核苦酸及其組合。此種去氧核糖核苦酸及核糖核苦酸包 括天然分子及合成類似物。實施例之核苷酸構成體、核酸 及核普酸序列也涵蓋核普酸構成體之全部形式，包括但非 限於單股形式、雙股形式、髮夾形式、莖與環⑻⑽⑽七⑻ 結構等。 ( 另一實施例係有關轉形有機體，諸如選自於由植物細 胞及昆蟲細胞、細菌、酵母、桿病毒 '原蟲、線蟲及藻類 斤、'’成之、、且群之有機體。轉形有機體包含：實施例之DNA 分子、包含該DNA分子之表現卡s、或包含該表現卡g 之載體，其可穩定結合入轉形有機體之基因體。 實施例之序列提供於驗構成體，用來於感興趣之 有機體中表現。構成體將包括工作式聯結至實施例之序列 3,調節序列。如此處使用，「工作式聯結」-詞表 子/、第一序列間之功能聯結，其中啟動子序列引發 94306 47 200900008 4 .St:::序:W對應之DM序列的轉錄。大致上， 乍弋聯、、，口表不如結之核酸序列為連續，杏兩 個蛋白質之編碼區、接續、且固時接合兩 額外含有至少m + 個呼取框内。構成體 個额外基因來共同轉形 額外基因可提供於多個職構成體上。機體 個限::置T:成體係提供以供Cry毒素序列插入之多 位置處於调節區之轉錄調節之下。 r 含有選擇性標記基因。 構成體額外 有機體内括於5’至3,轉錄方向：用作為宿主之 -/、有功此之轉錄起始區及轉譯起弘亦 動子）、實施例之DNA序列、及 =de1(亦即一啟 結區）。轉錄起始區（亦即啟二機體、、Ά亦即終 動子為天然、類似、異體、或異源。此外，啟 動子可為天然序列，或另外為人士广r 丨级 mifn., 次另卜為&成序列。此處使用之「.異 (⑽㈣」一詞指示啟動子並未出現於啟動子導入直中 源天=有機體。當啟動子對實施例之序列為「異體」或’乂異 或ϋ炒預期啟動子對工作式聯結之實施例序列為非本有 '天;、、、、之啟動子。如此處使用，嵌合體基因包括 動^:式聯結至對該編碼序列為異源之轉錄起始區。當啟 表:==:天然序列時’工蝴 。野生土之表現不同，結果導致表現型的改變。 終結區可為轉錄起始區所本有，也可為工作 序列所本有，可為植物宿主所本有，或可：生 自，、匕來源(亦即對該啟動子、標的序列、植物宿主或其任 94306 48 200900008 一種組合為異體或異源）。 m 方便之終結區可得自農桿菌（儿之Ti質 體，諸如阿妥平（octopine)合成酶及諾帕林（nopaline)合成 酶終結區。也參考 Guerineau 等人（1991)]\1〇1.〇611.〇61^1;· 262:141-144 ； Proudfoot (1991)Cell 64:671-674 ； Sanfacon 等人（1991)Gene Dev. 5:141-149; Mogen 等人（1990)Plant Cell 2:1261-1272 ; Munroe 等人（1990)Gene 91:151-158 ; Balias 等人（1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903;及 Joshi 〇等人（1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。 若屬適當，核酸可經最佳化來增加於宿主有機體内的 表現。如此，當宿主有機體為植物時，合成核酸可使用植 物偏好之密碼子來合成用來改善表現。例如參考Campbell 及 Gowri (1990)Plant Physiol. 92:1-11 有關宿主偏好密碼 子使用之討論。舉例言之，雖然實施例之核酸序列可於單 子葉植物及雙子葉植物種屬二者中表現，但序列可經修改 來考慮單子葉植物及雙子葉植物之特定密碼子偏好及GC 含量偏好，原因在於此等偏好顯示有差異（Murray等人 (1989)Nucleic Acids Res.17:477-498)。如此，特定胺基酸 之玉米偏好密碼子可由得自已知玉米基因序列衍生而得。 用於玉米植物的28個基因之玉米密碼子列舉於參見上文 Murray等人之表4。方法可得自於合成植物偏好基因之領 域。例如參考美國專利案第5,380,831及5,436,391號，及 Murray 等人 Nucleic Acids Res.17:477-498，以引用方式併 入此處。 49 94306 200900008 已知額外序列改性來提升於細胞宿主之基因表現。包 括去除編碼假聚腺苷化信號之序列，去除外顯子-内含子剪 接位置信號、去除以轉座子（transposon-like)重複本，以及 去除其它經過明確特徵化對基因表現可能有害之序列。序 列之GC含量可調整至對給定細胞宿主之平均程度，如參 考宿主細胞中表現之已知基因計算。「宿主細胞」一詞用於 此處係指含有載體且支援表現載體之複製及/或表現之細 胞。宿主細胞可為原核細胞諸如大腸桿菌（E. coli);或真核 細胞諸如酵母細胞、昆蟲細胞、兩棲類細胞或哺乳類細胞、 或單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞。單子葉宿主細胞之 實例為玉米宿主細胞。於可能時，序列經修改來避免預期 之髮夾二級mRNA結構。 表現卡匣額外含有5,前導子序列。此種前導子序列可 用來促進轉绎·。轉譯前導子為本技術領域所已知，包括： 小RNA病毒前導子諸如EMCV前導子（腦心肌炎5，非編碼 區）（Elroy-Stein 等人 〇989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130);波提病毒（potyvirus)前導子，例如TEV前 導子（菸草腐蝕病毒）(Gallie等人（1995)Gene 165(2): 233-23 8)、MDMV前導子（玉米矮小嵌紋病毒）、人免疫球 蛋白重鏈結合蛋白質（BiP) (Macejak等人（1991)Nature 353:90-94);得自苜蓿嵌紋病毒之外套蛋白質mRNA之未 經轉譯之前導子（AMV RNA 4) (Jobling等人（1987)自然 325:622-625);菸草嵌紋病毒前導子（TMV) (Gallie等人 (1989)Molecular Biology 〇f RNA，Cech 編輯（Liss，紐約）， 50 94306 200900008 237-256頁）；及玉米萎黃斑點病毒前導子（MCMV) % (Lommel 等人（1991)Virology81:382-385)。也參考 Della-Cioppa 等人（1987)Plant Physiol.84:965-968。 製備表現卡匣時，各個DNA片段經操作來提供適當 方向之DNA序列，以及若屬適當於適當讀取框之DNA序 列。為了達成此項目的，調節子（adapter)及聯結子（linkers) 可用來接合DNA片段；或可涉及其它操作來提供方便之 限切位置，去除多餘DNA，去除限切位置等。用於此項目 1的，可能涉及試管内突變發生、引子修復、限切、煉合、 再度取代例如轉位（transition)及顛位（transversion)。 多個啟動子可用於實施例。啟動子可基於期望之結果 選定。核酸可與組成性、組織偏好、可誘導、或其它啟動 子組合用來於宿主有機體表現。用於植物宿主細胞之適當 組成啟動子例如為Rsyn7啟動子之核啟動子及其它組成啟 動子，揭示於WO 99/43 838及美國專利6,072,050;核CaMV 35S 啟動子（Odell 等人（1985)Nature 313:810-812);稻米艾 V. 克汀素（actin) (McElroy 等人（1990)Plant Cell 2:163-171); 泛素（ubiquitin) (Christensen 等人（1989)Plant Mol. Biol. 12:619-632 及 Christensen 等人（1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) ; pEMU (Last 等人（1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten 等人（1984) EMBO J. 3:2723-2730) ; ALS啟動子（美國專利第5,659,026號）等。其它組 成性啟動子例如包括美國專利案第5,608,149 ; 5,608，144 ; 5,604,121 ； 5,569,597 ； 5,466,785 ； 5,399,680 ； 5,268,463 ； 51 94306 200900008 5,608，142 ;及 6，177,611 號之討論。 依據期望結果，較佳係由可誘導之啟動子表現該基 因。特別令人感興趣用來調節於植物體表現實施例之核苷 酸序列之啟動子為創傷誘導啟動子。此種創傷誘導啟動子 可能回應昆蟲進食造成的傷害，此種啟動子包括馬鈴薯蛋 白酶抑制劑（pin II)啟動子（Ryan( 1990) Ann· Rev. Phytopath· 28:425-449 ; Duan 等人（1996)Nature Biotechnology 14:494-498) ; wun 1 及 wun 2，美國專利 5,428,148 ; winl 及 win2 (Stanford 等人（1989) Mol. Gen. Genet. 215:200- 208);系特 明素（systemin)(McGurl 等人（1992)Science 225: 1570- 1573) ; WIP1 (Rohmeier 等人（1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792 ; Eckelkamp 等人（1993) FEBS Letters 323:73-76); MPI 基因（Corderok 等人（1994) Plant J. 6 (2):141-150)等， 以引用方式併入此處。 此外，病原誘導性啟動子可用於實施例之方法及核苷 酸構成體。此種病原誘導性啟動子包括得自病原感染後誘 發之病理機轉相關蛋白質（PR蛋白質）；例如PR蛋白質、 SAR蛋白質、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶等。例如參考 Redolfi 等人（1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254 ; Uknes 等人（1992) Plant Cell 4:645-656 ;及 Van Loon(1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116。也參考 WO 99/43819，以引用 方式併入此處。 目標為於病原感染位置或位置附近局部表現之啟動 子。例如參考 Marineau 等人（1987) Plant Mol. Biol. 52 94306 200900008 9:335-342 ； Matton 等人（1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331 ; Somsisch 等人（1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430 ; Somsisch 等人（1988) Mol· Gen. Genet. 2:93-98 ;及 Yang (1996) Proc. Natl. Acad· Sci. USA 93:14972-14977。也參考 Chen 等人（1996) Plant J. 10:955-966 ; Zhang 等人（1994) Proc. Natl. Acad. Sci_ USA 91:2507-2511 ; Warner 等人（1993) Plant J. 3:191-201 ; Siebertz 等人（1989) Plant Cell 1:961-968 ;美國專利 5,750,3 86 (線蟲可誘導）；及其中引用之參考文獻。特別令 人感興趣者為玉米PRm基因之可誘導啟動子，其表現係藉 病琢腐病儀[Fusarium monniforme)所議導（例如參考 Cordero 等人（1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200)。 經化學調節之啟動子可透過施加外生化學調節劑而用 來調控基因於植物體的表現'。依據目標而定，啟動子可為 化學誘導性啟動子，施用化學品誘導基因表現；或化學阻 遏性啟動子，施用化學品可阻遏基因表現。化學誘導性啟 動子為本技術領域所已知，包括但非限於玉米In2-2啟動 子，其係藉苯磺醯胺除草劑安全劑活化；玉米GST啟動 子，其係藉作為萌前除草劑之斥水親電子化合物而活化； 及菸草PR-la啟動子，藉水揚酸活化。其它感興趣之化學 調節性啟動子包括類固醇反應性啟動子（例如參考糖皮質 激素誘導性啟動子，Schena等人（1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 及 McNellis 等人（1998)Plant J. 14 (2):247-257)及四環素（tetracycline)-可誘導啟動子及四 53 94306 200900008 ♦ 環素-可阻遏啟動子（例如參考Gatz等人（1991) Mol.Gen. Genet. 227:229-237，及美國專利第 5,814,61 8 及 5,789,156 號）’以引用方式併入此處。 組織偏好啟動子可用來靶定於特定植物組織内部提升 殺蟲蛋白質的表現。組織偏好啟動子包括述於Yamamoto 等人（1997) Plant J. 12 (2) 255-265 ; Kawamata 等人（1997) Plant Cell Physiol.38 (7):792-803 ; Hansen 等人（1997)1\4〇1· Gen Genet. 254 (3):337_343 ; Russell 等人（1997)Transgenic Res.6 (2):157-168 ; Rinehart 等人（1996) Plant Physiol.112 (3):133 1-1341 ; Van Camp 等人（1996) Plant Physiol.112 (2):525-535 ; Canevascini 等人（1996) Plant Physiol.112 (2) :513-524 ； Yamamoto 等人（1994) Plant Physiol.35 (5) :773-778 ； Lam(l 994)Results Probl. Cell Differ.20: 181-196 ; Orozco 等人（1993) Plant Mol Biol. 23 (6):1129-1138 ; Matsuoka 等人（1993) Proc. Natl· Acad. Sci. USA 90 (20):9586-9590 ;及 Guevara-Garcia 等人（1993) Plant J. 4 V. (3) :495-505。若有所需，此等啟動子可經修改而用於微弱 表現。 葉偏好啟動子為本技術領域所已知。例如參考 Yamamoto 等人（1997) Plant J. 12 (2):255-265 ; Kwon 等人 (1994) Plant Physiol.l05:357-67 ; Yamamoto 等人 1994) Plant Cell Physiol.35 (5):773-778 ; Gotor 等人（1993 Plant J. 3:509-18 ; Orozco 等人（1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) :1129-1138 ;及 Matsuoka 等人（1993) Proc. Natl. Acad. 54 94306 200900008 *

Sci. USA 90 (20):9586-9590 ° 根偏好啟動子或根特異性啟動子為已知，可選自於參 考文獻可得之多種啟動子，或由多個可相容之種屬重生。 例如參考 Hire 等人（1992) Plant Mol. Biol· 20 (2):207-218 (大豆根特異性麩胺合成酶基因）；Keller及Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10):1051-1061 (法國豆之 GRP 1.8 基因 之根特異性控制元件）；Sanger等人（1990) Plant Mol. Biol.14 (3):433-443 (根瘤農桿菌之甘露平（mannopine)合 f成酶（MAS)基因之根特異性啟動子）；及Miao等人（1991) Plant Cell 3 (1) : 11-22 (編碼溶胞麩胺合成酶（GS)之全長 cDNA純株，係於大豆根及根結節表現）。也參考Bogusz 等人（1990) Plant Cell 2 (7):633-641，此處說明由固氮非豆 科尸及相關之非固氮非豆科TVema 所得血色素基因所分離之兩種根特異性啟動 子。此等基因之啟動子係聯結至β-葡萄糖醛酸苷酶通報子 基因，且被導入非豆科Wcoiz·⑽iahc謂及豆科

V com/cw/aiz«内部，兩種情況下，皆保有根特異性啟動子活 性。Leach及Aoyagi(1991)描述其分析生根農桿菌 之高度表現的 rolC 及 rolD 根誘 導基因之啟動子的分析（參考Plant Science(Limerick) 79 (1):69-76)。獲得結論於該等啟動子中促進基因及組織偏好 DNA定子分離。Teeri等人（1989)使用基因融合至lacZ來 顯示農桿菌T-DNA基因編碼octopine合成酶於根尖表皮特 別具有活性，且顯示TR2’基因於完好植物為根特異性，於 55 94306 200900008 葉組織可以創傷刺激，此乃用於殺蟲基因及殺幼蟲基因之 特別期望的特性組合（參考EMBO· 8(2)··343·350)。TR1，基 因融合至nptll (新黴素（neomyc⑻磷酸轉移酶π濱示類似 的特性。額外根偏好啟動子包括VfENOD-GRP3基因啟動 子（Kuster 等人（1995) Plant Mol. Biol. 29 (4):759-772);及 r〇lB 啟動子（Capana 等人（1994) Plant Mol. Biol. 25 (4):681-691)。也參考美國專利第 5,837,876 ; 5,75〇,386 ; ^ 5,633,363 ； 5,459,252 ； 5,401,836 ； 5,110,732 ； ^ 5,023,179 1 ;號。 「種子偏好」啟動子包括「種子特異性」啟動子（該等 基因於種子發育期間具有活性，諸如種子儲存蛋白啟動子） 以及「種子發芽」啟動子（於種子發芽時有活性之該等啟動 子）。參考 Thompsone 等人（1989)Bio Essays 1〇:1〇8，以引 用方式併入此處。此等種子偏好啟動子包括但非限於cimi (細胞激肽誘導訊息）；cZ19B1 (玉米19kDas米蛋白）；及 、爪ilps (肌-肌糖醇小磷酸合成酶）（參考美國專利第 6,225,529號’以引用方式併入此處）。r -玉米蛋白及Gl〇b-l 為胚乳特異性啟動子。對雙子葉植物，種子特異性啟動子 已括i_非限於且類石_法賽林素（phase〇Hn)、拿平素 (napm)、/3 -康格希尼（c〇nglycinin)、大豆植物凝集素、十 字花科素（CrUciferin)等。對單子葉植物，種子特異性啟動 子包括但非限於玉米15kDa玉米蛋白、22伽玉米蛋白、 27 kDa玉米蛋白、卜玉米蛋白、蠟樣素（评狀幻、收縮素 (ShrUnken) 1、收縮素2、球蛋白1等。也參考WO第〇0/12733 94306 56 200900008 號’此處揭示得自endUend2基因之種子偏好啟動子； 以引用方式併入此處。「偏好」於 ^ .. 、特疋、、且織表現之啟動子於 :、哉比較於至少另一種植物組織可更為高度表現。若干 、、且織偏好啟動子幾乎排他地只於該特定組織中表現。 若期望低度表現，則將使用弱啟動子。大致上，如此 ^用「弱啟動子」-詞係指可驅動編碼序列低度表現之 :動子。低度表現程度約為1/1000轉錄本至約i/i〇〇〇〇〇 、轉錄本至、：讀，_轉錄本。另外，了解「弱啟動子」 4也涵盖只於少數細胞驅動表現而非於其它細胞驅動表 現來獲仔總低度表現之啟動子。當啟動子以無法接受之高 度驅動表現時，部分啟動子序列可經删除或修改來降低 現程度。 此等微弱組成性啟動子例如包括Rsyn7啟動子之核心 啟動子（WO 99/43838及美國專利第6,〇72,〇5〇號）、核心 35S CaMV啟動子等。其它組成性啟動子例如包括美國專 、利第 5,608，149 ; 5,608,144 ; 5,604,121 ; 5,569,597 ; 5,466,785 ; 5,399,680 ; 5,268,463 ; 5,608，142 ;及 6，177,611 號之揭示；以引用方式併入此處。 通常表現卡匣將包含用於選擇轉形細胞之可選擇標記 基因。可選擇標記基因用於選擇經轉形之細胞或組織。標 δ己基因包括編碼抗生素抗藥性之基因，諸如編碼新徽素碟 酸轉移S# II (ΝΕΟ)及濕黴素（hygromycin)碟酸轉移酶（ηρτ) 之基因’以及賦予對除草劑化合物之抗藥性之基因，除草 劑化合物諸如格佛赛（gIuf〇sjnate)銨、波摩喜尼 57 94306 200900008 〇1<〇111(^}^1)、咪唾琳酮類、及2,4-二氯苯氧基乙醯酸 (2,4-D)。適當可選擇標記基因之額外實例包括但非限於編 碼對下列化合物之抗藥性之基因：氯黴素（chloramphenicol) (Herrera Estrella 等人（1983) EMBO J. 2:987-992);胺甲喋 吟（methotrexate)(Herrera Estrella 等人（1983 Nature 303: 209-213 ;及 Meijer 等人（1991)Plant Mol. Biol. 16:807-820);鏈黴素（streptomycin)(Jones 等人（1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91);史貝提諾徽素（spectinomycin) f \ < (Bretagne-Sagnard 等人（1996)Transgenic Res.5:131-137); 布里歐黴素（Meomycin)(Hille 等人（1990)Plant Mol. Biol. 7:171-176);磺醯胺（Guerineau 等人（1990)Plant Mol. Biol. 15:127-136);波摩喜尼（Stalker 等人（1988)Science 242:419-423);格佛賽（glyphosate)(Shaw 等人（1986)Science 233:478-481 ;及美國專利申請案第10/004,357號；及第 10/427,692 號）；佛菲諾瑞辛（phosphinothricin) (DeBlock 、等人（1987) EMBO J. 6:2513-2518)。大致上參考 Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech· 3:506-511; Christopherson 等人 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318 ; Yao 等人 (1992)Cell71:63-72 ； Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422 ; Barkley 等人（1980)Operon，pp· 177-220 ; Hu 等人（1987)Cell 48:555-566 ; Brown 等人（1987)Cell 49:603-612; Figge 等人（1988)Cell 52:713-722; Deuschle 等人（1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst 等人（1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553 ; Deuschle 等人 58 94306 200900008

(1990)Science 248:480-483 ; Gossen (1993)博士論文，海德 堡大學；Reines 等人（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921 ; Labow 等人（1990) Mol· Cell. Biol. 10:3343-3356 ; Zambretti 等人（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956 ; Baim 等人（1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076 ; Wyborski 等人（1991)Nucleis Acids Res. 19:4647-4653 ； Hillenand-Wissman(l989)Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb 等人（1991) Antimicrob. 1 Agents Chemother. 35:1591-1595 ; Kleinschnidt 等人 (1988)Biochemistry 27:1094-1104 ; Bonin( 1993)博士 論文， 海德堡大學；Gossen 等人（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 ; Oliva 等人（1992) Antimicrob. Agents

Chemother. 36:913-919 ; Hlavka 等人 1985)實驗藥理學手 冊，78 期（Springer-Verlag，柏林)；及 Gill 等人（1988)自然 334:721-724。此等揭示以引用方式併入此處。 w 前述可選擇標記基因之列表並非限制性。任何可選擇 標記基因皆可用於實施例。 實施例之方法涉及將多肽或多核苷酸導入植物體。「導 入」意圖表示將多核苷酸或多肽以序列可接近植物細胞内 部之方式呈獻給植物。實施例之方法並未依賴將多核苷酸 或多肽導入植物之任何特定方法，唯有多核苷酸或多肽可 接近植物之至少一個細胞之内部。多核苷酸或多肽導入植 物之方法為本技術領域所已知，包括但非限於穩定轉形方 法、暫時性轉形方法及病毒媒介方法。 59 94306 200900008 「穩定轉形」意圖表示導入植物之核苷酸構成體嵌入 植物之基因體，而可由子代繼承。「暫時性轉形」意圖表示 多核苷酸被導入植物而未整合入植物之基因體，或多肽被 導入植物體内。 轉形方案以及將核苷酸序列導入植物之方案可依據勒j 定用來轉形之植物或植物細胞類別，亦即單子葉植物或雙 子葉植物而改變。將核苷酸序列導入植物細胞以及隨後插 入植物基因體内之適當方法包括顯微注射（Crossway等人 (1986)Biotechniques 4:320-334)、電穿孔（RiggS 等人（1986)

Proc. Natl. Acad. Sci· USA 83:5602-5606)、農桿菌媒介轉 形（美國專利案第5,563,055及5,981，840號）、直接基因移 轉（Paszkowski 等人（1984) EMBO J· 3:2717-2722)、及彈道 顆粒加速（例如參考美國專利第4,945,050 ; 5,879,918 ; 5,886,244 ;及 5,932,782 號；Tomes 等人（1995)Plant Cell， Tissue and Organ Culture:基本方法，由 Gamborg 及 Phillips 編輯（Springer-Verlag，柏林）；及 McCabe 等人（1988) Biotechnology 6:923-926);及 LecI 轉形（WO 第 00/28058 號）。用於馬鈐薯轉形，參考Tu等人（1998)Plant Molecular Biology 37:829_838 及 Chong 等人（2000)Transgenic Res.9: 71-78。其他轉形程序可參考Weissinger等人（1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477 ; Sanford 等人（1987) Particulate Science and Technology 5:27-37(洋蔥）；Christou 等人（1988) Plant Physiol. 87:671-674(大豆）；McCabe 等人（1988)Bio/ Technology 6:923-926(大豆）；Finer 及 McMullen (1991)In 60 94306 200900008

Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182(大豆）；Singh 等人（1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324(大豆）；Datta 等人（1990) Biotechnology 8:736-740 (稻米）；Klein 等人（1988) Proc. Natl· Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (玉米）；Klein 等人（1988) Biotechnology 6:559-563(玉米）；美國專利第 5,240,855; 5,322,783 及 5,324,646 號；Klein 等人（1988)Plant Physiol.91: 440-444(玉米）；Fromm 等人（1990) Biotechnology 8:833-839 (玉米）；Hooykaas-Van Slogteren 等人（1984)Nature (倫 f '敦）311:763-764;美國專利案第 5,736,369 號（榖類）；Bytebier 等人（1987) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 84:5345- 5349 (百合 科）；De Wet等人（1985)胚珠組織之實驗操作，由Chapman 等人編輯（Longman，紐約），pp. 197-209 (花粉）；Kaeppler 等人（1990)Plant Cell Reports 9:415_418 及 Kaeppler 等人 (1992) Theor. Appl_ Genet. 84:560-566(鬚根媒介轉形），； D’Halluin 等人（1992)Plant Cell 4:1495-1505 (電穿孔）；Li 等人（1993)Plant Cell Reports 12:250-255 及 Christou 及 Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (稻米）；Osjoda 等人 (1996) Nature Biotechnologyl4:745-750 (玉米透過根瘤農桿 菌;全部皆以引用方式併入此 處。 於特定實施例中，實施例之序列可使用多種短暫轉形 方法來提供予植物。此種短暫轉形方法包括但非限於將 Cry毒素蛋白質或其變體及片段直接導入植物；或將Cry 毒素轉錄本導入植物。此等方法包括例如顯微注射或粒子 61 94306 200900008 撞擊。例如參考 Crossway 等人（1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185 ; Nomura 等人（1986)Plant Sci. 44:53-58 ; Hepler 等人（1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176-2180 及 Hush 等人（1994)The Journal of Cell Science 107:775-784， 全部皆以引用方式併入此處。另外，Cry毒素聚核苷酸可 使用本技術領域已知技術暫時轉形入植物。此等技術包括 病毒載體系統，以可排除DNA隨後釋放之方式沈澱多核 苷酸。如此可出現由粒子結合DNA的轉錄，但其被釋放 來變成嵌入基因體的頻次大減。此種方法包括使用以聚乙 基亞胺塗覆之粒子（PEI ;希格瑪公司（Sigma) #P3143)。 本技術領域已知將多核苷酸靶定插入植物基因體中特 定位置之方法。於一個實施例中，多核苷酸插入期望的基 因體位置可使用定點重組系統達成。例如參考 W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855、 及W099/25853，全部皆以引用方式併入此處。簡言之， 實施例之多核苷酸可被包含於一個側接有兩個不同重組位 置之轉移卡匣。該轉移卡匣被導入一植株，該植株之基因 體穩定結合一目標位置，該目標位置側接兩個與轉移卡匣 之重組位置相對應之不同的重組位置。提供適當重組酶， 轉移卡ϋ嵌入目標位置。藉此，所欲之多核苷酸整合於植 物基因體之特定染色體位置。 已經轉形之細胞可根據習知方式於植物體内生長。例 如參考 McCormick 等人（1986)Plant Cell Report 5:81-84。 此等植物可生長，可與相同轉移品系或不同品系授粉，所 62 94306 200900008 ==具有_別之所欲表㈣性之 導表現。可生長二舟劝斗、壬々 了只注表現或可誘 期望之表型特性的声//世代來確保穩定維持與遺傳 衣1 %•性的表現，然後收穫 望之表型特性的表現。 &種子末確保已經達成期 :施例之核苷酸序列可藉植物與病 來提供予植物。诵堂+ I 士、+、止 々娜毋杨馱接觸 入病主⑽Λ 涉及將目標核㈣構成體嵌 質初Γ人#/子或R Ν Α分子。應了解實施例之重組蛋白 η内葬二聚蛋白之—部分，隨後於活體内或試管 内藉蛋白貝分解程序來製造期望之殺蟲蛋白質。也了解此 種病毒多蛋白包含實施例之殺蟲蛋白質之胺基酸序列之至 少-部分’病毒多蛋白可具有期望之殺蟲活性。此等病毒 多蛋白及其編碼核㈣序列係由實施例所涵蓋。對植物提 供核普酸構成體及於植物體製造編碼蛋白質（涉及病毒 DNA分子或RNA分子）之方法為本肋領域所'已知。例如 參考美國專利案第 5,_，191 ; 5,889，19G ; 5,866,785 ; 5,589,367 ;及5,316,931號；以引用方式併人此處。 貫施例復關於實施例之轉形植株之植物繁殖材料，包 括但非限於種子、塊莖、球t、鱗莖、葉及切根及切枝。 貝把例可用於任何植物種屬之轉形，包括但非限於單 子葉植物及雙子葉植物。感興趣之植物之實例包括但非限 於玉米（Zea mays)、蕓苔屬（例如 β napus、β rapa、β y·狀c如）、特別為可用作為種籽油之蕓苔屬、苜蓿 似"να)、稻米（〇〇；% 如"叩）、裸麥、高粱 (iSWg/zwm 而、粟[例如珍珠粟 63 94306 200900008 {Pennisetum glaucum)、嚴、Panicum miliaceum、、'\、朱 、指形粟（五/⑼们’似、向曰葵 {Helianthus annuus)、♦紅 H (Ccwthamus iinctorius)、小麥 {Triticum aestivum)、大 l〈Glycine max')、恭草{Nicotiana tabacum)、馬铃 I {Solanum tuberosum)、[Arachis hypogaea)、棉{Gossypium barbadense 、 Gossypium hirsutum)、甘集{Ipomoea batatus)、樹 1 (Manihot escw/ewia)、咖°非（(^<?力^<3 5/7/7.)、椰子（Cocos «Mcz/erfl)、鳳 f \ 梨、柑橘樹（Cz’irws 印/?·)、可可（77ze<9办romfl cacao)、茶（Came///fl 似以）、香蕉5p/?.)、經梨 (Persea awwz.cawfl)、無花果（尸/cws casz’ca)、番石權（i^z'i/z.ww guajava')、芒朱[Mangifera indica)、紙後（Olea europaea)、 本瓜（Carica papaya)、腰果 QAnacardium occidentale)、夏氣 3. (Macadamia integrifolia) ^ ^ {Prunus amygdalus) ' 莱（万eifl vw/garzi)、甘嚴（Sacc/zarww叹夕.）、燕麥、大麥、蔬 、菜、觀賞用植物及針葉樹。 蔬菜包括蕃％ 、萵苣（例如

Lactuca sativa)' .2. (Phaseolus vulgaris)' 3. {Phaseolus limensis、、紙 3~{Lathyrus spp.)反辨 L 亀[Cucumis、t 成 I i笔 如胡瓜（C. saiz’vws)、哈蜜瓜（C. 及香瓜（C. 。觀賞用植物包括杜|| (及⑽、繡球 (Macrophylla hydrangea)、表後[Hibiscus rosasanensis)、暮 *{Rosaspp.)、^^：l、Tulipaspp.')、7}f^/^、Narcissusspp·')、 ♦奪年{Petunia hybrida)、象乃警{Dianthus caryophyllus')、 64 94306 200900008 聖誕紅（五及菊。可用於實施本實施例 之針葉樹例如包括松諸如火炬松（Phz/s ΜΜβ)、低地松 (Pinus eUiotii)、il 美夤松（Pinus ponderosa)、海難松[Pinus coWoria)及蒙特列松（Phwi1;道格拉斯樅 {Pseudotsuga menziesii).，西方戴衫{Tsuga canadensis) \ 雲 杉;紅杉;冷杉諸如 太平洋銀冷杉flma0z7^)及香月旨冷杉（JMes 厶a/sawea);及西洋杉諸如香杉及阿拉斯加 () ^ ^ {Chamaecyparis nootkatensis)° 植物（例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉、番紅花、 花生、咼粱、小麥、粟、於草等）諸如玉米植株及大豆植株。 草坪草包括但非限於：一年生早熟禾(尸<9<32Μβ); — 年生黑麥草ww/"//orwm);加拿大早熟禾（户⑽ cowprewa);紫羊茅rz^ra);叢生小糠草（dgrc^沿 ie㈣以）；糖穗草;有冠麥草（JgrcT^rc»?? ;通道麥草cr加扣;長葉羊茅 /owgzyb/Za);肯州藍草（尸<9fl;果園草 (Dactylis glomerata) \ 多年 t 票、麥草(J^olium perenne)’，晚 ^ 狐草（FeWwca rMra);小糠草α/6α);粗莖藍草（Pofl trivialis)，丰茅(Festuca ovina) ·，無芒雀麥萆（Bromus inennis)，筆机羊茅 QFestuca arundinacea) ·，梯故草（Phleum ，天鶴絨小糠草（jy⑽沿 •仙）；驗茅（pwccz_ne"z’a distans).，西方麥萆（Agropyron smithif) ·，玉暮違萆屬 ;聖澳古斯汀草（沿⑼扣叩 65 94306 200900008 secundatum') ’，绪壤專屬{Zoysia spp) ’，节喜專{Paspalum notatum) 也毯專{Axonopus affinis、’，给給％ {Eremochloa ophiuroides)；纪育草（Pennisetum clandesirtum).，海雀稗 (尸仏vagzifliwm);格蘭馬草（方⑽化/⑽a grac"以）；水牛 等（Buchloe dactyloids)，垂龍蓴[Bouteloua curtipenduia)。 標的植物包括可提供標的種子之穀類植物、油軒植物 及豆科植物。標的種子包括穀類種子諸如玉米、小麥、大 麥、稻米、高粱、黑麥、粟等。油籽植物包括棉、大豆、 番紅花、向曰葵、蕓苔、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子、亞麻、 蓖麻、橄欖等。豆科植物包括豆類及豌豆類。豆類包括膠 豆、刺槐豆、香豆、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、萊豆、 蠶豆、扁豆、小藜豆等。 於若干實施例中，本實施例之核酸序列可與感興趣之 •核苦酸序列之任何組合堆疊來形成具有期望表型之植物。 例如實施例之多核苷酸可與具有殺害蟲及/或殺蟲活性之 任何其它編碼多肽之多核苷酸堆疊，諸如其它Bt毒性蛋白 質（例如述於美國專利案第5,366,892 ; 5,747,450 ; 5,736,514 ; 5,723,756 ; 5,593,881 號；及 Geiser 等人（1986) 基因48:109)、戊素（pentin)(述於美國專利案第5,981，722 號）等堆疊。所產生之組合也包括任一種目標多核苷酸之多 個複本。本實施例之多核苷酸也可與任何其它基因或基因 組合堆疊’來產生具有多種期望特徵組合之植物，包括但 非限於動物進食所期望之特徵諸如高油基因（例如美國專 利案第6,232,529號）；平衡胺基酸[例如荷朵席素 94306 66 200900008 (hordothionins)(美國專利案第 5,990,389 ; 5,885,801 ; 5,885,802 ;及 5,703,049 號）；大麥高離胺酸（Williamson 等 人（1987) Eur· J. Biochem. 165:99-106 ;及 WO 98/20122)及 高曱胺酸蛋白質（Pedersen等人（1986) J. Biol· Chem. 261:6279 ; Kirihara 等人（1988)Gene 71:359 ;及 Musumura 等人（1989)Plant Mol. Biol. 12:123)];消化能力增高[例如 經修改之儲存蛋白質（美國專利申請案第10/053,410號，申 請曰2001年11月7曰）；及硫還原氧化素（thioredoxins)(美 ^國專利申請案第1〇/〇〇5,429號，申請日2001年12月3 曰）]，其揭示以引用方式併入此處。 實施例之多核苷酸也可與抗病性或抗殺草劑抗性所期 望之特徵堆疊[例如芙莫尼素（fumonisin)解毒基因（美國專 利案第5,792,931號）；無毒力基因及抗病性基因（Jones等 人（1994)Science 266:789 ； Martin 等人（1993)Science 262:1432 ;及 Mindrinos 等人（1994)Cell 78:1089);可能導 致殺草劑抗性之乙醯乳酸合成酶（ALS)突變株諸如S4突變 及/或Hra突變；麩醯胺合成酶抑制劑諸如磷烷素 (phosphinothricin)或巴司塔（basta)(例如bar基因）；及格佛 賽（glyphosate)抗藥性（EPSPS基因及GAT基因，如美國專 利申請案第10/004,357 ;及10/427,692號之揭示）];以及 加工處理或加工產物期望之基因諸如高油（例如美國專利 案第6,232,529號）；經修改油（例如脂肪酸去飽和酶基因（美 國專利案第5,952,544號；WO 94/11516);經修改澱粉[例 如ADPG焦鱗酸酶（AGPase)、殿粉合成酶（SS)、澱粉分支 67 94306 200900008 酶（SBE)及澱粉去分支酶（SDBE)];及聚合物或生物塑膠[例 如美國專利案第5,602,321號；β-酮基硫醇酶、聚羥基丁酸 合成酶及乙醯乙醯基_CoA還原酶（Schuben等人（l988) L 如£^1'1〇1.170:5837-5847)促進聚羥基烷酸鹽類（1>11八）之表 現]，其揭示以引用方式併入此處。可將實施例之多核苷酸 與可提供農藝特徵之多核㈣組纟，農藝特徵諸如為雄不 孕（例如參考美國專利案第5,583,210號）、莖長度、花期、 或轉形技術特徵諸如細胞週期調節或基因 购州⑽9;w晴職；WG9細21)，其(揭1示= 引用方式併入此處。 此等堆疊組合可藉任一種方法形成，該等方法包括但 非限制，藉任何習知方法或拓普克斯（T〇 p c r 〇 s方 ，將，交育種。若各項特徵係由基因轉形植物； 二則目‘多核著酸序.列可於任何時間以任何順序組合。 一項或多項期望性狀之基因轉殖植物可用作為標 後之轉形導人額外性狀。該等性狀可藉任一種轉 入。之jl. 口，與標的之多核苷酸以共轉形方案同時導 式)，二右‘入一序列’則二序列可含於分開轉形卡匣(反 式）或§於同一個轉形卡丨猫 …同啟動子―可= 望之性妝夕☆人 種、、且5組合而於植株產生期 系統而於期望且二：：了解多核苦酸序列可使用定點重組 土 口體位置堆疊。例如參考W099/25S21、 94306 68 200900008 W099/25854^ WO99/25840 皆以引用方式併入此處。 W099/25855 及 W099/25853， 實施例之虹成物可用來以多種方式保護植物'種子及 植物產物Μ如’組成物可用於涉及經由—種選自於喷霧、 撒粉、廣播或種子塗覆所紐忐 、 殺蟲組成物置於害蟲環境中。、將有效量之 於植物繁殖材料(果實、塊莖、鱗莖、球莖、穀粒、種 子等)’但特別為種子作為商品出售前，常見以保護性塗層 = =塗層包括除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、_ 囷』、权線蛾劑、殺軟體動物劑、或此等製劑中之數種之 混合’若有需要’可連同本技術領域常用於配方之其它載 d界面活性劑、或施用_促進輔劑來對抗細菌、真 動物等害物所引發之損害提供保護。為了處理種子、可將保 護性塗層經由將塊.莖或穀粒以液體配方浸潰，或將塊贫或 穀粒以濕或乾配方組合塗覆而施用於種子上。此外，：特 殊情況下，其它施用於植物之方法為可能，例芽 果實的處理。 ^ ^ 包含本實_之殺蟲蛋白質之編瑪核㈣序列之本實 施例之植物種子可使用種子保護劑塗層處理，該種子保^ 劑塗層包含種子處理化合物例如開普坦㈣_)、卡玻辛 (carboxin)、席蘭（thiram)、美沙拉席（聰㈣圳、皮瑞米 佛（pirimiphos)-甲基、及其它常用之種子處理劑。於一個 ，施例中，包含實施例之殺蟲組成物之種子保護劑塗層可 單獨使用或與種子處理常用之種子保護性塗财之一者組 94306 69 200900008 合。 須了解編碼殺蟲蛋白質之基因可用來轉形昆蟲病原性 有機體。此等有機體包括棒狀病毒、真菌、原蟲、細菌及 線蟲。 編碼實施例之殺蟲蛋白質之基因可透過適當載體而導 入微生物宿主，該宿主施用於環境，或施用於植物或動物。 於將核酸插入細胞之内文中所使用之「導入」一詞表示「轉 染（transfection)」或「轉形（transformation)」或「轉導 (transduction)」，且包括將核酸敌入真核細胞或原核細胞， 此處核酸可嵌入細胞基因體（例如染色體、質體、色素體 (plastid)、或粒線體DNA)、轉變成自體複製子或可暫時性 表現（例如轉染之mRNA)。 可選用已知佔據一種或多種目標農作物之「植物圈 (phytosphere)·」（葉面、葉圈、根圈、及/或根面）之微生物 宿主。此等微生物經選擇因而可於特定環境與野生型微生 物競爭，提供可表現殺害蟲蛋白質基因之穩定維持及表 V - 現，以及期望地提供殺蟲劑免於受到環境分解及鈍化之改 良性保護。 此等微生物包括細菌、藻類及真菌。特別令人感興趣 之微生物諸如為細菌（例如假單胞菌⑽似）、歐文 氏菌、瑟雷氏菌（Swraik)、克雷白氏菌 {Klebsiella) ' 黃單胞菌、鍵絲菌 所少ces)、根瘤菌、紅假單胞菌 (及、曱基菌、農桿菌 70 94306 200900008 (Jgrokc化r/wm)、醋桿菌、乳酸桿菌 (Lactobacillus)、節桿菌(Arthrobacter)、固氮菌 、 串珠菌⑽〇w〇c)及產鹼菌 (j/cW/gMM);真菌特別為酵母，例如啤酒酵母 GSacckrow少cm)、隱球酵母（o^hcoccw)、克魯維酵母 (尺/w少vwom少ces)、擲孢酵母、紅酵母 及黑酵母（JweoZ)似。其中特別令人感 興趣之此等植物圈細菌種屬，例如丁香假單胞菌 {Pseudomonas 、螢光假單胞菌（Pwz^om⑽似 //woresce;^)、〉周枯瑟雷氏菌marcesce似）、木質醋 桿菌X少//⑽w)、農桿菌、類球紅 假單胞菌（及/、田野黃單胞菌 (Xanthomonas campestris)、炼板瘤舊{Rhizobium melioti)、 嗜内產驗菌（j/ctfZ/gewe·? s 木克雷維菌 (C/avzlflcier χγ/ζ·)及文藍迪爾固氣菌（yizoiokcier 及植物圈酵母菌屬諸如深紅酵母（及Zzoiioiorw/α 7Λί/Ζ^<3)、紅酵 \ 母（R. glutinis)、海濱江酵母（R. marina)、燈黃乡工酵母（R. aurantiaca) ^ ^ fi (Cryptococcus albidus)^ 酵母（C 似）、羅倫隱球酵母（C. /awre价//)、羅斯酵母 (iS^cc/zarowyce*? rosez·)、普地酵母（& 、釀酒酵 母（S. cerevzWae)、擲孢酵母、香氣 擲孢酵母（S. 、綠克魯維酵母（幻 verc^ae)、及出芽黑酵母〇 其中 特別令人感興趣者為有色微生物。 71 94306 200900008 ， #夕種方式可用來於允許基因穩定維持及表現之 下，將可表現殺蟲蛋白質之其 ”牛 可建構表現卡n，包奸^ ^ &主。例如’ i祜知的核苷酸構成體工作式聯社 錄_信號及轉譯調節信號用來表現該核皆酸構成體，及 於佰主有機體内之序列同岸 斤幻U源之核苷酸序列，藉此發 入，及/或於宿主體内有功能之 ; 穩定維持。 是衣糸、，充It此進仃肷入或 轉錄及轉譯調節信號包括但非限於啟動子、 起點位置、操作子、活化子、促進子、其它調節元件、核 槺體結合位置、起始密碼子、終止密碼子等。例如參考美 國專利案第5,039,523及4,853,331號；EP0第〇48〇7㈣ 號；Sambrook 等人⑽2)M〇lecular cl〇ning : a —⑽吻 Manna!，編者為Maniads等人（冷泉港實驗室出版社，纟丑約 州冷臬港）’後文稱做「Sambrook IIj; Davis等人編輯 (1980)AdvanCed Bacterial Genetics(冷泉港實驗室出版 社），紐約州冷泉港；及其中引用之參考文獻。 適墓佰主細胞（其中，當接受處理的細胞施用至目標害 烛％ i兄時，含殺蟲蛋白質細胞將被處理來延長細胞中殺蟲 蛋白質活性）’可包括原核細胞或真核細胞，通常係限於不 會產生對高等有機體如哺乳動物有毒性之物質的那些細 j。但於毒素為不穩定或施甩濃度夠低以避免對哺乳動物 宿主造成任何毒性可能時，可使用對高等有機體產生有毒 物質之有機體。至於宿主’特別令人感興趣者為原核生物 及低等真核生物，諸如真菌。原核生物之說明例包括格蘭 94306 72 200900008 氏陰性菌及格蘭氏陽性菌，包括腸細菌科 (Enterobacteriaceae)諸如埃希氏菌（五、歐文氏菌 (五、志贺氏菌〇S7n，ge//fl)、沙門氏菌（iSW_狀/⑻及變 形囷（Proiews)，芽孢桿菌科（Bacillaceae)、根瘤菌科 (Rhizobiaceae)諸如根瘤菌；螺旋菌科 (Spirillaceae)諸如發光菌（photobacterium)、發酵單胞菌 {Zymomonas) '瑟雷氏菌、產氣單胞菌 、弧 ί (Ρ767'ζ·〇)、脫硫弧菌、螺 f \ ’旋菌（5>/rz7/謂）；乳酸桿菌科（Lactobacillaceae);假單胞菌 科（Pseudomonadaceae)諸如假單胞菌似)及醋桿 囷（dceekcier)、固氮菌科（Azotobacteraceae)及頌化菌科 (Nitrobacteraceae)。真核生物包括真菌諸如藻菌綱 (Phycomycetes)及子囊菌綱（Ascomycetes)，其包括酵母， 諸如哮酒酵母及裂殖酵母 (iSc/zz'zo⑽cc/zaromyces);及擔子菌綱（Basidiomycetes)酵母 '諸如紅酵母（及/zc>(ioiww/(3)、黑酵母（JweoZ?似zW/ww)、擲孢 酵母（Sporobolomyces)專。 選擇用於製造殺蟲蛋白質目的之宿主細胞特別令人感 興趣之特性包括殺蟲蛋白質基因容易導入宿主體内、表現 系統之可取得性、表現效率、蛋白質於宿主體内之安定性、 及附屬遺傳能力的存在性。用作為殺蟲劑微囊之特別令人 感興趣之特性包括保護量之殺蟲劑，諸如厚細胞壁、色素、 及胞内之包涵體的包裝或形成；葉親和力；缺乏哺乳動物 毒性；害蟲誘食性；容易殺死且固定而不會損害毒素等。 73 94306 200900008 其它考量包括配製及操作容易性、經濟、儲存安定性等。 特別令人感興趣之宿主有機體包括酵母，諸如紅酵母 屬、黑酵母屬、啤酒酵母屬（例如釀酒酵母）、擲孢酵母屬、 葉面有機體諸如假單胞菌屬（例如綠膿桿菌（尸. 、螢光假單胞菌）、歐文氏菌屬、及黃質菌屬 (F/avohderz'ww w.)、及其它有機體包括蘇力菌（Bt)、大 腸桿菌（五· co/z·)、枯草桿菌（5acz7/z^ 等。 編碼實施例殺蟲蛋白質之基因可被導入可於植物上繁 殖之微生物（附生菌）來將殺蟲蛋白質遞送予可能之標靶害 蟲。附生菌例如可為格蘭氏陽性菌或格蘭氏陰性菌。 根菌落細菌例如可藉本技術領域已知方法由感興趣之 植物分離。特別為可於根形成菌落之蠟狀芽孢桿菌 (万cerews)菌株可分離自植物根部（例如參考 Handelsman 等人（1991) Appl. Environ. Microbiol. 56: 713-718)。編碼實施例殺蟲蛋白質之基因可藉本技術領域 已知之標準方法導入根菌落蠟狀芽孢桿菌内。 編碼殺蟲蛋白質之基因例如可利用電轉形而被導入根 菌落芽孢桿菌。特別是，編碼殺蟲蛋白質之基因可被導入 穿梭載體例如 PHT3101 (Lerecius 等人（1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218)。含有特定殺蟲蛋白質基因之 編碼序列之穿梭載體PHT3101例如可利用電穿孔轉形入 根菌落芽孢桿菌（Lerecius 等人（1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218)。 表現系統可經設計以讓殺蟲蛋白質分泌於格蘭氏陰性 74 94306 200900008 菌（例如大腸桿菌）之胞質外側。使殺蟲蛋白質分泌之優點 為：（1)避免所表現之殺蟲蛋白質可能之細胞毒性效應；以 及（2)改善殺蟲蛋白質之純化效率，包括但非限於每單位體 積細胞培養液之蛋白質回收及純化效率增高，以及每單位 蛋白質之回收及純化之時間及/或成本縮短。 經由將適當大腸桿菌信號胜肽融合至殺蟲蛋白質之胺 基端，可將殺蟲蛋白質作成可自大腸桿菌分泌者。大腸桿 菌所識別之信號胜肽於已知於大腸桿菌分泌之蛋白質，例 如 OmpA蛋白質中發現（Ghrayeb人（1984) EMBO J, 3:2437-2442)。OmpA為大腸桿菌外膜之主要蛋白質，如此 據信其信號胜肽於轉位過程有效。此外，OmpA信號胜肽 無需於處理前修改，如同其它信號胜肽般，例如脂蛋白信 號胜肽（Duffaud 等人（1987) Meth. Enzymol. 153:492)。 實施例之殺蟲蛋白質可於細菌宿主體内發酵，所得細 菌經處理且以如Bt品系之用作為殺蟲劑噴霧之相同方式 用作為微生物喷霧。於殺蟲蛋白質係由芽孢桿菌分泌之情 況下，分泌信號使用本技術領域已知程序移除及突變。此 種突變及/或刪失可預防發酵過程中殺蟲蛋白質分泌入生 長培養基。殺蟲蛋白質保持於細胞内部，然後細胞經過處 理來獲得經過囊封之殺蟲蛋白質。任何適當微生物可用於 此項目的。假單胞菌用來表現Bt毒素為囊封蛋白質，所得 細胞經過加工及喷霧作為殺蟲劑（Gaertner等人（1993)，先 進工程殺蟲劑，Kim編輯）。 另外，殺蟲蛋白質經由將異源基因導入細胞宿主來製 75 94306 200900008 造。異源基因表現直接或間接導致胞内製造且維持殺蟲 劑。然後，當細胞施用於標靶病蟲害之環境時，此等細胞 於可延長細胞所製造的毒素活性之條件下處理。所得產物 保有毒素之毒性。然後此等天然囊封殺蟲蛋白質根據施用 於標乾病蟲害所棲息之環境（例如土壌、水及植物葉片）之 習知技術配製。例如參考EPA第〇 1923 19號，及其中引用 之參考文獻。 _ “>丨-人工·V /王、啕機體、 、'’田胞孢子救触蛋白質、殺蟲成分、打擊害蟲成分、突 變株、活細胞或死細胞及細胞成分，包括活細胞及死細胞 及細胞成分之混合物，且包括破碎細胞及破碎細胞成分 =分：之殺蟲蛋白質可與可接受之载劍配製成殺蟲組成 物畔亦即例如懸浮液劑、溶液劑、乳液劑、撒布粉劑、可 =粒：或丸粒劑、可濕潤粉劑、及可乳 =霧劑、經浸潰之顆粒、辅劑、可塗覆糊劍、』： .且也囊封於例如聚合物物f之内部。此厂 習知手段製備，諸如將包含该多 ^方、、且成物可藉 均化、贫跑、、 該夕肽之細胞培養乾燥、凍乾、 :卞：過濾、離心、沈澱、或濃縮。 刖文揭示之組成物也可經由下、β 活性劑、惰,脖若 方法獲侍，添加界面 . 载背、防腐劑、保濕劑、進舍Μ 別、囊封劑、黏結劑、乳化劑、毕料I嶺劑、誘引 衝劑、流動劑或肥料、微量營養供；卜光保護劑、緩 之製劑。一種或多 /、'，、口或其匕影響植物生長 殺蟲劑、殺直菌y辰 予品，包括但非限於除草劑、 ，、殼細菌劑、殺綠蟲劑、殺軟體動二 94306 76 200900008 殺療蟲劑、植物生長調節劑、收穫助劑及肥料，可與配 業界習用之載劑、界面活性劑或辅劑或其它可辅助 作:及施用於特定標革巴害蟲之成分组合。適當载劑及辅;； 可為固體或㈣，且係於尋“於配方技術之物質_ 應，例如天然或再生礦物質、溶劑、分散劑、濕潤劑、稠 化劑、黏結劑、或肥料。實施例之活性成分通常係以 物形式施用’且可施用於農作物區、植株或欲處理的種子。 舉例言之，實施例之組成物可施用至準備儲存的穀物或施 用於儲存於糧倉或貯窖等之穀物。實施例之組成物可與其 它化合物同時施用或猶序施用。施用本實施例之活性成^ 或本實施例之農用化學品組成物（其中含有至少一種經由 實施例之菌株所製造之殺蟲蛋白質）之方法包括但非限於 葉施用、種子塗覆、及土壤施用。施用數目及施用率係依 據相對應害蟲之侵害強度決定。 、 適當界面活性劑包括但非限於陰離子化合物諸如金屬 (羧酸鹽；長鏈脂肪酸之羧酸酯；N_醯基肌胺酸酯 (N-aCylSarcosinate);磷酸與乙氧基化脂肪醇之單酯或二酯 或此等酯類之鹽類；脂肪醇硫酸鹽諸如十二烷基硫酸鈉、 十八烷基硫酸鈉或鯨蠟基硫酸鈉；乙氧基化脂肪醇硫酸 鹽，乙氧基化烧基紛硫酸鹽；木質續酸鹽；石蝶礦酸鹽； 烷基芳基磺酸鹽諸如烷基苯磺酸鹽或低碳烷基萘磺酸鹽， 例如丁基萘磺酸鹽；磺酸化萘-甲醛縮合物之鹽；磺酸化酚 -甲醛縮合物之鹽；較為複雜之磺酸鹽諸如醯胺磺酸鹽，例 如油酸與N-甲基牛磺酸之磺酸化縮合產物；或二烷基磺基 94306 77 200900008 丁一 iic鹽，例如—辛基丁二酸磺酸鈉。非離子性劑包括脂 肪駄知、知肪醇、脂肪酸醯胺、或脂肪烷基_或烯基經取代 之盼與％氧乙烧之縮合產⑯；多元醇醚之脂肪醋，例如山 术來糖爿日肪酸醋；此等酯類與環氧乙烷之縮合產物，例如 ♦氧伸乙基山梨聚糖脂肪酸酯類；環氧乙烷與環氧丙烷之 嵌段共聚物；块屬甘醇類諸如2,4,7,9-四乙基-5-癸炔-4,7-一知，或乙氧化炔屬甘醇類。陽離子性界面活性劑之實例 广、例如包括脂肪族單胺、二胺或多胺諸如乙酸酯、環烧酸醋 或油酸醋；或含氧胺諸如聚氧伸乙基烧基胺之氧化胺；經 由緩酉夂與一胺或多胺縮合所製備之醯胺聯結之胺；或四級 錢鹽。 惰性材料之實例包括但非限於無機礦物諸如高嶺土、 層狀石夕酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鱗酸鹽或植物物質諸如軟 木、粉化玉米穗轴、花生殼、米糠及核桃殼。 、本T施例之組成物可呈適當形式供直接施用，或呈需 要以適Π或其它稀㈣於施料騎之主要 劑形式。殺蟲濃度將依據料配方之本質衫，特 ^濃縮劑或供直接使用決定。組成物含有跑_固體 或液體惰性載劑，及〇至5〇%或〇.1%至5〇%界面活性劑。 此專組成物可以商品之標示施科投藥，例如呈 時每英㈣_ 4(psi)_5 (^(psi)，呈液體形^每: 畝於約〇·〇ι品脫（lb.H0品脫之施用率投予。 母央 於其他實施例中，組成物及實施例之經過 及殺蟲蛋白質可於配方前處理來延長當施用於標 94306 78 200900008 境時的殺蟲活性，只要該前處理不會對殺蟲活性造成不利 即可。此等處理可為化學手段及/或物理手段，只要處理不 會對組成物之性質造成不利影響即可。化學劑之實例包括 但非限於邊化劑；駿類諸如甲搭及戊搭；抗感染劑諸如氯 化吉菲蘭（zephiran);醇類如異丙醇及乙醇；及組織固定 劑，諸如保英氏（Bouin，_定劑及海利氏（Heliy，s)固定劑 (例如參考 HUmason(1967)Animal Techniques w.l ^ 浮利曼公司（W.H. Freeman and Co.)。 於其它實施例中，較佳係以蛋白酶例如騰蛋白酶處理 W毒素多肽來活化蛋白f ’隨後將本實施例之殺蟲蛋白 質組成物施用至標無害蟲環境。藉絲胺酸蛋白酶活化前毒 素之方法為本技術領域所已知。例如參考 Bwchem. J. 6:445_454 及 Carr〇11 及(i989)心如幻 261:99-1()5，其教示以引用方式併入.此處。例如適當活化 方案包括但非限於組合欲活化之多肽例如經純化之新穎 Cry多肽（例如具有SEQ 1〇耻2所列舉之胺基酸序⑴及 蛋白質/胰蛋白酶重量比為"1〇〇之胰蛋白酶，於2〇心碳 酸虱鈉ΙρΗ 8，且於36。〇消化樣本3小時。 組成物（包括實施例之經轉形微生物及殺蟲蛋白 施用至有害昆蟲之環境，施用方法例如為錢 粉、賤散、塗覆或傾倒、導入土壌内或土壤上、導入灌、、g :::種：處理或一般施用或撒粉而於害蟲開始出現^ 告触出現减用作為保護措施。例如實施例之 及/或轉形微生物可混合穀物來於儲存期間保護穀物。則 94306 79 200900008 於植物生長早期對害蟲獲得良好控制係為4要，原因在於 此乃植物最嚴重受損時間。實施例之組成物若有所需，可 有/、匕杈蟲劑。於一個實施例中，組成物可直接 施用至土壤，於栽種時，呈載劑與實施例之芽孢桿菌菌株 或轉形微生物之死細胞組成物之顆粒形式。另一個實施例 為包含辰用化學品諸如除草劑、殺蟲劑、肥料、惰性载劑 及芽抱桿菌菌株或實施例之轉形微生物死細胞之組成物之 顆粒形式。 熟習本領域技藝人士了解並非全部化合物皆可同等有 效施用於所有害蟲。實施例之化合物顯示對抗有害昆蟲之 活性’包括有經濟重要性之農藝害蟲、森林害蟲、溫室害 蟲、苗圃害蟲、觀賞植物害蟲、食物與纖維害蟲、公共衛 生及動物衛生害蟲、住宅及商業大樓害蟲、居家害蟲及倉 儲害告蟲包括選自於鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅 目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、 尊翅目、風目、微翅目、毛翅目等目之昆蟲，特別為鞘翅 目及鱗翅目昆蟲。 鱗翅目幼蟲包括但非限於夜蛾科（Noctuidae)之夜盜 触 仪蛾、尺礎、及實夜蛾：JE Smith(秋仪蛾），s如呈而Hubner (甜菜夜蛾）；/"wra Fabricius(於草仪蛾，茶蠶）；cwaiker (I領伏蛾），Tlf Linnaeus (甘藍蛾）；Jgro治 /psz’/o” Hufnagel(球菜夜蛾）；a. orthogonia Morrison (西方 伏蛾），⑽Fabricius (顆粒夜蛾）； 80 94306 200900008

Htibner (棉葉蟲）；m· Hiibner (甘藍 K 後）’，Pseudophisia includens Walker (大豆尺虫筻）；

Htibner (黎豆夜蛾）；

Fabricius (綠苜稽蟲）；v/rescews Fabricius (於草 夜蛾幼蟲）；hewdfl/eha ㈣c〖a Haworth (夜盜蟲）； Athetis mindara BMnes A Mcdunnough[氣反夜織）’，Euxoa Harris (深色邊夜蛾）；/77⑽/训《 Boisduval (多刺棉鈴蟲）；五.Fabricius(斑點棉鈐蟲）； 汉e/zc〇ver；7fl arwz’gero Htibner(美國棉鈴蟲）；//. _zea Boddie (玉米穗蟲或棉鈴蟲）；Me/⑽c/zrfl 户/cia Harris(斑馬紋毛 蟲）；五gz>a fXy/ow少cwr/a/k Grote(柑橘夜蛾）；得自鎮 蛾科（Pyralidae)之煩、鞘蛾、結網蟲（webworm)、尖頭蟲、 及雕葉& : 聽δζ’/α/ζ) Hiibner (歐洲玉米模）；

Amyelois transitella Walker (海軍橙蟲）；

Zeller (地中海麵粉蛾）；Ca办a ca"ie//fl Walker (杏蛾）；C7n7o Walker (稻稈煩）；C· (高粱模）；CWcyra Stainton (稻米蛾）、

Clemens (玉米根結網蟲）；C· ieierre/Zw Zincken (藍草結網蟲）；Cna/^fl/ocroc/s mei/ka/以 Guerre (稻捲葉蛾）；Oesw/a /w⑽7，a/z\y Htibner (葡萄捲葉蛾）； Diaphania hyalinata Linnaeus (^v^) ； D. nitidalis Stoll 野模）；Dyar (西南玉米填）；D.

Fabricius (甘嚴填）；五orewma /q/hW Dyar (墨西 哥稻填）；母Htibner (於草（可可亞）蛾）； 81 94306 200900008

Galleria melloneUa lAnnwas [大堡藏蛾）·，Herpetogramma Walker (草地結網蟲）；丑〇所〇已6^〇/«0 Hulst (向曰蔡蛾）；似"g/iose/Zwi· Zeller (小型玉 米桿模）；Jdro/a gr/seZ/a Fabricius (小型虫鼠蛾）；

Linnaeus (甜菜結網蟲）；（9ri/^ga Walker (茶樹結網蛾）；Mwwca Geyer (豆莢頌）；

Plodia interpunctella HiibnQic (印％ 安数輪織）’，Scirpophaga /«ceriw/w Walker (三化煩）；ί/ί/efl Guerre (芽菜 捲葉蛾）；及捲葉蛾科（Tortricidae)之捲葉蛾、芽蟲 (budworm)、種子蟲（geed worm)及果實蟲（fruit worm): Jc/er以 g/<9ver<3?2a Walsingham (西方黑頭芽蟲）；A. var/awa Fernald (東方黑頭芽蟲）；w幻;Walker (果樹 捲葉蛾）；i rw狀a Linnaeus (歐洲捲葉蛾）；及其它捲葉蛾 {Ar chips)種屬 ， Adoxophyes orana Fischer von R6sslerstamm(夏果捲葉蛾）；CW/zy/z·*? Walsingham (帶狀向曰葵蛾）；/aiz/erreana Walsingham (榛捲葉 蛾）；C ；7〇mo«e"a Linnaeus (内蠹蛾）；/Vtf，少?ic^a/Zavei/ima Clemens (雜色捲葉蛾）；P. ⑽a Walsingham (雜食捲葉 蛾）；Denis & Schiffermiiller (歐洲葡萄葉 蛾）；^ζ·/Μ6»ί<3 ace//a仙 Denis & Schiffermiiller (眼點狀芽 蛾）；五vzVeawa Clemens (葡萄果實蛾）；五wp〇eCZ7/a ambiguella Hiibner (葡萄葉蛾）；Bonagota salubricola Meyrick (巴西蘋果捲葉蛾）；〇ίφ/ζο//ία wo/eWa Busck (東 方果實蛾）；Riley (向曰葵芽蛾）； 82 94306 200900008

Argyrotaenia spp· ； Choristoneura spp. ° 於鱗翅目中選定之其它農業害蟲包括但非限於

Alsophila pometaria (狀 &竣).，Anarsia lineatella

Zeller (桃嫩枝模）；J.E. Smith (柳撥條紋 櫟蟲）；dw/zeraea Gu6rin-M0neville (中國櫟蠶）；

Bombyx mori Linnaeus Bucculatrix thurberiella Busck (棉葉鑽孔蟲）；Co/z’as Boisduval (苜蓿毛蟲）；

Datana integerrima Grote & Robinson (胡桃毛蟲）；

Tschetwerikov (西伯利亞蠢蛾）、

Ennomos subsignaria Hiibner (输展楚義）·’ Erannis iiZiaria

Harris (#i X. ) > Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (褐尾 蛾）；丑Gu6rin-M0neville (葡萄葉雕葉 蟲）；〇//v/fle Cockrell (牧草天蠶蛾）；/f少; c⑽ea Drury (秋結網蟲）；Xez/er/α Walsingham (蕃祐針蟲）；/^ce//arz'a /ζ·πβ//αγζ·β 、Hulst (東方鐵杉尺礎）；//sce/Zarz'a Hulst (西方 鐵杉尺蠖）；Zewcoma saZ/c^ Linnaeus (沙丁蛾）；⑽irz·。 dispar Linnaeus (吉普赛蛾)；Manduca quinquemaculata Haworth (五點鷹蛾，蕃蘇天蛾）；Μ. πχίβ Haworth(蕃祐天 蛾’於草天蛾）；（9/?ero/>/ziera Linnaeus (冬蛾）；

Paleacrita vernata (春 K 後、’，Papilio cresphontes

Cramer(大鳳蝶，鳳蝶幼蟲（orange dog)) ; Ρ/ζ〇^·<3?π·ί/ζ·β californica Packard (加州標蟲）；citrella Stainton (掛橘潛葉蛾）；尸六少Z>/⑽ 83 94306 200900008

Fabricius (斑點幕狀潛葉蛾）；尸/er/s Linnaeus (大 白蝶）；尸· Linnaeus (小白蝶）；P.Linnaeus (綠脈 白綠 Y，Platyptilia carduidactyla Ki\Qy (涛裔涵味）\ Plutella xylostella Linnaeus (Μ ) » Pectinophora gossypiella Saunders (粉紅棉龄蟲）；尸Boisduval & Leconte (南方甘藍蟲）；fleg/'oiaia Guen6e (雜食 尺虫筻）；iSc/zz’zwfl ccmcz·仙a J.E. Smith (紅脊毛蟲）； cerealella Olivier - Thaumetopoea pityocampa

Schiffermuller (松帶蛾）；77似〇/<3 Hummel (負袋 夜蛾）；TWa ako/wia Meyrick (蕃茄潛葉蛾）；办⑽omew/a padella Linnaeus (紹蛾）；Heliothis subflexa Guenee ； Malacosoma spp.dL Orgyia spp. ° 令人感興趣之鞘翅目幼蟲及成蟲包括長角象科 (Anthribidae)、豆象科（Bruchidae)、及象曱科（Curculionidae) 之象曱[包括但非限於：Boheman (棉 '象甲）；Dsor/zo/^似 oryzop/n./ws Kuschel (稻水象甲）； «SVio/i/n’/ws grawflrz’ws Linnaeus (糧倉象甲）；& or少zae Linnaeus (稻象曱）；办户era Fabricius (苜蓿葉象 〒）.，Cylindrocopturus adspersus LeConte (向日葵莖象 甲）；少x /w/vz^ LeConte (紅向日葵種子象曱）；& ίο/Άί/Μ·? LeConte (灰向日葵種子象甲）；5>/ze??c>；?/z〇r 似 waWs Chittenden (玉米0彖蟲）];葉曱科（Chrysomelidae)之 蚤甲、瓜曱、根蟲、葉曱、馬鈐薯曱、及潛葉蟲[包括但非 限於：Say (科羅拉多馬鈴薯 84 94306 200900008 曱）；P/Mroi/ca vz>gz/ea LeConte (西方玉米根 蟲）；D. Smith & Lawrence (北方玉米根蟲）；D. undecimpunctata howardi Barber (南方玉米根蟲）； Chaetocnema pulicaria Melsheimer (i ^ ^ ψ )； Phyllotreta crwcz/erae Goeze (玉米蚤甲）；Co/a·^以 ⑽ Fabricius (葡萄葉甲）；Linnaeus (穀類葉甲）； Zjgogrflwmfl exc/flmaiz'OMh Fabricius (向日葵曱)];瓢蟲科 (Coccinellidae)之曱蟲[包括但非限於：五/?z7ac/2；2a vflr/veW/s Mulsant (墨西哥豆曱）];金龜科（Scarabaeidae)之金龜子及 其它曱蟲[包括但非限於：尸ζ·//ζ·α y_a/>⑽z'ca Newman (曰本 曱）；Cyc/ocep/zfl/iaf Z>〇7"ea/z'*s· Arrow (北方圓頭犀金龜，白螬· 增）；C. /mwacw/flia Olivier (南方圓頭犀金龜，白蜻槽）； Rhizotrogus majalis Razoumowsky (歐洲金龜子）； Phyllophaga crinita Burmeister > Ligyrus gibbosus

De Geer (胡蘿蔔曱）];皮蠹科（Dermestidae)之地毯曱；T 頭蟲科（Elateridae)金針蟲屬，叩頭蟲屬 \ - . . 金势氣凰{Conoderus spp.) ·，金騎备屬[Limonius spp.) ’，金 針蟲屬（JgrMies <^/7.);金針蟲屬（C7e«/cera s;?;?·);金針蟲 屬（Jeo/似 w.);小蠹科（Scolytidae)之象皮曱及擬步行蟲 科（Tenebrionidae)之曱蟲。 感興趣之雙翅目之成蟲及非成蟲包括潛葉蟲 dgromyza Loew (玉米污點潛葉蟲）；蚋[包括但 非限於：C㈣Coquillett(高粱蚋）； Mayetiola destructor Say {妹辛魂）·，Sitodiplosis mosellana 85 94306 200900008 4

Gdhin (小麥蚋）；TVeo/似Felt (向曰葵 * 種子蚋）];果繩（Tephritidae)、/Hi Linnaeus (歐洲 小繩）；蛆[包括但非限於Z)e//a /?/αίΜ，α meigen (玉米粒 蛆）；Z). c⑽rciaia Fallen (小麥球繩）；及其它繩屬（De/ζ'α 吵/?·)、Merow_yza flmerfca⑽ Fitch (小麥稈姐）；

Linnaeus (家虫遐）；Linnaeus、 F. femoralis Stein ^.¾¾) i Stomoxys calcitrans Linnaeus (廄绳）];秋家繩、角繩、綠頭繩、C/zrj^o所少α β/τ?· ; jP/zorwk f、 '印/7.;及其它苔蘚繩害蟲、馬繩^/7.;胃繩 Gastrophilus spp. ； Oestrus spp. ； ^ Hypoderma spp. ； ^ il Chrysops spp. ； Melophagus ovinus Linnaeus 昆蟲）；及其它短角亞目（Brachycera)、蚊jedes ;

Anopheles spp. .，Culex spp..，票、鐵 Prosimulium spp. \ Aww/z’ww w.;叮咬蚋、沙繩、蕈蚊、及其它長角亞目 (Nematocera) ° 感興趣之昆蟲包括半翅目及同翅目之成蟲及踊，例如 但非限於球蚜科（Adelgidae)之球蚜、盲螓科（Miridae)之盲 螓、蟬科（Cicadidae)之蟬、大葉蟬科（Cicadellidae)之葉蟬 屬（五之葉蟬、麥蠟蟬科（cixiidae)、蛾蠟蟬科 (Flatidae)、蠟蟬科（Fulgoroidea)、瓢蠟蟬科（Issidae)及飛虱 科（Delphacidae)之飛虱、角蟬科（Membracidae)之角蟬、木 乱科（Psyllidae)之木風、粉風科（Aleyrodidae)之粉虱、财科 (八卩1^(1丨(136)之牙蟲、根瘤辑科（卩11}^11〇\614(136)之根瘤坊、粉 虫介科（Pseudococcidae)之粉岭、餘岭科（Asterolecanidae)、 86 94306 200900008 虫介科（Coccidae)、粉纷科（Dactylopiidae)、盾矫科 (Diaspididae)、絨紛科（Eriococcidae)、旌矫科 (Ortheziidae)、紅紛科（Phoenicococcidae)及綿输科 (Margarodidae)之綿矫、網蟢科（Tingidae)之網墙、墻科 (Pentatomidae)之蝝象、長螓屬之長蜷；及長 螻科（Lygaeidae)之其它種子蟢象、沫蟬科（Cercopidae)之珠 蟬、綠螓科（Coreidae)之綠螻，及紅臻科（Pyrrhocoridae)之 紅蟥及棉蟢。 (" 同翅目之農藝上重要昆蟲進一步包括但非限於： Acyrthisiphon pisum Harris (5宛豆虫牙）；Aphis craccivora Koch (έχ 豆財）；Scopoli (黑豆辑）；

Glover (棉辑，瓜坊）；i Forbes (玉米根財）；

De Geer (蘋果财）；Patch (繡線菊 财）；dw/flcori/zww βο/απ/ Kaltenbach (毛地黃財）；（草莓 財）；Z)/wr(3/>/n\s· π<9χζ·<2 Kurdjumov/Mordvilko (蘇俄白財）； Dysaphis plantaginea Paaserini ; Eriosoma /am’gerwm Hausmann (毛狀蘋果財）；

Linnaeus (-^ if) > Hyalopterus pruni Geoffroy ；

Lipaphis erysimi Kahenbach (蕪箐蚜）；Metop〇!〇phium dirrhodum Wa\kei:(麥片场）’，Macrosiphum euphorbiae Thomas (馬鈐薯財）；⑽Sulzer (桃-馬鈴薯財， 綠桃財）；rzDm_grz· Mosley (萵苣虫牙）；似 印/?·(根虫牙及蟲癭虫牙）；wazWs Fitch (玉米葉 蚜）；天.pad/ Linnaeus (鳥莓-燕麥蚜）；船>謂 94306 87 200900008 4

Rondani (麥二叉辑）；Sz>/za //avfl Forbes (黃甘蔗财）； Sitobion avenae Fabricius (英國穀物虫牙）；Therioaphis wflczJflia Buckton (斑點苜蓿虫牙）；JbxoWerfl awraWz·/ Boyer de Fonscolombe (黑柑橘对）；及 71. cz’ir/czWa Kirkaldy (褐柑 橘虫牙）；(球蚜）；尸/z>>//<9xera devaWazWx Pergande (美洲胡桃根瘤虫牙）；Mkcz· Gennadius (於 草粉風、甘薯粉乱）；凡 argeWz/o/z·/ Bellows & Perring (銀 葉粉風）；乃/fl/ewroAs c/zW Ashmead (柑橘粉風）； r\ ' Trialeurodes abutiloneus 狀楚輪 反 T. vaporariorum Westwood(溫室粉風）；Harris (馬鈴薯葉跳 珲）；WWaieZ/ws Fallen (小褐飛風）；Macro/esie·? quadrilineatus ¥o~rba (繁苑葉跳蹲）’，Nephotettix cinticeps Uhler (綠葉跳蟬）；TV. ?π·^τί?/7ζ·(^ι/5· St&l (稻葉跳蟬）； Nilaparvata /wgews StM (褐飛風）；Peregrz·⑽·？ ma/<iz\s Ashmead (玉米飛風）；Horvath (白背飛 H ) ; Muir (稻飛虱）； .¾ pomaria McAtee I Erythroneoura spp. (¾ 萄葉跳蟬）；Linnaeus (週期蟬）； Icerya purchasi MaskeW (構整吩）’’ Quadraspidiotus Comstock (聖荷希矫）；尸Mwococcws c"rz· Risso (柑橘粉价）；π/?.(其它粉纷複合物）； Cacopsylla pyricola Foerster [洋梨本瓦）’，Trioza diospyri Ashmead (柿木風）。 半翅目之其它具有農藝重要性之種屬包括但非限於： 88 94306 200900008

Acrosternum hilare Say (綠臭备）’，Anasa tristis De Gwr (綠 '> Blissus leucopterus leucopterus Say (-¾.^) ； Corythuca Fabricius (棉網墻）；QyWo尸Distant (蕃痴螻）；swit/re//似 Herrich-Schaffer (棉墙）； jwwj Say (褐臭蟲）；五.var/o/w/w Palisot de Beauvois (—點臭蟲）；似π/?·(種子螻之複合 物）；c<?rcw/z^ Say (葉腳松種子墙）； //«ec^arb Palisot de Beauvois (灰暗盲蟓）；Z. f \ :Knight (西方灰暗盲蟢）；joraie⑽z\s· Linnaeus (常見草地 墙）；Z. rwgw/φβ㈣z) Poppius (歐洲灰暗盲蟠）； />aZ)w/z·㈣s Linnaeus (常見綠盲蟢）；A/ezara v/rzWfl Linnaeus (南方綠臭蟲)；似；Fabricius (稻米臭 蟲）；Oncopeltus fasciatus Dallas (大馬利筋蟢）； seWa加 Reuter (棉風蟬）。 此外，本發明之實施例可有效對抗半翅目諸如 Qalocoris norvegicus Gmelin $ ^1-) i Orthops campestris k.'

Linnaeus ; /Ves/ocorz's rwgz'c<9//z’*s· Fallen (蘋果盲蟢）； Cyrtopeltis modestus Distant (¾ 4|.) ； Cyrtopeltis notatus

Distant (小盲螓）；Reuter (白斑 私蜂）’，Diaphnocoris chloi'ionis Say (笔炎言凑）·， Labopidicola allii Knight (泮 i 节凑）·，Pseudatomoscelis Reuter (棉風蟬）；Jiie/p/2〇c〇7七 7'apzWws Say (快速 盲墙）；/keaiws Fabricius (四線盲墙）； er/cae Schilling (假長墙）；rap/zaTiws Howard (假長 89 94306 200900008 墙）；TVezara WrzWa Linnaeus (南方綠臭蟲）；盾螓·屬 (Eurygaster spp.);緣螻屬(Coreidae);紅螓屬 、Pyrrhocoridae spp.)’，網嗓爆{Tinidae spp·、’，Blostomatidae spp· ·，氣蜂慝（Reduviidae spp.) ·，反臭备慝（Cimicidae spp.)。 也包括蜱瞒目（蜗）之成蟲及幼蟲諸如Jcerz'a Keifer (小麥捲虫茜）；PeiroWa /ak/w Mtiller (褐白蜗）；葉虫茜 科（Tetranychidae)之4知蛛蜗及紅瞒、Ραπο/ίΜ/ζΜ·? w/w/ Koch (歐洲紅蜗）；wriz'cae Koch (兩點换蛛蜗）；J； \ ⑽z'e/z· McGregor (麥達尼蜗）；J1. ciwnaZjarz'wws Boisduval (洋紅虫知蛛瞒）；71. hdeWawz· Ugarov & Nikolski (草莓始π 蛛 端）’，細 M 瞒（Tenuipalpidae)之 M)端、Brevipalpus lewisi McGregor (柑橘扁蜗）；癭瞒科（Eriophyidae)之繡蜗及芽蜗 及其它葉進食螨及對人類健康及動物健康重要的蟎，亦即 皮蜗科（Epidermoptidae)之塵蜗、螺形蜗科（Demodicidae) 之囊泡蜗、及家瞒科（Glycyphagidae)之顆粒蜗、碑目 (Ixodidae)^ · Ixodes scapularis Say ) ； /. holocyclus

Neumann (澳洲麻痒碑）；DermaceWor var/aM/zi Say (美洲 犬蜱）；Linnaeus (孤星蜱）；及洋 蜗科（Psoroptidae)、蒲蜗科（Pyemotidae)、济蜗科 (Sarcoptidae)之济蜗及癢蜗。 雙尾目（Thysanura)令人感興趣之害蟲，諸如 saccharina Linnaeus (¾ ) ； Thermobia domestica Packard (衣魚）。 其它涵蓋的節肢動物害蟲包括：换蛛目（Araneae)之虫知 90 94306 200900008 蛛諸如 Gertsch & Mulaik (褐隱 士虫知 蛛）；及似Fabricius (黑窗虫知蛛）；及家姑 虫延目(Scutigeromorpha)之蝶虫公諸 士口 Scutigera coleoptrata Linnaeus (家虫吳虫公）。 害蟲可於發育早期例如幼蟲或其它未成熟形式測試本 實施例組成物之殺蟲活性。昆蟲於約20°C至約30°C及約 30%至約70%相對濕度於全暗處飼養。如Czapla及Lang (1990) J. Econ.Entomol. 83 (6):2480-2485 所述進行生物檢 定分析。幼蟲的飼養方法及進行生物檢定分析之方法為熟 習本領域技藝人士眾所周知。 廣泛不同的生物檢定分析技術為熟習本領域技藝人士 所已知。大致程序包括在密封容器内添加實驗化合物或實 驗有機體至的膳食來源。藉死亡率的改變、體重減輕、誘 引、驅除以及其它於進食或暴露一段適當時間長度後的行 為及生理的改變來測定殺蟲活性，但非限制性。此處所述 生物檢定分析可用於幼蟲階段及成蟲階段的任何進食害 蟲。 下列實例僅供舉例說明之用而非限制性。 【實施方式】 實例1 :蘇力菌毒素對選用昆蟲之殺蟲活性測試之生物檢 定分析 進行生物檢定分析來評估蘇力菌殺蟲毒素胜肽（示於 8丑(^1〇1\[0:2)對歐洲玉米填（(915>卜/77/^2腳〜7^3">$1)、玉米穗蟲 zea)、球菜夜蛾（Jgroi/s 、秋夜蛾 91 94306 200900008 (Spodoptera frugiperda) ' ^ 3- F^^%{Pseudoplusia includens) 及天鶴絨豆毛蟲之效果。進食檢定 分析係以含殺蟲蛋白質之人工膳食進行。使用鱗翅目專用 之人工膳食局部施用殺蟲蛋白質。毒素係以每孔每25微升 樣本0.3微克之施用率施用，讓其乾燥。蛋白質係於pH 10 之10 mM碳酸鹽缓衝液。各孔内放置一隻新生幼蟲自由進 食5日。幼蟲反應諸如發育遲緩及/或死亡之結果表示為陽 性結果。若幼蟲類似陰性對照組則結果表示為陰性，陰性 w對照組薇食的膳食只施用前述緩衝劑。 表1 : SEQ ID NO:2之進食生物檢定分析結果 測試昆蟲 結果 歐洲玉米填腳 + 玉米穗蟲zea) + 球菜夜蛾 «groins· h/ow) + 狀氣織[Spodoptera frugiperda) 大豆尺蠖 + 天鵝絨豆毛蟲 + 實例2 :測試蘇力菌毒素對黃莖螟之殺蟲活性之生物檢定 分析 新生昆蟲之製備 黃莖模<2 /«ceriw/fls Walker)成蟲收集自稻 田（ARS Mandya及Tattaguppe農場）’連同稻田植物一起放 置於籠内。於此種條件下可存活3-4日之成蟲產下卵塊於 葉刃上。連同葉部分小心切下卵塊，於密封塑膠培養皿於 室溫分開孵化蟲卵。恰在孵化後的新生幼蟲用於建立生物 92 94306 200900008 檢定分析。 ' 莖段之製備 使用本只轭例之Bt毒素製備基因轉殖稻株。稻株轉形 方法為本技術領域所已知，諸如邮等人（植 1994 ,6(2).271282)所述方案。 干』 一自約55.日齡各Bt稻株（各株為一項目）之底部切下 分檗’做成均等大小的五段（約2厘米㈣）。全部莖段皆 ，放置於培養皿的“I紙圓盤上，以蒸財㈣ 1 :維持非Bt對照組。經2-3 B尨 給娱。 、，」3日後’各項目有2-3段用來提供 生物檢定分析 使用小刷於各個平盤^釋放新生三㈣ 隻。平盤以塑膠袋包裹密封以免幼蟲逃離。全部盤= 於托盤内，托盤置於含水的大型水槽中且維持於室溫^ 下。母日小心打開各平盤來提#右 卞 .去除過里冷秦直到觀察結束再重 。 觀察 5日後銳祭幼蟲死亡率 内之稻祥節段表面上是否有任=以 層狀方式（逐-稻鞘）縱向切割稻 广後’以刀片以 '否存在有活幼蟲或死幼蟲。存活’觀察組織内部是 而死幼蟲則又黑又扁。 /六触維持於隧道内部， 對照組的生長。結果顯示於表2。 蛾的生長與非Bt 94306 93 200900008 表2 : 14項黃莖螟生物檢定分析結果 接種幼蟲* 存活幼蟲 %死亡率 註記 5 0 100% 死幼蟲轉黑 3 0 100% 死幼蟲轉黑，2幼蟲逃離 3 0 100% 死幼蟲轉黑，2幼蟲逃離 2 0 100% 死幼蟲轉黑，3幼蟲逃離 5 0 100% 死幼蟲轉黑 4 0 100% 死幼蟲轉黑，1幼蟲逃離 5 0 100% 死幼蟲轉黑 5 0 100% 死幼蟲轉黑 5 2 60% 死幼蟲轉黑，活幼蟲生長受影響 4 -- 2 50% 死幼蟲轉黑，活幼蟲生長受影響， 1幼蟲逃離 5 3 40% 死幼蟲轉黑，活幼蟲生長不受影響 3 0 100% 死幼蟲轉黑，2幼蟲逃離 5 0 100% 死幼蟲轉黑 3 0 100% 死幼蟲轉黑，2幼蟲逃離 *全部生物檢定分析初步皆接種5隻幼蟲，但調整數目來反 應逃離的幼蟲。 摘要 全部檢定分析皆釋放5隻幼蟲；有些幼蟲於檢定分析 期間逃離；只基於檢定分析結束時仍然留在培養皿上的幼 蟲計算％死亡率。14項中有11項顯示100%死亡率。兩項 顯示50-60%死亡率，且存活幼蟲罹病。一項中觀察到40% 死亡率且同時允許幼蟲正常發育。 實例3 : LC5Q及EC5G之測定 進行生物檢定分析來測定SEQ ID NO:2所示之殺蟲毒 性胜肽對歐洲玉米模屬Zu7<3//5·)、玉米穗蟲 (Helicoverpa zefl)、球菜夜蛾ζ·/^ζ7⑽）、及秋夜蛾 94 94306 200900008 (办之 LC5〇 及 EC50。對含殺蟲蛋白質 之人工膳食進行進食檢定分析。殺蟲蛋白質以pH 1 0之10 mM碳酸鹽缓衝劑稀釋，及以昆蟲膳食稀釋來獲得最終毒 素濃度為10000、1000、100、10及1 ppm。各孔内放置一 隻新生幼蟲自由進食5日。於各劑量使用八次重複進行生 物檢定分析，生物檢定分析重複三次。經由稱重各毒素濃 度之存活幼蟲，結果以LC5〇表示死亡率及/或以EC5〇表示。 表3 : LC5Q及EC5G結果 試驗尾蟲 LC5。奈克/平方厘米（ng/cm2) EC5〇奈克/平方厘米 歐洲玉米螟 0.42 0.2 玉米穩蟲 122.3 31.25 球菜夜蛾 >10000 60.57 秋夜蛾 無活性 無活性 實例4 :藉粒子碰撞轉形玉米及基因轉殖植物再生 得自溫室施體植株之朱成熟玉米胚與使用包含工作式 聯結至泛素啟動子及選擇標記基因PAT (Wohlleben等人 (1988)基因70:25-37)之毒素核苷酸序列（例如SEQ ID ΝΟ:1)之DNA分子碰撞，其中PTA係提供對除草劑百拉佛 司（Bialaphos)之抗藥性。或者，可選擇標記基因係由不同 DNA分子所提供。轉形係如下進行。培養基配方顯示如下。 標革巴組織之製備 玉米穗去殼，表面於30%克羅司（CloroxTM)漂白水加 0.5%麥克羅（Micro)清潔劑中接受表面滅菌20分鐘，以無 菌水清洗二次。未成熟胚經切下，以每平盤25胚，胚軸侧 向下（胚盤側向上）放置於560Y培養基上4小時，然後於 95 94306 200900008 2.5 .厘求之標革巴區段校準準備進行碰撞。 DNA之準備 製備包含毒素核苷酸序列（例如SEQ ID ΝΟ:1)工作式 聯結至泛素啟動子之質體載體。例如適當轉形載體包含得 自玉米之UBI1啟動子、得自UBI1及UBI1内生子之5, UTR’與Pinll終結子組合。載體額外含有藉camV35S啟 動子驅動之PAT選擇性標記基因，包括CAMV35S終結 子。視需要，可選擇標記係駐在於分開質體上。包含毒素 核普酸序列及PAT可選擇標記之DNA分子使用氯化妈沈 澱程序沈澱於1.1微米（平均直徑）之鎢丸粒上，該沈澱程 序如下： 100微升製備於水之鶴粒子 10微升（1微克）DNA於Tris EDTA緩衝劑（1微克總 DNA) 100微升2.5 Μ氯化鈣 ,10 微升 Ο·1 Μ 精三胺（spermidine) 當維持於多管《機上時，各試劑循序添加入鶴粒子 懸午液内。終混合物經短暫超音波處理

下維持分鐘。沈殺後，試管短暫離心， 二振I ⑽毫升腦乙醇洗務，離心3〇秒。再度= 105微升100%乙醇添加至最終的鎢二示攻體’將 撞，鎢/驗粒子經簡短超音波振盪微，粒子搶碰 巨载體中央。碰㈣讓其乾燥2分鐘、Μ升打點於各個 粒子檢虚理 94306 96 200900008 樣品平盤於粒子槍#HE34-1 或#HE34-2以第4級碰 撞。全部樣本皆接受由備妥粒子/DNA各試管共取10整份 之650 PSI的單次擊發。 隨後處理 於碰撞後，胚維持於560Y培養基2日，然後移至含3 毫克/升百拉佛司（Bialaphos)之560R選擇性培養基上，每 2週進行一次次培養。約經10週選擇後，對選擇有抗性之 癒傷組織純株移至288 J培養基來起始植株再生。於體細胞 1胚成熟（2-4週）後，發育良好的體細胞胚移至培養基内發 芽，移至光照培養室内。約經7-10日後，發育中的小苗移 至試管内以272V不含激素培養基培養7-10日，直到小苗 完成成長。然後將植株移植插入含有盆土之平盤（相當於 2.5吋盆），於生長室内生長一週，隨後又於溫室生長1-2 週，然後移至傳統600盆（1.6加侖）生長至成熟。監視植物， 藉業界已知之檢定分析或如前文說明將毒素表現計分。 石並撞培養基及培養基 碰撞培養基（560Y)包含4.0克/升N6基本鹽（希格瑪公 司（SIGMA) C-1416)，1.0 毫升/升愛瑞可森（Eriksson’s)維生 素混合物（ΙΟΟΟχ希格瑪-15 11)，0.5毫克/升鹽酸噻胺，120.0 克/升蔗糖，1.0毫克/升2,4-D脯胺酸，及2.88克/升L-脯 胺酸（使用KOH調整至pH 5.8之後使用去離子水調整至定 量體積）；2.0克/升吉爾萊（GelriteTM)(於去離子水調整至定 量之後添加）；及8.5毫克/升硝酸銀（於培養基滅菌且冷卻 至室溫後添加）。選擇性培養基（560R)包含4.0克/升N6基 97 94306 200900008 礎鹽（希格瑪公司C-1416)，ΐ·〇毫升/升愛瑞可森維生素混 合物（誦X希格瑪-1511)，〇.5毫克/升鹽酸嗟胺，3〇〇克/

升蔗糖，及2‘0宅克/升2,4-D脯胺酸（使用K〇H調整至pH 5.8之後使用去離子水調整至定量體積）；3〇克/升吉爾萊 ⑽(於去離子水調整至定量之後添加）；及〇85毫克/升硝酸 銀及3.0毫克/升百拉佛司（於培養基滅菌且冷卻至室溫後 添加）。 f,植物再生培養基（288J)包含（3克/升MS鹽_c〇 11117-074)’ 5.0毫升/升MS維生素存料溶液（〇 ι〇〇克於鹼 酸，0·02克/升鹽酸嗟胺、〇1〇克/升鹽酸π比咳素，及〇.仰 克/升甘胺酸以精鍊去離子水調整至體積）（他㈣如及 Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473)，1〇〇 毫克 / 升肌糖醇 (寧_—)，0.5毫克/升玉米素、6〇克/升蔗糖及ι 〇毫 升/升之0.1離層酸（調整至pH 5 6後以精鍊去離子水 調整至定量體積）；3.〇克/升吉爾菜（GelriteTM)(以去離子水 '調整至定量後添加）及乂〇毫克/升㈣乙酸及3.0毫克/升 百拉佛司（培養基滅菌且冷卻至6(rc後添加）。 不含激素之培養基（272V)包含4 3克/升Ms鹽（出6〇〇 11117 074)’ 5.0宅升/升Ms維生素存料溶液（ο」⑽克菸鹼 酸，0·02克/升鹽酸嗟胺、0.10克/升鹽酸吼嘴素，及040 克/升甘胺酸以精鍊去離子水調整至體積），（U克/升肌糖 醇，及40.0克/升薦糖(調整至pH56後以精鍊去離 整至定量體積）；及6克/升巴克多細。_旨（使料料 離子水δ周整至^量體積後添加），滅菌及冷卻至㈣。 94306 98 200900008 貝例5 .辰桿菌媒介之玉米 • 木轉形及基因轉殖植株再生 “對於具有毋素核苦酸序列（例如剛ι〇耻 菌媒介玉米的轉形來說， 干 第5 98U4D η 之方法（美國專利案 第5，州，84〇歧PCT專利公告w 内容係以引用方式併入此處）。簡 ^6就，、其 胚及與農桿菌懸浮液於特定各 、入刀離未成熟

脾主去件下接觸之胚，藉此細菌可 將常素核皆酸序列（S]Eq iD N 一本^ ο·1)移轉至未成熟胚之至少 、夕個細胞（步驟1:感染步驟）。本步驟中，未成 1熟胚浸泡於農桿菌懸浮液 h料未成 ^ .Λί進订初步接種。胜盘虞捏鈷丛 同培養一段時間（步驟2:丑 I、辰杯囷共 未成熟胚於固體培養基上;1步驟)。於感染步驟後， 需要的「休⑼於此共培養期後，涵蓋視 /」。於此休止步驟中，胚係 可抑制農桿菌生長之枋决去六士 主^ 種已知 疳妷之览摆此 存在下培養，但未添加植物轉 形株之'選擇劑（步驟3 :休 得 辛之固髀拉差盆L 、止乂驟）。未成熟胚可於具有抗生 ’、 " 土上培養，但不含選擇劑以去除農;T菌月或 、了感染細胞之休止期。， ’、干囷及為 上培養，並回收生長的鐘—人，種胚於含選擇劑之培養基 来成傷組織（步驟4··選擇步驟）。

t ;:具有選擇劑之固體培養基上培養，獲得轉SI 於然後癒傷組織再生成植物(步驟5 ··再： 上培養^生植^養基上生長之癒傷組織可於固體培養基 實例6 ··大豆胚之轉形 大豆胚與含SEQ ID Ν〇:1工 . 且之毒素核苦酸序列之質濟 工外、，，。Pmll啟動子 J 貝體石亚考里如下。袁V 4盆 刻卜马了誘導體細胞 94306 99 200900008 胚由適虽大豆培養株之經過表面滅菌之未成熟種子切下 之長3至5宅米子葉係於適當瓊脂培養基上，於26。〇亮處 ，暗處培養6至10週。體細胞胚產生二次胚，然後切下二 ••人胚放置於適當液體培養基。重複選擇體細胞胚群落，繁 殖作為早期的球狀階段胚，懸浮液係如下文說明般維持。 大豆胚懸浮培養物維持於35毫升液體培養基中，於旋 轉振搖器上，15〇rpm，26〇C，螢光燈以16:8小時日/夜之 晝照明。培養物每兩週經由將約35毫克組織接種入％ 毫升液體培養基進行次培養。 然後藉粒子搶碰撞的方法轉形大豆胚懸浮培養物 (Klein等人（1987)Naiure(倫敦）327:7〇_73，美國專利案第 4,945,〇5〇 f虎）。杜邦公司（Du p〇nt)百里提克⑼心s叫 PDS1000/HE儀器（氦氣更新）可用於此等轉形。 山可用來協助大豆轉形之可選擇標記基因係得自花挪菜 甘欠紋病毒之35S啟動子（0dell等人（1985)Ν&_ 3ΐ3:8ι〇· U)知自質體pjR225之濕黴素（hygr〇myc⑻磷酸轉移酶

基因（得自大腸桿菌；Gritz等人 及得自農桿菌Ti質體之t-DNA 94306 100 200900008 及50微升CaCl2 (2.5 Μ)。然後粒子製品授動3分鐘，於 微離心機中離心1()秒，移除上清液。經過腿塗覆之粒 子隨後再度於微升腦乙醇洗—次，再懸浮於4〇微 升無水乙醇。DNA/粒子懸浮液各自以超音波處理三次，每 次1秒。然後將5微升經DNA塗覆之金粒子 載劑盤上。 古、^^ 3〇0至400笔克兩週齡懸浮培養物置於空的60xl5 宅米培養皿中’使用滴管由組織移出殘液。對各轉形實驗， 通常碰撞5-10組織平盤。膜破裂壓力設定於ιι〇〇_，室 内抽真空1 28吋汞柱真空。組織放置遠離保持網約3.5 喊三次。於碰撞後’組織平分並放回液體内，且如 刖文說明進行培養。 二才里後5至7曰’以新鮮培養基更換液體培養基，而 11至12日以含50毫克/毫升濕黴素之新鮮培養基 ^換液體培養基。此選擇性培養基可每週更新。碰撞後7 觀察到由未經轉形的壞死胚群落中長出綠色的 ^二織。移出分離的綠色組織，接種入個別燒瓶内來產 =的經同源細胞地繁瘦之轉形胚懸浮培養液。各新細胞 為獨立的轉形事件處理。然後這些懸浮液物可進行 維持為未成熟胚之群集，或藉個別體細胞胚成熟 及發牙來再生為全株。 此領η二:I所述王°卩公開案、專利案及專利申請案係指 =熟習本領域技藝人士對本發明之相關程度之指示。 Α開案、專利案及專利中請案皆以引用方式併入此 94306 101 200900008 處，如同個別公開案 示併入此處般。 專利案或專利申請案特別且個別指 雖然已經故由舉例說明及實例以若+細節說明本發明 以求徹底了解’顯然可於實施例之範圍内進行部份變化及 修改。 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 102 94306

Claims (1)

1. 200900008 十、申請專利範圍： 1 · 一種經分離之核酸分子，其係選自由下列所組成之組 群： (a)包含SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸序列或其全長補體 之核酸分子； (b) 編碼包含seq π) n〇:2之胺基酸序列之多肽 核酸序列； 之 (c) 具有與（a)之核苷酸序列至少8〇%序列相同性之 (V核苷酸序列； (d) 具有與（a)之核苷酸序列至少85%序列相同性之 核苷酸序列； ⑷編碼包含特徵為與（b)之絲酸序财至少鳩 序列相同性之-胺基酸序列之蛋白質之核㈣序列；以。 及 . . (f)編碼包含特徵為與⑻之胺基酸有 相同性之-胺基酸序列之蛋白質之核㈣軸W ^申請專利範㈣，項之經分離之核酸分子， 錢序縣經設計用來於植物中表現之合成列。… .=麵構成體，包含如申__】項之核酸 4.如申請專利範圍第3項之DNA 縣 石馬異源多肽之核酸分子。 成體，進—步包含編 5· 一種宿主細胞，其含有如宇 構成體。 节月專利轭圍弟3項之DNA 94306 103 200900008 6. 如申請專利範圍第5項之宿主細胞，其為細菌細胞。 7. 如申請專利範圍第5項之宿主細胞，其為植物細胞。 8. —種基因轉殖植物，.包含如申請專利範圍第了項之宿主 細胞。 9.如申請專利範圍第8項之基因轉殖植物，其係選自由玉 米、咼粱、小麥、甘藍、向曰葵、蕃茄、十字花科、辣 椒（peppers)、馬鈴薯、棉、稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸 草、大麥、及油籽油菜（〇i!seedrape)所組成之組群。 .種如申清專利範圍第9項之植物之轉形種子，其中該 種子包含該DNA構成體。 11. —種具有殺蟲活性之經分離之多肽，其係選自於由下列 所組成之組群： ⑷包含SEQ IDNO:2之胺基酸序列之一多肽； (b) 由SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸序列所編碼之一多肽，· (c) 具有與（a)或（b)之多肽序列至少8〇%序列相同性 1. 之一多肽序列；及 (d)具有與（a)或（…之多肽序列至少85%序列相同性 之一多肽序列。 12·如申請專利範圍第U項之多肽，進一步包 酸序列。 3艿源胺基 13 — .一種組成物，包含如申請專利範圍第u項之多肽。 =申睛專利範圍第13項之組成物，其中該組成物 2於粉劑(powder)、塵粉劑（dust)、丸粒劑、粒劑、二露 蜊、乳劑、膠體、及溶液劑所組成之組群。 貝， 94306 104 200900008 15. 如申請專利範圍第13項之組成物，其中該組成物係經 由蘇力菌（5<3£7/"似似/*〇細胞培養物之乾燥、束 乾、均化、萃取、過濾、離心、沈澱（Sedimentati〇n)戋 濃縮而製備。 16. 如申睛專利範圍第13項之組成物，包含自約1重量^/ 至約99重量％之該多肽。 Π.—種控制鱗翅目或鞘翅目害蟲族群之方法，包含使該族 群與殺蟲有效量之如申請專利範圍第U項之多肽接觸。 ^18. —種殺死鱗翅目或鞘翅目害蟲之方法，包含使該害蟲接 觸’或餵食該害蟲殺蟲有效量之如申請專利範圍第工工 項之多狀。 19.一種製造具有殺蟲活性之多肽之方法，包含於編碼該多 肽之核酸分子可表現之條件下，培養如申請專利範圍第 4項之佰主細胞，該.多肽係選自由下列所組成之組群： ⑷包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之多肽； (b) 由SEQ ID NO: 1之核苷酸序列所編碼之多肽； (c) 具有與（a)或（b)之多肽序列至少8〇%序列相同性 之多肽序列；及 (d) 具有與（a)或（b)之多肽序列至少85〇/0序列相同性 之多狀序列。 種植物’其具有穩定結合於其基因體内之構成 體，該DNA構成體包含編碼具有殺蟲活性之蛋白質之 核营酸序列，其中該核苦酸序列係選自由下列所組成之 94306 105 200900008 • ⑷包含SEQ ID N〇:l之核普酸序歹,j或其全長補體 之核酸分子； (b)編碼包含SEq ID N〇:2之胺基酸序列之多肽之 核苷酸序列； (C)具有與（a)之核苷酸序列至少80%序列相同性之 核苷酸序列； (d) 具有與（a)之核苷酸序列至少85%序列相同性之 核苦酸序列； (e) 編碼包含一特徵為與⑻之胺基酸序列有至少 70 /〇序列相同性之胺基酸序列之蛋白質之核苷酸序 列；以及 (f) 編碼包含一特徵為與（b)之胺基酸序列有至少 75 /〇序列相同性之胺基酸序列之蛋白質之核苷酸序列， 其中該核苷酸序列係工作式聯結至啟動子，該啟動 子係驅動植物細胞中編碼序列的表現。 、pi.如申請專利範圍第2〇項之植物，其中該植物為植物細 胞。 22. —種保護植物免於害蟲之方法，包含於該植物或其細胞 内導入至少一種表現载體，該表現載體包含編碼殺蟲多 肽之核苦酸序列，其中該核苷酸序列係選自於由下列所 組成之組群： (a) 包含SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸序列或其全長補體 之核酸分子； (b) 編碼包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之多肽之 94306 106 200900008 ' 核普酸序列； ，核二具:與⑷之㈣酸序収少齡序列相同性之 核與（a)之料酸序列至少85%序列相同性之 碼包含一特徵為與(b)之胺基酸序列有至少 序列相同性之胺基酸序列之蛋白質之核*酸序 列，以及 ^ f ^編碼包含-㈣為與⑻之胺基酸序列有至少 75/〇序列相同性之胺基酸序列之蛋白質 23·如申請專利範圍第22項之方法，其中該植物^且有 抗鱗翅目害蟲或魏目害蟲之殺蟲活性之殺蟲多狀。

   94306 107 200900008 七、指定代表圖··本案無圖式 (一） 本案指定代表圖為：第（）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 本案無代表化學式 94306 丨修JE ««充 發明專利說明書 200900008 I此處由本局於收 文時黏貼條碼 (本說明書格式、順序及粗體字， ※申請案號：丨丨 ※申請曰期： 一、發明名稱：（中文/英文） 請_勿任意更動|※記號部分請勿填寫） 分類：

   一二 H 01》 (2006,01) (2006.01) 對鱗翅目具有活性之新穎蘇力菌（BACILLUS THURINGIENSIS)基因 NOVEL BACILLUS THURINGIENSIS GENE WITH LEPIDOPTERAN ACTIVITY 二、申請人：（共1人) 姓名或名稱：（中文/英文） 先鋒高科技育成的國際公司 PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC. 代表人：（中文/英文）（簽章）米契爾瑪利安納/MICHEL, MARIANNE Η. 住居所或營業所地址··（中文/英文） 美國•愛荷華州50131-0552 ·強森•西北62街7250號 7250 NW 62nd Avenue Johnston, Iowa 50131-0552, U. S. A. .國籍：（中文/英文）美國/U.S.A. 三、發明人：（共5人） 《 姓名：（中文/英文） 1·阿貝德安卓R / ABAD，ANDRE R 2. 董華 / DONG, HUA 3. 羅蘇 B / L0，SUE B. 1 施曉梅 / SHI，ΧΙΑ0ΜΕΙ 5.郁操國 / YU, CA0 GU0 國籍：（中文/英文）1.法國/FRANCE 2.中國大陸/CHINA 。 3·美國/U. S· A. 4. 5_ 加拿大/CANADA 94306 200900008

   (此處由本局於收1 文時黏貼條碼^ 專利說明書 請勿任意更動，※記號部分請勿填寫） 輕,.〜導（2°06·01) 分類：^⑼ C/2A；咖 (本說明書格式、順序及粗體字 ※申請案號： ) ※申請日期： 紐0：分類：⑽％ 明名稱：（中文/英文） ^〇ir7/〇 j5'Gi} 對_目具有活性之新顆蘇力菌（bacillus THURINGIENSIS)基因 novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity 二、申請人：（共1人） Γ · 姓名或名稱：（中文/英文） 先鋒向科技育成的國際公司 PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC. 代表人：（中文/英文）（簽章）米契爾瑪利安納H/MICHEL，MARIANNEH. 住居所或營業所地址：（中文/英文） 美國•愛荷華州40131-0552 ·強森•西北62街7250號 … 7250 NW 62nd Avenue Johnston, Iowa 50131-0552, U.S.A. m籍：（中文/英文）美國/U.S. A. 二、發明人：（共5人） &名：（中文/英文） L阿貝德安卓R / ABAD，ANDRE R. 2. 董華 / D0NG，HUA 3. 羅蘇 B / L0, SUE Β· 4. 施曉梅 / SHI, ΧΙΑ0ΜΕΙ 5. 郁操國 / YU, CA0 GUO 國籍：（中文/英文）1.法國/FRANCE 2.中國大陸/CHINA 3·美國/U. S. A_ 4. 5.加拿大/CANADA 94306