ES2937045T3 - Proteínas insecticidas y métodos para su uso - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para controlar plagas. Los métodos implican la transformación de organismos con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína insecticida. En particular, las secuencias de ácido nucleico son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad insecticida. Así, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformadas. Las composiciones son ácidos nucleicos insecticidas y proteínas de especies bacterianas. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación posterior en organismos de interés que incluyen plantas, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos). Las proteínas plaguicidas encuentran uso para controlar, inhibir el crecimiento o matar lepidópteros, coleópteros, dípteros, hongos, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas insecticidas y métodos para su uso
REFERENCIA A LA LISTA DE SECUENCIAS PRESENTADA ELECTRÓNICAMENTE
Se presentó una lista de secuencias que tiene el nombre de archivo "5345PCT_sequenceJisting.txt" creado el 28 de agosto de 2014, y que tiene un tamaño de 576 kilobytes en formato legible por ordenador con la memoria descriptiva. La lista de secuencias forma parte de la memoria descriptiva.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta divulgación se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan genes novedosos que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas y las secuencias de ácido nucleico que codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a plagas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El control biológico de plagas de insectos de importancia agrícola usando un agente microbiano, tal como hongos, bacterias u otras especie de insectos produce una alternativa ecológica y comercialmente atractiva a los plaguicidas químicos sintéticos. En líneas generales, el uso de bioplaguicidas presenta un riesgo menor de polución y peligros ambientales y los bioplaguicidas proporcionan mayos especificidad de diana de lo que es característico de los insecticidas químicos de amplio espectro tradicionales. Además, los bioplaguicidas a menudo tienen menor coste de producción y, por tanto, mejoran el rendimiento económico para una amplia diversidad de cultivos.
Determinadas especies de microorganismos del género Bacillus son conocidas por poseer actividad plaguicida contra una serie de plagas de insectos incluyendo Lepidoptera, Díptera, Coleóptera, Hemiptera y otros. Bacillus thuringiensis (Bt) y Bacillus popilliae están entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta ahora. La patogenia de los insectos también se ha atribuido a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus y B. cereus. Los insecticidas microbianos, particularmente los obtenidos de cepas de Bacillus, han desempeñado una función importante en agricultura como alternativas al control químico de plagas.
Se han desarrollado plantas de cultivo con resistencia potenciada a insectos genomanipulando plantas de cultivo para que produzcan proteínas plaguicidas de Bacillus. Por ejemplo, se han genomanipulado plantas de maíz y algodón para que produzcan proteínas plaguicidas aisladas de cepas de Bt. Estos cultivos genomanipulados ahora se usan ampliamente en agricultura y han proporcionado a los agricultores una alternativa ecológica a los métodos tradicionales de control de insectos. Aunque se ha demostrado que son muy exitosas comercialmente, estas plantas de cultivo genomanipuladas resistentes a insectos proporcionan resistencia a solamente una estrecha gama de las plagas de insectos económicamente importantes. En algunos casos, los insectos pueden desarrollar resistencia a diferentes compuestos insecticidas, que genera la necesidad de identificar agentes de control biológico alternativos para el control de las plagas.
Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad de nuevas proteínas plaguicidas con diferentes intervalos de actividad insecticida contra plagas de insectos, por ejemplo, proteínas insecticidas que son activas contra una diversidad de insectos del orden Lepidoptera y el orden Coleoptera incluyendo, aunque sin limitación, plagas de insectos que han desarrollado resistencia a insecticidas existentes.
El documento US 2012/233726 se refiere a un gen de Bacillus thuringiensis con actividad contra lepidópteros. Halford (Food and Energy Security 1.1 (2012): 9-28) se refiere a los éxitos, fracasos y perspectivas de la biotecnología de plantas. Kupferschmied et al. (Frontiers in plant science 4 (2013): 287) se refiere a Pseudomonas asociadas a las raíces con actividades insecticidas. Schellenberg et al. (Science 354.6312 (2016): 634-637) se refiere a una proteína insecticida selectiva de Pseudomonas para controlar gusanos de la raíz del maíz.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones independientes 1-12. Aspectos adicionales y realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no se encuentre bajo el alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona simplemente para fines ilustrativos.
La invención proporciona una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido PIP-72 que tiene actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera), en la que el polipéptido PIP-72 codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 32.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 que tiene actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera), en la que el polipéptido PIP-72 codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 32.
La invención proporciona además un casete de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la invención unido de forma funcional a un elemento regulador heterólogo; opcionalmente en el que el elemento regulador es un promotor que puede expresar una proteína en plantas.
La invención proporciona adicionalmente una planta transgénica que comprende: A. la construcción de ADN de la invención; o B. transformada de forma estable con la construcción de ADN de la invención.
La invención también proporciona una semilla producida a partir de la planta de la invención, en la que la semilla comprende la construcción de Ad N de la invención.
La invención proporciona además una planta descendiente producida a partir de la semilla de la invención.
La invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora transformada con la construcción de ADN de la invención; opcionalmente en la que la célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula vegetal; preferiblemente en la que la célula vegetal es una célula de planta monocotiledónea o dicotiledónea.
La invención también proporciona un polipéptido PIP-72 recombinante que tiene actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera), en el que el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 32.
La invención proporciona además una composición que comprende el polipéptido PIP-72 recombinante de la invención.
La invención proporciona adicionalmente una proteína de fusión que comprende el polipéptido PIP-72 de la invención.
La invención también proporciona un método: A. para controlar una población de plaga de insectos, que comprende poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida del polipéptido PIP-72 de la invención; o B. de inhibición del crecimiento o de eliminación de una plaga de insectos, que comprende poner en contacto la plaga de insectos con una composición que comprende una cantidad eficaz como insecticida del polipéptido PIP-72 de la invención; o C. para controlar una población de plaga de insectos resistente a una proteína plaguicida, que comprende poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida del polipéptido PIP-72 de la invención; o D. de control de una infestación por insectos en una planta transgénica y que proporciona control de la resistencia de los insectos, que comprende expresar en la planta el polipéptido PIP-72 de la invención.
La invención proporciona además un método de identificación: A. en una muestra biológica de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PIP-72 de la invención, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un polinucleótido que hibrida con la secuencia de nucleótidos en condiciones de hibridación rigurosas y detectar la unión de dicho polinucleótido a dicha secuencia de nucleótidos, en el que dicha unión es diagnóstica de dicha secuencia de nucleótidos en dicha muestra; o B. en una muestra del polipéptido PIP-72 de la invención, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo que se une específicamente a dicho polipéptido, y detectar la unión, en el que dicha unión es diagnóstica de la presencia de dicho polipéptido en dicha muestra.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Ea (SEQ ID NO: 16), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20), SRBS_294080 (SEQ ID NO: 22); JG43047 (SEQ ID NO: 24); SwiRh_4910 (SEQ ID NO: 26); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28), PFL_6283 (SEQ ID NO: 30); PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32); XBJ1_1078 (SEQ ID NO: 34); plu2373 (SEQ ID NO: 36); y PIP-72Ge (SEQ ID NO: 38). La diversidad de secuencia está resaltada. Los aminoácidos 37-51 (motivo 1) con respecto a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) están subrayados.
La figura 2 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927); PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Bb (SEQ ID NO: 928); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); WP_030131237 (SEQ ID NO: 929); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); y GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20). La diversidad de aminoácidos entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La figura 3 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); y PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). La diversidad de aminoácidos entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La figura 4 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de WP_030131237 (SEQ ID NO: 929) PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); y PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). La diversidad de aminoácidos entre PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La figura 5 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de PIP-72Fh (SEQ ID NO: 932), PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941); PIP-72Fi (SEQ ID NO: 933); PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 14). La diversidad de aminoácidos entre PIP-72Ca (SEQ ID NO: 2) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La figura 6 muestra los resultados de eficacia de T0 GH para acontecimientos generados a partir de las construcciones PHP61664, PHP61666, PHP61668, PHP64465, PHP64468, PHP64471 y PHP69828. Se observó la eficacia de acontecimientos derivados de las construcciones con respecto a acontecimientos de control negativo medida por protección de las raíces contra el gusano de la raíz del maíz occidental. La protección de la raíz se midió de acuerdo con el número de nudos de las raíces lesionados (CRWNIS = puntuación de lesión de nudos por gusano de la raíz del maíz) usando el método desarrollado por Oleson, et al. (2005) [J. Econ Entomol. 98(1 ):1 -8]. La puntuación de lesión de la raíz se mide de "0" a "3", indicando "0" ausencia de lesión visible de la raíz, indicando "1" daño de 1 nudo de raíz, indicando "2" daño en 2 nudos de raíz e indicando "3" una puntuación máxima de 3 nudos de daño de raíz. Cada símbolo (triángulo, cuadrado o círculo) representa un único acontecimiento.
Descripción detallada
Debe apreciarse que esta divulgación no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, géneros y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con fines descriptivos de aspectos particulares únicamente.
Como se usa en este documento, las formas singulares "un/o", "una", y "el", "la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y una referencia a "la proteína" incluye referencias a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación salvo que se indique claramente lo contrario.
La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para controlar plagas. Los métodos implican transformar organismos con secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido PIP-72. En particular, las secuencias de ácido nucleico de los aspectos son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad plaguicida. Por tanto, en este documento se describen bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas, transformados. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas plaguicidas de especies bacterianas. Las secuencias de ácido nucleico encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para su posterior transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de polipéptidos PIP-72 alterados por métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio, intercambio de dominios o barajado de ADN. Los polipéptidos PIP-72 encuentran uso en el control o eliminación de poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hongos, hemípteros y nematodos y para producir composiciones con actividad plaguicida. Las plagas de insectos de interés incluyen, aunque sin limitación, especies de lepidópteros incluyendo, aunque sin limitación: polilla de dorso de diamante, por ejemplo, Helicoverpa zea Boddie; medidor de la soja, por ejemplo, Pseudoplusia includens Walker; y oruga de las leguminosas por ejemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner y especies de coleópteros incluyendo, aunque sin limitación, gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera) - WCRW, doradilla (Diabrotica undecimpunctata howardi) - SCRW y gusano alfilerillo (Diabrotica barberi) -NCRW.
Por "toxina plaguicida" o "proteína plaguicida" se usa en este documento para hacer referencia a una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas que incluyen, aunque sin limitación, miembros de los órdenes de los lepidópteros, dípteros, hemípteros y coleópteros o del filo de los nematodos o una proteína que tiene homología con dicha proteína. Se han aislado proteínas plaguicidas de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas plaguicidas incluyen, aunque sin limitación: proteínas insecticidas de Pseudomonas sp. tales como PSEEN3174 (Monalysin; (2011) PLoS Pathogens 7:1-13); de Pseudomonas protegens cepa CHA0 y Pf-5 (previamente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386; n.° de acceso a GenBank EU400157); de Pseudomonas taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem., 58:12343-12349) y de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 y Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas insecticidas de Photorhabdus sp. y Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal 3:101-118 y Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069); patente de Estados Unidos número 6.048.838, y patente de Estados Unidos número 6.379.946; un polipéptido PIP-1 del documento de Estados Unidos de número de serie 13/792861; un polipéptido AfIP-1A y/o AfIP-1B del documento de Estados Unidos de número de serie 13/800233; un polipéptido PHI-4 del documento de Estados Unidos de número de serie 13/839702; polipéptidos PIP-47 del documento de Estados Unidos de número de serie 61/866747; las proteínas insecticidas del documento de Estados Unidos de número de serie 61/863761 y 61/863763;
y 6-endotoxinas incluyendo, aunque sin limitación: las clases Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry28, Cry29, Cry30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry46, Cry47, Cry49, Cry51, Cry52, Cry53, Cry54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 y Cry71 de genes de 6-endotoxina y los genes citolíticos cyt1 y cyt2 de B. thuringiensis. Miembros de estas clases de proteínas insecticidas de B. thuringiensis incluyen, aunque sin limitación, Cry1Aa1 (n.° de acceso AAA22353); Cry1Aa2 (n.° de acceso AAA22552); Cry1Aa3 (n.° de acceso BAA00257); Cry1Aa4 (n.° de acceso CAA31886); Cry1Aa5 (n.° de acceso BAA04468); Cry1Aa6 (n.° de acceso AAA86265); Cry1Aa7 (n.° de acceso AAD46139); Cry1Aa8 (n.° de acceso I26149); Cry1Aa9 (n.5 de acceso BAA77213) Cry1Aa10 (n.1 de acceso AAD55382); Cry1Aa11 (n.° de acceso CAA70856); Cry1Aa12 (n.° de acceso AAP80146) Cry1Aa13 (n.° de acceso AAM44305): Cry1Aa14 (n.1 de acceso AAP40639); Cry1Aa15 (n.° de acceso AAY66993) Cry1Aa16 (n.° de acceso HQ439776); Cry1Aa17 (n.° de acceso HQ439788); Cry1Aa18 (n.° de acceso HQ439790) Cry1Aa19 (n.° de acceso HQ685121); Cry1Aa20 (n.( de acceso JF340156); Cry1Aa21 (n.° de acceso JN651496); Cry1Aa22 (n.° de acceso KC158223); Cry1Ab1 (n.° de acceso AAA22330); Cry1Ab2 (n.° de acceso AAA22613) Cry1Ab3 (n.° de acceso AAA22561); Cry1Ab4 (n.° de acceso BAA00071); Cry1Ab5 (n.° de acceso CAA28405) Cry1Ab6 (n.° de acceso AAA22420); Cry1Ab7 (n.° de acceso CAA31620); Cry1Ab8 (n.° de acceso AAA22551) Cry1Ab9 (n.° de acceso CAA38701); Cry1Ab10 (n.° de acceso A29125); Cry1Ab11 (n.° de acceso I12419); Cry1Ab12 (n.° de acceso AAC64003) Cry1Ab13 (n.° de acceso AAN76494); Cry1Ab14 (n.° de acceso AAG16877); Cry1Ab15 (n.° de acceso AAO13302) Cry1Ab16 (n.° de acceso AAK55546); Cry1Ab17 (n.° de acceso AAT46415); Cry1Ab18 (n.° de acceso AAQ88259) Cry1Ab19 (n.° de acceso AAW31761); Cry1Ab20 (n.° de acceso ABB72460); Cry1Ab21 (n.° de acceso ABS18384) Cry1Ab22 (n.° de acceso ABW87320); Cry1Ab23 (n.° de acceso HQ439777); Cry1Ab24 (n.° de acceso HQ439778) Cry1Ab25 (n.° de acceso HQ685122); Cry1Ab26 (n.° de acceso HQ847729); Cry1Ab27 (n.1 de acceso JN135249) Cry1Ab28 (n.° de acceso JN135250); Cry1Ab29 (n.° de acceso JN135251); Cry1Ab30 (n.° de acceso JN135252) Cry1Ab31 (n.° de acceso JN135253); Cry1Ab32 (n.° de acceso JN135254); Cry1Ab33 (n.° de acceso AAS93798) Cry1Ab34 (n.° de acceso KC156668); similar a Cry1Ab (n.° de acceso AAK14336); similar a Cry1Ab (n.° de acceso AAK14337); similar a Cry1Ab (n.° de acceso AAK14338); similar a Cry1Ab (n.° de acceso ABG88858); Cry1Ac1 (n.° de acceso AAA22331); Cry1Ac2 (n.° de acceso AAA22338); Cry1Ac3 (n.° de acceso CAA38098); Cry1Ac4 (n. de acceso AAA73077); Cry1Ac5 (n.° de acceso AAA22339); Cry1Ac6 (n.° de acceso AAA86266); Cry1Ac7 (n.° de acceso AAB46989); Cry1Ac8 (n.° de acceso AAC44841); Cry1Ac9 (n.° de acceso AAB49768); Cry1Ac10 (n.° de acceso CAA05505); Cry1Ac11 (n. ’ de acceso CAA10270); Cry1Ac12 (n.° de acceso I12418); Cry1Ac13 (n.° de acceso AAD38701); Cry1Ac14 (n.° de acceso AAQ06607); Cry1Ac15 (n.° de acceso AAN07788); Cry1Ac16 (n.° de acceso AAU87037); Cry1Ac17 (n.° de acceso AAX18704); Cry1Ac18 (n.° de acceso AAY88347); Cry1Ac19 (n.° de acceso ABD37053); Cry1Ac20 (n.° de acceso ABB89046); Cry1Ac21 (n.° de acceso AAY66992); Cry1Ac22 (n.° de acceso ABZ01836); Cry1Ac23 (n.° de acceso CAQ30431); Cry1Ac24 (n.° de acceso ABL01535); Cry1Ac25 (n.° de acceso FJ513324); Cry1Ac26 (n.° de acceso FJ617446); Cry1Ac27 (n.° de acceso FJ617447); Cry1Ac28 (n.° de acceso ACM90319); Cry1Ac29 (n.1 ’ de acceso DQ438941); Cry1Ac30 (n.° de acceso GQ227507); Cry1Ac31 (n.° de acceso GU446674); Cry1Ac32 (n.° de acceso HM061081); Cry1Ac33 (n.° de acceso GQ866913); Cry1Ac34 (n.° de acceso HQ230364); Cry1Ac35 (n.11 de acceso JF340157); Cry1Ac36 (n.° de acceso JN387137); Cry1Ac37 (n.° de acceso JQ317685); Cry1Ad1 (n.° de acceso AAA22340); Cry1Ad2 (n.° de acceso CAA01880); Cry1Ae1 (n.° de acceso AAA22410); Cry1Af1 (n.° de acceso AAB82749); Cry1Ag1 (n.° de acceso AAD46137); Cry1Ah1 (n.° de acceso AAQ14326); Cry1Ah2 (n.° de acceso ABB76664); Cry1Ah3 (n.° de acceso HQ439779); Cry1Ai1 (n.° de acceso AAO39719); Cry1Ai2 (n.° de acceso HQ439780); similar a Cry1A (n.° de acceso AAK14339); Cry1Ba1 (n. O de acceso CAA29898); Cry1Ba2 (n de acceso CAA65003); Cry1Ba3 (n.° de acceso AAK63251); Cry1Ba4 (n de acceso AAK51084); Cry1Ba5 (n de acceso ABO20894); Cry1Ba6 (n.° de acceso ABL60921); Cry1Ba7 (n de acceso HQ439781); Cry1Bb1 (n de acceso AAA22344); Cry1Bb2 (n.° de acceso HQ439782); Cry1Bc1 (n de acceso CAA86568); Cry1Bd1 (n de acceso AAD10292); Cry1Bd2 (n.° de acceso AAM93496); Cry1Be1 (n de acceso AAC32850); Cry1Be2 (n de acceso AAQ52387); Cry1Be3 (n.° de acceso ACV96720); Cry1Be4 (n de acceso HM070026); Cry1Bf1 (n.° de acceso CAC50778); Cry1Bf2 (n.° de acceso AAQ52380); Cry1Bg1 (n de acceso AAO39720); Cry1Bh1 (n.° de acceso HQ589331); Cry1Bi1 (n.° de acceso KC156700); Cry1Ca1 (n de acceso CAA30396); Cry1Ca2 (n.° de acceso CAA31951); Cry1Ca3 (n.° de acceso AAA22343); Cry1Ca4 (n. de acceso CAA01886); Cry1Ca5 (n.° de acceso CAA65457); Cry1Ca6 [1] (n.° de acceso AAF37224); Cry1Ca7 (n. de acceso AAG50438); Cry1Ca8 (n.° de acceso AAM00264); Cry1Ca9 (n.° de acceso AAL79362); Cry1Ca10 (n. de acceso AAN16462); Cry1Ca11 (n.° ’ de acceso AAX53094); Cry1Ca12 (n.° de acceso HM070027); Cry1Ca13 (n de acceso HQ412621): Cry1Ca14 (n.° de acceso JN651493); Cry1Cb1 (n.° de acceso M97880); Cry1Cb2 (n.° de acceso AAG35409);
Cry1Cb3 (n .° de acceso ACD50894); similar a Cry1Cb (n.° de acceso AAX63901); Cry1Da1 (n.° de acceso CAA38099);
Cry1Da2 (n.° de acceso I76415); Cry1Da3 (n.° de acceso HQ439784); Cry1Db1 (n.° de acceso CAA80234); Cry1Db2 (n.° de acceso AAK48937); Cry1 Dc1 (n.° de acceso ABK35074); Cry1 Ea1 (n.° de acceso CAA37933); Cry1 Ea2 (n.° de acceso CAA39609); Cry1 Ea3 (n.° de acceso AAA22345); Cry1 Ea4 (n.° de acceso AAD04732); Cry1 Ea5 (n.° de acceso A15535);
Cry1Ea6 (n.° de acceso AAL50330); Cry1Ea7 (n.° de acceso AAW72936); Cry1Ea8 (n.° de acceso ABX11258); Cry1Ea9 (n.° de acceso HQ439785); Cry1Ea10 (n.° de acceso ADR00398); Cry1 Ea11 (n.° de acceso JQ652456); Cry1 Eb1 (n.° de acceso AAA22346); Cry1Fa1 (n.° de acceso AAA22348); Cry1Fa2 (n.° de acceso AAA22347); Cry1Fa3 (n.° de acceso HM070028); Cry1Fa4 (n.° de acceso HM439638); Cry1FM (n.° de acceso CAA80235); Cry1Fb2 (n.° de acceso BAA25298); Cry1Fb3 (n.° de acceso AAF21767); Cry1Fb4 (n.° de acceso AAC10641); Cry1Fb5 (n.° de acceso AAO13295); Cry1Fb6 (n.° de acceso ACD50892); Cry1Fb7 (n.° de acceso ACD50893); Cry1Ga1 (n.° de acceso CAA80233); Cry1Ga2 (n.° de acceso CAA70506); C rylG bl (n.° de acceso AAD10291); Cry1Gb2 (n.° de acceso AAO13756); Cry1Gc1 (n.° de acceso AAQ52381); Cry1Ha1 (n.° de acceso CAA80236); Cry1Hb1 (n.° de acceso AAA79694); Cry1Hb2 (n.° de acceso HQ439786); similar a Cry1H (n.° de acceso AAF01213); Cry1Ia1 (n.° de acceso CAA44633); Cry1 Ia2 (n.° de acceso AAA22354); Cry1 Ia3 (n.° de acceso AAC36999); Cry1 Ia4 (n.° de acceso AAB00958);
Cry1 Ia5 (n.° de acceso CAA70124); Cry1 Ia6 (n.° de acceso AAC26910); Cry1 Ia7 (n.° de acceso AAM73516); Cry1 Ia8 (n.° de acceso AAK66742); Cry1 Ia9 (n.° de acceso AAQ08616); Cry1 Ia10 (n.° de acceso AAP86782); Cry1 Ia11 (n.° de acceso CAC85964); Cry1Ia12 (n.° de acceso AAV53390); Cry1Ia13 (n.° de acceso ABF83202); Cry1Ia14 (n.° de acceso ACG63871); Cry1Ia15 (n.° de acceso FJ617445); Cry1Ia16 (n.° de acceso FJ617448); Cry1Ia17 (n.° de acceso GU989199); Cry1Ia18 (n.° de acceso ADK23801); Cry1Ia19 (n.° de acceso HQ439787); Cry1Ia20 (n.° de acceso JQ228426); Cry1Ia21 (n.° de acceso JQ228424); Cry1Ia22 (n.° de acceso JQ228427); Cry1Ia23 (n.° de acceso JQ228428); Cry1Ia24 (n.° de acceso JQ228429); Cry1Ia25 (n.° de acceso JQ228430); Cry1Ia26 (n.° de acceso JQ228431); Cry1Ia27 (n.° de acceso JQ228432); Cry1Ia28 (n.° de acceso JQ228433); Cry1Ia29 (n.° de acceso JQ228434); Cry1 Ia30 (n.° de acceso JQ317686); Cry1 Ia31 (n.° de acceso JX944038); Cry1 Ia32 (n.° de acceso JX944039);
Cry1 Ia33 (n.° de acceso JX944040); Cry1 Ib1 (n.° de acceso AAA82114); Cry1 Ib2 (n.° de acceso ABW88019); Cry1 Ib3 (n.° de acceso ACD75515); Cry1 Ib4 (n.° de acceso HM051227); Cry1 Ib5 (n.° de acceso HM070028); Cry1 Ib6 (n.° de acceso ADK38579); Cry1Ib7 (n.° de acceso JN571740); Cry1Ib8 (n.° de acceso JN675714); Cry1Ib9 (n.° de acceso JN675715);
Cry1 Ib10 (n.° de acceso JN675716); Cry1Ib11 (n.° de acceso JQ228423); Cry1Ic1 (n.° de acceso AAC62933); Cry1Ic2
(n.° de acceso AAE71691); Cry1Id1 (n.° de acceso AAD44366); Cry1Id2 (n.° de acceso JQ228422); Cry1Ie1 (n.° de acceso AAG43526); Cry1Ie2 (n.° de acceso HM439636); Cry1Ie3 (n.° de acceso KC156647); Cry1Ie4 (n.° de acceso KC156681); Cry1If1 (n.° de acceso AAQ52382); Cry1Ig1 (n.° de acceso KC156701); similar a Cry1I (n.° de acceso AAC31094); similar a Cry1I (n.° de acceso ABG88859); Cry1Ja1 (n.° de acceso AAA22341); Cry1Ja2 (n.° de acceso HM070030); Cry1Ja3 (n.° de acceso JQ228425); Cry1Jb1 (n.° de acceso AAA98959); Cry1Jc1 (n.° de acceso AAC31092);
Cry1Jc2 (n.° de acceso AAQ52372); Cry1Jd1 (n.° de acceso CAC50779); Cry1Ka1 (n.° de acceso AAB00376); Cry1Ka2
(n.° de acceso HQ439783); Cry1La1 (n.° de acceso AAS60191); Cry1La2 (n.° de acceso HM070031); Cry1Ma1 (n.° de acceso FJ884067); Cry1Ma2 (n.° de acceso KC156659); Cry1Na1 (n.° de acceso KC156648); Cry1Nb1 (n.° de acceso KC156678); similar a Cry1 (n.° de acceso AAC31091); Cry2Aa1 (n.° de acceso AAA22335); Cry2Aa2 (n.° de acceso AAA83516); Cry2Aa3 (n.° de acceso D86064); Cry2Aa4 (n.° de acceso AAC04867); Cry2Aa5 (n.° de acceso CAA10671);
Cry2Aa6 (n.° de acceso CAA10672); Cry2Aa7 (n.° de acceso CAA10670); Cry2Aa8 (n.° de acceso AAO13734); Cry2Aa9
(n.° de acceso AAO13750); Cry2Aa10 (n.° de acceso AAQ04263); Cry2Aa11 (n.° de acceso AAQ52384); Cry2Aa12 (n.° de acceso ABI83671); Cry2Aa13 (n.° de acceso ABL01536); Cry2Aa14 (n.° de acceso ACF04939); Cry2Aa15 (n.° de acceso JN426947); Cry2Ab1 (n.° de acceso A de acceso CAA39075); Cry2Ab3 (n.° de acceso AAG36762); Cry2Ab4 (n.° de acceso AAO acceso AAQ04609); Cry2Ab6 (n.° de acceso AAP59457); Cry2Ab7 (n.° de acceso AAZ acceso ABC95996); Cry2Ab9 (n.° de acceso ABC74968); Cry2Ab10 (n.° de acceso b11 (n.° de acceso CAM84575); Cry2Ab12 (n.° de acces ABM21764); Cry2Ab13 (n.° de acceso Ab14 (n.° de acceso ACG76121); Cry2Ab15 (n.° de acces HM037126); Cry2Ab16 (n.° de acceso Ab17 (n.° de acceso HQ439789); Cry2Ab18 (n.° de acces JN135255); Cry2Ab19 (n.° de acceso JN13 acceso JN135257); Cry2Ab21 (n.° de acceso JN135258); Cry2Ab22 (n.° de acceso JN13 acceso JN135260); Cry2Ab24 (n.° de acceso JN135261); Cry2Ab25 (n.° de acceso JN41 acceso JN426946); Cry2Ab27 (n.° de acceso JN415764); Cry2Ab28 (n.° de acceso JN65 acceso CAA40536); Cry2Ac2 (n.° de acceso AAG35410); Cry2Ac3 (n.° de acceso AAQ acceso ABC95997); Cry2Ac5 (n.° de acceso ABC74969); Cry2Ac6 (n.° de acceso ABC acceso CAL18690); Cry2Ac8 (n.° de acceso CAM09325); Cry2Ac9 (n.° de acceso CAM09 acceso ABN15104); Cry2Ac11 (n.° de acceso CAM83895); Cry2Ac12 (n.° de acceso CAM acceso AAF09583); Cry2Ad2 (n.° de acceso ABC86927); Cry2Ad3 (n.° de acceso CAK acceso CAM32331); Cry2Ad5 (n.° de acceso CAO78739); Cry2Ae1 (n.° de acceso AAQ acceso ABO30519); Cry2Af2 (n.° de acceso GQ866915); Cry2Ag1 (n.° de acceso ACH
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acceso EU939453); Cry2Ah2 (n.° de acceso ACL80665); Cry2Ah3 (n.° de acceso GU073380); Cry2Ah4 (n.° de acceso KC156702); Cry2Ai1 (n.° de acceso FJ788388);
Cry2Aj (n.° de acceso); Cry2Ak1 (n.° de acceso KC156660); Cry2Ba1 (n.° de acceso KC156658); Cry3Aa1 (n.° de acceso a Aa 22336); Cry3Aa2 (n.° de acceso AAA22541); Cry3Aa3 (n.° de acceso CAA68482); Cry3Aa4 (n.° de acceso AAA22542); Cry3Aa5 (n.° de acceso AAA50255); Cry3Aa6 (n.° de acceso AAC43266); Cry3Aa7 (n.° de acceso CAB41411); Cry3Aa8 (n.° de acceso AAS79487); Cry3Aa9 (n.° de acceso AAW05659); Cry3Aa10 (n.° de acceso AAU29411); Cry3Aa11 (n.° de acceso AAW82872); Cry3Aa12 (n.° de acceso ABY49136); Cry3Ba1 (n.° de acces CAA34983); Cry3Ba2 (n.° de acceso CAA00645); Cry3Ba3 (n.° de acceso JQ397327); Cry3Bb1 (n.° de acceso AAA22334); Cry3Bb2 (n.° de acceso AAA74198); Cry3Bb3 (n.° de acceso I15475); Cry3Ca1 (n.° de acceso CAA42469);
Cry4Aa1 (n.° de acceso CAA68485); Cry4Aa2 (n.° de acceso BAA00179); Cry4Aa3 (n.° de acceso CAD30148); Cry4Aa4
(n.° de acceso AFB18317); similar a Cry4A (n.° de acceso AAY96321); Cry4Ba1 (n.° de acceso CAA30312); Cry4Ba2 (n.° de acceso CAA30114); Cry4Ba3 (n.° de acceso AAA22337); Cry4Ba4 (n.° de acceso BAA00178); Cry4Ba5 (n.° de acceso CAD30095); similar a Cry4Ba (n.° de acceso ABC47686); Cry4Ca1 (n.° de acceso EU646202); Cry4Cb1 (n.° de acceso FJ403208); Cry4Cb2 (n.° de acceso FJ597622); Cry4Cc1 (n.° de acceso FJ403207); Cry5Aa1 (n.° de acceso AAA67694);
Cry5Ab1 (n.° de acceso AAA67693); Cry5Ac1 (n.° de acceso I34543); Cry5Ad1 (n.° de acceso ABQ82087); Cry5Ba1 (n.° de acceso AAA68598); Cry5Ba2 (n.° de acceso ABW88931); Cry5Ba3 (n.° de acceso AFJ04417); Cry5Ca1 (n.° de acceso HM461869); Cry5Ca2 (n.° de acceso ZP_04123426); Cry5Da1 (n.° de acceso HM461870); Cry5Da2 (n.° de acceso ZP_04123980); Cry5Ea1 (n.° de acceso HM485580); Cry5Ea2 (n.° de acceso ZP_04124038); Cry6Aa1 (n.° de acceso AAA22357); Cry6Aa2 (n.° de acceso AAM46849); Cry6Aa3 (n.° de acceso ABH03377); Cry6Ba1 (n.° de acceso AAA22358); Cry7Aa1 (n.° de acceso AAA22351); Cry7Ab1 (n.° de acceso AAA21120); Cry7Ab2 (n.° de acceso AAA21121); Cry7Ab3 (n.° de acceso ABX24522); Cry7Ab4 (n.° de acceso EU380678); Cry7Ab5 (n.° de acceso ABX79555); Cry7Ab6 (n.° de acceso ACI44005); Cry7Ab7 (n.° de acceso ADB89216); Cry7Ab8 (n.° de acceso GU145299); Cry7Ab9 (n.° de acceso ADD92572); Cry7Ba1 (n.° de acceso ABB70817); Cry7Bb1 (n.° de acceso KC156653); Cry7Ca1 (n.° de acceso ABR67863); Cry7Cb1 (n.° de acceso KC156698); Cry7Da1 (n.° de acceso ACQ99547); Cry7Da2 (n.° de acceso HM572236); Cry7Da3 (n.° de acceso KC156679); Cry7Ea1 (n.° de acceso HM035086); Cry7Ea2 (n.° de acceso HM132124); Cry7Ea3 (n.° de acceso EEM19403); Cry7Fa1 (n.° de acceso HM035088); Cry7Fa2 (n.° de acceso EEM19090); Cry7Fb1 (n.° de acceso HM572235); Cry7Fb2 (n.° de acceso KC156682); Cry7Ga1 (n.° de acceso HM572237); Cry7Ga2 (n.° de acceso KC156669); Cry7Gb1 (n.° de acceso KC156650); Cry7Gc1 (n.° de acceso KC156654); Cry7Gd1 (n.° de acceso KC156697); Cry7Ha1 (n.° de acceso KC156651); Cry7Ia1 (n.° de acceso KC156665); Cry7Ja1 (n.° de acceso KC156671); Cry7Ka1 (n.° de acceso KC156680); Cry7Kb1 (n.° de acceso BAM99306); Cry7La1 (n.° de acceso BAM99307); Cry8Aa1 (n.° de acceso AAA21117); Cry8Ab1 (n.° de acceso EU044830); Cry8Ac1 (n.° de acceso KC156662); Cry8Ad1 (n.° de acceso KC156684); Cry8Ba1 (n.° de acceso AAA21118); Cry8Bb1 (n.° de acceso CAD57542); Cry8Bc1 (n.° de acceso CAD57543); Cry8Ca1 (n.° de acceso AAA21119); Cry8Ca2 (n.° de acceso AAR98783); Cry8Ca3 (n.° de acceso EU625349); Cry8Ca4 (n.° de acceso ADB54826); Cry8Da1 (n.° de acceso BAC07226); Cry8Da2 (n.° de acceso BD133574); Cry8Da3 (n.° de acceso BD133575); Cry8Db1 (n.° de acceso BAF93483); Cry8Ea1 (n.° de acceso AAQ73470); Cry8Ea2 (n.° de acceso EU047597); Cry8Ea3 (n.° de acceso KC855216); Cry8Fa1 (n.° de acceso AAT48690); Cry8Fa2 (n.° de acceso HQ174208); Cry8Fa3 (n.° de acceso AFH78109); Cry8Ga1 (n.° de acceso AAT46073); Cry8Ga2 (n.° de acceso ABC42043); Cry8Ga3 (n.° de acceso FJ198072); Cry8Ha1 (n.° de acceso AAW81032); Cry8Ia1 (n.° de acceso EU381044); Cry8Ia2 (n.° de acceso GU073381); Cry8Ia3 (n.° de acceso HM044664); Cry8Ia4 (n.° de acceso KC156674); Cry8Ib1 (n.° de acceso GU325772); Cry8Ib2 (n.° de acceso KC156677); Cry8Ja1 (n.° de acceso EU625348); Cry8Ka1 (n.° de acceso FJ422558); Cry8Ka2 (n.° de acceso ACN87262); Cry8Kb1 (n.° de acceso HM123758); Cry8Kb2 (n.° de acceso KC156675); Cry8La1 (n.° de acceso GU325771); Cry8Ma1 (n.° de acceso HM044665); Cry8Ma2 (n.° de acceso EEM86551); Cry8Ma3 (n.° de acceso HM210574); Cry8Na1 (n.° de acceso HM640939); Cry8Pa1 (n.° de acceso HQ388415); Cry8Qa1 (n.° de acceso HQ441166); Cry8Qa2 (n.° de acceso KC152468); Cry8Ra1 (n.° de acceso AFP87548); Cry8Sa1 (n.° de acceso JQ740599); Cry8Ta1 (n.° de acceso KC156673); similar a Cry8 (n.° de acceso FJ770571); similar a Cry8 (n.° de acceso ABS53003); Cry9Aa1 (n.° de acceso CAA41122); Cry9Aa2 (n.° de acceso CAA41425); Cry9Aa3 (n.° de acceso GQ249293); Cry9Aa4 (n.° de acceso GQ249294); Cry9Aa5 (n.° de acceso JX174110); similar a Cry9Aa (n.° de acceso AAQ52376); Cry9Ba1 (n.° de acceso CAA52927); Cry9Ba2 (n.° de acceso GU299522); Cry9Bb1 (n.° de acceso AAV28716); Cry9Ca1 (n.° de acceso CAA85764); Cry9Ca2 (n.° de acceso AAQ52375); Cry9Da1 (n.° de acceso BAA19948); Cry9Da2 (n.° de acceso AAB97923); Cry9Da3 (n.° de acceso GQ249293); Cry9Da4 (n.° de acceso GQ249297); Cry9Db1 (n.° de acceso AAX78439); Cry9Dc1 (n.° de acceso KC156683); Cry9Ea1 (n.° de acceso BAA34908); Cry9Ea2 (n.° de acceso AAO12908); Cry9Ea3 (n.° de acceso ABM21765); Cry9Ea4 (n.° de acceso ACE88267); Cry9Ea5 (n.° de acceso ACF04743); Cry9Ea6 (n.° de acceso ACG63872); Cry9Ea7 (n.° de acceso FJ380927); Cry9Ea8 (n.° de acceso GQ249292); Cry9Ea9 (n.° de acceso JN651495); Cry9Eb1 (n.° de acceso CAC50780); Cry9Eb2 (n.° de acceso GQ249298); Cry9Eb3 (n.° de acceso KC156646); Cry9Ec1 (n.° de acceso AAC63366); Cry9Ed1 (n.° de acceso AAX78440); Cry9Ee1 (n.° de acceso GQ249296); Cry9Ee2 (n.° de acceso KC156664); Cry9Fa1 (n.° de acceso KC156692); Cry9Ga1 (n.° de acceso KC156699); similar a Cry9 (n.° de acceso AAC63366); Cry10Aa1 (n.° de acceso AAA22614); Cry10Aa2 (n.° de acceso E00614); Cry10Aa3 (n.° de acceso CAD30098); Cry10Aa4 (n.° de acceso AFB18318); similar a Cry10A (n.° de acceso DQ167578); Cry11Aa1 (n.° de acceso AAA22352); Cry11Aa2 (n.° de acceso AAA22611); Cry11Aa3 (n.° de acceso CAD30081); Cry11Aa4 (n.° de acceso AFB18319); similar a Cry11Aa (n.° de acceso DQ166531); Cry11Ba1 (n.° de acceso CAA60504); Cry11Bb1 (n.° de acceso AAC97162); Cry11Bb2 (n.° de acceso HM068615); Cry12Aa1 (n.° de acceso AAA22355); Cry13Aa1 (n.° de acceso AAA22356); Cry14Aa1 (n.° de acceso AAA21516); Cry14Ab1 (n.° de acceso KC156652); Cry15Aa1 (n.° de acceso AAA22333); Cry16Aa1 (n.° de acceso CAA63860); Cry17Aa1 (n.° de acceso CAA67841); Cry18Aa1 (n.° de acceso CAA67506); Cry18Ba1 (n.° de acceso AAF89667); Cry18Ca1 (n.° de acceso AAF89668); Cry19Aa1 (n.° de acceso CAA68875); Cry19Ba1 (n.° de acceso BAA32397); Cry19Ca1 (n.° de acceso AFM37572); Cry20Aa1 (n.° de acceso AAB93476); Cry20Ba1 (n.° de acceso ACS93601); Cry20Ba2 (n.° de acceso KC156694); similar a Cry20 (n.° de acceso GQ144333); Cry21Aa1 (n.° de acceso I32932); Cry21Aa2 (n.° de acceso I66477); Cry21Ba1 (n.° de acceso BAC06484); Cry21Ca1 (n.° de acceso JF521577); Cry21Ca2 (n.° de acceso KC156687); Cry21Da1 (n.° de acceso JF521578); Cry22Aa1 (n.° de acceso I34547); Cry22Aa2 (n.° de acceso CAD43579); Cry22Aa3 (n.° de acceso ACD93211); Cry22Ab1 (n.° de acceso AAK50456); Cry22Ab2 (n.° de acceso CAD43577); Cry22Ba1 (n.° de acceso CAD43578); Cry22Bb1 (n.° de acceso KC156672); Cry23Aa1 (n.° de acceso AAF76375); Cry24Aa1 (n.° de acceso AAC61891); Cry24Ba1 (n.° de acceso BAD32657); Cry24Ca1 (n.° de acceso CAJ43600); Cry25Aa1 (n.° de acceso AAC61892); Cry26Aa1 (n.° de acceso AAD25075); Cry27Aa1 (n.° de acceso BAA82796); Cry28Aa1 (n.° de acceso AAD24189); Cry28Aa2 (n.° de acceso AAG00235); Cry29Aa1 (n.° de acceso CAC80985); Cry30Aa1 (n.° de acceso CAC80986); Cry30Ba1 (n.° de acceso BAD00052); Cry30Ca1 (n.° de acceso BAD67157); Cry30Ca2 (n.° de acceso ACU24781); Cry30Da1 (n.° de acceso EF095955); Cry30Db1 (n.° de acceso BAE80088); Cry30Ea1 (n.° de acceso ACC95445); Cry30Ea2 (n.° de acceso FJ499389); Cry30Fa1 (n.° de acceso ACI22625); Cry30Ga1 (n.° de acceso ACG60020); Cry30Ga2 (n.° de acceso HQ638217); Cry31Aa1 (n.° de acceso BAB11757); Cry31Aa2 (n.° de acceso AAL87458); Cry31Aa3 (n.° de acceso BAE79808); Cry31Aa4 (n.° de acceso BAF32571); Cry31Aa5 (n.° de acceso BAF32572); Cry31Aa6 (n.° de acceso BAI44026); Cry31Ab1 (n.° de acceso BAE79809); Cry31Ab2 (n.° de acceso BAF32570); Cry31Ac1 (n.° de acceso BAF34368); Cry31Ac2 (n.° de acceso AB731600); Cry31Ad1 (n.° de acceso BAI44022); Cry32Aa1 (n.° de acceso AAG36711); Cry32Aa2 (n.° de acceso GU063849); Cry32Ab1 (n.° de acceso GU063850); Cry32Ba1 (n.° de acceso BAB78601); Cry32Ca1 (n.° de acceso BAB78602); Cry32Cb1 (n.° de acceso KC156708); Cry32Da1 (n.° de acceso BAB78603); Cry32Ea1 (n.° de acceso GU324274); Cry32Ea2 (n.° de acceso KC156686); Cry32Eb1 (n.° de acceso KC156663); Cry32Fa1 (n.° de acceso KC156656); Cry32Ga1 (n.° de acceso KC15 acceso KC156661); Cry32Hb1 (n.° de acceso KC156666); Cry32Ia1 (n.° de acceso KC15 acceso KC156685); Cry32Ka1 (n.° de acceso KC156688); Cry32La1 (n.° de acceso KC15 acceso KC156690); Cry32Mb1 (n.° de acceso KC156704); Cry32Na1 (n.° de acceso KC15 acceso KC156703); Cry32Pa1 (n.° de acceso KC156705); Cry32Qa1 (n.° de acceso KC15 acceso KC156707); Cry32Sa1 (n.° de acceso KC156709); Cry32Ta1 (n.° de acceso KC15 acceso KC156655); Cry33Aa1 (n.° de acceso AAL26871); Cry34Aa1 (n.° de acceso AAG acceso AAK64560); Cry34Aa3 (n.° de acceso AAT29032); Cry34Aa4 (n.° de acceso AAT2 acceso AAG41671); Cry34Ac1 (n.° de acceso AAG50118); Cry34Ac2 (n.° de acceso AAK acceso AAT29029); Cry34Ba1 (n.° de acceso AAK64565); Cry34Ba2 (n.° de acceso AAT2 acceso AAT29031); Cry35Aa1 (n.° de acceso AAG50342); Cry35Aa2 (n.° de acceso AAK acceso AAT29028); Cry35Aa4 (n.° de acceso AAT29025); Cry35Ab1 (n.° de acceso AAG acceso AAK64563); Cry35Ab3 (n.° de acceso AY536891); Cry35Ac1 (n.° de acceso AAG acceso AAK64566); Cry35Ba2 (n.° de acceso AAT29027); Cry35Ba3 (n.° de acceso AAT2 acceso AAK64558); Cry37Aa1 (n.° de acceso AAF76376); Cry38Aa1 (n.° de acceso AAK acceso BAB72016); Cry40Aa1 (n.° de acceso BAB72018); Cry40Ba1 (n.° de acceso BAC acceso EU381045); Cry40Da1 (n.° de acceso ACF15199); Cry41Aa1 (n.° de acceso BAD acceso BAD35163); Cry41Ba1 (n.° de acceso HM461871); Cry41Ba2 (n.° de acceso ZP_04 acceso BAD35166); Cry43Aa1 (n.° de acceso BAD15301); Cry43Aa2 (n.° de acceso 3Ba1 (n.° de acces BAD15303); Cry43Ca1 (n.° de acceso KC156676); Cry43Cb1 (n.° de acceso 3Cc1 (n.° de acces KC156696); similar a Cry43 (n.° de acceso BAD15305); Cry44Aa (n.° de acceso B acceso BAD22577); Cry46Aa (n.° de acceso BAC79010); Cry46Aa2 (n.° de acceso BAG6 acceso BAD35170); Cry47Aa (n.° de acceso AAY24695); Cry48Aa (n.° de acceso CAJ acceso CAJ86545); Cry48Aa3 (n.° de acceso CAJ86546); Cry48Ab (n.° de acceso CAJ acceso CAJ86549); Cry49Aa (n.° de acceso CAH56541); Cry49Aa2 (n.° de acceso CAJ acceso CAJ86543); Cry49Aa4 (n.° de acceso CAJ86544); Cry49Ab1 (n.° de acceso 0Aa1 (n.° de acces BAE86999); Cry50Ba1 (n.° de acceso GU446675); Cry50Ba2 (n.° de acceso 1Aa1 (n.° de acces ABI14444); Cry51Aa2 (n.° de acceso GU570697); Cry52Aa1 (n.° de acceso EF61 acceso FJ361760); Cry53Aa1 (n.° de acceso EF633476); Cry53Ab1 (n.° de acceso FJ36 acceso ACA52194); Cry54Aa2 (n.° de acceso GQ140349); Cry54Ba1 (n.° de acceso 5Aa1 (n.° de acces ABW88932); Cry54Ab1 (n.° de acceso JQ916908); Cry55Aa2 (n.° de acceso 6Aa1 (n.° de acces ACU57499); Cry56Aa2 (n.° de acceso GQ483512); Cry56Aa3 (n.° de acceso 7Aa1 (n.° de acces ANC87261); Cry58Aa1 (n.° de acceso ANC87260); Cry59Ba1 (n.° de acceso 9Aa1 (n.° de acces ACR43758); Cry60Aa1 (n.° de acceso ACU24782); Cry60Aa2 (n.° de acceso 0Aa3 (n.° de acces EEM99278); Cry60Ba1 (n.° de acceso GU810818); Cry60Ba2 (n.° de acceso 0Ba3 (n.° de acces EEM99279); Cry61Aa1 (n.° de acceso HM035087); Cry61Aa2 (n.° de acceso 1Aa3 (n.° de acces EEM19308); Cry62Aa1 (n.° de acceso HM054509); Cry63Aa1 (n.° de acceso BAI acceso BAJ05397); Cry65Aa1 (n.° de acceso HM461868); Cry65Aa2 (n.° de acceso ZP_04 acceso HM485581); Cry66Aa2 (n.° de acceso ZP_04099945); Cry67Aa1 (n.° de acceso HM acceso ZP_04148882); Cry68Aa1 (n.° de acceso HQ113114); Cry69Aa1 (n.° de acceso HQ acceso JQ821388); Cry69Ab1 (n.° de acceso JN209957); Cry70Aa1 (n.° de acceso JN6 acceso ADO51070); Cry70Bb1 (n.° de acceso EEL67276); Cry71Aa1 (n.° de acceso JX0
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acceso JX025569); Cyt1Aa (número de acceso a GenBank X03182); Cyt1Ab (número de acceso a GenBank X98793); Cyt1B (número de acceso a GenBank U37196); Cyt2A (número de acceso a GenBank Z14147); y Cyt2B (número de acceso a GenBank U52043).
Ejemplos de 6-endotoxinas también incluyen, aunque sin limitación, proteínas Cry1A de las patentes de Estados Unidos número 5.880.275, 7.858.849, 8.530.411, 8.575.433 y 8.686.233; una toxina DIG-3 o DlG-11 (eliminación N-terminal de variantes de hélice a 1 y/o hélice a 2 de proteínas cry tales como CrylA, Cry3A) de las patentes de Estados Unidos número 8.304.604, 8.304.605 y 8.476.226; Cry1 B de la solicitud de patente de Estados Unidos de número de serie 10/525.318; Cry1 C de la patente de Estados Unidos número 6.033.874; Cry1 F de las patentes de Estados Unidos número 5.188.960 y 6.218.188; quimeras Cry1A/F de las patentes de Estados Unidos número 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063);
una proteína Cry2 tal como proteína Cry2Ab de la patente de Estados Unidos número 7.064.249); una proteína Cry3A incluyendo, aunque sin limitación, una proteína insecticida híbrida manipulada (eHIP) creada fusionando combinaciones únicas de regiones variables y bloques conservados de al menos dos proteínas Cry diferentes (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0017914); una proteína Cry4; una proteína Cry5; una proteína Cry6; proteínas
Cry8 de las patentes de Estados Unidos número 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 y 7.462.760; una proteína Cry9 tal como miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F, incluyendo, aunque sin limitación, la proteína Cry9D de la patente de Estados Unidos número 8.802.933 y la proteína Cry9B de la patente de Estados Unidos número 8.802.934; una proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7145-7151; una proteína Cry22, una proteína Cry34Ab1 de las patentes de Estados Unidos número 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593; una proteína CryET33 y cryET34 de las patentes de Estados Unidos número 6.248.535, 6.326.351,6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 y 7.504.229; homólogos de CryET33 y CryET34 de la publicación de patente de Estados Unidos número 2006/0191034, 2012/0278954, y la publicación PCT número WO 2012/139004; una proteína Cry35Ab1 de las patentes de Estados Unidos número 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593; una proteína Cry46, una proteína
Cry 51, una proteína binaria Cry; una TIC901 o toxina relacionada; TIC807 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 del documento PCT US 2006/033867; toxinas TIC853 de la patente de Estados Unidos 8.513.494, AXMI-027, AXMI-036 y AXMI-038 de la patente de Estados Unidos número 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 de la patente de Estados Unidos número 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 y AXMI-021 del documento WO 2006/083891; AXMI-010 del documento WO 2005/038032; AXMI-003 del documento WO 2005/021585; AXMI-008 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0250311; AXMI-006 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0216186; AXMI-007 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0210965; AXMI-009 de la solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0210964; AXMI-014 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0197917; AXMI-004 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0197916; AXMI-028 y AXMI-029 del documento WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 y AXMI-004 del documento WO 2004/074462; AXMI-150 de la patente de Estados Unidos número 8.084.416; AXMI-205 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 y AXMI-064 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0263488; AXMI-R1 y proteínas relacionadas de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z y AXMI225z del documento WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 y AXMI231 del documento WO 2011/103247 y la patente de Estados Unidos número 8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 y AXMI-184 de la patente de Estados Unidos número 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 y AXMI-045 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0298211; AXMI-066 y AXMI-076 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 de la patente de Estados Unidos número 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0005543, AXMI270 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US20140223598, AXMI279 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US20140223599, proteínas cry tales como Cry1A y Cry3A que tienen sitios proteolíticos modificados de la patente de Estados Unidos número 8.319.019; una proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa y Cry1Ca de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0064710. Otras proteínas Cry son bien conocidas por los expertos en la materia (véase Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), en lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). La actividad insecticida de las proteínas Cry es bien conocida por los expertos en la materia (para una revisión, véase van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). El uso de proteínas Cry como rasgos de plantas transgénicas es bien conocido por los expertos en la materia y las plantas transgénicas para Cry que incluyen, aunque sin limitación, plantas que expresan Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c y CBI-Bt han recibido la aprobación reglamentaria (véase, Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 y el CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. en cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). También puede expresarse más de una proteína plaguicida bien conocida por los expertos en la materia en plantas, tales como Vip3Ab y Cry1Fa (documento US2012/0317682); Cry1BE y Cry1F (documento US2012/0311746); Cry1CA y Cry1AB (documento US2012/0311745); Cry1F y CryCa (documento US2012/0317681); Cry1 DA y Cry1BE (documento US2012/0331590); Cry1DA y Cry1Fa (documento US2012/0331589); Cry1AB y Cry1BE (documento US2012/0324606); Cry1Fa y Cry2Aa y Cry11 y Cry1E (documento US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa (documento US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab y Cry3Aa (documento US20130167268); Cry1Ab y Cry1F (documento US20140182018); y Cry3A y Cry1Ab o Vip3Aa (documento US20130116170). Las proteínas plaguicidas también incluyen lipasas insecticidas, que incluyen acil hidrolasas de lípido de la patente de Estados Unidos número 7.491.869, y colesterol oxidasas, tales como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). Las proteínas plaguicidas también incluyen toxinas VIP (proteínas insecticidas vegetativas) de las patentes de Estados Unidos número 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 y 8.237.020 y similares. Otras proteínas VIP son bien conocidas por los expertos en la materia (véase, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas de complejo de toxina (TC), obtenibles de organismos tales como Xenorhabdus, Photorhabdus y Paenibacillus (véanse las patentes de Estados Unidos número 7.491.698 y 8.084.418). Algunas proteínas TC tienen actividad insecticida "independiente" y otras proteínas TC potencian la actividad de las toxinas independientes producidas por el mismo organismo dado. La toxicidad de una proteína TC "independiente" (de Photorhabdus, Xenorhabdus o Paenibacillus, por ejemplo) puede potenciarse mediante uno o más "potenciadores" de proteínas TC obtenidos de un organismo fuente de un género diferente. Hay tres tipos principales de proteínas TC. Como se denomina en el este documento, las proteínas de la clase A ("proteína A") son toxinas independientes. Las proteínas de la clase B ("proteína B") y las proteínas de la clase C ("proteína C") potencian la toxicidad de las proteínas de la clase A. Ejemplos de proteínas de la clase A son TcbA, TcdA, XptA1 y XptA2. Ejemplos de proteínas de la clase B son TcaC, TcdB, XptB1Xb y XptC1Wi. Ejemplos de proteínas de la clase C son TccC, XptC1Xb y XptB1Wi. Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas de veneno de araña, serpiente y escorpión. Ejemplos de péptidos de veneno de araña incluyen, aunque sin limitación, péptidos de licotoxina-1 y mutantes de los mismos (patente de Estados Unidos número 8.334.366).
En algunos aspectos, los polipéptidos PIP-72 incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de ácido nucleico de longitud completa divulgadas en este documento y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, debido al uso de un sitio de inicio cadena abajo alternativo o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad plaguicida. El procesamiento puede producirse en el organismo en el que se expresa la proteína o en la plaga después de la ingesta de la proteína.
Por tanto, en este documento se describen secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes novedosas que confieren actividad plaguicida. También se describen las secuencias de aminoácidos de polipéptidos PIP-72. La proteína resultante de la traducción de estos genes de polipéptidos PIP-72 permite a las células controlar o eliminar las plagas que la ingieren.
Cepas bacterianas
Un aspecto se refiere a cepas bacterianas que expresan un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, la cepa bacteriana es una especie de Halomonas, Photorhabdus, Xenorhabdus, Burkholderia, Paludibacterium o Pseudomonas. En algunos aspectos, la cepa bacteriana es una cepa de Halomonas anticariensis, Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus bovienii, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia multivorans, Burkholderia thailandensis, Paludibacterium yongneupense, Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas entomophila, Pseudomonas chlororaphis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas congelans; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas protegens, Pseudomonas ficuserectae; Pseudomonas mosselii o Pseudomonas brassicacearum. En algunos aspectos, la cepa bacteriana es un cultivo biológicamente puro de Pseudomonas chlororaphis cepa SS143D5, depositado el 7 de febrero de 2013 con el n.° de acceso NRRL B-50810 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 (nrrl.ncaur.usda.gov, al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). El depósito se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimiento de Patente. Estos depósitos se realizaron simplemente como conveniencia para los expertos en la materia y no son una admisión de que se requiera un depósito según 35 U.S.C. §112. El acceso a este depósito estará disponible durante la tramitación de la solicitud para el Comisionado de Patentes y Marcas y las personas que el Comisionado determine autorizadas para ello tras petición. Tras la concesión de cualquier reivindicación de la solicitud, el solicitante o solicitantes pondrán a disposición del público, conforme a 37 C.F.R. § 1.808, la muestra o muestras del depósito del Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604. Este depósito se mantendrá en el lugar de depósito del NRRL, que es un lugar de depósito público, durante un periodo de 30 años o 5 años después de la petición más reciente o durante la vigencia aplicable de la patente, lo que dure más, y se remplazará si deja de ser viable durante ese periodo. Los depósitos estarán disponibles al público de manera irrevocable y sin restricción o condición tras la expedición de una patente. Además, el solicitante o solicitantes han satisfecho todos los requisitos de 37 C.F.R. §§1.801 - 1.809, incluyendo proporcionar una indicación de la viabilidad de la muestra tras el depósito. El solicitante o solicitantes no tienen autoridad para dispensar el cumplimiento de ninguna restricción impuesta por la ley sobre la transferencia de material biológico o su transporte en comercio. El solicitante o solicitantes no dispensan el cumplimiento de ninguna infracción de sus derechos garantizados según esta patente. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad del depósito no constituye una licencia para llevar a la práctica la presente invención derogando los derechos de patente garantizados por la acción gubernamental.
Moléculas de ácido nucleico, y variantes y fragmentos de las mismas
Un aspecto se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos PIP-72 o partes biológicamente activas de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifiquen proteínas con regiones de homología de secuencia. Como se usa en este documento, la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere a moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc, ADN genómico, ADN plastídico, ADN mitocondrial) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
Una molécula de ácido nucleico (o ADN) "aislada" se usa en este documento para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que no es más larga en su entorno natural, por ejemplo, in vitro. Una molécula de ácido nucleico (o ADN) "recombinante" se usa en este documento para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que está en una célula hospedadora bacteriana o vegetal recombinante. En algunos aspectos, un ácido nucleico aislado o recombinante está libre de secuencias (preferiblemente secuencias codificantes de proteína) que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Para los fines de la divulgación, "aisladas" o "recombinante" cuando se usan para hacer referencia a moléculas de ácido nucleico, excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido PIP-72 puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de ácido nucleico que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PIP-72 tiene uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico en comparación con la secuencia de ácido nucleico natural o genómica. En algunos aspectos, el cambio en la secuencia natural o genómica de ácido nucleico incluye, aunque sin limitación: cambios en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético; cambios en la secuencia de ácido nucleico debido a la sustitución, inserción, eliminación y/o adición de aminoácidos en comparación con la secuencia natural o genómica; la eliminación de uno o más intrones; la eliminación de unas o más regiones reguladoras cadena arriba o cadena abajo; y la eliminación de la región no traducida 5' y/o 3' asociada con la secuencia de ácido nucleico genómica. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 es una secuencia no genómica.
Se contempla una diversidad de polinucleótidos que codifican un polipéptido PIP-72 o proteínas relacionadas. Dichos polinucleótidos son útiles para la producción de polipéptidos PIP-72 en células hospedadoras cuando están unidos de forma funcional a secuencias adecuadas promotoras, de terminación de la transcripción y/o de poliadenilación. Dichos polinucleótidos también son útiles como sondas para aislar polinucleótidos homólogos o sustancialmente homólogos que codifiquen polipéptidos PIP-72 o proteínas relacionadas.
Fuentes de polinucleótidos que codifican polipéptidos PIP-72 o proteínas relacionadas incluyen, aunque sin limitación, una cepa de Halomonas anticariensis, Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus bovienii, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia multivorans, Burkholderia thailandensis, Paludibacterium yongneupense, Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas entomophila, Pseudomonas chlororaphis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas congelans; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas protegens, Pseudomonas ficuserectae; Pseudomonas mosselii o Pseudomonas brassicacearum. Fuentes de polinucleótidos que codifican polipéptidos PIP-72 o proteínas relacionadas incluyen, aunque sin limitación: una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Aa de SEQ ID No : 1 que codifica el polipéptido PIP-72Aa de SEQ ID NO: 2; una cepa de Pseudomonas rhodesiae que contiene el polinucleótido PIP-72Ba de SEQ ID NO: 3 que codifica el polipéptido PIP-72Ba de SEQ ID NO: 4; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Ca de SEQ ID NO: 5 que codifica el polipéptido PIP-72Ca de SEQ ID NO: 6; una cepa de Pseudomonas mandelii que contiene el polinucleótido PIP-72Cb de Se Q ID NO: 7 que codifica el polipéptido PIP-72Cb de SEQ ID NO: 8; una cepa de Pseudomonas congelans que contiene el polinucleótido PIP-72Da de s Eq ID NO: 9 que codifica el polipéptido PIP-72Da de SEQ ID NO: 10; una cepa de Pseudomonas mandelii que contiene el polinucleótido PIP-72Db de SEQ ID NO: 11 que codifica el polipéptido PIP-72Db de SEQ ID NO: 12; una cepa de Pseudomonas ficuserectae que contiene el polinucleótido PIP-72Dc de SEQ ID NO: 13 que codifica el polipéptido PIP-72Dc de SEQ ID NO: 14; una cepa de Pseudomonas mosselii que contiene el polinucleótido PIP-72Fa de Se Q ID NO: 17 que codifica el polipéptido PIP-72Fa de SEQ ID NO: 18; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Ff de SEQ ID NO: 27 que codifica el polipéptido PIP-72Ff de SEQ ID NO: 28; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gb de s Eq ID NO: 31 que codifica el polipéptido PIP-72Gb de SEQ ID NO: 32; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Ab de SEQ ID NO: 949 que codifica el polipéptido PIP-72Ab de SEQ ID n O: 927; una cepa de Pseudomonas brassicacearum que contiene el polinucleótido PIP-72Bb de SEQ ID NO: 950 que codifica el polipéptido PIP-72Ab de SEQ ID NO: 928; una cepa de Pseudomonas entomophila que contiene el polinucleótido PIP-72Fh de SEQ ID NO: 954 que codifica el polipéptido PIP-72AFh de SEQ ID NO: 932; una cepa de Pseudomonas entomophila que contiene el polinucleótido PIP-72Fh de SEQ ID NO: 955 que codifica el polipéptido PIP-72AFh de SEQ ID NO: 933; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Fj de SEQ ID NO: 956 que codifica el polipéptido PIP-72Fj de SEQ ID NO: 934; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Fk de SEQ ID NO: 957 que codifica el polipéptido PIP-72Fk de SEQ ID NO: 935; una cepa de Burkholderia multivorans que contiene el polinucleótido PIP-72Fl de SEQ ID NO: 958 que codifica el polipéptido PIP-72Fl de SEQ ID NO: 936; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gg de SEQ ID NO: 961 que codifica el polipéptido PIP-72Gg de SEQ ID NO: 939; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gh de SEQ ID NO: 962 que codifica el polipéptido PIP-72Gh de SEQ ID NO: 940; una cepa de Pseudomonas mosselii que contiene el polinucleótido PIP-72Gi de s Eq ID NO: 963 que codifica el polipéptido PIP-72Gi de SEQ ID NO: 941; una cepa de Pseudomonas protegens que contiene el polinucleótido PIP-72Gk de SEQ ID NO: 965 que codifica el polipéptido PIP-72Gk de SEQ ID NO: 943; una cepa de Pseudomonas plecoglossicida que contiene el polinucleótido PIP-72Gl de SEQ ID NO: 966 que codifica el polipéptido PIP-72Gl de s Eq ID NO: 944; y una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gn de SEQ ID NO: 968 que codifica el polipéptido PIP-72Gn de SEQ ID NO: 946. Estas secuencias polinucleotídicas se aislaron de un hospedador Halomonas, Photorhabdus, Xenorhabdus, Burkholderia, Paludibacterium o Pseudomonas y, por tanto, son adecuadas para la expresión del polipéptido PIP-72 codificado en otros hospedadores bacterianos. Por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968 pueden usarse para expresar polipéptidos PIP-72 en hospedadores bacterianos que incluyen, aunque sin limitación células hospedadoras bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas y Rhizobium. Los polinucleótidos también son útiles como sondas para aislar polinucleótidos homólogos o sustancialmente homólogos que codifiquen polipéptidos PIP-72 o proteínas relacionadas. Dichas sondas pueden usarse para identificar polinucleótidos homólogos o sustancialmente homólogos derivados de Halomonas, Photorhabdus, Xenorhabdus, Burkholderia, Paludibacterium, Pseudomonas u otras bacterias relacionadas.
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido PIP-72 también pueden sintetizarse de novo a partir de una secuencia polipeptídica PIP-72. La secuencia del gen polinucleotídico puede deducirse de una secuencia polipeptídica PIP-72 a través del uso del código genético. Pueden usarse programas informáticos tales como "BackTranslate" (GCG™ Package, Acclerys, Inc. San Diego, Calif.) para convertir una secuencia peptídica en la correspondiente secuencia de nucleótidos que codifica el péptido. Ejemplos de secuencias polipeptídicas PIP-72 que pueden usarse para obtener las correspondientes secuencias de nucleótidos incluyen, aunque sin limitación, el polipéptido PIP-72 de secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946. Además, las secuencias polinucleotídicas PIP-72 sintéticas de la divulgación pueden diseñarse de manera que se expresarán en plantas. La patente de Estados Unidos número 5.500.365 describe un método para sintetizar genes de plantas para mejorar el nivel de expresión de la proteína codificada por el gen sintetizado. Este método se refiere a la modificación de las secuencias génicas estructurales del transgén exógeno, para provocar que se transcriban, procesen, traduzcan y expresen de forma más eficaz por la planta. Las características de los genes que se expresan bien en plantas incluyen la eliminación de secuencias que pueden provocar empalme indeseado de intrones o poliadenilación en la región codificante de un transcrito génico, reteniendo al mismo tiempo sustancialmente la secuencia de aminoácidos de la parte tóxica de la proteína insecticida. Un método similar para obtener expresión potenciada de transgenes en plantas monocotiledóneas se divulga en la patente de Estados Unidos número 5.689.052.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 es un polinucleótido que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968, y variantes, fragmentos y complementos de las mismas. "Complemento" se usa en este documento para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico que es suficientemente complementaria a una secuencia de ácido nucleico dada, de modo que pueda hibridar con la secuencia de ácido nucleico dada para formar de ese modo una estructura bicatenaria estable. "Variantes de secuencia polinucleotídica" se usa en este documento para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico que, excepto por la degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PIP-72 es una secuencia de ácido nucleico no genómica. Como se usa en este documento, una "secuencia de ácido nucleico no genómica" o "molécula de ácido nucleico no genómica" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico en comparación con una secuencia de ácido nucleico natural o genómica. En algunos aspectos, el cambio con respecto a una molécula de ácido nucleico natural o genómica incluye, aunque sin limitación: cambios en la secuencia de ácido nucleico debidos a la degeneración del código genético; optimización de codones de la secuencia de ácido nucleico para su expresión en plantas; cambios en la secuencia de ácido nucleico para introducir al menos una sustitución, inserción, eliminación y/o adición de aminoácido en comparación con la secuencia natural o genómica; eliminación de uno o más intrones asociados con la secuencia de ácido nucleico genómica; inserción de uno o más intrones heterólogos; eliminación de una o más regiones reguladoras cadena arriba o cadena abajo asociadas con la secuencia de ácido nucleico genómica; inserción de una o más regiones reguladoras cadena arriba o cadena abajo heterólogas; eliminación de la región no traducida 5' y/o 3' asociada con la secuencia de ácido nucleico genómica; inserción de una región no traducida 5' y/o 3' heteróloga; y modificación de un sitio de poliadenilación. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica es un ADNc. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica es una secuencia de ácido nucleico sintética. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica no es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 927, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 928, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 932, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 933, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 934, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 935, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 936, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 939, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 940, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 941, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 943, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 944, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 945, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 946, en la que el polipéptido tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946, y en la que el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 2 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 4 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 6 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 8 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 10 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 12 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 14 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 18 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 28 y el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 32, y en la que el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 927, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 927, y en la que el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 928, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 928, y en la que el polipéptido P iP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 932, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 932, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 933, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 933, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 934, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 934, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 935, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 935, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 936, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 936, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 939, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 939, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 940, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 940, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 941, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 941, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 943, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 943, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 944, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 944, y en la que el polipéptido PlP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PlP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 945, en la que el polipéptido PIP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 945, y en la que el polipéptido P iP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 946, en la que el polipéptido PlP-72 tiene al menos un cambio aminoacídico en comparación con SEQ ID NO: 946, y en la que el polipéptido PIP-72 tiene actividad plaguicida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 4.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 6.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 8.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 10.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 12.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 14.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 18.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 28.
En algunos aspectos, la molécula de acido nucleico no genomica codifica un polipeptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 32.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 927 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 927.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 928 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 928.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 932 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 932.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 933 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 933.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 934 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 934.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 935 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 935.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 936 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 936.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 939 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 939.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 940 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 940.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 941 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 941.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 943 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 943.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 944 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 944.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 945 que tiene 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 945.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 946 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 946.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 846 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas, en las posiciones designadas por Xaa, en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 847 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas, en las posiciones designadas por Xaa, en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 848 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas, en las posiciones designadas por Xaa, en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 849 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas, en las posiciones designadas por Xaa, en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 846, en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 3 es Ile o Trp; Xaa en la posición 4 es Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 5 es Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile o Tyr; Xaa en la posición 6 es Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp o Tyr; Xaa en la posición 7 es Asn, Ala o Val; Xaa en la posición 8 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 9 es Ser, Ala, Cys, Gly o
Thr; Xaa en la posición 10 es Ser, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr o Trp; Xaa en la posición
11 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 12 es Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 13 es Ile, Asn, Gln o Val; Xaa en la posición 14 es Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys o Gln; Xaa en la posición 15 es Val, Ala, Cys, Ile, Met o Arg; Xaa en la posición 17 es Ile, Glu o Val; Xaa en la posición 18 es Asn o Ser; Xaa en la posición 19 es His, Ala, Glu, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser o Tyr; Xaa en la posición 20 es Trp, Ala o Thr; Xaa en la posición 22 es Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 23 es Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 24 es Gly, Asp o Phe; Xaa en la posición 25 es Asp, Ala, Glu, Phe, Asn o Gln; Xaa en la posición 26 es Thr,
Glu o Pro; Xaa en la posición 27 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Arg o Thr; Xaa en la posición 28 es Phe, Pro, Trp o Tyr; Xaa en la posición 29 es Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp o Tyr; Xaa en la posición 30 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 31 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr;
Xaa en la posición 33 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 34 es Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Tyr; Xaa en la posición 35 es Lys, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 36 es Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 37 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 38 es Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 39 es Trp o Phe; Xaa en la posición 40 es Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 42 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 44 es Ser, Ala, Asp, Glu, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 45 es Arg, Lys o Ser; Xaa en la posición 46 es Gly, Ala o Gln; Xaa en la posición 47 es Phe, Cys, Val o Tyr; Xaa en la posición 48 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 49 es Leu, Cys, Phe, Met, Arg o Tyr; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Thr o Val; Xaa en la posición 51 es Leu, Ala, Cys, Met o Val; Xaa en la posición 52 es Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Trp o Tyr; Xaa en la posición 53 es Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His,
Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 54 es Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser o Trp; Xaa en la posición 56 es Ala, Gly, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser o Thr; Xaa en la posición 57 es Gln, Glu, Leu, Met, Ser o Thr; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp o Tyr; Xaa en la posición 60 es Tyr,
Glu o Phe; Xaa en la posición 63 es Gln, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 64 es Ala, Phe, Gly, His, Arg, Ser o Tyr; Xaa en la posición 65 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Thr o Val; Xaa en la posición 66 es Ser, Ala o Gly; Xaa en la posición 67 es Lys, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 68 es Ile, Asp, Leu o Val; Xaa en la posición 69 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 70 es Val, Cys o Ile; Xaa en la posición 71 es Asp, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 72 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Trp; Xaa en la posición 73 es Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 74 es Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 75 es Val, Cys, Ile o Leu; Xaa en la posición 76 es Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 77 es Asp, Tyr; Xaa en la posición 78 es Gln, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 79 es Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp o Tyr; Xaa en la posición 80 es Arg, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 81 es Leu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 82 es Ile, Ala, Leu, Met, Arg o Val; Xaa en la posición 83 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 84 es Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 85 es Leu, Cys, Gly o Val; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Ile, Thr o Val, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 847, en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Lys o Ala; Xaa en la posición 3 es Ile o Leu; Xaa en la posición 4 es Thr o Ser; Xaa en la posición 5 es Val o Ile; Xaa en la posición 6 es Thr o Lys; Xaa en la posición 8 es Asn, Lys, Gly o Ser; Xaa en la posición 9 es Ser o Ala; Xaa en la posición 11 es Asn, Lys, His o Thr; Xaa en la posición 12 es Pro, Thr, Lys o Ser; Xaa en la posición 13 es Ile o Val; Xaa en la posición 14 es Glu o Asp; Xaa en la posición 15 es Val, Ala o Ile; Xaa en la posición 16 es Ala o Ser; Xaa en la posición 17 es Ile o Val; Xaa en la posición 18 es Asn o Ser; Xaa en la posición 19 es His, Lys, Arg, Gln o Ala; Xaa en la posición 21 es Gly o Arg; Xaa en la posición 22 es Ser, Lys, Asn, Asp o Thr; Xaa en la posición 25 es Asp o Asn; Xaa en la posición 26 es Thr o Asp; Xaa en la posición 27 es Ser, Thr, Asn o Lys; Xaa en la posición 28 es Phe, Tyr o Pro; Xaa en la posición 29 es Phe o Tyr; Xaa en la posición 30 es Ser, Gly o Lys; Xaa en la posición 31 es Val, Ile o Met; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala o Asp; Xaa en la posición 33 es Asn, Ser, Gln o Pro; Xaa en la posición 35 es Lys, Glu o Ser; Xaa en la posición 36 es Gln, Asn o Ser; Xaa en la posición 37 es Glu o Asp; Xaa en la posición 38 es Thr o Ser; Xaa en la posición 42 es Ser o Asn; Xaa en la posición 44 es Ser, Asp, Ala o Leu; Xaa en la posición 47 es Phe o Tyr; Xaa en la posición 48 es Leu o Met; Xaa en la posición 49 es Leu o Met; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala o Tyr; Xaa en la posición 51 es Leu o Val; Xaa en la posición 52 es Lys o Gln; Xaa en la posición 53 es Lys, Arg, Met o Leu; Xaa en la posición 54 es Asn, Lys o Gly; Xaa en la posición 55 es Gly o Ser; Xaa en la posición 56 es Ala, Thr, Gln o Ser; Xaa en la posición 57 es Gln, Val o Ala; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Lys, Tyr o Thr; Xaa en la posición 59 es Pro o Thr; Xaa en la posición 62 es Val o Ile; Xaa en la posición 63 es Gln, Ser o Leu; Xaa en la posición 64 es Ala, Gln o Ser; Xaa en la posición 65 es Ser o Thr; Xaa en la posición 67 es Lys, Gln, Arg o Asn; Xaa en la posición 69 es Glu, Lys o Val; Xaa en la posición 70 es Val o Ile; Xaa en la posición 71 es Asp, Glu o Tyr; Xaa en la posición 72 es Asn, His, Ser o Asp; Xaa en la posición 73 es Asn, Ser o Asp; Xaa en la posición 74 es Ala, Thr, Met, Ile o Lys; Xaa en la posición 76 es Lys o Thr; Xaa en la posición 78 es Gln, His o Ser; Xaa en la posición 80 es Arg, Glu o Gln; Xaa en la posición 81 es Leu, Pro, Ala o Thr; Xaa en la posición 82 es Ile o Leu; Xaa en la posición 83 es Glu, His, Asn, Gln o Leu; Xaa en la posición 85 es Leu, Val o Ala; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Tyr o Asn, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72 y/o se inserta un aminoácido entre el residuo 24 y 25 con respecto a SEQ ID NO: 847.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 848, en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Lys, Ala o Arg; Xaa en la posición 3 es Ile, Leu o Val; Xaa en la posición 4 es Thr o Ser; Xaa en la posición 5 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 6 es Thr, Lys, Ser o Arg; Xaa en la posición 8 es Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr o Ala; Xaa en la posición 9 es Ser, Ala o Thr; Xaa en la posición 11 es Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, His o Ser; Xaa en la posición 12 es Pro, Thr, Lys, Ser o Arg; Xaa en la posición 13 es Ile, Val o Leu; Xaa en la posición 14 es Glu o Asp; Xaa en la posición 15 es Val, Ala, Ile o Leu; Xaa en la posición 16 es Ala o Ser; Xaa en la posición 17 es Ile, Val o Leu; Xaa en la posición 18 es Asn, Ser, Gln o Thr; Xaa en la posición 19 es His, Lys, Ala, Gln, Asn o Arg; Xaa en la posición 21 es Gly, Arg o Lys; Xaa en la posición 22 es Ser, Lys, Asn, Thr, Arg, Asp, Glu o Gln; Xaa en la posición 25 es Asp, Asn, Glu o Gln; Xaa en la posición 26 es Thr, Asp, Ser o Glu; Xaa en la posición 27 es Ser, Thr, Lys, Asn, Gln o Arg; Xaa en la posición 28 es Phe, Tyr, Pro o Trp; Xaa en la posición 29 es Phe, Tyr o T rp; Xaa en la posición 30 es Ser, Gly, Lys, Thr o Arg; Xaa en la posición 31 es Val, Ile, Met o Leu; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala, Asp o Glu; Xaa en la posición 33 es Asn, Ser, Gln, Pro o Thr; Xaa en la posición 35 es Lys, Glu, Ser, Arg o Thr; Xaa en la posición 36 es Gln, Ser, Asn o Thr; Xaa en la posición 37 es Glu o Asp; Xaa en la posición 38 es Thr o Ser; Xaa en la posición 42 es Ser, Asn, Thr o Gln; Xaa en la posición 44 es Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile o Val; Xaa en la posición 47 es Phe, Tyr o Trp; Xaa en la posición 48 es Leu, Met, Ile o Val; Xaa en la posición 49 es Leu, Met, Ile o Val; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala, Tyr o Thr; Xaa en la posición 51 es Leu, Val o Ile; Xaa en la posición 52 es Lys, Gln, Arg o Asn; Xaa en la posición 53 es Lys, Arg, Met, Leu, Ile o Val; Xaa en la posición 54 es Asn, Lys, Gly, Gln o Arg; Xaa en la posición 55 es Gly, Ser o Thr; Xaa en la posición 56 es Ala, Thr, Gln, Ser o Asn; Xaa en la posición 57 es Gln, Val, Ala, Asn, Leu o Ile; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Lys, Tyr o Thr; Xaa en la posición 59 es Pro, Thr o Ser; Xaa en la posición 62 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 63 es Gln, Ser, Leu, Asn, Thr, Ile o Val; Xaa en la posición 64 es Ala, Gln, Ser, Asn o Thr; Xaa en la posición 65 es Ser o Thr; Xaa en la posición 67 es Lys, Gln, Asn o Arg; Xaa en la posición 69 es Glu, Val, Asp, Lys, Arg, Ile o Leu; Xaa en la posición 70 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 71 es Asp, Glu, Tyr o Trp; Xaa en la posición 72 es Asn, His, Ser, Asp, Gln, Thr o Glu; Xaa en la posición 73 es Asn, Ser, Asp, Gln, Thr o Glu; Xaa en la posición 74 es Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val o Arg; Xaa en la posición 76 es Lys, Thr, Arg o Ser; Xaa en la posición 78 es Gln, His, Ser, Asn o Thr; Xaa en la posición 80 es Arg, Glu, Gln, Lys, Asp o Asn; Xaa en la posición 81 es Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala o Ser; Xaa en la posición 82 es Ile, Leu o Val; Xaa en la posición 83 es Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile o Val; Xaa en la posición 85 es Leu, Val o Ala; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Tyr, Asn o Thr, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72 y/o se inserta un aminoácido entre el residuo 24 y 25 con respecto a SEQ ID NO: 848.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 849, en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 3 es Ile, Leu, Val o Trp; Xaa en la posición 4 es Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 5 es Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu o Tyr; Xaa en la posición 6 es Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp o Tyr; Xaa en la posición 7 es Asn, Ala o Val; Xaa en la posición 8 es Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met o Val; Xaa en la posición 9 es Ser, Ala, Cys, Gly o Thr; Xaa en la posición 11 es Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Val o Tyr; Xaa en la posición 12 es Pro, Thr, Lys, Ser, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Asn, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 13 es Ile, Asn, Gln, Leu o Val; Xaa en la posición 14 es Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys, Asp o Gln; Xaa en la posición 15 es Val, Ala, Ile, Leu, Cys, Met o Arg; Xaa en la posición 16 es Ala o Ser; Xaa en la posición 17 es Ile, Glu, Leu o Val; Xaa en la posición 18 es Asn, Gln, Thr o Ser; Xaa en la posición 19 es His, Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Pro, Ser o Tyr; Xaa en la posición 20 es Trp, Ala o Thr; Xaa en la posición 21 es Gly, Arg o Lys; Xaa en la posición 22 es Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 23 es Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 24 es Gly, Asp o Phe; Xaa en la posición 25 es Asp, Ala, Glu, Phe, Asn o Gln; Xaa en la posición 26 es Thr, Glu, Asp, Ser o Pro; Xaa en la posición 27 es Ser, Thr, Lys, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn o Gln; Xaa en la posición 28 es Phe, Tyr, Pro o Trp; Xaa en la posición 29 es Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp o Tyr; Xaa en la posición 30 es Ser, Gly, Lys, Thr, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 31 es Val, Ile, Met o Leu; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 33 es Asn, Ser, Gln, Pro, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Val o Tyr; Xaa en la posición 34 es Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Tyr; Xaa en la posición 35 es Lys, Glu, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 36 es Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 37 es Glu, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 38 es Thr, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 39 es Trp o Phe; Xaa en la posición 40 es Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 42 es Ser, Asn, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Val, Trp, Tyr o Gln; Xaa en la posición 44 es Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile, Ala, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Tyr o Val; Xaa en la posición 45 es Arg, Lys o Ser; Xaa en la posición 46 es Gly, Ala o Gln; Xaa en la posición 47 es Phe, Tyr Cys, Val o Trp; Xaa en la posición 48 es Leu, Met, Ile, Cys, Phe, Met, Arg, Tyr o Val; Xaa en la posición 49 es Leu, Met, Ile o Val; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala, Tyr, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Val o Thr; Xaa en la posición 51 es Leu, Val, Ala, Cys, Met o Ile; Xaa en la posición 52 es Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Gln, Trp o Tyr; Xaa en la posición 53 es Lys, Arg, Met, Leu, Ile, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr o Val; Xaa en la posición 54 es Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser o Trp; Xaa en la posición 55 es Gly, Ser o Thr; Xaa en la posición 56 es Ala, Thr, Gln, Ser, Gly, Leu, Pro, Arg o Asn; Xaa en la posición 57 es Gln, Glu, Leu, Met, Ser, Val, Ala, Asn, Ile o Thr; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Lys, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp, Tyr o Thr; Xaa en la posición 59 es Pro, Thr o Ser; Xaa en la posición 60 es Tyr, Glu o Phe; Xaa en la posición 62 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 63 es Gln, Ser, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 64 es Ala, Gln, Asn, Phe, Gly, His, Arg, Ser o Tyr; Xaa en la posición 65 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Val o Thr; Xaa en la posición 66 es Ser, Ala o Gly; Xaa en la posición 67 es Lys, Gln, Asn o Arg; Xaa en la posición 68 es Ile, Asp, Leu o Val; Xaa en la posición 69 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 70 es Val, Ile, Cys o Leu; Xaa en la posición 71 es Asp, Glu, Tyr, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val o T rp; Xaa en la posición 72 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, His o Trp; Xaa en la posición 73 es Asn, Ser, Asp, Gln, Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Val, Tyr o Glu; Xaa en la posición 74 es Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Tyr o Arg; Xaa en la posición 75 es Val, Cys, Ile o Leu; Xaa en la posición 76 es Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 77 es Asp, Tyr; Xaa en la posición 78 es Gln, His, Ser, Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Val, Tyr o Thr; Xaa en la posición 79 es Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp o Tyr; Xaa en la posición 80 es Arg, Glu, Gln, Lys, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val, Tyr o Asn; Xaa en la posición 81 es Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His o Ser; Xaa en la posición 82 es Ile, Ala, Leu, Met, Arg y Val; Xaa en la posición 83 es Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Lys, Pro, Arg, Ser, Thr, Tyr o Val; Xaa en la posición 84 es Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 85 es Leu, Val, Cys, Gly o Ala; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Tyr, Asn, Ile, Val o Thr, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72 y/o se inserta un aminoácido entre el residuo 24 y 25 con respecto a SEQ ID NO: 849.
En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido PIP-72 que comprende un motivo de aminoácidos como se representa por las posiciones 37-51 de SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848 o SEQ ID NO: 849.
En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido PIP-72 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2
En algunos aspectos, moléculas de ácido nucleico ejemplares codifican un polipéptido PIP-72 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946,, así como sustituciones, eliminaciones, inserciones de aminoácidos y fragmentos de las mismas y combinaciones de las mismas.
En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido PIP-72 de la tabla 14, tabla 17, tabla 20, tabla 23, tabla 24, tabla 26, tabla 28 y/o tabla 29, combinaciones de las sustituciones aminoacídicas de las mismas, y eliminaciones y/o inserciones de las mismas.
También se describen en este documento moléculas de ácido nucleico que codifican productos de transcripción y/o traducción que posteriormente se empalman para producir finalmente polipéptidos PIP-72 funcionales. El empalme puede conseguirse in vitro o in vivo, y puede implicar empalme en cis o trans. El sustrato para empalme puede ser polinucleótidos (por ejemplo, transcritos de ARN) o polipéptidos. Un ejemplo de empalme en cis de un polinucleótido es cuando un intrón insertado en una secuencia codificante se retira y se empalman las dos regiones exónicas flanqueantes para generar una secuencia codificante del polipéptido PIP-72. Un ejemplo de empalme en trans sería cuando un polinucleótido está encriptado por separación de la secuencia codificante en dos o más fragmentos que pueden transcribirse por separado y después empalmarse para formar la secuencia codificante plaguicida de longitud completa. El uso de una secuencia potenciadora de empalme, que puede introducirse en una construcción, puede facilitar el empalme en cis o trans de polipéptidos (patentes de Estados Unidos número 6.365.377 y 6.531.316). Por tanto, en algunos aspectos, los polinucleótidos no codifican directamente un polipéptido PIP-72 de longitud completa, sino que en su lugar codifican un fragmento o fragmentos de un polipéptido PIP-72. Estos polinucleótidos pueden usarse para expresar un polipéptido PIP-72 funcional a través de un mecanismo que implica empalme, donde el empalme puede producirse a nivel del polinucleótido (por ejemplo, intrón/exón) y/o polipéptido (por ejemplo, inteína/exteína). Esto puede ser útil, por ejemplo, en el control de la expresión de la actividad plaguicida, ya que un polipéptido plaguicida funcional se expresará solamente si se expresan todos los fragmentos requeridos en un entorno que permita los procesos de empalme para generar el producto funcional. En otro ejemplo, la introducción de una o más secuencias de inserción en un polinucleótido puede facilitar la recombinación con un polinucleótido de baja homología; el uso de un intrón o inteína para la secuencia de inserción facilita la retirada de la secuencia intermedia, restableciendo de ese modo la función de la variante codificada.
Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos PIP-72 también están incluidas por los aspectos. "Fragmento", como se usa en este documento, se refiere a una parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72. Un fragmento de una secuencia de ácido nucleico puede codificar una parte biológicamente activa de un polipéptido PIP-72 o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR usando métodos divulgados a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 comprenden al menos aproximadamente 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o 260 nucleótidos contiguos o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de ácido nucleico de longitud completa que codifica un polipéptido PIP-72 divulgado en este documento, dependiendo del uso pretendido. "Nucleótidos contiguos" se usa en este documento para hacer referencia a residuos nucleotídicos que están inmediatamente adyacentes a otro. Los fragmentos de las secuencias de ácido nucleico de los aspectos codificarán fragmentos proteínicos que retienen la actividad biológica del polipéptido PIP-72 y, por tanto, retienen la actividad insecticida. "Retiene la actividad PIP-72" se usa en este documento para hacer referencia a un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de la actividad insecticida del polipéptido PIP-72Aa de longitud completa de SEQ ID NO: 2. En un aspecto, la actividad insecticida es actividad contra lepidópteros. En un aspecto, la actividad insecticida es contra una especie de coleópteros. En un aspecto, la actividad insecticida es contra una especie Diabrotica. En un aspecto, la actividad insecticida es contra una o más plagas de insectos del complejo de gusanos del maíz: gusano de la raíz del maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera; gusano alfilerillo, D. barben: doradilla o escarabajo moteado del pepino; Diabrotica undecimpunctata howardi, y el gusano de la raíz del maíz mexicano, D. virgifera zeae. En un aspecto, la actividad insecticida es contra el gusano de la raíz del maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera.
En algunos aspectos, un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 que codifica una parte biológicamente activa de una proteína codificará al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 u 85 aminoácidos contiguos o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido PIP-72 de longitud completa de los aspectos. En algunos aspectos, el fragmento es un truncamiento N-terminal y/o C-terminal de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos desde el extremo N y/o el extremo C con respecto a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 o variantes de las mismas, por ejemplo, por proteólisis, inserción de un codón de inicio, eliminación de los codones que codifican los aminoácidos eliminados con la inserción concomitante de un codón de parada o por inserción de un codón de parada en la secuencia codificante. En algunos aspectos, los fragmentos incluidos en este documento son el resultado de la retirada de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 o más aminoácidos N-terminales del extremo N con respecto a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 o variantes de las mismas, por ejemplo, por proteólisis o por inserción de un codón de inicio en la secuencia codificante. En algunos aspectos, los fragmentos incluidos en este documento son el resultado de la retirada de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminoácidos N-terminales con respecto a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 -SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 o variantes de las mismas, por ejemplo, por proteólisis o por inserción de un codón de parada en la secuencia codificante.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 está codificado por una secuencia de ácido nucleico suficientemente homóloga a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 o SEQ ID NO: 968. "Suficientemente homólogo" se usa en este documento para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor homología de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos en este documento usando parámetros convencionales. Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la homología correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de ácido nucleico, teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la colocación del marco de lectura y similares. En algunos aspectos, la homología de secuencia es frente a la secuencia de longitud completa del polinucleótido que codifica un polipéptido PIP-72 o frente a la secuencia de longitud completa de un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia en comparación con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946. En algunos aspectos, la identidad de secuencia es frente a la secuencia de longitud completa del polinucleótido que codifica un polipéptido PIP-72 o frente a la secuencia de longitud completa de un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, la identidad de secuencia se calcula usando el algoritmo ClustalW del módulo ALIGNx ® del conjunto de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto. En algunos aspectos, la identidad de secuencia es en la longitud completa del polipéptido, calculada usando el algoritmo ClustalW del módulo ALIGNX del conjunto de programas Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes)*100). En un aspecto, las dos secuencias son de la misma longitud. En otro aspecto, la comparación es en la totalidad de la secuencia de referencia (por ejemplo, en la totalidad de una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2). El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas a continuación, con o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, típicamente se cuentan las coincidencias exactas.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BlAs TX de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos de BLAST con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de ácido nucleico homólogas a moléculas de ácido nucleico plaguicidas de los aspectos. Pueden realizarse búsquedas de proteínas de BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a moléculas de proteína plaguicidas de los aspectos. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase, Altschul, et al., (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede realizarse manualmente por inspección.
Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins, et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o ADN y, por tanto, puede proporcionar datos acerca de la conservación de secuencia de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de programa informático de análisis de ADN/aminoácidos disponibles en el mercado, tales como el módulo ALIGNX® del conjunto de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.). Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, puede evaluarse el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa informático útil para el análisis de alineaciones de ClustalW es GENEDOC™. GENEDOc ™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete GCG Wisconsin Genetics Software, versión 10 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, Calif., EE. UU.). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de ponderación de residuos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.
Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, usado en el programa informático GAP versión 10 para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguiente parámetros por defecto: % de identidad y % de similitud para una secuencia de ácido nucleico usando GAP un peso de hueco de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmpii; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando GAP un peso de hueco de 8 y un peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También pueden usarse programas equivalentes. "Programa equivalente" se usa en este documento para hacer referencia a cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias de residuos nucleotídicos idénticos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP versión 10.
Los aspectos también abarcan moléculas de ácido nucleico que codifican variantes del polipéptido PIP-72. Las "variantes" de las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido PIP-72 incluyen aquellas secuencias que codifican los polipéptidos PIP-72 divulgados en este documento, pero que difieren de forma conservativa a causa de la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas como se analiza anteriormente. Pueden identificarse variantes alélicas de origen natural con el uso de técnicas bien conocidas de biología molecular, tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se resumen a continuación. Las secuencias de ácido nucleico variantes también incluyen secuencias de ácido nucleico derivadas de forma sintética que se han generado, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, pero que aún codifican los polipéptidos PIP-72 divulgados como se analiza a continuación.
En este documento se describen polinucleótidos aislados o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos PIP-72 divulgados en este documento. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que, debido a la degeneración del código genético, existe una multitud de secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos PIP-72 de la presente divulgación. La tabla 1 es una tabla de codones que proporciona los codones sinónimos para cada aminoácido. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todos el aminoácido arginina. Por tanto, en cada posición en los ácidos nucleicos de la divulgación, donde se especifica una arginina por un codón, el codón puede alterarse en cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente sin alterar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN corresponde a T a una secuencia de ADN.
Tabla 1
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Los expertos en la materia apreciarán también que pueden introducirse cambios por mutación de las secuencias de ácido nucleico, dando lugar de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos PIP-72 codificados, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Por tanto, pueden crearse moléculas de ácido nucleico variantes introduciendo una o más sustituciones, adicionales y/o eliminaciones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de ácido nucleico divulgada en este documento, de modo que se introduzca una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones por técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Dichas secuencias de ácido nucleico variantes también están incluidas por la presente divulgación.
Como alternativa, pueden generarse secuencias de ácido nucleico variantes introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse por su capacidad de conferir actividad plaguicida para identificar mutantes que retengan la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse usando técnicas de ensayo convencionales.
Los polinucleótidos de la divulgación y fragmentos de los mismos opcionalmente se usan como sustratos para una diversidad de reacciones de recombinación y recombinación repetitiva, además de métodos de clonación convencionales como se expone en, por ejemplo, Ausubel, Berger y Sambrook, es decir, para producir homólogos de polipéptidos plaguicidas adicionales y fragmentos de los mismos con propiedades deseadas. Se conoce una diversidad de dichas reacciones, incluyendo las desarrolladas por los autores de la invención y sus colaboradores. Los métodos para producir una variante de cualquier ácido nucleico enumerado en este documento, que comprenden combinar de forma repetitiva dicho polinucleótido con un segundo (o más) polinucleótido, formando de ese modo una colección de polinucleótidos variantes también son aspectos de la divulgación, así como las colecciones producidas, las células que comprenden las colecciones y cualquier polinucleótido recombinante producido por dichos métodos. Adicionalmente, dichos métodos comprenden opcionalmente seleccionar un polinucleótido variante de dichas colecciones basándose en la actividad plaguicida, como cuando dicha recombinación repetitiva se hace in vitro o in vivo.
Está disponible una diversidad de protocolos que generan diversidad, incluyendo protocolos de recombinación repetitiva de ácidos nucleicos y se describen completamente en la técnica. Los procedimientos pueden usarse por separado y/o en combinación para producir una o más variantes de un ácido nucleico o conjunto de ácidos nucleicos, así como variantes de proteínas codificadas. De manera individual o colectiva, estos procedimientos proporcionan maneras robustas, ampliamente aplicables de generar ácidos nucleicos y conjuntos de ácidos nucleicos diversificados (incluyendo, por ejemplo, colecciones de ácidos nucleicos) útiles, por ejemplo, para la manipulación o el rápido desarrollo de ácidos nucleicos, proteínas, rutas, células y/u organismos con características nuevas y/o mejoradas.
Aunque se hacen distinciones y clasificaciones en el transcurso del análisis siguiente por motivos de claridad, se apreciará que las técnicas a menudo no son mutuamente excluyentes. De hecho, los diversos métodos pueden usarse individualmente o en combinación, en paralelo o en serie, para acceder a diversas variantes de secuencia.
El resultado de cualquiera de los procedimientos que generan diversidad descritos en este documento puede ser la generación de uno o más ácidos nucleicos, que pueden seleccionarse o cribarse para ácidos nucleicos con o que confieren propiedades deseables o que codifican proteínas con o que confieren propiedades deseables. Después de la diversificación mediante uno o más de los métodos de este documento o disponibles de otro modo para los expertos, cualquier ácido nucleico que se produzca puede seleccionarse para una actividad o propiedad deseada, por ejemplo, actividad plaguicida o, dicha actividad a un pH deseado, etc. Esto puede incluir identificar cualquier actividad que pueda detectarse, por ejemplo, en un formato automatizado o automatizable, mediante cualquiera de los ensayos de la técnica, véase, por ejemplo, el análisis sobre el cribado de actividad insecticida, infra. Puede evaluarse una diversidad de propiedades relacionadas (o incluso no relacionadas), en seria o en paralelo, a juicio del facultativo.
Se encuentran descripciones de una diversidad de procedimientos que generan diversidad para generar secuencias de ácido nucleico modificadas, por ejemplo, las que codifican polipéptidos que tienen actividad plaguicida o fragmentos de los mismos, en las siguientes publicaciones y las referencias citadas en las mismas: Soong, et al., (2000) Nat Genet 25(4):436-439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1-4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893-896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793-797; Minshull y Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284-290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259-264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; Crameri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436-438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4504-4509; Patten, et al., (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724-733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100-103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315-319; Gates, et al., (1996) J Mol Biol 255:373-386; Stemmer, (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" en: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nueva York. pág. 447-457; Crameri y Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer, et al., (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391 y Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747-10751.
Métodos de mutación para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157-178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369-374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423-462; Botstein y Shortle, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, (1986) Biochem J 237:1-7 y Kunkel, (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein y Lilley, eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis usando moldes que contienen uracilo (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367-382 y Bass, et al., (1988) Science 242:240-245); mutagénesis dirigida por oligonucleótido (Zoller y Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468-500; Zoller y Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329-350 (1987); Zoller y Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-6500), mutagénesis de ADN modificado por fosforotioato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8749-8764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8765-8787 (1985); Nakamaye y Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9679-9698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791-802 y Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803-814); mutagénesis usando ADN bicatenario con huecos (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9441-9456; Kramer y Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350-367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7207 y Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6987-6999).
Métodos adecuados adicionales incluyen reparación de emparejamientos incorrectos puntuales (Kramer, et al., (1984) Cell 38:879- 887), mutagénesis usando cepas hospedadoras con alteración en la reparación (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4431- 4443 y Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382- 403), mutagénesis por eliminación (Eghtedarzadeh y Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), selección por restricción y purificación por restricción (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415- 423), mutagénesis por síntesis génica total (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1299-1301; Sakamar y Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6361-6372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315-323 y Grundstrom, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3305- 3316), reparación de roturas bicatenarias (Mandecki, (1986) PNa S USA, 83:7177- 7181 y Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450-455). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores en Methods Enzymol volumen 154, que también describe controles útiles para la resolución de problemas con diversos métodos de mutagénesis.
Pueden encontrarse detalles adicionales con respecto a diversos métodos que generan diversidad en las siguientes patentes de Estados Unidos, publicaciones y solicitudes PCT y publicaciones EPO: patente de Estados Unidos número 5.723.323, patente de Estados Unidos número 5.763.192, patente de Estados Unidos número 5.814.476, patente de Estados Unidos número 5.817.483, patente de Estados Unidos número 5.824.514, patente de Estados Unidos número 5.976.862, patente de Estados Unidos número 5.605.793, patente de Estados Unidos número 5.811.238, patente de Estados Unidos número 5.830.721, patente de Estados Unidos número 5.834.252, patente de Estados Unidos número 5.837.458, documentos WO 1995/22625, WO 1996/33207, WO 1997/20078, WO 1997/35966, WO 1999/41402, WO 1999/41383, WO 1999/41369, WO 1999/41368, EP 752008, EP 0932670, WO 1999/23107, WO 1999/21979, WO 1998/31837, WO 1998/27230, WO 1998/27230, WO 2000/00632, WO 2000/09679, WO 1998/42832, WO 1999/29902, WO 1998/41653, WO 1998/41622, WO 1998/42727, WO 2000/18906, WO 2000/04190, WO 2000/42561, WO 2000/42559, WO 2000/42560, WO 2001/23401 y PCT/US01/06775.
Las secuencias de nucleótidos de los aspectos también pueden usarse para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras bacterias, particularmente una especie de Pseudomonas y más particularmente una cepa de Pseudomonas putida, Pseudomonas fulva o Pseudomonas chlororaphis. De esta manera, pueden usarse métodos tales como PCR, hibridación y similares para identificar dichas secuencias basándose en su homología de secuencia con las secuencias expuestas en este documento. Las secuencias que se seleccionan basándose en su identidad de secuencia con las secuencias completas expuestas en este documento o con fragmentos de las mismas están incluidas por los aspectos. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogos de las secuencias divulgadas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivados de un gen ancestral común y que se encentran en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias proteínicas codificadas comparten identidad sustancial como se define en otra parte en este documento. Las funciones de los ortólogos a menudo están altamente conservadas entre especies.
En una estrategia de PCR, pueden diseñarse cebadores oligonucleotídicos para su uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir del ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación por PCR en general son conocidos en la técnica y se divulgan en Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York), a partir de ahora en este documento "Sambrook". Véase también, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, aunque sin limitación, métodos que usan cebadores emparejados, cebadores internos, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente emparejados incorrectamente y similares.
Para identificar posibles polipéptidos PIP-72 de colecciones bacterianas, los lisados de células bacterianas pueden cribarse con anticuerpos generados contra un polipéptido PIP-72 usando inmunoelectrotransferencia y/o métodos de ELISA. Este tipo de ensayos puede realizarse de una manera de alto rendimiento. Las muestras positivas pueden analizarse adicionalmente mediante diversas técnicas tales como purificación e identificación de proteína basadas en anticuerpos. Los métodos de generación de anticuerpos son bien conocidos en la técnica como se analiza infra.
Como alternativa, puede usarse el método de identificación de proteínas basada en espectrometría de masas para identificar homólogos de polipéptidos PIP-72 usando protocolos de la bibliografía (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1­ 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc.). Específicamente, se usa el método de identificación de proteínas basado en LC-MS/MS para asociar los datos de MS de un lisado celular dado o muestras enriquecidas en el peso molecular deseado (escindidas de un gel de SDS-PAGE de las bandas del peso molecular relevante para PIP-72) con información de secuencia de PIP-72 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2)) y sus homólogos. Cualquier coincidencia en las secuencias peptídicas indica la posibilidad de tener los homólogos en las muestras. Pueden usarse técnicas adicionales (purificación de proteínas y biología molecular) para aislar la proteína e identificar las secuencias de los homólogos.
En métodos de hibridación, todo o parte de la secuencia de ácido nucleico plaguicida puede usarse para cribar colecciones de ADNc o genómicas. Los métodos para la construcción de dichas colecciones de ADNc y genómicas en general son conocidos en la técnica y se analizan en Sambrook y Russell, (2001), supra. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y pueden marcarse con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Pueden prepararse sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PIP-72 conocida divulgada en este documento. Adicionalmente pueden usarse cebadores degenerados diseñados basándose en los nucleótidos y residuos aminoacídicos conservados en la secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda típicamente comprende una región de la secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 de la divulgación o un fragmento o variante del mismo. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación en general son conocidos en la técnica y se divulgan en Sambrook y Russell, (2001), supra.
Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico completa, que codifica un polipéptido PIP-72, divulgada en este documento o una o más partes de la misma puede usarse como sonda que puede hibridar específicamente con las correspondientes secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias similares al polipéptido PIP-72 y ARN mensajeros. Para conseguir una hibridación específica en una diversidad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y preferiblemente son de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud o de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas pueden usarse para amplificar las correspondientes secuencias plaguicidas de un organismo elegido por PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen cribado por hibridación de colecciones de ADN sembradas en placa (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
La hibridación de dichas secuencias puede realizarse en condiciones rigurosas. "Condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se usa en este documento para hacer referencia a condiciones en las que una sonda hibridará con su secuencia diana hasta un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse secuencias diana que sean un 100 % complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir cierto emparejamiento incorrecto en las secuencias, de manera que se detecten menores grados de similitud (sondeo heterólogo). En general, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferentemente de menos de 500 nucleótidos de longitud.
Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en que la concentración salina sea de menos de aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a pH 7,0 hasta 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Condiciones ejemplares de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución tamponante de un 30 a un 35 % de formamida, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato sódico) al 1 % a 37 °C, y un lavado en SSC 1* a 2* (SSC 20* = NaCl 3,0 M/citrato de trisodio 0,3 M) a 50 hasta 55 °C. Condiciones ejemplares de rigurosidad moderada incluyen hibridación en un 40 a un 45 % de formamida, NaCl 1,0 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado en SSC 0,5* a 1* a 55 hasta 60 °C. Condiciones ejemplares de rigurosidad elevada incluyen hibridación en un 50 % de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado en SSC 0,1* a 60 hasta 65 °C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 1 % de SDS. La duración de la hibridación en general es de menos de aproximadamente 24 horas, habitualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.
La especificidad típicamente es la función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, puede obtenerse una aproximación de la Tm a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C 16,6 (log M) 0,41 (% GC)-0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidas) a la que un 50 % de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de emparejamiento incorrecto; por tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o las de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con ^90 % de identidad, la Tm puede disminuirse 10 °C. En general, se seleccionan condiciones rigurosas que sean aproximadamente 5 °C inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C inferiores al punto de fusión térmico (Tm); las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C inferiores al punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C inferiores al punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en la materia entenderán que se describen de forma inherente las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado deseado de emparejamiento incorrecto produce una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que pueda usarse una temperatura mayor. Se encuentran amplias directrices sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, N.Y.); y Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
En algunos aspectos, se describen en este documento moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o mayor identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ I NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947, o SEQ ID NO: 948 en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
Proteínas y variantes y fragmentos de las mismas
Los polipéptidos PIP-72 también están incluidos por la divulgación. "Proteína insecticida 72 de Pseudomonas", "polipéptido PIP-72" o "proteína PIP-72", como se usan en este documento indistintamente, se refieren a un polipéptido que tiene actividad plaguicida incluyendo, aunque sin limitación, actividad insecticida contra una o más plagas de insectos del origen Coleóptera, y es suficientemente homólogo a la proteína de SEQ ID NO: 2. Se contempla una diversidad de polipéptidos PIP-72. Fuentes de polinucleótidos que codifican polipéptidos PIP-72 o proteínas relacionadas incluyen, aunque sin limitación: una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Aa de SEQ ID NO: 1 que codifica el polipéptido PIP-72Aa de SEQ ID NO: 2; una cepa de Pseudomonas rhodesiae que contiene el polinucleótido PIP-72Ba de SEQ ID NO: 3 que codifica el polipéptido PIP-72Ba de SEQ ID NO: 4; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Ca de SEQ ID NO: 5 que codifica el polipéptido PIP-72Ca de SEQ ID NO: 6; una cepa de Pseudomonas mandelii que contiene el polinucleótido PIP-72Cb de SEQ ID NO: 7 que codifica el polipéptido PIP-72Cb de SEQ ID NO: 8; una cepa de Pseudomonas congelans que contiene el polinucleótido PIP-72Da de SEQ ID NO: 9 que codifica el polipéptido PIP-72Da de SEQ ID NO: 10; una cepa de Pseudomonas mandelii que contiene el polinucleótido PIP-72Db de SEQ ID NO: 11 que codifica el polipéptido PIP-72Db de SEQ ID NO: 12; una cepa de Pseudomonas ficuserectae que contiene el polinucleótido PIP-72Dc de SEQ ID NO: 13 que codifica el polipéptido PIP-72Dc de SEQ ID NO: 14; una cepa de Pseudomonas mosselii que contiene el polinucleótido
PIP-72Fa de Se Q ID NO: 17 que codifica el polipéptido PIP-72Fa de SEQ ID NO: 18; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Ff de SEQ ID NO: 27 que codifica el polipéptido PIP-72Ff de SEQ ID
NO: 28 y una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gb de SEQ ID NO: 31 que codifica el polipéptido PIP-72Gb de SEQ ID NO: 32; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Ab de SEQ ID NO: 949 que codifica el polipéptido PIP-72Ab de SEQ ID NO: 927; una cepa de Pseudomonas brassicacearum que contiene el polinucleótido PIP-72Bb de SEQ ID NO: 950 que codifica el polipéptido PIP-72Ab de SEQ
ID NO: 928; una cepa de Pseudomonas entomophila que contiene el polinucleótido PIP-72Fh de SEQ ID NO: 954 que codifica el polipéptido PIP-72AFh de SEQ ID NO: 932; una cepa de Pseudomonas entomophila que contiene el polinucleótido PIP-72Fh de SEQ ID NO: 955 que codifica el polipéptido PIP-72AFh de SEQ ID No : 933; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Fj de SEQ ID NO: 956 que codifica el polipéptido PIP-72Fj de SEQ ID NO: 934; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Fk de SEQ ID
NO: 957 que codifica el polipéptido PIP-72Fk de SEQ ID NO: 935; una cepa de Burkholderia multivorans que contiene el polinucleótido PIP-72Fl de s Eq ID NO: 958 que codifica el polipéptido PIP-72Fl de SEQ ID NO: 936; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gg de SEQ ID NO: 961 que codifica el polipéptido PIP-72Gg de SEQ ID NO: 939; una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gh de SEQ ID
NO: 962 que codifica el polipéptido PIP-72Gh de SEQ ID NO: 940; una cepa de Pseudomonas mosselii que contiene el polinucleótido PIP-72Gi de s Eq ID NO: 963 que codifica el polipéptido PIP-72Gi de SEQ ID NO: 941; una cepa de Pseudomonas protegens que contiene el polinucleótido PIP-72Gk de SEQ ID NO: 965 que codifica el polipéptido PIP-72Gk de SEQ ID NO: 943; una cepa de Pseudomonas plecoglossicida que contiene el polinucleótido PIP-72Gl de SEQ
ID NO: 966 que codifica el polipéptido PIP-72Gl de s Eq ID NO: 944; y una cepa de Pseudomonas chlororaphis que contiene el polinucleótido PIP-72Gn de SEQ ID NO: 968 que codifica el polipéptido PIP-72Gn de SEQ ID NO: 946. En algunos aspectos, la actividad insecticida es contra el gusano de la raíz del maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 es suficientemente homólogo a la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID
NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID
NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ
ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946. "Suficientemente homólogo" se usa en este documento para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%,
56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98% o 99% o mayor homología de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos en este documento usando parámetros convencionales. Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la correspondiente homología de proteínas teniendo en cuenta la similitud de aminoácidos y similares. En algunos aspectos, la homología de secuencia es frente a la secuencia de longitud completa de un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,
66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 8 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o mayor identidad de secuencia en comparación con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID
NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID
NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ
ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946. En algunos aspectos, la identidad de secuencia es frente a la secuencia de longitud completa de un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, la identidad de secuencia se calcula usando el algoritmo ClustalW del módulo ALIGNX® del conjunto de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto. En algunos aspectos, la identidad de secuencia es en la longitud completa del polipéptido, calculada usando el algoritmo ClustalW del módulo ALIGNX® del conjunto de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto.
Como se usa en este documento, las expresiones "proteína", "molécula peptídica" o "polipéptido" incluye cualquier molécula que comprende cinco o más aminoácidos. Es bien sabido en la técnica que las moléculas proteínicas, peptídicas o polipeptídicas pueden experimentar modificación, incluyendo modificaciones postraduccionales, tales como, aunque sin limitación, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, fosforilación u oligomerización. Por tanto, como se usa en este documento, las expresiones "proteína", "molécula peptídica" o "polipéptido" incluye cualquier proteína que se modifique mediante cualquier proceso biológico o no biológico. Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-aminoácidos de origen natural.
Una "proteína recombinante" se usa en este documento para hacer referencia a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo, in vitro o en una célula hospedadora bacteriana o vegetal recombinante. Un polipéptido
PIP-72 que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente un 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de proteína no plaguicida (también mencionada en este documento como "proteína contaminante").
Los "fragmentos" o "partes biológicamente activas" incluyen fragmentos polipeptídicos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a un polipéptido PIP-72 y que presentan actividad insecticida. Los "fragmentos" o "partes biológicamente activas" de polipéptidos PIP-72 incluyen fragmentos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946, respectivamente. Una parte biológicamente activa de un polipéptido PIP-72 puede ser un polipéptido, es decir, por ejemplo, de 10, 25, 50, 55, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o 85 aminoácidos de longitud. Dichas partes biológicamente activas pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse para la actividad insecticida. Como se usa aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, un fragmento de polipéptido PIP-72 comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946. En algunos aspectos, el fragmento del polipéptido PIP-72 es un truncamiento N-terminal y/o C-terminal de al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos desde el extremo N y/o el extremo C con respecto a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946, por ejemplo, por proteólisis, por inserción de un codón de inicio, por eliminación de los codones que codifican los aminoácidos eliminados e inserción concomitante de un codón de inicio, y/o inserción de un codón de parada.
En algunos aspectos, los fragmentos del polipéptido PIP-72 incluidos en este documento son el resultado de la retirada de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más aminoácidos N-terminales con respecto a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946, por ejemplo, por proteólisis o por inserción de un codón de inicio, por eliminación de los codones que codifican los aminoácidos eliminados e inserción concomitante de un codón de inicio.
En algunos aspectos, los fragmentos del polipéptido PIP-72 incluidos en este documento son el resultado de la retirada de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos N-terminales con respecto a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 o variantes de las mismas incluyendo, aunque sin limitación, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 -SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946. En algunos aspectos, el truncamiento es de los 4 primeros aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32 o variantes de las mismas incluyendo, aunque sin limitación, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID n O: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946.
"Variantes", como se usa en este documento, se refiere a proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos precursora. El término "aproximadamente", como se usa en este documento, con respecto al % de identidad de secuencia significa hasta e incluyendo ±0,5 % en incrementos de un 0,1 %. Por ejemplo "aproximadamente un 90 %" de identidad de secuencia incluye un 89,5 %, 89,6 %, 89,7 %, 89,8 %, 89,9 %, 90 %, 90,1 %, 90,2 %, 90,3 %, 90,4 % y 90,5 %.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 927.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 928.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 932.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 933.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 934.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 935.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 936.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 939.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 940.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 941.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 943.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 944.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 945.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene al menos aproximadamente un 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad en la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 946.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ
ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un
50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un
50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un
50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un
50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un
50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un
50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un
50 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, la identidad de secuencia es en la longitud completa del polipéptido, calculada usando el algoritmo ClustalW del módulo ALIGNX® del conjunto de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 comprende un motivo de aminoácidos representado por los residuos aminoacídicos 37-51 de SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848 o SEQ ID NO: 849.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene una sustitución aminoacídica en uno o más residuos seleccionados de los residuos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 4 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 7 81, 82, 83, 84, 85 o 86, de SEQ ID NO: 2 en cualquier combinación, y opcionalmente el polipéptido PIP-72 comprende además una eliminación de 1 a 5 aminoácidos, una inserción de 1 a 5 aminoácidos, la adición de uno o más aminoácidos en el extremo N y/o la adición de uno o más aminoácidos en el extremo C con respecto a SEQ ID NO: 2, en cualquier combinación.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene una sustitución aminoacídica en uno o más residuos seleccionados de los residuos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 4 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 86 de SEQ ID NO: 2 , en cualquier combinación, y opcionalmente el polipéptido PIP-72 comprende además una eliminación de 1 a 5 aminoácidos, una inserción de 1 a 5 aminoácidos, la adición de uno o más aminoácidos en el extremo
N o la adición de uno o más aminoácidos en el extremo C con respecto a SEQ ID NO: 2, en cualquier combinación.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene una sustitución aminoacídica en 1 a 45 residuos seleccionados de los residuos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85 y 86, de SEQ ID NO: 2 en cualquier combinación, y opcionalmente el polipéptido PIP-72 comprende además una eliminación de 1 a 5 aminoácidos, una inserción de 1 a 5 aminoácidos, la adición de uno o más aminoácidos en el extremo N y/o la adición de uno o más aminoácidos en el extremo C con respecto a SEQ ID NO: 2, en cualquier combinación.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene una sustitución aminoacídica en comparación con el aminoácido natural de SEQ ID NO: 2 en 1 a 45 residuos seleccionados de los residuos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 60, 63, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 y 86 de SEQ ID NO: 2, en cualquier combinación, y opcionalmente el polipéptido PIP-72 comprende además una eliminación de 1 a 5 aminoácidos, una inserción de 1 a 5 aminoácidos, la adición de uno o más aminoácidos en el extremo N y/o la adición de uno o más aminoácidos en el extremo
C con respecto a SEQ ID NO: 2, en cualquier combinación.
En aspectos específicos, la sustitución es una alanina en el lugar del aminoácido natural en la posición o posiciones indicadas. También se incluye una o más secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína o polipéptido variante.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 846, en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 3 es Ile o Trp; Xaa en la posición 4 es Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 5 es Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile o Tyr; Xaa en la posición 6 es Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp o Tyr; Xaa en la posición 7 es Asn, Ala o Val; Xaa en la posición 8 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 9 es Ser, Ala, Cys, Gly o Thr; Xaa en la posición 10 es Ser, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr o Trp; Xaa en la posición 11 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 12 es Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 13 es Ile, Asn, Gln o Val; Xaa en la posición 14 es Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys o Gln; Xaa en la posición 15 es Val, Ala, Cys, Ile, Met o Arg; Xaa en la posición 17 es Ile, Glu o Val; Xaa en la posición 18 es Asn o Ser; Xaa en la posición 19 es His, Ala, Glu, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser o Tyr; Xaa en la posición 20 es Trp, Ala o Thr; Xaa en la posición 22 es Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 23 es Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 24 es Gly, Asp o Phe; Xaa en la posición 25 es Asp, Ala, Glu, Phe, Asn o Gln; Xaa en la posición 26 es Thr, Glu o Pro; Xaa en la posición 27 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Arg o Thr; Xaa en la posición 28 es Phe, Pro, Trp o Tyr; Xaa en la posición 29 es Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp o Tyr; Xaa en la posición 30 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 31 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 33 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 34 es Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Tyr; Xaa en la posición 35 es Lys, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 36 es Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 37 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 38 es Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 39 es Trp o Phe; Xaa en la posición 40 es Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 42 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 44 es Ser, Ala, Asp, Glu, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 45 es Arg, Lys o Ser; Xaa en la posición 46 es Gly, Ala o Gln; Xaa en la posición 47 es Phe, Cys, Val o Tyr; Xaa en la posición 48 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 49 es Leu, Cys, Phe, Met, Arg o Tyr; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Thr o Val; Xaa en la posición 51 es Leu, Ala, Cys, Met o Val; Xaa en la posición 52 es Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Trp o Tyr; Xaa en la posición 53 es Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 54 es Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser o T rp; Xaa en la posición 56 es Ala, Gly, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser o Thr; Xaa en la posición 57 es Gln, Glu, Leu, Met, Ser o Thr; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp o Tyr; Xaa en la posición 60 es Tyr, Glu o Phe; Xaa en la posición 63 es Gln, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 64 es Ala, Phe, Gly, His, Arg, Ser o Tyr; Xaa en la posición 65 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Thr o Val; Xaa en la posición 66 es Ser, Ala o Gly; Xaa en la posición 67 es Lys, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 68 es Ile, Asp, Leu o Val; Xaa en la posición 69 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 70 es Val, Cys o Ile; Xaa en la posición 71 es Asp, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 72 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Trp; Xaa en la posición 73 es Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 74 es Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 75 es Val, Cys, Ile o Leu; Xaa en la posición 76 es Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 77 es Asp, Tyr; Xaa en la posición 78 es Gln, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 79 es Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp o Tyr; Xaa en la posición 80 es Arg, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 81 es Leu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 82 es Ile, Ala, Leu, Met, Arg o Val; Xaa en la posición 83 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 84 es Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 85 es Leu, Cys, Gly o Val; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Ile, Thr o Val, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 846 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45, sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 846 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 846 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 846 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 847, en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Lys o Ala; Xaa en la posición 3 es Ile o Leu; Xaa en la posición 4 es Thr o Ser; Xaa en la posición 5 es Val o Ile; Xaa en la posición 6 es Thr o Lys; Xaa en la posición 8 es Asn, Lys, Gly o Ser; Xaa en la posición 9 es Ser o Ala; Xaa en la posición 11 es Asn, Lys, His o Thr; Xaa en la posición 12 es Pro, Thr, Lys o Ser; Xaa en la posición 13 es Ile o Val; Xaa en la posición 14 es Glu o Asp; Xaa en la posición 15 es Val, Ala o Ile; Xaa en la posición 16 es Ala o Ser; Xaa en la posición 17 es Ile o Val; Xaa en la posición 18 es Asn o Ser; Xaa en la posición 19 es His, Lys, Arg, Gln o Ala; Xaa en la posición 21 es Gly o Arg; Xaa en la posición 22 es Ser, Lys, Asn, Asp o Thr; Xaa en la posición 25 es Asp o Asn; Xaa en la posición 26 es Thr o Asp; Xaa en la posición 27 es Ser, Thr, Asn o Lys; Xaa en la posición 28 es Phe, Tyr o Pro; Xaa en la posición 29 es Phe o Tyr; Xaa en la posición 30 es Ser, Gly o Lys; Xaa en la posición 31 es Val, Ile o Met; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala o Asp; Xaa en la posición 33 es Asn, Ser, Gln o Pro; Xaa en la posición 35 es Lys, Glu o Ser; Xaa en la posición 36 es Gln, Asn o Ser; Xaa en la posición 37 es Glu o Asp; Xaa en la posición 38 es Thr o Ser; Xaa en la posición 42 es Ser o Asn; Xaa en la posición 44 es Ser, Asp, Ala o Leu; Xaa en la posición 47 es Phe o Tyr; Xaa en la posición 48 es Leu o Met; Xaa en la posición 49 es Leu o Met; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala o Tyr; Xaa en la posición 51 es Leu o Val; Xaa en la posición 52 es Lys o Gln; Xaa en la posición 53 es Lys, Arg, Met o Leu; Xaa en la posición 54 es Asn, Lys o Gly; Xaa en la posición 55 es Gly o Ser; Xaa en la posición 56 es Ala, Thr, Gln o Ser; Xaa en la posición 57 es Gln, Val o Ala; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Lys, Tyr o Thr; Xaa en la posición 59 es Pro o Thr; Xaa en la posición 62 es Val o Ile; Xaa en la posición 63 es Gln, Ser o Leu; Xaa en la posición 64 es Ala, Gln o Ser; Xaa en la posición 65 es Ser o Thr; Xaa en la posición 67 es Lys, Gln, Arg o Asn; Xaa en la posición 69 es Glu, Lys o Val; Xaa en la posición 70 es Val o Ile; Xaa en la posición 71 es Asp, Glu o Tyr; Xaa en la posición 72 es Asn, His, Ser o Asp; Xaa en la posición 73 es Asn, Ser o Asp; Xaa en la posición 74 es Ala, Thr, Met, Ile o Lys; Xaa en la posición 76 es Lys o Thr; Xaa en la posición 78 es Gln, His o Ser; Xaa en la posición 80 es Arg, Glu o Gln; Xaa en la posición 81 es Leu, Pro, Ala o Thr; Xaa en la posición 82 es Ile o Leu; Xaa en la posición 83 es Glu, His, Asn, Gln o Leu; Xaa en la posición 85 es Leu, Val o Ala; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Tyr o Asn, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72 y/o se inserta un aminoácido entre el residuo 24 y 25 con respecto a SEQ ID NO: 847.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 847 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 847 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 847 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 847 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 848, en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Lys, Ala o Arg; Xaa en la posición 3 es Ile, Leu o Val; Xaa en la posición 4 es Thr o Ser; Xaa en la posición 5 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 6 es Thr, Lys, Ser o Arg; Xaa en la posición 8 es Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr o Ala; Xaa en la posición 9 es Ser, Ala o Thr; Xaa en la posición 11 es Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, His o Ser; Xaa en la posición 12 es Pro, Thr, Lys, Ser o Arg; Xaa en la posición 13 es Ile, Val o Leu; Xaa en la posición 14 es Glu o Asp; Xaa en la posición 15 es Val, Ala, Ile o Leu; Xaa en la posición 16 es Ala o Ser; Xaa en la posición 17 es Ile, Val o Leu; Xaa en la posición 18 es Asn, Ser, Gln o Thr; Xaa en la posición 19 es His, Lys, Ala, Gln, Asn o Arg; Xaa en la posición 21 es Gly, Arg o Lys; Xaa en la posición 22 es Ser, Lys, Asn, Thr, Arg, Asp, Glu o Gln; Xaa en la posición 25 es Asp, Asn, Glu o Gln; Xaa en la posición 26 es Thr, Asp, Ser o Glu; Xaa en la posición 27 es Ser, Thr, Lys, Asn, Gln o Arg; Xaa en la posición 28 es Phe, Tyr, Pro o Trp; Xaa en la posición 29 es Phe, Tyr o Trp; Xaa en la posición 30 es Ser, Gly, Lys, Thr o Arg; Xaa en la posición 31 es Val, Ile, Met o Leu; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala, Asp o Glu; Xaa en la posición 33 es Asn, Ser, Gln, Pro o Thr; Xaa en la posición 35 es Lys, Glu, Ser, Arg o Thr; Xaa en la posición 36 es Gln, Ser, Asn o Thr; Xaa en la posición 37 es Glu o Asp; Xaa en la posición 38 es Thr o Ser; Xaa en la posición 42 es Ser, Asn, Thr o Gln; Xaa en la posición 44 es Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile o Val; Xaa en la posición 47 es Phe, Tyr o Trp; Xaa en la posición 48 es Leu, Met, Ile o Val; Xaa en la posición 49 es Leu, Met, Ile o Val; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala, Tyr o Thr; Xaa en la posición 51 es Leu, Val o Ile; Xaa en la posición 52 es Lys, Gln, Arg o Asn; Xaa en la posición 53 es Lys, Arg, Met, Leu, Ile o Val; Xaa en la posición 54 es Asn, Lys, Gly, Gln o Arg; Xaa en la posición 55 es Gly, Ser o Thr; Xaa en la posición 56 es Ala, Thr, Gln, Ser o Asn; Xaa en la posición 57 es Gln, Val, Ala, Asn, Leu o Ile; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Lys, Tyr o Thr; Xaa en la posición 59 es Pro, Thr o Ser; Xaa en la posición 62 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 63 es Gln, Ser, Leu, Asn, Thr, Ile o Val; Xaa en la posición 64 es Ala, Gln, Ser, Asn o Thr; Xaa en la posición 65 es Ser o Thr; Xaa en la posición 67 es Lys, Gln, Asn o Arg; Xaa en la posición 69 es Glu, Val, Asp, Lys, Arg, Ile o Leu; Xaa en la posición 70 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 71 es Asp, Glu, Tyr o Trp; Xaa en la posición 72 es Asn, His, Ser, Asp, Gln, Thr o Glu; Xaa en la posición 73 es Asn, Ser, Asp, Gln, Thr o Glu; Xaa en la posición 74 es Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val o Arg; Xaa en la posición 76 es Lys, Thr, Arg o Ser; Xaa en la posición 78 es Gln, His, Ser, Asn o Thr; Xaa en la posición 80 es Arg, Glu, Gln, Lys, Asp o Asn; Xaa en la posición 81 es Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala o Ser; Xaa en la posición 82 es Ile, Leu o Val; Xaa en la posición 83 es Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile o Val; Xaa en la posición 85 es Leu, Val o Ala; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Tyr, Asn o Thr, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del eXtremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72 y/o se inserta un aminoácido entre el residuo 24 y 25 con respecto a SEQ ID NO: 848.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 848 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 848 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 848 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 848 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 849 en la que Xaa en la posición 2 es Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 3 es Ile, Leu, Val o Trp; Xaa en la posición 4 es Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 5 es Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu o Tyr; Xaa en la posición 6 es Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp o Tyr; Xaa en la posición 7 es Asn, Ala o Val; Xaa en la posición 8 es Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met o Val; Xaa en la posición 9 es Ser, Ala, Cys, Gly o Thr; Xaa en la posición 11 es Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Val o Tyr; Xaa en la posición 12 es Pro, Thr, Lys, Ser, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Asn, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 13 es Ile, Asn, Gln, Leu o Val; Xaa en la posición 14 es Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys, Asp o Gln; Xaa en la posición 15 es Val, Ala, Ile, Leu, Cys, Met o Arg; Xaa en la posición 16 es Ala o Ser; Xaa en la posición 17 es Ile, Glu, Leu o Val; Xaa en la posición 18 es Asn, Gln, Thr o Ser; Xaa en la posición 19 es His, Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Pro, Ser o Tyr; Xaa en la posición 20 es Trp, Ala o Thr; Xaa en la posición 21 es Gly, Arg o Lys; Xaa en la posición 22 es Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 23 es Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 24 es Gly, Asp o Phe; Xaa en la posición 25 es Asp, Ala, Glu, Phe, Asn o Gln; Xaa en la posición 26 es Thr, Glu, Asp, Ser o Pro; Xaa en la posición 27 es Ser, Thr, Lys, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn o Gln; Xaa en la posición 28 es Phe, Tyr, Pro o Trp; Xaa en la posición 29 es Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp o Tyr; Xaa en la posición 30 es Ser, Gly, Lys, Thr, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 31 es Val, Ile, Met o Leu; Xaa en la posición 32 es Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 33 es Asn, Ser, Gln, Pro, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Val o Tyr; Xaa en la posición 34 es Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Tyr; Xaa en la posición 35 es Lys, Glu, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 36 es Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 37 es Glu, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val; Xaa en la posición 38 es Thr, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 39 es Trp o Phe; Xaa en la posición 40 es Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 42 es Ser, Asn, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Val, Trp, Tyr o Gln; Xaa en la posición 44 es Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile, Ala, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Tyr o Val; Xaa en la posición 45 es Arg, Lys o Ser; Xaa en la posición 46 es Gly, Ala o Gln; Xaa en la posición 47 es Phe, Tyr Cys, Val o Trp; Xaa en la posición 48 es Leu, Met, Ile, Cys, Phe, Met, Arg, Tyr o Val; Xaa en la posición 49 es Leu, Met, Ile o Val; Xaa en la posición 50 es Ser, Ala, Tyr, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Val o Thr; Xaa en la posición 51 es Leu, Val, Ala, Cys, Met o Ile; Xaa en la posición 52 es Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Gln, Trp o Tyr; Xaa en la posición 53 es Lys, Arg, Met, Leu, Ile, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr o Val; Xaa en la posición 54 es Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser o Trp; Xaa en la posición 55 es Gly, Ser o Thr; Xaa en la posición 56 es Ala, Thr, Gln, Ser, Gly, Leu, Pro, Arg o Asn; Xaa en la posición 57 es Gln, Glu, Leu, Met, Ser, Val, Ala, Asn, Ile o Thr; Xaa en la posición 58 es His, Ala, Lys, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp, Tyr o Thr; Xaa en la posición 59 es Pro, Thr o Ser; Xaa en la posición 60 es Tyr, Glu o Phe; Xaa en la posición 62 es Val, Ile o Leu; Xaa en la posición 63 es Gln, Ser, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 64 es Ala, Gln, Asn, Phe, Gly, His, Arg, Ser o Tyr; Xaa en la posición 65 es Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Val o Thr; Xaa en la posición 66 es Ser, Ala o Gly; Xaa en la posición 67 es Lys, Gln, Asn o Arg; Xaa en la posición 68 es Ile, Asp, Leu o Val; Xaa en la posición 69 es Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr; Xaa en la posición 70 es Val, Ile, Cys o Leu; Xaa en la posición 71 es Asp, Glu, Tyr, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val o Trp; Xaa en la posición 72 es Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, His o Trp; Xaa en la posición 73 es Asn, Ser, Asp, Gln, Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Val, Tyr o Glu; Xaa en la posición 74 es Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Tyr o Arg; Xaa en la posición 75 es Val, Cys, Ile o Leu; Xaa en la posición 76 es Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 77 es Asp, Tyr; Xaa en la posición 78 es Gln, His, Ser, Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Val, Tyr o Thr; Xaa en la posición 79 es Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp o Tyr; Xaa en la posición 80 es Arg, Glu, Gln, Lys, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val, Tyr o Asn; Xaa en la posición 81 es Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His o Ser; Xaa en la posición 82 es Ile, Ala, Leu, Met, Arg y Val; Xaa en la posición 83 es Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Lys, Pro, Arg, Ser, Thr, Tyr o Val; Xaa en la posición 84 es Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp o Tyr; Xaa en la posición 85 es Leu, Val, Cys, Gly o Ala; y Xaa en la posición 86 es Ser, Ala, Tyr, Asn, Ile, Val o Thr, y en la que se eliminan opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o el extremo C del polipéptido PIP-72 y/o se inserta un aminoácido entre el residuo 24 y 25 con respecto a SEQ ID NO: 849.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 849 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 849 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 849 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 sustituciones aminoacídicas, en cualquier combinación, en los residuos indicados por Xaa en SEQ ID NO: 849 en comparación con el aminoácido natural en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, los polipéptidos PIP-72 ejemplares están codificados por la secuencia polinucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, una cualquiera de SEQ ID NO: 287 - SEQ ID NO: 527, una cualquiera de SEQ ID NO: 796 - SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 853 - SEQ ID NO: 864, una cualquiera de SEQ ID NO: 915 - SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 o SEQ ID NO: 968.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 está codificado por el polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 o SEQ ID NO: 968.
En algunos aspectos, los polipéptidos PIP-72 ejemplares se exponen en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 634, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 643, SEQ ID NO: 644, SEQ ID NO: 645, SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 663, SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 694, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 696, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 y SEQ ID NO: 946.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 .
En algunos aspectos, los polipéptidos PIP-72 ejemplares son los polipéptidos mostrados en la tabla 14, tabla 17, tabla 20, tabla 23, tabla 24, tabla 26, tabla 28 y/o tabla 29 y cualquier combinación de las sustituciones aminoacídicas de los mismos, así como eliminaciones y/o inserciones y fragmentos de los mismos.
En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 tiene un peso molecular calculado entre aproximadamente 6 kDa y aproximadamente 13 kDa, entre aproximadamente 7 kDa y aproximadamente 12 kDa, entre aproximadamente 8 kDa y aproximadamente 11 kDa, entre aproximadamente 9 kDa y aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 8,75 kDa, aproximadamente 9 kDa, aproximadamente 9,25 kDa, aproximadamente 9,5 kDa, aproximadamente 9,75 kDa, aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 10,25 kDa y aproximadamente 10,5 kDa. Como se usa en este documento, el término "aproximadamente" usado en el contexto de peso molecular de un polipéptido PIP-72 significa ±0,25 kilodalton.
En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 tiene una propiedad física modificada. Como se usa en este documento, la expresión "propiedad física" se refiere a cualquier parámetro adecuado para describir las características fisicoquímicas de una proteína. Como se usa en este documento, "propiedad física de interés" y "propiedad de interés" se usan indistintamente para hacer referencia a propiedades físicas de proteínas que se están investigando y/o modificando. Ejemplos de propiedades físicas incluyen, aunque sin limitación, carga neta superficial y distribución de carga sobre la superficie de la proteína, hidrofobia neta y distribución de residuos hidrófobos sobre la superficie de la proteína, densidad de carga superficial, densidad de hidrofobia superficial, recuento total de grupos ionizables superficiales, tensión superficial, tamaño de la proteína y su distribución en solución, temperatura de fusión, capacidad calorífica y segundo coeficiente del virial. Ejemplos de propiedades físicas también incluyen, aunque sin limitación, solubilidad, plegamiento, estabilidad y digestibilidad. En algunos aspectos, el polipéptido PIP-72 tiene digestibilidad aumentada de fragmentos proteolíticos en el intestino de un insecto. Los modelos para la digestión por fluidos gástricos simulados son conocidos por los expertos en la materia (Fuchs, R.L. y J.D. Astwood. Food Technology 50: 83-88, 1996; Astwood, J.D., et al. Nature Biotechnology 14: 1269-1273, 1996; Fu TJ et al. J. Agrie Food Chem. 50: 7154-7160, 2002).
En algunos aspectos, las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes incluidas por la divulgación son biológicamente activas, es decir, siguen teniendo la actividad biológica deseada (es decir, actividad plaguicida) de la proteína natural. En algunos aspectos, la variante tendrá al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 % o más de la actividad insecticida de la proteína natural. En algunos aspectos, las variantes pueden tener actividad mejorada sobre la proteína natural.
Los genes bacterianos muy a menudo tienen múltiples codones de inicio de metionina en proximidad al inicio del marco abierto de lectura. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio dará lugar a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, las bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En muy pocas ocasiones, la traducción en los sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el t Tg codifica una metionina. Además, a menudo no está determinado a priori cuál de estos codones se usa de forma natural en la bacteria. Por tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina también puede dar lugar a la generación de proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas están incluidas en la presente divulgación y pueden usarse en los métodos de la presente divulgación. Se entenderá que, cuando se expresa en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo en ATG para una traducción apropiada.
En otro aspecto, el polipéptido PIP-72 puede expresarse como una proteína precursora con una secuencia intermedia que cataliza el empalme postraduccional de múltiples etapas de la proteína. El empalme de proteínas implica la escisión de una secuencia intermedia de un polipéptido con la unión concomitante de las secuencias flanqueantes para producir un nuevo polipéptido (Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22159-22168). Esta secuencia intermedia o elemento de empalme de proteína, mencionada como inteínas, cataliza su propia escisión a través de tres reacciones coordinadas en las uniones de empalme N-terminales y C-terminales: un reordenamiento de acilo de la cisteína o serina N-terminal; una reacción de transesterficación entre los dos extremos para formar un intermedio éster o tioéster ramificado y escisión de enlaces peptídicos acoplada al ciclado de la asparagina C-terminal de la inteína para liberar la inteína (Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9091-9094. El esclarecimiento del mecanismo de empalme de proteínas ha dado lugar a varias aplicaciones basadas en inteína (Comb, et al., patente de Estados Unidos número 5.496.714; Comb, et al., patente de Estados Unidos número 5.834.247; Camarero y Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597-5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271-281, Chong, et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26:5109-5115; Chong, et al., (1998) J. Biol. Chem.
273:10567-10577; Cotton, etal., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:18359-18363; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:3923-3926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2256-2264; Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:9091-9094; Iwai y Pluckthun, (1999) FEBS Lett. 459:166-172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1-13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040-16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. NMR 14:105-114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643; Severinov y Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16205-16209; Shingledecker, et al., (1998) Gene 207:187-195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110-120; Wood, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889-892; Wu, et al., (1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231; Wu, et al., (1998b) Biochim Biophys Acta 1387:422-432; Xu, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120:5591-5592). Para la aplicación de inteínas en transgenes de plantas, véase Yang, et al., (Transgene Res 15:583-593 (2006)) y Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375-392 (2005)).
En otro aspecto, el polipéptido PIP-72 puede estar codificado por dos genes diferentes donde la inteína de la proteína precursora proviene de los dos genes, mencionada como inteína dividida, y las dos partes del precursor se unen por la formación de un enlace peptídico. Esta formación de enlace peptídico se consigue mediante empalme en trans mediado por inteína. Para este fin, un primer y un segundo casete de expresión que comprenden los dos genes diferentes codifican además inteínas que pueden mediar el empalme en trans de la proteína. Mediante empalme en trans, las proteínas y polipéptidos codificados por el primer y segundo fragmento pueden ligarse por la formación de enlace peptídico. Las inteínas de empalme en trans pueden seleccionarse de los genomas nucleolar y organular de diferentes organismos, incluyendo eucariotas, arqueobacterias y eubacterias. Las inteínas que pueden usarse se enumeran en neb.com/neb/inteins.html, a la que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). La secuencia de nucleótidos que codifica una inteína puede estar dividida en una parte 5' y una 3' que codifican la parte 5' y la 3' de la inteína, respectivamente. Las partes de secuencia no necesarias para el empalme de la inteína (por ejemplo, dominio de endonucleasa de asentamiento) pueden eliminarse. La secuencia codificante de inteína se divide de modo que la parte 5' y la 3' pueden realizar empalme en trans. Para seleccionar un sitio de empalme adecuado de la secuencia codificante de inteína, pueden seguirse las consideraciones publicadas por Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926. En la construcción del primer y segundo casete de expresión, la secuencia codificante de la inteína 5' se une al extremo 3' del primer fragmento que codifica la parte N-terminal del polipéptido PIP-72 y la secuencia codificante de la inteína 3' se une al extremo 5' del segundo fragmento que codifica la parte C-terminal del polipéptido PIP-72.
En general, los compañeros de empalme en trans pueden diseñarse usando cualquier inteína dividida, incluyendo cualquier inteína dividida de origen natural o dividida de forma artificial. Se conocen varias inteínas divididas de origen natural, por ejemplo: la inteína dividida del gen DnaE de Synechocystis sp. PCC6803 (véase, Wu, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(16):9226-31 y Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13):9091-4 y del gen DnaE de Nostoc punctiforme (véase, Iwai, et al., (2006) FEBS Lett. 580(7):1853-8). Las inteínas no divididas se han dividido artificialmente en el laboratorio para crear nuevas inteínas divididas, por ejemplo: la inteína dividida artificialmente de Ssp DnaB (véase, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422-32) y la inteína dividida de Sce VMA (véase, Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1571-8) y una miniinteína fúngica dividida artificialmente (véase, Elleuche, et al., (2007) Biochem Biophys Res Commun. 355(3):830-4). También hay bases de datos disponibles de inteínas que catalogan inteínas conocidas (véase, por ejemplo, la base de datos en línea disponible en: bioinformatics.weizmann.ac.il/" pietro/inteins/Inteinstable.html, a la que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www").
Las inteínas no divididas de origen natural pueden tener actividad endonucleasa u otras actividades enzimáticas que pueden eliminarse típicamente cuando se diseña una inteína dividida que se ha dividido de forma artificial. Dichas miniinteínas o inteínas divididas minimizadas son bien conocidas en la técnica y típicamente son de menos de 200 residuos aminoacídicos de longitud (véase, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422-32). Las inteínas divididas adecuadas pueden tener otros elementos polipeptídicos que posibilitan la purificación añadidos a su estructura, con la condición de que dichos elementos no inhiban el empalme de la inteína dividida o se añadan de una manera que les permita eliminarse antes del empalme. Se ha informado de empalme de proteínas usando proteínas que comprenden dominios similares a inteína bacteriana (BIL) (véase, Amitai, et al., (2003) Mol Microbiol. 47:61-73) y dominios de autoprocesamiento de hedgehog (Hog) (los últimos están combinados con inteínas cuando se mencionan como la superfamilia de Hog/inteína o la familia HINT (véase, Dassa, et al., (2004) J Biol Chem. 279:32001-7) y dominios tales como estos también pueden usarse para preparar inteínas divididas de forma artificial. En particular, miembros sin empalme de dichas familias pueden modificarse por metodologías de biología molecular para introducir o restablecer la actividad de empalme en dichas especies relacionadas. Estudios recientes demuestran que puede observarse empalme cuando un componente de inteína dividida N-terminal se deja reaccionar con un componente de inteína dividida C-terminal no encontrado en la naturaleza como su "compañero"; por ejemplo, se ha observado empalme utilizando compañeros que tienen tan poco como de un 30 a un 50 % de homología con el compañero "natural" de empalme (véase, Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322-30). Otras de dichas mezclas de compañeros dispares de inteínas divididas han demostrado ser no reactivas entre sí (véase, Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1571-8). Sin embargo, se encuentra dentro de la capacidad de un experto en la materia relevante determinar si un par de polipéptidos en particular puede asociarse entre sí para proporcionar una inteína funcional, usando métodos rutinarios y sin el ejercicio de una capacidad inventiva.
En otro aspecto, el polipéptido PIP-72 es una variante permutada circular. En determinados aspectos, el polipéptido PIP-72 es una variante permutada circular del polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, o SEQ ID NO: 946.
El desarrollo de métodos de ADN recombinante ha hecho posible estudiar los efectos de la transposición de secuencias sobre el plegamiento, estructura y función de las proteínas. La estrategia usada en la creación de nuevas secuencias se parece a la de los pares de proteínas de origen natural que están relacionadas por reorganización lineal de sus secuencias de aminoácidos (Cunningham, et al. ,(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3218-3222; Teather y Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:3837-3841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13-19; Yamiuchi y Minamikawa, (1991) FEBS Lett. 260:127-130; MacGregor, et al., (1996) f Eb S Lett. 378:263-266). La primera aplicación in vitro de este tipo de reordenamiento para proteínas se describió por Goldenberg y Creighton (J. Mol. Biol. 165:407-413, 1983). En la creación de una variante permutada circular, se selecciona un nuevo extremo N en un sitio interno (punto de rotura) de la secuencia original, teniendo la nueva secuencia el mismo orden de aminoácidos que la original desde el punto de rotura hasta que alcanza un aminoácido que está en o cerca del extremo C original. En este punto, se une la nueva secuencia, directamente o a través de una parte adicional de secuencia (conector), a un aminoácido que está en o cerca el extremo N original y la nueva secuencia continúa con la misma secuencia que la original hasta que alcanza un punto que está en o cerca del aminoácido que estaba N-terminal al sitio del punto de rotura de la secuencia original, formando este residuo el nuevo extremo C de la cadena. La longitud de la secuencia de aminoácidos del conector puede seleccionarse empíricamente o con la guía de la información estructural o usando una combinación de las dos estrategias. Cuando no hay información estructural disponible, puede prepararse una pequeña serie de conectores para ensayo usando un diseño cuya longitud se varía para abarcar un intervalo de 0 a 50 Á y cuya secuencia se elige para que sea coherente con la exposición superficial (hidrofilia, Hopp y Woods, (1983) Mol. Immunol. 20:483-489; Kyte y Doolittle, (1982) J. Mol. Biol.
157:105-132; área superficial expuesta a disolvente, Lee y Richards, (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400) y la capacidad de adoptar la conformación necesaria sin perturbar la configuración del polipéptido plaguicida (conformacionalmente flexible; Karplus y Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212-213). Suponiendo un desplazamiento de 2,0 a 3,8 Á por residuo, esto significaría que la longitud a ensayar sería entre 0 y 30 residuos, siendo de 0 a 15 residuos el intervalo preferido. Sería ejemplar de dichas series empíricas construir conectores usando una secuencia de casete tal como Gly-Gly-Gly-Ser repetido n veces, donde n is 1,2, 3 o 4. Los expertos en la materia reconocerán que hay muchas de dichas secuencias que varían de longitud o composición que pueden servir como conectores siendo la consideración principal que no sean excesivamente largos ni cortos (véase, Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437-462); si son demasiado largos, los efectos de la entropía propablemente desestabilizarán el plegamiento tridimensional, y también pueden hacer que el plegamiento sea cinéticamente impracticable, y si son demasiado cortos, probablemente desestabilizarán la molécula a causa de deformación de torsión o estérica. Los expertos en el análisis de información estructural de proteínas reconocerán que, usando la distancia entre los extremos de cadena, definida como la distancia entre los carbonos c-alfa, puede usarse para definir la longitud de la secuencia a usar o al menos limitar el número de posibilidades que deben ensayarse en una selección empírica de conectores. También reconocerán que, a veces, es el caso de que las posiciones de los extremos de la cadena polipeptídica están mal definidos en modelos estructurales derivados de los datos de difracción de rayos x o espectroscopia de resonancia magnética nuclear, y que cuando son ciertos, esta situación, por lo tanto, tendrá que tenerse en cuenta para estimar apropiadamente la longitud del conector requerido. A partir de esos residuos cuyas posiciones están bien definidas se seleccionan dos residuos que están cercanos en la secuencia a los extremos de cadena, y la distancia entre sus carbonos c-alfa se usa para calcular la longitud aproximada para un conector entre ellos. Usando la longitud calculada como guía, entonces se seleccionan conectores con un intervalo de número de residuos (calculado usando de 2 a 3,8 Á por residuo). Estos conectores pueden estar compuestos de la secuencia original, acortarse o alargarse según lo necesario y, cuando se alargan, los residuos adicionales pueden elegirse para que sean flexibles e hidrófilos como se describe anteriormente; u opcionalmente la secuencia original puede sustituirse usando una serie de conectores, siendo un ejemplo la estrategia de casete Gly-Gly-Gly-Ser mencionada anteriormente; u opcionalmente puede usarse una combinación de la secuencia original y nueva secuencia que tiene la longitud total apropiada. Las secuencias de polipéptidos plaguicidas que pueden plegarse en estados biológicamente activos pueden prepararse mediante selección apropiada de la posición inicial (extremo amínico) y final (extremo carboxílico) desde dentro de la cadena polipeptídica original mientras se usa la secuencia conectora como se describe anteriormente. Los extremos amínico y carboxílico se seleccionan de dentro de un tramo común se secuencia, denominada región de punto de rotura, usando las directrices descritas a continuación. Por tanto, se genera una secuencia de aminoácidos novedosa seleccionando los extremos amínico y carboxílico de dentro de la misma región de punto de rotura. En muchos casos, la selección de los nuevos extremos será de modo que la posición original del extremo carboxílico precederá inmediatamente la del extremo amínico. Sin embargo, los expertos en la materia reconocerán que las selecciones de los extremos en cualquier parte dentro de la región pueden funcionar, y que estos darán lugar de manera eficaz a eliminaciones o adiciones en las partes amínica o carboxílica de la nueva secuencia. Un dogma central de la biología molecular es que la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína dictamina el plegamiento en la estructura tridimensional necesaria para la expresión de su función biológica. Los expertos en la materia conocen métodos para obtener e interpretar la información estructural tridimensional usando difracción de rayos x de cristales de proteína individuales o espectroscopia de resonancia magnética nuclear de soluciones de proteínas. Ejemplos de información estructural que son relevantes para la identificación de regiones de punto de rotura incluyen la localización y tipo de estructura secundaria de la proteína (hélices alfa y 3-10, láminas beta paralelas y antiparalelas, reversiones y giros de cadena, y bucles; Kabsch y Sander, (1983) Biopolymers 22:2577-2637; el grado de exposición al disolvente de los residuos aminoacídicos, el grado y tipo de interacciones de los residuos entre sí (Chotia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537-572) y la distribución estática y dinámica de conformaciones a lo largo de la cadena polipeptídica (Alber y Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154:511-533). En algunos casos, se conoce información adicional sobre la exposición al disolvente de los residuos; un ejemplo es un sitio de adhesión postraduccional de carbohidrato que está necesariamente sobre la superficie de la proteína. Cuando no hay información estructural experimental disponible o no es factible obtenerla, también están disponibles métodos para analizar la secuencia de aminoácidos primaria para realizar predicciones de la estructura terciaria y secundaria de la proteína, la accesibilidad del disolvente y la existencia de giros y bucles. Los métodos bioquímicos a veces también son aplicables para determinar empíricamente la exposición superficial cuando los métodos estructurales directos no son factibles; por ejemplo, usando la identificación de sitios de escisión de la cadena después de proteólisis limitada para deducir la exposición superficial (Gentile y Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218:603-621). Por tanto, usando la información estructural obtenida de forma experimental o métodos predictivos (por ejemplo, Srinivisan y Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81-99) se examina la secuencia de aminoácidos precursora para clasificar las regiones de acuerdo con si están integradas o no en el mantenimiento de la estructura secundaria y terciaria. La existencia de secuencias dentro de regiones que se sabe que están implicadas en la estructura secundaria periódica (hélices alfa y 3-10, láminas beta paralelas y antiparalelas) son regiones que deben evitarse. Asimismo, las regiones de secuencia de aminoácidos que se observa que o se ha predicho que tienen un bajo grado de exposición al disolvente tienen mayor probabilidad de formar parte del denominado núcleo hidrófobo de la proteína y también deben evitarse para la selección del extremo amínico y carboxílico. En contraste, esas regiones que se sabe que o se ha predicho que están en giros o bucles superficiales, y especialmente esas regiones que se sabe que no son necesarias para la actividad biológica, son los sitios preferidos para la ubicación de los extremos de la cadena polipeptídica. Tramos continuos de secuencia de aminoácidos que se prefieren basándose en los criterios anteriores se denominan región de punto de rotura. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos PIP-72 permutados circulares con un nuevo extremo N/extremo C que contienen una región conectora que separa el extremo C y el extremo N original pueden prepararse esencialmente siguiendo el método descrito en Mullins, et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5529-5533. Se usan múltiples etapas de amplificaciones por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para reordenar la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos PIP-72 permutados circulares con un nuevo extremo N/extremo C que contienen una región conectora que separa el extremo C y el extremo N original pueden prepararse basándose en el método de duplicación en tándem descrito en Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427-431. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los nuevos genes del extremo N/extremo C se realiza usando un ADN molde duplicado en tándem.
En otro aspecto, se describen proteínas de fusión en este documento que incluyen dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos que comprende un polipéptido PIP-72 que incluye, aunque sin limitación, el polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, una cualquiera de SEQ ID NO: 927 - SEQ ID NO: 948, y fragmentos activos de las mismas.
Los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que codifican las mismas) son conocidos por los expertos en la materia. Los polinucleótidos que codifican un polipéptido PIP-72 pueden fusionarse a secuencias señal que dirigirán la localización del polipéptido PIP-72 a compartimentos particulares de una célula procariota o eucariota y/o dirigirán la secreción del polipéptido PIP-72 de los aspectos desde una célula procariota o eucariota. Por ejemplo, en E. coli, se puede desear dirigir la expresión de la proteína al espacio periplásmico. Ejemplos de secuencias o proteínas señal (o fragmentos de las mismas) a las que puede fusionarse el polipéptido PIP-72 para dirigir la expresión del polipéptido al espacio periplásmico de las bacterias incluyen, aunque sin limitación, la secuencia señal de pelB, la secuencia señal de la proteína de unión a maltosa (MBP), MBP, la secuencia señal de ompA, la secuencia señal de la subunidad B de la enterotoxina termoinestable de E. coli periplásmica y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina. Varios vectores están disponibles en el mercado para la construcción de proteínas de fusión que dirigirán la localización de una proteína, tal como la serie de vectores pMAL (particularmente la serie pMAL-p) disponible en New England Biolabs® (240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723). En un aspecto específico, el polipéptido PIP-72 puede fusionarse a la secuencia señal de la pectato liasa pelB para aumentar la eficacia de la expresión y la purificación de dichos polipéptidos en bacterias gramnegativas (véanse las patentes de Estados Unidos número 5.576.195 y 5.846.818). Las fusiones de péptido/polipéptido de tránsito de plastidios de plantas son bien conocidas en la técnica (véase la patente de Estados Unidos número 7.193.133). Los péptidos de tránsito del apoplasto tales como la señal de secreción de la alfaamilasa del arroz o la cebada también son bien conocidos en la técnica. El péptido de tránsito de plastidios en general se fusiona de manera N-terminal al polipéptido a dirigir (por ejemplo, el compañero de fusión). En un aspecto, la proteína de fusión consiste esencialmente en el péptido de tránsito de plastidios y el polipéptido PIP-72 a dirigir. En otro aspecto, la proteína de fusión comprende el péptido de tránsito de plastidios y el polipéptido a dirigir. En dicho aspectos, el péptido de tránsito de plastidios está preferiblemente en el extremo N de la proteína de fusión. Sin embargo, residuos aminoacídicos adicionales puede estar N-terminal al péptido de tránsito de plastidios, con la condición de que la proteína de fusión se dirija al menos parcialmente a un plastidio. En un aspecto específico, el péptido de tránsito de plastidios está en la mitad N-terminal, el tercio N-terminal o el cuarto N-terminal de la proteína de fusión. La mayor parte de o todo el péptido de tránsito de plastidios en general se escinde de la proteína de fusión tras la inserción en el plastidio. La posición de la escisión puede variar ligeramente entre especies de plantas, en diferentes estadios del desarrollo de la planta, como resultado de condiciones intercelulares específicas o la combinación particular de péptido de tránsito/compañero de fusión usada. En un aspecto, la escisión del péptido de tránsito de plastidios es homogénea, de modo que el sitio de escisión es idéntico en una población de proteínas de fusión. En otro aspecto, el péptido de tránsito de plastidios no es homogéneo, de modo que el sitio de escisión varía en 1-10 aminoácidos en una población de proteínas de fusión. El péptido de tránsito de plastidios puede fusionarse de forma recombinante a una segunda proteína en una de varias maneras. Por ejemplo, puede introducirse un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la secuencia de nucleótidos del péptido de tránsito en una posición correspondiente a su extremo C-terminal y puede manipularse el mismo sitio o uno compatible en la secuencia de nucleótidos de la proteína para dirigirla en su extremo N-terminal. Debe tenerse cuidado al diseñar estos sitios para garantizar que las secuencias codificantes del péptido de tránsito y la segunda proteína se mantengan "en el marco" para permitir la síntesis de la proteína de fusión deseada. En algunos casos, puede ser preferible retirar el codón de inicio de metionina de la segunda proteína cuando se introduce el nuevo sitio de restricción. La introducción de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en ambas moléculas precursoras y su posterior unión a través de técnicas de ADN recombinante puede provocar la adición de uno o más aminoácidos adicionales entre el péptido de tránsito y la segunda proteína. En general esto no afecta a la actividad de dirección siempre que el sitio de escisión del péptido de tránsito siga siendo accesible y la función de la segunda proteína no se altere mediante la adición de estos aminoácidos adicional en su extremo N. Como alternativa, un experto en la materia puede crear un sitio preciso de escisión entre el péptido de tránsito y la segunda proteína (con o sin su metionina de inicio) usando síntesis génica (Stemmer, et al., (1995) Gene 164:49-53) o métodos similares. Además, la fusión del péptido de tránsito puede incluir de forma intencionada aminoácidos posteriores del sitio de escisión. Los aminoácidos en el extremo N de la proteína madura pueden afectar a la capacidad del péptido de tránsito de dirigir proteínas a los plastidios y/o a la eficacia de escisión tras la importación de la proteína. Esto puede depender de la proteína a dirigir. Véase, por ejemplo, Comai, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(29):15104-9.
En algunos aspectos, se describen en este documento proteínas de fusión que comprenden un polipéptido PIP-72, y un polipéptido insecticida unido mediante un conector aminoacídico.
En algunos aspectos, se describen en este documento proteínas de fusión representadas por una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:
R1-L-R2, R2-L-R1, R1-R2 o R2-R1
en la que R1 es un polipéptido PIP-72 o el polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, o SEQ ID NO: 946, R2 es un polipéptido insecticida. El polipéptido R1 se fusiona directamente o a través de un segmento conector (L) al polipéptido R2. El término "directamente" define fusiones en que los polipéptidos se unen sin un conector peptídico. Por tanto, "L" representa un enlace químico o segmento polipeptídico al que tanto R1 como R2 se fusionan en el marco, muy comúnmente L es un péptido lineal al que R1 y R2 se unen mediante enlaces amida que ligan el extremo carboxílico de R1 al extremo amínico de L y el extremo carboxílico de L al extremo amínico de R2. Por "fusionado en el marco" se entiende que no hay terminación o alteración de la traducción entre los marcos de lectura de R1 y R2. El grupo conector (L) en general es un polipéptido entre 1 y 500 aminoácidos de longitud. Los conectores que unen las dos moléculas se diseñan preferiblemente para (1) permitir que las dos moléculas se plieguen y actúen independientemente entre sí, (2) que no tengan propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que pudiera interferir con los dominios funcionales de las dos proteínas, (3) que tengan característica hodrófoba o cargada mínima que pudiera interactuar con los dominios proteínicos funcionales y (4) proporcionar separación estérica de R1 y R2 de modo que R1 y R2 pudieran interactuar simultáneamente con sus receptores correspondientes en una sola célula. Típicamente los aminoácidos superficiales en las regiones proteínicas flexibles incluyen Gly, Asn y Ser. Se esperaría que casi cualquier permutación de secuencias de aminoácidos que contengan Gly, Asn y Ser satisficiera los criterios anteriores para una secuencia conectora. Otros aminoácidos neutros, tales como Thr y Ala, también pueden usarse en la secuencia conectora. También pueden incluirse aminoácidos adicionales en los conectores debido a la adición de sitios de restricción únicos en la secuencia conectora para facilitar la construcción de las fusiones.
En algunos aspectos, los conectores comprenden secuencias seleccionadas del grupo de fórmulas: (Gly3Ser)n, (Gly4Ser)n, (GlysSer)n, (GlynSer)n o (AlaGlySer)n donde n es un número entero. Un ejemplo de un conector altamente flexible es la región espaciadora rica en (GlySer) presente dentro de la proteína pIII de los bacteriófagos filamentosos, por ejemplo, los bacteriófagos M13 o fd (Schaller, et al., 1975). Esta región proporciona una región espaciadora flexible y larga entre dos dominios de la proteína superficial pIII. También se incluyen conectores en que se incluye una secuencia de reconocimiento de endopeptidasa. Dicho sitio de escisión puede ser valioso para separar los componentes individuales de la fusión para determinar si se pliegan apropiadamente y son activos in vitro. Ejemplos de diversas endopeptidasas incluyen, aunque sin limitación, plasmina, enterocinasa, calicreína, urocinasa, activador de plasminógeno tisular, clostripaína, quimosina, colagenasa, proteasa de veneno de víbora de Russel, enzima de escisión de posprolina, proteasa V8, trombina y factor Xa. En algunos aspectos, el conector comprende los aminoácidos EEKKN (SEQ ID NO: 488) del vehículo de expresión de múltiples genes (MGEV), que se escinde por proteasas vacuolares como se divulga en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número US 2007/0277263. En otros aspectos, los segmentos conectores peptídicos de la región de bisagra de la cadena pesada de las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, IgD o IgE proporcionan una relación angular entre los polipéptidos fijados. Son especialmente útiles esas regiones de bisagra donde las cisteínas se remplazan con serinas. Los conectores de la presente divulgación incluyen secuencias derivadas de la región de bisagra de IgG gamma 2b murina en que las cisteínas se han cambiado a serinas. Las proteínas de fusión no están limitadas por la forma, el tamaño o el número de secuencias conectoras empleadas y el único requisito del conector es que funcionalmente no interfiera de manera adversa con el plegamiento y la función de las moléculas individuales de la fusión.
En otro aspecto, se describen en este documento polipéptidos PIP-72 quiméricos que se crean a través de la unión de dos o más partes de genes de PIP-72, que originalmente codificaban proteínas PIP-72 separadas para crear un gen quimérico. La traducción del gen quimérico produce un único polipéptido PIP-72 quimérico con regiones, motivos o dominios derivados de cada uno de los polipéptidos originales. En determinados aspectos, la proteína quimérica comprende partes, motivos o dominios de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID No : 4), PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6) y PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8), PIP-72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Db (SEQ ID NO: 12), PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18), PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28) y PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32), PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927), PIP-72Bb (SEQ ID NO: 928), PIP-72Fh (SEQ ID NO: 932), PIP-72Fi (SEQ ID NO: 933), PIP-72Fj (SEQ ID NO: 934), PIP-72Fk (SEQ ID NO: 935), PIP-72Fl (SEQ ID NO: 936), PIP-72Gg (SEQ ID NO: 939), PIP-72Gh (SEQ ID NO: 940), PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941), PIP-72Gk (SEQ ID NO: 943), PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944), PIP-72Gm (SEQ ID NO: 945) o PIP-72Gn (SEQ ID NO: 946) en cualquier combinación.
Se reconoce que las secuencias de ADN pueden alterarse por diversos métodos, y que estas alteraciones pueden producir secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes de las codificadas por la proteína plaguicida de tipo silvestre (o natural). En algunos aspectos, un polipéptido PIP-72 puede alterarse de diversas maneras, incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones aminoacídicas de uno o más aminoácidos, incluyendo hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o más sustituciones, eliminaciones y/o inserciones aminoacídicas o combinaciones de las mismas en comparación con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, o SEQ ID NO: 946.
Los métodos para dichas manipulaciones en general son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido PIP-72 por mutaciones en el ADN. Esto también puede conseguirse mediante una de varias formas de mutagénesis y/o en desarrollo dirigido. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Dichas variantes tendrán la actividad plaguicida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de un polipéptido PIP-72 de conferir actividad plaguicida puede mejorarse por el uso de dichas técnicas sobre las composiciones de esta divulgación.
Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones aminoacídicas conservativas en uno o más residuos aminoacídicos no esenciales predichos. Un residuo aminoacídico "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo silvestre de un polipéptido PIP-72 sin alterar la actividad biológica. Una "sustitución aminoacídica conservativa" es una en que el residuo aminoacídico se remplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen: aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina); cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico); residuos polares cargados negativamente y sus amidas (por ejemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina); cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); residuos alifáticos pequeños no polares o ligeramente polares (por ejemplo, alanina, serina, treonina, prolina, glicina); cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); residuos alifáticos grandes no polares (por ejemplo, metionina, leucina, isoleucina, valina, cistina); cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina); cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina); cadenas laterales aromáticas grandes (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano).
Las sustituciones aminoacídicas pueden hacerse en regiones no conservadas que conserven la función. En general, dichas sustituciones no se harían en residuos aminoacídicos conservados o residuos aminoacídicos que residan dentro de un motivo conservado, donde dichos residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Ejemplos de residuos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de los aspectos (por ejemplo, residuos que son idénticos en una alineación de homólogos). Ejemplos de residuos que se conservan, pero que pueden permitir sustituciones aminoacídicas conservativas y aún conservar la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que tienen solamente sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de los aspectos (por ejemplo, residuos que tienen solamente sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en la alineación de los homólogos). Sin embargo, un experto en la materia entendería que las variantes funcionales puede tener alteraciones mínimas conservadas o no conservadas en los residuos conservados. Pueden encontrarse directrices con respecto a las sustituciones aminoacídicas apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
Al hacer dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir función biológica interactiva en una proteína en general está comprendida en la técnica (Kyte y Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1):105-32). Está aceptado que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye en la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.
Se sabe en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática similar y aún producirán una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún obtendrán una proteína biológica funcionalmente equivalente. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en su hidrofobia y características de carga (Kyte y Doolittle, ibid). Estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5). Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de 2, aquellos que estén dentro de 1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de 0,5 son incluso más particularmente preferidos.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de forma eficaz basándose en la hidrofilia. La patente de Estados Unidos número 4.554.101, expone que el promedio de hidrofilia local más grande de una proteína, regida por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.
Como se detalla en la patente de Estados Unidos número 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los residuos aminoacídicos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0, 0,1); glutamato (+3,0, 0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5, 0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).
Como alternativa, pueden hacerse alteraciones a la secuencia proteínica de muchas proteínas en el extremo amínico o carboxílico sin afectar sustancialmente a la actividad. Esto puede incluir inserciones, eliminaciones o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluyendo amplificaciones por PCR que alteran o amplían la secuencia codificante de la proteína como consecuencia de la inclusión de secuencias codificantes de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Como alternativa, las secuencias proteínicas añadidas pueden incluir secuencias codificantes de proteína completa, tales como las usadas habitualmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Dichas proteínas de fusión a menudo se usan para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés, (2) introducir un dominios de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar la purificación de la proteína, la detección de la proteína u otros usos experimentales conocidos en la técnica, (3) dirigir la secreción o la traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de bacterias gramnegativas, mitocondrias o cloroplastos de plantas o el retículo endoplásmico de células eucariotas, de lo que lo último a menudo provoca la glucosilación de la proteína.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos variantes de la divulgación también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como barajado de ADN. Con dicho procedimiento, puede usarse una o más regiones codificantes del polipéptido PIP-72 diferentes para crear un nuevo polipéptido PIP-72 que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan colecciones de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando esa estrategia, pueden barajarse motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre un gen plaguicida y otro genes plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una actividad plaguicida aumentada. Se conocen en la técnica estrategias para dicho barajado de ADN. Véase, por ejemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; y patentes de Estados Unidos número 5.605.793 y 5.837.458.
El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar polipéptidos PIP-72 alterados. Pueden intercambiarse dominios entre polipéptidos PIP-72, produciendo toxinas híbridas o quiméricas con actividad insecticida o espectro de diana mejorado. Los métodos para generar proteínas recombinantes y ensayarlas para la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbio!. 67:5328-5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbio!. 62:1537-1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).
Tanto el barajado de ADN como la mutagénesis dirigida al sitio se usaron para definir las secuencias polipeptídicas que poseen actividad plaguicida. En los ejemplos 8 y 9, el barajado de ADN se usó para generar una colección de variantes activas por recombinación de la diversidad presente en GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) y PIP-72Da (SEQ ID NO: 10). Los expertos en la materia serán capaces de usar comparaciones con otras proteínas o ensayos funcionales para definir más los motivos. Puede usarse cribado de alto rendimiento para ensayar variaciones de estos motivos para determinar la función de residuos específicos. Dado ese conocimiento para varios motivos, entonces se pueden definir los requisitos de una proteína funcional. El conocimiento de los motivos permite que los expertos en la materia diseñen variaciones de secuencia que no afectarían a la función.
La alineación de homólogos para homólogos de PIP-72 (figuras 1,2, 3, 4 y 5) permitió la identificación de residuos que están conservados entre los homólogos en esta familia (figura 1). En el ejemplo 10 y 11, se usó mutagénesis por saturación para hacer y ensayar sustituciones en posiciones aminoacídicas seleccionadas. Estos mutantes se ensayaron para la actividad y se identificaron varias sustituciones activas no presentes entre los homólogos que proporcionan una compresión de las restricciones funcionales en estos residuos.
En algunos aspectos, se describen en este documento polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o mayor identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947, o SEQ ID NO: 948, en la que el polipéptido tiene actividad insecticida.
Composiciones
También se incluyen composiciones que comprenden un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, la composición comprende una proteína de fusión de PIP-72.
Anticuerpos
También se incluyen anticuerpos contra un polipéptido PIP-72 de los aspectos o contra variantes o fragmentos del mismo. Los anticuerpos de la divulgación incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, así como fragmentos de los mismos que conservan su capacidad de unirse a proteínas PIP-72 encontradas en el intestino de los insectos. Un anticuerpo, anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo se dice que puede unirse a una molécula si puede reaccionar de forma específica con la molécula para unir de ese modo la molécula al anticuerpo, anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. Se entiende que la expresión "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) incluye moléculas intactas, así como fragmentos o regiones de unión o dominios de las mismas (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab)2) que pueden unirse al hapteno. Dichos fragmentos típicamente se producen por escisión proteolítica, tal como papaína o pepsina. Como alternativa, pueden producirse fragmentos de unión a hapteno a través de la aplicación de tecnología de ADN recombinante o a través de química sintética. Los métodos para la preparación de los anticuerpos de la presente divulgación en general son conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase, Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988), así como las referencias citadas en ese documento. Trabajos de referencia convencionales que exponen los principios generales de inmunología incluyen: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.Y. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y. (1980) y Campbell, "Monoclonal Antibody Technology," en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon, et al., (eds.), Elsevier, Ámsterdam (1984). Véanse también, las patentes de Estados Unidos número 4.196.265; 4.609.893; 4.713.325; 4.714.681; 4.716.111; 4.716.117 y 4.720.459. Los anticuerpos contra el polipéptido PIP-72 o partes de unión a antígeno de los mismos pueden producirse por una diversidad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos convencionales, por ejemplo, la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495. También pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, tales como transformación vírica u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal para preparar hibridomas es un sistema murino. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la técnica. Los compañeros de fusión (por ejemplo, células murinas de mieloma) y procedimientos de fusión también son conocidos. El anticuerpo y los anticuerpos monoclonales de la divulgación pueden prepararse utilizando un polipéptido PIP-72 como antígenos.
En este documento se describe un kit para detectar la presencia de un polipéptido PIP-72 o detectar la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido PIP-72, en una muestra. En un aspecto, el kit proporciona reactivos basados en anticuerpo para detectar la presencia de un polipéptido PIP-72 en una muestra de tejido. En otro aspecto, el kit proporciona sondas de ácido nucleico marcadas útiles para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos que codifiquen uno o más polipéptidos PIP-72. El kit se proporciona junto con reactivos apropiados y controles para realizar un método de detección, así como instrucciones para el uso del kit.
identificación y aislamiento de receptores
También se incluyen receptores del polipéptido PIP-72 de los aspectos o de variantes o fragmentos del mismo. Los métodos para identificar receptores son bien conocidos en la técnica (véase, Hofmann, et al., (1988) Eur. J. Biochem.
173:85-91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27277-27282) y pueden emplearse para identificar y aislar el receptor que reconoce los polipéptidos PIP-72 usando las vesículas de membrana con borde en cepillo de insectos susceptibles. Además del método de marcaje radiactivo enumerado en la bibliografía citada, el polipéptido PIP-72 puede marcarse con tinte fluorescente y otros marcadores comunes tales como estreptavidina. Las vesículas de membrana con borde en cepillo (BBMV) de insectos susceptibles tales como el medidor de la soja y chinches pueden prepararse de acuerdo con los protocolos enumerados en las referencias y separarse en gel de SDS-PAGE y transferirse a membrana adecuada. Los polipéptidos PIP-72 marcados pueden incubarse con membrana transferida de BBMV y los polipéptidos PIP-72 marcados pueden identificarse con los indicadores marcados. La identificación de la banda o bandas de proteína que interactúan con los polipéptidos PIP-72 puede detectarse por secuenciación en fase gaseosa de aminoácidos N-terminales o el método de identificación de proteínas basado en espectrometría de masas (Patterson, (1998) 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Una vez identificada la proteína, el gen correspondiente puede clonarse a partir del ADN genómico o una colección de ADNc de los insectos susceptibles y la afinidad de unión puede medirse directamente con los polipéptidos PIP-72. La función receptora para la actividad insecticida por los polipéptidos PIP-72 puede verificarse y conseguirse por el método de inactivación génica de tipo iARN (Rajagopal, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:46849-46851).
Construcciones de nucleótidos, casetes de expresión y vectores
El uso de la expresión "construcciones de nucleótidos" en este documento no pretende limitar los aspectos a construcciones de nucleótidos que comprenden ADN. Los expertos en la materia reconocerán que también pueden emplearse construcciones de nucleótidos, particularmente polinucleótidos y oligonucleótidos compuestos de ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos en los métodos divulgados en este documento. Las construcciones de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de los aspectos abarcan adicionalmente todas las formas complementarias de dichas construcciones, moléculas y secuencias. Además, las construcciones de nucleótidos, moléculas de nucleótidos y secuencias de nucleótidos de los aspectos abarcan todas las construcciones de nucleótidos, moléculas y secuencias que pueden emplearse en los métodos de los aspectos para transformar plantas incluyendo, aunque sin limitación, las comprendidas de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y combinaciones de los mismos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de origen natural como análogos sintéticos. Las construcciones de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de los aspectos también abarcan todas las formas de construcciones de nucleótidos incluyendo, aunque sin limitación, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo y bucle y similares.
Un aspectos más se refiere a un organismo transformado tal como un organismo seleccionado de células vegetales y de insecto, bacterias, levaduras, baculovirus, protozoos, nematodos y algas. El organismo transformado comprende una molécula de ADN de los aspectos, un casete de expresión que comprende la molécula de ADN o un vector que comprende el casete de expresión, que puede incorporarse de forma estable en el genoma del organismo transformado.
Las secuencias de los aspectos se proporcionan en construcciones de ADN para su expresión en el organismo de interés. La construcción incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' unidas de forma funcional a una secuencia de los aspectos. La expresión "una de forma funcional", como se usa en este documento, se refiere a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En general, unida de forma funcional significa que las secuencias de ácido nucleico que está ligadas están contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteína, en el mismo marco de lectura. La construcciones adicionalmente puede contener al menos un gen adicional a cotransformar en el organismo. Como alternativa, el gen o genes adicionales pueden proporcionarse en múltiples construcciones de ADN.
En algunos aspectos, la construcción de ADN comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido PIP-72 de los aspectos unido de forma funcional a una secuencia reguladora heteróloga.
En algunas realizaciones, la construcción de ADN comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947, o SEQ ID NO: 948, unido de forma funcional a una secuencia reguladora heteróloga.
En algunas realizaciones, la construcción de ADN comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 o SEQ ID NO: 948 unido de forma funcional a una secuencia reguladora heteróloga.
A dicha construcción de ADN se le proporciona una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia génica del polipéptido PIP-72 para que esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. La construcción de ADN adicionalmente puede contener genes marcadores de selección.
La construcción de ADN en general incluirá en la dirección 5' a 3' de transcripción: una región de inicio de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de los aspectos y una región de terminación de la transcripción y la traducción (es decir, región de terminación) funcionales en el organismo que sirve como hospedador. La región de inicio de la transcripción (es decir, el promotor) puede ser natural, análoga, exógena o heteróloga para el organismo hospedador y/o para la secuencia de los aspectos. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o, como alternativa, una secuencia sintética. El término "exógeno", como se usa en este documento, indica que el promotor no se encuentra en el organismo natural en que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "exógeno" o "heterólogo" para la secuencia de los aspectos, se pretende que el promotor no sea el promotor natural o de origen natural para la secuencia unida de forma funcional de los aspectos. Como se usa en este documento, un gen quimérico comprende una secuencia codificante unida de forma funcional a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga para la secuencia codificante. Cuando el promotor es una secuencia nativa o natural, la expresión de la secuencia unida de forma funcional se altera con respecto a la expresión de tipo silvestre, lo que provoca una alteración en el fenotipo.
En algunos aspectos, la construcción de ADN también puede incluir una secuencia potenciadora de la transcripción. Como se usa en este documento, el término un "potenciador" se refiere a una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel o especificidad de tejido de un promotor. Se conocen diversos potenciadores en la técnica incluyendo, por ejemplo, intrones con propiedades potenciadoras de la expresión génica en plantas (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2009/0144863), el intrón de la ubiquitina (es decir, el intrón 1 de la ubiquitina del maíz (véase, por ejemplo, la secuencia NCBI S94464; Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689)), el potenciador omega o el potenciador de cebado omega (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, Nueva York) 237-256 y Gallie, et al., (1987) Gene 60:217-25), el potenciador de CaMV 35S (véase, por ejemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1685-96), el intrón de AdhI del maíz (Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357), los potenciadores de la patente de Estados Unidos número 7.803.992, y también puede usarse el potenciador del virus baciliforme de la caña de azúcar (SCBV) del documento WO2013130813. No se pretende que la lista anterior de potenciadores de la transcripción sea limitante. Puede usarse cualquier potenciador de la transcripción apropiado en los aspectos.
La región de terminación puede ser natural con la región de inicio de la transcripción, puede ser natural con la secuencia de ADN de interés unida de forma funcional, puede ser natural con la planta hospedadora o puede obtenerse de otra fuente (es decir, exógena o heteróloga para el promotor, la secuencia de interés, la planta hospedadora o cualquier combinación de los mismos).
Están disponibles regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Véase también, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet.
262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 y Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Cuando sea apropiado, un ácido nucleico puede optimizarse para una expresión aumentada en el organismo hospedador. Por tanto, cuando el organismo hospedador es una planta, los ácidos nucleicos sintéticos pueden sintetizarse usando codones preferidos de planta para una expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para un análisis del uso de codones preferidos de planta. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de los aspectos pueden expresarse en especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para justificar las preferencias de codones específicos y las preferencias de contenido de GC de las monocotiledóneas o dicotiledóneas, ya que se ha demostrado que estas preferencias difieren (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Por tanto, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular puede obtenerse de secuencias génicas conocidas de maíz. El uso de codones de maíz para 28 genes de plantas de maíz se enumera en la tabla 4 de Murray, et al., supra. Están disponibles en la técnica métodos de síntesis de genes preferidos de planta. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos número 5.380.831 y 5.436.391 y Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, y Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010. También puede encontrarse una tabla de uso de codones de Zea maize en kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, a la que se puede acceder usando el prefijo www. La tabla 2 muestra un análisis de codones óptimos de maíz (adaptado de Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010).
Tabla 2
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Se comparó el uso de codones usando el ensayo de contingencia de la ji al cuadrado para identificar codones óptimos. Los codones que aparecen significativamente más a menudo (P\0,01) se indican con un asterisco.
Se muestra una tabla de uso de codones de Glycine max en la tabla 3 y también puede encontrarse en kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N, a la que se puede acceder usando el prefijo www.
Tabla 3
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En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido PIP-72 tiene codones optimizados para el maíz.
Se conocen modificaciones de secuencia adicionales para potenciar la expresión génica en un hospedador celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación putativas, señales de empalme de exones e intrones, repeticiones de tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de g C de la secuencia puede ajustarse a niveles promedio para un hospedador celular dado, calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedadora. La expresión "célula hospedadora", como se usa en este documento, se refiere a una célula que contiene un vector y mantiene la replicación y/o expresión del vector de expresión que se pretende. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas tales como E. coli o células eucariotas tales como células de levadura, insecto, anfibio o mamífero o células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Un ejemplo de una célula hospedadora monocotiledónea es una célula hospedadora de maíz. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm de horquilla secundaria predichas.
Los casetes de expresión pueden contener además secuencias líder 5'. Dichas secuencias líder pueden actuar potenciando la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV (región no codificante 5' del virus de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes de potyvirus, por ejemplo, líder de TEV (virus del grabado del tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), líder de MDMV (virus del mosaico enano del maíz), la proteína de unión a la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); líder no traducido del ARNm de la proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (ARN 4 de AMV) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), pág. 237-256) y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382-385). Véase también, Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Dichas construcciones también pueden contener una "secuencia de señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a determinadas estructuras intracelulares, tales como el cloroplasto (u otro plastidio), el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi.
"Secuencia señal", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia que sabe que o se sospecha que provoca el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a través de la membrana celular. En eucariotas, esto típicamente implica la secreción al aparato de Golgi, con algo de glucosilación resultante. Las toxinas insecticidas de bacterias a menudo se sintetizan como protoxinas, que se activan proteolíticamente en el intestino de la plaga diana (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunos aspectos, la secuencia señal se localiza en la secuencia natural o puede obtenerse de una secuencia de los aspectos. "Secuencia líder", como se usa en este documento, se refiere a cualquier secuencia que, cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para activar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por tanto, esto incluye secuencias líder que dirigen el transporte y/o la glucosilación mediante el pase al retículo endoplásmico, el pase a las vacuolas, los plastidios incluyendo cloroplastos, mitocondrias y similares. Las proteínas codificadas nucleares dirigidas a la luz de tilacoides del cloroplasto tienen un péptido de tránsito de dos partes característico, compuesto de un péptido señal de dirección al estroma y un péptido señal de dirección a la luz. La información de dirección al estroma están en la parte aminoproximal del péptido de tránsito. El péptido señal de dirección a la luz está en la parte carboxiloproximal del péptido de tránsito, y contiene toda la información para dirigirse a la luz. Las recientes investigaciones sobre proteómica del cloroplasto de plantas superiores ha conseguido la identificación de numerosas proteínas de la luz codificadas nucleares (Kieselbach et al. FEBS LETT480:271-276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319-341,2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350-356, 2001), cuyo péptido señal de dirección a la luz posiblemente pueda usarse de acuerdo con la presente divulgación. Se presentan aproximadamente 80 proteínas de Arabidopsis, así como proteínas homólogas de espinaca y guisante de jardín, por Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249-264, 2003. En particular, la tabla 2 de esta publicación divulga 85 proteínas de la luz del cloroplasto, identificadas por su número de acceso (véase también la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2009/09044298). Además, la versión esbozada recientemente publicada del genoma del arroz (Goff et al., Science 296:92-100, 2002) es una fuente adecuada para el péptido señal de dirección a la luz que puede usarse de acuerdo con la presente divulgación.
Los péptidos de tránsito de cloroplastos (CTP) adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen CTP quiméricos que comprenden, aunque sin limitación, un dominio N-terminal, un dominio central o un dominio C-terminal de un CTP de 1-desoxi-D xiulosa-5-fosfato sintasa de Oryza sativa, superóxido dismutasa de Oryza sativa, sintasa de almidón soluble de Oryza sativa, enzima de ácido málico dependiente de NADP de Oryza sativa, fosfo-2-deshidro-3-desoxiheptonato aldolasa 2 de Oryza sativa, L-ascorbato peroxidasa 5 de Oryza sativa, fosfoglucano hidrosoluble dicinasa de Oryza sativa, ssRUBISCO de Zea mays, beta-glucosidasa de Zea mays, malato deshidrogenasa de Zea mays, tiorredoxina de tipo M de Zea mays (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2012/0304336). Los péptidos de tránsito de cloroplastos de las publicaciones de patente de Estados Unidos US20130205440A1, US20130205441A1 y US20130210114A1.
El gen del polipéptido PIP-72 a dirigir al cloroplasto puede optimizarse para su expresión en el cloroplasto para justificar las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse usando codones preferidos de cloroplasto. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 5.380.831.
En la preparación del casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según lo apropiado, en el marco de lectura apropiado. Para ello, pueden emplearse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, o pueden realizarse otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminar el ADN superfluo, eliminar sitios de restricción o similares. Para este fin, pueden implicarse la mutagénesis in vitro, la reparación con cebador, restricción, hibridación, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.
Pueden usarse varios promotores en la práctica de los aspectos. Los promotores pueden seleccionarse basándose en el resultado deseado. Los ácidos nucleicos pueden combinarse con promotores constitutivos, preferidos de tejido, inducibles u otros promotores para la expresión en el organismo hospedador. Los promotores descritos en este documento incluyen homólogos de elementos en cis que se sabe que logran la regulación génica, que muestran homología con las secuencias promotoras descritas en este documento. Estos elementos en cis incluyen, aunque sin limitación, elementos en cis sensibles al oxígeno (Cowen et al., J Biol. Chem. 268(36):26904-26910 (1993)), elementos reguladores de la luz (Bruce y Quaill, Plant Cell 2 (11):1081-1089 (1990); Bruce et al., EMBO J. 10:3015-3024 (1991); Rocholl et al., Plant Sci. 97:189-198 (1994); Block et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5387-5391 (1990); Giuliano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7089-7093 (1988); Staiger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6930-6934 (1989); Izawa et al., Plant Cell 6:1277-1287 (1994); Menkens et al., Trends in Biochemistry 20:506-510 (1995); Foster et al., FASEB J.
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Los promotores constitutivos adecuados para su uso en una célula hospedadora vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor común del promotor de Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en el documento WO 1999/43838 y la patente de Estados Unidos número 6.072.050; el promotor común de 35S de CaMV (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812); actina del arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor de ALS (patente de Estados Unidos número 5.659.026) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos analizados en las patentes de Estados Unidos número 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 y 6.177.611. Promotores constitutivos adecuados también incluyen promotores que tienen fuerte expresión en casi todos los tejidos, pero tienen baja expresión en polen incluyendo, aunque sin limitación: promotores del virus del veteado del plátano (Acuminata yunnan) (BSV(AY)) divulgados en la patente de Estados Unidos US8.338.662; promotores del virus del veteado del plátano (Acuminata vietnam) (BSV(AV)) divulgados en la patente de Estados Unidos US8.350.121; y promotores del virus del veteado del plátano (Mysore) (BSV(MYS)) divulgados en la patente de Estados Unidos US8.395.022.
Dependiendo del resultado deseado, puede ser beneficioso expresar el gen a partir de un promotor inducible. Son de particular interés para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de los aspectos en plantas los promotores inducibles por heridas. Dichos promotores inducibles por heridas pueden responder a daños provocados por la alimentación de insectos, e incluyen el gen del inhibidor de la proteinasa de la patata (pin II) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 y wun2, patente de Estados Unidos número 5.428.148; win1 y win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141-150) y similares.
Además, pueden emplearse promotores inducibles por patógenos en los métodos y construcciones de nucleótidos de los aspectos. Dichos promotores inducibles por patógenos incluyen aquellos de proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Véase, por ejemplo, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645-656 y Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Véase también, el documento WO 1999/43819.
Son de interés los promotores que se expresan localmente en o cerca del sitio de infección del patógeno. Véase, por ejemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet.
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Pueden usarse promotores regulados por productos químicos para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo el objetivo, el promotor puede ser un promotor inducido por productos químicos, donde la aplicación del producto químico induce la expresión génica o un promotor reprimible por productos químicos, donde la aplicación del producto químico reprime la expresión génica. Los promotores inducibles por productos químicos son conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, el promotor In2-2 de maíz, que se activa por protectores del herbicida bencenosulfonamida, el promotor GST de maíz, que se activa por compuestos electrófilos hidrófobos que se usan como herbicidas pregerminación, y el promotor PR-1a de tabaco, que se activa por ácido salicílico. Otros promotores regulados por productos químicos de interés incluyen promotores sensibles a esteroides (véase, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis, et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (véase, por ejemplo, Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 y las patentes de Estados Unidos número 5.814.618 y 5.789.156).
Pueden utilizarse promotores preferidos de tejido para dirigir la expresión del polipéptido PIP-72 potenciado diana dentro de un tejido vegetal particular. Los promotores preferidos de tejido incluyen aquellos analizados en Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol.
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Se conocen en la técnica promotores con preferencia foliar. Véase, por ejemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 y Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
Los promotores preferidos de raíz o específicos de raíz son conocidos y pueden seleccionarse de muchos disponibles en la bibliografía o aislarse de novo de diversas especies compatibles. Véase, por ejemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de la glutamina sintasa específico de la raíz de la soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de control específico de raíces en el gen GRP 1.8 de la judía verde); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de raíz del gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) y Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11 -22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica la glutamina sintetasa (GS) citosólica, que se expresa en raíces y nódulos radiculares de la soja). Véase también, Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633-641, donde se describen dos promotores específicos de la raíz aislados de genes de hemoglobina de Parasponia andersonii no leguminosa fijadora de nitrógeno y Trema tomentosa no leguminosa no fijadora de nitrógeno relacionada. Los promotores de estos genes se unieron a un gen indicador de p-glucuronidasa y se introdujeron tanto en Nicotiana tabacum no leguminosa como en Lotus corniculatus leguminosa y, en ambos casos, se conservó la actividad promotora específica de raíces. Leach y Aoyagi (1991) describen su análisis de los promotores de los genes altamente expresados rolC y rolD de inducción radicular de Agrobacterium rhizogenes (véase Plant Science (Limerick) 79(1 ):69-76). Concluyeron que el potenciador y los determinantes de ADN preferidos de tejido se disocian en esos promotores. Teeri, et al., (1989) usaron la fusión génica con lacZ para demostrar que el gen de ADNt de Agrobacterium que codifica la octopina-sintasa es especialmente activo en la epidermis de los ápices de las raíces, y que el gen TR2' es específico de las raíces en la planta intacta y se estimula por heridas en el tejido foliar, una combinación especialmente deseable de características para su uso con un gen insecticida o larvicida (véase, EMBO J. 8(2):343-350). El gen TR1' fusionado con nptII (neomicina-fosfotransferasa II) mostró características similares. Promotores adicionales preferidos de raíz incluyen el promotor del gen VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772) y el promotor de rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Véanse también, las patentes de Estados Unidos número 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 y 5.023.179. Se divulgan secuencias reguladoras preferidas de la raíz de Arabidopsis thaliana en la solicitud de patente de Estados Unidos US20130117883. Se divulgan promotores de RCc3 de sorgo (Sorghum bicolor) preferidos de la raíz en la solicitud de patente de Estados Unidos US20120210463. Los promotores del maíz preferidos de la raíz de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 20030131377, la patente de Estados Unidos número 7.645.919 y 8.735.655. Los promotores del maíz específicos de la pilorriza 1 (ZmRCP1) de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 20130025000. Los promotores del maíz preferidos de la raíz de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 20130312136.
Promotores "preferidos de semilla" incluyen tanto promotores "específicos de semilla" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como promotores de proteínas de almacenamiento en la semilla) como promotores "de germinación de la semilla" (aquellos promotores activos durante la germinación de la semilla). Véase, Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108. Dichos promotores preferidos de semilla incluyen, aunque sin limitación, Cim1 (mensaje inducido por citocinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa del maíz); y milps (mio-inositol-1-fosfato-sintasa) (véase la patente de Estados Unidos número 6.225.529). Gamma-zeína y Glb-1 son promotores específicos de endosperma. Para dicotiledóneas, los promotores con específicos de semilla incluyen, aunque sin limitación, inhibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku y Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1079-1093), p-faseolina de alubia, napina, p-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina y similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, aunque sin limitación, zeína del maíz de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Véase también el documento WO 2000/12733, donde se divulgan promotores preferidos de semilla de los genes end1 y end2. En dicotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, aunque sin limitación, el promotor de la cubierta de la semilla de Arabidopsis, pBAN; y los promotores de semilla tempranos de Arabidopsis, p26, p63 y p63tr (patentes de Estados Unidos número 7.294.760 y 7.847.153). Un promotor que tiene expresión "preferida" en un tejido particular se expresa en ese tejido a un grado mayor que en al menos otro tejido de la planta. Algunos promotores preferidos de tejido muestran expresión casi exclusivamente en el tejido particular.
Cuando se desea expresión de bajo nivel, se usarán promotores débiles. En general, la expresión "promotor débil", como se usa en este documento, se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por expresión de bajo nivel se pretende a niveles de aproximadamente 1/1000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos a aproximadamente 1/500.000 transcritos. Como alternativa, se reconoce que la expresión "promotores débiles" también abarque promotores que dirigen la expresión en solamente unas pocas células y no en otras, para dar un nivel bajo total de expresión. Cuando un promotor dirige la expresión a niveles inaceptablemente altos, pueden eliminarse o modificarse partes de la secuencia promotora para disminuir los niveles de expresión.
Dichos promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo, el promotor común del promotor de Rsyn7 (documento WO 1999/43838 y patente de Estados Unidos número 6.072.050), el promotor común de 35S de CaMV, y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos divulgados en las patentes de Estados Unidos número 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 y 6.177.611.
No se pretende que la lista anterior de promotores sea limitante. Puede usarse cualquier promotor apropiado en los aspectos.
En general, el casete de expresión comprenderá un gen marcador de selección para la selección de células transformadas. Los genes marcadores de selección se utilizan para seleccionar las células o los tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como aquellos que codifican la neomicina-fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina-fosfotransferasa (HPT), así como también genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinil, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ejemplos adicionales de genes marcadores de selección adecuados incluyen, aunque sin limitación, genes que codifican resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209-213 y Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res.
5:131-137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinil (Stalker, et al., (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478-481 y solicitudes de patente de Estados Unidos de número de serie 10/004.357 y 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Véase en general, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol.
6:2419-2422; Barkley, et al., (1980) en The Operon, pág. 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-483; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother.
36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín) y Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724.
No se pretende que la lista anterior de genes marcadores de selección sea limitante. Puede usarse cualquier gen marcador de selección en los aspectos.
Transformación de plantas
Los métodos de los aspectos implican introducir un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducir", como se usa en este documento, significa presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal forma que la secuencia obtiene acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de los aspectos no dependen de un método particular para introducir un polinucleótido o polipéptido en una planta, solamente que el polinucleótido o los polipéptidos obtengan acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir un polinucleótido o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.
"Transformación estable", como se usa en este documento, significa que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y puede heredarse por la descendencia de la misma. "Transformación transitoria", como se usa en este documento, significa que se introduce un polinucleótido en la planta y no se integra en el genoma de la planta o se introduce un polipéptido en una planta. "Planta", como se usa en este documento, se refiere a plantas completas, órganos de las plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y la descendencia de los mismos. Las células vegetales pueden estar diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callo, células en cultivo en suspensión, protoplastos, células de las hojas, células de la raíz, células del floema y polen).
Los protocolos de transformación, así como los protocolos de introducción de secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o la célula de la planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, elegida para la transformación. Los métodos adecuados de introducción de secuencias de nucleótidos en células vegetales y la posterior inserción en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (patentes de Estados Unidos número 5.563.055 y 5.981.840), transferencia génica directa (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración de partículas balísticas (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos número 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244 y 5.932.782; Tomes, et al., (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips, (Springer-Verlag, Berlín) y McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926) y transformación Lecl (documento WO 00/28058). Para la transformación de patatas véase, Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838 y Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71-78. Pueden encontrarse procedimientos de transformación adicionales en Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen, (1991) ln Vitro Cell Dev. Biol.
27P:175-182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (rice); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes de Estados Unidos número 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol.
91:440-444 (maíz); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763-764; patente de Estados Unidos número 5.736.369 (cereales); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nueva York), pág. 197-209 (polen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por barbas); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens).
En aspectos específicos, las secuencias de los aspectos pueden proporcionarse a una planta usando una diversidad de métodos de transformación transitoria. Dichos métodos de transformación transitoria incluyen, aunque sin limitación, la introducción del polipéptido PIP-72 o variantes y fragmentos del mismo directamente en la planta o la introducción del transcrito del polipéptido PIP-72 en la planta. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo de partículas. Véase, por ejemplo, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53-58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176-2180 y Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784. Como alternativa, el polinucleótido del polipéptido PIP-72 puede transformarse de forma transitoria en la planta usando técnicas conocidas en la técnica. Dichas técnicas incluyen un sistema de vector vírico y la precipitación del polinucleótido de tal forma que impide la posterior liberación del a Dn . Por tanto, puede producirse la transcripción del ADN unido a partículas, pero la frecuencia con la que se libera para llegar a integrarse en el genoma se reduce enormemente. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma n.° P3143).
Se conocen en la técnica métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En un aspecto, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se consigue usando un sistema de recombinación específico de sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 y WO 1999/25853. En resumen, el polinucleótido de los aspectos puede estar contenido en un casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El casete de transferencia se introduce en una planta que ha incorporado de forma estable en su genoma un sitio diana que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del casete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y el casete de transferencia se integra en el sitio diana. El polinucleótido de interés se integra de ese modo en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.
Los vectores de transformación de plantas pueden comprender uno o más vectores de ADN necesarios para conseguir la transformación de la planta. Por ejemplo, una práctica común en la técnica es utilizar vectores de transformación de plantas que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores se mencionan a menudo en la técnica como "vectores binarios". Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, son los usados más a menudo para transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para conseguir una transformación eficaz es bastante grande, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN diferentes. Los vectores binarios típicamente contienen un vector plasmídico que contiene las secuencias de acción en cis requeridas para la transferencia de ADNt (tal como el límite izquierdo y el límite derecho), un marcador de selección que se manipule para que tenga capacidad de expresión en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen manipulado para que tenga capacidad de expresión en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También hay presentes en este vector plasmídico secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias de acción en cis se disponen de una manera que permite la transferencia eficaz a células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador de selección y el gen plaguicida se ubican entre el límite izquierdo y derecho. A menudo, un segundo vector plasmídico contiene los factores de acción en trans que median la transferencia del ADNt desde Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia del ADN por escisión en las secuencias del límite y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Pueden usarse varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de plantas. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar las plantas mediante otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.
En general, los métodos de transformación de plantas implican transferir ADN heterólogo a células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguido de aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador de selección) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa de células sin transformar. Después de la integración del ADN exógeno heterólogo en células vegetales, entonces se aplica un nivel umbral máximo de selección apropiada en el medio para destruir las células no transformadas y separar y proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección por transferencia regular a un medio fresco. Por pase continuo y exposición con selección apropiada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plasmídico. Entonces pueden usarse métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo de interés integrado en el genoma de la planta transgénica.
Típicamente se transfieren los explantes a un aporte fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en retoños después de colocarlas en medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Los retoños entonces se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar el retoño enraizado o plántula. La plántula transgénica entonces crece en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Típicamente se transfieren los explantes a un aporte fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Se encuentra una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas trangénicas en Ayres y Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar, (1997) Maydica 42:107-120. Como el material transformado contiene muchas células; hay presentes tanto células transformadas como sin transformar en cualquier fragmento de callo o tejido o grupo de células diana sometido. La capacidad de destruir células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen produce cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de retirar células no transformadas es una limitación a la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.
Las células que se han transformado pueden hacerse crecer en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas después pueden cultivarse, y polinizarse con la misma cepa transformada o diferentes cepas, e identificarse el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva o inducible de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda y después pueden recogerse las semillas para garantizar que se ha conseguido la expresión de la característica fenotípica deseada.
Las secuencias de nucleótidos de los aspectos pueden proporcionarse a la planta poniendo en contacto la planta con un virus o ácidos nucleicos víricos. En general, dichos métodos implican incorporar la construcción de nucleótidos de interés dentro de una molécula de ADN o ARN vírica. Se reconoce que las proteínas recombinantes de los aspectos pueden sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína vírica, que después puede procesarse por proteólisis in vivo o in vitro para producir el polipéptido PIP-72 deseado. También se reconoce que dicha poliproteína vírica, que comprende al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PIP-72 de los aspectos, puede tener la actividad plaguicida deseada. Dichas poliproteínas víricas y las secuencias de nucleótidos que las codifican están incluidas por los aspectos. Los métodos para proporcionar plantas con construcciones de nucleótidos y producir las proteínas codificadas en las plantas, que implican moléculas de ADN o ARN víricas son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos número 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367 y 5.316.931.
Se conocen en la técnica métodos para la transformación de cloroplastos. Véase, por ejemplo, Svab, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga, (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en el suministro con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador de selección y la dirección del ADN al genoma del plastidio a través de recombinación homóloga. Además, la transformación de plastidios puede conseguirse mediante transactivación de un transgén inactivo portado en plastidios por expresión preferida de tejido de una ARN polimerasa codificada nuclear y dirigida por los plastidios. Dicho sistema se ha presentado en McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
Los aspectos adicionales se refieren a material de propagación vegetal de una planta transformada de los aspectos incluyendo, aunque sin limitación, semillas, tubérculos, cormos, bulbos, hojas y esquejes de raíces y retoños.
Los aspectos pueden usarse para la transformación de cualquier especie de planta incluyendo, aunque sin limitación, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, aunque sin limitación, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, espadaña (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), panizo (Setaria italica), coracán (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.
Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), habas (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), poinsetia (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo. Las coníferas que pueden emplearse en la práctica de los aspectos incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino Tamarack (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata); pino Oregón (Pseudotsuga menziesii); tsuga occidental (Tsuga canadensis); pícea blanca (Picea glauca); secoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo del oeste (Thuja plicata) y falso ciprés de Nootka (Chamaecyparis nootkatensis). Plantas de los aspectos incluyen plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), tales como plantas de maíz y soja.
Hierbas incluyen, aunque sin limitación: pasto azul de invierno (Poa annua); margallo (Lolium multiflorum); pasto azul de Canadá (Poa compressa); festuca reptante (Festuca rubra); césped inclinado colonial (Agrostis tenuis); céped inclinado progresivo (Agrostis palustris); pasto de trigo del desierto (Agropyron desertorum); triguillo ruso del norte (Agropyron cristatum); festuca dura (Festuca longifolia); pasto azul de Kentucky (Poa pratensis); pasto ovillo (Dactylis glomerata); pallica (Lolium perenne); festuca roja (Festuca rubra); pasto quila (Agrostis alba); gamilla (Poa trivialis); cañuela de oveja (Festuca ovina); bromo suave (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); fleo (Phleum pratense); césped inclinado terciopelo (Agrostis canina); hierba alcalina llorona (Puccinellia distans); pasto de trigo occidental (Agropyron smithii); gramilla colorada (Cynodon spp.); pasto de San Agustín (Stenotaphrum secundatum); zoisia (Zoysia spp.); pasto bahía (Paspalum notatum); pasto alfombra (Axonopus affinis); prado chino (Eremochloa ophiuroides); pasto africano (Pennisetum clandesinum); grama de río (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); hierba búfalo (Buchloe dactyloids); pasto banderita (Bouteloua curtipendula).
Plantas de interés incluyen plantas de cereales que proporcionan semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Semillas de interés incluyen semillas de cereal, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Plantas oleaginosas incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, lino, ricino, oliva, etc. Plantas leguminosas incluyen alubias y guisantes. Las alubias incluyen guar, algarroba, fenogreco, soja, judías de jardín, caupí, soja verde, judía blanca, haba, lentejas, garbanzos, etc.
Evaluación de la transformación de las plantas
Después de la introducción de ADN exógeno heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos métodos tales como análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.
El análisis por PCR es un método rápido de cribar las células, tejido o retoños transformados por la presencia del gen incorporado en el estadio anterior antes del trasplante al suelo (Sambrook y Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, n Y). Se realiza PCR usando cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen de interés o el fondo del vector de Agrobacterium, etc.
La transformación de plantas puede confirmarse por análisis de transferencia de Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell (2001) supra). En general, se extrae el ADN total del transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. La membrana o "trasferencia" entonces se explora con, por ejemplo, fragmento de ADN diana radiomarcado con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales (Sambrook y Russell, (2001) supra).
En análisis de transferencia de Northern, se aísla ARN de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído, y se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con procedimientos convencionales que se usan de forma rutinaria en la técnica (Sambrook y Russell (2001) supra). La expresión del ARN codificado por el gen plaguicida se ensaya entonces hibridando el filtro a un sonda radiactiva derivada del gen plaguicida, por métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell (2001) supra).
Puede realizarse inmunoelectrotransferencia, ensayos bioquímicos y similares sobre las plantas transgénicas para confirmar la presencia de la proteína codificada por el gen plaguicida por procedimientos convencionales (Sambrook y Russell, 2001, supra) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en el polipéptido PIP-72.
Apilamiento de rasgos en plantas transgénicas
Las plantas transgénicas pueden comprender un apilado de uno o más polinucleótidos insecticidas divulgados en este documento con uno o más polinucleótidos adicionales, dando como resultado la producción o supresión de múltiples secuencias polipeptídicas. Pueden obtenerse plantas transgénicas que comprenden apilados de secuencias polinucleotídicas mediante métodos de hibridación tradicionales o mediante métodos de genomanipulación o mediante ambos. Estos métodos incluyen, aunque sin limitación, hibridación de líneas individuales que comprenden cada una un polinucleótido de interés, transformación de una planta transgénica que comprende un gen divulgado en este documento con un gen posterior y cotransformación de genes en una sola célula vegetal. Como se usa en este documento, el término "apilado" incluye tener los múltiples rasgos presentes en la misma planta (es decir, se incorporan ambos rasgos en el genoma nuclear, se incorpora un rasgo en el genoma nuclear y se incorpora un rasgo en el genoma de un plastidio o ambos rasgos se incorporan en el genoma de un plastidio). En un ejemplo no limitante, los "rasgos apilados" comprenden un apilado molecular donde las secuencias están físicamente adyacentes entre sí. Un rasgo, como se usa en este documento, se refiere al fenotipo obtenido de una secuencia particular o de grupos de secuencias. Puede realizarse cotransformación de genes usando vectores de transformación individuales que comprenden múltiples genes o genes portados por separado en múltiples vectores. Si las secuencias se apilan mediante transformación genética de las plantas, las secuencias polinucleotídicas de interés pueden combinarse en cualquier momento y en cualquier orden. Los rasgos pueden introducirse simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés proporcionados mediante cualquier combinación de casetes de expresión. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden combinarse en casetes de transformación diferentes (trans) o combinarse en el mismo casete de transformación (cis). La expresión de las secuencias puede dirigirse por el mismo promotor o por promotores diferentes. En determinados casos, puede ser deseable introducir un casete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Este puede combinarse con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de rasgos en la planta. Se reconoce además que las secuencias polinucleotídicas pueden apilarse en una ubicación genómica deseada usando un sistema de recombinación específico de sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 y WO 1999/25853.
En algunos aspectos, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos PIP-72 divulgados en este documento, en solitario o apilados con uno o más rasgos adicionales de resistencia a insectos pueden apilarse con uno o más rasgos de aporte adicionales (por ejemplo, resistencia a herbicidas, resistencia a hongos, resistencia a virus, tolerancia a las agresiones, resistencia a enfermedades, esterilidad masculina, fuerza de los tallos y similares) o rasgos de producción (por ejemplo, rendimiento aumentado, almidones modificados, perfil mejorado del aceite, aminoácidos equilibrados, alto contenido de lisina o metionina, digestibilidad aumentada, calidad mejorada de la fibra, resistencia a sequía y similares). Por tanto, pueden usarse los aspectos de polinucleótidos para proporcionar un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con capacidad de controlar de forma flexible y rentable muchísimas plagas agronómicas.
Transgenes útiles para apilamiento incluyen, aunque sin limitación:
1. Transgenes que confieren resistencia a insectos o enfermedades y que codifican:
(A) Genes de resistencia a enfermedades de las plantas. Las defensas de las plantas a menudo se activan por la interacción específica entre el producto de un gen de resistencia (R) a enfermedad en la planta y el producto de un gen de avirulencia (Avr) correspondiente en el patógeno. Puede transformarse una diversidad de plantas con el gen de resistencia clonado para manipular plantas que son resistentes a cepas de patógenos específicas. Véase, por ejemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonación del gen Cf-9 del tomate para resistencia a Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (gen Pto del tomate para resistencia a Pseudomonas syringae pv. del tomate que codifica una proteína cinasa); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (gen RSP2 de Arabidopsis para resistencia a Pseudomonas syringae), McDowell y Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178-83 y Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6):567-82. Una planta resistente a una enfermedad es una que es más resistente a un patógeno en comparación con la planta de tipo silvestre.
(B) Genes que codifican una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de los mismos misma o un polipéptido sintético modelado en los mismos. Véase, por ejemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que divulgan la clonación y secuencia de nucleótidos de un gen de delta-endotoxina Bt. Además, pueden adquirirse moléculas de ADN que codifican genes de delta-endotoxina en la American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por ejemplo, con los números de acceso a la ATCC® 40098, 67136, 31995 y 31998. Otros ejemplos no limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis que están genomanipulados se dan en las siguientes patentes y solicitudes de patente: patentes de Estados Unidos n.° 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; 5.986.177; 6.023.013, 6.060.594, 6.063.597, 6.077.824, 6.620.988, 6.642.030, 6.713.259, 6.893.826, 7.105.332; 7.179.965, 7.208.474; 7.227.056, 7.288.643, 7.323.556, 7.329.736, 7.449.552, 7.468.278, 7.510.878, 7.521.235, 7.544.862, 7.605.304, 7.696.412, 7.629.504, 7.705.216, 7.772.465, 7.790.846, 7.858.849 y los documentos WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 y WO 1997/40162.
También pueden apilarse genes que codifican proteínas plaguicidas que incluyen, aunque sin limitación: proteínas insecticidas de Pseudomonas sp. tales como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de Pseudomonas protegens cepa CHA0 y Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386: n.° de acceso a GenBank EU400157); de Pseudomonas taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343-12349) y de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 y Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas insecticidas de Photorhabdus sp. y Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 y Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069); patente de Estados Unidos número 6.048.838, y patente de Estados Unidos número 6.379.946; un polipéptido PIP-1 del documento de Estados Unidos de número de serie 13792861; un polipéptido AfIP-1A y/o AfIP-1B del documento de Estados Unidos de número de serie 13/800233; un polipéptido PHI-4 del documento de Estados Unidos de número de serie 13/839702; polipéptidos PIP-47 del documento de Estados Unidos de número de serie 61/866747; las proteínas insecticidas del documento de Estados Unidos de número de serie 61/863761 y 61/863763; y 6-endotoxinas incluyendo, aunque sin limitación: las clases Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry28, Cry29, Cry30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry51, Cry52, Cry53, Cry54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 y Cry71 de genes de 6-endotoxina y los genes citolíticos Cyt1 y Cyt2 de B. thuringiensis. Miembros de estas clases de proteínas insecticidas de B. thuringiensis incluyen, aunque sin limitación Cry1Aa1 (n.° de acceso AAA22353); Cry1Aa2 (n.° de acceso n.° de acceso AAA22552); Cry1Aa3 (n.° de acceso bAa 00257); Cry1Aa4 (n.° de acceso CAA31886); Cry1Aa5 (n.° de acceso BAA04468); Cry1Aa6 (n.° de acceso AAA86265); Cry1Aa7 (n.° de acceso AAD46139); Cry1Aa8 (n.° de acceso I26149); Cry1Aa9 (n.° de acceso BAA77213) Cry1Aa10 (n.° de acceso AAD55382); Cry1Aa11 (n.° de acceso CAA70856); Cry1Aa12 (n.° de acceso AAP80146) Cry1Aa13 (n.° de acceso AAM44305); Cry1Aa14 (n.° de acceso AAP40639); Cry1Aa15 (n.° de acceso AAY66993) Cry1Aa16 (n.° de acceso HQ439776); Cry1Aa17 (n.° de acceso HQ439788); Cry1Aa18 (n.° de acceso HQ439790) Cry1Aa19 (n.° de acceso HQ685121); Cry1Aa20 (n.° de acceso JF340156); Cry1Aa21 (n.° de acceso JN651496) Cry1Aa22 (n.° de acceso KC158223); Cry1Ab1 (n.° de acceso AAA22330); Cry1Ab2 (n.° de acceso AAA22613); Cry1Ab3 (n.° de acceso AAA22561); Cry1Ab4 (n.° de acceso BAA00071); Cry1Ab5 (n.° de acceso CAA28405); Cry1Ab6 (n.° de acceso AAA22420); Cry1Ab7 (n.° de acceso CAA31620); Cry1Ab8 (n.° de acceso AAA22551); Cry1Ab9 (n.° de acceso CAA38701); Cry1Ab10 (n.° de acceso A29125); Cry1Ab11 (n.° de acceso I12419); Cry1Ab12 (n.° de acceso AAC64003) Cry1Ab13 (n.° de acceso AAN76494); Cry1Ab14 (n.° de acceso AAG16877); Cry1Ab15 (n.° de acceso AAO13302) Cry1Ab16 (n.° de acceso AAK55546); Cry1Ab17 (n.° de acceso AAT46415); Cry1Ab18 (n.° de acceso AAQ88259) Cry1Ab19 (n.° de acceso AAW31761); Cry1Ab20 (n.° de acceso ABB72460); Cry1Ab21 (n.° de acceso ABS18384); Cry1Ab22 (n.° de acceso ABW87320); Cry1Ab23 (n.° de acceso HQ439777); Cry1Ab24 (n.° de acceso HQ439778); Cry1Ab25 (n.° de acceso HQ685122); Cry1Ab26 (n.° de acceso HQ847729); Cry1Ab27 (n.° de acceso JN135249); Cry1Ab28 (n.° de acceso JN135250); Cry1Ab29 (n.° de acceso JN135251); Cry1Ab30 (n.° de acceso JN135252); Cry1Ab31 (n.° de acceso JN135253); Cry1Ab32 (n.° de acceso JN135254); Cry1Ab33 (n.° de acceso AAS93798); Cry1Ab34 (n.° de acceso KC156668); similar a Cry1Ab (n.° de acceso AAK14336); similar a Cry1Ab (n.° de acceso AAK14337); similar a Cry1Ab (n.° de acceso AAK14338); similar a Cry1Ab (n.° de acceso ABG88858); Cry1Ac1 (n.° de acceso AAA22331); Cry1Ac2 (n.° de acceso AAA22338); Cry1Ac3 (n.° de acceso CAA38098); Cry1Ac4 (n.° de acceso AAA73077); Cry1Ac5 (n.° de acceso AAA22339); Cry1Ac6 (n.° de acceso AAA86266); Cry1Ac7 (n.° de acceso AAB46989); Cry1Ac8 (n.° de acceso AAC44841); Cry1Ac9 (n.° de acceso AAB49768); Cry1Ac10 (n.° de acceso CAA05505 ); Cry1Ac11 (n.° de acceso CAA10270); Cry1Ac12 (n.° de acceso I12418); Cry1Ac13 (n.° de acceso AAD38701); Cry1Ac14 (n.° de acceso AAQ06607); Cry1Ac15 (n.° de acceso AAN07788); Cry1Ac16 (n.° de acceso AAU87037); Cry1Ac17 (n.° de acceso AAX18704); Cry1Ac18 (n.° de acceso AAY88347); Cry1Ac19 (n.° de acceso ABD37053); Cry1Ac20 (n.° de acceso ABB89046); Cry1Ac21 (n.° de acceso AAY66992); Cry1Ac22 (n.° de acceso ABZ01836); Cry1Ac23 (n.° de acceso CAQ30431); Cry1Ac24 (n.° de acceso ABL01535); Cry1Ac25 (n.° de acceso FJ513324); Cry1Ac26 (n.° de acceso FJ617446); Cry1Ac27 (n.° de acceso FJ617447); Cry1Ac28 (n.° de acceso ACM90319); Cry1Ac29 (n.° de acceso DQ438941); Cry1Ac30 (n.° de acceso GQ227507); Cry1Ac31 (n.° de acceso GU446674); Cry1Ac32 (n.° de acceso HM061081); Cry1Ac33 (n.° de acceso GQ866913); Cry1Ac34 (n.° de acceso HQ230364); Cry1Ac35 (n.° de acceso JF340157); Cry1Ac36 (n.° de acceso JN387137); Cry1Ac37 (n.° de acceso JQ317685); Cry1Ad1 (n.° de acceso AAA22340); Cry1Ad2 (n.° de acceso CAA01880); Cry1Ae1 (n.° de acceso AAA22410); Cry1Af1 (n.° de acceso AAB82749); Cry1Ag1 (n.° de acceso AAD46137); Cry1Ah1 (n.° de acceso AAQ14326); Cry1Ah2 (n.° de acceso ABB76664); Cry1Ah3 (n.° de acceso HQ439779); Cry1Ai1 (n.° de acceso AAO39719); Cry1Ai2 (n.° de acceso HQ439780); similar a Cry1A (n.° de acceso AAK14339); Cry1Ba1 (n.° de acceso CAA29898); Cry1Ba2 (n.° de acceso CAA65003); Cry1Ba3 (n.° de acceso AAK63251); Cry1Ba4 (n.° de acceso AAK51084); Cry1Ba5 (n.° de acceso ABO20894); Cry1Ba6 (n.° de acceso ABL60921); Cry1Ba7 (n.° de acceso HQ439781); Cry1Bb1 (n.° de acceso AAA22344); Cry1Bb2 (n.° de acceso HQ439782); Cry1Bc1 (n.° de acceso CAA86568); Cry1Bd1 (n.° de acceso AAD10292); Cry1Bd2 (n.° de acceso AAM93496); Cry1Be1 (n.° de acceso AAC32850); Cry1Be2 (n.° de acceso AAQ52387); Cry1Be3 (n.° de acceso ACV96720); Cry1Be4 (n.° de acceso HM070026); Cry1Bf1 (n.° de acceso CAC50778); Cry1Bf2 (n.° de acceso AAQ52380); Cry1Bg1 (n.° de acceso AAO39720); Cry1Bh1 (n.° de acceso HQ589331); Cry1Bi1 (n.° de acceso KC156700); Cry1Ca1 (n.° de acceso CAA30396); Cry1Ca2 (n.° de acceso CAA31951); Cry1Ca3 (n.° de acceso AAA22343); Cry1Ca4 (n.° de acceso CAA01886); Cry1Ca5 (n.° de acceso CAA65457); Cry1Ca6 [1] (n.° de acceso AAF37224 ); Cry1Ca7 (n.° de acceso AAG50438); Cry1Ca8 (n.° de acceso AAM00264); Cry1Ca9 (n.° de acceso AAL79362); Cry1Ca10 (n.° de acceso AAN16462); Cry1Ca11 (n.° de acceso AAX53094); Cry1Ca12 (n.° de acceso HM070027); Cry1Ca13 (n.° de acceso HQ412621); Cry1Ca14 (n.° de acceso JN651493); Cry1Cb1 (n.° de acceso M97880); Cry1Cb2 (n.° de acceso AAG35409); Cry1Cb3 (n.° de acceso ACD50894); similar a Cry1Cb (n.° de acceso AAX63901); Cry1Da1 (n.° de acceso CAA38099); Cry1Da2 (n.° de acceso I76415); Cry1Da3 (n.° de acceso HQ439784); Cry1Db1 (n.° de acceso CAA80234); Cry1Db2 (n.° de acceso AAK48937); Cry1 Dc1 (n.° de acceso ABK35074); Cry1 Ea1 (n.° de acceso CAA37933); Cry1 Ea2 (n.° de acceso CAA39609); Cry1 Ea3 (n.° de acceso AAA22345); Cry1 Ea4 (n.° de acceso AAD04732); Cry1 Ea5 (n.° de acceso A15535); Cry1Ea6 (n.° de acceso AAL50330); Cry1Ea7 (n.° de acceso AAW72936); Cry1Ea8 (n.° de acceso ABX11258); Cry1Ea9 (n.° de acceso HQ439785); Cry1Ea10 (n.° de acceso ADR00398); Cry1 Ea11 (n.° de acceso JQ652456); Cry1Eb1 (n.° de acceso AAA22346); Cry1Fa1 (n.° de acceso AAA22348); Cry1Fa2 (n.° de acceso AAA22347); Cry1Fa3 (n.° de acceso HM070028); Cry1Fa4 (n.° de acceso HM439638); Cry1Fb1 (n.° de acceso CAA80235); Cry1Fb2 (n.° de acceso BAA25298); Cry1Fb3 (n.° de acceso AAF21767); Cry1Fb4 (n.° de acceso AAC10641); Cry1Fb5 (n.° de acceso AAO13295); Cry1Fb6 (n.° de acceso ACD50892); Cry1Fb7 (n.° de acceso ACD50893); Cry1Ga1 (n.° de acceso CAA80233); Cry1Ga2 (n.° de acceso CAA70506); Cry1Gb1 (n.° de acceso AAD10291); Cry1Gb2 (n.° de acceso AAO13756); Cry1Gc1 (n.° de acceso AAQ52381); Cry1Ha1 (n.° de acceso CAA80236); Cry1Hb1 (n.° de acceso AAA79694); Cry1Hb2 (n.° de acceso HQ439786); similar a Cry1H (n.° de acceso AAF01213); Cry1Ia1 (n.° de acceso CAA44633); Cry1 Ia2 (n.° de acceso AAA22354); Cry1 Ia3 (n.° de acceso AAC36999); Cry1 Ia4 (n.° de acceso AAB00958); Cry1 Ia5 (n.° de acceso CAA70124); Cry1 Ia6 (n.° de acceso AAC26910); Cry1 Ia7 (n.° de acceso AAM73516); Cry1 Ia8 (n.° de acceso AAK66742); Cry1 Ia9 (n.° de acceso AAQ08616); Cry1 Ia10 (n.° de acceso AAP86782); Cry1 Ia11 (n.° de acceso CAC85964); Cry1Ia12 (n.° de acceso AAV53390); Cry1Ia13 (n.° de acceso ABF83202); Cry1Ia14 (n.° de acceso ACG63871); Cry1Ia15 (n.° de acceso FJ617445); Cry1Ia16 (n.° de acceso FJ617448); Cry1Ia17 (n.° de acceso GU989199); Cry1Ia18 (n.° de acceso ADK23801); Cry1Ia19 (n.° de acceso HQ439787); Cry1Ia20 (n.° de acceso JQ228426); Cry1Ia21 (n.° de acceso JQ228424); Cry1Ia22 (n.° de acceso JQ228427); Cry1Ia23 (n.° de acceso JQ228428); Cry1Ia24 (n.° de acceso JQ228429); Cry1Ia25 (n.° de acceso JQ228430); Cry1Ia26 (n.° de acceso JQ228431); Cry1Ia27 (n.° de acceso JQ228432); Cry1Ia28 (n.° de acceso JQ228433); Cry1Ia29 (n.° de acceso JQ228434); Cry1 Ia30 (n.° de acceso JQ317686); Cry1 Ia31 (n.° de acceso JX944038); Cry1 Ia32 (n.° de acceso JX944039); Cry1 Ia33 (n.° de acceso JX944040); Cry1 Ib1 (n.° de acceso AAA82114); Cry1 Ib2 (n.° de acceso ABW88019); Cry1 Ib3 (n.° de acceso ACD75515); Cry1 Ib4 (n.° de acceso HM051227); Cry1 Ib5 (n.° de acceso HM070028); Cry1 Ib6 (n.° de acceso ADK38579); Cry1Ib7 (n.° de acceso JN571740); Cry1Ib8 (n.° de acceso JN675714); Cry1Ib9 (n.° de acceso JN675715); Cry1 Ib10 (n.° de acceso JN675716); Cry1Ib11 (n.° de acceso JQ228423); Cry1Ic1 (n.° de acceso AAC62933); 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Cry2Aa3 (n.° de acceso D86064); Cry2Aa4 (n.° de acceso AAC04867); Cry2Aa5 (n.° de acceso CAA10671); Cry2Aa6 (n.° de acceso CAA10672); Cry2Aa7 (n.° de acceso CAA10670); Cry2Aa8 (n.° de acceso AAO13734); Cry2Aa9 (n.° de acceso AAO13750); Cry2Aa10 (n.° de acceso AAQ04263); Cry2Aa11 (n.° de acceso AAQ52384); Cry2Aa12 (n.° de acceso ABI83671); Cry2Aa13 (n.° de acceso ABL01536); Cry2Aa14 (n.° de acceso ACF04939); Cry2Aa15 (n.° de acceso JN426947); Cry2Ab1 (n.° de acceso AAA22342); Cry2Ab2 (n.° de acceso CAA39075); Cry2Ab3 (n.° de acceso AAG36762); Cry2Ab4 (n.° de acceso AAO13296); Cry2Ab5 (n.° de acceso AAQ04609); Cry2Ab6 (n.° de acceso AAP59457); Cry2Ab7 (n.° de acceso AAZ66347); Cry2Ab8 (n.° de acceso ABC95996); Cry2Ab9 (n.° de acceso ABC74968); Cry2Ab10 (n.° de acceso EF157306); Cry2Ab11 (n.° de acceso CAM84575); Cry2Ab12 (n.° de acceso ABM21764); Cry2Ab13 (n.° de acceso ACG76120); Cry2Ab14 (n.° de acceso ACG76121); Cry2Ab15 (n.° de acceso HM037126); Cry2Ab16 (n.° de acceso GQ866914); Cry2Ab17 (n.° de acceso HQ439789); Cry2Ab18 (n.° de acceso JN135255); Cry2Ab19 (n.° de acceso JN135256); Cry2Ab20 (n.° de acceso JN135257); Cry2Ab21 (n.° de acceso JN135258); Cry2Ab22 (n.° de acceso JN135259); Cry2Ab23 (n.° de acceso JN135260); Cry2Ab24 (n.° de acceso JN135261); Cry2Ab25 (n.° de acceso JN415485); Cry2Ab26 (n.° de acceso JN426946); Cry2Ab27 (n.° de acceso JN415764); Cry2Ab28 (n.° de acceso JN651494); Cry2Ac1 (n.° de acceso CAA40536); Cry2Ac2 (n.° de acceso AAG35410); Cry2Ac3 (n.° de acceso AAQ52385); Cry2Ac4 (n.° de acceso ABC95997); Cry2Ac5 (n.° de acceso ABC74969); Cry2Ac6 (n.° de acceso ABC74793); Cry2Ac7 (n.° de acceso CAL18690); Cry2Ac8 (n.° de acceso CAM09325); Cry2Ac9 (n.° de acceso CAM09326); Cry2Ac10 (n.° de acceso ABN15104); Cry2Ac11 (n.° de acceso CAM83895); Cry2Ac12 (n.° de acceso CAM83896); Cry2Ad1 (n.° de acceso AAF09583); Cry2Ad2 (n.° de acceso ABC86927); Cry2Ad3 (n.° de acceso CAK29504); Cry2Ad4 (n.° de acceso CAM32331); Cry2Ad5 (n.° de acceso CAO78739 ); Cry2Ae1 (n.° de acceso AAQ52362); Cry2Af1 (n.° de acceso ABO30519); Cry2Af2 (n.° de acceso GQ866915); Cry2Ag1 (n.° de acceso ACH91610); Cry2Ah1 (n.° de acceso EU939453); Cry2Ah2 (n.° de acceso ACL80665); Cry2Ah3 (n.° de acceso GU073380); Cry2Ah4 (n.° de acceso KC156702); Cry2Ai1 (n.° de acceso FJ788388); Cry2Aj (n.° de acceso); Cry2Ak1 (n.° de acceso KC156660); Cry2Ba1 (n.° de acceso KC156658); Cry3Aa1 (n.° de acceso a Aa 22336); Cry3Aa2 (n.° de acceso AAA22541); Cry3Aa3 (n.° de acceso CAA68482); Cry3Aa4 (n.° de acceso AAA22542); Cry3Aa5 (n.° de acceso AAA50255); Cry3Aa6 (n.° de acceso AAC43266); Cry3Aa7 (n.° de acceso CAB41411); Cry3Aa8 (n.° de acceso AAS79487); Cry3Aa9 (n.° de acceso AAW05659); Cry3Aa10 (n.° de acceso AAU29411); Cry3Aa11 (n.° de acceso AAW82872); Cry3Aa12 (n.° de acceso ABY49136); Cry3Ba1 (n.° de acceso CAA34983); Cry3Ba2 (n.° de acceso CAA00645); Cry3Ba3 (n.° de acceso JQ397327); Cry3Bb1 (n.° de acceso AAA22334); Cry3Bb2 (n.° de acceso AAA74198); Cry3Bb3 (n.° de acceso I15475); Cry3Ca1 (n.° de acceso CAA42469); Cry4Aa1 (n.° de acceso CAA68485); Cry4Aa2 (n.° de acceso BAA00179); Cry4Aa3 (n.° de acceso CAD30148); Cry4Aa4 (n.° de acceso AFB18317); similar a Cry4A (n.° de acceso AAY96321); Cry4Ba1 (n.° de acceso CAA30312); Cry4Ba2 (n.° de acceso CAA30114); Cry4Ba3 (n.° de acceso AAA22337); Cry4Ba4 (n.° de acceso BAA00178); Cry4Ba5 (n.° de acceso CAD30095); similar a Cry4Ba (n.° de acceso ABC47686); Cry4Ca1 (n.° de acceso EU646202); Cry4Cb1 (n.° de acceso FJ403208); Cry4Cb2 (n.° de acceso FJ597622); Cry4Cc1 (n.° de acceso FJ403207); Cry5Aa1 (n.° de acceso AAA67694); Cry5Ab1 (n.° de acceso AAA67693); Cry5Ac1 (n.° de acceso I34543); Cry5Ad1 (n.° de acceso ABQ82087); Cry5Ba1 (n.° de acceso AAA68598); Cry5Ba2 (n.° de acceso ABW88931); Cry5Ba3 (n.° de acceso AFJ04417); Cry5Ca1 (n.° de acceso HM461869); Cry5Ca2 (n.° de acceso ZP_04123426); Cry5Da1 (n.° de acceso HM461870); Cry5Da2 (n.° de acceso ZP_04123980); Cry5Ea1 (n.° de acceso HM485580); Cry5Ea2 (n.° de acceso ZP_04124038); Cry6Aa1 (n.° de acceso AAA22357); 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Cry7Gc1 (n.° de acceso KC156654); Cry7Gd1 (n.° de acceso KC156697); Cry7Ha1 (n.° de acceso KC156651); Cry7Ia1 (n.° de acceso KC156665); Cry7Ja1 (n.° de acceso KC156671); Cry7Ka1 (n.° de acceso KC156680); Cry7Kb1 (n.° de acceso BAM99306); Cry7La1 (n.° de acceso BAM99307); Cry8Aa1 (n.° de acceso AAA21117); Cry8Ab1 (n.° de acceso EU044830); Cry8Ac1 (n.° de acceso KC156662); Cry8Ad1 (n.° de acceso KC156684); Cry8Ba1 (n.° de acceso AAA21118); Cry8Bb1 (n.° de acceso CAD57542); Cry8Bc1 (n.° de acceso CAD57543); Cry8Ca1 (n.° de acceso AAA21119); Cry8Ca2 (n.° de acceso AAR98783); Cry8Ca3 (n.° de acceso EU625349); Cry8Ca4 (n.° de acceso ADB54826); Cry8Da1 (n.° de acceso BAC07226); Cry8Da2 (n.° de acceso BD133574); Cry8Da3 (n.° de acceso BD133575); Cry8Db1 (n.° de acceso BAF93483); Cry8Ea1 (n.° de acceso AAQ73470); Cry8Ea2 (n.° de acceso EU047597); Cry8Ea3 (n.° de acceso KC855216); Cry8Fa1 (n.° de acceso AAT48690); Cry8Fa2 (n.° de acceso HQ174208); Cry8Fa3 (n.° de acceso AFH78109); Cry8Ga1 (n.° de acceso AAT46073); Cry8Ga2 (n.° de acceso ABC42043); Cry8Ga3 (n.° de acceso FJ198072); Cry8Ha1 (n.° de acceso AAW81032); Cry8Ia1 (n.° de acceso EU381044); Cry8Ia2 (n.° de acceso GU073381); Cry8Ia3 (n.° de acceso HM044664); Cry8Ia4 (n.° de acceso KC156674); Cry8Ib1 (n.° de acceso GU325772); Cry8Ib2 (n.° de acceso KC156677); Cry8Ja1 (n.° de acceso EU625348); Cry8Ka1 (n.° de acceso FJ422558); Cry8Ka2 (n.° de acceso ACN87262); Cry8Kb1 (n.° de acceso HM123758); Cry8Kb2 (n.° de acceso KC156675); Cry8La1 (n.° de acceso GU325771); Cry8Ma1 (n.° de acceso HM044665); Cry8Ma2 (n.° de acceso EEM86551); Cry8Ma3 (n.° de acceso HM210574); Cry8Na1 (n.° de acceso HM640939); Cry8Pa1 (n.° de acceso HQ388415); Cry8Qa1 (n.° de acceso HQ441166); Cry8Qa2 (n.° de acceso KC152468); Cry8Ra1 (n.° de acceso AFP87548); Cry8Sa1 (n.° de acceso JQ740599); Cry8Ta1 (n.° de acceso KC156673); similar a Cry8 (n.° de acceso FJ770571); similar a Cry8 (n.° de acceso ABS53003); Cry9Aa1 (n.° de acceso CAA41122); Cry9Aa2 (n.° de acceso CAA41425); Cry9Aa3 (n.° de acceso GQ249293); Cry9Aa4 (n.° de acceso GQ249294); Cry9Aa5 (n.° de acceso JX174110); similar a Cry9Aa (n.° de acceso AAQ52376); Cry9Ba1 (n.° de acceso CAA52927); Cry9Ba2 (n.° de acceso GU299522); Cry9Bb1 (n.° de acceso AAV28716); Cry9Ca1 (n.° de acceso CAA85764); Cry9Ca2 (n.° de acceso AAQ52375); Cry9Da1 (n.° de acceso BAA19948); Cry9Da2 (n.° de acceso AAB97923); Cry9Da3 (n.° de acceso GQ249293); Cry9Da4 (n.° de acceso GQ249297); Cry9Db1 (n.° de acceso AAX78439); Cry9Dc1 (n.° de acceso KC156683); Cry9Ea1 (n.° de acceso BAA34908); Cry9Ea2 (n.° de acceso AAO12908); Cry9Ea3 (n.° de acceso ABM21765); Cry9Ea4 (n.° de acceso ACE88267); Cry9Ea5 (n.° de acceso ACF04743); Cry9Ea6 (n.° de acceso ACG63872); Cry9Ea7 (n.° de acceso FJ380927); Cry9Ea8 (n.° de acceso GQ249292); Cry9Ea9 (n.° de acceso JN651495); Cry9Eb1 (n.° de acceso CAC50780); Cry9Eb2 (n.° de acceso GQ249298); Cry9Eb3 (n.° de acceso KC156646); Cry9Ec1 (n.° de acceso AAC63366); Cry9Ed1 (n.° de acceso AAX78440); Cry9Ee1 (n.° de acceso GQ249296); Cry9Ee2 (n.° de acceso KC156664); Cry9Fa1 (n.° de acceso KC156692); Cry9Ga1 (n.° de acceso KC156699); similar a Cry9 (n.° de acceso AAC63366); Cry10Aa1 (n.° de acceso AAA22614); Cry10Aa2 (n.° de acceso E00614); Cry10Aa3 (n.° de acceso CAD30098); Cry10Aa4 (n.° de acceso AFB18318); similar a Cry10A (n.° de acceso DQ167578); Cry11Aa1 (n.° de acceso AAA22352); Cry11Aa2 (n.° de acceso AAA22611); Cry11Aa3 (n.° de acceso CAD30081); Cry11Aa4 (n.° de acceso AFB18319); similar a Cry11Aa (n.° de acceso DQ166531); Cry11Ba1 (n.° de acceso CAA60504); Cry11Bb1 (n.° de acceso AAC97162); Cry11Bb2 (n.° de acceso HM068615); Cry12Aa1 (n.° de acceso AAA22355); Cry13Aa1 (n.° de acceso AAA22356); Cry14Aa1 (n.° de acceso AAA21516); Cry14Ab1 (n.° de acceso KC156652); Cry15Aa1 (n.° de acceso AAA22333); Cry16Aa1 (n.° de acceso CAA63860); Cry17Aa1 (n.° de acceso CAA67841); Cry18Aa1 (n.° de acceso CAA67506); Cry18Ba1 (n.° de acceso AAF89667); Cry18Ca1 (n.° de acceso AAF89668); Cry19Aa1 (n.° de acceso CAA68875); Cry19Ba1 (n.° de acceso BAA32397); Cry19Ca1 (n.° de acceso AFM37572); Cry20Aa1 (n.° de acceso AAB93476); Cry20Ba1 (n.° de acceso ACS93601); Cry20Ba2 (n.° de acceso KC156694); similar a Cry20 (n.° de acceso GQ144333); Cry21Aa1 (n.° de acceso I32932); Cry21Aa2 (n.° de acceso I66477); Cry21Ba1 (n.° de acceso BAC06484); Cry21Ca1 (n.° de acceso JF521577); Cry21Ca2 (n.° de acceso KC156687); Cry21Da1 (n.° de acceso JF521578); Cry22Aa1 (n.° de acceso I34547); Cry22Aa2 (n.° de acceso CAD43579); Cry22Aa3 (n.° de acceso ACD93211); Cry22Ab1 (n.° de acceso AAK50456); Cry22Ab2 (n.° de acceso CAD43577); Cry22Ba1 (n.° de acceso CAD43578); Cry22Bb1 (n.° de acceso KC156672); Cry23Aa1 (n.° de acceso AAF76375); Cry24Aa1 (n.° de acceso AAC61891); Cry24Ba1 (n.° de acceso BAD32657); Cry24Ca1 (n.° de acceso CAJ43600); Cry25Aa1 (n.° de acceso AAC61892); Cry26Aa1 (n.° de acceso AAD25075); Cry27Aa1 (n.° de acceso BAA82796); Cry28Aa1 (n.° de acceso AAD24189); Cry28Aa2 (n.° de acceso AAG00235); Cry29Aa1 (n.° de acceso CAC80985); Cry30Aa1 (n.° de acceso CAC80986); Cry30Ba1 (n.° de acceso BAD00052); Cry30Ca1 (n.° de acceso BAD67157); Cry30Ca2 (n.° de acceso ACU24781); Cry30Da1 (n.° de acceso EF095955); Cry30Db1 (n.° de acceso BAE80088); Cry30Ea1 (n.° de acceso ACC95445); Cry30Ea2 (n.° de acceso FJ499389); Cry30Fa1 (n.° de acceso ACI22625); Cry30Ga1 (n.° de acceso ACG60020); Cry30Ga2 (n.° de acceso HQ638217); Cry31Aa1 (n.° de acceso BAB11757); Cry31Aa2 (n.° de acceso AAL87458); Cry31Aa3 (n.° de acceso BAE79808); Cry31Aa4 (n.° de acceso BAF32571); Cry31Aa5 (n.° de acceso BAF32572); Cry31Aa6 (n.° de acceso BAI44026); Cry31Ab1 (n.° de acceso BAE79809); Cry31Ab2 (n.° de acceso BAF32570); Cry31Ac1 (n.° de acceso BAF34368); Cry31Ac2 (n.° de acceso AB731600); Cry31Ad1 (n.° de acceso BAI44022); Cry32Aa1 (n.° de acceso AAG36711); Cry32Aa2 (n.° de acceso GU063849); Cry32Ab1 (n.° de acceso GU063850); Cry32Ba1 (n.° de acceso BAB78601); Cry32Ca1 (n.° de acceso BAB78602); Cry32Cb1 (n.° de acceso KC156708); Cry32Da1 (n.° de acceso BAB78603); Cry32Ea1 (n.° de acceso GU324274); Cry32Ea2 (n.° de acceso KC156686); Cry32Eb1 (n.° de acceso KC156663); Cry32Fa1 (n.° de acceso KC156656); Cry32Ga1 (n.° de acceso KC156657); Cry32Ha1 (n.° de acceso KC156661); Cry32Hb1 (n.° de acceso KC156666); Cry32Ia1 (n.° de acceso KC156667); Cry32Ja1 (n.° de acceso KC156685); Cry32Ka1 (n.° de acceso KC156688); Cry32La1 (n.° de acceso KC156689); Cry32Ma1 (n.° de acceso KC156690); Cry32Mb1 (n.° de acceso KC156704); Cry32Na1 (n.° de acceso KC156691); Cry32Oa1 (n.° de acceso KC156703); Cry32Pa1 (n.° de acceso KC156705); Cry32Qa1 (n.° de acceso KC156706); Cry32Ra1 (n.° de acceso KC156707); Cry32Sa1 (n.° de acceso KC156709); Cry32Ta1 (n.° de acceso KC156710); Cry32Ua1 (n.° de acceso KC156655); Cry33Aa1 (n.° de acceso AAL26871); Cry34Aa1 (n.° de acceso AAG50341); Cry34Aa2 (n.° de acceso AAK64560); Cry34Aa3 (n.° de acceso AAT29032); Cry34Aa4 (n.° de acceso AAT29030); Cry34Ab1 (n.° de acceso AAG41671); Cry34Ac1 (n.° de acceso AAG50118); Cry34Ac2 (n.° de acceso AAK64562); Cry34Ac3 (n.° de acceso AAT29029); Cry34Ba1 (n.° de acceso AAK64565); Cry34Ba2 (n.° de acceso AAT29033); Cry34Ba3 (n.° de acceso AAT29031); Cry35Aa1 (n.° de acceso AAG50342); Cry35Aa2 (n.° de acceso AAK64561); Cry35Aa3 (n.° de acceso AAT29028); Cry35Aa4 (n.° de acceso AAT29025); Cry35Ab1 (n.° de acceso AAG41672); Cry35Ab2 (n.° de acceso AAK64563); Cry35Ab3 (n.° de acceso AY536891); Cry35Ac1 (n.° de acceso AAG50117); Cry35Ba1 (n.° de acceso AAK64566); Cry35Ba2 (n.° de acceso AAT29027); Cry35Ba3 (n.° de acceso AAT29026); Cry36Aa1 (n.° de acceso AAK64558); Cry37Aa1 (n.° de acceso AAF76376 ); Cry38Aa1 (n.° de acceso AAK64559); Cry39Aa1 (n.° de acceso BAB72016); Cry40Aa1 (n.° de acceso BAB72018); Cry40Ba1 (n.° de acceso BAC77648); Cry40Ca1 (n.° de acceso EU381045); Cry40Da1 (n.° de acceso ACF15199); Cry41Aa1 (n.° de acceso BAD35157); Cry41Ab1 (n.° de acceso BAD35163); Cry41Ba1 (n.° de acceso HM461871); Cry41Ba2 (n.° de acceso ZP_04099652); Cry42Aa1 (n.° de acceso BAD35166); Cry43Aa1 (n.° de acceso BAD15301); Cry43Aa2 (n.° de acceso BAD95474); Cry43Ba1 (n.° de acceso BAD15303); Cry43Ca1 (n.° de acceso KC156676); Cry43Cb1 (n.° de acceso KC156695); Cry43Cc1 (n.° de acceso KC156696); similar a Cry43 (n.° de acceso BAD15305); Cry44Aa (n.° de acceso BAD08532); Cry45Aa (n.° de acceso e acceso (n.° de a acceso e acceso acceso acceso acceso acceso acceso acceso
Figure imgf000062_0001
acceso
BAJ05397); Cry65Aa1 (n.° de acceso HM461868); Cry65Aa2 (n.° de acceso ZP_04123838); Cry66Aa1 (n.° de acceso HM485581); Cry66Aa2 (n.° de acceso ZP_04099945); Cry67Aa1 (n.° de acceso HM485582); Cry67Aa2 (n.° de acceso ZP_04148882); Cry68Aa1 (n.° de acceso HQ113114); Cry69Aa1 (n.° de acceso HQ401006); Cry69Aa2 (n.° de acceso JQ821388); Cry69Ab1 (n.° de acceso JN209957); Cry70Aa1 (n.° de acceso JN646781); Cry70Ba1 (n.° de acceso ADO51070); Cry70Bb1 (n.° de acceso EEL67276); Cry71Aa1 (n.° de acceso JX025568); Cry72Aa1 (n.° de acceso JX025569).
Ejemplos de 6-endotoxinas también incluyen, aunque sin limitación, proteínas Cry1A de las patentes de Estados Unidos número 5.880.275, 7.858.849, 8.530.411, 8.575.433 y 8.686.233; una toxina DIG-3 o DlG-11 (eliminación N-terminal de variantes de hélice a 1 y/o hélice a 2 de proteínas cry tales como CrylA, Cry3A) de las patentes de Estados Unidos número 8.304.604, 8.304.605 y 8.476.226; Cry1 B de la solicitud de patente de Estados Unidos de número de serie 10/525.318; Cry1 C de la patente de Estados Unidos número 6.033.874; Cry1 F de las patentes de Estados Unidos número 5.188.960 y 6.218.188; quimeras Cry1A/F de las patentes de Estados Unidos número 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063);
una proteína Cry2 tal como proteína Cry2Ab de la patente de Estados Unidos número 7.064.249); una proteína Cry3A incluyendo, aunque sin limitación, una proteína insecticida híbrida manipulada (eHIP) creada fusionando combinaciones únicas de regiones variables y bloques conservados de al menos dos proteínas Cry diferentes (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0017914); una proteína Cry4; una proteína Cry5; una proteína Cry6; proteínas
Cry8 de las patentes de Estados Unidos número 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 y 7.462.760; una proteína Cry9 tal como miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F, incluyendo, aunque sin limitación, la proteína Cry9D de la patente de Estados Unidos número 8.802.933 y la proteína Cry9B de la patente de Estados Unidos número 8.802.934; una proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7145-7151; una proteína Cry22, una proteína Cry34Ab1 de las patentes de Estados Unidos número 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593; una proteína CryET33 y cryET34 de las patentes de Estados Unidos número 6.248.535, 6.326.351,6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 y 7.504.229; homólogos de CryET33 y CryET34 de la publicación de patente de Estados Unidos número 2006/0191034, 2012/0278954, y la publicación PCT número WO 2012/139004; una proteína Cry35Ab1 de las patentes de Estados Unidos número 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593; una proteína Cry46, una proteína
Cry 51, una proteína binaria Cry; una TIC901 o toxina relacionada; TIC807 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 del documento PCT US 2006/033867; toxinas TIC853 de la patente de Estados Unidos 8.513.494, AXMI-027, AXMI-036 y AXMI-038 de la patente de Estados Unidos número 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 de la patente de Estados Unidos número 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 y AXMI-021 del documento WO 2006/083891; AXMI-010 del documento WO 2005/038032; AXMI-003 del documento WO 2005/021585; AXMI-008 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0250311; AXMI-006 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0216186; AXMI-007 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0210965; AXMI-009 de la solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0210964; AXMI-014 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0197917; AXMI-004 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0197916; AXMI-028 y AXMI-029 del documento WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 y AXMI-004 del documento WO 2004/074462; AXMI-150 de la patente de Estados Unidos número 8.084.416;
AXMI-205 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 y AXMI-064 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0263488; AXMI-R1 y proteínas relacionadas de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z y AXMI225z del documento WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 y AXMI231 del documento WO 2011/103247 y la patente de Estados Unidos número 8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 y AXMI-184 de la patente de Estados Unidos número 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 y AXMI-045 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0298211; AXMI-066 y AXMI-076 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 de la patente de Estados Unidos número 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0005543, AXMI270 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US20140223598, AXMI279 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US20140223599, proteínas cry tales como Cry1A y Cry3A que tienen sitios proteolíticos modificados de la patente de Estados Unidos número 8.319.019; una proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa y Cry1Ca de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0064710. Otras proteínas Cry son bien conocidas por los expertos en la materia (véase Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), en lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). La actividad insecticida de las proteínas Cry es bien conocida por los expertos en la materia (para una revisión, véase van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). El uso de proteínas Cry como rasgos de plantas transgénicas es bien conocido por los expertos en la materia y las plantas transgénicas para Cry que incluyen, aunque sin limitación, plantas que expresan Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c y CBI-Bt han recibido la aprobación reglamentaria (véase, Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 y el CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. en cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). También puede expresarse más de una proteína plaguicida bien conocida por los expertos en la materia en plantas, tales como Vip3Ab y Cry1Fa (documento US2012/0317682); Cry1BE y Cry1F (documento US2012/0311746);
Cry1CA y Cry1AB (documento US2012/0311745); Cry1F y CryCa (documento US2012/0317681); Cry1DA y Cry1BE (documento US2012/0331590); Cry1DA y Cry1Fa (documento US2012/0331589); Cry1AB y Cry1BE (documento US2012/0324606); Cry1Fa y Cry2Aa y Cry11 y Cry1E (documento US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa (documento US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab y Cry3Aa (documento US20130167268); Cry1Ab y Cry1F (documento US20140182018); y Cry3A y Cry1Ab o Vip3Aa (documento US20130116170). Las proteínas plaguicidas también incluyen lipasas insecticidas, que incluyen acil hidrolasas de lípido de la patente de Estados Unidos número 7.491.869, y colesterol oxidasas, tales como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). . Las proteínas plaguicidas también incluyen toxinas VIP (proteínas insecticidas vegetativas) de las patentes de Estados Unidos número 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 y 8.237.020 y similares. Otras proteínas VIP son bien conocidas por los expertos en la materia (véase, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www"). Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas de complejo de toxina (TC), obtenibles de organismos tales como Xenorhabdus, Photorhabdus y Paenibacillus (véanse las patentes de Estados Unidos número 7.491.698 y 8.084.418). Algunas proteínas TC tienen actividad insecticida "independiente" y otras proteínas TC potencian la actividad de las toxinas independientes producidas por el mismo organismo dado. La toxicidad de una proteína TC "independiente" (de Photorhabdus, Xenorhabdus o Paenibacillus, por ejemplo) puede potenciarse mediante uno o más "potenciadores" de proteínas TC obtenidos de un organismo fuente de un género diferente. Hay tres tipos principales de proteínas TC. Como se denomina en el este documento, las proteínas de la clase A ("proteína A") son toxinas independientes. Las proteínas de la clase B ("proteína B") y las proteínas de la clase C ("proteína C") potencian la toxicidad de las proteínas de la clase A. Ejemplos de proteínas de la clase A son TcbA, TcdA, XptA1 y XptA2. Ejemplos de proteínas de la clase B son TcaC, TcdB, XptB1Xb y XptC1Wi. Ejemplos de proteínas de la clase C son TccC, XptC1Xb y XptB1Wi. Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas de veneno de araña, serpiente y escorpión. Ejemplos de péptidos de veneno de araña incluyen, aunque sin limitación, péptidos de licotoxina-1 y mutantes de los mismos (patente de Estados Unidos número 8.334.366).
(C) Un polinucleótido que codifica una hormona o feromona específica de insecto tal como una hormona ecdiesteroidea y juvenil, una variante de la misma, un mimético basado en la misma o un antagonista o agonista de la misma. Véase, por ejemplo, la divulgación de Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de la expresión de baculovirus de esterasa de la hormona juvenil clonada, un inactivador de la hormona juvenil.
(D) Un polinucleótido que codifica un péptido específico de insecto que, tras la expresión, altera la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véanse las divulgaciones de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (la clonación de expresión producir ADN que codifica el receptor de la hormona diurética de insecto); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res.
Comm. 163:1243 (se identifica una alostatina en Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300-310; Carlini y Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847-853 y Vasconcelos y Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. Véase también, la patente de Estados Unidos número 5.266.317 de Tomalski, et al., que divulga genes que codifican toxinas específicas de insecto.
(E) Un polinucleótido que codifica una enzima responsable de una hiperacumulación de un monoterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no proteínica con actividad insecticida.
(F) Un polinucleótido que codifica una enzima implicada en la modificación, incluyendo la modificación postraduccional, de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, una enzima glucolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una cinasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quitinasa y una glucanasa, ya sean naturales o sintéticas. Véase, la solicitud PCT WO 1993/02197 de Scott, et al., que divulga la secuencia de nucleótidos de un gen de callasa. Pueden obtenerse moléculas de ADN que contienen secuencias que codifican quitinasa, por ejemplo, de la ATCC® con los números de acceso 39637 y 67152. Véase también, Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica la quitinasa del anquilosotoma del tabaco y Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que proporcionan la secuencia de nucleótidos del gen de la poliubiquitina ubi4-2 del perejil, y las patentes de Estados Unidos número 6.563.020; 7.145.060 y 7.087.810.
(G) Un polinucleótido que codifica una molécula que estimula la transducción de señales. Por ejemplo, véase la divulgación de Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, de secuencias de nucleótidos para clones de ADN de calmodulina de soja verde, y Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que proporciona la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de calmodulina de maíz.
(H) Un polinucleótido que codifica un péptido de momento hidrófobo. Véase, la solicitud PCT WO 1995/16776 y la patente de Estados Unidos número 5.580.852 (divulgación de derivados peptídicos de Taquiplesina que inhiben patógenos fúngicos de plantas) y la solicitud PCT WO 1995/18855 y la patente de Estados Unidos número 5,607,914 (muestra péptidos antimicrobianos sintéticos que confieren resistencia a enfermedades).
(I) Un polinucleótido que codifica una permeasa de membrana, un formador de canales o un bloqueante de canales. Por ejemplo, véase la divulgación de Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expresión heteróloga de un análogos del péptido lítico cecropina-beta para hacer que las plantas de tabaco sean resistentes a Pseudomonas solanacearum.
(J) Un gen que codifica una proteína invasiva de virus o una toxina compleja derivada de la misma. Por ejemplo, la acumulación de proteínas de la cubierta vírica en células vegetales transformadas confiere resistencia a infección vírica y/o desarrollo de enfermedad provocada por el virus del que deriva el gen de la proteína de la cubierta, así como por virus relacionados. Véase, Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. Se ha conferido resistencia mediada por proteínas de la cubierta a plantas transformadas contra el virus del mosaico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino, el virus del veteado del tabaco, el virus X de la patata, el virus Y de la patata, el virus del grabado del tabaco, el virus del traqueteo del tabaco y el virus del mosaico del tabaco. Id.
(K) Un gen que codifica un anticuerpo específico de insecto o una inmunotoxina derivada del mismo. Por tanto, un anticuerpo dirigido a una función metabólica crucial en el aparato digestivo del insecto inactivaría una enzima afectada, eliminando el insecto. Véase Taylor, et al., Resumen n.° 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escocia, 1994) (inactivación enzimática en tabaco transgénico mediante la producción de fragmentos de anticuerpo monocatenarios).
(L) Un gen que codifica un anticuerpo específico de virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que muestra que plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpos recombinantes están protegidos del ataque de virus.
(M) Un polinucleótido que codifica una proteína que detiene el desarrollo producida en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Por tanto, las endo alfa-1,4-D-poligalacturonasas fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes de la planta solubilizando la homo-alfa-1,4-D-galacturonasa de la pared de las células vegetales. Véase, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. La clonación y caracterización de un gen que codifica una proteína inhibidora de la endopoligalacturonasa de la alubia se describe por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.
(N) Un polinucleótido que codifica una proteína que detiene el desarrollo producida en la naturaleza por una planta. Por ejemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305, han demostrado que plantas transgénicas que expresan el gen inactivador del ribosoma de la cebada tienen una resistencia aumentada a enfermedad fúngica.
(O) Genes implicados en la respuesta a resistencia adquirida sistémica (SAR) y/o los genes relacionados con la patogénesis. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse y Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456-64 y Somssich, (2003) Cell 113(7):815-6.
(P) Genes antifúngicos (Cornelissen y Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709-712 y Parijs, et al., (1991) Planta 183:258-264 y Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149. Véanse también, las solicitudes de patente de Estados Unidos de número de serie 09/950.933; 11/619.645; 11/657.710; 11/748.994; 11/774.121 y las patentes de Estados Unidos número 6.891.085 y 7.306.946. Cinasas similares al receptor de LysM para la percepción de fragmentos de quitina como una primera etapa en la respuesta de defensa de las plantas contra patógenos fúngicos (documento US 2012/0110696).
(Q) Genes de desintoxicación, tales como fumonisina, beauvericina, moniliformina y zearalenona y sus derivados estructuralmente relacionados. Por ejemplo, véanse, las patentes de Estados Unidos número 5.716.820; 5.792.931; 5.798.255; 5.846.812; 6.083.736; 6.538.177; 6.388.171 y 6.812.380.
(R) Un polinucleótido que codifica una cistatina e inhibidores de cisteína proteinasa. Véase, la patente de Estados Unidos número 7.205.453.
(S) Genes de defensina. Véase, el documento WO 2003/000863 y las patentes de Estados Unidos número 6.911.577; 6.855.865; 6.777.592 y 7.238.781.
(T) Genes que confieren resistencia a nematodos. Véase, por ejemplo, la solicitud PCT WO 1996/30517; la solicitud PCT WO 1993/19181, el documento WO 2003/033651 y Urwin, et al., (1998) Planta 204:472-479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327-31; las patentes de Estados Unidos número 6.284.948 y 7.301.069 y genes miR164 (documento WO 2012/058266).
(U) Genes que confieren resistente a podredumbre de las raíces de Phytophthora, tales como los genes Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 y otros genes Rps. Véase, por ejemplo, Shoemaker, et al., Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, Calif. (1995).
(V) Genes que confieren resistencia a la podredumbre parda de los tallos, tal como se describe en la patente de Estados Unidos número 5.689.035.
(W) Genes que confieren resistencia a Colletotrichum, tales como los descritos en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US 2009/0035765. Esto incluye el locus Rcg que puede utilizarse como conversión de un solo locus.
2. Transgenes que confieren resistencia a un herbicida, por ejemplo:
(A) Un polinucleótido que codifica resistencia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tal como una imidazolinona o una sulfonilurea. Genes ejemplares en esta categoría codifican la enzima ALS y AHAS mutante como se describe, por ejemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 y Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Véanse también, las patentes de Estados Unidos número 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 y 5.378.824; la solicitud de patente de Estados Unidos de número de serie 11/683.737 y la publicación internacional WO 1996/33270.
(B) Un polinucleótido que codifica una proteína para resistencia al glifosato (resistencia conferida por genes mutantes de 5-enopiruvil-3-fosfoshikimato sintasa (EPSP) y aroA, respectivamente) y otros compuestos fosfono, tales como glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferasa (PAT) y de fosfinotricina acetil transferasa de Streptomyces hygroscopicus (bar)) y ácidos piridinoxi o fenoxi propiónicos y ciclohexonas (genes que codifican el inhibidor de ACCasa). Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 4.940.835 de Shah, et al., que divulga la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia al glifosato. La patente de Estados Unidos número 5.627.061 de Barry, et al., también describe genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse también, las patentes de Estados Unidos número 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 5.094.945, 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E y 5.491.288 y las publicaciones internacionales EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 y EP 1173582. También se confiere resistencia al glifosato a plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa como se describe más completamente en las patentes de Estados Unidos número 5.776.760 y 5.463.175. Además, puede conferirse resistencia al glifosato a plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican la glifosato N-acetiltransferasa. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos número 7.462.481; 7.405.074 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número US 2008/0234130. Una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante puede obtenerse con el número de acceso a la ATCC® 39256, y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se divulga en la patente de Estados Unidos número 4.769.061 de Comai. La solicitud EP número 0333033 de Kumada, et al., y la patente de Estados Unidos número 4.975.374 de Goodman, et al., divulgan secuencias de nucleótidos de genes de la glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas tales como L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen de la fosfinotricin-acetil-transferasa se proporciona en las solicitudes EP número 0242246 y 0242236 de Leemans, et al.; De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad fosfinotricin-acetiltransferasa. Véanse también, las patentes de Estados Unidos número 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 y 5.879.903. Genes ejemplares que confieren resistencia a ácidos fenoxi propriónicos y ciclohexonas, tales como setoxidima y haloxifop, son los Acc1-S1, Acc1-S2 y Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
(C) Un polinucleótido que codifica una proteína para la resistencia a herbicidas que inhiben la fotosíntesis, tal como una triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen de la nitrilasa). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169, describen la transformación de Chlamydomonas con plásmidos que codifican genes psbA mutantes. Las secuencias de nucleótidos para genes de la nitrilasa se divulgan en la patente de Estados Unidos número 4.810.648 de Stalker y las moléculas de ADN que contienen estos genes están disponibles con los números de acceso a la ATCC® 53435, 67441 y 67442. La clonación y la expresión de un ADN que codifica una glutatión S-transferasa se describen por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.
(D) Un polinucleótido que codifica una proteína para resistencia a la acetohidroxiácido sintasa, que se ha descubierto que hace que las plantas que expresan esta enzima sean resistentes a múltiples tipos de herbicidas, se ha introducido en una diversidad de plantas (véase, por ejemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet. 246:419). Otros genes que confieren resistencia a herbicidas incluyen: un gen que codifica una proteína quimérica del citocromo P4507A1 de rata y la NADPH-citocromo P450 oxidorreductasa de levadura (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106:17), genes para la glutatión reductasa y la superóxido dismutasa (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1687) y genes para diversas fosfotransferasas (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).
(E) Un polinucleótido que codifica resistencia a un herbicida dirigido a la protoporfirinógeno oxidasa (protox) que es necesaria para la producción de clorofila. La enzima protox sirve de diana para una diversidad de compuestos herbicidas. Estos herbicidas también inhiben el crecimiento de todas las especies diferentes de plantas presentes, provocando su destrucción total. El desarrollo de plantas que contienen actividad protox alterada que son resistentes a estos herbicidas se describe en las patentes de Estados Unidos número 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 y 5.767.373 y la publicación internacional WO 2001/12825.
(F) El gen aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicidovorans) codifica la proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1). El rasgo confiere tolerancia a herbicidas de ácido 2,4-diclorofenoxiacético y ariloxifenoxipropionato (comúnmente mencionados como herbicidas "fop", tales como quizalofop). El propio gen aad-1, para la tolerancia a herbicidas en plantas, se divulgó por primer vez en el documento WO 2005/107437 (véase también, el documento US 2009/0093366). El gen aad-12, derivado de Delftia acidovorans, que codifica la proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12) que confiere tolerancia a los herbicidas de ácido 2,4-diclorofenoxiacético y piridiloxiacetato desactivando varios herbicidas con un resto ariloxialcanoato, incluyendo fenoxi auxina (por ejemplo, 2,4-D, MCPA), así como piridiloxi auxinas (por ejemplo, fluroxypyr, triclopyr).
(G) Un polinucleótido que codifica una dicamba monooxigenasa resistente a herbicida divulgado en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0135879 para conferir tolerancia a dicamba.
(H) Una molécula polinucleotídica que codifica bromoxinil nitrilasa (Bxn) divulgada en la patente de Estados Unidos número 4.810.648 para conferir resistencia al bromoxinil.
(I) Una molécula polinucleotídica que codifica fitoeno (crtl) descrita en Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833-840 y en Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481-489 para tolerancia a la norflurazona.
3. Transgenes que confieren o contribuyen a una característica de grano alterada
Tales como:
(A) Ácidos grasos alterados, por ejemplo, por
(1) Regulación por disminución de estearoil-ACP para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta. Véase, Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 y el documento WO 1999/64579 (Genes to Alter Lipid Profiles in Corn).
(2) Elevación del ácido oleico mediante modificación del gen FAD-2 y/o disminución del ácido linolénico mediante modificación del gen FAD-3 (véanse las patentes de Estados Unidos número 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 y el documento WO 1993/11245).
(3) Alteración del contenido de ácido linolénico o linoleico conjugado, tal como en el documento WO 2001/12800.
(4) Alteración de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1 ps, diversos genes Ipa tales como Ipa1, Ipa3, hpt o hggt. Por ejemplo, véanse, los documentos WO 2002/42424, WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, las patentes de Estados Unidos número 6.423.886, 6.197.561, 6.825.397 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos número US 2003/0079247, US 2003/0204870 y Rivera-Madrid, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620-5624.
(5) Genes que codifican la delta-8 desaturasa para generar ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (patentes de Estados Unidos número 8.058.571 y 8.338.152), delta-9 desaturasa para reducir las grasas saturadas (patente de Estados Unidos número 8.063.269), A6-desaturasa de Primula para mejorar los perfiles de ácidos grasos omega-3.
(6) Ácidos nucleicos aislados y proteínas asociadas con la regulación del metabolismo de lípidos y glúcidos, en particular, la proteína del metabolismo de lípidos (LMP) usada en métodos de producción de plantas transgénicas y la modulación de los niveles de compuestos de almacenamiento en las semillas incluyendo lípidos, ácidos grasos, almidones o proteínas de almacenamiento en las semillas y su uso en métodos de modulación del tamaño de las semillas, la cantidad de semillas, el peso de las semillas, la longitud de las raíces y el tamaño de las hojas de las plantas (documento EP 2404499).
(7) Alteración de la expresión de una proteína inducible de glúcidos 2 de alto nivel de expresión (HSI2) en la planta para aumentar o disminuir la expresión de HSI2 en la planta. Aumentar la expresión de HSI2 aumenta el contenido de aceite mientras que disminuir HSI2 disminuye la sensibilidad a ácido abscísico y/o aumenta al resistencia a sequía (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2012/0066794).
(8) Expresión de citocromo b5 (Cb5) en solitario o con FAD2 para modular el contenido de aceite de en la semilla de la planta, particularmente para aumentar los niveles de ácidos grasos omega-3 y mejorar la relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3 (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0191904).
(9) Moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos similares a wrinkled1 para modular el metabolismo de los glúcidos (patente de Estados Unidos número 8.217.223).
(B) Contenido de fósforo alterado, por ejemplo, por
(1) Introducción de un gen que codifica fitasa que potenciaría la degradación de fitato, que añade más fosfato libre a la planta transformada. Por ejemplo, véase, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para una divulgación de la secuencia de nucleótidos de un gen de fitasa de Aspergillus niger.
(2) Modulación de un gen que reduce el contenido de fitato. En el maíz, esto podría conseguirse, por ejemplo, clonando y después volviendo a introducir el ADN asociado con uno o más de los alelos, tales como los alelos de LPA, identificados en mutantes de maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico, tal como en el documento WO 2005/113778 y/o alterando la actividad inositol cinasa como en el documento WO 2002/059324, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2003/0009011, el documento WO 2003/027243, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2003/0079247, el documento WO 1999/05298, la patente de Estados Unidos número 6.197.561, la patente de Estados Unidos número 6.291.224, la patente de Estados Unidos número 6.391.348, el documento WO 2002/059324, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2003/0079247, el documento WO 1998/45448, el documento WO 1999/55882, el documento WO 2001/04147.
(C) Carbohidratos alterados, logrado, por ejemplo, alterando un gen para una enzima que afecta al patrón de ramificación del almidón o un gen que altera la tiorredoxina tal como NTR y/o TRX (véase la patente de Estados Unidos número 6.531.648) y/o una gamma zeína de inactivación o mutante tal como cs27 o TUSC27 o en27 (véase la patente de Estados Unidos número 6.858.778 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2005/0160488, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2005/0204418). Véase, Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol.
170:810 (secuencia de nucleótidos del gen de la fructosiltransferasa mutante de Streptococcus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (secuencia de nucleótidos del gen de la levansacarasa de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (producción de plantas transgénicas que expresan alfa-amilasa de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (secuencias de nucleótidos de genes de invertasa del tomate), Sogaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagénesis dirigida al sitio del gen de la alfa-amilasa de la cebada) y Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima II de ramificación del almidón de endosperma de maíz), documento WO 1999/10498 (digestibilidad mejorada y/o extracción de almidón mediante la modificación de UDP-D-xilosa 4-epimerasa, Fragile 1 y 2, Ref1, HCHL, C4H), patente de Estados Unidos número 6.232.529 (método de producción de semilla de alto contenido de aceite por modificación de niveles de almidón (AGP)). Los genes de modificación de ácidos grasos mencionados en este documento también pueden usarse para afectar al contenido y/o la composición del almidón mediante la interrelación de las rutas del almidón y el aceite.
(D) Alteración del contenido o la composición de antioxidantes, tal como la alteración de tocoferol o tocotrienoles.
Por ejemplo, véase, la patente de Estados Unidos número 6.787.683, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0034886 y el documento WO 2000/68393 que implican la manipulación de los niveles de antioxidantes y el documento WO 2003/082899 a través de la alteración de la homogentisato geranil geranil transferasa (hggt).
(E) Alteración de aminoácidos esenciales en las semillas. Por ejemplo, véase, la patente de Estados Unidos número 6.127.600 (método de aumento de la acumulación de aminoácidos esenciales en las semillas), la patente de Estados Unidos número 6.080.913 (métodos binarios de aumento de la acumulación de aminoácidos esenciales en las semillas), la patente de Estados Unidos número 5.990.389 (lisina elevada), el documento WO 1999/40209 (alteración de las composiciones de aminoácidos en las semillas), el documento WO 1999/29882 (métodos para alterar el contenido de aminoácidos de las proteínas), la patente de Estados Unidos número 5.850.016 (alteración de las composiciones de aminoácidos en las semillas), el documento WO 1998/20133 (proteínas con niveles potenciados de aminoácidos esenciales), la patente de Estados Unidos número 5.885.802 (metionina elevada), la patente de Estados Unidos número 5.885.801 (treonina elevada), la patente de Estados Unidos número 6.664.445 (enzimas vegetales biosintéticas de aminoácidos), la patente de Estados Unidos número 6.459.019 (lisina y treonina aumentadas), la patente de Estados Unidos número 6.441.274 (subunidad beta de la triptófano sintasa vegetal), la patente de Estados Unidos número 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), la patente de Estados Unidos número 5.939.599 (azufre elevado), la patente de Estados Unidos número 5.912.414 (metionina aumentada), el documento WO 1998/56935 (enzimas biosintéticas vegetales de aminoácidos), el documento WO 1998/45458 (proteína seminal manipulada que tiene mayor porcentaje de aminoácidos esenciales), el documento WO 1998/42831 (lisina aumentada), la patente de Estados Unidos número 5.633.436 (aumento del contenido de aminoácidos con azufre), la patente de Estados Unidos número 5.559.223 (proteínas sintéticas de almacenamiento con estructura definida que contienen niveles programables de aminoácidos esenciales para la mejora del valor nutritivo de las plantas), el documento WO 1996/01905 (treonina aumentada), el documento WO 1995/15392 (lisina aumentada), la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2003/0163838, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2003/0150014, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0068767, la patente de Estados Unidos número 6.803.498, el documento WO 2001/79516.
4. Genes que controlan la esterilidad masculina:
Hay disponibles varios métodos para conferir esterilidad masculina genética, tales como múltiples genes mutantes en ubicaciones separadas dentro del genoma que confieren esterilidad masculina, como se divulga en las patentes de Estados Unidos número 4.654.465 y 4.727.219 de Brar, et al., y translocaciones cromosómicas, como se describe por Patterson en las patentes de Estados Unidos número 3.861.709 y 3.710.511. Además de estos métodos, Albertsen, et al., patente de Estados Unidos número 5.432.068, describen un sistema de esterilidad masculina nuclear que incluye: identificar un gen que es crucial para la fertilidad masculina; silenciar este gen natural que es crucial para la fertilidad masculina; retirar el promotor natural del gen esencial para la fertilidad masculina y remplazarlo con un promotor inducible; insertar de nuevo este gen modificado por genomanipulación en la planta; y, por tanto, crear una planta que es tiene esterilidad masculina debido a que el promotor inducible no está "activado", dando como resultado que no se transcriba el gen de fertilidad masculina. La fertilidad se restablece induciendo o "activando" el promotor, lo que, a su vez, permite que se transcriba el gen que confiere fertilidad masculina.
(A) Introducción de un gen de desacetilasa bajo el control de un promotor específico del tapete y con la aplicación del producto químico N-Ac-PPT (documento WO 2001/29237).
(B) Introducción de diversos promotores específicos del estambre (documentos WO 1992/13956, WO 1992/13957).
(C) Introducción de la barnasa y el gen barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611-622).
Para ejemplos adicionales de sistemas y genes de esterilidad masculina y femenina nuclear, véanse también, las patentes de Estados Unidos número 5.859.341; 6.297.426; 5.478.369; 5.824.524; 5.850.014 y 6.265.640.
5. Genes que crean un sitio para la integración de ADN específica de sitio.
Esto incluye la introducción de sitios de FRT que pueden usarse en el sistema FLP/FRT y/o sitios Lox que pueden usarse en el sistema Cre/Loxp. Por ejemplo, véase, Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 y el documento WO 1999/25821. Otros sistemas que pueden usarse incluyen la recombinasa Gin del fago Mu (Maeser, et al., (1991) Vicki Chandler, The Maize Handbook cap. 118 (Springer-Verlag 1994), la recombinasa Pin de E. coli (Enomoto, et al., 1983) y el sistema R/RS del plásmido pSRi (Araki, et al., 1992).
6. Genes que afectan a la resistencia a la agresión abiótica
Incluyen, aunque sin limitación, desarrollo de la floración, panículas y semillas, potenciación de la eficacia de utilización del nitrógeno, sensibilidad alterada al nitrógeno, resistencia o tolerancia a la sequía, resistencia o tolerancia al frío y resistencia o tolerancia a la sal y rendimiento aumentado bajo agresión.
(A) Por ejemplo, véase: el documento WO 2000/73475 donde se altera la eficacia del uso de agua a través de alteración de malato; las patentes de Estados Unidos número 5.892.009, 5.965.705, 5.929.305, 5.891.859, 6.417.428, 6.664.446, 6.706.866, 6.717.034, 6.801.104, los documentos WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO 2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/036444, WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO 2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO 2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521.
(B) El documento WO 199938977 que describe genes, incluyendo genes CBF y factores de transcripción eficaces en la mitigación de los efectos negativos de la congelación, alta salinidad y sequía en plantas, así como para conferir otros efectos positivos al fenotipo de la planta.
(C) La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0148654 y el documento WO 2001/36596 donde se altera el ácido abscísico en las plantas, provocando un fenotipo mejorado de la planta tal como rendimiento aumentado y/o tolerancia aumentada a agresión abiótica.
(D) Los documentos WO 2000/006341, WO 2004/090143, las patentes de Estados Unidos número 7.531.723 y 6.992.237 donde se modifica la expresión de citocinina produciendo plantas con tolerancia aumentada a las agresiones, tal como tolerancia a la sequía y/o rendimiento aumentado. Véanse también, los documentos WO 2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, la patente de Estados Unidos número 6.084.153, el documento WO 2001/64898, la patente de Estados Unidos número 6.177.275 y la patente de Estados Unidos número 6.107.547 (potenciación de la utilización de nitrógeno y sensibilidad alterada al nitrógeno).
(E) Para la alteración de etileno, véase, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0128719, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2003/0166197 y el documento WO 2000/32761.
(F) Para factores de transcripción o reguladores transcripcionales de plantas de agresión abiótica, véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0098764 o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2004/0078852.
(G) Genes que aumentan la expresión de pirofosfatasa vacuolar, tal como AVP1 (patente de Estados Unidos número 8.058.515) para un rendimiento aumentado; ácido nucleico que codifica los polipéptidos HSFA4 o HSFA5 (factor de choque térmico de la clase A4 o A5), un polipéptido de proteína transportadora de oligopéptidos (similar a OPT4); un polipéptido similar a plastochron2 (similar a PLA2) o un polipéptido similar a homeosecuencia-1 relacionada con Wuschel (similar a WOX1) (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número US 2011/0283420).
(H) Regulación por disminución de polinucleótidos que codifican proteínas poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) para modular la muerte celular programadas (patente de Estados Unidos número 8.058.510) para un vigor aumentado.
(I) Polinucleótido que codifica polipéptidos DTP21 para conferir resistencia a sequía (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número US 2011/0277181).
(J) Secuencias de nucleótidos que codifican proteínas ACC sintasa 3 (ACS3) para modular el desarrollo, modular la respuesta a las agresiones y modular la tolerancia a las agresiones (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número US 2010/0287669).
(K) Polinucleótidos que codifican proteínas que confieren un fenotipo de tolerancia a sequía (DTP) para conferir resistencia a sequía (documento WO 2012/058528).
(L) Genes de tocoferol ciclasa (TC) para conferir tolerancia a sequía y salinidad (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2012/0272352).
(M) Proteínas de la familia de CAAX aminoterminal para tolerancia a agresiones (patente de Estados Unidos número 8.338.661).
(N) Mutaciones en el gen que codifica SAL1 tienen tolerancia aumentada a las agresiones, incluyendo resistencia aumentada a sequía (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0257633).
(O) Expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: polipéptido GRF, polipéptido similar a RAA1, polipéptido SYR, polipéptido ARKL y polipéptido y Tp que aumentan los rasgos relacionados con el rendimiento (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2011/0061133).
(P) Modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de trehalosa fosfato fosfatasa (TPP) de la clase III para potenciar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, particularmente aumentar el rendimiento de las semillas (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0024067).
(Q) Expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fenotipo tolerante a sequía (DTP6), específicamente AT-DTP6 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número US-2014/0223595.
Otros genes y factores de transcripción que afectan al crecimiento de las plantas y rasgos agronómicos, tales como rendimiento, floración, crecimiento de la planta y/o estructura de la planta, pueden introducirse o someterse a introgresión en plantas, véanse, por ejemplo, los documentos WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339 y la patente de Estados Unidos número 6.573.430 (TFL), la patente de Estados Unidos número 6.713.663 (FT), los documentos WO 1996/14414 (CON), WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FR1), WO 1997/29123, la patente de Estados Unidos número 6.794.560, la patente de Estados Unidos número 6.307.126 (GAI), el documento WO 1999/09174 (D8 y Rht) y los documentos WO 2004/076638 y WO 2004/031349 (factores de transcripción).
. Genes que confieren rendimiento aumentado
(A) Una planta de cultivo transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminasa (ACCDP), en la que la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta de cultivo provoca el crecimiento aumentado de las raíces de la planta y/o rendimiento aumentado y/o tolerancia aumentada a las agresiones ambientales en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta (patente de Estados Unidos número 8.097.769).
(B) La sobreexpresión del gen de proteína con dedos de cinc de maíz (Zm-ZFP1) usando un promotor preferido de semillas ha demostrado potenciar el crecimiento de la planta, aumentar el número de granos y el peso total de granos por planta (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2012/0079623).
(C) La sobreexpresión constitutiva de la proteína de dominio de límites de órganos laterales (LOB) (Zm-LOBDP1) ha demostrado aumentar el número de granos y el peso total de granos por planta (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2012/0079622).
(D) Potenciación de rasgos relacionados con el rendimiento en plantas modulando la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a VIM1 (variante en metilación 1) o un polipéptido similar a VTC2 (GDP-L-galactosa fosforilasa) o un polipéptido DUF1685 o un polipéptido similar a ARF6 (factor sensible a auxinas) (documento WO 2012/038893).
(E) La modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a Ste20 o un homólogo del mismo proporciona plantas que tienen rendimiento aumentado con respecto a plantas de control (documento EP 2431472).
(F) Genes que codifican polipéptidos de la nucleósido difosfatasa cinasa (NDK) y homólogos de los mismos para modificar la arquitectura de las raíces de la planta (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 2009/0064373).
8. Genes que confieren digestibilidad de la planta.
(A) Alteración del nivel de xilano presente en la pared celular de una planta modulando la expresión de xilano sintasa (patente de Estados Unidos número 8.173.866).
En algunos aspectos, el rasgo apilado puede ser un rasgo o evento que ha recibido la aprobación reglamentaria incluyendo, aunque sin limitación, los eventos de la tabla 4A - 4F.
Tabla 4A Oryza sativa Arroz
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Tabla 4B Medicago sativa Alfalfa
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Tabla 4C Triticum aestivum Trigo
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Tabla 4D Helianthus annuus Girasol
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Tabla 4E Glycine max L. Soja
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Tabla 4F Zea mays L. Maíz
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Otros eventos con aprobación reglamentaria son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden encontrarse en el Center for Environmental Risk Assessment (cera-gmc.org/?action=gm_crop_database, al que se puede acceder usando el prefijo www) y en el International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, al que se puede acceder usando el prefijo www).
Silenciamiento génico
En algunos aspectos, el rasgo apilado puede estar en forma de silenciamiento de uno o más polinucleótidos de interés, que provoca la supresión de uno o más polipéptidos de la plaga diana. En algunos aspectos, el silenciamiento se consigue a través del uso de una construcción de ADN de supresión.
En algunos aspectos, puede apilarse uno o más polinucleótidos que codifican los polipéptidos de los polipéptidos PIP-72 o fragmentos o variantes de los mismos con uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tienen actividad insecticida o rasgos agronómicos como se expone anteriormente y opcionalmente pueden incluir además uno o más polinucleótidos que proporcionan silenciamiento génico de uno o más polinucleótidos diana como se analiza posteriormente.
"Construcción de ADN de supresión" es una construcción de ADN recombinante que, cuando se transforma o se integra de forma estable en el genoma de la planta, provoca el "silenciamiento" de un gen diana en la planta. El gen diana puede ser endógeno o transgénico para la planta. "Silenciamiento", como se usa en este documento, con respecto al gen diana, se refiere en general a la supresión de los niveles de ARNm o proteína/enzima expresada por el gen diana, y/o el nivel de la actividad enzimática o funcionalidad de la proteína. El término "supresión" incluye rebajar, reducir, descender, disminuir, inhibir, eliminar y evitar. "Silenciamiento" o "silenciamiento génico" no especifica el mecanismo y es inclusivo, y no limitado a, estrategias de antisentido, cosupresión, supresión vírica, supresión en horquilla, supresión en tallo-bucle, estrategias basadas en iARN y basadas en ARN pequeño.
Una construcción de ADN de supresión puede comprender una región derivada de un gen diana de interés y puede comprender la totalidad o parte de la secuencia de ácido nucleico del hebra de sentido (o hebra de antisentido) del gen diana de interés. Dependiendo de la estrategia a utilizar, la región puede ser un 100 % idéntica o menos de un 100 % idéntica (por ejemplo, al menos un 50 % o cualquier número entero entre un 51 % y un 100% idéntica) a la totalidad o parte de la hebra de sentido (o hebra de antisentido) del gen de interés.
Las construcciones de ADN de supresión son bien conocidas en la técnica, se construyen fácilmente una vez que se ha seleccionado el gen diana de interés e incluyen, sin limitación, construcciones de cosupresión, construcciones de antisentido, construcciones de supresión vírica, construcciones de supresión en horquilla, construcciones de supresión en tallo-bucle, construcciones productoras de ARN bicatenario y, de manera más general, construcciones de iARN (interferencia de ARN) y construcciones de ARN pequeño, tales como construcciones de ARNip (ARN interferente pequeño) y construcciones de miARN (microARN).
"Inhibición de antisentido" se refiere a la producción de transcritos de ARN de antisentido que pueden suprimir la expresión de la proteína diana.
"ARN de antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a la totalidad o parte de un transcrito primario diana o ARNm y que bloquea la expresión de un fragmento de ácido nucleico aislado diana (patente de Estados Unidos número 5.107.065). La complementariedad de un ARN de antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito génico específico, es decir, en la secuencia no codificante 5', la secuencia no codificante 3', intrones o la secuencia codificante.
"Cosupresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN de sentido que pueden suprimir la expresión de la proteína diana. ARN "de sentido" se refiere a un transcrito de ARN que incluye el ARNm y puede traducirse en proteína dentro de una célula o in vitro. Se han diseñado previamente construcciones de cosupresión en plantas centrándose en la sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con un ARNm natural, en la orientación de sentido, que provoca la reducción de todo el ARN que tiene homología con la secuencia sobreexpresada (véase, Vaucheret, et al., (1998) Plant J. 16:651-659 y Gura, (2000) Nature 404:804-808).
Otra variación describe el uso de secuencias víricas de las plantas para dirigir la supresión de secuencias codificantes de ARNm proximales (publicación PCT WO 1998/36083).
Un trabajo reciente ha descrito el uso de estructuras "en horquilla" que incorporan la totalidad o parte de una secuencia codificante de ARNm en una orientación complementaria que produce una posible estructura de "tallo-bucle" para el ARN expresado (publicación PCT WO 1999/53050). En este caso, el tallo se forma por los polinucleótidos correspondientes al gen de interés insertados en la orientación de sentido o de antisentido con respecto al promotor y el bucle se forma por algunos polinucleótidos del gen de interés, que no tienen un complemento en la construcción. Esto aumenta la frecuencia de cosupresión o silenciamiento en las plantas transgénicas recuperadas. Para una revisión de la supresión en horquilla, véase, Wesley, et al., (2003) Methods in Molecular Biology, Plant Functional Genomics: Methods and Protocols 236:273-286.
Una construcción donde el tallo se forma por al menos 30 nucleótidos de un gen a suprimir y el bucle se forma por una secuencia de nucleótidos aleatoria, también se ha usado de forma eficaz para supresión (publicación PCT WO 1999/61632).
También se ha descrito el uso de secuencias de poli-T y poli-A para generar el tallo en la estructura de tallobucle (publicación PCT WO 2002/00894).
Otra variación más incluye el uso de repeticiones sintéticas para promover la formación de un tallo en la estructura de tallo-bucle. Los organismos transgénicos preparados con dichos fragmentos de ADN recombinante han demostrado tener niveles reducidos de la proteína codificada por el fragmento de nucleótidos que forma el bucle, como se describe en la publicación PCT WO 2002/00904.
La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales, mediado por ARN interferentes pequeños (ARNip) (Fire, et al., (1998) Nature 391:806). El proceso correspondiente en plantas se denomina normalmente silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) o silenciamiento de ARN y también se denomina disipación en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente usado para evitar la expresión de genes exógenos y está habitualmente compartido por diversas plantas y filos (Fire, et al., (1999) Trends Genet. 15:358). 15:358). Dicha protección contra la expresión de genes exógenos puede haber evolucionado en respuesta a la producción de ARN bicatenarios (ARNbc) derivados de infección vírica o de la integración aleatoria de elementos de transposón en un genoma hospedador mediante una respuesta celular que destruye específicamente el ARN monocatenario homólogo del ARN genómico vírico. La presencia de ARNbc en células activa la respuesta de iARN a través de un mecanismo que aún tiene que caracterizarse completamente.
La presencia de ARNbc largos en las células estimula la actividad de la enzima ribonucleasa III mencionada como dicer. Dicer está implicada en el procesamiento del ARNbc en trozos pequeños de ARNbc conocidos como ARN interferentes pequeños (ARNip) (Berstein, et al., (2001) Nature 409:363). Los ARN interferentes pequeños derivados de la actividad de dicer típicamente son de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden estructuras bicatenarias de aproximadamente 19 pares de bases (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Dicer también se ha implicado en la escisión de ARN temporales pequeños (ARNtp) de 21 y 22 nucleótidos del ARN precursor de estructura conservada que están implicados en el control traduccional (Hutvagner, et al., (2001) Science 293:834). La respuesta de iARN también ofrece un complejo de endonucleasa, normalmente mencionado como complejo se silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la escisión de ARN monocatenario que tiene complementariedad de secuencia con la hebra de antisentido de la estructura bicatenaria del ARNip. La escisión del ARN diana tiene lugar en el centro de la región complementaria a la hebra de antisentido de la estructura bicatenaria del ARNip (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Además, la interferencia de ARN también puede implicar silenciamiento génico mediado por ARN pequeño (por ejemplo, miARN), supuestamente a través de mecanismos celulares que regulan la estructura de la cromatina y de ese modo evitan la transcripción de secuencias génicas diana (véase, por ejemplo, Allshire, (2002) Science 297:1818-1819; Volpe, et al., (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein, (2002) Science 297:2215-2218 y Hall, et al., (2002) Science 297:2232-2237). Por tanto, las moléculas de miARN de la divulgación pueden usarse para mediar el silenciamiento génico mediante interacción con transcritos de ARN o, como alternativa, mediante interacción con secuencias génicas particulares, en las que dicha interacción provoca el silenciamiento génico a nivel transcripcional o postranscripcional.
En este documento se describen además métodos y composiciones que permiten un aumento en la iARN producida a partir del elemento de silenciamiento. En dichos aspectos, los métodos y composiciones emplean un primer polinucleótido que comprende un elemento de silenciamiento para una secuencia de la plaga diana unida de forma funcional a un promotor activo en la célula vegetal; y un segundo polinucleótido que comprende un elemento potenciador supresor que comprende la secuencia de la plaga diana o una variante activa o fragmento del mismo unido de forma funcional a un promotor activo en la célula vegetal. La expresión combinada del elemento de silenciamiento con el elemento potenciador supresor da lugar a una amplificación aumentada del ARN inhibidor producido a partir del elemento de silenciamiento sobre la que puede conseguirse con solamente la expresión del elemento de silenciamiento en solitario. Además de la amplificación aumentada de la propia especie de iARN específica, los métodos y composiciones permiten además la producción de una población diversa de especies de iARN que puede potenciar la eficacia de alteración de la expresión del gen diana. Por tanto, cuando el elemento potenciador supresor se expresa en una célula vegetal en combinación con el elemento de silenciamiento, los métodos y composición pueden permitir la producción sistémica de iARN en toda la planta; la producción de cantidades mayores de iARN a las que se observarían con solamente la construcción del elemento de silenciamiento en solitario; y la carga mejorada de iARN en el floema de la planta, proporcionando, por tanto, mejor control de los insectos que se alimentan del floema mediante una estrategia de iARN. Por tanto, los diversos métodos y composiciones proporcionan métodos mejorados para el suministro de ARN inhibidor al organismo diana. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2009/0188008.
Como se usa en este documento, un "elemento potenciador supresor" comprende un polinucleótido que comprende la secuencia diana a suprimir o un fragmento activo o variante del misma. Se reconoce que el elemento potenciador supresor no tiene que ser idéntico a la secuencia diana, sino que, en su lugar, el elemento potenciador supresor puede comprender una variante de la secuencia diana, siempre que el elemento potenciador supresor tenga suficiente identidad de secuencia con la secuencia diana para permitir un nivel aumentado de la iARN producida por el elemento de silenciamiento sobre el que puede conseguirse con solamente la expresión del elemento de silenciamiento. Asimismo, el elemento potenciador supresor puede comprender un fragmento de la secuencia diana, en el que el fragmento es de suficiente longitud para permitir un nivel aumentado de la iARN producida por el elemento de silenciamiento sobre el que puede conseguirse con solamente la expresión del elemento de silenciamiento.
Se reconoce que pueden emplearse múltiples elementos potenciadores supresores a partir de la misma secuencia diana o a partir de diferentes secuencias diana o a partir de diferentes regiones de la misma secuencia diana. Por ejemplo, los elementos potenciadores supresores empleados pueden comprender fragmentos de la secuencia diana obtenidos de diferentes regiones de la secuencia diana (es decir, de la 3' UTR, secuencia codificante, intrón y/o 5' UTR). Además, el elemento potenciador supresor puede estar contenido en un casete de expresión, como se describe en otra parte en este documento, y en aspectos específicos, el elemento potenciador supresor está en el mismo vector o construcción de ADN o en uno diferente que el elemento de silenciamiento. El elemento potenciador supresor puede estar unido de forma funcional a un promotor como se divulga en este documento. Se reconoce que el elemento potenciador supresor puede expresarse de forma constitutiva o, como alternativa, puede producirse de una manera específica de estadio empleando los diversos promotores inducibles o preferidos de tejido o regulados por el desarrollo que se analizan en otra parte en este documento.
En aspectos específicos, empleando tanto un elemento de silenciamiento como el elemento potenciador supresor, se produce producción sistémica de iARN en toda la planta completa. En aspectos adicionales, la planta o partes de la planta de la divulgación tienen una carga mejorada de iARN en el floema de la planta de lo que se observaría con la expresión de la construcción del elemento de silenciamiento en solitario y, por tanto, proporciona mejor control de los insectos que se alimentan del floema mediante una estrategia de iARN. En aspectos específicos, las plantas, partes de la planta y células vegetales de la divulgación pueden caracterizarse además por permitir la producción de una diversidad de especies de iARN que pueden potenciar la eficacia de alteración de la expresión del gen diana.
En aspectos específicos, la expresión combinada del elemento de silenciamiento y el elemento potenciador supresor aumenta la concentración del ARN inhibidor en la célula vegetal, la planta, la parte de la planta, el tejido vegetal 0 el floema sobre el nivel que se consigue cuando el elemento de silenciamiento se expresa en solitario.
Como se usa en este documento, un "nivel aumentado de ARN inhibidor" comprende cualquier aumento estadísticamente significativo en el nivel de iARN producido en una planta que tiene la expresión combinada en comparación con una planta de control apropiada. Por ejemplo, un aumento en el nivel de iARN en la planta, la parte de la planta o la célula vegetal puede comprender al menos un aumento de aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 1 %-5 %, aproximadamente un 5 %-10 %, aproximadamente un 10 %-20 %, aproximadamente un 20 %-30 %, aproximadamente un 30 %-40 %, aproximadamente un 40 %-50 %, aproximadamente un 50 %-60 %, aproximadamente un 60-70 %, aproximadamente un 70 %-80 %, aproximadamente un 80 %-90 %, aproximadamente un 90 %-100 % o mayor en el nivel de iARN en la planta, la parte de la planta, la célula vegetal o el floema cuando se compara con un control apropiado. En otros aspectos, el aumento en el nivel de iARN en la planta, la parte de la planta, la célula vegetal o el floema puede comprender al menos un aumento de aproximadamente 1 vez, aproximadamente 1 vez-5 veces, aproximadamente 5 veces-10 veces, aproximadamente 10 veces-20 veces, aproximadamente 20 veces-30 veces, aproximadamente 30 veces-40 veces, aproximadamente 40 veces-50 veces, aproximadamente 50 veces-60 veces, aproximadamente 60 veces-70 veces, aproximadamente 70 veces-80 veces, aproximadamente 80 veces-90 veces, aproximadamente 90 veces-100 veces o mayor en el nivel de iARN en la planta, la parte de la planta, la célula vegetal o el floema cuando se compara con un control apropiado. Pueden encontrarse ejemplos de expresión combinada del elemento de silenciamiento con el elemento potenciador supresor para el control de chinches y Lygus en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2011/0301223 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2009/0192117.
Algunos aspectos se refieren a la regulación por disminución de la expresión de genes diana en especies de plagas de insectos mediante moléculas de ácido ribonucleico (ARN) interferente. La publicación PCT WO 2007/074405 describe métodos de inhibición de la expresión de genes diana en plagas de invertebrados que incluyen el escarabajo de la patata de Colorado. La publicación PCT WO 2005/110068 describe métodos de inhibición de la expresión de genes diana en plagas de invertebrados que incluyen en particular el gusano de la raíz del maíz occidental como un medio para controlar la infestación por insectos. Además, la publicación PCT WO 2009/091864 describe composiciones y métodos para la supresión de genes diana de especies de plagas de insectos que incluyen plagas del género Lygus. Moléculas de ácido nucleico que incluyen iARN para dirigir la subunidad H de la ATPasa vacuolar, útil para controlar una población e infestación de plaga de coleópteros como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2012/0198586. La publicación PCT WO 2012/055982 describe ácido ribonucleico (ARN o a Rn bicatenario) que inhibe o regula por disminución la expresión de un gen diana que codifica: una proteína ribosómica de insecto tal como la proteína ribosómica L19, la proteína ribosómica L40 o la proteína ribosómica S27A; una subunidad del proteasoma de insecto tal como la proteína Rpn6, la proteína Pros 25, la proteína Rpn2, la proteína de la subunidad beta 1 del proteasoma o la proteína Pros beta 2; un p-coatómero de insecto de la vesícula COPI, el Y-coatómero de la vesícula COPi, la proteína de p'-coatómero o el Z-coatómero de la vesícula COPI; una proteína Tetraspanina 2 A de insecto que es una proteína del dominio transmembranario putativo; una proteína de insecto que pertenece a la familia de la actina tal como Actina 5C; una proteína ubiquitina-5E de insecto; una proteína Sec23 de insecto que es un activador de GTPasa implicado en el transporte de proteínas intracelulares; una proteína crinkled de insecto que es una miosina no convencional que está implicada en la actividad motora; una proteína crooked neck de insecto que está implicada en la regulación del empalme alternativo nuclear del ARNm; una proteína de subunidad G de H+-ATPasa vacuolar de insecto y una Tbp-1 de insecto tal como la proteína de unión a Tat. Las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2012/029750, US 20120297501 y 2012/0322660 describen ácidos ribonucleicos interferentes (ARN o ARN bicatenario) que funcionan tras la captación por una especie de plaga de insectos para regular por disminución la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en los que el ARN comprende al menos un elemento de silenciamiento, en los que el elemento de silenciamiento es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, comprendiendo o consistiendo una hebra en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2012/0164205 describe posibles dianas para ácidos ribonucleicos bicatenarios interferentes para inhibir plagas de invertebrados incluyendo: una secuencia homóloga de Chd3, una secuencia homóloga de beta-tubulina, una secuencia homóloga de la V-ATPasa de 40 kDa, una secuencia homóloga de EF1a, una secuencia homóloga de la subunidad p28 del proteasoma 26S, una secuencia homóloga de la hormona juvenil epóxido hidrolasa, una secuencia homóloga de la proteína del canal de cloruro dependiente de hinchamiento, una secuencia homóloga de la proteína glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, una secuencia homóloga de la proteína Act42A, una secuencia homóloga del factor 1 de ADP-ribosilación, una secuencia homóloga de la proteína del factor de transcripción IIB, una secuencia homóloga de la quitinasa, una secuencia homóloga de la enzima de conjugación con ubiquitina, una secuencia homóloga de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una secuencia homóloga de la ubiquitina B, un homólogo de la hormona juvenil esterasa y una secuencia homóloga de la alfa tubulina. La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2009/0192117 describe la supresión de polinucleótidos diana de Lygus.
Uso en el control plaguicida
En la técnica son conocidos métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de ácido nucleico de los aspectos o una variante de la misma, en el control plaguicida o en la manipulación de otros organismos como agentes plaguicidas. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.
Pueden seleccionarse microorganismos hospedadores que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan porque pueden competir satisfactoriamente en el entorno particular con los microorganismos de tipo silvestre, proporcionar mantenimiento estable y expresión del gen que expresa el polipéptido PIP-72 y, de forma deseable, proporcionar protección mejorada del plaguicida contra la degradación ambiental e inactivación.
Dichos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de particular interés microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes, hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de particular interés especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacterxyli y Azotobacter vinelandii y especies de levaduras de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son de particular interés los microorganismos pigmentados. Organismos hospedadores de particular interés incluyen levaduras, tales como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (tal como S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., organismos del filoplano tales como Pseudomonas spp. (tales como P. aeruginosa, P. fluorescens, P. chlororaphis), Erwinia spp. y Flavobacterium spp., y otros de dichos organismos, incluyendo Agrobacterium tumefaciens, E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus y similares.
Pueden introducirse genes que codifican los polipéptidos PIP-72 de los aspectos en microorganismos que se multiplican en plantas (epífitos) para suministrar los polipéptidos PIP-72 contra posibles plagas diana. Los epífitos pueden ser, por ejemplo, bacterias grampositivas o gramnegativas.
Pueden aislarse bacterias que colonizan las raíces, por ejemplo, de la planta de interés por métodos conocidos en la técnica. Específicamente, una cepa de Bacillus cereus que coloniza las raíces puede aislarse de las raíces de una planta (véase, por ejemplo, Handelsman et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Pueden introducirse genes que codifican los polipéptidos PIP-72 de los aspectos en un Bacillus cereus que coloniza las raíces por métodos convencionales conocidos en la técnica.
Pueden introducirse genes que codifican polipéptidos PIP-72, por ejemplo, en el Bacillus que coloniza las raíces por medio de electrotransformación. Específicamente, pueden clonarse genes que codifican los polipéptidos PIP-72 en un vector lanzadera, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius, et al., (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218. El vector lanzadera pHT3101 que contiene la secuencia codificante de gen del polipéptido PIP-72 particular puede transformarse, por ejemplo, en el Bacillus que coloniza las raíces por medio de electroporación (Lerecius, et al., (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218).
Pueden diseñarse sistemas de expresión de modo que los polipéptidos PIP-72 se secreten fuera del citoplasma de bacterias gramnegativas, tales como E. coli, por ejemplo. Ventajas de tener polipéptidos PIP-72 secretados son: (1) elusión de los posibles efectos citotóxicos del polipéptido PIP-72 expresado; y (2) mejora en la eficacia de purificación del polipéptido PIP-72 incluyendo, aunque sin limitación, eficacia aumentada en la recuperación y purificación de la proteína por volumen de caldo celular y tiempo y/o costes disminuidos de recuperación y purificación por proteína unitaria.
Los polipéptido PIP-72 pueden prepararse para que se secreten en E. coli, por ejemplo, fusionando un péptido señal de E. coli apropiado al extremo aminoterminal del polipéptido PIP-72. Los péptidos señal reconocidos por E. coli pueden encontrarse en proteínas que ya se sabe que se secretan en E. coli, por ejemplo, la proteína OmpA (Ghrayeb, et al., (1984) EMBO J, 3:2437-2442). OmpA es una proteína principal de la membrana externa de E. coli y, por tanto, se cree que su péptido señal es eficaz en el proceso de translocación. Además, el péptido señal de OmpA no tiene que modificarse antes del procesamiento como puede ser el caso para otros péptidos señal, por ejemplo, el péptido señal de la lipoproteína (Duffaud, et al., (1987) Meth. Enzymol. 153:492).
Los polipéptidos PIP-72 de los aspectos pueden fermentarse en un hospedador bacteriano y las bacterias resultantes pueden procesarse y usarse como pulverización microbiana de la misma manera que las cepas Bt se han usado como pulverizaciones insecticidas. En el caso de uno o más polipéptidos PIP-72 que se secreten de Bacillus, la señal de secreción se retira o se muta usando procedimientos conocidos en la técnica. Dichas mutaciones y/o eliminaciones evitan la secreción del polipéptido o polipéptidos PIP-72 en el medio de cultivo durante el proceso de fermentación. Los polipéptidos PIP-72 se retienen dentro de la célula, y las células entonces se procesan para producir los polipéptidos PIP-72 encapsulados. A este efecto, puede usarse cualquier microorganismo adecuado. Pseudomonas se ha usado para expresar toxinas Bt como proteínas encapsuladas y las células resultantes se han procesado y pulverizado como un insecticida (Gaertner, et al., (1993), en: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).
Como alternativa, los polipéptidos PIP-72 se producen introduciendo un gen heterólogo en un hospedador celular. La expresión del gen heterólogo da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. Estas células entonces se tratan en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la plaga o plagas diana. El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos polipéptidos PIP-72 encapsulados de forma natural entonces pueden formularse de acuerdo con técnicas convencionales para su aplicación al entorno hospedador de una plaga diana, por ejemplo, suelo, agua y follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, el documento EPA 0192319 y las referencias citadas en el mismo.
Composiciones plaguicidas
En algunos aspectos, los ingredientes activos pueden aplicarse en forma de composiciones y pueden aplicarse al área de cultivo o planta a tratar, de forma simultánea o en sucesión con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites inactivos, polímeros y/o formulaciones de liberación prolongada o de vehículo biodegradable que permiten dosificación a largo plazo de un área diana después de una sola aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, viricidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con vehículos adicionales aceptables desde el punto de vista agrícola, tensioactivos o adyuvantes que promueven la aplicación empleados normalmente en la técnica de formulación. Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias habitualmente empleadas en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, adhesivos, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones pueden prepararse en "cebos" comestibles o modelarse en "trampas" de plagas para permitir la alimentación o ingesta por una plaga diana de la formulación plaguicida.
Los métodos de aplicación de un ingrediente activo o una composición agroquímica que contiene al menos uno de los polipéptidos PIP-72 producidos por las cepas bacterianas incluyen aplicación foliar, recubrimiento de semillas y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.
La composición puede formularse como un polvo, polvo fino, bolita, gránulo, pulverización, emulsión, coloide, solución o similares, y puede prepararse por medios convencionales tales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido. En todas estas composiciones que contienen al menos uno de estos polipéptidos plaguicidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 99 % en peso.
Las plagas de lepidópteros, dípteros, heterópteros, nematodos, hemípteros o coleópteros pueden eliminarse o reducirse en número en un área dada por los métodos de la divulgación o pueden aplicarse de forma profiláctica a un área del entorno para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente, la plaga ingiere o entra en contacto con una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido. "Cantidad eficaz como plaguicida", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad del plaguicida que puede provocar la muerte a al menos una plaga o reducir de forma apreciable el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas diana específicas a controlar, el entorno específico, la localización, la planta, el cultivo o el terreno agrícola a tratar, las condiciones ambientales y el método, la tasa, la concentración, la estabilidad y la cantidad de aplicación de la composición de polipéptido eficaz como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación por la plaga.
Las composiciones plaguicidas descritas pueden prepararse formulando la célula bacteriana, la suspensión de cristales y/o esporas o el componente proteínico aislado con el vehículo agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones pueden formularse antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizado, secado por congelación, desecado o en un vehículo acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un polvo fino o material granular o una suspensión en aceite (vegetal o mineral) o agua o emulsiones de aceite/agua o como un polvo humectable o en combinación con cualquier otro material de vehículo adecuado para aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. La expresión "vehículo agrícolamente aceptable" cubre todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, adhesivos, aglutinantes, etc. que se usan normalmente en la tecnología de formulación de plaguicidas; estos son bien conocidos por los expertos en la formulación de plaguicidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, por mezcla homogénea, combinación y/o molienda de la composición plaguicida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Se describen formulaciones adecuadas y métodos de aplicación en la patente de Estados Unidos número 6.468.523. Las plantas también pueden tratarse con una o más composiciones químicas, que incluyen uno o más herbicidas, insecticidas o fungicidas. Composiciones químicas ejemplares incluyen: Herbicidas para frutos/hortalizas: Atrazina, Bromacil, Diurón, Glifosato, Linurón, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halosulfurón Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfurón, Indaziflam; Insecticidas para frutos/hortalizas: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifós, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinón, Malatión, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novalurón, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefurano, Fluacripirim, Tolfenpirad, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gamma-cihalotrina, Espiromesifeno, Spinosad, Rynaxypyr, Cyazypyr, Spinoteram, Triflumurón, Spirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Spinetoram, Tiodicarb, Flonicamid, Metiocarb, Emamectina-benzoato, Indoxacarb, Fortiazato, Fenamifós, Cadusafós, Piriproxifeno, óxido de Fenbutatín, Hextiazox, Metomil, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; Fungicidas para frutos/hortalizas: Carbendazim, Clorotalonil, EBDC, azufre, Tiofanato-metilo, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Kresoxim-metilo, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobina, Fenhexamid, fumarato de oxpoconazol, Ciazofamid, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamid, Boscalid; Herbicidas para cereales: Isoproturón, Bromoxinil, Ioxinil, Fenoxies, Clorsulfurón, Clodinafop, Diclofop, Diflufenicán, Fenoxaprop, Florasulam, Fluoroxypyr, Metsulfurón, Triasulfurón, Flucarbazona, Iodosulfurón, Propoxicarbazona, Picolinafeno, Mesosulfurón, Beflubutamid, Pinoxadén, Amidosulfurón, Tifensulfurón metilo, Tribenurón, Flupirsulfurón, Sulfosulfurón, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxasulfona; Fungicidas para cereales: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Kresoxim-metilo, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Insecticidas para cereales: Dimetoato, Lambda-cihaltrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, p-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurán, Clorphirifós, Metamidofós, Oxidemetón-metilo, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas para el maíz: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralid, (S-) Dimetenamid, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfurón, Primisulfurón, Rimsulfurón, Sulcotriona, Foramsulfurón, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfón; Insecticidas para el maíz: Carbofurano, Clorpirifós, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprid, Lambda-Cihalotrina, Teflutrina, Terbufós, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumurón, Rynaxypyr, Deltametrina, Tiodicarb, p-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenurón, Triflumorón, Teflutrina,Tebupirimfós, Etiprol, Cyazypyr, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurán, Avermectina, Metiocarb, Espirodiclofeno, Spirotetramat; Fungicidas para el maíz: Fenitropán, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas para el arroz: Butacloro, Propanil, Azimsulfurón, Bensulfurón, Cyhalofop, Daimurón, Fentrazamida, Imazosulfurón, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfurón, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofán, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfurón, Oxaziclomefona, Benzobiciclón, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfurón, Pretilacloro, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfán; Insecticidas para el arroz: Diazinón, Fenitrotión, Fenobucarb, Monocrotofós, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurán, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefurán, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rynaxypyr, Deltametrina, Acetamiprid, Tiametoxam, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifós, Cartap, Metamidofós, Etofenprox, Triazofós, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas para el arroz: Tiofanato-metilo, Azoxistrobina, Carpropamid, Edifenfós, Ferimzona, Iprobenfós, Isoprotiolano, Pencicurón, Probenazol, Piroquilón, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocymet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas para el algodón: Diurón, Fluometurón, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butilo, Glifosato, Norflurazón, Pendimetalina, Piritiobac-sodio, Trifloxisulfurón, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazurón; Insecticidas para el algodón: Acefato, Aldicarb, Clorpirifós, Cipermetrina, Deltametrina, Malatión, Monocrotofós, Abamectina, Acetamiprid, Benzoato de Emamectina, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-Cihalotrina, Spinosad, Tiodicarb, Gamma-Cihalotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamid, Flubendiamida, Triflumurón, Rynaxypyr, Beta-Ciflutrina, Spirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofurán, Flubendiamida, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, gamma Cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofós, Triazofós, Endosulfán; Fungicidas para el algodón: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas para la soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimurón-Etilo, Cloransulam-Metilo, Fenoxaprop, Fomesafeno, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquín, Imazethapyr, (S-)Metolacloro, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Insecticidas para la soja: Lambda-cihalotrina, Metomil, Paratión, Tiocarb, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurán, Flubendiamida, Rynaxypyr, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, p-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Spirotetramat, Espinodiclofeno, Triflumurón, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas para la soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas para la remolacha azucarera: Cloridazón, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitrón, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfurón, Tepraloxidim, Quizalofop; Insecticidas para la remolacha azucarera: Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurán, Deltametrina, p-Ciflutrina, gamma/lambda Cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rynaxypyr, Cyaxypyr, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas para la colza: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina, Etametsulfurón, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas para la colza: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Insecticidas para la colza: organofosfatos de Carbofurano, Piretroides, Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofurán, p-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Spinosad, Spinotoram, Flubendiamida, Rynaxypyr, Cyazypyr, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.
En algunos aspectos, el herbicida es Atrazina, Bromacil, Diurón, Clorsulfurón, Metsulfurón, Tifensulfurón Metilo, Tribenurón, Acetocloro, Dicamba, Isoxaflutol, Nicosulfurón, Rimsulfurón, Piritiobac-sodio, Flumioxazina, Clorimurón-Etilo, Metribuzina, Quizalofop, S-metolacloro, Hexazina o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, el insecticida es Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomil, Indoxacarb, Oxamil o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, el herbicida es un herbicida que inhibe la homogentisato solanesiltransferasa (HST) y/o herbicida que inhibe la hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) de la publicación de patente de Estados Unidos US2011173718.
Actividad plaguicida e insecticida
"Plaga" incluye, aunque sin limitación, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera y Coleoptera.
Los expertos en la materia reconocerán que no todos los compuestos son igual de eficaces contra todas las plagas. Los compuestos de los aspectos presentan actividad contra plagas de insectos, que pueden incluir plagas de plantas agronómicamente importantes, forestales, de invernadero, ornamentales de vivero, alimenticias y fibrosas, para la salud pública y animal, de estructuras domésticas y comerciales, del hogar y de productos almacenados.
Las larvas del orden Lepidoptera incluyen, aunque sin limitación, cogolleros, gusanos cortadores, orugas y heliotinos de la familia Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (cogollero del maíz); S. exigua Hübner (cogollero de la remolacha); S. litura Fabricius (gusano cortador del tabaco, oruga de los racimos); Mamestra configurata Walker (cogollero bertha); M. brassicae Linnaeus (polilla de la col); Agrotis Ípsilon Hufnagel (gusano cortador negro); A. ortogonia Morrison (gusano cortador occidental); A. subterranea Fabricius (gusano cortador granulado); Alabama argillacea Hübner (gusano foliar del algodón); Trichoplusia ni Hübner (oruga de la col); Pseudoplusia includens Walker (oruga de la soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (oruga de la leguminosas); Hypena scabra Fabricius (gusano de trébol verde); Heliothis virescens Fabricius (gusano de los frutos del tabaco); Pseudaletia unipuncta Haworth (cogollero); Athetis mindara Barnes y Mcdunnough (gusano cortador de piel rugosa); Euxoa messoria Harris (gusano cortador de lateral oscuro); Earias insulana Boisduval (oruga espinosa); E. vittella Fabricius (oruga moteada); Helicoverpa armigera Hübner (oruga americana); H. zea Boddie (elotero u oruga del algodón); Melanchra picta Harris (oruga cebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (gusano cortador de cítricos); barrenadores, polillas, gusanos de los brotes, gusanos de las piñas y destructores de la familia Piralidae Ostrinia nubilalis Hübner (barrenador del maíz europeo); Amyelois transitella Walker (gusano naranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (polilla de la harina mediterránea); Cadra cautella Walker (polilla de la almendra); Chilo suppressalis Walker (barrenador de los tallos del arroz); C. partellus, (barrenador del sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (polilla del arroz); Crambus caliginosellus Clemens (gusano de los brotes de las raíces del maíz); C. teterrellus Zincken (gusano de los brotes de la hierba forrajera); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (enrollador de las hojas del arroz); Desmia funeralis Hübner (plegador de las hojas de la uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (gusano del melón); D. nitidalis Stoll (gusano descomponedor); Diatraea grandiosella Dyar (barrenador del maíz suroccidental), D. saccharalis Fabricius (barrenador de la caña de azúcar); Eoreuma loftini Dyar (barrenador del arroz mejicano); Ephestia elutella Hübner (polilla del tabaco (cacao)); Galleria mellonella Linnaeus (polilla de cera mayor); Herpetogramma licarsisalis Walker (gusano de los brotes del césped); Homoeosoma electellum Hulst (polilla del girasol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (barrenador menor de los tallos de maíz); Achroia grisella Fabricius (polilla de cera menor); Loxostege sticticalis Linnaeus (gusano de los brotes de la remolacha); Orthaga thyrisalis Walker (polilla de los brotes del árbol del té); Maruca testulalis Geyer (barrenador de las vainas de la alubia); Plodia interpunctella Hübner (polilla de la harina índica); Scirpophaga incertulas Walker (barrenador amarillo de los tallos); Udea rubigalis Guenée (desfoliador del apio); y enrolladores foliares, gusanos de los frutos, gusanos de las semillas y gusanos de los frutos de la familia Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (gusano de los frutos de cabeza negra occidental); A. variana Fernald (gusano de los frutos de cabeza negra oriental); Archips argyrospila Walker (enrollador de las hojas de árboles frutales); A. rosana Linnaeus (enrollador de las hojas europeo); y otras especies Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (polilla tortrícida de frutos de verano); Cochylis hospes Walsingham (polilla bandeada del girasol); Cydia latiferreana Walsingham (gusano de la avellana); C. pomonella Linnaeus (polilla de la manzana); Platynota flavedana Clemens (enrollador foliar variegado); P. stultana Walsingham (enrollador foliar omnívoro); Lobesia botrana Denis y Schiffermüller (polilla de las viñas europea); Spilonota ocellana Denis y Schiffermüller (polilla con manchas oculares); Endopiza viteana Clemens (polilla de la uva); Eupoecilia ambiguella Hübner (polilla de la vid); Bonagota salubricola Meyrick (enrollador de las hojas de la manzana brasileño); Grapholita molesta Busck (polilla de los frutos oriental); Suleima helianthana Riley (polilla del girasol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.
Otras plagas agronómicas seleccionadas del orden Lepidoptera incluyen, aunque sin limitación, Alsophila pometaria Harris (azotador de otoño); Anarsia lineatella Zeller (oruga zapadora del melocotón); Anisota senatoria J.E.
Smith (gusano naranja bandeado del roble); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (polilla Tussah del roble chino); Bombyx mori Linnaeus (gusano de seda); Bucculatrix thurberiella Busck (perforador foliar del algodón); Colias eurytheme Boisduval (oruga de la alfalfa); Datana integerrima Grote y Robinson (oruga de la nuez); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (polilla de seda siberiana), Ennomos subsignaria Hübner (oruga del olmo); Erannis tiliaria Harris (oruga del tilo); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (polilla de cola parda); Harrisina americana Guérin-Méneville (destructor foliar de la uva); Hemileuca oliviae Cockrell (oruga de pastizales); Hyphantria cunea Drury (gusano de los brotes del maíz); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiuro del tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (oruga de la cicuta oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (oruga de la cicuta occidental); Leucoma salicis Linnaeus (polilla satén); Lymantria dispar Linnaeus (polilla gitana); Manduca quinquemaculata Haworth (esfinge de cinco manchas, gusano del tomate); M. sexta Haworth (gusano del tomate, gusano del tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (polilla de invierno); Paleacrita vernata Peck (azotador de primavera); Papilio cresphontes Cramer (mariposa cometa gigante); Phryganidia californica Packard (gusano del roble de California); Phyllocnistis citrella Stainton (minador de hojas de los cítricos); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador de hojas tentiforme moteado); Pieris brassicae Linnaeus (mariposa blanca grande); P. rapae Linnaeus (mariposa blanca pequeña); P. napi Linnaeus (mariposa blanca verdinevada); Platyptilia carduidactyla Riley (polilla de penacho de la alcachofa); Plutella xylostella Linnaeus (polilla dorso de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders (oruga rosa); Pontia protodice Boisduval y Leconte (gusano de la col sureño); Sabulodes aegrotata Guenée (oruga omnívora); Schizura concinna J.E. Smith (oruga de joroba roja); Sitotroga cerealella Olivier (polilla de los granos Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (oruga de la procesionaria del pino); Tineola bisselliella Hummel (polilla de la ropa); Tuta absoluta Meyrick (minador de las hojas del tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (arañuelo del ciruelo); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. y Orgyia spp.
Son de interés las larvas y los adultos del orden Coleoptera que incluyen gorgojos de las familias Anthribidae, Bruchidae y Curculionidae (que incluyen, aunque sin limitación: Anthonomus grandis Boheman (gorgojo del algodón); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgojo acuático del arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgojo de granero); S. oryzae Linnaeus (gorgojo del arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgojo foliar del trébol); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgojo de los tallos del girasol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgojo rojo de las semillas del girasol); S. sordidus LeConte (gorgojo gris de las semillas del girasol); Sphenophorus maidis Chittenden (picudo del maíz)); escarabajuelos, escarabajos del pepino, gusanos de la raíz, escarabajos de las hojas, escarabajos de la patata y minadores de hojas de la familia Chrysomelidae (incluyendo, aunque sin limitación: Leptinotarsa decemlineata Say (escarabajo de la patata de Colorado); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (gusano de la raíz del maíz occidental); D. barben Smith y Lawrence (gusano alfilerillo); D. undecimpunctata howardi Barber (doradilla); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (escarabajuelo del maíz); Phyllotreta cruciferae Goeze (escarabajuelo de las crucíferas); Phyllotreta striolata (escarabajuelo pelado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis de la uva); Oulema melanopus Linnaeus (escarabajo de las hojas de los cereales); Zygogramma exclamationis Fabricius (escarabajo del girasol)); escarabajos de la familia Coccinellidae (incluyendo, aunque sin limitación: Epilachna varivestis Mulsant (escarabajo de la alubia mejicano)); gusanos blancos y otros escarabajos de la familia Scarabaeidae (incluyendo, aunque sin limitación: Popillia japonica Newman (escarabajo japonés); Cyclocephala borealis Arrow (guanso blanco enmascarado del norte, tórsalo blanco); C. immaculata Olivier (gusano blanco enmascarado del sur, tórsalo blanco); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (gusano blanco europeo); Phyllophaga crinita Burmeister (tórsalo blanco); Ligyrus gibbosus De Geer (escarabajo de la zanahoria)); escarabajos de la alfombra de la familia Dermestidae; gusanos de alambre de la familia Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; escarabajos de la corteza de la familia Scolytidae y escarabajos de la familia Tenebrionidae.
Son de interés los adultos e inmaduros del orden Diptera, incluyendo minadores de las hojas Agromyza parvicornis Loew (minador de las hojas manchado del maíz); mosquitos (incluyendo, aunque sin limitación: Contarinia sorghicola Coquillett (mosquito del sorgo); Mayetiola destructor Say (cecidomio); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosquito del trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosquito de las semillas del girasol)); moscas de frutas (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas de la fruta); larvas (incluyendo, aunque sin limitación: Delia platura Meigen (larva del maíz); D. coarctata Fallen (mosca del cogollo del trigo) y otras Delia spp., Meromyza americana Fitch (larva del tallo del trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas domésticas pequeñas); Stomoxis calcitrans Linnaeus (moscas de establo)); moscas de la cara, moscas de los cuernos, moscas chupadoras, Chrysomya spp.; Phormia spp. y otras plagas de moscas muscoides, moscas del caballo Tabanus spp.; moscardones Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas del ganado bovino Hypoderma spp.; moscas del ciervo Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) y otras Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos mordedores, moscas de la arena, esciáridos y otros Nematocera.
Se incluyen como insectos de interés adultos y ninfas de los órdenes Hemiptera y Homoptera tales como, aunque sin limitación, adélgidos de la familia Adelgidae, chinches de plantas de la familia Miridae, cigarras de la familia Cicadidae, saltahojas, Empoasca spp.; de la familia Cicadellidae, saltaplantas de las familias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae y Delphacidae, membranácidos de la familia Membracidae, psílidos de la familia Psyllidae, moscas blancas de la familia Aleyrodidae, áfidos de la familia Aphididae, filoxera de la familia Phylloxeridae, gorgojos de la familia Pseudococcidae, escamas de las familias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae, Ortheziidae, Phoenicococcidae y Margarodidae, bichos de encaje de la familia Tingidae, chinches hediondos de la familia Pentatomidae, chinches, Blissus spp.; y otros chinches de semillas de la familia Lygaeidae, cercopoideos de la familia Cercopidae, chinches de la calabaza de la familia Coreidae y abujes y manchadores del algodón de la familia Pirrhocoridae.
Miembros agronómicamente importantes del orden Homoptera incluyen, aunque sin limitación: Acyrthisiphon pisum Harris (áfido del guisante); Aphis craccivora Koch (áfido del caupí); A. fabae Scopoli (áfido negro de la judía); A. gossypii Glover (áfido del algodón, áfido del melón); A. maidiradicis Forbes (áfido de la raíz del maíz); A. pomi De Geer (áfido del manzano); A. spiraecola Patch (áfido spirea); Aulacorthum solani Kaltenbach (áfido digital); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (áfido de la fresa); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (áfido del trigo ruso); Dysaphis plantaginea Paaserini (áfido rosado de la manzana); Eriosoma lanigerum Hausmann (áfido lanoso de la manzana); Brevicoryne brassicae Linnaeus (áfido de la col); Hyalopterus pruni Geoffroy (áfido harinoso de la ciruela); Lipaphis erysimi Kaltenbach (áfido del nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (áfido de los cereales); Macrosiphum euphorbiae Thomas (áfido de la patata); Myzus persicae Sulzer (áfido del melocotón y la patata, áfido verde del melocotón); Nasonovia ribisnigri Mosley (áfido de la lechuga); Pemphigus spp. (áfidos de la raíz y áfidos de las cecidias); Rhopalosiphum maidis Fitch (áfido de la hoja del maíz); R. padi Linnaeus (áfido del cerezo aliso y la avena); Schizaphis graminum Rondani (áfido del trigo); Sipha flava Forbes (áfido amarillo de la caña de azúcar); Sitobion avenae Fabricius (áfido del grano inglés); Therioaphis maculata Buckton (áfido moteado de la alfalfa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (áfido negro de los cítricos) y T. citricida Kirkaldy (áfido pardo de los cítricos); Melanaphis sacchari (áfido de la caña de azúcar); Adelges spp. (adelgidos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera del pacanero); Bemisia tabaci Gennadius (mosca blanca del tabaco, mosca blanca de la batata); B. argentifolii Bellows y Perring (mosca blanca de hoja plateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca blanca de los cítricos); Trialeurodes abutiloneus (mosca de alas bandeadas) y T. vaporariorum Westwood (mosca blanca de los invernaderos); Empoasca fabae Harris (saltahojas de la patata); Laodelphax striatellus Fallen (fulgoromorfo pardo más pequeño); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cicadélido de la margarita); Nephotettix cinticeps Uhler (cicadélido verde); N. nigropictus Stál (cicadélido del arroz); Nilaparvata lugens Stál (cicadélido pardo); Peregrinus maidis Ashmead (cicacélido del maíz); Sogatella furcifera Horvath (cicacélido de dorso pálido); Sogatodes orizcola Muir (delfácido del arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cicacélido blanco de la manzana); Erythroneoura spp. (cicacélido de la uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cícada periódica); Icerya purchasi Maskell (cochinilla acanalada); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (cochinilla de San José); Planococcus citri Risso (gorgojo de los cítricos); Pseudococcus spp. (otro complejo de gorgojos); Cacopsylla pyricola Foerster (psilla de la pera); Trioza diospyri Ashmead (psilla del caqui).
Especies agronómicamente importantes de interés del orden Hemiptera incluyen, aunque sin limitación: Acrosternum hilare Say (chinche verde); Anasa tristis De Geer (bicho de la calabaza); Blissus leucopterus leucopterus Say (chinche); Corythuca gossypii Fabricius (bicho de encaje del algodón); Cyrtopeltis modesta Distant (bicho del tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (manchador del algodón); Euschistus servus Say (chinche parda); E. variolarius Palisot de Beauvois (chinche verde de un lunar); Graptostethus spp. (complejo de bichos de semilla); Leptoglossus corculus Say (chinche americana de los pinos); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (bicho común del prado); L. Hesperus Knight (chinche lligus); L. pratensis Linnaeus (bicho común del prado occidental); L. rugulipennis Poppius (chinche lygus europeo); Lygocoris pabulinus Linnaeus (insecto cápside verde común); Nezara viridula Linnaeus (chinche verde del sur); Oebalus pugnax Fabricius (chinche del arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (chinche grande del algodoncillo); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga saltona del algodón).
Además, los aspectos pueden ser eficaces contra Hemiptera, tales como Calocoris norvegicus Gmelin (chinche de la fresa); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (insecto cápside de la manzana); Cyrtopeltis modestus Distant (chinche del tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca chupadora); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga saltona con marcas blancas); Diaphnocoris chlorionis Say (chinche de la acacia de tres espinas); Labopidicola allii Knight (chinche de la cebolla); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga saltona del algodón); Adelphocoris rapidus Say (chinche rápido); Poecilocapsus lineatus Fabricius (chinche de cuatro líneas); Nysius ericae Schilling (falso chinche); Nysius raphanus Howard (falso chinche); Nezara viridula Linnaeus (chinche verde sureño); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pirrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. y Cimicidae spp.
También se incluyen adultos y larvas del orden Acari (acáridos) tales como Aceria tosichella Keifer (ácaro del enrollamiento del trigo); Petrobia latens Müller (ácaro pardo del trigo); ácaros araña y ácaros rojos de la familia Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro rojo europeo); Tetranychus urticae Koch (ácaro araña de dos manchas); T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro araña carmín); T. turkestani Ugarov y Nikolski (ácaro araña de la fresa); ácaros planos de la familia Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de los cítricos); ácaros de la roya y los brotes de la familia Eriophyidae y otros ácaros de alimentación foliar y ácaros importantes en la salud humana y animal, es decir, ácaros del polvo de la familia Epidermoptidae, ácaros de los folículos de la familia Demodicidae, ácaros de los cereales de la familia Glycyphagidae, garrapatas del orden Ixodidae. Ixodes scapularis Say (garrapata del ciervo); I. holocyclus Neumann (garrapata de la parálisis australiana); Dermacentor variabilis Say (garrapata del perro americana); Amblyomma americanum Linnaeus (garrapata estrella solitaria) y ácaros escabióticos de las familias Psoroptidae, Pyemotidae y Sarcoptidae.
Son de interés plagas de insectos del orden Thysanura, tales como Lepisma saccharina Linnaeus (lepisma); Thermobia domestica Packard (insecto de fuego).
Plagas de artrópodos adicionales cubiertas incluyen: arañas del orden Araneae tales como Loxosceles reclusa Gertsch y Mulaik (araña ermitaña parda) y Latrodectus mactans Fabricius (araña viuda negra) y ciempiés del origen Scutigeromorpha tales como Scutigera coleoptrata Linnaeus (ciempiés doméstico).
Plagas de insectos de interés incluyen la superfamilia de las chinches y otros insectos relacionados que incluyen, aunque sin limitación, especies pertenecientes a la familia Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus y Bagrada hilaris (bicho Bagrada)), la familia Plataspidae (Megacopta cribraria - chinche globular) y la familia Cydnidae (Scaptocoris castanea - chinche de la raíz) y especies de lepidópteros, que incluyen, aunque sin limitación: polilla de dorso de diamante, por ejemplo, Helicoverpa zea Boddie; oruga de la soja, por ejemplo, Pseudoplusia includens Walker y oruga de las leguminosas, por ejemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner.
Son bien conocidos en la técnica métodos para medir la actividad plaguicida. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 y patente de Estados Unidos número 5.743.477. En general, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Dichos ensayos pueden incluir poner en contacto las plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta de sobrevivir y/o provocar la muerte de las plagas.
Los nematodos incluyen nematodos parasitarios tales como nematodos de los nudos de las raíces, nematodos de los quistes y de lesiones, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; particularmente miembros de los nematodos de los quistes incluyendo, aunque sin limitación, Heterodera glycines (nematodo de los quistes de la soja); Heterodera schachtii (nematodo de los quistes de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo de los quistes de los cereales) y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos de los quistes de la patata). Los nematodos de lesiones incluyen Pratylenchus spp.
Tratamiento de semillas
Para proteger y para potenciar el rendimiento en producción y las tecnologías de rasgos, las opciones de tratamiento de semillas pueden proporcionar flexibilidad de planificación de cultivos adicional y control rentable contra insectos, malas hierbas y enfermedades. El material seminal puede tratarse, típicamente tratarse superficialmente, con una composición que comprende combinaciones de herbicidas químicos o biológicos, protectores de herbicidas, insecticidas, fungicidas, inhibidores y potenciadores de la germinación, nutrientes, reguladores y activadores del crecimiento vegetal, bactericidas, nematicidas, avicidas y/o molusquicidas. Estos compuestos típicamente se formulan junto con vehículos, tensioactivos o adyuvantes promotores de la aplicación adicionales, empleados normalmente en la técnica de formulación. Los recubrimientos pueden aplicarse impregnando material de propagación con una formulación líquida o por recubrimiento con una formulación húmeda o seca combinada. Ejemplos de los diversos tipos de compuestos que pueden usarse como tratamientos de semillas se proporcionan en The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., publicado por el British Crop Production Council.
Algunos tratamientos de las semillas que pueden usarse en semillas de cultivo incluyen, aunque sin limitación, uno o más de ácido abscísico, acibenzolar-S-metilo, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirillum, azadiractina, azoxistrobina, Bacillus spp. (incluyendo una o más de las especies cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis y/o thuringiensis), Bradyrhizobium spp. (incluyendo uno o más de betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi y/o yuanmingense), captano, carboxina, quitosano, clotianidina, cobre, cyazypyr, difenoconazol, etidiazol, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteína harpin, imazalil, imidacloprid, ipconazol, isoflavenoides, lipoquitooligosacárido, mancozeb, manganeso, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, miclobutanil, PCNB, penflufeno, penicillium, penthiopyrad, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rynaxypyr, S-metolacloro, saponina, sedaxano, TCMTb , tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, tiram, tolclofós-metilo, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triticonazol y/o cinc. El recubrimiento de semillas PCNB se refiere al número de registros de EPA 00293500419, que contiene quintozeno y terrazol. TCMTB se refiere a 2-(tiocianometiltio)benzotiazol.
Las variedades de semillas y las semillas con rasgos transgénicos específicos pueden ensayarse para determinar las opciones de tratamiento de semillas y las tasas de aplicación que pueden complementar dichas variedades y rasgos transgénicos para potenciar el rendimiento. Por ejemplo, una variedad con buen potencial de rendimiento, pero susceptibilidad a tizón en las espigas, puede beneficiarse del uso de una tratamiento de semillas que proporcione protección contra el tizón de las espigas, una variedad con buen potencial de rendimiento, pero susceptibilidad al nematodo de los quistes puede beneficiarse del uso de un tratamiento de semillas que proporcione protección contra el nematodo de los quistes, etc. Asimismo, una variedad que incluya un rasgo transgénico que confiera resistencia a insectos puede beneficiarse del segundo modo de acción conferido por el tratamiento de semillas, una variedad que incluya un rasgo transgénico que confiera resistencia a herbicidas puede beneficiarse de un tratamiento de semillas con un protector que potencie la resistencia de las plantas a ese herbicida, etc. Además, el buen establecimiento de las raíces y la germinación temprana que se produce por el uso apropiado de un tratamiento de semillas puede provocar un uso más eficaz del nitrógeno, una mejor capacidad de resistir la sequía y un aumento global en el potencial de rendimiento de una diversidad de variedades que contienen un determinado rasgo, cuando se combina con un tratamiento de semillas.
Métodos para eliminar una plaga de insectos y controlar una población de insectos
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para eliminar una plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido PIP-72 recombinante. En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para eliminar una plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de una proteína plaguicida recombinante de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 o SEQ ID NO: 852 o una variante de las mismas.
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para controlar una población de plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido PIP-72 recombinante. En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para controlar una población de plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de una proteína plaguicida recombinante de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 o SEQ ID NO: 852 o una variante de las mismas. Como se usa en este documento, "controlar una población de plaga" o "controlar una plaga" se refiere a cualquier efecto sobre una plaga que da como resultado la limitación de los daños que provoca esa plaga. Controlar una plaga incluye, aunque sin limitación, eliminar la plaga, inhibir el desarrollo de la plaga, alterar la fertilidad o el crecimiento de la plaga de tal manera que la plaga proporcione menos daños a la planta, disminuir la cantidad de descendencia producida, producir plagas menos aptas, producir plagas más susceptibles al ataque por depredadores o impedir que las plagas coman la planta.
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para controlar una población de plaga de insectos resistente a una proteína plaguicida, que comprenden poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido PIP-72 recombinante. En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para controlar una población de plaga de insectos resistente a una proteína plaguicida, que comprenden poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de una proteína plaguicida recombinante de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 o SEQ ID NO: 852 o una variante de las mismas.
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido PIP-72. En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma un polinucleótido recombinante que codifica una proteína plaguicida de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 o SEQ ID NO: 852 o variantes de las mismas.
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para eliminar una plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido recombinante de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 o SEQ ID NO: 948 o una variante de las mismas.
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para controlar una población de plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz de un polipéptido recombinante de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 o SEQ ID NO: 948 o una variante de las mismas. Como se usa en este documento, "controlar una población de plaga" o "controlar una plaga" se refiere a cualquier efecto sobre una plaga que da como resultado la limitación de los daños que provoca esa plaga. Controlar una plaga incluye, aunque sin limitación, eliminar la plaga, inhibir el desarrollo de la plaga, alterar la fertilidad o el crecimiento de la plaga de tal manera que la plaga proporcione menos daños a la planta, disminuir la cantidad de descendencia producida, producir plagas menos aptas, producir plagas más susceptibles al ataque por depredadores o impedir que las plagas coman la planta.
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para controlar una población de plaga de insectos resistente a una proteína plaguicida, que comprenden poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz de un polipéptido recombinante de SEQ ID No : 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID n O: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 o SEQ ID NO: 948 o una variante de las mismas.
En algunos aspectos, en este documento se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma un polinucleótido recombinante que codifica una proteína plaguicida de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 o SEQ ID NO: 948 o variantes de las mismas.
Estrategias de control de la resistencia de los insectos (IRM)
La expresión de 6-endotoxinas de B. thuringiensis en plantas de maíz transgénicas ha demostrado ser un medio eficaz de control de plagas de insectos importantes desde el punto de vista agrícola (Perlak, et al., 1990; 1993). Sin embargo, los insectos han evolucionado de modo que son resistentes a 6-endotoxinas de B. thuringiensis expresadas en plantas transgénicas. Dicha resistencia, si llega a propagarse, limitaría claramente el valor comercial del germoplasma que contiene genes que codifican dichas 6-endotoxinas de B. thuringiensis.
Una manera de aumentar la eficacia de los insecticidas transgénicos contra las plagas diana y reducir simultáneamente el desarrollo de plagas resistentes a insecticidas, es usar y proporcionar refugios no transgénicos (es decir, sin proteína insecticida) (una sección de cultivos de cereal habitual sin insecticida) para su uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína insecticida activa contra las plagas diana. La Environmental Protection Agency de Estados Unidos (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm, a la que se puede acceder usando el prefijo www) publica los requisitos para el uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína Bt activa contra plagas diana. Además, la National Corn Growers Association, en su cibersitio: (ncga.com/insect-resistancemanagement-fact-sheet-bt-corn, al que se puede acceder usando el prefijo www) también proporciona directrices similares con respecto a los requisitos de los refugios. Debido a las pérdidas por los insectos dentro de las áreas de refugio, refugios más grandes pueden reducir el rendimiento global.
Otra manera de aumentar la eficacia de los insecticidas transgénicos contra plagas diana y reducir simultáneamente el desarrollo de plagas resistentes a insecticidas, sería tener un repositorio de genes insecticidas que sean eficaces contra grupos de plagas de insectos y que manifiesten sus efectos a través de diferentes modos de acción.
La expresión en una planta de dos o más composiciones insecticidas tóxicas para la misma especie de insecto, expresándose cada insecticida a niveles eficaces, sería otra manera de conseguir control del desarrollo de resistencia. Esto se basa en el principio de que el desarrollo de resistencia contra dos modos de acción diferentes es mucho menos probable que solamente una. Roush, por ejemplo, expone estrategias de dos toxinas, también denominadas "piramidación" o "apilamiento", para el control de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777-1786). El apilamiento o piramidación de dos proteínas diferentes, cada una eficaz contra las plagas diana y con poca o ninguna resistencia cruzada, puede permitir el uso de un refugio más pequeño. La Environmental Protection Agency de Estados Unidos requiere significativamente menos (en general un 5 %) de refugio estructurado de maíz sin Bt plantado que para productos de un solo rasgo (en general un 20 %). Hay diversas maneras de proporcionar los efectos de IRM de un refugio, incluyendo diversos patrones de siembra geométrica en los campos y mezclas de semillas en la bolsa, como se analiza adicionalmente por Roush.
En algunos aspectos, los polipéptidos PIP-72 de la divulgación son útiles como estrategia de control de la resistencia de los insectos en combinación (es decir, piramidal) con otras proteínas plaguicidas, que incluyen, aunque sin limitación, toxinas Bt, proteínas insecticidas de Xenorhabdus sp. o Photorhabdus sp. y similares.
En este documento se describen métodos de control de una o más infestaciones por insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica, que promueven el control de la resistencia de los insectos, que comprenden expresar en la planta al menos dos proteínas insecticidas diferentes que tienen diferentes modos de acción.
En algunos aspectos, los métodos para controlar la infestación por insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el control de la resistencia de los insectos con la al menos una de las proteínas insecticidas comprenden un polipéptido PIP-72 insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera.
En algunos aspectos, los métodos para controlar la infestación por insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el control de la resistencia de los insectos con la al menos una de las proteínas insecticidas comprenden una proteína de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 o variantes de las mismas, insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera.
En algunos aspectos, los métodos para controlar la infestación por insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el control de la resistencia de los insectos comprenden expresar en la planta transgénica un polipéptido PIP-72 y una proteína Cry insecticidas para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera, que tienen diferentes modos de acción.
En algunos aspectos, los métodos para controlar la infestación por insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el control de la resistencia de los insectos comprenden en la plantas transgénica una proteína de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 o variantes de las mismas y una proteína Cry insecticidas para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera, que tienen diferentes modos de acción.
En este documento también se describen métodos de reducción de la probabilidad de aparición de resistencia de insectos lepidópteros y/o coleópteros en plantas transgénicas que expresan en las plantas proteínas insecticidas para controlar la especie de insectos, que comprenden la expresión de un polipéptido PIP-72 insecticida para la especie de insectos en combinación con una segunda proteína insecticida para la especie de insectos, que tienen diferentes modos de acción.
En este documento también se describen métodos de reducción de la probabilidad de aparición de resistencia de insectos lepidópteros y/o coleópteros en plantas transgénicas que expresan en las plantas proteínas insecticidas para controlar la especie de insectos, que comprenden la expresión de una proteína de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 o variantes de las mismas, insecticida para la especie de insectos en combinación con una segunda proteína insecticida para la especie de insectos, que tienen diferentes modos de acción.
En este documento también se describen medios para el control eficaz de la resistencia de insectos lepidópteros y/o coleópteros de plantas transgénicas, que comprenden coexpresar a altos niveles en las plantas dos o más proteínas insecticidas tóxicas para insectos lepidópteros y/o coleópteros, pero que muestran cada una un modo diferente de lograr su actividad de eliminación, en las que las dos o más proteínas insecticidas comprenden un polipéptido PIP-72 y una proteína Cry. En este documento también se describen medios para el control eficaz de la resistencia de insectos lepidópteros y/o coleópteros de plantas transgénicas, que comprenden coexpresar a altos niveles en las plantas dos o más proteínas insecticidas tóxicas para insectos lepidópteros y/o coleópteros, pero que muestran cada una un modo diferente de lograr su actividad de eliminación, en las que las dos o más proteínas insecticidas comprenden una proteína de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, una cualquiera de SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 o SEQ ID NO: 946 o variantes de las mismas y una proteína Cry.
Además, en este documento se describen métodos para obtener la aprobación reglamentaria para la siembra o comercialización de plantas que expresan proteínas insecticidas para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera, que comprenden la etapa de remitirse, presentar o confiar en los datos de unión del ensayo de insectos que muestran que el polipéptido PIP-72 no compite con los sitios de unión para las proteínas Cry en dichos insectos. Además, en este documento se describen métodos para obtener la aprobación reglamentaria para la siembra o comercialización de plantas que expresan proteínas insecticidas para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera, que comprenden la etapa de remitirse, presentar o confiar en los datos de unión del ensayo de insectos que muestran que la proteína de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, una cualquiera de SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, una cualquiera de SEQ ID NO: 825 -SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, s Eq ID NO: 772 o SEQ ID NO: 852 o variante de las mismas no compite con los sitios de unión para proteínas Cry en dichos insectos.
Métodos para aumentar el rendimiento de las plantas
En este documento se describen métodos para aumentar el rendimiento de las plantas. Los métodos comprenden proporcionar una planta o célula vegetal que exprese un polinucleótido que codifique la secuencia polipeptídica plaguicida divulgada en este documento y hacer crecer la planta o una semilla de la misma en un campo infestado con una plaga contra la que el polipéptido tiene actividad plaguicida. En algunos aspectos, el polipéptido tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros o nematodos, y el campo está infestado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros o nematodos.
Como se define en este documento, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. "Biomasa", como se usa en este documento, se refiere a cualquier producto medido de la planta. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto medido de la planta. Aumentar el rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, aumentar la biomasa foliar de la planta puede aumentar el rendimiento de las hortalizas de hoja para consumo humano o animal. Además, aumentar la biomasa foliar puede usarse para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo incluyendo, aunque sin limitación, al menos un aumento de un 1 %, al menos un aumento de un 3 %, al menos un aumento de un 5 %, al menos un aumento de un 10 %, al menos un aumento de un 20 %, al menos un aumento de un 30 %, de al menos un 50 %, de al menos un 70 %, de al menos un 100 % o mayor en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia plaguicida.
En métodos específicos, el rendimiento de la planta se aumenta como resultado de resistencia mejorada a las plagas de una planta que expresa un polipéptido PIP-72 divulgado en este documento. La expresión del polipéptido PIP-72 provoca una capacidad reducida de una plaga de infestar o alimentarse en una planta, mejorando, por tanto, el rendimiento de la planta.
Métodos de procesamiento
En este documento se describen además métodos de procesamiento de una planta, parte de una planta o semilla para obtener un alimento o producto alimenticio de una planta, parte de una planta o semilla que comprende un polipéptido PIP-72. Las plantas, partes de las plantas o semillas descritas en este documento, pueden procesarse para producir aceite, productos proteínicos y/o subproductos que son derivados obtenidos por procesamiento, que tienen valor comercial. Ejemplos no limitantes incluyen semillas transgénicas que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 que puede procesarse para producir aceite de soja, productos de soja y/o subproductos de soja.
"Procesamiento" se refiere a cualquier método físico y químico usado para obtener cualquier producto de soja e incluye, aunque sin limitación, acondicionado por calor, descascaramiento y molienda, extrusión, extracción con disolvente o remojo en agua y extracción de las semillas completas o parciales.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Parte experimental
Ejemplo 1 - Identificación de una proteína insecticida activa contra el gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW) de la cepa SS143D5
La proteína PIP-72Aa activa contra WCRW (Diabrotica virgifera virgifera) se identificó mediante purificación de la proteína, cromatografía de líquidos y espectrometría de masas (LC-MS/MS) y clonación por PCR de Pseudomonas chlororaphis cepa SS143D5 como sigue:
Se observó actividad insecticida contra WCRW (Diabrotica virgifera virgifera) de un lisado claro de células de SS143D5 que han crecido en medio de soja con tripticasa (triptona 17 g/l, digestión enzimática de harina de soja 3 g/l, dextrosa 2,5 g/l, cloruro de sodio 5 g/l, K2HPO42,5 g/l) y cultivadas durante una noche a 26 °C con agitación a 250 rpm. Esta actividad insecticida mostró sensibilidad al calor y a proteinasa, lo que indica su naturaleza proteínica. Para la extracción de proteínas, las células se descongelaron y se resuspendieron en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5 (tampón A) que contenía cóctel de inhibidor de proteasa V de CalBiochem. Se obtuvo un lisado aclarado en bruto pasando las células a través de un homogeneizador a 206,84 MPa (30.000 psi), seguido de centrifugación a 13.800 x g durante 20 min.
Los bioensayos de WCRW se realizaron usando muestras de 10 microlitros de lisado celular mezcladas con alimento para WCRW fundido de baja fusión (Southland Products Inc. Lake Village, Arkansas) en un formato de 96 pocillos. Los neonatos de Diabrotica virgifera virgifera se colocaron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. El ensayo se ejecutó durante 4 días a 25 °C y después se puntuó la mortalidad de los insectos y el crecimiento reducido del crecimiento de los insectos. Los puntuaciones se apuntaron como muerto, gravemente atrofiado (poco o ningún crecimiento, pero vivo), atrofiado (crecimiento hasta el segundo estadio, pero no equivalente a los controles) o sin actividad.
Se extrajo el ADN genómico de la cepa SS143D5 con un kit de extracción de ADN genómico bacteriano Sigma-Aldrich® (cat. n.° NA2110-KT, Sigma-Aldrich, PO Box 14508, St. Louis, MO 63178) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se determinó la concentración de ADN usando un espectrofotómetro NanoDrop® (Thermo Scientific®, 3411 Silverside Road, Bancroft Building, Suite 100, Willmington, DE 19810) y el ADN genómico se diluyó hasta 40 ng/ul con agua estéril. Se configuró una reacción de PCR de 25 ul combinando 80 ng de ADN genómico, 2 ul (5 uM) de los cebadores de ADN ribosómico 16S TACCTTGTTACGACTT (SEQ ID NO: 285) y AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (SEQ ID NO: 286), 1 ul de dNTP 10 cmM, tampón Phusion® HF™ 1x y 1 unidad de ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (New England Biolabs®, cat. n.° M0530L, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723). La reacción de PCR se ejecutó en un termociclador MJ Research PTC-200 (Bio-Rad® Laboratories, Inc., 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California, 94547, EE. UU.) con el siguiente programa: 96 °C 1 min; 30 ciclos de 96 °C 15 segundos, 52 °C 2 minutos y 72 °C 2 minutos; 72 °C 10 minutos; y mantenimiento a 4 °C. Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de ADN QiaQuick® (cat. n.° 28104, QIAGEN® Inc., 27220 Turnberry Lane, Valencia, CA 91355). Se secuenció el ADN de la muestra de PCR purificada y la secuencia de ADN ribosómico 16S resultante se exploró en BLAST frente a la base de datos del NCBI, que indicó que SS143D5 es una cepa de Pseudomonas chlororaphis. La cepa de Pseudomonas chlororaphis SS143D5, se depositó el 7 de febrero de 2013 con el n.° de acceso NRRL B-50810 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 (nrrl.ncaur.usda.gov, al que se puede acceder en Internet usando el prefijo "www").
También se preparó el ADN genómico de la cepa SS143D5 aislada de acuerdo con un protocolo de construcción de colección desarrollado Illumina y se secuenció usando el Illumina® Genome Analyzer® IIx (cat. n.° SY-301-1301, Illumina Inc., 9885Towne Center Drive, San Diego, CA92121). Las secuencias de cóntigos de ácido nucleico se ensamblaron y se generaron los marcos abiertos de de lectura.
El sedimento celular de un cultivo durante una noche de SS143D5 cultivado en caldo 2x YT a 26 °C con agitación a 250 rpm se lisó a ~137,89 MPa (20.000 psi) después de resuspensión en tampón de acetato, pH 5. El lisado en bruto se aclaró por centrifugación y se cargó en una columna HiT rap™ S-HP (GE Healthcare, 800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855). La proteína unida se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio y se fraccionó. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y se intercambió el tampón para carga en una columna MonoQ™ (GE Healthcare), desarrollada a pH 8. PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio y después de la confirmación de la actividad, se purificó adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba. Para esto, la proteína se ajustó a sulfato de amonio 0,8 M, se cargó en una columna HiTrap™ Butil-HP (GE Healthcare) y la proteína activa se recuperó en la fracción no unida. El análisis de SDS-PAGE mostró una sola banda después de tinción con tinte azul de Coomassie™. La banda de proteína se escindió, se digirió con tripsina y se analizó por nanoespectrometría de masas en tándem por cromatografía de líquidos/electronebulización (nano-LC/ESI-MS/MS) en un espectrómetro de masas Thermo Q Exactive™ Orbitrap™ (Thermo Fisher Scientific®, 81 Wyman Street, Waltham, MA 02454) conectado con un sistema Eksigent NanoLC 1-D Plus nano-lc (AB Sciex™, 500 Old Connecticut Path, Framingham, MA 01701). Se recogieron diez espectros de iones de producto en un modo de adquisición dependiente de información después de una exploración de evaluación MS1.
La identificación de la proteína se hizo mediante búsquedas en la base de datos usando Mascot® (Matrix Science, 10 Perrins Lane, Londres NW3 1QY, Reino Unido). Las búsquedas frente a la base de datos propia Bacteria-Plus, que combina todas las secuencias de proteínas bacterianas y secuencias de queratina derivadas de la base de datos no redundante (nr) del NCBI, así como las secuencias de proteínas propias, identificaron un gen novedoso codificado por la cepa SS143D5, que se denominó PIP-72Aa (SEQ ID NO: 1).
Ejemplo 2 - Identificación de homólogos de PIP-72Aa
Las identidades de los genes pueden determinarse realizando búsquedas BLAST (Basic Local Alignment 20 Search Tool; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; véase también ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, a la que se puede acceder usando el prefijo www) con parámetros por defecto para la similitud con secuencias contenidas en la base de datos "nr" BLAST disponible al público (que comprende todas las traducciones no redundantes de CDS de GenBank, secuencias derivadas del banco de datos de estructuras tridimensionales de Brookhaven, la última versión principal de la base de datos de secuencias de proteínas 25 SWISS-PROT, EMBL y bases de datos DDBJ. Además de las bases de datos públicas, se hicieron búsquedas en las bases de datos internas de DuPont Pioneer. La secuencia polinucleotídica SEQ ID NO: 1 se analizó.
La búsqueda identificó varios homólogos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) que tienen porcentaje de identidad variable con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). Los homólogos de PIP-72Aa activos insecticidas indicados en este documento como: PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28) y PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) se identificaron a partir de una base de datos de genomas bacterianos interna de DuPont Pioneer de: Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas chlororaphis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas congelans; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas ficuserectae; Pseudomonas mosselii; Pseudomonas chlororaphis; y Pseudomonas chlororaphis respectivamente. PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28) y PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) están codificados por SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 31, respectivamente. Los homólogos de baja identidad inactivos denominados en este documento PIP-72Ea (SEQ ID NO: 16) y PIP-72Ge (SEQ ID NO: 38) se identificaron a partir de una base de datos de genomas bacterianos interna de DuPont Pioneer de Pseudomonas congelans y Pseudomonas chlororaphis respectivamente. PIP-72Ea y PIP-72Ge están codificados por SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 37, respectivamente.
Los homólogos activos insecticidas más distantes denominados en este documento: GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20 - proteína hipotética GBP346_A3175, n.° de acceso YP_002897852); JG43047 (SEQ ID NO: 24 - proteína hipotética, n.° de acceso JGI - 2165143047) y PFL_6283 (SEQ ID NO: 30 - proteína hipotética, n.° de acceso y P_004842361.1) se identificaron de bases de datos públicas externas de: Burkholderia pseudomallei MSHR346; Pseudomonas sp. y Pseudomonas protegens Pf-5, respectivamente. GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20); JG43047 (SEQ ID NO: 24) y PFL_6283 (SEQ ID NO: 30) están codificados por SEQ ID NO: 19, SEQ iD NO: 23 y SEQ ID NO: 29, respectivamente.
Los homólogos más distantes, que no se expresaron o eran inactivos a las concentraciones ensayadas se denominaron SRBS_294080 (SEQ ID NO: 22 - proteína hipotética de una rizosfera de pasto varilla MC, n.° de acceso JGI 2021745495); SwiRh_4910 (SEQ ID NO: 26 - proteína hipotética de rizosfera de pasto varilla, n.° de acceso JGI -SwiRh_1014910); XBJ1_1078 (SEQ ID NO: 34 - proteína hipotética XBJ1_1078 de Xenorhabdus bovienii SS-2004, n.° de acceso YP_003467009) y plu2373 (SEQ ID No : 36 - proteína hipotética plu2373 de Photorhabdus luminescens subesp. laumondii TTO1, n.° de acceso NP_929618) se identificaron de bases de datos públicas externas; Xenorhabdus codificados por SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 35, respectivamente.
Se identificaron homólogos de PIP-72 adicionales de búsquedas BLAST en bases de datos públicas y bases de datos internas de DuPont Pioneer básicamente como se describe anteriormente. La tabla 5 muestra la denominación del polipéptido PIP-72, el porcentaje de identidad con IPD072Aa (SEQ ID NO: 2), la fuente de la cepa bacteriana y la especie bacteriana. La tabla 6 muestra la denominación del polipéptido PIP-72, el identificador de secuencia polipeptídica y el identificador de secuencia polinucleotídica.
Tabla 5
Figure imgf000093_0001
Tabla 6
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La figura 1 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Ea (SEQ ID NO: 16), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20), SRBS_294080 (SEQ ID NO: 22); JG43047 (SEQ ID NO: 24); SwiRh_4910 (SEQ ID NO: 26); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28), PFL_6283 (SEQ ID NO: 30); PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32); XBJ1_1078 (SEQ ID NO: 34); plu2373 (SEQ ID NO: 36); y PIP-72Ge (SEQ ID NO: 38). La diversidad de la secuencia de aminoácidos está resaltada. Los aminoácidos 37-51 (motivo 1) con respecto a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) están subrayados.
La figura 2 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927); PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Bb (SEQ ID NO: 928); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); WP_030131237 (SEQ ID NO: 929); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); y GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20). La diversidad de la secuencia de aminoácidos entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La figura 3 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); y PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). La diversidad de la secuencia de aminoácidos entre PIP-72Aa (SEQ ID No : 2) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La figura 4 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de WP_030131237 (SEQ ID NO: 929) PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); y PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). La diversidad de la secuencia de aminoácidos entre PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La figura 5 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de PIP-72Fh (SEQ ID NO: 932), PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941); PIP-72Fi (SEQ ID NO: 933); PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 14). La diversidad de aminoácidos entre PIP-72Ca (SEQ ID NO: 2) y los otros homólogos se indica con sombreado.
La tabla 7 muestra la identidad de secuencia entre los homólogos de PIP-72.
Tabla 7
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Ejemplo 3 - Expresión en E. co li de PIP-72Aa y homólogos
El gen de PIP-72Aa se amplificó por PCR usando ADN genómico aislado de la cepa SS143D5: cebador directo (SEQ ID NO: 39) y cebador inverso (SEQ ID NO: 40). Se verificó la secuencia de ADN del producto de PCR resultante y se subclonó en pCOLD™ 1 (Takara Bio Inc., Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, Japón 520-2193) en el marco con una marca N-terminal de His-6 seguida de un sitio de escisión de Factor Xa. Los polinucleótidos que codifican los homólogos de PIP-72Aa identificados de las cepas internas (PIP-72Ba, PIP-72Ca, PIP-72Cb, PIP-72Da, PIP-72Db, PIP-72Dc, PIP-72Db, PIP-72Ea, PIP-72Fa, JG43047, IDP072Ff, PFL_6283, PIP-72Gb, PIP-72Ge) se clonaron como se describe anteriormente, usando su respectiva preparación de ADN genómico respectiva como molde para amplificación génica por PCR y las secuencias cebadoras indicadas en la tabla 8.
Los homólogos de PIP-72Aa que se identificaron de bases de datos externas (GBP_A3175, SRBS_294080, SwiRh_4910, XBJ1_1078, Plu2373, WP_030131237 y WP_016417435) se obtuvieron a través de síntesis génica con extremos 5' y 3' compatibles para clonación cadena abajo en pCOLD™-1.
Tabla 8
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Se transformaron células de E. coli BL21-DE3 competentes con ADN plasmídico de pCOLD™ -1, que contenía el respectivo inserto del gen de PIP-72 para expresión de la proteína recombinante. Las células de E. coli transformadas se cultivaron durante una noche a 37 °C con selección en carbenicilina y después se inocularon en un medio 2xYT fresco (1:25) y se cultivaron más hasta una densidad óptica de aproximadamente 0,8. Las células entonces se enfriaron en presencia de ITPG 1 mM y se cultivaron más a 16 °C durante 16 horas para inducir la expresión de la proteína. Las proteínas expresadas en E. coli se purificaron por cromatografía de iones metálicos inmovilizados usando Ni-NTA agarosa (Qiagen®, Alemania) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
Ejemplo 4 - Actividad contra insectos de PIP-72Aa y homólogos
Se ensayó una serie de concentraciones de la muestra proteínica concentrada frente a insectos coleópteros y se calcularon las concentraciones para una mortalidad de un 50 % (CL50) o una inhibición de un 50 % (CI50) de los individuos en dos experimentos independientes. Los resultados de WCRW para PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) se muestran en la tabla 9.
Tabla 9
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Para medir las actividades insecticidas de otros polipéptidos PIP-72, se realizaron bioensayos de WCRW (Diabrotica virgifera virgifera) usando 20 ul de las muestras de proteína purificada aplicadas de forma tópica sobre 75 ul de alimento artificial de WCRW (basado en Bio-Serv F9800B) en cada placa de bioensayo de 96 pocillos (BD Falcon 353910), después se secaron al aire. Se colocó un número variable de neonatos de Diabrotica virgifera virgifera (de 3 a 9) en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. El ensayo se ejecutó durante 4 días a 25 °C sin luz y después se puntuó la mortalidad y el crecimiento reducido. La actividad insecticida contra WCRW para los diversos polipéptidos PIP-72 se muestra en la tabla 10.
PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) se ensayó adicionalmente contra la doradilla (Diabrotica undecimpunctata howardi) y el escarabajo de San Antonio (Diabrotica speciosa), así como contra el insecto chupador Lygus hesperus. PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) no fue insecticida contra estas plagas a las concentraciones ensayadas (hasta 875 ppm de proteína purificada).
Varios polipéptidos PIP-72 también se ensayaron contra SCRW (Diabrotica undecimpunctata howardi). Los bioensayos se realizaron usando 10 ul de las muestras de proteína purificada mezcladas con 50 ul de alimento artificial de SCRW (basado en Bio-Serv F9800B) en cada una de las placas de bioensayo de 96 pocillos (BD Falcon 353910). Se colocó un número variable de neonatos de Diabrotica undecimpunctata howardi (de 3 a 5) en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. El ensayo se ejecutó durante 4 días a 25 °C sin luz y después se puntuó la mortalidad y el crecimiento reducido. Tabla 10
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Se realizaron ensayos de alimentación de lepidópteros con alimento artificial en una configuración de placa de 96 pocillos. La proteína purificada se incorporó con el alimento artificial específico de lepidópteros en una relación de 10 ul de lisado aclarado y 40 ul de mezcla de alimento. Se colocaron de dos a cinco larvas neonatas en cada pocillo para alimentarse ad libitum durante 5 días. Los resultados se expresaron como positivos para reacciones de las larvas tales como crecimiento reducido o mortalidad. Los resultados se expresaron como negativos si las larvas eran similares al control negativo que se estaba alimentando con alimento al que se ha aplicado el tampón anterior solamente.
PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PFL_6283 (SEQ ID NO: 30), PIP-72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18) y PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) se ensayaron sobre el barrenador del maíz europeo (Ostrinia nubilalis), el elotero (Helicoverpa zea), el gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), el cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda) y la oruga de la soja (Pseudoplusia includens). No se observó actividad contra las especies de lepidópteros para ninguno de los polipéptidos PIP-72 ensayados a concentraciones de proteína de hasta 800 ppm.
Ejemplo 5 - Ausencia de resistencia cruzada de PIP-72Aa en cepa resistente a mCry3A de WCRW
La cepa de WCRW resistente a mCry3A se desarrolló por selecciones de WCRW en plantas de maíz transgénicas para mCry3A con un nivel de expresión T0 de mCry3A a >10.000 ppm de proteínas totales en raíces. Se hicieron siete selecciones en larvas F3, F6, f 7, F8, F10, F12, F14. Los huevos F16 de los insectos resistentes a Cry3A tenían una relación de resistencia (RR) de >46 veces a mCry3A en comparación con la colonia de laboratorio susceptible, y se usaron para ensayo de resistencia cruzada de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). Se utilizaron bioensayos de incorporación en el alimento de W c Rw normalizado para evaluar los efectos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) en larvas de w CrW. Se colocaron larvas neonatas de WCRW en las placas que contenían el alimento del bioensayo y proteína insecticida con 4 réplicas para cada concentración de tratamiento durante 3 días después del inicio de cada bioensayo. Se valoró la mortalidad y el crecimiento reducido importante de los insectos y se usó para calcular las concentraciones inhibidoras (CI50 y CL50) basándose en el análisis de sondeo. La relación de resistencia (RR) se calculó como sigue: RR = (CL/CI50 de WCRW resistentes) / (CL/CI50 de WCRW susceptibles). Como se muestra en la tabla 11, insectos WCRW resistentes a Cry3A fueron sensibles a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
Tabla 11
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Ejemplo 6 - Transformación estable mediada por Agrobacterium de maíz
Para la transformación del maíz mediada por Agrobacterium de polipéptidos de PIP-72, se empleó el método de Zhao (patente de Estados Unidos número 5.981.840 y publicación de patente internacional número WO 1998/32326). En resumen, se aislaron embriones inmaduros de maíz y los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias podían transferir un polinucleótido que codifica un polipéptido PIP-72 a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de Agrobacterium para el inicio de inoculación. Los embriones se cocultivaron durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cocultivo). Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo de las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivaron en un medio que contenía un agente selectivo y se recupera el callo transformado en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Los embriones inmaduros se cultivaron en un medio sólido con un agente selectivo, lo que da como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. El callo después se regeneró en plantas (etapa 5: la etapa de regeneración), y los callos cultivados en medio selectivo se cultivaron en medio sólido para regenerar las plantas.
Para la detección del polipéptido PIP-72 en tejido foliar, se pulverizaron 4 perforaciones/muestras foliares liofilizadas y se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía TWEEN™ 20 (PBST) al 0,1 %, beta-mercaptoetanol al 1 % que contenía 1 comprimido/7 ml de inhibidor de proteinasa Mini completo (Roche 1183615301). La suspensión se sonicó durante 2 min y después se centrifugó a 4 °C, 20.000 g durante 15 min. A una alícuota de sobrenadante se le añadió 1/3 de volumen de tampón de muestra NuPAGE® LDS 3X (Invitrogen™ (CA, EE. UU.), B-ME al 1 % que contiene 1 comprimido/7 ml de inhibidor de proteinasa Mini completo. La reacción se calentó a 80 °C durante 10 min y después se centrifugó. Se cargó una muestra de sobrenadante en geles Midi con Bis-Tris al 4-12 % con tampón de migración MES según las instrucciones del fabricante (Invitrogen™) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa usando un aparato iBlot® (Invitrogen™). La membrana de nitrocelulosa se incubó en PBST que contenía leche desnatada en polvo al 5 % durante 2 horas antes de incubación durante una noche en anticuerpo de conejo anti-PIP-72Aa purificado por afinidad en PBST durante una noche. La membrana se aclaró tres veces con PBST y después se incubó en PBST durante 15 min y después dos veces 5 min antes de incubar durante 2 horas en PBST con anticuerpo de cabra anticonejo-HRP durante 3 horas. Las proteínas detectadas se visualizaron usando reactivos de inmunoelectrotransferencia ECL (GE Healthcare cat. n.° RPN2106) y película Kodak® Biomax® MR. Para la detección de la proteína PIP-72Aa en raíces, las raíces se liofilizaron y se resuspendieron 2 mg de polvo por muestra en LDS, se añadió beta-mercaptoetanol al 1 % que contenía 1 comprimido/7 ml de inhibidor de proteinasa Mini completo. La reacción se calentó a 80 °C durante 10 min y después se centrifugó a 4 °C, 20.000 g durante 15 min. Se cargó una muestra de sobrenadante en geles Midi con Bis-Tris al 4-12 % con tampón de migración MES según las instrucciones del fabricante (Invitrogen™) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa usando un aparato iBlot® (Invitrogen™). La membrana de nitrocelulosa se incubó en PBST que contenía leche desnatada en polvo al 5 % durante 2 horas antes de incubación durante una noche en anticuerpo policlonal de conejo anti-PIP-72Aa purificado por afinidad en PBST durante una noche. La membrana se aclaró tres veces con PBST y después se incubó en PBST durante 15 min y después dos veces 5 min antes de incubar durante 2 horas en PBST con anticuerpo de cabra anticonejo-HRP durante 3 h. Las proteínas insecticidas unidas al anticuerpo se detectaron usando reactivos de inmunoelectrotransferencia ECL™ (GE Healthcare cat. n.° RPN2106) y película Kodak® Biomax® MR.
Las plantas de maíz transgénicas positivas para la expresión de las proteínas insecticidas se ensayan para la actividad plaguicida usando bioensayos convencionales conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, bioensayos de escisión de raíces y bioensayos de plantas completas. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número US 2003/0120054 y la publicación internacional número WO 2003/018810.
Ejemplo 7 - Construcciones de vector de expresión para la expresión de PIP-72Aa en plantas
Los vectores de expresión en plantas, PHP61666, PHP61668, PHP61664 se construyeron para que incluyeran un casete de transgén que contenía PIP-72Aa natural (SEQ ID NO: 1), variante 1 optimizada para maíz de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 850) y variante 2 optimizada para maíz de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 851), respectivamente, bajo el control del promotor del virus del mosaico del marvel (MMV) [Dey N y Maiti iB, 1999, Plant Mol. Biol. 40(5):771-82] en combinación con un elemento potenciador. También se ensayaron vectores adicionales, PHP64465, PHP64471 y PHP64468 que expresaban PIP-72Aa (variante 1 optimizada para el maíz) bajo diferentes combinaciones de promotor, intrón y terminador en eventos de maíz transgénico. PHP64465 expresa PIP-72Aa (variante 1) bajo el control del promotor de la poliubiquitina del maíz y la 5'UTR y el intrón asociados (Christensen AH y Quail RH, 1996, Transgenic Res 5:213-218) combinados con el potenciador de 35s (Kay et al., 1987, Science 236(4806):1299-1302. PHP64471 y PHP64468 expresan la variante 1 bajo el control del promotor del virus del veteado del plátano [BSV(AY)TR] (Diehn S, Lu AL y Simmons CR, 2012, patente de Estados Unidos 8338662B2) con el intrón ZM-HPLV9 (Diehn S et al., 2011, documento US2011039696) o ZM-ADH1 (Callis et al., 1987, Genes Develop 1:1183-1200), respectivamente. PHP69828 expresa la variante 3 optimizada para el maíz de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 853) con los mismos elementos reguladores que en PHP64471.
Estas construcciones se usaron para generar eventos de maíz transgénico para ensayar la eficacia contra el gusano de la raíz del maíz proporcionada por la expresión de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
Los resultados de eficacia en invernadero en T0 para los eventos generados a partir de estas construcciones se muestran en la figura 8. Se observó la eficacia de los eventos derivados de cada una de las construcciones con respecto a eventos de control negativo medida por protección de las raíces contra el gusano de la raíz del maíz occidental. La protección de la raíz se midió de acuerdo con el número de nudos de las raíces lesionados (CRWNIS = puntuación de lesión de nudos por gusano de la raíz del maíz) usando el método desarrollado por Oleson, et al. (2005) [J. Econ Entomol.
98(1 ):1-8]. La puntuación de lesión de la raíz se mide de "0" a "3", indicando "0" ausencia de lesión visible de la raíz, indicando "1" daño de 1 nudo de raíz, indicando "2" daño en 2 nudos de raíz e indicando "3" una puntuación máxima de 3 nudos de daño de raíz. Las puntuaciones intermedias (por ejemplo, 1,5) indican fracciones adicionales de nudos con daño (por ejemplo, un nudo y medio lesionado).
La figura 8 muestra que la mayoría de los eventos de las construcciones de ensayo (cada una representa un solo evento de la construcción) funcionaron mejor que el control negativo con puntuaciones de lesión por gusano de la raíz de <1,0. Varias construcciones, tales como PHP64471 y PHP64468, mostraron puntuaciones de lesión por gusano de la raíz que promediaron <0,2 entre todos los eventos ensayados.
Ejemplo 8 - Variantes de PIP-72Aa con múltiples sustituciones aminoacídicas
Para crear variantes de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) con múltiples cambios aminoacídicos, se generaron colecciones de variantes por barajado de ADN sintético (Ness et al., 2002, Nature Biotechnology 20, 1251-5) de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 1) y GBP_A3175 (Se Q ID NO: 19) o por mutagénesis dirigida al sitio (técnica QuikChange™ Lightning o técnica QuikChange™ II, Agilent, Santa Clara CA). Una alineación de secuencia de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) se muestra en la figura 5. En resumen, se realizaron reacciones de síntesis génica con los oligonucleótidos enumerados en la tabla 12.
Tabla 12
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Se generaron varios genes sintéticos usando diferentes conjuntos de cebadores indicados en la tabla 13. Las reacciones de síntesis génica F46, F31 y F39 utilizaron cada una conjuntos de 10 cebadores oligonucleotídicos diferenciados. Las reacciones de síntesis génica deg7, deg15, deg20 utilizaron conjuntos de cebadores oligonucleotídicos con degeneración de secuencia, produciendo colecciones de secuencias. Las reacciones de síntesis génica F46, F31, F39, deg7, deg15 y deg20 se combinaron y se cribaron como una sola colección.
Tabla 13
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Los fragmentos génicos sintéticos se subclonaron en el vector de expresión pCOLD™1 como se describe en el ejemplo 3. Los ADN plasmídicos resultantes se transformaron en E. coli, y la proteína se expresó como se describe en el ejemplo 3. Se realizaron bioensayos sobre el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el ejemplo 4 para determinar las variantes génicas que conservaban la actividad insecticida. Se realizó secuenciación de ADN en las variantes génicas activas. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las variantes del polipéptido PIP-72 activas resultantes se enumeran en la tabla 14. Se recuperaron cinco variantes activas de 59 variantes únicas que se cribaron. La tabla 15 muestra las sustituciones aminoacídicas de las variantes del polipéptido PIP-72 activas resultantes en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
Tabla 14
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Tabla 15
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Para generar polipéptidos PIP-72 activos adicionales, se realizó mutagénesis dirigida al sitio adicional usando las secuencias polinucleotídicas PIP-72Aa-Fb-9 (SEQ ID NO: 288), PIP-72Aa-Fb-27 (SEQ ID NO: 289) y PIP-72Aa-Fb-33 (SEQ ID NO: 291) como moldes por la técnica QuikChange™ (Agilent, 5301 Stevens Creek Blvd., Santa Clara CA) usando los cebadores oligonucleotídicos enumerados en la tabla 16. Los cebadores PIP-72Aa-Fb_9-27_1 (SEQ ID NO: 143), PIP-72Aa-Fb_9-27_2 (SEQ ID NO: 144), PIP-72Aa-Fb_9-27_3 (SEQ ID NO: 145), PIP-72Aa-Fb_9-27_12 (SEQ ID NO: 146), PIP-72Aa-Fb_9-27_13 (SEQ ID NO: 147) y PIP-72Aa-Fb_9-27_14 (SEQ ID NO: 148) se usaron para mutagénesis de los moldes de ADN plasmídico PIP-72Aa-Fb-09 (SEQ ID NO: 288) y PIP-72Aa-Fb-27 (SEQ ID NO: 289). Los cebadores PIP-72Aa-Fb_33_1 a PIP-72Aa-Fb_33_11 (SEQ ID NO: 149 a Se Q ID NO: 159) se usaron para mutagénesis del molde de ADN plasmídico PIP-72Aa-Fb-33 (SEQ ID NO: 291).
Tabla 16
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Los ADN plasmídicos resultantes se transformaron en E. coli, y la proteína se expresó como se describe en el ejemplo 3. Se realizaron bioensayos sobre el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el ejemplo 4 para determinar las variantes génicas que conservaban la actividad insecticida. Se realizó secuenciación de a Dn en las variantes génicas activas. El porcentaje de identidad en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), la identificación del clon, las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de las variantes activas resultantes se enumeran en la tabla 17. Las variantes del polipéptido PIP-72 de PIP-72Aa-Fb-9 (SEQ ID NO: 530) produjeron 33 variantes activas de 72 que se cribaron. Las variantes del polipéptido PIP-72 de PIP-72Aa-Fb-27 (SEQ ID NO: 530) produjeron 11 variantes activas de 52 que se cribaron. Las variantes del polipéptido PIP-72 de PIP-72Aa-Fb-33 (SEQ ID NO: 532) produjeron 47 variantes activas de 79 que se cribaron. La tabla 18 muestra las sustituciones aminoacídicas de las variantes del polipéptido PIP-72 activas resultantes en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
Tabla 17
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Tabla 18
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Ejemplo 9 - Variantes de PIP-72Aa con múltiples sustituciones aminoacídicas
Para generar variantes del polipéptido PIP-72 adicionales, se realizó mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores oligonucleotídicos enumerados en la tabla 19 para introducir sustituciones aminoacídicas de PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) en PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) o de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) en PIP-72Da (SEQ ID NO: 845 - resintetizado para facilitar la mutagénesis). Una alineación de secuencia de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) se muestra en la figura 6. Los fragmentos génicos sintéticos se subclonaron en el vector de expresión pCOLD™1 como se describe en el ejemplo 3.
Tabla 19
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Los ADN plasmídicos resultantes se transformaron en E. coli, y la proteína insecticida se expresó como se describe en el ejemplo 3. Se realizaron bioensayos sobre el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el ejemplo 4 para determinar las variantes génicas que conservaban la actividad insecticida. Se realizó secuenciación de ADN en las variantes génicas activas. El porcentaje de identidad en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), la denominación del clon, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las variantes del polipéptido PIP-72 activas resultantes se enumeran en la tabla 20. De las aproximadamente 180 variantes del polipéptido PIP-72 únicas que se cribaron, se identificaron 156 variantes activas. La tabla 21 resume el % de identidad de las variantes activas en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 17), el número de clones con cada % de identidad y la identificación del clon. La tabla 22 muestra las sustituciones aminoacídicas de las variantes del polipéptido PIP-72 activas resultantes en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
Tabla 20
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Tabla 21
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Tabla 22
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Ejemplo 10 - Identificación de posiciones aminoacídicas que afectan a la función de PIP-72Aa
La alineación de secuencia proteínica de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y otros miembros activos de la familia PIP-72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18), GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) y PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) se muestra en la figura 2. A partir de la alineación, se seleccionaron las posiciones aminoacídicas conservadas 7, 10, 20, 23, 24, 34, 60, 61, 66, 68, 75, 77, 79, 84 para mutagénesis por saturación usando los cebadores oligonucleotídicos indicados en la tabla 23 (técnica QuikChange™, Agilent, 5301 Stevens Creek Blvd, Santa Clara CA). Además, las posiciones 8, 11, 12, 15, 16, 19, 27, 30, 31, 32, 33, 53, 56, 58, 65, 70, 71, 73, 74, 78, 80, 81, 83, 85, 86, que difieren entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) se sometieron a mutagénesis por saturación usando una modificación del método QuikChange™ con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (New England Biolabs®, cat. n.° M0530L, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723), con los cebadores oligonucleotídicos indicados en la tabla 23. Los ADN plasmídicos resultantes se transformaron en E. coli, y la proteína se expresó como se describe en el ejemplo 3. Se realizaron bioensayos sobre el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el ejemplo 4 para determinar las variantes génicas que conservaban la actividad insecticida. La tabla 23 enumera las posiciones que se abordaron y resume los datos que se obtuvieron. Se muestran las sustituciones aminoacídicas que se identificaron por análisis de la secuencia de ADN. Para cada posición, se muestran las sustituciones aminoacídicas que producían variantes de PIP-72Aa que conservaban actividad contra el gusano de la raíz del maíz occidental.
Tabla 23
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Ejemplo 11 - Identificación del motivo 1 y análisis de posiciones aminoacídicas que afectan a la función de PIP-72Aa
A partir de la alineación de secuencia proteínica de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) y otros miembros activos de la familia incluyendo PIP-72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18), GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) y PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) mostrada en la figura 2, se identificó el motivo 1 conservado como potencialmente importante para la función (subrayado en la figura 2 con respecto a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). Cada posición dentro del motivo 1 (37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51) se sometió a mutagénesis por saturación usando los cebadores oligonucleotídicos indicados en la tabla 24. Los ADN plasmídicos resultantes se transformaron en E. coli y la proteína se expresó como se describe en el ejemplo 3. Se realizaron bioensayos sobre el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el ejemplo 4 para determinar las variantes génicas que conservaban la actividad insecticida. La tabla 24 enumera las posiciones que se mutagenizaron y resume los datos que se obtuvieron. Para cada posición, se muestran las sustituciones aminoacídicas que producían variantes del polipéptido PIP-72A que conservaban actividad contra el gusano de la raíz del maíz occidental. Además, se indican las sustituciones aminoacídicas asociadas con la expresión de proteína soluble en E. coli.
Tabla 24
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Ejemplo 12 - Variantes de PIP-72Aa con múltiples sustituciones aminoacídicas en el motivo 1
Se generaron variantes de PIP-72Aa con múltiples sustituciones aminoacídicas seleccionadas en el motivo 1 mediante la técnica QuikChange™ (Agilent, Santa Clara CA) usando una combinación de los cebadores oligonucleotídicos indicados en la tabla 25. Los ADN plasmídicos resultantes se transformaron en E. coli, y la proteína se expresó como se describe en el ejemplo 3. Se realizaron bioensayos sobre el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el ejemplo 4 para determinar las variantes génicas que conservaban la actividad insecticida. Se realizó secuenciación de ADN en las variantes génicas activas. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las variantes activas se enumeran en la tabla 26. De las 78 variantes cribadas, 20 tenían actividad detectable contra el gusano de la raíz del maíz occidental. Las variantes activas contenían entre 2 y 7 sustituciones aminoacídicas con respecto a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). La tabla 27 muestra las sustituciones aminoacídicas de las variantes del polipéptido PIP-72 activas resultantes en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
Tabla 25
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Tabla 26
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Tabla 27
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Ejemplo 13 - Identificación de posiciones aminoacídicas adicionales que afectan a la función de PIP-72Aa Las posiciones aminoacídicas restantes 2, 3, 4, 5, 6, 9, 13, 14, 17, 18, 21, 22, 25, 26, 28, 29, 35, 36, 52, 54, 55, 57, 59, 62, 63, 64, 67, 69, 72, 76, 82 se sometieron a mutagénesis por saturación como se describe en el ejemplo 11, usando los cebadores oligonucleotídicos indicados en la tabla 27. Los ADN plasmídicos resultantes se transformaron en E. coli, y la proteína se expresó como se describe en el ejemplo 3. Se realizaron bioensayos sobre el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el ejemplo 4 para determinar las variantes génicas que conservaban la actividad insecticida. La tabla 28 enumera las posiciones que se mutagenizaron y resume las sustituciones aminoacídicas identificadas por secuenciación de ADN y se muestran las sustituciones aminoacídicas que produjeron variantes de PIP-72Aa que conservaban actividad contra el gusano de la raíz del maíz occidental.
Tabla 28
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Ejemplo 14 - Variantes de PIP-72Aa con actividad mejorada contra el gusano de la raíz del maíz occidental
Para crear variantes de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) con actividad aumentada sobre gusano de la raíz del maíz occidental, se generaron colecciones por barajado de ADN sintético (Ness et al., 2002, Nature Biotechnology 20, 1251-5) de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 1) y por mutagénesis dirigida al sitio (técnica QuikChange™ Lightning o técnica QuikChange™ II, Agilent, Santa Clara CA). Se identificaron doce polipéptidos variantes de PIP-72 con actividad específica aumentada contra el gusano de la raíz del maíz occidental. Los polipéptidos variantes de PIP-72 A5, A5:10E, A5:10T, A5:10V, A5:10A, A5:10L, A5:10E/78H, A5:8M, A5:71H/83F, A5:4S/54Q/78H, A5:71H y 3_68 presentaron actividad insecticida mejorada entre aproximadamente 1,2 y 2 veces contra el gusano de la raíz del maíz occidental en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). La tabla 29 muestra las sustituciones aminoacídicas en comparación con PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) para cada uno de los polipéptidos variantes de PIP-72, el correspondiente indicador de secuencia de aminoácidos y el correspondiente identificador de secuencia de ácido nucleico. Las sustituciones aminoacídicas en comparación con A5 (SEQ ID NO: **) están en negrita.
Tabla 29
Figure imgf000134_0002
Para determinar la actividad sobre el gusano de la raíz del maíz occidental, se ensayaron las proteínas de ensayo como se describe en el ejemplo 4. Se usó un sistema de puntuación numérico de 0-3 basado en el tamaño y la mortalidad. Si no se observaba respuesta o el crecimiento era normal, se daba puntuación 0. Cuando el crecimiento estaba algo retardado sin nada de mortalidad, era puntuación 1. Puntuación 2 significaba muerte parcial (se usaron múltiples insectos en cada pocillo) y fuerte inhibición del crecimiento. Puntuación 3 indicaba mortalidad completa. Cada tratamiento se repitió 6 veces para la posible puntuación máxima de 18. En este sistema de puntuación, la puntuación 9 con 6 repeticiones de un tratamiento significa la respuesta de un 50 % (9 de 18) del tratamiento y se denominó CIL50 (concentración inhibidora del crecimiento y letal para una respuesta de un 50 %). Los datos de actividad se muestran en la tabla 30. Los números de CIL50 convertidos representan promedios entre 2 y 20 experimentos.
Tabla 30
Figure imgf000135_0001
Se han hecho esfuerzos por garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero deben permitirse algunos errores o desviaciones experimentales.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido PIP-72 que tiene actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera), en la que el polipéptido PIP-72 codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 32.
2. Un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PIP-72 que tiene actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera), en la que el polipéptido PIP-72 codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 32.
3. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido aislado de reivindicación 2 unido de forma funcional a un elemento regulador heterólogo; opcionalmente en el que el elemento regulador es un promotor que puede expresar una proteína en plantas.
4. Una planta transgénica que comprende:
A. la construcción de ADN de la reivindicación 1; o
B. transformada de forma estable con la construcción de ADN de la reivindicación 1.
5. Una semilla producida a partir de la planta de la reivindicación 4, en la que la semilla comprende la construcción de ADN de la reivindicación 1.
6. Una planta descendiente producida a partir de la semilla de la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora transformada con la construcción de ADN de la reivindicación 1;
opcionalmente en la que la célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula vegetal;
preferiblemente en la que la célula vegetal es una célula de planta monocotiledónea o dicotiledónea.
8. Un polipéptido PIP-72 recombinante que tiene actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera), en el que el polipéptido PIP-72 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 32.
9. Una composición que comprende el polipéptido PIP-72 recombinante de la reivindicación 8.
10. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido PIP-72 de la reivindicación 8.
11. Un método:
A. para controlar una población de plaga de insectos, que comprende poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida del polipéptido PIP-72 de la reivindicación 8; o
B. de inhibición del crecimiento o de eliminación de una plaga de insectos, que comprende poner en contacto la plaga de insectos con una composición que comprende una cantidad eficaz como insecticida del polipéptido PIP-72 de la reivindicación 8; o
C. para controlar una población de plaga de insectos resistente a una proteína plaguicida, que comprende poner en contacto la población de plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida del polipéptido PIP-72 de la reivindicación 8; o
D. de control de una infestación de insectos en una planta transgénica y que proporciona control de la resistencia de los insectos, que comprende expresar en la planta el polipéptido PIP-72 de la reivindicación 8.
12. Un método de identificación:
A. en una muestra biológica de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PIP-72 de la reivindicación 8, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un polinucleótido que hibrida con la secuencia de nucleótidos en condiciones de hibridación rigurosas y detectar la unión de dicho polinucleótido a dicha secuencia de nucleótidos, en el que dicha unión es diagnóstica de dicha secuencia de nucleótidos en dicha muestra; o
B. en una muestra del polipéptido PIP-72 de la reivindicación 8, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo que se une específicamente a dicho polipéptido, y detectar la unión, en el que dicha unión es diagnóstica de la presencia de dicho polipéptido en dicha muestra.
13. La construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el polipéptido PIP-72 comprende:
A) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 32; o
B) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad con SEQ ID NO: 32; o
C) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
14. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el polipéptido PIP-72 comprende:
A) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 32; o
B) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad con SEQ ID NO: 32; o
C) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
15. El polipéptido PIP-72 recombinante de la reivindicación 8, en el que el polipéptido PIP-72 comprende: A) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 32; o
B) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad con SEQ ID NO: 32; o
C) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
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