BR122020001770B1 - Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto - Google Patents

Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína inseticida. Em particular, as sequências de ácidos nucleicos são úteis para preparar plantas e micro-organismos que possuem atividade inseticida. Dessa forma, bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes transformadas são fornecidas. As composições são ácidos nucleicos e proteínas inseticidas de espécies bacterianas. As sequências podem ser usadas na construção de vetores de expressão para transformação subsequente em organismos de interesse incluindo plantas, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos). As proteínas pesticidas são úteis no controle, na inibição do crescimento ou na morte de populações de pragas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, fungos, hemípteros e nematódeos e para produzir composições com atividade inseticida.

Description

Referência à listagem de sequências enviada eletronicamente
[0001] Uma listagem de sequências com o nome de arquivo “5345PCT_sequence_listing.txt” criada em quinta-feira, 28 de agosto de 2014, e tendo um tamanho de 576 kilobytes é depositada em forma legível por computador simultaneamente ao relatório descritivo. A listagem de sequências faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.
Campo da invenção
[0002] Esta revelação refere-se ao campo da biologia molecular. São fornecidos novos genes que codificam proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são úteis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes a pragas.
Antecedentes da invenção
[0003] O controle biológico de pragas de inseto de importância agrícola com o uso de um agente microbiano, como fungos, bactérias, ou outras espécies de insetos consiste em uma alternativa ambientalmente amigável e comercialmente atrativa aos pesticidas químicos sintéticos. Geralmente falando, o uso de biopesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos ambientais, e ainda fornecem uma especificidade ao alvo maior que aquela que é característica de inseticidas químicos de amplo espectro tradicionais. Além disso, os biopesticidas custam frequentemente menos para serem produzidos e, portanto, melhoram o rendimento econômico para uma ampla variedade de culturas.
[0004] Certas espécies de micro-organismos do gênero Bacillus são conhecidas por possuírem atividade pesticida contra uma gama de pragas de inseto, incluindo lepidópteros, dípteros, coleópteros, hemípteros e outros. Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus popilliae estão entre os agentes de biocontrole mais bem-sucedidos descobertos até o momento. A patogenicidade a insetos também tem sido atribuída a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus e B. cereus. Os inseticidas microbianos, particularmente, aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, desempenharam um papel importante na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas.
[0005] Plantas para cultivo com resistência acentuada a insetos foram desenvolvidas por meio de manipulação genética de plantas para cultivo para a produção de proteínas pesticidas de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho e algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas a partir de cepas de Bt. Essas culturas geneticamente manipuladas são atualmente usadas amplamente na agricultura, e têm fornecido aos agricultores uma alternativa ambientalmente amigável aos métodos de controle de insetos tradicionais. Embora elas tenham provado ser muito bem-sucedidas comercialmente, essas plantas para cultivo geneticamente modificadas para a resistência a insetos fornecem resistência apenas para uma faixa estreita de pragas de inseto importantes economicamente. Em alguns casos, os insetos podem desenvolver resistência a diferentes compostos inseticidas, o que gera a necessidade de identificar agentes de controle biológico alternativos para o controle de pragas.
[0006] Consequentemente, existe uma necessidade por novas proteínas pesticidas com diferentes gamas de atividade inseticida contra praga de insetos, por exemplo, proteínas inseticidas que são ativas contra uma variedade de insetos na ordem Lepidoptera e na ordem Coleoptera incluindo, mas não se limitando a praga de insetos que desenvolveram resistência aos inseticidas existentes.
Sumário da invenção
[0007] São fornecidas composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes. As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucleico, e células hospedeiras compreendendo os vetores. As composições incluem também as sequências de polipeptídeos pesticidas e anticorpos para estes polipeptídeos. As sequências de ácidos nucleicos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassete de expressão para a transformação e expressão em organismos, inclusive micro-organismos e plantas. O nucleotídeo ou as sequências de aminoácidos podem ser sequências sintéticas que tenham sido projetadas para expressão em um organismo incluindo, mas não se limitando a, um micro-organismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformados.
[0008] Em particular, são fornecidas moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que codificam polipeptídeos de Proteína Inseticida-72 (PIP-72) de Pseudomonas incluindo substituições, deleções, inserções de aminoácidos e fragmentos dos mesmos, e combinações dos mesmos. Adicionalmente, são abrangidas as sequências de aminoácidos que correspondem aos polipeptídeos PIP-72. São fornecidas moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes capazes de codificar um polipeptídeo PIP-72 de SEQ ID NO: 849 assim como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos. Sequências de ácidos nucleicos que são complementares a uma sequência de ácidos nucleicos das modalidades ou que hibridizam com uma sequência das modalidades também são abrangidas. Também são fornecidos polipeptídeos PIP- 72 isolados ou recombinantes de SEQ ID NO: 849 assim como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos.
[0009] São fornecidos métodos para produzir os polipeptídeos e para usar estes polipeptídeos para controlar ou matar uma praga de lepidópteros, coleópteros, nematódeos, fungos e/ou dípteros. As plantas transgênicas das modalidades expressam uma ou mais das sequências pesticidas aqui reveladas. Em várias modalidades, a planta transgênica compreende, adicionalmente, um ou mais genes adicionais para resistência a insetos, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas coleópteras, lepidópteras, hemípteras ou de nematódeos. Será compreendido por um elemento versado na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que confere um traço agronômico de interesse.
[0010] Os métodos para a detecção dos ácidos nucleicos e polipeptídeos das modalidades em uma amostra também estão incluídos. É fornecido um kit para detectar a presença de um polipeptídeo PIP-72 ou para detectar a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo PIP-72 em uma amostra. O kit pode ser fornecido junto com todos os reagentes e amostras de controle necessárias para executar um método para detectar o agente pretendido, assim como instruções para uso.
[0011] As composições e métodos das modalidades são úteis para a produção de organismos com resistência ou tolerância a pragas intensificada. Esses organismos e composições compreendendo os organismos são desejáveis para fins agrícolas. As composições das modalidades também são úteis para gerar proteínas alteradas ou aprimoradas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de polipeptídeos PIP-72 ou ácidos nucleicos em produtos ou organismos.
Breve descrição das figuras
[0012] A Figura 1 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Ea (SEQ ID NO: 16), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20), SRBS_294080 (SEQ ID NO: 22); JG43047 (SEQ ID NO: 24); SwiRh_4910 (SEQ ID NO: 26); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28), PFL_6283 (SEQ ID NO: 30); PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32); XBJ1_1078 (SEQ ID NO: 34); plu2373 (SEQ ID NO: 36); e PIP-72Ge (SEQ ID NO: 38). A diversidade da sequência está realçada. Os aminoácidos 37-51 (motivo 1) relativos à PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) estão sublinhados.
[0013] A Figura 2 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927); PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Bb (SEQ ID NO: 928); PIP- 72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); WP_030131237 (SEQ ID NO: 929); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); e GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20). A diversidade de aminoácido entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0014] A Figura 3 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); e PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). A diversidade de aminoácido entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0015] A Figura 4 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de WP_030131237 (SEQ ID NO: 929) PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); e PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). A diversidade de aminoácido entre PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0016] A Figura 5 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos de PIP-72Fh (SEQ ID NO: 932), PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941); PIP-72Fi (SEQ ID NO: 933); PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 14). A diversidade de aminoácido entre PIP-72Ca (SEQ ID NO: 2) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0017] A Figura 6 mostra os resultados de eficácia de GH de T0 para eventos gerados a partir dos construtos PHP61664, PHP61666, PHP61668, PHP64465, PHP64468, PHP64471 e PHP69828. A eficácia de eventos derivados de ambos os construtos foi observada em relação a eventos de controle negativo conforme medido pela proteção da raiz contra a lagarta da raiz do milho ocidental. A proteção de raiz foi medida de acordo com o número de nós de raízes lesadas (CRWNIS = classificação de lesão de nó de lagarta da raiz do milho) com o uso do método desenvolvido por Oleson, et al. (2005) [J. Econ Entomol. 98(1):1 a 8]. A classificação de lesão de raiz é medida de “0” a “3” com “0” indicando nenhuma lesão de raiz visível, “1” indicando 1 nó de dano de raiz, “2” indicando 2 nós de dano de raiz, e “3” indicando uma classificação máxima de 3 nós de dano de raiz. Cada símbolo, (triângulo, quadrado ou círculo) representa um evento único.
Descrição detalhada
[0018] Deve-se compreender que esta invenção não é limitada pela metodologia, pelos protocolos, pelas linhagens celulares, gêneros, e reagentes descritos, já que estes podem variar. Também deve ser compreendido que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito apenas de descrever as modalidades particulares, e não se destina a ser limitante do escopo da presente descrição.
[0019] Como usado aqui, as formas singulares “um/uma”, “e”, e “o/a” incluem referências no plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Desta forma, por exemplo, referência a “uma célula” inclui uma pluralidade destas células e referência a “a proteína” inclui referência a uma ou mais proteínas e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica, e assim em diante. Todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado conforme comumente compreendido pelo versado na técnica à qual esta descrição pertence, exceto onde indicado claramente em contrário.
[0020] A presente revelação é direcionada a composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo PIP-72. Em particular, as sequências de ácidos nucleicos das modalidades são úteis para preparar plantas e micro-organismos que possuem atividade pesticida. Dessa forma, bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes transformadas são fornecidas. As composições são ácidos nucleicos e proteínas pesticidas de espécies bacterianas. As sequências de ácidos nucleicos são usadas na construção de vetores de expressão para a subsequente transformação em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos), e para a geração de polipeptídeos PIP-72 alterados por meio de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida, troca de domínio ou embaralhamento de DNA. Os polipeptídeos PIP-72 encontram utilização no controle ou no extermínio de populações de praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, fungos, hemípteros e nematódeos e para produzir composições com atividade pesticida. As pragas de insetos de interesse incluem, mas não se limitado a, espécies de Lepidoptera incluindo, mas não se limitando a: traça-das- crucíferas, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker; e lagarta-da-soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner e espécies de Coleoptera incluindo, mas não se limitando ao crisomelídeo do sistema radicular de milho ocidental (Diabrotica virgifera) - WCRW, crisomelídeo do sistema radicular de milho meridional (Diabrotica undecimpunctata howardi) - SCRW, e crisomelídeo do sistema radicular de milho setentrional (Diabrotica barberi) - NCRW.
[0021] O termo “toxina pesticida” ou “proteína pesticida” é usado na presente invenção para se referir a uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas não se limitando a, membros das ordens Lepidoptera, Diptera, Hemiptera e Coleoptera ou do filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia para esta proteína. Proteínas pesticidas foram isoladas de organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. As proteínas pesticidas incluem, mas não se limitam a: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp., como PSEEN3174 (Monalysin; (2011) PLoS Pathogens 7:1 a 13); da cepa de Pseudomonas protegens CHA0 e Pf-5 (anteriormente, fluorescens) (Pechy- Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2.368 a 2.386; n° de acesso do GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem., 58:12.343 a 12.349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45 a 50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal, 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069); Patente US número 6.048.838, e Patente US número 6.379.946; um polipeptídeo PIP-1 de número de série US 13/792861; um polipeptídeo AfIP-1A e/ou AfIP-1B de número de série US 13/800233; polipeptídeos PHI-4 de número de série US 13/839702; polipeptídeos PIP-47 de número de série US 61/866747; proteínas inseticidas de número de série US n° 61/863761 e 61/863763; e δ-endotoxinas incluindo, mas não se limitando às classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51, Cry52, Cry 53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 e Cry71 dos genes da δ-endotoxina e dos genes citolíticos cyt1 e cyt2 de B. thuringiensis. Membros destas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, mas não se limitam a, Cry1Aa1 (n° de acesso AAA22353); Cry1Aa2 (n° de acesso AAA22552); Cry1Aa3 (n° de acesso BAA00257); Cry1Aa4 (n° de acesso CAA31886); Cry1Aa5 (n° de acesso BAA04468); Cry1Aa6 (n° de acesso AAA86265); Cry1Aa7 (n° de acesso AAD46139); Cry1Aa8 (n° de acesso I26149); Cry1Aa9 (n° de acesso BAA77213); Cry1Aa10 (n° de acesso AAD55382); Cry1Aa11 (n° de acesso CAA70856); Cry1Aa12 (n° de acesso AAP80146); Cry1Aa13 (n° de acesso AAM44305); Cry1Aa14 (n° de acesso AAP40639); Cry1Aa15 (n° de acesso AAY66993); Cry1Aa16 (n° de acesso HQ439776); Cry1Aa17 (n° de acesso HQ439788); Cry1Aa18 (n° de acesso HQ439790); Cry1Aa19 (n° de acesso HQ685121); Cry1Aa20 (n° de acesso JF340156); Cry1Aa21 (n° de acesso JN651496); Cry1Aa22 (n° de acesso KC158223); Cry1Ab1 (n° de acesso AAA22330); Cry1Ab2 (n° de acesso AAA22613); Cry1Ab3 (n° de acesso AAA22561); Cry1Ab4 (n° de acesso BAA00071); Cry1Ab5 (n° de acesso CAA28405); 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Cry61Aa3 (n° de acesso EEM19308); Cry62Aa1 (n° de acesso HM054509); Cry63Aa1 (n° de acesso BAI44028); Cry64Aa1 (n° de acesso BAJ05397); Cry65Aa1 (n° de acesso HM461868); Cry65Aa2 (n° de acesso ZP_04123838); Cry66Aa1 (n° de acesso HM485581); Cry66Aa2 (n° de acesso ZP_04099945); Cry67Aa1 (n° de acesso HM485582); Cry67Aa2 (n° de acesso ZP_04148882); Cry68Aa1 (n° de acesso HQ113114); Cry69Aa1 (n° de acesso HQ401006); Cry69Aa2 (n° de acesso JQ821388); Cry69Ab1 (n° de acesso JN209957); Cry70Aa1 (n° de acesso JN646781); Cry70Ba1 (n° de acesso ADO51070); Cry70Bb1 (n° de acesso EEL67276); Cry71Aa1 (n° de acesso JX025568); Cry72Aa1 (n° de acesso JX025569); Cyt1Aa (Gebank, n° de acesso X03182); Cyt1Ab (Gebank, n° de acesso X98793); Cyt1B (Gebank, n° de acesso U37196); Cyt2A (Gebank, n° de acesso Z14147); e Cyt2B (Gebank, n° de acesso U52043).
[0022] Exemplos de δ-endotoxinas incluem, também, mas não se limitam a, proteínas Cry1A das patentes US n°s 5.880.275, 7.858.849, 8.530.411, 8.575.433 e 8.686.233; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal de variantes de a-hélice 1 e/ou α- hélice 2 das proteínas cry, como Cry1A, Cry3A) das Patentes US números 8.304.604, 8.304.605 e 8.476.226; Cry1B do pedido de patente US número de série 10/525.318; Cry1C da patente US n° 6.033.874; Cry1F das Patentes US números 5.188.960 e 6.218.188; quimeras Cry1A/F das patentes US n°s 7.070.982; 6.962.705 e 6.713.063); uma proteína Cry2, como a proteína Cry2Ab da patente US n° 7.064.249); uma proteína Cry3A que inclui, mas não se limita a uma proteína híbrida inseticida manipulada (eHIP) criada pela fusão de combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (publicação de pedido de patente US n° 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das patentes US n°s 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 e 7.462.760; uma proteína Cry9, como os membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F, incluindo, mas não se limitando a, a proteína Cry9D da patente US n° 8.802.933 e a proteína Cry9B da patente US n° 8.802.934; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7.145 a 7.151; uma proteína Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das patentes US n°s 6.127.180, 6.624.145 e 6.340.593; proteínas CryET33 e cryET34 das patentes US n°s 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e 7.504.229; homólogos de CryET33 e CryET34 da publicação de patente US n° 2006/0191034, 2012/0278954, e publicação PCT número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das patentes US n°s 6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma toxina TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 da publicação de pedido de patente US número 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 do pedido PCT US 2006/033867; toxinas TIC853, da patente US 8.513.494, AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da patente US n° 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 da Patente US número 7,923,602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 de WO 2006/083891; AXMI-010 do documento WO 2005/038032; AXMI-003 do documento WO 2005/021585; AXMI-008 da publicação de pedido de patente US número 2004/0250311; AXMI-006 da publicação de pedido de patente US número 2004/0216186; AXMI-007 da publicação de pedido de patente US número 2004/0210965; AXMI-009 do pedido de patente US número 2004/0210964; AXMI-014 da publicação de pedido de patente US número 2004/0197917; AXMI-004 da publicação de pedido de patente US número 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 do documento WO 2004/074462; AXMI- 150 da patente US n° 8.084.416; AXMI-205 da publicação de pedido de patente US número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 da publicação de pedido de patente US número 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas da publicação de pedido de patente US número 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z de WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 do documento WO 2011/103247 e patente US n° 8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI- 005, AXMI-163 e AXMI-184 da patente US n° 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 da publicação de pedido de patente US número 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 da publicação de pedido de patente US número 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da patente US n° 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 da publicação de pedido de patente US n° 2010/0005543, AXMI270 da publicação de pedido de patente US n° US20140223598, AXMI279 da publicação de pedido de patente US n° US20140223599, proteínas cry, como Cry1A e Cry3A, tendo os sítios proteolíticos modificados da patente US n° 8.319.019; uma proteína toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 da publicação de pedido de patente US n° 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas dos versados na técnica (consulte, Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”). A atividade inseticida das proteínas Cry é bem conhecida de um versado na técnica (para uma revisão, consulte, van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). O uso de proteínas Cry como característica de planta transgênica é bem conhecido de um versado na técnica e plantas transgênicas para Cry incluindo, mas não se limitando a, plantas expressando Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam aprovação regulatória (consulte Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 e o banco de dados CERA (2010, GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA)), Fundação de pesquisa ILSI, Washington D.C., EUA em cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida do versado na técnica também pode ser expressa em plantas, como Vip3Ab & Cry1Fa (US2012/0317682); Cry1BE & Cry1F (US2012/0311746); Cry1CA & Cry1AB (US2012/0311745); Cry1F & CryCa (US2012/0317681); Cry1DA & Cry1BE (US2012/0331590); Cry1DA & Cry1Fa (US2012/0331589); Cry1AB & Cry1BE (US2012/0324606); Cry1Fa & Cry2Aa e Cry1I & Cry1E (US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab & Cry3Aa (US20130167268); Cry1Ab e Cry1F (US20140182018); e Cry3A e Cry1Ab ou Vip3Aa (US20130116170). As proteínas pesticidas incluem, também, lipases inseticidas incluindo acil hidrolases de lipídio da patente US n° 7.491.869, e colesterol oxidases, tal como as de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). As proteínas pesticidas incluem, também as toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das patentes US n°s 5.877.012, 6.107.279 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686, e 8.237.020 e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas do versado na técnica (consulte lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, que pode ser acessado na internet usando o prefixo “www”). As proteínas pesticidas incluem, também proteínas do complexo de toxina (TC), que podem ser obtidas a partir de organismos como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consulte as patentes US n°s 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida “independente” e outras proteínas TC acentuam a atividade das toxinas independentes produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC “independente” (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser intensificada por um ou mais “potenciadores” da proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme mencionado no presente documento, proteínas da classe A (“proteína A”) são toxinas independentes. As proteínas da classe B (“proteína B”) e as proteínas da classe C (“proteína C”) intensificam a toxicidade das proteínas da classe A. Exemplos de proteínas de classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Exemplos de proteínas de classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Exemplos de proteínas de classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas incluem, também, proteínas do veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos do veneno de aranha incluem, mas não se limitam a peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (patente US n° 8.334.366).
[0023] Em algumas modalidades, os polipeptídeos PIP-72 incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de ácidos nucleicos de comprimento total reveladas no presente documento, e as sequências de aminoácidos que são mais curtas que as sequências de comprimento total, ou devido ao uso de um sítio de início à jusante alternativo ou devido a um processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressada ou na praga após ingestão da proteína.
[0024] Desta forma, são aqui fornecidas sequências de ácido nucleico isoladas ou recombinantes inovadoras que conferem atividade pesticida. Também são fornecidas as sequências de aminoácidos de polipeptídeos PIP-72. A proteína resultante da tradução desses genes de polipeptídeo PIP-72 permite que as células controlem ou exterminem pragas que ingerirem a mesma.
Cepas bacterianas
[0025] Um aspecto se refere a cepas bacterianas que expressam um polipeptídeo PIP-72. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é uma espécie de Halomonas, Photorhabdus, Xenorhabdus, Burkholderia, Paludibacterium ou Pseudomonas. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é uma cepa de Halomonas anticariensis, Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus bovienii, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia multivorans, Burkholderia thailandensis, Paludibacterium yongneupense, Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas entomophila, Pseudomonas chlororaphis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas congelans; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas protegens, Pseudomonas ficuserectae; Pseudomonas mosselii ou Pseudomonas brassicacearum. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é uma cultura biologicamente pura de uma cepa SS143D5 de Pseudomonas chlororaphis, depositada em 7 de fevereiro de 2013, com o número de acesso NRRL B-50810 na Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, EUA (nrrl.ncaur.usda.gov, que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”). O depósito será mantido sob os termos do Budapest Treaty (Tratado de Budapeste) sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de micro-organismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes. Esses depósitos foram feitos meramente como uma a conveniência para as pessoas versadas na técnica e não são uma admissão de que um depósito é necessário sob o 35 U.S.C. §112. Acesso a este depósito será disponível durante a pendência do pedido ao Comissionário de Marcas e Patentes e pessoas determinadas pelo Comissionário a serem intituladas a isso mediante solicitação. Mediante aceitação de quaisquer reivindicações no pedido, a(s) Requerente(s) tornarão disponível para o público, de acordo com 37 C.F.R. § 1.808, amostra(s) do depósito na Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA. Este depósito será mantido no centro depositário NRRL, que é um centro depositário público, durante um período de 30 anos, ou 5 anos após a última solicitação, ou pela vida eficaz da patente, o que for mais longo, e será substituído caso se torne não viável durante este período. Os depósitos estarão irrevogável, irrestrita e incondicionalmente disponíveis ao público após a concessão de uma patente. Adicionalmente, os Requerente(s) cumpriram todos os requerimentos de 37 C.F.R. §§1.801 - 1.809, incluindo fornecer uma indicação da viabilidade da amostra no depósito. O(s) requerente(s) não têm autoridade para renunciar a quaisquer restrições impostas pela lei sobre a transferência de material biológico ou seu transporte no comércio. O(s) Requerente(s) não renuncia(m) a qualquer violação dos seus direitos concedidos com esta patente. Entretanto, deve-se compreender que a disponibilidade de um depósito não constitui licença para praticar a presente invenção em derrogação aos direitos de patente concedidos por ação governamental. Moléculas de Ácido Nucleico, e Variantes e Fragmentos das mesmas
[0026] Outro aspecto se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que compreendem sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos PIP-72 ou porções biologicamente ativas dos mesmos, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência. Como usado aqui, o termo “molécula de ácido nucleico” se refere a moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA, DNA genômico, DNA plastidial, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou dupla fita, mas é, de preferência, DNA dupla fita.
[0027] Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) “isolada” é usada na presente invenção para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos (ou DNA) que não está mais no seu ambiente natural, por exemplo in vitro. Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) “recombinante” é usada na presente invenção para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos (ou DNA) que está em uma célula hospedeira bacteriana ou vegetal recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico “isolado” ou “recombinante” é isento de sequências (de preferência, sequências que codificam proteínas) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para os propósitos da revelação, “isolado” ou “recombinante” quando usados para se referirem a moléculas de ácido nucleico exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo PIP-72 pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de ácidos nucleicos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico deriva.
[0028] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo de PIP-72 tem uma ou mais mudanças na sequência de ácidos nucleicos em comparação à sequência de ácidos nucleicos nativa ou genômica. Em algumas modalidades, a alteração na sequência de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, mas não se limita a, alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à degeneração do código genético; alterações na sequência de ácidos nucleicos causadas por substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais íntrons; deleção de uma ou mais regiões reguladoras a montante ou a jusante; e deleção da região 5’ e/ou 3’ não a traduzida associada a sequência de ácidos nucleicos genômica. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de PIP-72 é uma sequência não genômica.
[0029] É contemplada uma variedade de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de PIP-72 ou proteínas relacionadas. Tais polinucleotídeos são úteis para a produção de polipeptídeos PIP-72 em células hospedeiras quando ligados funcionalmente ao promotor adequado, à terminação de transcrição e/ou às sequências de poliadenilação. Tais polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos de PIP-72 ou proteínas relacionadas.
[0030] Fontes de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PIP-72 ou proteínas relacionadas incluem, mas não se limitam a, cepas de Halomonas anticariensis, Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus bovienii, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia multivorans, Burkholderia thailandensis, Paludibacterium yongneupense, Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas entomophila, Pseudomonas chlororaphis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas congelans; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas protegens, Pseudomonas ficuserectae; Pseudomonas mosselii ou Pseudomonas brassicacearum. Fontes de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PIP-72 ou proteínas relacionadas incluem, mas não se limitam a, uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Aa da SEQ ID NO: 1) codificando o polipeptídeo PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2; uma cepa de Pseudomonas rhodesiae que contém o polinucleotídeo PIP-72Ba da SEQ ID NO: 3) codificando o polipeptídeo PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Ca da SEQ ID NO: 5) codificando o polipeptídeo PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6; uma cepa de Pseudomonas mandelii que contém o polinucleotídeo PIP-72Cb da SEQ ID NO: 7) codificando o polipeptídeo PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8; uma cepa de Pseudomonas congelans que contém o polinucleotídeo PIP-72Da da SEQ ID NO: 9) codificando o polipeptídeo PIP-72Da (SEQ ID NO: 10; uma cepa de Pseudomonas mandelii que contém o polinucleotídeo PIP-72Db da SEQ ID NO: 11) codificando o polipeptídeo PIP-72Db (SEQ ID NO: 12; uma cepa de Pseudomonas ficuserectae que contém o polinucleotídeo PIP-72Dc da SEQ ID NO: 13) codificando o polipeptídeo PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14; uma cepa de Pseudomonas mosselii que contém o polinucleotídeo PIP-72Fa da SEQ ID NO: 17) codificando o polipeptídeo PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Ff da SEQ ID NO: 27) codificando o polipeptídeo PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gb da SEQ ID NO: 31) codificando o polipeptídeo PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP- 72Ab da SEQ ID NO: 949) codificando o polipeptídeo PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927; uma cepa de Pseudomonas brassicacearum que contém o polinucleotídeo PIP-72Bb da SEQ ID NO: 950) codificando o polipeptídeo PIP-72Ab (SEQ ID NO: 928; uma cepa de Pseudomonas entomophila que contém o polinucleotídeo PIP-72Fh da SEQ ID NO: 954) codificando o polipeptídeo PIP-72AFh (SEQ ID NO: 932; uma cepa de Pseudomonas entomophila que contém o polinucleotídeo PIP-72Fh da SEQ ID NO: 955) codificando o polipeptídeo PIP-72AFh (SEQ ID NO: 933; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Fj da SEQ ID NO: 956) codificando o polipeptídeo PIP-72Fj (SEQ ID NO: 934; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Fk da SEQ ID NO: 957) codificando o polipeptídeo PIP-72Fk (SEQ ID NO: 935; uma cepa de Burkholderia multivorans que contém o polinucleotídeo PIP-72Fl da SEQ ID NO: 958) codificando o polipeptídeo PIP-72Fl (SEQ ID NO: 936; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gg da SEQ ID NO: 961) codificando o polipeptídeo PIP-72Gg (SEQ ID NO: 939; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gh da SEQ ID NO: 962) codificando o polipeptídeo PIP-72Gh (SEQ ID NO: 940; uma cepa de Pseudomonas mosselii que contém o polinucleotídeo PIP- 72Gi da SEQ ID NO: 963) codificando o polipeptídeo PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941; uma cepa de Pseudomonas protegens que contém o polinucleotídeo PIP-72Gk da SEQ ID NO: 965) codificando o polipeptídeo PIP-72Gk (SEQ ID NO: 943; uma cepa de Pseudomonas plecoglossicida que contém o polinucleotídeo PIP-72Gl da SEQ ID NO: 966) codificando o polipeptídeo PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944; e uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gn da SEQ ID NO: 968) codificando o polipeptídeo PIP-72Gn (SEQ ID NO: 946. Essas sequências de polinucleotídeos foram isoladas de um hospedeiro de Halomonas, Photorhabdus, Xenorhabdus, Burkholderia, Paludibacterium ou Pseudomonas e são, dessa forma, adequadas para a expressão do polipeptídeo PIP-72 codificado em outros hospedeiros bacterianos. Por exemplo, a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968 podem ser usadas para expressar polipeptídeos PIP-72 em hospedeiros bacterianos que incluem, mas não se limitam a células hospedeiras bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas e Rhizobium. Os polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos de PIP-72 ou proteínas relacionadas. Essas sondas podem ser usadas para identificar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos derivados de Halomonas, Photorhabdus, Xenorhabdus, Burkholderia, Paludibacterium, Pseudomonas ou outras bactérias relacionadas.
[0031] Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de PIP-72 também podem ser sintetizados de novo de uma sequência de polipeptídeos de PIP-72. A sequência do gene de polinucleotídeo pode ser deduzida a partir de uma sequência de polipeptídeos PIP-72 através do uso do código genético. Programas de computador como “BackTranslate” (Pacote GCG®, Acclerys, Inc. San Diego, Califórnia, EUA) podem ser usados para converter uma sequência de peptídeos na sequência de nucleotídeos correspondente que codifica o peptídeo. Exemplos de sequências de polipeptídeos PIP-72 que podem ser usadas para obter sequências de codificação de nucleotídeo correspondentes incluem, mas não se limitam a, sequência de polipeptídeos PIP- 72 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946. Ademais, as sequências de polinucleotídeo PIP-72 sintéticas da revelação podem ser desenhadas de modo a serem expressadas em plantas. A patente US n° 5.500.365 descreve um método para sintetizar genes de planta para melhorar o nível de expressão da proteína codificada pelo gene sintetizado. Este método está relacionado à modificação das sequências gênicas estruturais do transgene exógeno, para fazer com que elas sejam transcritas, processadas, traduzidas e expressas de modo mais eficiente pela planta. As características dos genes que são bem expressas em plantas incluem a eliminação de sequências que podem causar splicing indesejado de íntrons ou poliadenilação na região codificante de um transcrito gênico enquanto retém substancialmente a sequência de aminoácidos da porção tóxica da proteína inseticida. Um método similar para se obter a expressão intensificada de transgenes em plantas monocotiledôneas é apresentado na patente US n° 5.689.052.
[0032] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo PIP-72 é um polinucleotídeo que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968, e suas variantes, fragmentos e complementos. O termo “complemento” é usado na presente invenção para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos que é suficientemente complementar a uma dada sequência de ácidos nucleicos de modo que ela pode hibridizar à dada sequência de ácidos nucleicos para formar assim um dúplex estável. O termo “variantes de sequência de polinucleotídeos” é usado na presente invenção para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos que, exceto pela degeneração do código genético codifica o mesmo polipeptídeo.
[0033] Em algumas modalidades a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PIP-72 é uma sequência de ácidos nucleicos não genômica. Com usado aqui uma “sequência de ácidos nucleicos não genômica” ou “molécula de ácido nucleico não genômica” se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais alterações na sequência de ácido nucleico em comparação com uma sequência de ácido nucleico nativa ou genômica. Em algumas modalidades, a alteração para uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, mas não se limita a, alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à degeneração do código genético; otimização do códon da sequência de ácidos nucleicos para expressão em plantas; alterações na sequência de ácidos nucleicos para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais íntrons associados com a sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de um ou mais íntrons heterólogos; deleção de uma ou mais regiões reguladoras à montante ou à jusante associadas com a sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma ou mais regiões reguladoras heterólogas à montante ou à jusante; deleção da região 5’ e/ou 3’ não-traduzida associada com a sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma região 5’ e/ou 3’ não-traduzida heteróloga; e modificação de um sítio de poliadenilação. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica é um cDNA. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica é uma sequência de ácidos nucleicos sintética. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica não é a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968.
[0034] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0035] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0036] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0037] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0038] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0039] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64% 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76% 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0040] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0041] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0042] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0043] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0044] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0045] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 927, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0046] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 928, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0047] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 932, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0048] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 933, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0049] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 934, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0050] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 935, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0051] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 936, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0052] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 939, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0053] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 940, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0054] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 941, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0055] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64% 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76% 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 943, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0056] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 944, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0057] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 945, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0058] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 946, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0059] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0060] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 2 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0061] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 4 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0062] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 6 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0063] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 8 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0064] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 10 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0065] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 12 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0066] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 14 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0067] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 18 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0068] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 28 e o polipeptídeo PIP- 72 tem atividade pesticida.
[0069] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 32 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0070] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 927, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 927 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0071] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 928, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 928 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0072] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 932, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 932 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0073] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 933, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 933 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0074] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 934, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 934 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0075] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 935, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 935 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0076] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 936, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 936 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0077] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 939, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 939 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0078] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 940, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 940 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0079] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 941, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 941 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0080] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 943, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 943 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0081] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 944, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 944 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0082] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 945, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 945 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0083] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 946, em que o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos uma alteração de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 946 e sendo que o polipeptídeo PIP-72 tem atividade pesticida.
[0084] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946.
[0085] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0086] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 4.
[0087] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 6.
[0088] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 8.
[0089] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 10.
[0090] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 12.
[0091] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 14.
[0092] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 18.
[0093] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 28.
[0094] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32 tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 32.
[0095] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 927 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 927.
[0096] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 928 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 928.
[0097] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 932 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 932.
[0098] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 933 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 933.
[0099] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 934 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 934.
[0100] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 935 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 935.
[0101] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 936 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 936.
[0102] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 939 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 939.
[0103] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 940 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 940.
[0104] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 941 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 941.
[0105] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 943 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 943.
[0106] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 944 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 944.
[0107] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 945 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 945.
[0108] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não- genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 946 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 946.
[0109] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 846 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em posições designadas por Xaa, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0110] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 847 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em posições designadas por Xaa, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0111] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 848 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em posições designadas por Xaa, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0112] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não-genômica codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 849 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos em posições designadas por Xaa, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0113] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 846, onde Xaa na posição 2 é Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 3 é Ile ou Trp; Xaa na posição 4 é Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 5 é Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile ou Tyr; Xaa na posição 6 é Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp ou Tyr; Xaa na posição 7 é Asn, Ala ou Val; Xaa na posição 8 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 9 é Ser, Ala, Cys, Gly ou Thr; Xaa na posição 10 é Ser, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr ou Trp; Xaa na posição 11 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 12 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 13 é Ile, Asn, Gln ou Val; Xaa na posição 14 é Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys ou Gln; Xaa na posição 15 é Val, Ala, Cys, Ile, Met ou Arg; Xaa na posição 17 é Ile, Glu ou Val; Xaa na posição 18 é Asn ou Ser; Xaa na posição 19 é His, Ala, Glu, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser ou Tyr; Xaa na posição 20 é Trp, Ala ou Thr; Xaa na posição 22 é Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 23 é Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 24 é Gly, Asp ou Phe; Xaa na posição 25 é Asp, Ala, Glu, Phe, Asn ou Gln; Xaa na posição 26 é Thr, Glu ou Pro; Xaa na posição 27 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Arg ou Thr; Xaa na posição 28 é Phe, Pro, Trp ou Tyr; Xaa na posição 29 é Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr; Xaa na posição 30 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 31 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 32 é Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 33 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 34 é Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Tyr; Xaa na posição 35 é Lys, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 36 é Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 37 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 38 é Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 39 é Trp ou Phe; Xaa na posição 40 é Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 42 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 44 é Ser, Ala, Asp, Glu, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 45 é Arg, Lys ou Ser; Xaa na posição 46 é Gly, Ala ou Gln; Xaa na posição 47 é Phe, Cys, Val ou Tyr; Xaa na posição 48 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 49 é Leu, Cys, Phe, Met, Arg ou Tyr; Xaa na posição 50 é Ser, Ala, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Thr ou Val; Xaa na posição 51 é Leu, Ala, Cys, Met ou Val; Xaa na posição 52 é Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; Xaa na posição 53 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 54 é Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser ou Trp; Xaa na posição 56 é Ala, Gly, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser ou Thr; Xaa na posição 57 é Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr; Xaa na posição 58 é His, Ala, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp ou Tyr; Xaa na posição 60 é Tyr, Glu ou Phe; Xaa na posição 63 é Gln, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 64 é Ala, Phe, Gly, His, Arg, Ser ou Tyr; Xaa na posição 65 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Thr ou Val; Xaa na posição 66 é Ser, Ala ou Gly; Xaa na posição 67 é Lys, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 68 é Ile Asp, Leu ou Val; Xaa na posição 69 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 70 é Val, Cys ou Ile; Xaa na posição 71 é Asp, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 72 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp; Xaa na posição 73 é Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 74 é Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 75 é Val, Cys, Ile ou Leu; Xaa na posição 76 é Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 77 é Asp, Tyr; Xaa na posição 78 é Gln, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 79 é Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; Xaa na posição 80 é Arg, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 81 é Leu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 82 é Ile, Ala, Leu, Met, Arg ou Val; Xaa na posição 83 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 84 é Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 85 é Leu, Cys, Gly ou Val; e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Ile, Thr ou Val, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N-terminal e/ou C-terminal do polipeptídeo PIP-72.
[0114] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 847, onde Xaa na posição 2 é Gly, Lys ou Ala; Xaa na posição 3 é Ile ou Leu; Xaa na posição 4 é Thr ou Ser; Xaa na posição 5 é Val ou Ile; Xaa na posição 6 é Thr ou Lys; Xaa na posição 8 é Asn, Lys, Gly ou Ser; Xaa na posição 9 é Ser ou Ala; Xaa na posição 11 é Asn, Lys, His ou Thr; Xaa na posição 12 é Pro, Thr, Lys ou Ser; Xaa na posição 13 é Ile ou Val; Xaa na posição 14 é Glu ou Asp; Xaa na posição 15 é Val, Ala ou Ile; Xaa na posição 16 é Ala ou Ser; Xaa na posição 17 é Ile ou Val; Xaa na posição 18 é Asn ou Ser; Xaa na posição 19 é His, Lys, Arg, Gln ou Ala; Xaa na posição 21 é Gly ou Arg; Xaa na posição 22 é Ser, Lys, Asn, Asp ou Thr; Xaa na posição 25 é Asp ou Asn; Xaa na posição 26 é Thr ou Asp; Xaa na posição 27 é Ser, Thr, Asn ou Lys; Xaa na posição 28 é Phe, Tyr ou Pro; Xaa na posição 29 é Phe ou Tyr; Xaa na posição 30 é Ser, Gly ou Lys; Xaa na posição 31 é Val, Ile ou Met; Xaa na posição 32 é Gly, Ala ou Asp; Xaa na posição 33 é Asn, Ser, Gln ou Pro; Xaa na posição 35 é Lys, Glu ou Ser; Xaa na posição 36 é Gln, Asn ou Ser; Xaa na posição 37 é Glu ou Asp; Xaa na posição 38 é Thr ou Ser; Xaa na posição 42 é Ser ou Asn; Xaa na posição 44 é Ser, Asp, Ala ou Leu; Xaa na posição 47 é Phe ou Tyr; Xaa na posição 48 é Leu ou Met; Xaa na posição 49 é Leu ou Met; Xaa na posição 50 é Ser, Ala ou Tyr; Xaa na posição 51 é Leu ou Val; Xaa na posição 52 é Lys ou Gln; Xaa na posição 53 é Lys, Arg, Met ou Leu; Xaa na posição 54 é Asn, Lys ou Gly; Xaa na posição 55 é Gly ou Ser; Xaa na posição 56 é Ala, Thr, Gln ou Ser; Xaa na posição 57 é Gln, Val ou Ala; Xaa na posição 58 é His, Ala, Lys, Tyr ou Thr; Xaa na posição 59 é Pro ou Thr; Xaa na posição 62 é Val ou Ile; Xaa na posição 63 é Gln, Ser ou Leu; Xaa na posição 64 é Ala, Gln ou Ser; Xaa na posição 65 é Ser ou Thr; Xaa na posição 67 é Lys, Gln, Arg ou Asn; Xaa na posição 69 é Glu, Lys ou Val; Xaa na posição 70 é Val ou Ile; Xaa na posição 71 é Asp, Glu ou Tyr; Xaa na posição 72 é Asn, His, Ser ou Asp; Xaa na posição 73 é Asn, Ser ou Asp; Xaa na posição 74 é Ala, Thr, Met, Ile ou Lys; Xaa na posição 76 é Lys ou Thr; Xaa na posição 78 é Gln, His ou Ser; Xaa na posição 80 é Arg, Glu ou Gln; Xaa na posição 81 é Leu, Pro, Ala ou Thr; Xaa na posição 82 é Ile ou Leu; Xaa na posição 83 é Glu, His, Asn, Gln ou Leu; Xaa na posição 85 é Leu, Val ou Ala; e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Tyr ou Asn, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N-terminal e/ou C-terminal do polipeptídeo PIP-72 e/ou um aminoácido é inserido entre os resíduos 24 e 25 em relação à SEQ ID NO: 847.
[0115] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 848, onde Xaa na posição 2 é Gly, Lys, Ala ou Arg; Xaa na posição 3 é Ile, Leu ou Val; Xaa na posição 4 é Thr ou Ser; Xaa na posição 5 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 6 é Thr, Lys, Ser ou Arg; Xaa na posição 8 é Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr ou Ala; Xaa na posição 9 é Ser, Ala ou Thr; Xaa na posição 11 é Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, His ou Ser; Xaa na posição 12 é Pro, Thr, Lys, Ser ou Arg; Xaa na posição 13 é Ile, Val ou Leu; Xaa na posição 14 é Glu ou Asp; Xaa na posição 15 é Val, Ala, Ile ou Leu; Xaa na posição 16 é Ala ou Ser; Xaa na posição 17 é Ile, Val ou Leu; Xaa na posição 18 é Asn, Ser, Gln ou Thr; Xaa na posição 19 é His, Lys, Ala, Gln, Asn ou Arg; Xaa na posição 21 é Gly, Arg ou Lys; Xaa na posição 22 é Ser, Lys, Asn, Thr, Arg, Asp, Glu ou Gln; Xaa na posição 25 é Asp, Asn, Glu ou Gln; Xaa na posição 26 é Thr, Asp, Ser ou Glu; Xaa na posição 27 é Ser, Thr, Lys, Asn, Gln ou Arg; Xaa na posição 28 é Phe, Tyr, Pro ou Trp; Xaa na posição 29 é Phe, Tyr ou Trp; Xaa na posição 30 é Ser, Gly, Lys, Thr ou Arg; Xaa na posição 31 é Val, Ile, Met ou Leu; Xaa na posição 32 é Gly, Ala, Asp ou Glu; Xaa na posição 33 é Asn, Ser, Gln, Pro ou Thr; Xaa na posição 35 é Lys, Glu, Ser, Arg ou Thr; Xaa na posição 36 é Gln, Ser, Asn ou Thr; Xaa na posição 37 é Glu ou Asp; Xaa na posição 38 é Thr ou Ser; Xaa na posição 42 é Ser, Asn, Thr ou Gln; Xaa na posição 44 é Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile ou Val; Xaa na posição 47 é Phe, Tyr ou Trp; Xaa na posição 48 é Leu, Met, Ile ou Val; Xaa na posição 49 é Leu, Met, Ile ou Val; Xaa na posição 50 é Ser, Ala, Tyr ou Thr; Xaa na posição 51 é Leu, Val ou Ile; Xaa na posição 52 é Lys, Gln, Arg ou Asn; Xaa na posição 53 é Lys, Arg, Met, Leu, Ile ou Val; Xaa na posição 54 é Asn, Lys, Gly, Gln ou Arg; Xaa na posição 55 é Gly, Ser ou Thr; Xaa na posição 56 é Ala, Thr, Gln, Ser ou Asn; Xaa na posição 57 é Gln, Val, Ala, Asn, Leu ou Ile; Xaa na posição 58 é His, Ala, Lys, Tyr ou Thr; Xaa na posição 59 é Pro, Thr ou Ser; Xaa na posição 62 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 63 é Gln, Ser, Leu, Asn, Thr, Ile ou Val; Xaa na posição 64 é Ala, Gln, Ser, Asn ou Thr; Xaa na posição 65 é Ser ou Thr; Xaa na posição 67 é Lys, Gln, Asn ou Arg; Xaa na posição 69 é Glu, Val, Asp, Lys, Arg, Ile ou Leu; Xaa na posição 70 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 71 é Asp, Glu, Tyr ou Trp; Xaa na posição 72 é Asn, His, Ser, Asp, Gln, Thr ou Glu; Xaa na posição 73 é Asn, Ser, Asp, Gln, Thr ou Glu; Xaa na posição 74 é Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val ou Arg; Xaa na posição 76 é Lys, Thr, Arg ou Ser; Xaa na posição 78 é Gln, His, Ser, Asn ou Thr; Xaa na posição 80 é Arg, Glu, Gln, Lys, Asp ou Asn; Xaa na posição 81 é Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala ou Ser; Xaa na posição 82 é Ile, Leu ou Val; Xaa na posição 83 é Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile ou Val; Xaa na posição 85 é Leu, Val ou Ala; e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Tyr, Asn ou Thr, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N- terminal e/ou C-terminal do polipeptídeo PIP-72 e/ou um aminoácido é inserido entre os resíduos 24 e 25 em relação à SEQ ID NO: 848.
[0116] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 849, onde Xaa na posição 2 é Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 3 é Ile, Leu, Val ou Trp; Xaa na posição 4 é Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 5 é Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu ou Tyr; Xaa na posição 6 é Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp ou Tyr; Xaa na posição 7 é Asn, Ala ou Val; Xaa na posição 8 é Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met ou Val; Xaa na posição 9 é Ser, Ala, Cys, Gly ou Thr; Xaa na posição 11 é Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Val ou Tyr; Xaa na posição 12 é Pro, Thr, Lys, Ser, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Asn, Gln, Arg, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 13 é Ile, Asn, Gln, Leu ou Val; Xaa na posição 14 é Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys, Asp ou Gln; Xaa na posição 15 é Val, Ala, Ile, Leu, Cys, Met ou Arg; Xaa na posição 16 é Ala ou Ser; Xaa na posição 17 é Ile Glu, Leu ou Val; Xaa na posição 18 é Asn, Gln, Thr ou Ser; Xaa na posição 19 é His, Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Pro, Ser ou Tyr; Xaa na posição 20 é Trp, Ala ou Thr; Xaa na posição 21 é Gly, Arg ou Lys; Xaa na posição 22 é Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 23 é Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 24 é Gly, Asp ou Phe; Xaa na posição 25 é Asp, Ala, Glu, Phe, Asn ou Gln; Xaa na posição 26 é Thr, Glu, Asp, Ser ou Pro; Xaa na posição 27 é Ser, Thr, Lys, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn ou Gln; Xaa na posição 28 é Phe, Tyr, Pro ou Trp; Xaa na posição 29 é Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr; Xaa na posição 30 é Ser, Gly, Lys, Thr, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 31 é Val, Ile, Met ou Leu; Xaa na posição 32 é Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 33 é Asn, Ser, Gln, Pro, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Val ou Tyr; Xaa na posição 34 é Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Tyr; Xaa na posição 35 é Lys, Glu, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 36 é Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 37 é Glu, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 38 é Thr, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 39 é Trp ou Phe; Xaa na posição 40 é Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 42 é Ser, Asn, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Val, Trp, Tyr ou Gln; Xaa na posição 44 é Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile, Ala, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Tyr ou Val; Xaa na posição 45 é Arg, Lys ou Ser; Xaa na posição 46 é Gly, Ala ou Gln; Xaa na posição 47 é Phe, Tyr Cys, Val ou Trp; Xaa na posição 48 é Leu, Met, Ile, Cys, Phe, Met, Arg, Tyr ou Val; Xaa na posição 49 é Leu, Met, Ile ou Val; Xaa na posição 50 é Ser, Ala, Tyr, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Val ou Thr; Xaa na posição 51 é Leu, Val, Ala, Cys, Met ou Ile; Xaa na posição 52 é Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Gln, Trp ou Tyr; Xaa na posição 53 é Lys, Arg, Met, Leu, Ile, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr ou Val; Xaa na posição 54 é Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser ou Trp; Xaa na posição 55 é Gly, Ser ou Thr; Xaa na posição 56 é Ala, Thr, Gln, Ser, Gly, Leu, Pro, Arg ou Asn; Xaa na posição 57 é Gln, Glu, Leu, Met, Ser, Val, Ala, Asn, Ile ou Thr; Xaa na posição 58 é His, Ala, Lys, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp, Tyr ou Thr; Xaa na posição 59 é Pro, Thr ou Ser; Xaa na posição 60 é Tyr, Glu ou Phe; Xaa na posição 62 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 63 é Gln, Ser, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 64 é Ala, Gln, Asn, Phe, Gly, His, Arg, Ser ou Tyr; Xaa na posição 65 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Val ou Thr; Xaa na posição 66 é Ser, Ala ou Gly; Xaa na posição 67 é Lys, Gln, Asn ou Arg; Xaa na posição 67 é Lys, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 68 é Ile Asp, Leu ou Val; Xaa na posição 69 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 70 é Val, Ile, Cys ou Leu; Xaa na posição 71 é Asp, Glu, Tyr, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val ou Trp; Xaa na posição 72 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, His ou Trp; Xaa na posição 73 é Asn, Ser, Asp, Gln, Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Val, Tyr ou Glu; Xaa na posição 74 é Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Tyr ou Arg; Xaa na posição 75 é Val, Cys, Ile ou Leu; Xaa na posição 76 é Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 77 é Asp, Tyr; Xaa na posição 78 é Gln, His, Ser, Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Val, Tyr ou Thr; Xaa na posição 79 é Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; Xaa na posição 80 é Arg, Glu, Gln, Lys, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val, Tyr ou Asn; Xaa na posição 81 é Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His ou Ser; Xaa na posição 82 é Ile, Ala, Leu, Met, Arg e Val; Xaa na posição 83 é Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Lys, Pro, Arg, Ser, Thr, Tyr ou Val; Xaa na posição 84 é Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 85 é Leu, Val, Cys, Gly ou Ala e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Tyr, Asn, Ile, Val ou Thr, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N-terminal e/ou C-terminal do polipeptídeo PIP-72 e/ou um aminoácido é inserido entre os resíduos 24 e 25 em relação à SEQ ID NO: 849.
[0117] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico codificam um polipeptídeo PIP-72 que compreende um motivo de aminoácidos, conforme representado pelas posições de 37 a 51 da SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848 ou SEQ ID NO: 849.
[0118] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico codificam um polipeptídeo PIP-72 que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2
[0119] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico exemplificadoras codificam um polipeptídeo PIP-72 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946, assim como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos.
[0120] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico codificam um polipeptídeo PIP-72 das Tabelas 14, 17, 20, 23, 24, 26, 28 e/ou 29, combinações de substituições de aminoácidos do mesmo e deleções e/ou inserções do mesmo.
[0121] Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam produtos de transcrição e/ou tradução que são subsequentemente submetidos a splicing para produzir, por fim, polipeptídeos de PIP-72 funcional. O splicing pode ser executado in vitro ou in vivo, e pode envolver splicing cis ou trans. O substrato para o splicing pode ser polinucleotídeos (por exemplo, transcritos de RNA) ou polipeptídeos. Um exemplo de cis-splicing de um polinucleotídeo é onde um íntron inserido em uma sequência de codificação é removido e as duas regiões de exon de flanqueamento são submetidas a splicing para gerar uma sequência de codificação de polipeptídeo de PIP-72. Um exemplo de splicing trans seria quando um polinucleotídeo é criptografado pela separação da sequência codificante em dois ou mais fragmentos que podem ser transcritos separadamente e, então, submetidos a splicing para formar a sequência codificante de pesticida de comprimento total. O uso de uma sequência intensificadora de splicing, que pode ser introduzida em um construto, pode facilitar o splicing no splicing cis ou trans dos polipeptídeos (patentes US n°s 6.365.377 e 6.531.316). Dessa forma, em algumas modalidades, os polinucleotídeos não codificam diretamente um polipeptídeo de PIP-72 de comprimento total, mas, ao invés disso, codificam um fragmento ou fragmentos de um polipeptídeo de PIP-72. Esses polinucleotídeos podem ser usados para expressar um polipeptídeo de PIP-72 funcional através de um mecanismo que envolve splicing, onde o splicing pode ocorrer no nível de polinucleotídeo (por exemplo, íntron/exon) e/ou polipeptídeo (por exemplo, intein/extein). Isto pode ser útil, por exemplo, no controle da expressão da atividade pesticida, uma vez que um polipeptídeo pesticida funcional somente será expresso se todos os fragmentos necessários forem expressos em um ambiente que permita processos de splicing para gerar um produto funcional. Em um outro exemplo, a introdução de uma ou mais sequências de inserção em um polinucleotídeo pode facilitar a recombinação com um polinucleotídeo de baixa homologia; o uso de um íntron ou inteína para a sequência de inserção facilita a remoção da sequência interveniente, restaurando assim a função da variante codificada.
[0122] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos dessas sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de PIP-72 também são abrangidas pelas modalidades. O termo “fragmento”, como usado aqui, se refere a uma porção da sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo PIP-72. Um fragmento de uma sequência de ácidos nucleicos pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo PIP-72 ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR com o uso de métodos revelados abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo PIP-72 compreendem pelo menos cerca de 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou 260, nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de ácidos nucleicos de comprimento total que codifica um polipeptídeo PIP-72 revelado no presente documento, dependendo do uso desejado. “Nucleotídeos contíguos” é usado na presente invenção para se referir a resíduos de nucleotídeo que estão imediatamente adjacentes uns aos outros. Os fragmentos das sequências de ácidos nucleicos das modalidades irão codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo de PIP-72 e, por conseguinte, retêm a atividade inseticida. O termo “retém atividade PIP-72” é usado na presente invenção para se referir a um polipeptídeo que tem ao menos cerca de 10%, ao menos cerca de 30%, ao menos cerca de 50%, ao menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida do polipeptídeo PIP-72Aa de comprimento total da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a atividade inseticida é atividade sobre Coleópteros. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Coleópteros. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Diabrotica. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra um ou mais pragas de inseto do complexo da lagarta da raiz do milho: lagarta da raiz do milho ocidental, Diabrotica virgifera virgifera; lagarta da raiz do milho setentrional, D. barberi: lagarta da raiz do milho meridional ou besouro manchado do pepino; Diabrotica undecimpunctata howardi, e a lagarta da raiz do milho mexicano, D. virgifera zeae. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra a lagarta da raiz do milho ocidental, D. virgifera virgifera.
[0123] Em algumas modalidades, um fragmento de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo PIP-72 que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína codificará pelo menos cerca de 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 ou 85 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo PIP-72 de comprimento total das modalidades. Em algumas modalidades, o fragmento é um truncamento N-terminal e/ou C-terminal de pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais aminoácidos da terminação N e/ou terminação C em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 ou suas variantes, por exemplo, por proteólise, inserção de um códon inicial, deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados com a inserção concomitante de um códon de parada ou mediante a inserção de um códon de parada na sequência codificante. Em algumas modalidades, os fragmentos abrangidos na presente invenção resultam da remoção dos aminoácidos N-terminais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 ou mais aminoácidos N-terminais em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 ou suas variantes, por exemplo, por proteólise ou mediante a inserção de um códon inicial na sequência codificante. Em algumas modalidades, os fragmentos abrangidos na presente invenção são o resultado da remoção dos aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 N-terminais em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 ou suas variantes, por exemplo, por proteólise ou mediante a inserção de um códon inicial na sequência codificante.
[0124] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos suficientemente homóloga à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 ou SEQ ID NO: 968. O termo “suficientemente homólogo” é usado na presente invenção para se referir a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que tem ao menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homologia de sequência em comparação a uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento aqui descritos usando parâmetros padrão. O versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser adequadamente ajustados para determinar a homologia correspondente das proteínas codificadas por duas sequências de ácidos nucleicos, levando em consideração a degeneração do códon, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura, e similares. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento total do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PIP-72 ou contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo de PIP-72. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 tem ao menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência em comparação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é contra a sequência de comprimento total do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PIP-72 ou contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo de PIP-72. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é calculada usando o algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® da suíte de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA) com todos os parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é ao longo de todo o comprimento do polipeptídeo calculado usando o algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX da suíte de programas Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA) com todos os parâmetros padrão.
[0125] Para determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótima. O percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, percentual de identidade=número de posições idênticas/número total das posições (por exemplo, posições sobrepostas)x100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a comparação é ao longo de toda a sequência de referência (por exemplo, ao longo de toda a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2). A porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas a seguir, com ou sem a permissão da ocorrência de lacunas. Ao calcular a porcentagem de identidade, tipicamente, igualdades exatas são contadas.
[0126] A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser feita usando um algoritmo matemático. Um exemplo não-limitador de um algoritmo matemático utilizado para a comparação entre duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:2264, modificado conforme descrito em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Esse algoritmo está incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403. As buscas de nucleotídeo por BLAST podem ser feitas com o programa BLASTN, pontuação = 100, tamanho da palavra = 12, para obter sequências de ácidos nucleicos homólogas às moléculas de ácido nucleico pesticidas das modalidades. As buscas de proteína por BLAST podem ser feitas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho da palavra = 3, para obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína pesticida das modalidades. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado, conforme descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para executar uma busca repetida que detecta relações distantes entre as moléculas. Consulte Altschul, et al., (1997) supra. Quando se usa os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. O alinhamento também pode ser feito manualmente por inspeção.
[0127] Outro exemplo não-limitador de um algoritmo matemático utilizado para a comparação entre as sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins, et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673 4680). ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de aminoácidos ou DNA, e assim pode fornecer dados sobre a conservação da sequência de toda a sequência de aminoácidos. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de programas de análise de DNA/aminoácidos comercialmente disponíveis, como o módulo ALIGNX® da suíte de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, o percentual de identidade de aminoácidos pode ser avaliado. Um exemplo não-limitador de um programa de software útil para a análise de alinhamentos ClustalW é o GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a avaliação das similaridades de aminoácidos (ou DNA) e a identidade entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não-limitador de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo de Myers e Miller, (1988) CABIOS 4:11-17. Esse algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que faz parte do pacote de programas GCG Wisconsin Genetics, versão 10 (disponível junto à Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, Califórnia, EUA). Quando se utiliza o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma Tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade por lacuna de 4 podem ser usadas.
[0128] Outro exemplo não-limitador de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, que usa o software GAP versão 10 para determinar a identidade ou similaridade de sequências usando os seguintes parâmetros padrão: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de ácidos nucleicos usando um peso GAP de 50 e um peso de comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmpii; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando um peso GAP de 8 e um peso de comprimento de 2, e o programa de pontuação BLOSUM62. Programas equivalentes podem, também, ser usados. O termo “programa equivalente” é usado na presente invenção para se referir a qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem pareamentos de resíduos de nucleotídeos idênticos, e um percentual de identidade de sequência idêntico quando comparado com o alinhamento correspondente gerado por GAP versão 10.
[0129] As modalidades também abrangem moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de polipeptídeo PIP-72. As “variantes” do polipeptídeo PIP-72 que codificam sequências de ácidos nucleicos incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídeos PIP-72 revelados no presente documento, mas que se diferem conservativamente devido à degeneração do código genético bem como aqueles que são suficientemente idênticos conforme discutido acima. Variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, como a reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme descrito abaixo. As sequências de ácidos nucleicos variantes também incluem sequências de ácidos nucleicos sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, através do uso de mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codificam os polipeptídeos PIP-72 revelados conforme discutido abaixo.
[0130] A presente invenção fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos PIP- 72 revelados no presente documento. Os versados na técnica irão prontamente observar que, devido à degenerescência do código genético, existe uma multitude de sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos de PIP-72 da presente revelação. A Tabela 1 é uma Tabela de códons que fornece os códons sinônimos para cada aminoácido. Por exemplo, todos os códons AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, e CGU codificam o aminoácido arginina. Dessa forma, em todas as posições nos ácidos nucleicos da descrição nas quais uma arginina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos acima, sem alterar o polipeptídeo codificado. Entende-se que U em uma sequência de RNA corresponde a T em uma sequência de DNA.
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[0131] O indivíduo versado vai observar adicionalmente que podem ser introduzidas mudanças por meio de mutação das sequências de ácidos nucleicos levando assim a mudanças na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos PIP-72 codificados, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Desta forma, moléculas de ácido nucleico variantes podem ser criadas pela introdução de uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de nucleotídeo na sequência de ácidos nucleicos correspondente aqui apresentada, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas-padrão, como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Essas sequências de ácidos nucleicos variantes também são abrangidas pela presente revelação.
[0132] Alternativamente, sequências de ácidos nucleicos variantes podem ser produzidas pela introdução de mutações aleatoriamente ao longo da totalidade ou de parte da sequência codificante, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes pode ser submetidos à triagem para a capacidade de conferir atividade pesticida para identificar mutantes que retém a atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressada de forma recombinante, e a atividade da proteína pode ser determinada usando-se técnicas de ensaio padrão.
[0133] Os polinucleotídeos da revelação e seus fragmentos são, opcionalmente, usados como substratos para uma variedade de reações de recombinação e recombinação recursiva, em adição aos métodos de clonagem padrão apresentados, por exemplo, em Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir homólogos adicionais do polipeptídeo pesticida e seus fragmentos com as propriedades desejadas. Uma variedade dessas reações é conhecida, inclusive aquelas desenvolvidas pelos inventores e seus colaboradores. Os métodos para produzir uma variante de qualquer ácido nucleico mencionado na presente invenção compreendendo recombinar de forma recursiva este polinucleotídeo com um segundo polinucleotídeo (ou mais), formando assim uma biblioteca de polinucleotídeos variantes também são modalidades da descrição, tal como são as bibliotecas produzidas, as células compreendendo as bibliotecas e qualquer polinucleotídeo recombinante produzido por estes métodos. Adicionalmente, esses métodos compreendem, opcionalmente, selecionar um polinucleotídeo variante a partir de tais bibliotecas com base na atividade pesticida, tal como é quando tal recombinação recursiva é feita in vitro ou in vivo.
[0134] Uma variedade de protocolos de geração de diversidade, inclusive protocolos de recombinação recursiva de ácidos nucleicos, estão disponíveis e completamente descritos na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente, e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, assim como variantes das proteínas codificadas. Individualmente e coletivamente, esses procedimentos fornecem formas robustas e amplamente aplicáveis de gerar ácidos nucleicos e conjuntos de ácidos nucleicos diversificados (inclusive, por exemplo, bibliotecas de ácido nucleico) úteis, por exemplo, para a manipulação ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, vias, células e/ou organismos com características novas e/ou aprimoradas.
[0135] Embora distinções e classificações sejam feitas no curso da discussão a seguir, para fins de clareza, será entendido que as técnicas, frequentemente, não são mutuamente exclusivas. De fato, os vários métodos podem ser usados de forma isolada ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequência.
[0136] O resultado de qualquer um dos procedimentos geradores de diversidade aqui descritos pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, que podem ser selecionados ou submetidos à triagem de ácidos nucleicos com, ou que conferem, propriedades desejáveis ou que codificam proteínas com, ou que conferem, propriedades desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos da presente invenção ou disponíveis de outro modo para um versado na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que são produzidos podem ser selecionados para uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, atividade pesticida ou, tal atividade em um pH desejado, etc. Isto pode incluir identificar qualquer atividade que possa ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dos ensaios na técnica, consulte, por exemplo, a discussão sobre triagem da atividade inseticida, abaixo. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, de acordo com o discernimento do profissional.
[0137] As descrições de uma variedade de procedimentos geradores de diversidade para gerar sequências de ácidos nucleicos modificadas, por exemplo, aquelas que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida ou seus fragmentos, são encontradas nas seguintes publicações e nas referências aqui citadas: Soong, et al., (2000) Nat Genet 25(4):436 a 439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1 a 4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893 a 896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793 a 797; Minshull and Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284-290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259-264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; Crameri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436-438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4504-4509; Patten, et al., (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724-733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100-103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315-319; Gates, et al., (1996) J Mol Biol 255:373-386; Stemmer, (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York, EUA, pp. 447-457; Crameri and Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer, et al., (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391 e Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747-10751.
[0138] Métodos mutacionais para gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157-178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369-374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423-462; Botstein and Shortle, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, (1986) Biochem J 237:1-7 e Kunkel, (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” em Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein and Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagênese usando moldes contendo uracila (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367-382 e Bass, et al., (1988) Science 242:240 245); mutagênese dirigida por oligonucleotídeo (Zoller and Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468-500; Zoller e Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329 a 350 (1987); Zoller and Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-6500), mutagênese de DNA modificada por fosforotioato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8749-8764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8765-8787 (1985); Nakamaye e Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9.679 a 9.698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791 a 802 e Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803 a 814); mutagênese usando dúplex de DNA com lacuna (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9441-9456; Kramer and Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350-367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7207 e Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6987-6999).
[0139] Métodos adicionais adequados incluem reparo de erro pontual no pareamento et al., (1984) Cell 38:879-887), mutagênese usando cepas hospedeiras com reparo deficiente (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4431-4443 e Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382-403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh and Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), purificação por restrição e seleção por restrição (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423), mutagênese por síntese gênica total (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1299-1301; Sakamar e Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6361-6372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315-323 and Grundstrom, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3305-3316), reparo de quebra de fita dupla (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7177-7181 e Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450-455). Detalhes adicionais sobre muitos dos métodos acima podem ser encontrados em Methods Enzymol Volume 154, que também descreve controles úteis para solucionar problemas com vários métodos de mutagênese.
[0140] Detalhes adicionais com relação a vários métodos geradores de diversidade podem ser encontrados nas seguintes patentes US, publicações PCT e pedidos e publicações EPO: patente US número 5.723.323, patente US número 5.763.192, patente US número 5.814.476, patente US número 5.817.483, patente US número 5.824.514, patente US número 5.976.862, patente US número 5.605.793, patente US número 5.811.238, patente US número 5.830.721, patente US número 5.834.252, patente US número 5.837.458, WO 1995/22625, WO 1996/33207, WO 1997/20078, WO 1997/35966, WO 1999/41402, WO 1999/41383, WO 1999/41369, WO 1999/41368, EP 752008, EP 0932670, WO 1999/23107, WO 1999/21979, WO 1998/31837, WO 1998/27230, WO 1998/27230, WO 2000/00632, WO 2000/09679, WO 1998/42832, WO 1999/29902, WO 1998/41653, WO 1998/41622, WO 1998/42727, WO 2000/18906, WO 2000/04190, WO 2000/42561, WO 2000/42559, WO 2000/42560, WO 2001/23401 e PCT/US01/06775.
[0141] As sequências de nucleotídeos das modalidades também podem ser usadas para isolar sequências correspondentes de outros organismos, particularmente outras bactérias, particularmente uma espécie de Pseudomonas e, mais particularmente, uma cepa de Pseudomonas putida, de Pseudomonas fulva ou de Pseudomonas chlororaphis. Desta forma, métodos como PCR, hibridização e similares podem ser usados para identificar essas sequências com base na sua homologia de sequência com as sequências aqui descritas. Sequências que são selecionadas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras apresentadas na presente invenção, ou com fragmentos das mesmas, são abrangidas pelas modalidades. Essas sequências incluem sequências que são ortólogas das sequências apresentadas. O termo “ortólogos” refere-se a genes derivados a partir de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado da especiação. Genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeos e/ou suas sequências de proteína codificadas compartilham uma identidade substancial conforme definido em qualquer parte do presente documento. As funções dos ortólogos são frequentemente altamente conservadas entre as espécies.
[0142] Em uma abordagem de PCR, podem ser definidos iniciadores de oligonucleotídeos para uso em reações de PCR para amplificar as sequências de DNA correspondentes a partir do cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para desenhar iniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e são apresentados em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, EUA), deste ponto em diante no presente documento “Sambrook”. Consulte também Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York, EUA); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York, EUA); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York, EUA). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas não se limitam a, métodos que utilizam iniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de genes, iniciadores específicos de vetores, iniciadores parcialmente não correspondentes, e similares.
[0143] Para identificar possíveis polipeptídeos PIP-72 a partir de coletas bacterianas, os lisados celulares podem ser submetidos à triagem com anticorpos gerados contra um polipeptídeo PIP-72 com o uso de métodos Western blotting e/ou ELISA. Esse tipo de ensaio pode ser feito com alta produtividade em alta produtividade. Amostras positivas podem ser adicionalmente analisadas por várias técnicas, como purificação e identificação de proteínas baseadas em anticorpos. Os métodos para gerar anticorpos são bem conhecidos na técnica, conforme discutido abaixo.
[0144] Alternativamente, o método de identificação de proteína à base de espectrometria de massa pode ser usado para identificar homólogos de polipeptídeos PIP-72 com o uso de protocolos nas literaturass (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Especificamente, o método de identificação de proteína à base de LC-MS/MS é usado para associar os dados de MS de um dado lisado celular ou amostras enriquecidas de peso molecular desejado (excisadas do gel de SDS-PAGE de bandas de peso molecular relevante para PIP-72) com informações de sequência de PIP-72 (por exemplo, SEQ ID NO: 2)) e seus homólogos. Qualquer correspondência nas sequências de peptídeos indica o potencial de existirem homólogos nas amostras. Técnicas adicionais (purificação de proteína e biologia molecular) podem ser usadas para isolar a proteína e identificar as sequências dos homólogos.
[0145] Em métodos de hibridização, a totalidade ou parte da sequência de ácidos nucleicos pesticida pode ser usada para fazer triagem de bibliotecas de cDNA ou genômicas. Métodos para a construção dessas bibliotecas de cDNA e genômicas são de conhecimento geral na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra. As assim chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, como 32P ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para hibridização podem ser produzidas por meio da marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base na sequência de ácidos nucleicos de codificação de polipeptídeo PIP-72 conhecida revelada no presente documento. Iniciadores degenerados projetados com base em resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos conservados na sequência de ácidos nucleicos ou na sequência de aminoácidos codificada podem ser, adicionalmente, usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de ácidos nucleicos que hibridiza sob condições estringentes com pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo PIP-72 da revelação ou um fragmento ou variante do mesmo. Métodos para a preparação de sondas para hibridização são de conhecimento geral na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra, aqui incorporado por referência.
[0146] Por exemplo, uma totalidade de sequência de ácidos nucleicos, que codifica um polipeptídeo PIP-72, revelado no presente documento ou uma ou mais porções do mesmo, pode ser usada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com sequências de ácidos nucleicos correspondentes que codificam sequências de polipeptídeo semelhante a PIP-72 e RNAs mensageiros. Para se obter hibridização específica sob uma variedade de condições, essas sondas incluem sequências que são únicas e têm, de preferência, ao menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento ou ao menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar por PCR as sequências pesticidas correspondentes de um organismo escolhido. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências codificadoras adicionais a partir de um organismo desejado, ou como um teste diagnóstico para determinar a presença de sequências codificadoras em um organismo. Técnicas de hibridização incluem triagem por hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (placas ou colônias; consulte, por exemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA).
[0147] A hibridização de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. Os termos “condições estringentes” ou “condições estringentes de hibridização” são usados na presente invenção para se referir a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar a sua sequência-alvo em um grau detectavelmente maior que a outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação ao plano de fundo). As condições de estringência dependem da sequência e são diferentes em circunstâncias diferentes. Ao controlar a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma não complementaridade nas sequências de modo que sejam detectados graus mais baixos de similaridade (detecção heteróloga). Em geral, uma sonda tem menos que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de preferência, menos de 500 nucleotídeos de comprimento.
[0148] Tipicamente, as condições de estringência serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íons de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons de Na (ou outros sais) a um valor de pH de 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos). As condições de estringência também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificadoras incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCl/0,3 M de citrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplificadoras incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a 55 a 60°C. Condições de alta estringência exemplificadoras incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, geralmente, de cerca de 4 a cerca de 12 horas.
[0149] A especificidade é tipicamente a função das lavagens pós- hibridização, sendo que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA- DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5°C,+16,6 (log M)+0,41 (% GC)-0,61 (% form)-500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é a porcentagem dos nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de bases A Tm é a temperatura (sob a força iônica e pH definidos) sob a qual 50% de uma sequência-alvo complementar se hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. A Tm é reduzida por cerca de 1°C para cada 1% de pareamento incorreto; dessa forma, a Tm, as condições de hibridização e/ou de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se forem desejadas sequências com ^90% de identidade, a Tm pode ser reduzida em 10°C. Em geral, as condições de estringência são selecionadas para serem cerca de 5°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica e seu complemento a uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições de estringência severa podem utilizar uma hibridização e/ou uma lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C a menos em relação ao ponto de fusão térmica (Tm); condições de estringência moderada podem utilizar uma hibridização e/ou uma lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm); as condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou uma lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm). Com o uso da equação, das composições de hibridização e lavagem, e da Tm desejada, os versados na técnica entenderão que variações na estringência da hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de pareamento incorreto resultar em uma Tm menor que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que se possa usar uma temperatura mais alta. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, N.Y., EUA); and Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, EUA). Consulte, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA).
[0150] Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico são fornecidas que codificam um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo ao menos 75%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ I NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida. Proteínas e variantes e fragmentos das mesmas
[0151] Os polipeptídeos PIP-72 também são abrangidos pela revelação. Os termos “proteína inseticida 72 de Pseudomonas”, “polipeptídeo PIP-72” ou “proteína PIP-72”, como usados aqui, se referem de forma intercambiável a um polipeptídeo que tem atividade pesticida incluindo, mas não se limitando a, a atividade inseticida, contra uma ou mais pragas de insetos da ordem Coleoptera, e é suficientemente homólogo à proteína da SEQ ID NO: 2. Uma variedade de polipeptídeos PIP-72 é contemplada. Fontes de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PIP-72 ou proteínas relacionadas incluem, mas não se limitam a, uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Aa da SEQ ID NO: 1) codificando o polipeptídeo PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2; uma cepa de Pseudomonas rhodesiae que contém o polinucleotídeo PIP-72Ba da SEQ ID NO: 3) codificando o polipeptídeo PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP- 72Ca da SEQ ID NO: 5) codificando o polipeptídeo PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6; uma cepa de Pseudomonas mandelii que contém o polinucleotídeo PIP-72Cb da SEQ ID NO: 7) codificando o polipeptídeo PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8; uma cepa de Pseudomonas congelans que contém o polinucleotídeo PIP-72Da da SEQ ID NO: 9) codificando o polipeptídeo PIP-72Da (SEQ ID NO: 10; uma cepa de Pseudomonas mandelii que contém o polinucleotídeo PIP- 72Db da SEQ ID NO: 11) codificando o polipeptídeo PIP-72Db (SEQ ID NO: 12; uma cepa de Pseudomonas ficuserectae que contém o polinucleotídeo PIP-72Dc da SEQ ID NO: 13) codificando o polipeptídeo PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14; uma cepa de Pseudomonas mosselii que contém o polinucleotídeo PIP-72Fa da SEQ ID NO: 17) codificando o polipeptídeo PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Ff da SEQ ID NO: 27) codificando o polipeptídeo PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28 e uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gb da SEQ ID NO: 31) codificando o polipeptídeo PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Ab da SEQ ID NO: 949) codificando o polipeptídeo PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927; uma cepa de Pseudomonas brassicacearum que contém o polinucleotídeo PIP-72Bb da SEQ ID NO: 950) codificando o polipeptídeo PIP-72Ab (SEQ ID NO: 928; uma cepa de Pseudomonas entomophila que contém o polinucleotídeo PIP-72Fh da SEQ ID NO: 954) codificando o polipeptídeo PIP-72AFh (SEQ ID NO: 932; uma cepa de Pseudomonas entomophila que contém o polinucleotídeo PIP-72Fh da SEQ ID NO: 955) codificando o polipeptídeo PIP-72AFh (SEQ ID NO: 933; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Fj da SEQ ID NO: 956) codificando o polipeptídeo PIP-72Fj (SEQ ID NO: 934; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Fk da SEQ ID NO: 957) codificando o polipeptídeo PIP-72Fk (SEQ ID NO: 935; uma cepa de Burkholderia multivorans que contém o polinucleotídeo PIP-72Fl da SEQ ID NO: 958) codificando o polipeptídeo PIP-72Fl (SEQ ID NO: 936; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gg da SEQ ID NO: 961) codificando o polipeptídeo PIP-72Gg (SEQ ID NO: 939; uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gh da SEQ ID NO: 962) codificando o polipeptídeo PIP-72Gh (SEQ ID NO: 940; uma cepa de Pseudomonas mosselii que contém o polinucleotídeo PIP-72Gi da SEQ ID NO: 963) codificando o polipeptídeo PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941; uma cepa de Pseudomonas protegens que contém o polinucleotídeo PIP-72Gk da SEQ ID NO: 965) codificando o polipeptídeo PIP- 72Gk (SEQ ID NO: 943; uma cepa de Pseudomonas plecoglossicida que contém o polinucleotídeo PIP-72Gl da SEQ ID NO: 966) codificando o polipeptídeo PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944; e uma cepa de Pseudomonas chlororaphis que contém o polinucleotídeo PIP-72Gn da SEQ ID NO: 968) codificando o polipeptídeo PIP- 72Gn (SEQ ID NO: 946. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra a lagarta da raiz do milho ocidental,D. virgifera virgifera.
[0152] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 é suficientemente homólogo à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946. O termo “suficientemente homólogo” é usado na presente invenção para se referir a uma sequência de aminoácidos que tem ao menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homologia de sequência em comparação a uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento aqui descritos usando parâmetros- padrão. O versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser adequadamente ajustados para determinar a homologia correspondente das proteínas, levando em consideração a similaridade de aminoácidos e similares. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo PIP-72. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência em comparação com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo PIP-72. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é calculada usando o algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® da suíte de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA) com todos os parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é ao longo de todo o comprimento do polipeptídeo calculado usando o algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® da suíte de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA) com todos os parâmetros padrão.
[0153] Como usado aqui, os termos “proteína,” “molécula de peptídeo,” ou “polipeptídeo” inclui qualquer molécula que compreende cinco ou mais aminoácidos. É bem conhecido na técnica que moléculas de proteína, peptídeo ou polipeptídeo podem sofrer modificação, inclusive modificações pós-traducionais, como, mas não se limitando a, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Dessa forma, como usado aqui, os termos “proteína”, “molécula de peptídeo” ou “polipeptídeo” incluem qualquer proteína que é modificada por qualquer processo biológico ou não-biológico. Os termos “aminoácido” e “aminoácidos” se referem a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural.
[0154] O termo “proteína recombinante” é usado na presente invenção para se referir a uma proteína que não está mais no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira bacteriana ou planta recombinante. Um polipeptídeo PIP-72 que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteína que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não pesticida (também denominado na presente invenção uma “proteína contaminante”).
[0155] “Fragmentos” ou “porções biologicamente ativas” incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos idênticas o suficiente a um polipeptídeo PIP-72 e que exibem atividade inseticida. “Fragmentos” ou “porções biologicamente ativas” de polipeptídeos PIP-72 incluem fragmentos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946, respectivamente. Uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo PIP-72 pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 55, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 ou 85 aminoácidos de comprimento. Essas porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto à atividade inseticida. Como usado no presente documento, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo PIP-72. Em algumas modalidades, um fragmento de polipeptídeo PIP-72 compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946. Em algumas modalidades, o fragmento do polipeptídeo PIP-72 é um truncamento N-terminal e/ou C-terminal de pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais aminoácidos da terminação N e/ou terminação C em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946, por exemplo, por proteólise, inserção de um códon inicial, deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados e inserção concomitante de um códon de parada e/ou inserção de um códon de parada.
[0156] Em algumas modalidades, os fragmentos do polipeptídeo PIP-72 abrangidos na presente invenção são o resultado da remoção dos aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946, por exemplo, por proteólise ou por inserção de um códon inicial, por deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados e inserção concomitante de um códon de parada.
[0157] Em algumas modalidades, os fragmentos do polipeptídeo PIP-72 abrangidos na presente invenção são o resultado da remoção dos aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou variantes dos mesmos incluindo, mas não se limitando a qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946. Em algumas modalidades, o truncamento é dos primeiros 4 aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32 ou variantes dos mesmos incluindo, mas não se limitando a qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946.
[0158] O termo “variantes”, como usado aqui, refere-se a proteínas ou polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é ao menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos parental. O termo “cerca de”, como usado aqui, em relação à % de identidade de sequência significa até e incluindo ± 0,5% em incrementos de 0,1%. Por exemplo, “cerca de 90%” de identidade de sequência inclui 89,5%, 89,6%, 89,7%, 89,8%, 89,9%, 90%, 90,1%, 90,2%, 90,3% 90,4% e 90,5%.
[0159] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98% ou 99% de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946.
[0160] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
[0161] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.
[0162] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.
[0163] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.
[0164] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[0165] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.
[0166] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.
[0167] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0168] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.
[0169] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.
[0170] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 927.
[0171] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 928.
[0172] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 932.
[0173] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 933.
[0174] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 934.
[0175] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 935.
[0176] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 936.
[0177] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 939.
[0178] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 940.
[0179] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 941.
[0180] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 943.
[0181] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 944.
[0182] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 945.
[0183] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade por todo o comprimento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 946.
[0184] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0185] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0186] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0187] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0188] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0189] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0190] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0191] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0192] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
[0193] Em algumas modalidades, a identidade de sequência é ao longo de todo o comprimento do polipeptídeo calculado usando o algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® da suíte de programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA) com todos os parâmetros padrão.
[0194] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 compreende um motivo de aminoácido representado pelas posições de aminoácidos 37-51 da SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848 ou SEQ ID NO: 849.
[0195] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 tendo uma substituição de aminoácidos em um ou mais resíduos selecionados dentre os resíduos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86 da SEQ ID NO: 2, em qualquer combinação e, opcionalmente, o polipeptídeo PIP-72 compreende adicionalmente uma deleção de 1 a 5 aminoácidos, uma inserção de 1 a 5 aminoácidos, adição de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou adição de um ou mais aminoácidos na extremidade C-terminal em relação à SEQ ID NO: 2, em qualquer combinação.
[0196] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 tendo uma substituição de aminoácidos em um ou mais resíduos selecionados dentre os resíduos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86 da SEQ ID NO: 2, em qualquer combinação e, opcionalmente, o polipeptídeo PIP-72 compreende adicionalmente uma deleção de 1 a 5 aminoácidos, uma inserção de 1 a 5 aminoácidos, adição de um ou mais aminoácidos no N-terminal ou adição de um ou mais aminoácidos no C-terminal em relação à SEQ ID NO: 2, em qualquer combinação.
[0197] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 tendo uma substituição de aminoácidos em 1 a 45 resíduos selecionados dentre os resíduos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 23, 8, 9, 10, 24, 25, 11, 26, 12, 27, 13, 28, 14, 29, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 e 86 da SEQ ID NO : 2, em qualquer combinação e, opcionalmente, o polipeptídeo PIP-72 compreende adicionalmente uma deleção de 1 a 5 aminoácidos, uma inserção de 1 a 5 aminoácidos, adição de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou adição de um ou mais aminoácidos na extremidade C-terminal em relação à SEQ ID NO: 2, em qualquer combinação.
[0198] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 tendo uma substituição de aminoácido em comparação com o aminoácido nativo da SEQ ID NO: 2 em 1 a 45 resíduos selecionados dentre os resíduos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 e 86 da SEQ ID NO: 2, em qualquer combinação e, opcionalmente, o polipeptídeo PIP-72 compreende adicionalmente uma deleção de 1 a 5 aminoácidos, uma inserção de 1 a 5 aminoácidos, adição de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou adição de um ou mais aminoácidos na extremidade C-terminal em relação à SEQ ID NO: 2, em qualquer combinação.
[0199] Em modalidades específicas, a substituição é uma alanina para o aminoácido nativo na(s) referida(s) posição(ões). Também é (são) abrangida(s) sequência(s) de ácidos nucleicos que codifica a variante de proteína ou polipeptídeo.
[0200] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 846, onde Xaa na posição 2 é Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 3 é Ile ou Trp; Xaa na posição 4 é Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 5 é Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile ou Tyr; Xaa na posição 6 é Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp ou Tyr; Xaa na posição 7 é Asn, Ala ou Val; Xaa na posição 8 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 9 é Ser, Ala, Cys, Gly ou Thr; Xaa na posição 10 é Ser, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr ou Trp; Xaa na posição 11 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 12 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 13 é Ile, Asn, Gln ou Val; Xaa na posição 14 é Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys ou Gln; Xaa na posição 15 é Val, Ala, Cys, Ile, Met ou Arg; Xaa na posição 17 é Ile, Glu ou Val; Xaa na posição 18 é Asn ou Ser; Xaa na posição 19 é His, Ala, Glu, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser ou Tyr; Xaa na posição 20 é Trp, Ala ou Thr; Xaa na posição 22 é Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 23 é Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 24 é Gly, Asp ou Phe; Xaa na posição 25 é Asp, Ala, Glu, Phe, Asn ou Gln; Xaa na posição 26 é Thr, Glu ou Pro; Xaa na posição 27 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Arg ou Thr; Xaa na posição 28 é Phe, Pro, Trp ou Tyr; Xaa na posição 29 é Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr; Xaa na posição 30 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 31 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 32 é Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 33 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 34 é Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Tyr; Xaa na posição 35 é Lys, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 36 é Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 37 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 38 é Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 39 é Trp ou Phe; Xaa na posição 40 é Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 42 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 44 é Ser, Ala, Asp, Glu, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 45 é Arg, Lys ou Ser; Xaa na posição 46 é Gly, Ala ou Gln; Xaa na posição 47 é Phe, Cys, Val ou Tyr; Xaa na posição 48 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 49 é Leu, Cys, Phe, Met, Arg ou Tyr; Xaa na posição 50 é Ser, Ala, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Thr ou Val; Xaa na posição 51 é Leu, Ala, Cys, Met ou Val; Xaa na posição 52 é Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; Xaa na posição 53 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 54 é Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser ou Trp; Xaa na posição 56 é Ala, Gly, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser ou Thr; Xaa na posição 57 é Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr; Xaa na posição 58 é His, Ala, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp ou Tyr; Xaa na posição 60 é Tyr, Glu ou Phe; Xaa na posição 63 é Gln, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 64 é Ala, Phe, Gly, His, Arg, Ser ou Tyr; Xaa na posição 65 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Thr ou Val; Xaa na posição 66 é Ser, Ala ou Gly; Xaa na posição 67 é Lys, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 68 é Ile Asp, Leu ou Val; Xaa na posição 69 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 70 é Val, Cys ou Ile; Xaa na posição 71 é Asp, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 72 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp; Xaa na posição 73 é Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 74 é Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 75 é Val, Cys, Ile ou Leu; Xaa na posição 76 é Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 77 é Asp, Tyr; Xaa na posição 78 é Gln, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 79 é Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; Xaa na posição 80 é Arg, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 81 é Leu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 82 é Ile, Ala, Leu, Met, Arg ou Val; Xaa na posição 83 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 84 é Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 85 é Leu, Cys, Gly ou Val; e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Ile, Thr ou Val, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N-terminal e/ou C-terminal do polipeptídeo PIP-72.
[0201] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 846 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 846 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0202] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 846 que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 substituições de aminoácido, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 846 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0203] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 847, onde Xaa na posição 2 é Gly, Lys ou Ala; Xaa na posição 3 é Ile ou Leu; Xaa na posição 4 é Thr ou Ser; Xaa na posição 5 é Val ou Ile; Xaa na posição 6 é Thr ou Lys; Xaa na posição 8 é Asn, Lys, Gly ou Ser; Xaa na posição 9 é Ser ou Ala; Xaa na posição 11 é Asn, Lys, His ou Thr; Xaa na posição 12 é Pro, Thr, Lys ou Ser; Xaa na posição 13 é Ile ou Val; Xaa na posição 14 é Glu ou Asp; Xaa na posição 15 é Val, Ala ou Ile; Xaa na posição 16 é Ala ou Ser; Xaa na posição 17 é Ile ou Val; Xaa na posição 18 é Asn ou Ser; Xaa na posição 19 é His, Lys, Arg, Gln ou Ala; Xaa na posição 21 é Gly ou Arg; Xaa na posição 22 é Ser, Lys, Asn, Asp ou Thr; Xaa na posição 25 é Asp ou Asn; Xaa na posição 26 é Thr ou Asp; Xaa na posição 27 é Ser, Thr, Asn ou Lys; Xaa na posição 28 é Phe, Tyr ou Pro; Xaa na posição 29 é Phe ou Tyr; Xaa na posição 30 é Ser, Gly ou Lys; Xaa na posição 31 é Val, Ile ou Met; Xaa na posição 32 é Gly, Ala ou Asp; Xaa na posição 33 é Asn, Ser, Gln ou Pro; Xaa na posição 35 é Lys, Glu ou Ser; Xaa na posição 36 é Gln, Asn ou Ser; Xaa na posição 37 é Glu ou Asp; Xaa na posição 38 é Thr ou Ser; Xaa na posição 42 é Ser ou Asn; Xaa na posição 44 é Ser, Asp, Ala ou Leu; Xaa na posição 47 é Phe ou Tyr; Xaa na posição 48 é Leu ou Met; Xaa na posição 49 é Leu ou Met; Xaa na posição 50 é Ser, Ala ou Tyr; Xaa na posição 51 é Leu ou Val; Xaa na posição 52 é Lys ou Gln; Xaa na posição 53 é Lys, Arg, Met ou Leu; Xaa na posição 54 é Asn, Lys ou Gly; Xaa na posição 55 é Gly ou Ser; Xaa na posição 56 é Ala, Thr, Gln ou Ser; Xaa na posição 57 é Gln, Val ou Ala; Xaa na posição 58 é His, Ala, Lys, Tyr ou Thr; Xaa na posição 59 é Pro ou Thr; Xaa na posição 62 é Val ou Ile; Xaa na posição 63 é Gln, Ser ou Leu; Xaa na posição 64 é Ala, Gln ou Ser; Xaa na posição 65 é Ser ou Thr; Xaa na posição 67 é Lys, Gln, Arg ou Asn; Xaa na posição 69 é Glu, Lys ou Val; Xaa na posição 70 é Val ou Ile; Xaa na posição 71 é Asp, Glu ou Tyr; Xaa na posição 72 é Asn, His, Ser ou Asp; Xaa na posição 73 é Asn, Ser ou Asp; Xaa na posição 74 é Ala, Thr, Met, Ile ou Lys; Xaa na posição 76 é Lys ou Thr; Xaa na posição 78 é Gln, His ou Ser; Xaa na posição 80 é Arg, Glu ou Gln; Xaa na posição 81 é Leu, Pro, Ala ou Thr; Xaa na posição 82 é Ile ou Leu; Xaa na posição 83 é Glu, His, Asn, Gln ou Leu; Xaa na posição 85 é Leu, Val ou Ala; e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Tyr ou Asn, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N- terminal e/ou C-terminal do polipeptídeo PIP-72 e/ou um aminoácido é inserido entre os resíduos 24 e 25 em relação à SEQ ID NO: 847.
[0204] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 847 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 847 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0205] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 847 que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 substituições de aminoácido, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 847 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0206] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 848, onde Xaa na posição 2 é Gly, Lys, Ala ou Arg; Xaa na posição 3 é Ile, Leu ou Val; Xaa na posição 4 é Thr ou Ser; Xaa na posição 5 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 6 é Thr, Lys, Ser ou Arg; Xaa na posição 8 é Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr ou Ala; Xaa na posição 9 é Ser, Ala ou Thr; Xaa na posição 11 é Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, His ou Ser; Xaa na posição 12 é Pro, Thr, Lys, Ser ou Arg; Xaa na posição 13 é Ile, Val ou Leu; Xaa na posição 14 é Glu ou Asp; Xaa na posição 15 é Val, Ala, Ile ou Leu; Xaa na posição 16 é Ala ou Ser; Xaa na posição 17 é Ile, Val ou Leu; Xaa na posição 18 é Asn, Ser, Gln ou Thr; Xaa na posição 19 é His, Lys, Ala, Gln, Asn ou Arg; Xaa na posição 21 é Gly, Arg ou Lys; Xaa na posição 22 é Ser, Lys, Asn, Thr, Arg, Asp, Glu ou Gln; Xaa na posição 25 é Asp, Asn, Glu ou Gln; Xaa na posição 26 é Thr, Asp, Ser ou Glu; Xaa na posição 27 é Ser, Thr, Lys, Asn, Gln ou Arg; Xaa na posição 28 é Phe, Tyr, Pro ou Trp; Xaa na posição 29 é Phe, Tyr ou Trp; Xaa na posição 30 é Ser, Gly, Lys, Thr ou Arg; Xaa na posição 31 é Val, Ile, Met ou Leu; Xaa na posição 32 é Gly, Ala, Asp ou Glu; Xaa na posição 33 é Asn, Ser, Gln, Pro ou Thr; Xaa na posição 35 é Lys, Glu, Ser, Arg ou Thr; Xaa na posição 36 é Gln, Ser, Asn ou Thr; Xaa na posição 37 é Glu ou Asp; Xaa na posição 38 é Thr ou Ser; Xaa na posição 42 é Ser, Asn, Thr ou Gln; Xaa na posição 44 é Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile ou Val; Xaa na posição 47 é Phe, Tyr ou Trp; Xaa na posição 48 é Leu, Met, Ile ou Val; Xaa na posição 49 é Leu, Met, Ile ou Val; Xaa na posição 50 é Ser, Ala, Tyr ou Thr; Xaa na posição 51 é Leu, Val ou Ile; Xaa na posição 52 é Lys, Gln, Arg ou Asn; Xaa na posição 53 é Lys, Arg, Met, Leu, Ile ou Val; Xaa na posição 54 é Asn, Lys, Gly, Gln ou Arg; Xaa na posição 55 é Gly, Ser ou Thr; Xaa na posição 56 é Ala, Thr, Gln, Ser ou Asn; Xaa na posição 57 é Gln, Val, Ala, Asn, Leu ou Ile; Xaa na posição 58 é His, Ala, Lys, Tyr ou Thr; Xaa na posição 59 é Pro, Thr ou Ser; Xaa na posição 62 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 63 é Gln, Ser, Leu, Asn, Thr, Ile ou Val; Xaa na posição 64 é Ala, Gln, Ser, Asn ou Thr; Xaa na posição 65 é Ser ou Thr; Xaa na posição 67 é Lys, Gln, Asn ou Arg; Xaa na posição 69 é Glu, Val, Asp, Lys, Arg, Ile ou Leu; Xaa na posição 70 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 71 é Asp, Glu, Tyr ou Trp; Xaa na posição 72 é Asn, His, Ser, Asp, Gln, Thr ou Glu; Xaa na posição 73 é Asn, Ser, Asp, Gln, Thr ou Glu; Xaa na posição 74 é Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val ou Arg; Xaa na posição 76 é Lys, Thr, Arg ou Ser; Xaa na posição 78 é Gln, His, Ser, Asn ou Thr; Xaa na posição 80 é Arg, Glu, Gln, Lys, Asp ou Asn; Xaa na posição 81 é Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala ou Ser; Xaa na posição 82 é Ile, Leu ou Val; Xaa na posição 83 é Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile ou Val; Xaa na posição 85 é Leu, Val ou Ala; e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Tyr, Asn ou Thr, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N-terminal e/ou C- terminal do polipeptídeo PIP-72 e/ou um aminoácido é inserido entre os resíduos 24 e 25 em relação à SEQ ID NO: 848.
[0207] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 848 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 848 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0208] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 848 que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 substituições de aminoácido, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 848 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0209] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 849, onde Xaa na posição 2 é Gly, Ala, Cys, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 3 é Ile, Leu, Val ou Trp; Xaa na posição 4 é Thr, Ala, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 5 é Val, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu ou Tyr; Xaa na posição 6 é Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Trp ou Tyr; Xaa na posição 7 é Asn, Ala ou Val; Xaa na posição 8 é Asn, Lys, Gly, Ser, Gln, Arg, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met ou Val; Xaa na posição 9 é Ser, Ala, Cys, Gly ou Thr; Xaa na posição 11 é Asn, Lys, Thr, Gln, Arg, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Val ou Tyr; Xaa na posição 12 é Pro, Thr, Lys, Ser, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Asn, Gln, Arg, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 13 é Ile, Asn, Gln, Leu ou Val; Xaa na posição 14 é Glu, Ala, Cys, Phe, His, Lys, Asp ou Gln; Xaa na posição 15 é Val, Ala, Ile, Leu, Cys, Met ou Arg; Xaa na posição 16 é Ala ou Ser; Xaa na posição 17 é Ile Glu, Leu ou Val; Xaa na posição 18 é Asn, Gln, Thr ou Ser; Xaa na posição 19 é His, Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Pro, Ser ou Tyr; Xaa na posição 20 é Trp, Ala ou Thr; Xaa na posição 21 é Gly, Arg ou Lys; Xaa na posição 22 é Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 23 é Asp, Ala, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 24 é Gly, Asp ou Phe; Xaa na posição 25 é Asp, Ala, Glu, Phe, Asn ou Gln; Xaa na posição 26 é Thr, Glu, Asp, Ser ou Pro; Xaa na posição 27 é Ser, Thr, Lys, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Asn ou Gln; Xaa na posição 28 é Phe, Tyr, Pro ou Trp; Xaa na posição 29 é Phe, Ala, Cys, Ile, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr; Xaa na posição 30 é Ser, Gly, Lys, Thr, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 31 é Val, Ile, Met ou Leu; Xaa na posição 32 é Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 33 é Asn, Ser, Gln, Pro, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Arg, Val ou Tyr; Xaa na posição 34 é Gly, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Tyr; Xaa na posição 35 é Lys, Glu, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 36 é Gln, Ala, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 37 é Glu, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val; Xaa na posição 38 é Thr, Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 39 é Trp ou Phe; Xaa na posição 40 é Asp, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 42 é Ser, Asn, Thr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Val, Trp, Tyr ou Gln; Xaa na posição 44 é Ser, Asp, Ala, Leu, Thr, Glu, Ile, Ala, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Val, Tyr ou Val; Xaa na posição 45 é Arg, Lys ou Ser; Xaa na posição 46 é Gly, Ala ou Gln; Xaa na posição 47 é Phe, Tyr Cys, Val ou Trp; Xaa na posição 48 é Leu, Met, Ile, Cys, Phe, Met, Arg, Tyr ou Val; Xaa na posição 49 é Leu, Met, Ile ou Val; Xaa na posição 50 é Ser, Ala, Tyr, Cys, Asp, Ile, Met, Pro, Gln, Val ou Thr; Xaa na posição 51 é Leu, Val, Ala, Cys, Met ou Ile; Xaa na posição 52 é Lys, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Gln, Trp ou Tyr; Xaa na posição 53 é Lys, Arg, Met, Leu, Ile, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr ou Val; Xaa na posição 54 é Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser ou Trp; Xaa na posição 55 é Gly, Ser ou Thr; Xaa na posição 56 é Ala, Thr, Gln, Ser, Gly, Leu, Pro, Arg ou Asn; Xaa na posição 57 é Gln, Glu, Leu, Met, Ser, Val, Ala, Asn, Ile ou Thr; Xaa na posição 58 é His, Ala, Lys, Asp, Phe, Leu, Met, Asn, Arg, Trp, Tyr ou Thr; Xaa na posição 59 é Pro, Thr ou Ser; Xaa na posição 60 é Tyr, Glu ou Phe; Xaa na posição 62 é Val, Ile ou Leu; Xaa na posição 63 é Gln, Ser, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 64 é Ala, Gln, Asn, Phe, Gly, His, Arg, Ser ou Tyr; Xaa na posição 65 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Val ou Thr; Xaa na posição 66 é Ser, Ala ou Gly; Xaa na posição 67 é Lys, Gln, Asn ou Arg; Xaa na posição 67 é Lys, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 68 é Ile Asp, Leu ou Val; Xaa na posição 69 é Glu, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr; Xaa na posição 70 é Val, Ile, Cys ou Leu; Xaa na posição 71 é Asp, Glu, Tyr, Ala, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Val ou Trp; Xaa na posição 72 é Asn, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, His ou Trp; Xaa na posição 73 é Asn, Ser, Asp, Gln, Thr, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Val, Tyr ou Glu; Xaa na posição 74 é Ala, Thr, Met, Ile, Lys, Ser, Leu, Val, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Tyr ou Arg; Xaa na posição 75 é Val, Cys, Ile ou Leu; Xaa na posição 76 é Lys, Ala, Cys, Phe, His, Ile, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 77 é Asp, Tyr; Xaa na posição 78 é Gln, His, Ser, Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Arg, Val, Tyr ou Thr; Xaa na posição 79 é Gly, Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; Xaa na posição 80 é Arg, Glu, Gln, Lys, Asp, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val, Tyr ou Asn; Xaa na posição 81 é Leu, Pro, Thr, Ile, Val, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His ou Ser; Xaa na posição 82 é Ile, Ala, Leu, Met, Arg e Val; Xaa na posição 83 é Glu, His, Asn, Leu, Gln, Ile, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, Lys, Pro, Arg, Ser, Thr, Tyr ou Val ; Xaa na posição 84 é Pro, Ala, Cys, Glu, Ile, Ser, Val, Trp ou Tyr; Xaa na posição 85 é Leu, Val, Cys, Gly ou Ala e Xaa na posição 86 é Ser, Ala, Tyr, Asn, Ile, Val ou Thr, e sendo que de 1 a 14 aminoácidos são opcionalmente deletados da extremidade N-terminal e/ou C-terminal do polipeptídeo PIP- 72 e/ou um aminoácido é inserido entre os resíduos 24 e 25 em relação à SEQ ID NO: 849.
[0210] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 849 tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 substituições de aminoácidos, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 849 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0211] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 849 que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 substituições de aminoácido, em qualquer combinação, nos resíduos designados por Xaa na SEQ ID NO: 849 em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[0212] Em algumas modalidades exemplificadoras, os polipeptídeos PIP-72 são codificados pela sequência de polinucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 287 - SEQ ID NO: 527, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 796 - SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 853 - SEQ ID NO: 864, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 915 - SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 ou SEQ ID NO: 968.
[0213] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 é codificado pelo polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 ou SEQ ID NO: 968.
[0214] Em algumas modalidades, os polipeptídeos PIP-72 exemplificadores são apresentados na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO 540, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO 544, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO 548, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO 552, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO 556, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO 560, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO 568, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO 572, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO 580, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO 584, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO 588, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO 600, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO 604, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO 612, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO 616, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO 620, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO 624, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO 628, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 634, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO 636, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO 640, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 643, SEQ ID NO 644, SEQ ID NO: 645, SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO 648, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO 652, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO 656, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO 660, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 663, SEQ ID NO 664, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO 668, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO 684, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 694, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO 696, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO 728, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO 736, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO 752, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, e SEQ ID NO: 946
[0215] Em algumas . mo dalidades, o polipeptídeo PIP -72 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934 , SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 93 6, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 94 1, SEQ ID NO : 943, SEQ ID NO: 944, SEQ
[0216] Em algumas ID NO: 945 ou SEQ ID modalidades, os NO: 946. polipeptídeos PIP -72 exemplificadores são os polipeptídeos mostrados na Tabela 14, Tabela 17, Tabela 20, Tabela 23, Tabela 24, Tabela 26, Tabela 28, e/ou Tabela 29 e quaisquer combinações das substituições de aminoácido, assim como deleções e/ou inserções e seus fragmentos.
[0217] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 tem um peso molecular calculado entre cerca de 6 kDa e cerca de 13 kDa, entre cerca de 7 kDa e cerca de 12 kDa, entre cerca de 8 kDa e cerca de 11 kDa, entre cerca de 9 kDa e cerca de 10 kDa, cerca de 8,75 kDa, cerca de 9 kDa, cerca de 9,25 kDa, cerca de 9,5 kDa, cerca de 9,75 kDa, cerca de 10 kDa, cerca de 10,25 kDa e cerca de 10,5 kDa. Como usado aqui, o termo “cerca de” usado no contexto do peso molecular de um polipeptídeo PIP-72 significa ± 0,25 quilodaltons.
[0218] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de PIP-72 tem uma propriedade física modificada. Como usado aqui, o termo “propriedade física” se refere a qualquer parâmetro adequado para descrever as características físico-químicas de uma proteína. Como usado aqui, “propriedade física de interesse” e “propriedade de interesse” são usados de forma intercambiável para se referir às propriedades físicas de proteínas que estão sendo investigadas e/ou modificadas. Exemplos de propriedades físicas incluem, mas não se limitam à carga de superfície líquida e distribuição de carga sobre a superfície da proteína, hidrofobicidade líquida e distribuição de resíduos hidrofóbicos na superfície da proteína, densidade de carga da superfície, densidade de hidrofobicidade da superfície, contagem total de grupos ionizáveis da superfície, tensão superficial, tamanho da proteína e sua distribuição em solução, temperatura de fusão, capacidade de calor, e segundo coeficiente virial. Exemplos de propriedades físicas incluem, também, mas não se limitam a, solubilidade, dobramento, estabilidade e digestibilidade. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 tem digestibilidade de fragmentos proteolíticos aumentada no trato gastrointestinal de um inseto. Os modelos para digestão por fluidos gástricos simulados são conhecidos de um versado na técnica (Fuchs, R.L. e J.D. Astwood. Food Technology 50: 83-88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1269-1273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50: 7154-7160, 2002).
[0219] Em algumas modalidades, as variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos devido à mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela revelação são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada (isto é, atividade pesticida) da proteína nativa. Em algumas modalidades, a variante terá ao menos cerca de 10%, ao menos cerca de 30%, ao menos cerca de 50%, ao menos cerca de 70%, ao menos cerca de 80% ou mais da atividade inseticida da proteína nativa. Em algumas modalidades, as variantes podem ter atividade melhorada em relação à proteína nativa.
[0220] Genes bacterianos muito frequentemente possuem múltiplos códons de iniciação de metionina próximos ao início do quadro de leitura aberto. Frequentemente, o início da tradução em um ou mais destes códons de iniciação levará à geração de uma proteína funcional. Esses códons de iniciação podem incluir códons ATG. Entretanto, bactérias como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como um códon de iniciação, e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em raras ocasiões, a tradução em sistemas bacterianos pode começar em um códon TTG, embora neste caso, o TTG codifique uma metionina. Além disso, não é frequentemente determinado a priori quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Dessa forma, entende-se que o uso de um dos códons de metionina alternativos pode, também, levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são abrangidas na presente revelação e podem ser usadas nos métodos da presente revelação. Será compreendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon de iniciação alternativo para ATG, para tradução adequada.
[0221] Em um outro aspecto, o polipeptídeo PIP-72 pode ser expressado como uma proteína precursora com uma sequência interveniente que catalisa o splicing de proteína pós- traducional de múltiplas etapas. O splicing de proteína envolve a excisão de uma sequência interveniente de um polipeptídeo com a união concomitante das sequências flanqueadoras para produzir um novo polipeptídeo (Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22.159 a 22.168). Essa sequência interveniente ou elemento de splicing de proteína, chamado de inteína, que catalisa sua própria excisão através de três reações coordenadas nas junções de splice do N- terminal e C-terminal: uma reorganização da cisteína ou serina N-terminal; uma reação de transesterificação entre as duas terminações para formar um intermediário de éster ou tioéster ramificado e clivagem da ligação peptídica acoplada à ciclização da asparagina C-terminal da inteína para liberar a inteína (Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9.091 a 9.094. A elucidação do mecanismo de splicing de proteína levou a inúmeras aplicações baseadas em inteína (Comb, et al., patente US n° 5.496.714; Comb, et al., 5.834.247; Camarero e Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597-5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271-281, Chong, et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26:5109-5115; Chong, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:10567-10577; Cotton, et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:18.359 a 18.363; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:3.923 a 3.926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2.256 a 2.264; Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:9.091 a 9.094; Iwai e Pluckthun, (1999) FEBS Lett. 459:166 a 172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1-13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6.705 a 6.710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040-16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. NMR 14:105-114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643; Severinov e Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16.205 a 16.209; Shingledecker, et al., (1998) Gene 207:187-195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110-120; Wood, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889 a 892; Wu, et al., (1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231; Wu, et al., (1998b) Biochim Biophys Acta 1387:422-432; Xu, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120:5.591 a 5.592). Para a aplicação de inteínas em transgenes de planta, consulte, Yang, et al., (Transgene Res 15:583 a 593 (2006)) e Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375-392 (2005)).
[0222] Em um outro aspecto, o polipeptídeo PIP-72 pode ser codificado por dois genes separados em que a inteína da proteína precursora é proveniente dos dois genes, chamado de inteína dividida e as duas porções do precursor são unidas por uma formação de ligação peptídica. Essa formação de ligação peptídica é feita por trans-splicing mediado por inteína. Para esse propósito, um primeiro e um segundo cassetes de expressão compreendendo os dois genes separados codificam, ainda, inteínas capazes de mediar o trans-splicing da proteína. Através do trans-splicing, as proteínas e os polipeptídeos codificados pelo primeiro e segundo fragmentos podem ser ligados pela formação de ligações peptídicas. Inteínas de trans-splicing podem ser selecionadas a partir dos genomas nucleolares e das organelas de diferentes organismos, inclusive eucariotos, arqueobactérias e eubactérias. As inteínas que podem ser usadas são mencionadas em neb.com/neb/inteins.html, que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”). A sequência de nucleotídeos que codifica uma inteína pode ser dividida em uma parte 5‘ e uma 3' que codificam a parte 5‘ e a parte 3‘ da inteína, respectivamente. Porções de sequência não necessárias para o splicing da inteína (por exemplo, domínio de “homing” endonuclease) podem ser deletadas. A sequência codificante da inteína é dividida de modo que as partes 5' e 3' sejam capazes de fazer trans-splicing. Para selecionar um sítio de divisão adequado da sequência codificante da inteína, as considerações publicadas por Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926 podem ser seguidas. Na construção do primeiro e do segundo cassetes de expressão, a sequência de codificação da inteína 5' é ligada à extremidade 3' do primeiro fragmento que codifica a parte amino-terminal do polipeptídeo PIP-72 e a sequência de codificação de inteína 3' é ligada à extremidade 5‘ do segundo fragmento que codifica a parte C-terminal do polipeptídeo PIP-72.
[0223] Em geral, os parceiros de trans-splicing podem ser desenhados usando qualquer inteína dividida, inclusive qualquer inteína dividida de ocorrência natural ou dividida artificialmente. São conhecidas diversas inteínas divididas de ocorrência natural, por exemplo: a inteína dividida do gene DnaE de Synechocystis sp. PCC6803 (consulte, Wu, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(16):9.226 a 31 e Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13):9.091 a 4 e o gene DnaE de Nostoc punctiforme (consulte, Iwai, et al., (2006) FEBS Lett. 580(7):1853-8). As inteínas não divididas foram artificialmente divididas no laboratório para criar novas inteínas divididas, por exemplo: a inteína Ssp DnaB artificialmente dividida (consulte, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422 a 32) e inteína Sce VMA dividida (consulte, Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1.571 a 8) e uma mini-inteína fúngica artificialmente dividida (consulte, Elleuche, et al., (2007) Biochem Biophys Res Commun. 355(3):830-4). Também existem bancos de dados de inteína disponíveis que catalogam inteínas conhecidas (consulte, por exemplo, a bases de dados online disponível em: bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/Inteinstable.htm l, que pode ser acessada na world wide web usando-se o prefixo “www”).
[0224] As inteínas não divididas de ocorrência natural podem ter atividades de endonuclease ou outras atividades enzimáticas que podem ser tipicamente removidas quando se desenha uma inteína dividida artificialmente. Essas mini- inteínas ou inteínas divididas minimizadas são bem conhecidas na técnica e têm tipicamente um comprimento menor que 200 resíduos de aminoácidos (consulte, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422-32). As inteínas divididas adequadas podem ter outros elementos polipeptídicos que permitem purificação adicionados a sua estrutura, desde que esses elementos não inibam o splicing da inteína dividida ou sejam adicionados de uma forma que permita que elas sejam removidas antes do splicing. O splicing de proteína foi relatado com o uso de proteínas que compreendem domínios tipo inteína bacteriana (BIL) (consulte, Amitai, et al., (2003) Mol Microbiol. 47:61 a 73) e domínios de autoprocessamento hedgehog (Hog) (o último é combinada com inteínas quando referido à superfamília de Hog/inteína ou família HINT (consulte, Dassa, et al., (2004) J Biol Chem. 279:32001 a 7) e domínios como esses podem também ser usados para preparar inteínas divididas artificialmente. Em particular, elementos de não-splicing dessas famílias podem ser modificados por metodologias de biologia molecular para introduzir ou restaurar atividade de splicing nessas espécies relacionadas. Estudos recentes demonstram que o splicing pode ser observado quando um componente da inteína dividida de N-terminal é deixado reagir com um componente da inteína dividida de C- terminal que não é encontrado na natureza para ser seu “parceiro”; por exemplo, o splicing foi observado utilizando parceiros que têm tão pouco quanto 30 a 50% de homologia com o parceiro de splicing “natural” (consulte, Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322-30). Foi mostrado que outras dessas misturas de parceiros de inteína dividida desiguais não são reativas entre si (consulte, Brenzel, et al., 2006 Biochemistry. 45(6):1571-8). Entretanto, está dentro da capacidade de um versado na técnica relevante determinar se um par particular de polipeptídeos é capaz de fazer associação entre si para fornecer uma inteína funcional, usando métodos de rotina e sem o exercício de atividade inventiva.
[0225] Em um outro aspecto, o polipeptídeo PIP-72 é uma variante permutada circular. Em certas modalidades, o polipeptídeo PIP-72 é uma variante permutada circular do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946.
[0226] O desenvolvimento de métodos de DNA recombinante tornou possível estudar os efeitos da transposição de sequências sobre o dobramento, estrutura e função da proteína. A abordagem usada na criação de novas sequências se assemelha àquela de pares de ocorrência natural de proteínas que são relacionadas pela reorganização linear de suas sequências de aminoácidos (Cunningham, et al.,(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 76:3.218 a 3.222; Teather e Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:3.837 a 3.841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13 a 19; Yamiuchi e Minamikawa, (1991) FEBS Lett. 260:127 a 130; MacGregor, et al., (1996) FEBS Lett. 378:263-266). A primeira aplicação in vitro deste tipo de rearranjo às proteínas foi descrita por Goldenberg e Creighton (J. Mol. Biol. 165:407-413, 1983). Ao criar uma variante permutada circular, um novo N-terminal é selecionado em um sítio interno (ponto de quebra) da sequência original, a nova sequência tendo a mesma ordem de aminoácidos que a original a partir do ponto de quebra até ela alcançar um aminoácido que está no C- terminal original ou próximo dele. Nesse ponto, a nova sequência é unida, diretamente ou através de uma porção adicional de sequência (ligante), a um aminoácido que está no N-terminal original, ou próximo dele, e a nova sequência continua com a mesma sequência que a original até ela alcançar um ponto em que ela está no, ou próximo, do aminoácido que estava no N-terminal ao sítio do ponto de quebra da sequência original, este resíduo formando o novo C-terminal da cadeia. O comprimento da sequência de aminoácidos do ligante pode ser selecionado empiricamente ou com orientação de informações estruturais ou pelo uso de uma combinação das duas abordagens. Quando nenhuma informação estrutural estiver disponível, uma pequena série de ligantes pode ser preparada para teste usando um design cujo comprimento é alterado de modo a ocupar um intervalo de 0 a 50 Â e cuja sequência é escolhida de modo a ser compatível com a exposição à superfície (capacidade hidrofílica, Hopp and Woods, (1983) Mol. Immunol. 20:483 a 489; Kyte e Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157:105 a 132; área da superfície exposta ao solvente, Lee and Richards, (1971) J. Mol. Biol. Biol. 55:379-400) e a capacidade de adotar a conformação necessária sem perturbar a configuração do polipeptídeo pesticida (conformacionalmente flexível; Karplus e Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212 a 213). Supondo uma média de tradução de 2,0 a 3.8 Â por resíduo, isso significaria que o comprimento para teste seria entre 0 a 30 resíduos, com 0 a 15 resíduos sendo a faixa preferencial. Exemplos de tal série empírica seria construir ligantes usando uma sequência de cassete como Gly-Gly-Gly-Ser repetida n vezes, onde n é 1, 2, 3 ou 4. Os versados na técnica reconhecerão que há muitas destas sequências que variam em comprimento ou composição que podem servir como ligantes com a consideração primária de que eles não são nem excessivamente longos nem curtos (conforme, Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437-462); se eles forem longos demais, os efeitos de entropia vão provavelmente desestabilizar o dobramento tridimensional e podem também tornar o dobramento cineticamente impraticável, e se eles forem curtos demais, eles vão provavelmente desestabilizar a molécula por causa da tensão torcional ou estérica. Os versados na técnica de análise de informações estruturais de proteína reconhecerão que o uso da distância entre as extremidades da cadeia, definidas como a distância entre os carbonos c-alfa, pode ser usado para definir o comprimento da sequência a ser usada ou ao menos limitar o número de possibilidades que devem ser testadas em uma seleção empírica de ligantes. Eles também reconhecerão que é algumas vezes o caso de que as posições das extremidades da cadeia polipeptídica são mal definidas nos modelos estruturais derivados de difração de raios X (DRX) ou dados de espectroscopia por ressonância magnética nuclear, e que, quando verdadeira, essa situação, portanto, precisará ser levada em consideração para estimar adequadamente o comprimento do ligante necessário. A partir desses resíduos cujas posições são bem definidas, são selecionados dois resíduos que têm sequências próximas às extremidades de cadeia, e a distância entre seus carbonos c-alfa é usada para calcular um comprimento aproximado para um ligante entre eles. Usando o comprimento calculado como um guia, os ligantes com uma faixa de números de resíduos (calculada usando 2 a 3,8 Â por resíduo) são então selecionadas. Esses ligantes podem ser compostos da sequência original, encurtada ou alongada, conforme necessário, e quando alongada, os resíduos adicionais podem ser escolhidos para serem flexíveis e hidrofílicos, conforme descrito acima; ou opcionalmente, a sequência original pode ser substituída para usar uma série de ligantes, um exemplo sendo a abordagem de cassete Gly-Gly-Gly-Ser acima mencionada; ou opcionalmente, uma combinação da sequência original e a nova sequência tendo o comprimento total adequado pode ser usada. Sequências de polipeptídeos pesticidas capazes de se dobrar para estados biologicamente ativos podem ser preparadas pela seleção adequada das posições iniciais (terminação amino) e finais (terminação carboxila) de dentro da cadeia polipeptídica original, porém usando a sequência ligante, conforme descrito acima. As terminações amino e carboxila são selecionadas a partir de dentro de um trecho comum da sequência, chamado de uma região de ponto de quebra, usando as orientações descritas a seguir. Uma nova sequência de aminoácidos é, assim, gerada pela seleção de terminações amino e carboxila de dentro da mesma região de ponto de quebra. Em muitos casos, a seleção de novas terminações será tal que a posição original da terminação carboxila precede imediatamente aquela da terminação amino. Entretanto, os versados na técnica irão reconhecer que seleções dos terminais em qualquer local dentro da região podem funcionar e que a mesmas levarão eficazmente a deleções ou adições às porções amino ou carboxila da nova sequência. É um dogma central da biologia molecular que a sequência de aminoácidos primária de uma proteína determina o dobramento da estrutura tridimensional necessária para expressão de sua função biológica. Os métodos para obter e interpretar a informação estrutural tridimensional usando difração de raios X (DRX) de Cristais de proteína únicos ou espectroscopia por ressonância magnética nuclear de soluções de proteína são conhecidos pelos versados na técnica. Exemplos de informações estruturais que são relevantes para a identificação de regiões de ponto de quebra incluem o local e o tipo de estrutura secundária da proteína (alfa e 3-10 hélices, folhas beta paralelas e antiparalelas, reversões e voltas de cadeia, e alças; Kabsch and Sander, (1983) Biopolymers 22:2577-2637; o grau de exposição ao solvente dos resíduos de aminoácido, a extensão e o tipo de interações dos resíduos uns com os outros (Chothia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537-572) e a distribuição estática e dinâmica das conformações ao longo da cadeia polipeptídica (Alber and Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154:511-533). Em alguns casos, informações adicionais são conhecidas sobre a exposição dos resíduos aos solventes; um exemplo é um sítio de fixação pós-traducional de carboidrato que está necessariamente sobre a superfície da proteína. Quando informações estruturais experimentais não estiverem disponíveis ou não for possível obtê-las, também estão disponíveis métodos para analisar a sequência de aminoácidos primária de modo a fazer predições da estrutura terciária e secundária da proteína, acessibilidade do solvente e a ocorrência de voltas e alças. Métodos bioquímicos também são algumas vezes aplicáveis para determinar empiricamente a exposição da superfície quando métodos estruturais diretos forem impraticáveis; por exemplo, usando a identificação de sítios de cisão de cadeia após proteólise limitada de modo a inferir exposição da superfície (Gentile and Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218:603-621). Dessa forma, o uso de informações estruturais derivadas experimentalmente ou métodos preditivos (por exemplo, Srinivisan and Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81-99) a sequência de aminoácidos parental é inspecionada para classificar as regiões de acordo com se elas fazem ou não parte da manutenção da estrutura secundária e terciária. A ocorrência de sequências dentro de regiões que são conhecidas por estarem envolvidas na estrutura secundária periódica (alfa e 3-10 hélices, folhas beta paralelas e antiparalelas) são regiões que devem ser evitadas. De maneira similar, as regiões da sequência de aminoácidos nas quais se observa ou se prevê um baixo grau de exposição de solvente mais provavelmente fazem parte do assim chamado núcleo hidrofóbico da proteína e também devem ser evitadas para a seleção das terminações amino e carboxila. Em contrapartida, as regiões que são conhecidas ou previstas para estarem em voltas ou alças da superfície, e especialmente as regiões que conhecidamente não são necessárias para a atividade biológica, são os sítios preferencias para a localização dos extremos da cadeia polipeptídica. Trechos contínuos de sequências de aminoácidos que são preferenciais, com base nos critérios, acima são chamados de região de ponto de quebra. Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PIP-72 permutados circulares com novos N-terminal/ C-terminal que contêm uma região de ligante que separa o C-terminal e o N-terminal podem ser produzidos seguindo-se essencialmente o método descrito em Mullins, et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5529-5533. Múltiplas etapas de amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) são usadas para rearranjar a sequência de DNA que codifica a sequência de aminoácidos primária da proteína. Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PIP-72 permutados circulares com novos N-terminal/ C-terminal que contêm uma região de ligante que separa o C-terminal e o N-terminal original podem ser produzidos com base no método de duplicação em tandem descrito em Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427-431. A amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) dos novos genes N-terminal/ C-terminal é feita usando um DNA molde duplicado em tandem.
[0227] Em outro aspecto, são fornecidas proteínas de fusão que incluem dentro de sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos que compreende um polipeptídeo PIP-72 que inclui, mas não se limita ao polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 927 - SEQ ID NO: 948, e fragmentos ativos dos mesmos.
[0228] Métodos para desenhar e construir proteínas de fusão (e polinucleotídeos que codificam as mesmas) são conhecidos dos versados na técnica. Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo PIP-72 podem ser fundidos a sequências sinal que direcionam a localização do polipeptídeo PIP-72 para compartimentos particulares de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou direcionam a secreção do polipeptídeo PIP-72 das modalidades de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. coli, pode-se querer direcionar a expressão da proteína para o espaço periplasmático. Exemplos de sequências ou proteínas de sinal (ou fragmentos das mesmas) às quais o polipeptídeo PIP-72 pode ser fusionado a fim de direcionar a expressão do polipeptídeo para o espaço periplasmático de bactérias incluem, mas não se limitam a, sequência sinal pelB, à sequência sinal da proteína de ligação à maltose (MBP), MBP, a sequência sinal ompA, a sequência sinal da subunidade de enterotoxina B termolábil de E. coli e a sequência sinal da fosfatase alcalina. Vários vetores são comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que vão direcionar a localização de uma proteína, como a série de vetores pMAL (particularmente, a série pMAL-p) disponível junto à New England Biolabs® (240 County Road, Ipswich, MA, 019382723, EUA). Em uma modalidade específica, o polipeptídeo PIP-72 pode ser fundido a sequência sinal da pectato liase pelB para aumentar a eficiência de expressão e purificação de tais polipeptídeos em bactérias gram-negativas (consulte, patentes US n° 5.576.195 e 5.846.818). Fusões de polipeptídeo/peptídeo de trânsito plastidial de planta são bem conhecidas na técnica (consulte, patente US número 7.193.133). Os peptídeos de trânsito do apoplasto, como o sinal de secreção de alfa-amilase de arroz ou cevada, também são bem conhecidos na técnica. O peptídeo de trânsito do plastídeo é geralmente fusionado pelo N- terminal ao polipeptídeo a ser direcionado (por exemplo, o parceiro de fusão). Em uma modalidade, a proteína de fusão consiste essencialmente no peptídeo de trânsito de plastídeo e no polipeptídeo PIP-72 a ser direcionado. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende o peptídeo de trânsito plastidial e o polipeptídeo a ser direcionado. Em tais modalidades, o peptídeo de trânsito do plastídeo está, de preferência, no N- terminal da proteína de fusão. Entretanto, resíduos de aminoácido adicionais podem estar N-terminais ao peptídeo de trânsito do plastídeo, fazendo com que a proteína de fusão seja ao menos parcialmente direcionada para um plastídeo. Em uma modalidade específica, o peptídeo de trânsito do plastídeo está na metade N-terminal, terça-parte N-terminal ou quarta-parte N- terminal da proteína de fusão. A maior parte ou o todo do peptídeo de trânsito do plastídeo é geralmente clivado da proteína de fusão quando da inserção no plastídeo. A posição de clivagem pode variar ligeiramente entre as espécies de planta, em diferentes estágios de desenvolvimento da planta, como resultado das condições intercelulares específicas ou da combinação específica do peptídeo de trânsito/parceiro de fusão usado. Em uma modalidade, a clivagem do peptídeo de trânsito do plastídeo é homogênea de modo que o sítio de clivagem seja idêntico em uma população de proteínas de fusão. Em outra modalidade, o peptídeo de trânsito do plastídeo não é homogêneo, de modo que o sítio de clivagem varia de 1 a 10 aminoácidos em uma população de proteínas de fusão. O peptídeo de trânsito do plastídeo pode ser fundido de forma recombinante a uma segunda proteína em uma de várias formas. Por exemplo, um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição pode ser introduzido na sequência de nucleotídeos do peptídeo de trânsito em uma posição correspondente a sua extremidade C-terminal e o mesmo sítio ou um sítio compatível pode ser manipulado na sequência de nucleotídeos da proteína a ser direcionada na sua extremidade N- terminal. Deve-se tomar cuidado ao se desenhar esses sítios para assegurar que as sequências codificantes do peptídeo de trânsito e da segunda proteína sejam mantidas “in-frame (em fase de leitura)” para permitir a síntese da proteína de fusão desejada. Em alguns casos, pode ser preferencial remover o códon de iniciação da metionina da segunda proteína quando o novo sítio de restrição for introduzido. A introdução de sítios de reconhecimento das endonucleases de restrição em ambas as moléculas parentais e sua união subsequente através de técnicas de DNA recombinante pode resultar na adição de um ou mais aminoácidos adicionais entre o peptídeo de trânsito e a segunda proteína. Isso geralmente não afeta a atividade de direcionamento contanto que o sítio de clivagem do peptídeo de trânsito permaneça acessível e a função da segunda proteína não seja alterada mediante a adição desses aminoácidos adicionais no seu N-terminal. Alternativamente, o versado na técnica pode criar um sítio de clivagem preciso entre o peptídeo de trânsito e a segunda proteína (com ou sem sua metionina iniciadora) usando síntese gênica (Stemmer, et al., (1995) Gene 164:49-53) ou métodos similares. Além disso, a fusão do peptídeo de trânsito pode incluir intencionalmente aminoácidos à jusante do sítio de clivagem. Os aminoácidos no N-terminal da proteína madura podem afetar a capacidade de o peptídeo de trânsito direcionar proteínas para os plastídeos e/ou a eficiência da clivagem após a importação da proteína. Isso pode ser dependente da proteína a ser direcionada. Consulte, por exemplo, Comai, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(29):15104-9.
[0229] Em algumas modalidades, são fornecidas proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo PIP-72, e um polipeptídeo inseticida unido por um ligante de aminoácido.
[0230] Em algumas modalidades, são fornecidas proteínas de fusão representadas por uma fórmula selecionada do grupo que consiste em R1-L-R2, R2-L- R1, R1- R2 ou R2- R1 onde R1 é um polipeptídeo PIP-72 ou o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946, R2 é um polipeptídeo inseticida. O polipeptídeo R1 é fundido diretamente ou através de um segmento ligante (L) ao polipeptídeo R2. O termo “diretamente” define fusões nas quais os polipeptídeos são unidos sem um ligante de peptídeo. Dessa forma, “L” representa uma ligação química ou segmento de polipeptídeo ao qual ambos R1 e R2 são fundidos em fase de leitura, mais comumente, L é um peptídeo linear ao qual R1 e R2 são ligados por ligações de amida que ligam uma terminação carbóxi de R1 à terminação amino de L e à terminação carbóxi de L à terminação amino de R2. Por “fusionado em fase de leitura” entende-se que não há terminação da tradução ou interrupção entre as fases de leitura de R1 e R2. O grupo de ligação (L) é geralmente um polipeptídeo entre 1 e 500 aminoácidos de comprimento. Os ligantes que unem as duas moléculas são, de preferência, projetados para (1) permitir que as duas moléculas se dobrem e ajam independentemente uma da outra, (2) não ter propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada que possa interferir com os domínios funcionais das duas proteínas, (3) ter característica hidrofóbica ou carregada mínima que possa interagir com os domínios funcionais da proteína e (4) fornecer separação estérica de R1 e R2, de modo que R1 e R2 possam interagir simultaneamente com seus receptores correspondentes em uma única célula. Tipicamente, os aminoácidos de superfície em regiões de proteína flexíveis incluem Gly, Asn e Ser. Virtualmente seria esperado que qualquer permutação de sequências de aminoácidos contendo Gly, Asn e Ser satisfizesse os critérios acima para uma sequência ligante. Outros aminoácidos neutros, como Thr e Ala, podem, também, ser usados na sequência ligante. Aminoácidos adicionais podem, também, ser incluídos nos ligantes devido à adição de sítios de restrição únicos na sequência ligante para facilitar a construção das fusões.
[0231] Em algumas modalidades, os ligantes compreendem sequências selecionadas do grupo de fórmulas: (Gly3Ser)n, (Gly4Ser)n, (Gly5Ser)n, (GlynSer)n ou (AlaGlySer)n onde n é um n é um número inteiro. Um exemplo de um ligante altamente flexível é a região espaçadora rica em (GlySer) presente dentro da proteína pIII de bacteriófagos filamentosos, por exemplo, bacteriófagos M13 ou fd (Schaller, et al., 1975). Essa região fornece uma região espaçadora longa e flexível entre dois domínios da proteína de superfície pIII. Também estão incluídos ligantes nos quais uma sequência de reconhecimento da endopeptidase está incluída. Esse sítio de clivagem pode ser valioso para separar os componentes individuais da fusão para determinar se eles estão apropriadamente dobrados e ativos in vitro. Exemplos de várias endopeptidases incluem, mas não se limitam a, plasmina, enteroquinase, calicreína, uroquinase, ativador do plasminogênio tecidual, clostripaina, quimosina, colagenase, protease do veneno da cobra víbora de Russell, enzima de clivagem pós-prolina, protease V8, trombina e fator Xa. Em algumas modalidades, o ligante compreende os aminoácidos EEKKN (SEQ ID NO: 488) do veículo de expressão multigênica (MGEV), que é clivado por proteases vacuolares, conforme apresentado na publicação de pedido de patente US número US 2007/0277263. Em outras modalidades, segmentos do ligante de peptídeo da região de dobradiça das imunoglobulinas de cadeia pesada IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE fornecem uma relação angular entre os polipeptídeos ligados. Especialmente úteis são as regiões de dobradiça nas quais as cisteínas são substituídas por serinas. Os ligantes da presente revelação incluem sequências derivadas da região de dobradiça de IgG gama 2b murina na qual as cisteínas foram mudadas para serinas. As proteínas de fusão não são limitadas pela forma, tamanho ou número de sequências ligantes empregadas e o único requisito do ligante é que, funcionalmente, ele não interfira adversamente no dobramento e na função das moléculas individuais da fusão.
[0232] Em um outro aspecto, são fornecidos polipeptídeos PIP-72 quiméricos que são criados através da união de duas ou mais porções de genes de PIP-72, que codificaram originalmente proteínas de PIP-72 separadas, para criar um gene quimérico. A tradução do gene quimérico resulta em um único polipeptídeo PIP-72 quimérico com regiões, motivos ou domínios derivados de cada um dos polipeptídeos originais. Em certas modalidades, a proteína quimérica compreende porções, motivos ou domínios de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4), PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6) e PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8), PIP-72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Db (SEQ ID NO: 12), PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14), PIP- 72Fa (SEQ ID NO: 18), PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28) e PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32), PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927), PIP-72Bb (SEQ ID NO: 928), PIP-72Fh (SEQ ID NO: 932), PIP-72Fi (SEQ ID NO: 933), PIP-72Fj (SEQ ID NO: 934), PIP-72Fk (SEQ ID NO: 935), PIP-72Fl (SEQ ID NO: 936), PIP-72Gg (SEQ ID NO: 939), PIP-72Gh (SEQ ID NO: 940), PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941), PIP-72Gk (SEQ ID NO: 943), PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944), PIP-72Gm (SEQ ID NO: 945) ou PIP-72Gn (SEQ ID NO: 946) em qualquer combinação.
[0233] É reconhecido que sequências de DNA podem ser alteradas através de vários métodos e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes daquelas codificadas pela proteína pesticida selvagem (ou nativa). Em algumas modalidades, um polipeptídeo PIP-72 pode ser alterado de várias formas, incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de um ou mais aminoácidos, incluindo até 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou mais substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos ou suas combinações em comparação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946.
[0234] Os métodos para tais manipulações são de conhecimento geral na técnica. Por exemplo, variantes da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo PIP-72 podem ser preparadas por mutações no DNA. Isso pode ser feito por uma dentre várias formas de mutagênese e/ou em evolução dirigida. Em alguns aspectos, as alterações codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Essas variantes vão possuir a atividade pesticida desejada. Entretanto, entende-se que a capacidade de um polipeptídeo PIP-72 conferir atividade pesticida pode ser melhorada por meio do uso de tais técnicas mediante as composições desta revelação.
[0235] Por exemplo, substituições de aminoácido conservativas podem ser realizadas em um ou mais resíduos de aminoácido previstos e não essenciais. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado da sequência tipo selvagem de um polipeptídeo PIP-72 sem alterar a atividade biológica. Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido que possuem cadeias laterais similares foram definidas na técnica. aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina); cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico); resíduos polares e carregados negativamente e suas amidas (por exemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina; cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); resíduos polares, não polares ou ligeiramente polares alifáticos pequenos (por exemplo, alanina, serina, treonina, prolina, glicina); cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); resíduos alifáticos grandes e não polares (por exemplo, metionina, leucina, isoleucina, valina, cistina); cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina); cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina); cadeias laterais aromáticas grandes (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).
[0236] As substituições de aminoácido podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, essas substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácido conservados ou para resíduos de aminoácido contidos no interior de um motivo conservado, onde esses resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas às sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de homólogos). Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservativas, e ainda retêm atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas às sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento dos homólogos). Entretanto, o versado na técnica deve compreender que variantes funcionais podem ter alterações minoritárias conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados. Orientações sobre as substituições de aminoácido adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC), aqui incorporado por referência.
[0237] Ao fazer essas alterações, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático do aminoácido em conferir função biológica interativa em uma proteína é geralmente compreendida na técnica (Kyte and Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1):105- 32). Se aceita que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que, por sua vez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e similares.
[0238] É sabido na técnica que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou classificação hidropática similar e ainda resultam em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obtêm uma proteína biológica funcionalmente equivalente. A cada aminoácido atribuiu-se um índice hidropático com base na sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, ibid). Eles são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) e arginina (-4,5). Ao fazer tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +2, é preferencial os que estão dentro de +1, são particularmente preferenciais os que estão dentro de +0,5 e são ainda mais particularmente preferenciais.
[0239] Também é compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A patente US n° 4.554.101 estabelece que a maior capacidade hidrofílica média local de uma proteína, conforme regido pela capacidade hidrofílica de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com uma propriedade biológica da proteína.
[0240] Conforme detalhado na patente US n° 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácido: arginina (+3,0) lisina (+3,0); aspartato (+3,0,+0,1); glutamato (+3,0,+0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (0,4); prolina (-0,5,+0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).
[0241] Alternativamente, podem ser feitas alterações na sequência de proteína de muitas proteínas nas terminações amino ou carboxila sem afetar substancialmente a atividade. Isto pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, como PCR, inclusive amplificações de PCR que alteram ou estendem a sequência codificante da proteína em vista da inclusão de sequências codificantes de aminoácidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências codificantes de proteína inteiras, como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteína. Essas proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação da proteína, a detecção da proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica, (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína para uma organela subcelular, como o espaço periplasmático de bactérias gram-negativas, mitocôndrias ou cloroplastos de plantas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, a última destas frequentemente resulta em glicosilação da proteína.
[0242] As sequências de nucleotídeos e aminoácidos variantes da revelação também abrangem sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões de codificação de polipeptídeo PIP-72 diferentes podem ser usadas para criar um novo polipeptídeo PIP-72 que possui as propriedades desejadas. Dessa forma, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos com sequências relacionadas compreendendo regiões de sequência que possuem uma identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas homologamente in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando essa abordagem, motivos de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida e outros genes pesticidas conhecidos para se obter um novo gene que codifica uma proteína com uma propriedade melhorada de interesse, tal como atividade inseticida aumentada. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389- 391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; e Patentes US números 5.605.793 e 5.837.458.
[0243] O embaralhamento ou troca de domínio é um outro mecanismo para gerar polipeptídeos PIP-72 alterados. Os domínios podem ser trocados entre polipeptídeos PIP-72, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade inseticida ou espectro-alvo melhorado. Os métodos para gerar proteínas recombinantes e testá-las quanto à atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17.954 a 17.958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20.923 a 20.930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).
[0244] Tanto o embaralhamento de DNA quanto a mutagênese sítio- dirigida foram usados para definir sequências de polipeptídeos que têm atividade pesticida. Nos Exemplos 8 e 9, o embaralhamento de DNA foi usado para gerar uma biblioteca de variantes ativas por recombinação da diversidade presente em GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) e PIP-72Da (SEQ ID NO: 10). O versado na técnica será capaz de usar comparações a outras proteínas ou ensaios funcionais para definir ainda mais os motivos. A triagem com alto rendimento pode ser usada para testar variações destes motivos para determinar a função de resíduos específicos. Dado o conhecimento para vários motivos, pode-se, então, definir os requisitos para uma proteína funcional. O conhecimento dos motivos permite ao versado na técnica projetar variações de sequência que não afetariam a função.
[0245] O alinhamento de homólogos de PIP-72 (Figuras 1, 2, 3, 4 e 5) permitiu a identificação de resíduos que são altamente conservados entre homólogos nessa família (Figura 1). Nos exemplos 10 e 11, a mutagênese de saturação foi usada para fazer e testar substituições em posições de aminoácido selecionadas. Esses mutantes foram testados quanto à atividade e foram identificadas várias substituições ativas não presentes entre os homólogos, fornecendo um entendimento das restrições funcionais nesses resíduos.
[0246] Em algumas modalidades, são fornecidos polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos tendo ao menos 75%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948, em que o polipeptídeo tem atividade pesticida.
Composições
[0247] Também são abrangidas composições que compreendem um polipeptídeo PIP-72. Em algumas modalidades, a composição compreende um polipeptídeo PIP-72. Em algumas modalidades, a composição compreende uma proteína de fusão de PIP-72.
Anticorpos
[0248] Também são abrangidos os anticorpos para um polipeptídeo PIP-72 das modalidades ou para variantes ou fragmentos dos mesmos. Os anticorpos da descrição incluem anticorpos policlonais e monoclonais assim como seus fragmentos, os quais retêm sua capacidade de ligação às proteínas de PIP-72 encontradas no trato gastrointestinal de insetos. Um anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo é dito ser capaz de se ligar a uma molécula, se ela for capaz de reagir especificamente com a molécula para assim ligar a molécula ao anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo. O termo “anticorpo” (Ab) ou ”anticorpo monoclonal” (Mab) se destina a incluir moléculas intactas assim como fragmentos ou regiões de ligação ou domínios dos mesmos (como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab).sub.2) que são capazes de fazer ligação a um hapteno. Estes fragmentos são tipicamente produzidos por clivagem proteolítica, como papaína ou pepsina. Alternativamente, os fragmentos de ligação à hapteno podem ser produzidos através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante ou através de química sintética. Os métodos para a preparação dos anticorpos da presente descrição são de conhecimento geral na técnica. Por exemplo, consulte, Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow e David Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988), assim como as referências ali citadas. Trabalhos de referência padrão descrevendo os princípios gerais de imunologia incluem: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.Y. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y., EUA (1980) e Campbell, “Monoclonal Antibody Technology,” In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Burdon, et al., (eds.), Elsevier, Amsterdã (1984). Consulte também, as patentes US n°s 4.196.265; 4.609.893; 4.713.325; 4.714.681; 4.716.111; 4.716.117 e 4.720.459. Os anticorpos para o polipeptídeo PIP-72 ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, inclusive metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256:495. Outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais também podem ser empregadas, como por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema murino. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusão também são conhecidos. O anticorpo e anticorpos monoclonais da descrição podem ser preparados pelo uso de um polipeptídeo PIP- 72 como antígenos.
[0249] É fornecido um kit para detectar a presença de um polipeptídeo PIP-72 ou para detectar a presença de uma sequência de nucleotídeos, que codifica um polipeptídeo PIP-72 em uma amostra. Em uma modalidade, o kit fornece reagentes à base de anticorpo para detectar a presença de um polipeptídeo PIP-72 em uma amostra de tecido. Em outra modalidade, o kit fornece sondas de ácido nucleico marcadas úteis para detectar a presença de um ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídeo(s) PIP-72. O kit é fornecido juntamente com reagentes e controles adequados para executar um método de detecção, assim como instruções para uso do kit.
Identificação e isolamento do receptor
[0250] Também são abrangidos os receptores para um polipeptídeo PIP-72 das modalidades ou para variantes ou fragmentos dos mesmos. Métodos para identificar receptores são bem conhecidos na técnica (consulte, Hofmann, et. al., (1988) Eur. J. Biochem. 173:85 a 91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27277-27282) e podem ser empregados para identificar e isolar o receptor que reconhece os polipeptídeos PIP-72 usando as vesículas de membrana de borda em escova de insetos suscetíveis. Além do método de marcação radioativa mencionado nas literaturas citadas, o polipeptídeo PIP-72 pode ser identificado com corante fluorescente e outras marcações comuns como estreptavidina. As vesículas de membrana de borda em escova (BBMV) de insetos suscetíveis como lagarta falsa- medideira e percevejos podem ser preparadas de acordo com os protocolos mencionados nas referências e separadas em gel de SDS-PAGE e aplicadas para marcação em uma membrana adequada. Os polipeptídeos PIP-72 identificados podem ser incubados com a membrana transferida de BBMV e os polipeptídeos PIP-72 podem ser identificados com os repórteres marcados. A identificação de banda(s) de proteína que interagem com os polipeptídeos PIP-72 pode ser detectada por método de identificação de proteína à base de espectrometria de massa ou sequenciamento em fase gasosa de aminoácido N-terminal (Patterson, (1998) 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Uma vez que a proteína é identificada, o gene correspondente pode ser clonado a partir da biblioteca de cDNA ou DNA genômico dos insetos susceptíveis e a afinidade de ligação pode ser medida diretamente com os polipeptídeos PIP-72. A função do receptor para atividade inseticida pelos polipeptídeos PIP-72 pode ser verificada realizando-se o método de inativação de gene do tipo de RNAi (Rajagopal, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:46849-46851). Construtos de nucleotídeo, cassete de expressão e vetores
[0251] O uso do termo “construtos de nucleotídeo” na presente invenção não se destina a limitar as modalidades aos construtos de nucleotídeos que compreendem DNA. Os versados na técnica reconhecerão que os construtos de nucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos de ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, podem também ser empregados nos métodos apresentados na presente invenção. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos, e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem adicionalmente todas as formas complementares desses construtos, moléculas e sequências. Adicionalmente, os construtos de nucleotídeos, moléculas de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem todos os construtos de nucleotídeos, moléculas e sequência que podem ser empregadas nos métodos das modalidades para transformar plantas incluindo, mas não se limitando a aquelas que compreendem desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combinações dos mesmos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas de ocorrência natural quanto análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das modalidades também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeos incluindo, mas não se limitando a, formas de fita simples, formas de fita dupla, estruturas em grampo (hairpin), estruturas em haste-e-alça (stem-and-loop) e similares.
[0252] Uma modalidade adicional está relacionada a um organismo transformado, tal como um organismo selecionado a partir de células vegetais e de insetos, bactérias, leveduras, baculovírus, protozoários, nematódeos e algas. O organismo transformado compreende uma molécula de DNA das modalidades, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, que podem ser incorporados de maneira estável ao genoma do organismo transformado.
[0253] As sequências das modalidades são fornecidas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências reguladoras 5' e 3' ligadas funcionalmente a uma sequência das modalidades. O termo “ligado funcionalmente”, conforme usado na presente invenção, refere-se a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, sendo que a sequência do promotor inicia e serve de mediadora para a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Em geral, a expressão “ligado funcionalmente” significa que as sequências de ácidos nucleicos que estão sendo ligadas são contíguas e onde for necessário para unir duas regiões codificantes de proteína no mesmo quadro de leitura. O construto pode conter, adicionalmente, pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos construtos de DNA.
[0254] Em algumas modalidades, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PIP-72 das modalidades funcionalmente ligadas a uma sequência reguladora heteróloga.
[0255] Em algumas modalidades, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo ao menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948, ligado funcionalmante a um promotor, é construído.
[0256] Em algumas modalidades, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948, ligado funcionalmente a um promotor, é construído.
[0257] Esse construto de DNA é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência de gene de polipeptídeo PIP-72 para ser destinada a ficar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias. O construto de DNA pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis.
[0258] O construto de DNA incluirá geralmente na direção 5' a 3' de transcrição: uma região de iniciação transcricional e traducional (isto é, um promotor), uma sequência das modalidades, e uma região de terminação transcricional e traducional (isto é, região de terminação) funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação transcricional (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das modalidades. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. O termo “estranho” para uso na presente invenção indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Um promotor “estranho” ou “heterólogo” à sequência das modalidades indica que o promotor não é o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência ligada funcionalmente das modalidades. Para uso na presente invenção, um gene quimérico compreende uma sequência codificadora ligada funcionalmente a uma região de início de transcrição que é heteróloga à sequência codificadora. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência ligada funcionalmente é alterada da expressão de ocorrência natural, o que resulta em uma alteração no fenótipo.
[0259] Em algumas modalidades, o construto de DNA pode, também, incluir uma sequência intensificadora transcricional. Como usado aqui, o termo um “intensificador” se refere a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor, e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou especificidade de tecido de um promotor. Vários acentuadores são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, íntrons com propriedades acentuadoras da expressão gênica em plantas (publicação de pedido de patente US n° 2009/0144863, o íntron da ubiquitina (isto é, o íntron da ubiquitina do milho 1 (consulte, por exemplo, sequência NCBI S94464; Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689)), o acentuador ômega ou o acentuador ômega prime (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, New York) 237-256 e Gallie, et al., (1987) Gene 60:217-25), o acentuador 35S de CaMV (consulte, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:168596), o íntron AdhI do milho (Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40 a 48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357), os acentuadores da patente US n° 7.803.992 e o acentuador do vírus baciliforme da cana-de-açúcar (SCBV) de WO2013130813 também podem ser usados, cada um dos quais são incorporados por referência. A lista acima de intensificadores transcricionais não tem a intenção de ser limitadora. Qualquer intensificador transcricional adequado pode ser usado nas modalidades.
[0260] A região de terminação pode ser nativa à região de iniciação transcricional, pode ser nativa à sequência de DNA de interesse ligada funcionalmente, pode ser nativa à planta hospedeira ou pode ser derivada de uma outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de interesse, à planta hospedeira ou a qualquer combinação dos mesmos).
[0261] Regiões de terminação adequadas estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consulte também, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
[0262] Quando apropriado, o ácido nucleico pode ser otimizado para ter uma expressão aumentada no organismo hospedeiro. Dessa forma, quando o organismo hospedeiro é uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais de plantas para uma expressão melhorada. Consulte, por exemplo, Campbell and Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão do uso de códons preferenciais para o hospedeiro. Por exemplo, embora as sequências de ácidos nucleicos das modalidades possam ser expressas tanto em espécies de plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas para considerar as preferências de códon específicas e as preferências de conteúdo de GC de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, visto que foi demonstrado que essas preferências são diferenciadas (Murray) et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Dessa forma, o códon preferencial do milho para um aminoácido particular pode ser derivado de sequências de genes conhecidas do milho. O uso do códon de milho para 28 genes de plantas de milho é mostrado na Tabela 4 de Murray, et al., supra. Métodos para sintetizar genes preferenciais de plantas estão disponíveis na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes US n°s 5.380.831 e 5.436.391 e Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477498, e Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010, aqui incorporadas por referência. Uma Tabela de uso de códons de Zea maize também pode ser encontrada em kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, que pode ser acessado usando o prefixo “www”. A Tabela 2 mostra uma análise de códons de milho ótimos (adaptado de Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010).
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O uso de códons foi comparado usando o teste de contingência de qui -quadrado para identificar códons ótimos . Os códons que ocorrem significativamente mais frequentemente (P\0,01) são indicados com um asterisco.
[0263] Uma Tabela de uso de códons de Glycine max é mostrada na Tabela 3 e também pode ser encontrada em kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N, que pode ser acessado usando o prefixo “www”.
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[0264] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo PIP-72 tem códons otimizados para milho.
[0265] Modificações de sequência adicionais para intensificar a expressão gênica em um hospedeiro celular são conhecidas. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais espúrios de poliadenilação, sinais de sítio de splice éxon- íntron, repetições similares a transpóson, e outras sequências bem caracterizadas, que podem ser prejudiciais à expressão gênica. O conteúdo de GC da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. O termo “célula hospedeira” para uso na presente invenção, refere-se a uma célula que contém um vetor e destinada a suportar a replicação e/ou expressão do vetor de expressão. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coli, ou células eucarióticas, como células de leveduras, insetos, anfíbios, ou mamíferos ou células vegetais de monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de célula hospedeira de monocotiledônea é uma célula hospedeira do milho. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas secundárias de grampo de mRNA previstas.
[0266] Os cassetes de expressão podem, adicionalmente, conter sequências líder 5'. Essas sequências de iniciação podem atuar intensificando a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região 5' não-codificante de encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (vírus “Etch” do tabaco) (Gallie et al., (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (vírus do mosaico anão do milho), e proteína de ligação à cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al., (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al., (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), páginas 237-256) e líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382-385). Consulte também, Della- Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Esses construtos podem conter, também, uma “sequência sinal” ou “sequência líder” para facilitar o transporte cotraducional ou pós-traducional do peptídeo para certas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.
[0267] O termo “sequência de sinal”, como usado aqui, refere-se a uma sequência que sabidamente resulta, ou espera-se que resulte, em transporte de peptídeo cotraducional ou pós- traducional através da membrana celular. Em eucariotos, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. As toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas, que são ativadas proteoliticamente no trato gastrointestinal da praga alvo (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades, a sequência sinal está situada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das modalidades. O termo “sequência líder”, como usado aqui, refere-se a qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte cotraducional da cadeia de peptídeo para uma organela subcelular. Desta forma, isto inclui sequência líder que direcionam o transporte e/ou glicosilação pela passagem para o retículo endoplasmático, passagem para os vacúolos, plastídios, inclusive cloroplastos, mitocôndria, e similares. As proteínas codificadas no núcleo direcionadas para o compartimento do lúmen tilacoide do cloroplasto têm um peptídeo de trânsito bipartido característico composto de um peptídeo de sinal de direcionamento para o estroma e um peptídeo de sinal de direcionamento para o lúmen. As informações de direcionamento para o estroma estão na porção amino-proximal do peptídeo de trânsito. O peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen está na porção carbóxi-proximal do peptídeo de trânsito e contém todas as informações para o direcionamento para o lúmen. Pesquisas recentes em proteômica do cloroplasto de plantas superiores levaram à identificação de várias proteínas do lúmen codificadas de no núcleo (Kieselbach et al. FEBS LETT 480:271-276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319-341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350-356, 2001), cujo peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente descrição. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas homólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249-264, 2003. Em particular, a Tabela 2 desta publicação, que está incorporada nesta descrição por referência, revela 85 proteínas do lúmen de cloroplasto, identificadas por seu número de acesso (consulte também a publicação de pedido de patente US 2009/09044298). Além disso, a versão preliminar recentemente publicada do genoma do arroz (Goff et al, Science 296:92-100, 2002) é uma fonte adequada para o peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen, que pode ser usada de acordo com a presente descrição.
[0268] Peptídeos de trânsito de cloroplasto (CTP) adequados são bem conhecidos de um versado na técnica e incluem, também, CTPs quiméricos compreendendo, mas não se limitando a, um domínio N-terminal, um domínio central ou um domínio C- terminal de um CTP da 1-desóxi-D xilulose-5-fosfato sintase de Oryza sativa ou superóxido dismutase de Oryza sativa ou amido sintase solúvel de Oryza sativa ou enzima de ácido málico dependente de NADP de Oryza sativa ou fosfo-2-desidro-3- desóxi-heptonato aldolase 2 de Oryza sativa ou L-ascorbato peroxidase 5 de Oryza sativa ou fosfoglicano-água-diquinase de Oryza sativa, ssRUBISCO de Zea mays, beta-glicosidase de Zea mays, malato desidrogenase de Zea mays, tioredoxina tipo M de Zea mays (publicação de pedido de patente US 2012/0304336). Os peptídeos de trânsito de cloroplasto das publicações de patente US US20130205440A1, US20130205441A1 e US20130210114A1.
[0269] O gene do polipeptídeo PIP-72 a ser direcionado para o cloroplasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto para considerar diferenças no uso de códon entre o núcleo da planta e esta organela. Dessa forma, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais do cloroplasto. Consulte, por exemplo, a patente US n° 5.380.831, aqui incorporada por referência.
[0270] Ao preparar o cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme for adequado, na fase de leitura adequada. Para isso, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para esse propósito, podem estar envolvidos mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões.
[0271] Inúmeros promotores podem ser usados na prática das modalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais por tecido, induzíveis ou outros promotores para expressão no organismo hospedeiro. Os promotores da presente invenção incluem homólogos de elementos cis que sabidamente afetam a regulação gênica que mostra homologia com as sequências promotoras da presente invenção. Esses elementos cis incluem, mas não se limitam a, elementos cis responsivos ao oxigênio (Cowen et al., J Biol. Chem. 268(36):26904-26910 (1993)), elementos regulatórios de luz (Bruce and Quaill, Plant Cell 2 (11):1081-1089 (1990); Bruce et al., EMBO J. 10:3015-3024 (1991); Rocholl et al., Plant Sci. 97:189-198 (1994); Block et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5387-5391 (1990); Giuliano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7089-7093 (1988); Staiger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 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Chem. 271:32593-32598 (1996); Tjaden et al., Plant Cell 6:107-118 (1994); Tjaden et al., Plant Physiol. 108:1109-1117 (1995); Ngai et al., Plant J. 12:1021-1234 (1997); Bruce et al., EMBO J. 10:3015-3024 (1991); Ngai et al., Plant J. 12:1021-1034 (1997)), elementos responsivos à giberelina, (Muller et al., J. Plant Physiol. 145:606-613 (1995); Croissant et al., Plant Science 116:27-35 (1996); Lohmer et al., EMBO J. 10:617-624 (1991); Rogers et al., Plant Cell 4:1443-1451 (1992); Lanahan et al., Plant Cell 4:203-211 (1992); Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7266-7270 (1991); Gilmartin et al., Plant Cell 2:369-378 (1990); Huang et al., Plant Mol. Biol. 14:655-668 (1990), Gubler et al., Plant Cell 7:1879-1891 (1995)), elementos responsivos ao ácido abscísico (Busk et al., Plant Cell 9:22612270 (1997); Guiltinan et al., Science 250:267-270 (1990); Shen et al., Plant Cell 7:295-307 (1995); Shen et al., Plant Cell 8:1107-1119 (1996); Seo et al., Plant Mol. Biol. 27:1119-1131 (1995); Marcotte et al., Plant Cell 1:969-976 (1989); Shen et al., Plant Cell 7:295-307 (1995); Iwasaki et al., Mol Gen Genet 247:391-398 (1995); Hattori et al., Genes Dev. 6:609-618 (1992); Thomas et al., Plant Cell 5:1401-1410 (1993)), elementos similares aos elementos responsivos ao ácido abscísico (Ellerstrom et al., Plant Mol. Biol. 32:1019-1027 (1996)), elementos responsivos à auxina (Liu et al., Plant Cell 6:645-657 (1994); Liu et al., Plant Physiol. 115:397-407 (1997); Kosugi et al., Plant J. 7:877-886 (1995); Kosugi et al., Plant Cell 9:1607-1619 (1997); Ballas et al., J. Mol. Biol. 233:580-596 (1993)), um elemento cis responsivo ao tratamento com metil jasmonato (Beaudoin and Rothstein, Plant Mol. Biol. 33:835-846 (1997)), um elemento cis responsivo à resposta ao ácido abscísico e ao estresse (Straub et al., Plant Mol. Biol. 26:617630 (1994)), elementos cis responsivos ao etileno (Itzhaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8925-8929 (1994); Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5939-5943 (1993); Sessa et al., Plant Mol. Biol. 28:145-153 (1995); Shinshi et al., Plant Mol. Biol. 27:923-932 (1995)), elementos cis responsivos ao ácido salicílico (Strange et al., Plant J. 11:1315-1324 (1997); Qin et al., Plant Cell 6:863-874 (1994)), um elemento cis que responde ao estresse hídrico e ao ácido abscísico (Lam et al., J. Biol. Chem. 266:17131-17135 (1991); Thomas et al., Plant Cell 5:1401-1410 (1993); Pla et al., Plant Mol Biol 21:259-266 (1993)), um elemento cis essencial para a expressão específica da fase M (Ito et al., Plant Cell 10:331-341 (1998)), elementos responsivos à sacarose (Huang et al., Plant Mol. Biol. 14:655668 (1990); Hwang et al., Plant Mol Biol 36:331-341 (1998); Grierson et al., Plant J. 5:815-826 (1994)), elementos responsivos ao choque térmico (Pelham et al., Trends Genet. 1:31-35 (1985)), elementos responsivos à auxina e/ou ácido salicílico também relatados para regulação de luz (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7890-7897 (1989); Benfey et al., Science 250:959-966 (1990)), elementos responsivos ao etileno e ao ácido salicílico (Ohme-Takagi et al., Plant Mol. Biol. 15:941-946 (1990)), elementos responsivos ao estresse por feridas e abiótico (Loake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9230-9234 (1992); Mhiri et al., Plant Mol. Biol. 33:257-266 (1997)), elementos responsivos antioxidantes (Rushmore et al., J. Biol. Chem. 266:11632-11639; Dalton et al., Nucleic Acids Res. 22:5016-5023 (1994)), elementos Sph (Suzuki et al., Plant Cell 9:799-807 1997)), elementos responsivos a elicitor (Fukuda et al., Plant Mol. Biol. 34:81-87 (1997); Rushton et al., EMBO J. 15:5690-5700 (1996)), elementos responsivos a metal (Stuart et al., Nature 317:828-831 (1985); Westin et al., EMBO J. 7:3763-3770 (1988); Thiele et al., Nucleic Acids Res. 20:11831191 (1992); Faisst et al., Nucleic Acids Res. 20:3-26 (1992)), elementos responsivos à baixa temperatura (Baker et al., Plant Mol. Biol. 24:701-713 (1994); Jiang et al., Plant Mol. Biol. 30:679-684 (1996); Nordin et al., Plant Mol. Biol. 21:641-653 (1993); Zhou et al., J. Biol. Chem. 267:23515-23519 (1992)), elementos responsivos à seca (Yamaguchi et al., Plant Cell 6:251-264 (1994); Wang et al., Plant Mol. Biol. 28:605-617 (1995); Bray EA, Trends in Plant Science 2:48-54 (1997)) elementos acentuadores da gluteína (Colot et al., EMBO J. 6:3559-3564 (1987); Thomas et al., Plant Cell 2:1171-1180 (1990); Kreis et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond., B314:355-365 (1986)), elementos reguladores independentes de luz (Lagrange et al., Plant Cell 9:1469-1479 (1997); Villain et al., J. Biol. Chem. 271:32593-32598 (1996)), elementos acentuadores de OCS (Bouchez et al., EMBO J. 8:4197-4204 (1989); Foley et al., Plant J. 3:669-679 (1993)), elementos ACGT (Foster et al., FASEB J. 8:192-200 (1994); Izawa et al., Plant Cell 6:1277-1287 (1994); Izawa et al., J. Mol. Biol. 230:1131-1144 (1993)), elementos cis negativos em genes relacionados de plastídio (Zhou et al., J. Biol. Chem. 267:23515-23519 (1992); Lagrange et al., Mol. Cell Biol. 13:2614-2622 (1993); Lagrange et al., Plant Cell 9:14691479 (1997); Zhou et al., J. Biol. Chem. 267:23515-23519 (1992)), elementos da "box" (caixa) prolamina (Forde et al., Nucleic Acids Res. 13:7327-7339 (1985); Colot et al., EMBO J. 6:3559-3564 (1987); Thomas et al., Plant Cell 2:1171-1180 (1990); Thompson et al., Plant Mol. Biol. 15:755-764 (1990); Vicente et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7685-7690 (1997)), elementos em acentuadores do gene da cadeia pesada da IgM (Gillies et al., Cell 33:717-728 (1983); Whittier et al., Nucleic Acids Res. 15:2515-2535 (1987)). Exemplos de promotores incluem aqueles descritos na patente US n° 6.437.217 (promotor RS81 do milho), na patente US n° 5.641.876 (promotor da actina do arroz), na patente US n° 6.426.446 (promotor RS324 do milho), na patente US n° 6.429.362 (promotor PR-1 do milho), na patente US n° 6.232.526 (promotor A3 do milho), na patente US n° 6.177.611 (promotores constitutivos do milho), na patente US n° 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), na patente US n° 6.433.252 (promotor da oleosina L3 do milho, P- Zm.L3), na patente US n° 6.429.357 (promotor da actina do arroz 2 assim como um íntron da actina 2), na patente US n° 5.837.848 (promotor específico da raiz), na patente US n° 6.294.714 (promotores induzíveis por luz), na patente US n° 6.140.078 (promotores induzíveis por sal), na patente US n° 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno), na patente US n° 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência ao fósforo), na patente US n° 6.635.806 (promotor gama coixina, P-Cl.Gcx), pedido de patente US n° de série 09/757.089 (promotor da aldolase do cloroplasto) e patente US n° 8.772.466 (fator nuclear da transcrição do milho B (NFB2)).
[0272] Promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no documento WO 1999/43838 e na patente US n° 6.072.050; o promotor 35S de CaMV nuclear (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2 :163-171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotor ALS (Patente US n° 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes US números 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611. Promotores constitutivos adequados também incluem promotores que têm expressão forte em quase todos os tecidos, mas têm baixa expressão em pólen, incluindo, mas não se limitando a, promotores do vírus das estrias da bananeira (Acuminata Yunnan) (BSV(AY)) revelados na patente US 8.338.662; promotores do vírus das estrias da bananeira (Acuminata Yunnan) (BSV(AY)) revelados na patente US 8.350.121; promotores do vírus das estrias da bananeira (Acuminata Yunnan) (BSV(AY)) revelados na patente US 8.395.022.
[0273] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível. De interesse particular para a regulação da expressão das sequências de nucleotídeos das modalidades em planta são os promotores induzíveis por lesão. Esses promotores induzíveis por lesão podem responder aos danos causado pela alimentação de insetos, e incluem o inibidor da proteinase da batata, gene (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425 a 449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 e wun2, patente US n° 5.428.148; win1 e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783 a 792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok et al., (1994) Plant J. 6(2):141-150) e similares, aqui incorporados por referência.
[0274] Adicionalmente, os promotores induzidos por patógenos podem ser empregados nos métodos e construtos de nucleotídeos das modalidades. Esses promotores induzidos por patógenos incluem aqueles de proteínas relacionadas a patogênese (proteína PR), que são induzidos após a infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3- glucanase, quitinase, etc. Consulte, por exemplo, Redolfi et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245 a 254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645 a 656 and Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Consulte também, WO 1999/43819, aqui incorporado por referência.
[0275] São promotores de interesse aqueles expressos localmente no, ou próximo ao sítio de infecção por patógeno. Consulte, por exemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular PlantMicrobe Interactions 2:325-331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Consulte também, Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961-968; patente US número 5.750.386 (induzível em nematódeo) e as referências ali citadas. De interesse particular é o promotor induzível para o gene PRms de milho, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consulte, por exemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).
[0276] Promotores regulados quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível quimicamente, em que a aplicação da substância química induz expressão gênica, ou um promotor reprimível quimicamente, em que a aplicação da substância química reprime uma expressão gênica. Promotores induzíveis quimicamente são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, promotor In2-2 no milho, que é ativado por protetores (safeners) de herbicidas compostos por benzenossulfonamida, o promotor GST no milho, que é ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados quimicamente de interesse incluem promotores responsivos a esteroides (ver, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 e McNellis, et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257) e os promotores induzíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 e patentes US n°s 5.814.618 e 5.789.156), aqui incorporadas por referência.
[0277] Os promotores preferenciais por tecido podem ser utilizados para direcionar expressão intensificada do polipeptídeo PIP-72 dentro de um tecido de planta particular. Os promotores preferenciais por tecido incluem aqueles discutidos em Yamamoto et al., (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para uma expressão fraca.
[0278] Promotores com preferência por folha são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357 a 67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773- 778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 e Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
[0279] Os promotores preferencias por raiz ou específicos de raiz são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo a partir de várias espécies compatíveis. Consulte, por exemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene glutamina sintetase específico de raiz de feijão-soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 de feijão); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de raiz no gene da manopina-sintetase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clone de cDNA completo que codifica a glutamina sintetase citossólica (GS), que é expressa em raízes e nódulos de raízes de soja). Consulte também Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633-641, onde dois promotores específicos de raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa fixadora de nitrogênio Parasponia andersonii e da não leguminosa não fixadora de nitrogênio relacionada Trema tomentosa são descritos. Os promotores desses genes foram ligados a um gene repórter da β-glucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na leguminosa Lotus corniculatus e, em ambos os exemplos, a atividade do promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem suas análises dos promotores dos genes indutores de raiz altamente expressos rolC e rolD de Agrobacterium rhizogenes (consulte Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Eles concluíram que o intensificador e os determinantes do DNA com preferência por tecido são dissociados naqueles promotores. Teeri, et al., (1989) usaram fusão de genes com lacZ para demonstrar que o gene T-DNA de Agrobacterium que codifica a octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz, e que o gene TR2' é específico para raiz na planta intacta e estimulado por lesões no tecido foliar, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene de ação inseticida ou larvicida (consulte EMBO J. 8(2):343-350). O gene TR1', fundido a nptII (neomicina fosfotransferase II) apresentou características similares. Promotores adicionais preferenciais de raiz incluem o promotor do gene VfENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772) e o promotor rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Consulte também, as patentes US n°s 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 e 5.023.179. As sequências reguladoras preferenciais de raiz de Arabidopsis thaliana são apresentadas no pedido de patente US20130117883. Os promotores preferenciais para raiz de sorgo (Sorghum bicolor) RCc3 são revelados no pedido de patente US20120210463. Os promotores preferenciais para raiz de milho da publicação de pedido de patente 20030131377, patente US n° 7.645.919 e 8.735.655. Os promotores específicos para a ponta da raiz 1 de milho (ZmRCP1) da publicação do pedido de patente US 20130025000. Os promotores específicos para a ponta da raiz de milho da publicação do pedido de patente US 20130312136.
[0280] Os promotores “com preferência por sementes” incluem os promotores “específicos de semente” (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento da semente como os promotores de proteínas de armazenamento na semente) bem como os promotores de “germinação de sementes” (aqueles promotores ativos durante a germinação de sementes). Consulte, Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, aqui incorporado por referência. Esses promotores preferenciais por sementes incluem, mas não se limitam a, Cim1 (mensagem induzida por citocinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDA do milho); e milps (mio-inositol-1-fosfato sintase) (consulte a patente US n° 6.225.529, aqui incorporada por referência). Gamma-zeína e Glb-1 são promotores específicos de endosperma. Para dicotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas não se limitam a inibidor de tripsina de Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku e Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1079-1093),β-faseolina de feijão soja, napina, β- conglicinina, glicinina 1, lectina de feijão soja, cruciferina, e similares. Para monocotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas não se limitam a, zeína de 15 kDa do milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gama-zeína, ceráceo, shrunken 1, shrunken 2, Globulina 1, etc. Consulte também WO 2000/12733, em que os promotores preferenciais em sementes dos genes end1 and end2 são apresentados; aqui incorporadas por referência. Em dicotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas não se limitam ao promotor de revestimento das sementes de Arabidopsis, pBAN; e os promotores de semente precoces de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (patentes US n°s 7.294.760 e 7.847.153). Um promotor que tem uma expressão “preferencial” em um tecido particular é expressado nesse tecido em um grau maior do que em ao menos um outro tecido vegetal. Alguns promotores preferencias de tecido mostram expressão quase exclusivamente no tecido particular.
[0281] Quando um baixo nível de expressão é desejado, promotores fracos serão usados. Em geral, o termo “promotor fraco”, conforme usado na presente invenção, refere-se a um promotor que dirige a expressão de uma sequência codificadora em um nível baixo. Pela expressão em nível baixo, entende-se níveis de cerca de 1/1000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos a cerca de 1/500.000 transcritos. Alternativamente, é reconhecido que o termo “promotores fracos” também abrange promotores que dirigem a expressão em apenas umas poucas células e não em outras para conferir um nível total baixo de expressão. Quando um promotor dirige a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência de promotor podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.
[0282] Esses promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor mínimo do promotor Rsyn7 (WO 1999/43838 e patente US número 6.072.050), o promotor mínimo 35S de CaMV, e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles apresentados nas patentes US n°s 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611, aqui incorporados por referência.
[0283] A lista de promotores acima não tem a intenção de ser limitadora. Qualquer promotor adequado pode ser usado nas modalidades.
[0284] Em geral, o cassete de expressão poderá também compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam para resistência a antibióticos, como aqueles que codificam para a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como o glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenaxiacetato (2,4-D). Exemplos adicionais de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não se limitam aos genes que codificam resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209-213 e Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinila (Stalker, et al., (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478-481 e pedido de patente US n°s seriais 10/004.357 e 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Consulte, em geral, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech., 3:506-511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980) em The Operon, páginas 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-483; Gossen, (1993) Tese de doutorado, Universidade de Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3.343 a 3.356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4.647 a 4.653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143 a 162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1.591 a 1.595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin, (1993) Tese de doutorado, Universidade de Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin) e Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724. Essas revelações estão aqui incorporadas por referência.
[0285] A lista de genes marcadores selecionáveis acima não se destina a ser limitadora. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado nas modalidades.
Transformação de planta
[0286] Os métodos das modalidades envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. “Introdução”, como usado aqui, significa apresentação à planta do polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal modo que a sequência tem acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das modalidades não dependem de um método específico para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeos ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária e métodos mediados por vírus.
[0287] “Transformação estável” como usado aqui, significa que o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pela sua progênie. “Transformação temporária”, como usado aqui, significa que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou que um polipeptídeo é introduzido em uma planta. O termo “planta”, como usado aqui, refere-se a plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de planta, propágulos, embriões e progênie da mesma. Células de planta podem ser diferenciadas ou indiferenciadas (por exemplo, calo, células em cultura em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen).
[0288] Os protocolos para transformação, bem como os protocolos para introdução de sequências de nucleotídeo em plantas, podem variar conforme o tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, que se pretende transformar. Os métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de plantas e a inserção subsequente no genoma de planta inclui microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium (Patentes US n°s 5.563.055 e 5.981.840), transferência direta de genes (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) e aceleração balística de partículas (consulte, por exemplo, as patentes US n°s 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244 e 5.932.782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips, (Springer-Verlag, Berlin) e McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926) e transformação de Lecl (WO 00/28058). Para a transformação da batata, consulte, Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:7178. Procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (feijão-soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (feijão-soja); Finer and McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P, 175 a 182 (feijão-soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. volume 96, páginas 319 a 324 (feijão-soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (milho); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); Patentes US números 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (London) 311:763-764; patente US n° 5.736.369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, New York), páginas 197-209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por microfibras); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou and Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais estão aqui incorporados por referência.
[0289] Em modalidades específicas, as sequências das modalidades podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos para transformação temporária. Tais métodos de transformação temporária incluem, mas não se limitam à introdução do polipeptídeo PIP-72 ou variantes e fragmentos dos mesmos diretamente na planta ou a introdução de um transcrito de polipeptídeo PIP-72 na planta. Esses métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Consulte, por exemplo, Crossway et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179 a 185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53 a 58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176-2180 and Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todos os quais estão aqui incorporados por referência. Alternativamente, o polinucleotídeo de polipeptídeo PIP-72 pode ser transformado na planta de forma transitória com o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Essas técnicas incluem um sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de forma a impossibilitar a liberação subsequente do DNA. Dessa forma, a transcrição a partir do DNA ligado a partícula pode ocorrer, mas a frequência com a qual o mesmo é liberado para integrar-se ao genoma é grandemente reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143).
[0290] Métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em um local específico no genoma da planta são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é obtida usando um sistema de recombinação sítio específico. Consulte, por exemplo, os documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853, todos os quais estão aqui incorporados por referência. Brevemente, o polinucleotídeo das modalidades pode estar contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O cassete de transferência introduzido em uma planta tem, incorporado de maneira estável a seu genoma, um sítio-alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos, os quais correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase adequada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao sítio-alvo. O polinucleotídeo de interesse é, portanto, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.
[0291] Os vetores de transformação de planta podem ser compreendidos por um ou mais vetores de DNA necessários para se obter a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de planta que são compostos de mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são frequentemente chamados na técnica de “vetores binários”. Os vetores binários, assim como vetores com plasmídios auxiliares, são mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para se obter a transformação eficiente são muito grandes, e é vantajoso separar as funções em moléculas de DNA separadas. Os vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmidial que contém as sequências cis-atuantes necessárias para a transferência de T-DNA (como a borda esquerda e a borda direita), um marcador selecionável que é manipulado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal, e um “gene de interesse” (um gene manipulado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor plasmidial as sequências necessárias para replicação bacteriana. As sequências cis-atuantes são dispostas de modo a permitir transferência eficiente para as células de planta e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida estão localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor plasmidial contém os fatores trans-atuantes que fazem a mediação da transferência do T-DNA do Agrobacterium para células de planta. Esse plasmídio contém, frequentemente, as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção das células vegetais pelo Agrobacterium, e a transferência de DNA por clivagem nas sequências de borda e transferência de DNA mediada por vir, tal como é entendido na técnica (Hellens and Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usadas para transformação de planta. O segundo vetor plasmidial não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.
[0292] Em geral, os métodos de transformação de planta envolvem transferir DNA heterólogo para células vegetais alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo indiferenciado, protoplastos, etc.), seguido de aplicação de um nível limite máximo de seleção adequada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células vegetais transformadas a partir de um grupo de massas celulares não transformadas. Após a integração do DNA estranho heterólogo nas células vegetais, aplica-se então um nível limite máximo de seleção adequada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células supostamente transformadas que sobrevivem a esse tratamento de seleção pela transferência regular para um meio novo. Mediante passagem contínua e desafio com a seleção adequada, as células transformadas com o vetor plasmidial são identificadas e proliferadas. Métodos moleculares e bioquímicos podem então ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo de interesse integrado ao genoma da planta transgênica.
[0293] Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento novo do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após serem colocadas em meio de regeneração suplementado com um nível limite máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar o broto ou plântula enraizados. A plântula transgênica então cresce como uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento novo do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni and Jauhar, (1997) Maydica 42:107 a 120. Uma vez que o material transformado contém muitas células; tanto células transformadas quanto não-transformadas estão presentes em qualquer pedaço do calo alvo ou tecido ou grupo de células em questão. A capacidade de matar as células não-transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade de remover células não- transformadas é uma limitação para a rápida recuperação das células vegetais transformadas e geração bem- sucedida de plantas transgênicas.
[0294] As células que foram transformadas podem ser cultivadas para se tornarem plantas de acordo com maneiras convencionais. Consulte, por exemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas, sejam polinizadas com a mesma linhagem transformada ou com linhagens diferentes, e o híbrido resultante tem expressão constitutiva ou induzida da característica fenotípica desejada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de maneira estável e herdada e, então, as sementes são coletadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada.
[0295] As sequências de nucleotídeos das modalidades podem ser fornecidas à planta colocando a planta em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Em geral, esses métodos envolvem a incorporação de um construto de nucleotídeo de interesse em uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que as proteínas recombinantes das modalidades podem ser sintetizadas inicialmente como parte de uma poliproteína viral, que pode ser posteriormente processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir o polipeptídeo PIP-72 desejado. Também é reconhecido que essa poliproteína viral, que compreende pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo PIP-72 das modalidades, pode ter a atividade pesticida desejada. Essas poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeos que as codificam são abrangidas pelas modalidades. Métodos para suprir plantas com construtos de nucleotídeos e produzir as proteínas codificadas nas plantas, que envolvem moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, patentes US n°s 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367 e 5.316.931; aqui incorporadas por referência.
[0296] Os métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Svab, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga, (1993) EMBO J. 12:601-606. O método tem por base a aplicação por uma pistola de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma do plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação do plastídeo pode ser executada pela transativação de um transgene silencioso gerado no plastídio por expressão preferencial por tecido de uma RNA polimerase codificada no núcleo e direcionada ao plastídio. Este sistema foi relatado em McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
[0297] As modalidades se referem adicionalmente a um material de propagação vegetal de uma planta transformada das modalidades incluindo, mas não se limitando a, sementes, tubérculos, cormos, bulbos, folhas e mudas de raízes e brotos.
[0298] As modalidades podem ser usadas para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a monocotiledôneas e a dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não se limitam a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), em particular as espécies de Brassica úteis como fontes de óleo, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, mexoeira (Pennisetum glaucum), painço (Panicum miliaceum), painço-da-Itália (Setaria italica), capim-pé-de- galinha (Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana- de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, legumes, ornamentais e coníferas.
[0299] Os vegetais comestíveis incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagem (Phaseolus vulgaris), feijão-de-lima (Phaseolus limensis), ervilha (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), melão cantalupe (C. cantalupensis) e melão almiscarado (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. Coníferas que podem ser empregadas na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros como pinheiro-taeda (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro-ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro-torto (Pinus contorta) e pinheiro monterey (Pinus radiata); Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); pinheiro-do-canadá (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); sequoia canadense (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros como abeto prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). As plantas das modalidades incluem plantas cultivadas (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, feijão-soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc., como plantas de milho e feijão-soja).
[0300] As gramíneas incluem, mas não se limitam a: annual bluegrass (Poa annua); azevem (Lolium multiflorum); poa-do- Canadá (Poa compressa); festuca Vermelha (Festuca rubra); agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); trigo-grama encrespado (Agropyron desertorum); trigo-grama aberto (Agropyron cristatum); festuca dura (Festuca longifolia); capim do campo (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata); azevem perene (Lolium perenne); festuca vermelha (Festuca rubra); grama gigante (Agrostis alba); poa comum (Poa trivialis); festuca ovelha (Festuca ovina); cevadinha (Bromus inermis); festuca (Festuca arundinacea); capim-timóteo (Phleum pratense); grama velvet (Agrostis canina); grama-chorão (Puccinellia distans); trigo-grama ocidental (Agropyron smithii); capim-bermuda (Cynodon spp.); grama-de-santo-agostinho (Stenotaphrum secundatum); grama- esmeralda (Zoysia spp.); grama-forquilha (Paspalum notatum); grama-carpete (Axonopus affinis); grama centopéia (Eremochloa ophiuroides); grama kikuio (Pennisetum clandesinum); grama- rasteira-da-praia (Paspalum vaginatum); grama blue (Bouteloua gracilis); grama buffalo (Buchloe dactyloids); grama aveia (Bouteloua curtipendula).
[0301] Outras plantas de interesse incluem plantas de cereais que fornecem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de cereais, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, painço, etc. Plantas de sementes oleaginosas incluem algodão, feijão-soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, linho, rícino, oliva, et. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, alfarrobeira, feno-grego, feijão-soja, feijões de jardim, feijão-caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão fava, lentilhas, grão-de-bico etc.
Avaliação da transformação das plantas
[0302] Após a introdução do DNA estranho heterólogo nas células vegetais, a transformação ou integração do gene heterólogo ao genoma da planta é confirmada por vários métodos, como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.
[0303] A análise por PCR é um método rápido para triar células, tecidos ou brotos transformados quanto a presença de gene incorporado no estágio precoce anterior ao transplante para o solo (Sambrook and Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA). A reação de PCR é executada usando-se iniciadores de oligonucleotídicos específicos para o gene de interesse ou plano de fundo do vetor de Agrobacterium, etc.
[0304] A transformação da planta pode ser confirmada por análise de Southern blot do DNA genômico (Sambrook e Russell, (2001) supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição adequadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A membrana ou “blot” é então hibridizada, por exemplo, com o fragmento de DNA alvo radiomarcado com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta, de acordo com técnicas-padrão (Sambrook e Russell, (2001) supra).
[0305] Na análise de Northern Blot, o RNA é isolado de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose e formaldeído, e aplicado sobre um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrão que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra). A expressão do RNA codificado pelo gene pesticida é então testada mediante hibridização do filtro com uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida, com o uso de métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra).
[0306] Os ensaios bioquímicos por Western blot e similares podem ser executados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) com o uso de anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes no polipeptídeo PIP-72. Empilhamento de traços na planta transgênica
[0307] As plantas transgênicas podem compreender uma pilha de um ou mais polinucleotídeos inseticidas aqui apresentados com um ou mais polinucleotídeos adicionais resultando na produção ou supressão de múltiplas sequências de polipeptídeos. As plantas transgênicas compreendendo pilhas de sequências de polinucleotídeos podem ser obtidas por métodos de reprodução tradicionais ou através de métodos de engenharia genética. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, melhoramento de linhagens individuais, cada uma compreendendo um polinucleotídeo de interesse, transformação de uma planta transgênica compreendendo um gene aqui apresentado com um gene subsequente e cotransformação de genes em uma única célula vegetal. Como usado aqui, o termo “empilhado” inclui ter múltiplos traços presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado no genoma nuclear e um traço é incorporado no genoma de um plastídio ou ambos os traços são incorporados no genoma de um plastídio). Em um exemplo não-limitador, os “traços empilhados” compreendem uma pilha molecular onde as sequências estão fisicamente adjacentes umas às outras. Um traço, como usado aqui, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. A cotransformação de genes pode ser executada usando vetores de transformação únicos compreendendo múltiplos genes ou genes carregados separadamente em múltiplos vetores. Caso as sequências sejam empilhadas por transformação genética das plantas, as sequências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado por qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação de traços desejados na planta. É reconhecido ainda que as sequências de polinucleotídeos podem ser empilhadas em um local genômico desejado com o uso de um sistema de recombinação sítio-específico. Consulte, por exemplo, os documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853, todos os quais estão aqui incorporados por referência.
[0308] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos PIP-72 revelados no presente documento, sozinhos ou empilhados, com uma ou mais traços adicionais de resistência a inseto podem ser empilhados com uma ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência à herbicida, resistência fúngica, resistência a vírus ou tolerância ao estresse, resistência à doença, esterilidade masculina, resistência do caule, e similares) ou traços de saída (por exemplo, produtividade aumentada, amidos modificados, perfil de óleo aprimorado, aminoácidos balanceados, alto teor de lisina ou metionina, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra melhorada, resistência à secura, e similares). Desta forma, as modalidades de polinucleotídeos podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade melhorada de cultura com a capacidade de controlar de forma flexível e econômica qualquer quantidade de pragas agrícolas.
[0309] Os transgenes úteis para empilhamento incluem, mas não se limitam a: 1. Transgenes que conferem resistência a insetos ou doenças e que codificam: (A) Genes de resistência a doenças da planta. As defesas da planta são frequentemente ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para modificação de plantas que são resistentes a cepas específicas de patógeno. Consulte, por exemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonagem do gene Cf-9 de tomate para resistência à Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (o gene Pto de tomate para resistência à Pseudomonas syringae pv. tomate codifica uma proteína quinase); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 de Arabidopsis para resistência à Pseudomonas syringae), McDowell and Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178-83 e Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6):567- 82. Uma planta resistente a uma doença é aquela que é mais resistente a um patógeno, em comparação à planta de tipo selvagem. (B) Genes que codificam uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado sobre ela. Consulte, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que revela a clonagem e a sequência de nucleotídeos do gene da delta-endotoxina de Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes da delta- endotoxina podem ser adquiridas junto à American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA), por exemplo, com os números de acesso ATCC® 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitadores de transgenes de Bacillus thuringiensis sendo geneticamente manipulados são dados nas seguintes patentes e pedidos de patente e estão aqui incorporados por referência para este propósito: Patentes US números 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; 5.986.177; 6.023.013, 6.060.594, 6.063.597, 6.077.824, 6.620.988, 6.642.030, 6.713.259, 6.893.826, 7.105.332; 7,179,965, 7,208,474; 7.227.056, 7.288.643, 7.323.556, 7.329.736, 7.449.552, 7.468.278, 7.510.878, 7.521.235, 7.544.862, 7.605.304, 7.696.412, 7.629.504, 7.705.216, 7.772.465, 7.790.846, 7.858.849 e WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 e WO 1997/40162.
[0310] Genes codificando proteínas pesticidas também podem ser empilhados, incluindo, mas não se limitando a, proteínas inseticidas de Pseudomonas sp. como PSEEN3174 (Monalisina, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de Pseudomonas protegens cepa CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386: n° de acesso do GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343-12349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 and Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069), patente US n° 6.048.838, e patente US n° 6.379.946; um polipeptídeo PIP-1 de número de série US 13792861; um polipeptídeo AfIP-1A e/ou AfIP-1B de número de série US 13/800233; um polipeptídeo PHI-4 de número de série US 13/839702; polipeptídeos PIP-47 de número de série US 61/866747; proteínas inseticidas de número de série US n° 61/863761 e 61/863763; e δ-endotoxinas incluindo, mas não se limitando a, as classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51, Cry52, Cry 53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 e Cry71 dos genes da δ-endotoxina e dos genes citolíticos Cyt1 e Cyt2 de B. thuringiensis. Membros destas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, mas não se limitam a, Cry1Aa1 (n° de acesso AAA22353); Cry1Aa2 (n° de acesso AAA22552); Cry1Aa3 (n° de acesso BAA00257); Cry1Aa4 (n° de acesso CAA31886); Cry1Aa5 (n° de acesso BAA04468); Cry1Aa6 (n° de acesso AAA86265); Cry1Aa7 (n° de acesso AAD46139); Cry1Aa8 (n° de acesso I26149); Cry1Aa9 (n° de acesso BAA77213); Cry1Aa10 (n° de acesso AAD55382); Cry1Aa11 (n° de acesso CAA70856); Cry1Aa12 (n° de acesso AAP80146); Cry1Aa13 (n° de acesso AAM44305); Cry1Aa14 (n° de acesso AAP40639); Cry1Aa15 (n° de acesso AAY66993); Cry1Aa16 (n° de acesso HQ439776); Cry1Aa17 (n° de acesso HQ439788); Cry1Aa18 (n° de acesso HQ439790); Cry1Aa19 (n° de acesso HQ685121); Cry1Aa20 (n° de acesso JF340156); Cry1Aa21 (n° de acesso JN651496); Cry1Aa22 (n° de acesso KC158223); Cry1Ab1 (n° de acesso AAA22330); Cry1Ab2 (n° de acesso AAA22613); Cry1Ab3 (n° de acesso AAA22561); Cry1Ab4 (n° de acesso BAA00071); Cry1Ab5 (n° de acesso CAA28405); Cry1Ab6 (n° de acesso AAA22420); Cry1Ab7 (n° de acesso CAA31620); Cry1Ab8 (n° de acesso AAA22551); Cry1Ab9 (n° de acesso CAA38701); Cry1Ab10 (n° de acesso A29125); Cry1Ab11 (n° de acesso I12419); Cry1Ab12 (n° de acesso AAC64003); Cry1Ab13 (n° de acesso AAN76494); Cry1Ab14 (n° de acesso AAG16877); Cry1Ab15 (n° de acesso AAO13302); Cry1Ab16 (n° de acesso AAK55546); Cry1Ab17 (n° de acesso AAT46415); Cry1Ab18 (n° de acesso AAQ88259); Cry1Ab19 (n° de acesso AAW31761); Cry1Ab20 (n° de acesso ABB72460); Cry1Ab21 (n° de acesso ABS18384); Cry1Ab22 (n° de acesso ABW87320); Cry1Ab23 (n° de acesso HQ439777); Cry1Ab24 (n° de acesso HQ439778); Cry1Ab25 (n° de acesso HQ685122); Cry1Ab26 (n° de acesso HQ847729); Cry1Ab27 (n° de acesso JN135249); Cry1Ab28 (n° de acesso JN135250); Cry1Ab29 (n° de acesso JN135251); Cry1Ab30 (n° de acesso JN135252); Cry1Ab31 (n° de acesso JN135253); Cry1Ab32 (n° de acesso JN135254); Cry1Ab33 (n° de acesso AAS93798); Cry1Ab34 (n° de acesso KC156668); semelhante à Cry1Ab (n° de acesso AAK14336); semelhante à Cry1Ab (n° de acesso AAK14337); semelhante à Cry1Ab (n° de acesso AAK14338); semelhante à Cry1Ab (n° de acesso ABG88858); Cry1Ac1 (n° de acesso AAA22331); Cry1Ac2 (n° de acesso AAA22338); Cry1Ac3 (n° de acesso CAA38098); Cry1Ac4 (n° de acesso AAA73077); Cry1Ac5 (n° de acesso AAA22339); Cry1Ac6 (n° de acesso AAA86266); Cry1Ac7 (n° de acesso AAB46989); Cry1Ac8 (n° de acesso AAC44841); Cry1Ac9 (n° de acesso AAB49768); Cry1Ac10 (n° de acesso CAA05505); Cry1Ac11 (n° de acesso CAA10270); Cry1Ac12 (n° de acesso I12418); Cry1Ac13 (n° de acesso AAD38701); Cry1Ac14 (n° de acesso AAQ06607); Cry1Ac15 (n° de acesso AAN07788); Cry1Ac16 (n° de acesso AAU87037); Cry1Ac17 (n° de acesso AAX18704); Cry1Ac18 (n° de acesso AAY88347); Cry1Ac19 (n° de acesso ABD37053); Cry1Ac20 (n° de acesso ABB89046); Cry1Ac21 (n° de acesso AAY66992); Cry1Ac22 (n° de acesso ABZ01836); Cry1Ac23 (n° de acesso CAQ30431); Cry1Ac24 (n° de acesso ABL01535); Cry1Ac25 (n° de acesso FJ513324); Cry1Ac26 (n° de acesso FJ617446); 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Cry40Ca1 (n° de acesso EU381045); Cry40Da1 (n° de acesso ACF15199); Cry41Aa1 (n° de acesso BAD35157); Cry41Ab1 (n° de acesso BAD35163); Cry41Ba1 (n° de acesso HM461871); Cry41Ba2 (n° de acesso ZP_04099652); Cry42Aa1 (n° de acesso BAD35166); Cry43Aa1 (n° de acesso BAD15301); Cry43Aa2 (n° de acesso BAD95474); Cry43Ba1 (n° de acesso BAD15303); Cry43Ca1 (n° de acesso KC156676); Cry43Cb1 (n° de acesso KC156695); Cry43Cc1 (n° de acesso KC156696); semelhante à Cry43 (n° de acesso BAD15305); Cry44Aa (n° de acesso BAD08532); Cry45Aa (n° de acesso BAD22577); Cry46Aa (n° de acesso BAC79010); Cry46Aa2 (n° de acesso BAG68906); Cry46Ab (n° de acesso BAD35170); Cry47Aa (n° de acesso AAY24695); Cry48Aa (n° de acesso CAJ18351); Cry48Aa2 (n° de acesso CAJ86545); Cry48Aa3 (n° de acesso CAJ86546); Cry48Ab (n° de acesso CAJ86548); Cry48Ab2 (n° de acesso CAJ86549); Cry49Aa (n° de acesso CAH56541); Cry49Aa2 (n° de acesso CAJ86541); Cry49Aa3 (n° de acesso CAJ86543); Cry49Aa4 (n° de acesso CAJ86544); Cry49Ab1 (n° de acesso CAJ86542); Cry50Aa1 (n° de acesso BAE86999); Cry50Ba1 (n° de acesso GU446675); Cry50Ba2 (n° de acesso GU446676); Cry51Aa1 (n° de acesso ABI14444); Cry51Aa2 (n° de acesso GU570697); Cry52Aa1 (n° de acesso EF613489); Cry52Ba1 (n° de acesso FJ361760); Cry53Aa1 (n° de acesso EF633476); Cry53Ab1 (n° de acesso FJ361759); Cry54Aa1 (n° de acesso ACA52194); Cry54Aa2 (n° de acesso GQ140349); Cry54Ba1 (n° de acesso GU446677); Cry55Aa1 (n° de acesso ABW88932); Cry54Ab1 (n° de acesso JQ916908); Cry55Aa2 (n° de acesso AAE33526); Cry56Aa1 (n° de acesso ACU57499); Cry56Aa2 (n° de acesso GQ483512); Cry56Aa3 (n° de acesso JX025567); Cry57Aa1 (n° de acesso ANC87261); Cry58Aa1 (n° de acesso ANC87260); Cry59Ba1 (n° de acesso JN790647); Cry59Aa1 (n° de acesso ACR43758); Cry60Aa1 (n° de acesso ACU24782); Cry60Aa2 (n° de acesso EAO57254); Cry60Aa3 (n° de acesso EEM99278); Cry60Ba1 (n° de acesso GU810818); Cry60Ba2 (n° de acesso EAO57253); Cry60Ba3 (n° de acesso EEM99279); Cry61Aa1 (n° de acesso HM035087); Cry61Aa2 (n° de acesso HM132125); Cry61Aa3 (n° de acesso EEM19308); Cry62Aa1 (n° de acesso HM054509); Cry63Aa1 (n° de acesso BAI44028); Cry64Aa1 (n° de acesso BAJ05397); Cry65Aa1 (n° de acesso HM461868); Cry65Aa2 (n° de acesso ZP_04123838); Cry66Aa1 (n° de acesso HM485581); Cry66Aa2 (n° de acesso ZP_04099945); Cry67Aa1 (n° de acesso HM485582); Cry67Aa2 (n° de acesso ZP_04148882); Cry68Aa1 (n° de acesso HQ113114); Cry69Aa1 (n° de acesso HQ401006); Cry69Aa2 (n° de acesso JQ821388); Cry69Ab1 (n° de acesso JN209957); Cry70Aa1 (n° de acesso JN646781); Cry70Ba1 (n° de acesso ADO51070); Cry70Bb1 (n° de acesso EEL67276); Cry71Aa1 (n° de acesso JX025568); Cry72Aa1 (n° de acesso JX025569).
[0311] Exemplos de δ-endotoxinas incluem, também, mas não se limitam a, proteínas Cry1A das patentes US n°s 5.880.275, 7.858.849, 8.530.411, 8.575.433 e 8.686.233; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal de variantes de a-hélice 1 e/ou α- hélice 2 das proteínas cry, como Cry1A, Cry3A) das Patentes US números 8.304.604, 8.304.605 e 8.476.226; Cry1B do pedido de patente US número de série 10/525.318; Cry1C da patente US n° 6.033.874; Cry1F das Patentes US números 5.188.960 e 6.218.188; quimeras Cry1A/F das patentes US n°s 7.070.982; 6.962.705 e 6.713.063); uma proteína Cry2, como a proteína Cry2Ab da patente US n° 7.064.249); uma proteína Cry3A que inclui, mas não se limita a uma proteína híbrida inseticida manipulada (eHIP) criada pela fusão de combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (publicação de pedido de patente US n° 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das patentes US n°s 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 e 7.462.760; uma proteína Cry9, como os membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F, incluindo, mas não se limitando a, a proteína Cry9D da patente US n° 8.802.933 e a proteína Cry9B da patente US n° 8.802.934; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7.145 a 7.151; uma proteína Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das patentes US n°s 6.127.180, 6.624.145 e 6.340.593; proteínas CryET33 e cryET34 das patentes US n°s 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e 7.504.229; homólogos de CryET33 e CryET34 da publicação de patente US n° 2006/0191034, 2012/0278954, e publicação PCT número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das patentes US n°s 6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma toxina TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 da publicação de pedido de patente US número 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 do pedido PCT US 2006/033867; toxinas TIC853, da patente US 8.513.494, AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da patente US n° 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 da Patente US número 7,923,602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 de WO 2006/083891; AXMI-010 do documento WO 2005/038032; AXMI-003 do documento WO 2005/021585; AXMI-008 da publicação de pedido de patente US número 2004/0250311; AXMI-006 da publicação de pedido de patente US número 2004/0216186; AXMI-007 da publicação de pedido de patente US número 2004/0210965; AXMI-009 do pedido de patente US número 2004/0210964; AXMI-014 da publicação de pedido de patente US número 2004/0197917; AXMI-004 da publicação de pedido de patente US número 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 do documento WO 2004/074462; AXMI- 150 da patente US n° 8.084.416; AXMI-205 da publicação de pedido de patente US número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 da publicação de pedido de patente US número 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas da publicação de pedido de patente US número 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z de WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 do documento WO 2011/103247 e patente US n° 8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI- 005, AXMI-163 e AXMI-184 da patente US n° 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 da publicação de pedido de patente US número 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 da publicação de pedido de patente US número 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da patente US n° 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 da publicação de pedido de patente US n° 2010/0005543, AXMI270 da publicação de pedido de patente US n° US20140223598, AXMI279 da publicação de pedido de patente US n° US20140223599, proteínas cry, como Cry1A e Cry3A, tendo os sítios proteolíticos modificados da patente US n° 8.319.019; uma proteína toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 da publicação de pedido de patente US n° 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas dos versados na técnica (consulte, Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”). A atividade inseticida das proteínas Cry é bem conhecida de um versado na técnica (para uma revisão, consulte, van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). O uso de proteínas Cry como característica de planta transgênica é bem conhecido de um versado na técnica e plantas transgênicas para Cry incluindo, mas não se limitando a, plantas expressando Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam aprovação regulatória (consulte Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 e o banco de dados CERA (2010, GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA)), Fundação de pesquisa ILSI, Washington D.C., EUA em cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida do versado na técnica também pode ser expressa em plantas, como Vip3Ab & Cry1Fa (US2012/0317682); Cry1BE & Cry1F (US2012/0311746); Cry1CA & Cry1AB (US2012/0311745); Cry1F & CryCa (US2012/0317681); Cry1DA & Cry1BE (US2012/0331590); Cry1DA & Cry1Fa (US2012/0331589); Cry1AB & Cry1BE (US2012/0324606); Cry1Fa & Cry2Aa e Cry1I & Cry1E (US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab & Cry3Aa (US20130167268); Cry1Ab e Cry1F (US20140182018); e Cry3A e Cry1Ab ou Vip3Aa (US20130116170). As proteínas pesticidas incluem, também, lipases inseticidas incluindo acil hidrolases de lipídio da patente US n° 7.491.869, e colesterol oxidases, tal como as de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). As proteínas pesticidas incluem, também as toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das patentes US n°s 5.877.012, 6.107.279 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e 8.237.020 e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas do versado na técnica (consulte lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, que pode ser acessado na internet usando o prefixo “www”). As proteínas pesticidas incluem, também proteínas do complexo de toxina (TC), que podem ser obtidas a partir de organismos como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consulte as patentes US n°s 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida “independente” e outras proteínas TC acentuam a atividade das toxinas independentes produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC “independente” (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser intensificada por um ou mais “potenciadores” da proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme mencionado no presente documento, proteínas da classe A (“proteína A”) são toxinas independentes. As proteínas da classe B (“proteína B”) e as proteínas da classe C (“proteína C”) intensificam a toxicidade das proteínas da classe A. Exemplos de proteínas de classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Exemplos de proteínas de classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Exemplos de proteínas de classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas incluem, também, proteínas do veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos do veneno de aranha incluem, mas não se limitam a peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (patente US n° 8.334.366). (C) Um polinucleotídeo que codifica um hormônio ou feromônio específico de inseto como, por exemplo, um hormônio ecdisteroide e juvenil, uma variante do mesmo, um mimético com base no mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consulte, por exemplo, a revelação de Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de expressão em baculovírus da esterase do hormônio juvenil clonado, um inativador do hormônio juvenil. (D) Um polinucleotídeo que codifica um peptídeo específico de insetos que, mediante expressão, perturba a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, consulte as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão fornece DNA que codifica o receptor do hormônio diurético de insetos); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300-310; Carlini and Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847- 853 e Vasconcelos and Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. Consulte também, a patente US n° 5.266.317 concedida a Tomalski, et al., que revela genes que codificam toxinas específicas de inseto. (E) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima responsável por um excesso de acúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, um ácido hidroxâmico, um derivado fenilpropanoide ou outra molécula não-proteica com atividade inseticida. (F) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, natural ou sintética. Consulte o pedido PCT WO 1993/02197 em nome de Scott, et al., que revela a sequência de nucleotídeos de um gene da calase. As moléculas de DNA que contêm sequências que codificam a quitinase podem ser obtidas, por exemplo, junto à ATCC® sob os números de acesso 39637 e 67152. Consulte também, Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que mostra a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica quitinase do mandarová do fumo e Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. Biol. 21:673, que fornecem a sequência de nucleotídeos do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa e as patentes US n°s 6.563.020; 7.145.060 e 7.087.810. (G) Um polinucleotídeo que codifica uma molécula que estimula a transdução de sinal. Por exemplo, consulte a descrição de Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, de sequências de nucleotídeos dos clones de cDNA da calmodulina do feijão asiático, e Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que fornece a sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA da calmodulina de milho. (H) Um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de momento hidrofóbico. Consulte, a revelação no Pedido PCT WO 1995/16776 e na patente US n° 5.580.852 de derivados de peptídeo de Taquiplesina que inibiem patógenos fúngicos de plantas) e o Pedido PCT WO 1995/18855 e a patente US n° 5.607.914 (ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças). (I) Um polinucleotídeo que codifica uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, consulte a revelação de Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, da expressão heteróloga de um análogo do peptídeo lítico da cecropina-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum. (J) Um gene que codifica uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada dela. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral nas células vegetais transformadas confere resistência à infecção viral e/ou ao desenvolvimento da doença causada pelo vírus do qual é derivado o gene para proteína de revestimento, bem como por vírus relacionados. Consulte Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. A resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra o vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da estria do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus “Etch” do tabaco, vírus “rattle” do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Id. (K) Um gene que codifica um anticorpo específico para inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo que tem como alvo uma função metabólica de importância crítica nos intestinos do inseto desativaria uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor, et al., Resumo n° 497, SEVENTH INT’L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênico através da produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única). (L) Um gene que codifica um anticorpo específico para vírus. Consulte, por exemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que mostra que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinante são protegidas do ataque do vírus. (M) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína que reprime o desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, as endo alfa-1,4-D- poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização por fungos e a liberação de nutrientes pela planta mediante a solubilização da parede celular vegetal por homo-alfa-1,4-D- galacturonase. Consulte, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína inibidora da endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367. (N) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína que reprime o desenvolvimento produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305, mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene inativador de ribossoma da cevada possuem uma resistência aumentada à doença fúngica. (O) Os genes envolvidos na resposta à resistência sistêmica adquirida (SAR, ou “Systemic Acquired Resistance”) e/ou os genes relacionados à patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse and Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456-64 e Somssich, (2003) Cell 113(7):815-6. (P) Genes antifúngicos (Cornelissen and Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709-712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183:258-264 e Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149. Consulte também, os pedidos de patente US números seriais 09/950.933; 11/619.645; 11/657.710; 11/748.994; 11/774.121 e as patentes US n°s 6.891.085 e 7.306.946. Quinases semelhantes ao receptor LysM da percepção de fragmentos de quitina como uma primeira etapa na resposta de defesa da planta contra patógenos fúngicos (US 2012/0110696). (Q) Genes de desintoxicação, como aqueles da fumonisina, bovericina, moniliformina e zearalenona, bem como seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo, consulte as patentes US n°s 5.716.820; 5.792.931; 5.798.255; 5.846.812; 6.083.736; 6.538.177; 6.388.171 e 6.812.380. (R) Um polinucleotídeo que codifica inibidores da cistatina e cisteína proteinase. Consulte a patente U.S. n° 7.205.453. (S) Genes da defensina. Consulte, WO 2003/000863 e patentes US n°s 6.911.577; 6.855.865; 6.777.592 e 7.238.781. (T) Genes que conferem resistência a nematódeos. Consulte, por exemplo, o Pedido PCT WO 1996/30517; O Pedido PCT WO 1993/19181, WO 2003/033651 e Urwin, et al., (1998) Planta 204:472-479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327-31; as patentes US n°s 6.284.948 e 7.301.069 e os genes miR164 (WO 2012/058266). (U) Genes que conferem resistência à podridão da raiz de Phytophthora, como os genes Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 e outros genes Rps. Consulte, por exemplo, Shoemaker, et al., Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, Califórnia, EUA. (1995). (V) Genes que conferem resistência à podridão marrom do caule, tal como descrito na patente US n° 5.689.035 e incorporada por referência para este propósito. (W) Genes que conferem resistência ao Colletotrichum, tal como descrito na publicação de pedido de patente US 2009/0035765 e incorporada por referência para este propósito. Isto inclui o locus Rcg que pode ser usado como uma conversão de locus único. 2. Transgenes que conferem resistência a um herbicida, por exemplo: (A) Um polinucleotídeo que codifica resistência a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Genes exemplificadores nesta categoria codificam as enzimas ALS e AHAS mutantes, conforme descrito, por exemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 e Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Consulte também, as patentes US n°s 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 e 5.378.824; pedido de patente US número de série 11/683.737 e publicação internacional WO 1996/33270. (B) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para resistência ao glifosato (resistência conferida pelos genes da 5-enolpiruvil-3-fosfochiquimato sintase (EPSP) e aroA mutantes, respectivamente) e outros compostos fosfono como, por exemplo, glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferase (PAT) e fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces hygroscopicus (bar)) e ácidos piridinóxi ou fenóxi propiônicos e ciclo- hexonas (genes que codificam o inibidor de ACCase). Consulte, por exemplo, a patente US n° 4.940.835 de Shah, et al., que apresenta a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência ao glifosato. A patente US n° 5.627.061, de Barry, et al., também descreve genes que codificam enzimas EPSPS. Consulte também, as patentes US n°s 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 5,094,945, 4,940,835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E e 5.491.288 e as publicações internacionais EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 e EP 1173582, os quais estão aqui incorporados por referência para este propósito. A resistência ao glifosato também é conferida a plantas que expressam um gene que codifica uma enzima glifosato óxido- redutase, conforme descrito mais completamente nas patentes US n°s 5.776.760 e 5.463.175, as quais estão aqui incorporadas por referência para este propósito. Além disso, a resistência ao glifosato pode ser conferida a plantas pela superexpressão de genes que codificam a glifosato N-acetiltransferase. Consulte, por exemplo, patentes US n°s 7.462.481; 7.405.074 e a publicação de pedido de patente US n° US 2008/0234130. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o número de acesso ATCC® 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é revelada na patente US n° 4.769.061 concedida a Comai. O pedido EP n° 0 333 033 concedido a Kumada, et al. e a patente US n° 4.975.374 concedida a Goodman, et al., revelam sequências de nucleotídeos de genes da glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene de fosfinotricina-acetil-transferase é fornecida nos pedidos EP números 0 242 246 e 0 242 236 de Leemans, et al.; De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam para a atividade da fosfinotricina acetil transferase. Consulte também, as patentes US n°s 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 e 5.879.903, as quais estão aqui incorporadas por referência para este propósito. Exemplos de genes que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e ciclo-hexonas, como, por exemplo, setoxidima e haloxifope são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435. (C) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para resistência a um herbicida que inibe a fotossíntese, como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169, descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídios que codificam genes psbA mutantes. As sequências de nucleotídeos dos genes da nitrilase são reveladas na patente US n° 4.810.648 concedida a Stalker, e moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis com os números de acesso ATCC® 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão do DNA que codifica uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173. (D) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para resistência à aceto-hidróxi ácido sintase que, conforme observado, torna as plantas que expressam esta enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzido em uma variedade de plantas (consulte, por exemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet. 246:419). Outros genes que conferem resistência a herbicidas incluem: um gene codificando uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e óxido redutase de NADPH -citocromo P450 de levedura (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106(1):17-23), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1687, e genes para várias fosfotransferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619). (E) Um polinucleotídeo que codifica resistência a um herbicida direcionado para protoporfirinogênio oxidase (Protox) que é necessária para a produção de clorofila. A enzima Protox serve como alvo para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as diferentes espécies de plantas presentes, causando sua total destruição. O desenvolvimento de plantas contendo atividade alterada de protox que são resistentes a estes herbicidas é descrito nas Patentes US números 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 e 5.767.373 e na publicação internacional WO 2001/12825. (F) O gene aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicidovorans) codifica a proteína ariloxialcanoato desoxigenase (AAD-1). O traço confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ariloxifenoxipropionato (comumente denominado herbicidas “fop”, tal como quizalofope). O gene aad-1 em si, para tolerância a herbicida em plantas, foi primeiramente apresentado no documento WO 2005/107437 (consulte também, US 2009/0093366). O gene aad-12, derivado de Delftia acidovorans, que codifica a proteína arilóxi alcanoato desoxigenase (AAD- 12) que confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4- diclorofenoxiacético e piridilóxi acetato pela desativação de vários herbicidas com uma porção arilóxi alcanoato, inclusive fenóxi auxina (por exemplo, 2,4-D, MCPA), assim como piridilóxi auxinas (por exemplo, fluroxipir, triclopir). (G) Um polinucleotídeo que codifica uma dicamba mono oxigenase resistente a herbicida revelado na publicação de pedido de patente US 2003/0135879 para conferir tolerância à dicamba. (H) Uma molécula de polinucleotídeo que codifica bromoxinil nitrilase (Bxn) revelada na patente US n° 4.810.648 para conferir tolerância à bromoxinila. (I) Uma molécula de polinucleotídeo codificando fitoeno (crtl) descrita em Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833-840 and in Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481-489 para tolerância a norflurazon. 3. Transgenes que conferem ou contribuem para uma característica alterada para os grãos Tais como: (A) Ácidos graxos alterados, por exemplo, por (1) Regulação negativa da estearoil-ACP para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consulte Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 e WO 1999/64579 (genes para alterar os perfis lipídicos em milho). (2) Elevação do teor de ácido oleico através de modificação do gene FAD-2 e/ou redução do ácido linolênico através de modificação do gene FAD-3 (consulte as Patentes US números 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 e WO 1993/11245). (3) Alteração do teor de ácido linolênico ou linoleico conjugado, tal como em WO 2001/12800. (4) Alteração de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1 ps, vários genes Ipa como Ipa1, Ipa3, hpt ou hggt. Por exemplo, consulte, WO 2002/42424, WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, Patentes US n°s 6.423.886, 6.197.561, 6.825.397 e publicação de pedido de patente US n°s 2003/0079247, US 2003/0204870 e Rivera-Madrid, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620-5624. (5) Genes que codificam a delta-8 dessaturase para produzir ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (patentes US n°s 8.058.571 e 8.338.152), delta-9 dessaturase para reduzir as gorduras saturadas (patente US n° 8.063.269), Primula Δ6-dessaturase para melhorar os perfis de ácido graxo ômega-3. (6) Ácidos nucleicos e proteínas isoladas associadas com a regulação do metabolismo de lipídios e açúcares, em particular, a proteína do metabolismo de lipídio (LMP) usada em métodos de produzir plantas transgênicas e modular os níveis de compostos de armazenamento na semente, incluindo lipídios, ácidos graxos, amidos ou proteínas de armazenamento na semente, e uso em métodos para modulação do tamanho da semente, número de sementes, pesos da semente, comprimento da raiz e tamanho da folha das plantas (EP 2404499). (7) Alteração da expressão da proteína de alto nível de expressão induzível por açúcar 2 (HSI2) na planta para aumentar ou reduzir a expressão de HSI2 na planta. O aumento da expressão de HSI2 aumenta o teor de óleo, enquanto a redução da expressão de HSI2 reduz a sensibilidade ao ácido abscísico e/ou aumenta a resistência à seca (publicação de pedido de patente US n° 2012/0066794). (8) Expressão de citocromo b5 (Cb5) sozinho ou com FAD2 para modular o teor de óleo na semente da planta, particularmente para aumentar os níveis de ácidos graxos ômega-3 e aprimorar a razão entre ácidos graxos ômega-6 e ômega-3 (publicação de pedido de patente US no 2011/0191904) . (9) Moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos semelhantes a wrinkled1 para modular o metabolismo do açúcar (patente US n° 8.217.223). (B) Teor de fósforo alterado, por exemplo, pela (1) A introdução de um gene codificando fitase intensificaria a decomposição de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, consulte Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para uma revelação da sequência de nucleotídeos de um gene de fitase de Aspergillus niger. (2) Modulação de um gene que reduz o teor de fitato. Em milho, isto, por exemplo, poderia ser feito pela clonagem e, então, reintrodução do DNA associado com um ou mais dos alelos, como os alelos LPA, identificados em mutantes de milho caracterizados por baixos teores de ácido fítico, como no documento WO 2005/113778 e/ou pela alteração a atividade inositol quinase tal como no documento WO 2002/059324, publicação de pedido de patente US n° 2003/0009011, WO 2003/027243, publicação de pedido de patente US n° 2003/0079247, WO 1999/05298, patente US n° 6.197.561, patente US n° 6.291.224, patente US n° 6.391.348, WO 2002/059324, publicação de pedido de patente US n° 2003/0079247, WO 1998/45448, WO 1999/55882, WO 2001/04147. (C) Carboidratos alterados afetados, por exemplo, pela alteração de um gene para um enzima que afeta o padrão de ramificação do amido ou, um gene que altera a tioredoxina, como NTR e/ou TRX (consulte, patente US n° 6.531.648, que é incorporada por referência para este propósito) e/ou um nocaute de gama zeína ou mutante, como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consulte, a patente US n° 6.858.778 e a publicação de pedido de patente US n° 2005/0160488, publicação de pedido de patente US n° 2005/0204418, que estão incorporados por referência para este propósito). Consulte, Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeos do gene mutante da frutosiltransferase de Streptococcus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeos do gene levansucrase de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeos dos genes da tomate invertase), S0gaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagênese sítio-dirigida do gene da alfa-amilase da cevada) e Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima de ramificação de amido de endosperma de milho II), WO 1999/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração de amido através da modificação de UDP-D-xilose 4- epimerase, Frágil 1 e 2, Ref1, HCHL, C4H), patente US n° 6.232.529 (método de produzir semente com alto teor de óleo pela modificação dos níveis de amido (AGP)). Os genes da modificação de ácidos graxos mencionados no presente documento podem, também, ser usados para afetar o teor e/ou a composição de amido através da inter-relação das rotas de amido e óleo. (D) Alteração no teor ou na composição de antioxidantes, como alteração do tocoferol ou dos tocotrienóis. Por exemplo, consulte, a patente US n° 6.787.683, publicação de pedido de patente US n° 2004/0034886 e WO 2000/68393 envolvendo a manipulação dos níveis de antioxidantes e WO 2003/082899 através alteração de uma homogentisato geranil geranil transferase (hggt). (E) Aminoácidos essenciais da semente alterados. Por exemplo, consulte a patente US n° 6.127.600 (método para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais nas sementes), patente US n° 6.080.913 (métodos binários para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), patente US n° 5.990.389 (alto teor de lisina), WO 1999/40209 (alteração de composições de aminoácido nas sementes), WO 1999/29882 (métodos para alterar o teor de aminoácido das proteínas), patente US n° 5.850.016 (alteração das composições de aminoácido nas sementes), WO 1998/20133 (proteínas com níveis intensificados de aminoácidos essenciais), patente US n° 5.885.802 (alto teor de metionina), patente US n° 5.885.801 (alto teor treonina), patente US número 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácidos de planta), patente US n° 6.459.019 (teor de lisina e treonina aumentados), patente US n° 6.441.274 (subunidade beta da triptofano sintase vegetal), patente US n° 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), patente US n° 5.939.599 (alto teor de enxofre), patente US n° 5.912.414 ( teor de metionina aumentado), WO 1998/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácidos de planta), WO 1998/45458 (proteína de semente manipulada que tem uma porcentagem mais alta de aminoácidos essenciais), WO 1998/42831 (teor de lisina aumentado), patente US número 5.633.436 (aumento do teor de aminoácidos com enxofre), patente US n° 5.559.223 (proteínas para armazenamento sintéticas com estrutura definida contendo níveis programáveis de aminoácidos essenciais para melhoramento do valor nutricional das plantas), WO 1996/01905 (teor aumentado de treonina), WO 1995/15392 (teor aumentado de lisina), publicação de pedido de patente US n° 2003/0163838, publicação de pedido de patente US n° 2003/0150014, publicação de pedido de patente US n° 2004/0068767, patente US n° 6.803.498, WO 2001/79516. 4. Genes que controlam a esterilidade masculina:
[0312] Há vários métodos disponíveis para conferir esterilidade masculina genética, como, por exemplo, múltiplos genes mutantes em locais separados dentro do genoma que conferem esterilidade masculina, conforme apresentado nas Patentes US n°s 4.654.465 e 4.727.219 concedidas a Brar, et al., e translocações cromossômicas, conforme descrito por Patterson nas patentes US n°s 3.861.709 e 3.710.511. Em adição a estes métodos, Albertsen, et al., a patente US número 5.432.068 descreve um sistema de esterilidade masculina nuclear que inclui: silenciar esse gene nativo que tem importância crítica para a fertilidade masculina, remover o promotor nativo do gene essencial de fertilidade masculina, e substituir o mesmo por um promotor induzível, inserir este gene geneticamente manipulado de volta na planta; e assim, criar uma planta que é macho-estéril porque o promotor induzível não está “ligado” o que faz com que o gene de fertilidade masculina não seja transcrito. A fertilidade é restaurada induzindo ou “ligando” o promotor, o que, por sua vez, permite que o gene que confere fertilidade masculina seja transcrito. (A) Introdução de um gene de desacetilase sob o controle de um promotor tapetum-específico e com a aplicação do produto químico N-Ac-PPT (WO 2001/29237). (B) Introdução de vários promotores específicos do estame (WO 1992/13956, WO 1992/13957). (C) Introdução do gene barnase e barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611-622).
[0313] Para exemplos adicionais de sistemas de esterilidade nuclear masculinos e femininos, consulte também as patentes números 5.859.341; 6.297.426; 5.478.369; 5.824.524; 5.850.014 e 6.265.640, todas as quais estão aqui incorporadas, por referência. 5. Genes que criam um sítio para uma integração de DNA sítio-específica.
[0314] Isso inclui a introdução de sítios FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT, e/ou sítios Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, consulte, Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 e WO 1999/25821, que estão aqui incorporados, por referência. Outros sistemas que podem ser usados incluem a Gin recombinase do bacteriófago Mu (Maeser, et al., (1991) Vicki Chandler, The Maize Handbook capítulo 118 (Springer-Verlag 1994), a Pin recombinase de E. coli (Enomoto, et al., 1983) e o sistema R/RS do plasmídio pSRi (Araki, et al., 1992). 6. Genes que afetam a resistência ao estresse abiótico
[0315] Incluindo, mas não se limitando a floração, desenvolvimento da espiga e da semente, intensificação da eficiência de utilização de nitrogênio, capacidade de resposta alterada ao nitrogênio, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio, e resistência ou tolerância ao sal e produtividade aumentada sob condições de estresse. (A) Por exemplo, consulte: WO 2000/73475 no qual a eficiência do uso de água é alterada através da alteração de malato; Patentes US n°s 5.892.009, 5.965.705, 5.929.305, 5.891.859, 6.417.428, 6.664.446, 6.706.866, 6.717.034, 6.801.104, WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO 2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/036444, WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO 2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO 2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521. (B) WO 199938977 que descreve genes, incluindo os genes CBF e fatores de transcrição eficazes na mitigação dos efeitos negativos do congelamento, alta salinidade e seca em plantas, assim como que conferem outros efeitos positivos sobre o fenótipo da planta. (C) a publicação de pedido de patente US n° 2004/0148654 e o documento WO 2001/36596 nos quais o ácido abscísico é alterado nas plantas, resultando em um fenótipo melhorado da planta, tal como produtividade aumentada e/ou tolerância aumentada ao estresse abiótico. (D) WO 2000/006341, WO 2004/090143, Patentes US n°s 7.531.723 e 6.992.237, nos quais a expressão de citocinina é modificada, resultando em plantas com tolerância ao estresse aumentada, como tolerância à seca, e/ou produtividade aumentada. Consulte também, WO 2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, patente US n° 6.084.153, WO 2001/64898, patente US n° 6.177.275 e patente US n° 6.107.547 (intensificação da utilização de nitrogênio e capacidade de resposta alterada ao nitrogênio). (E) Para alteração do etileno, consulte a publicação de pedido de patente US n° 2004/0128719, publicação de pedido de patente US n° 2003/0166197 e WO 2000/32761. (F) Para os fatores de transcrição de planta ou reguladores traducionais do estresse abiótico, consulte, por exemplo, a publicação de pedido de patente US n° 2004/0098764 ou a publicação de pedido de patente US n° 2004/0078852. (G) Genes que aumentam a expressão da pirofosfatase vacuolar, como AVP1 (patente US n° 8.058.515) para aumento na produtividade; ácido nucleico que codifica os polipeptídeos HSFA4 ou HSFA5 (fator de choque térmico da classe A4 ou A5), um polipeptídeo da proteína transportadora de oligopeptídeos (semelhante à OPT4); um polipeptídeo semelhante ao plastocron2 (semelhante a PLA2) ou um polipeptídeo semelhante ao homeobox 1 relacionado a Wuschel (semelhante a WOX1) (publicação de pedido de patente US n° 2011/0283420). (H) Regulação negativa dos polinucleotídeos que codificam as proteínas poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) para modular a morte celular programada (patente US n° 8.058.510) para aumento do vigor. (I) Polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos DTP21 para conferir resistência à seca (publicação de pedido de patente US n° US 2011/0277181). (J) Sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas ACC sintase 3 (ACS3) para modular o desenvolvimento, modular a resposta ao estresse e modular a tolerância ao estresse (publicação de pedido de patente US n° 2010/0287669). (K) Polinucleotídeos que codificam proteínas que conferem um fenótipo de tolerância à seca (DTP) para conferir resistência à seca (WO 2012/058528). (L) Genes de tocoferol ciclase (TC) para conferir tolerância à seca e ao sal (publicação de pedido de patente US n° 2012/0272352). (M) Proteínas da família CAAX amino terminal para tolerância ao estresse (patente US n° 8.338.661). (N) Mutações no gene que codifica SAL1 tendo tolerância ao estresse aumentada, inclusive aumento da resistência à seca (publicação de pedido de patente US n° 2010/0257633). (O) Expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: polipeptídeo GRF, polipeptídeo semelhante a RAA1, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL, e polipeptídeo YTP que aumentam os traços relacionados à produtividade (publicação de pedido de patente US n° 2011/0061133). (P) Modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de trealose fosfato fosfatase (TPP) classe III para acentuar os traços relacionados à produtividade em plantas, particularmente, aumento da produtividade da semente (publicação de pedido de patente US n° 2010/0024067). (Q) Expressão de uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo de fenótipo tolerante à seca (DTP6), especificamente, AT-DTP6 da publicação de pedido de patente US n° 2014/0223595.
[0316] Outro genes e fatores de transcrição que afetam o crescimento e os traços agronômicos vegetais como produtividade, floração, crescimento vegetal e/ou estrutura da planta, podem ser introduzidos ou introgredidos em plantas, vide, por exemplo, WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339 e patente US n° 6.573.430 (TFL), patente US n° 6.713.663 (FT), WO 1996/14414 (CON), WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FR1), WO 1997/29123, patente US n° 6.794.560, patente US n° 6.307.126 (GAI), WO 1999/09174 (D8 e Rht) e WO 2004/076638 e WO 2004/031349 (fatores de transcrição). 7. Genes que conferem aumento da produtividade (A) Uma planta de cultivo transgênica transformada por um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo semelhante à 1- AminoCiclopropano-1-Carboxilato Desaminase (ACCDP), sendo que a expressão da sequência de ácidos nucleicos na planta de cultivo resulta em um aumento do crescimento da raiz na planta, e/ou aumento da produtividade, e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental em comparação a uma variedade selvagem da planta (patente US n° 8.097.769). (B) A superexpressão do gene da proteína de dedo de zinco de milho (Zm-ZFP1) usando um promotor preferencial para sementes mostrou aumentar o crescimento vegetal, aumentar o número de grãos e o peso total de grãos por planta (publicação de pedido de patente US n° 2012/0079623). (C) Foi mostrado que a superexpressão constitutiva da proteína do domínio dos contornos de órgãos laterais do milho (LOB) (Zm-LOBDP1) aumenta o número de grãos e o peso total dos grãos por planta (publicação de pedido de patente US n° 2012/0079622). (D) Melhoria dos traços relacionados à produtividade em plantas pela modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo semelhante à VIM1 (variante em metilação 1) ou um polipeptídeo semelhante à VTC2 (GDP-L-galactose fosforilase) ou um polipeptídeo DUF1685 ou um polipeptídeo semelhante à ARF6 (fator responsivo à auxina) (WO 2012/038893). (E) A modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo semelhante à Ste20 ou um homólogo do mesmo, gera plantas que têm aumento da produtividade em relação às plantas de controle (EP 2431472). (F) Genes que codificam polipeptídeos da nucleosídeo difosfatase quinase (NDK) e seus homólogos para modificar a arquitetura da raiz da planta (publicação de pedido de patente US n° 2009/0064373). 8. Genes que conferem digestibilidade à planta. (A) Alteração do nível de xilano presente na parede celular de uma planta mediante a modulação da expressão da xilano sintase (patente US número 8.173.866).
[0317] Em algumas modalidades, o traço empilhado pode ser um traço ou evento que recebeu aprovação regulatória incluindo, mas não se limitando aos eventos na Tabela 4A -4F. Tabela 4A Oryza sativa Arroz
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[0318] Outros eventos com aprovação regulatória são bem conhecidos de um versado na técnica e podem ser encontrados no Centro para Avaliação de Risco Ambiental (Center for Environmental Risk Assessment) (cera- gmc.org/?action=gm_crop_database, que pode ser acessado usando o prefixo “www”) e no Serviço Internacional para a Aquisição de Aplicações de Agricultura e Biotecnologia (International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications) (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, que pode ser acessado usando o prefixo “www”). Silenciamento gênico
[0319] Em algumas modalidades, a característica empilhada pode estar sob a forma de silenciamento de um ou mais polinucleotídeos de interesse resultando em supressão de um ou mais polipeptídeos-alvo da praga. Em algumas modalidades, o silenciamento é obtido através do uso de um construto de DNA de supressão.
[0320] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos PIP-72 ou seus fragmentos ou variantes podem ser empilhados com um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos que têm atividade inseticida ou traços agronômicos, conforme apresentado acima, e opcionalmente, podem incluir, também, um ou mais polinucleotídeos que proporcionam silenciamento gênico de um ou mais polinucleotídeos-alvo, conforme discutido abaixo.
[0321] “Construto de DNA de supressão” é um construto de DNA recombinante que, quando transformado ou estavelmente integrado no genoma da planta, resulta no “silenciamento” de um gene-alvo na planta. O gene-alvo pode ser endógeno ou transgênico em relação à planta. “Silenciamento”, conforme usado aqui, em relação ao gene-alvo, se refere, em geral, à supressão de níveis de mRNA ou proteína/enzima expressa pelo gene-alvo, e/ou o nível da atividade enzimática ou funcionalidade da proteína. O termo “supressão” inclui baixar, reduzir, declinar, diminuir, inibir, eliminar e impedir. O termo “silenciamento” ou “silenciamento gênico” não especifica o mecanismo e inclui, não se limitando a, antissenso, cossupressão, supressão viral, supressão por elemento em forma de grampo (hairpin), supressão por elementos do tipo haste-alça, abordagens à base de RNAi e abordagens com base em RNA pequeno.
[0322] Um construto de DNA de supressão pode compreender uma região derivada de um gene alvo de interesse e pode compreender toda ou parte da sequência de ácido nucleico da fita senso (ou fita antissenso) do gene alvo de interesse. Dependendo da abordagem a ser utilizada, a região pode ser 100% idêntica ou menos que 100% idêntica (por exemplo, pelo menos 50% ou qualquer número inteiro entre 51% e 100% idêntica) à totalidade ou parte da fita senso (ou fita antissenso) do gene de interesse.
[0323] Construtos de DNA de supressão são bem conhecidos na técnica, são prontamente construído uma vez que o gene de interesse alvo é selecionado, e incluem, sem limitação, construtos de cossupressão, construtos antissenso, construtos de supressão viral, construtos de supressão em forma grampo, construtos de supressão de haste-alça, construtos de produção de RNA de fita dupla e, mais em geral, construtos de RNAi (interferência de RNA) e construtos de RNA pequeno, como construtos de siRNA (RNA de interferência curto) e construtos de miRNA (microRNA).
[0324] “Inibição antissenso” se refere à produção de transcritos de RNA antissenso capazes de suprimir a expressão da proteína-alvo.
[0325] O termo “RNA antissenso” refere-se a um transcrito de RNA que é complementar ao todo ou parte de um transcrito primário alvo ou mRNA que bloqueia a expressão de um fragmento de ácido nucleico isolado alvo (patente US n° 5.107.065). A complementaridade de um RNA antissenso pode estar em qualquer parte do transcrito específico do gene, isto é, na sequência não-codificante 5', na sequência não-codificante 3', nos íntrons, ou na sequência de codificação.
[0326] “Cossupressão” se refere à produção de transcritos de RNA senso capazes de suprimir a expressão da proteína-alvo. RNA “senso” refere-se ao transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. Os construtos de cossupressão em plantas foram projetados anteriormente pela focalização na superexpressão de uma sequência de ácidos nucleicos que tem homologia a um mRNA nativo, na orientação senso, que resulta na redução de todo o RNA que tem homologia para a sequência superexpressa (consulte, Vaucheret, et al., (1998) Plant J. 16:651-659 e Gura, (2000) Nature 404:804-808).
[0327] Uma outra variação descreve o uso de sequências virais de planta para direcionar a supressão das sequências codificantes de mRNA proximais (publicação PCT WO 1998/36083).
[0328] Um trabalho recente descreveu o uso de estruturas “em forma de grampo” que incorporam o todo ou parte de uma sequência que codifica mRNA em uma orientação complementar que resulta em uma estrutura de “haste-alça” potencial para o RNA expresso (publicação PCT WO 1999/53050). Nesse caso, a haste é formada por polinucleotídeos que correspondem ao gene de interesse inserido na orientação senso ou antissenso com relação ao promotor, e a alça é formada por alguns polinucleotídeos do gene de interesse, que não têm um complemento no construto. Isso aumenta a frequência de cossupressão ou silenciamento nas plantas transgênicas recuperadas. Para uma revisão da supressão por elementos em forma de grampo, consulte, Wesley, et al., (2003) Methods in Molecular Biology, Plant Functional Genomics: Methods and Protocols 236:273 a 286.
[0329] Um construto no qual a haste é formada por pelo menos 30 nucleotídeos de um gene a ser suprimido e a alça é formada por uma sequência de nucleotídeos aleatória também foi eficazmente usado para supressão (publicação PCT WO 1999/61632).
[0330] O uso de sequências poli-T e poli-A para gerar a haste na estrutura do tipo haste-alça também foi descrita (publicação PCT WO 2002/00894).
[0331] Ainda outra variação inclui o uso de repetições sintéticas para promover a formação de uma haste na estrutura do tipo haste-alça. Foi mostrado que organismos transgênicos preparados com estes fragmentos de DNA recombinantes têm níveis reduzidos da proteína codificada pelo fragmento de nucleotídeos que forma a alça, conforme descrito na publicação PCT WO 2002/00904.
[0332] A interferência de RNA se refere ao processo de silenciamento gênico pós-transcricional sequência-específico em animais, mediados por RNAs de interferência curtos (siRNAs) (Fire, et al., (1998) Nature 391:806). O processo correspondente em plantas é comumente denominado silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) ou silenciamento por RNA e também é chamado de repressão (“quelling”) () em fungos. Acredita-se que o processo de silenciamento gênico pós- transcricional é um mecanismo de defesa celular conservado evolutivamente usado para impedir a expressão de genes estranhos e é comumente compartilhado por diversas floras e filos (Fire, et al., (1999) Trends Genet. 15:358). Essa proteção contra expressão de genes estranhos pode ter evoluído em resposta à produção de RNAs de fita dupla (dsRNAs) derivados de infecção viral ou da integração aleatória de elementos transpóson em um genoma hospedeiro através de uma resposta celular que destrói especificamente RNA de fita simples homólogo do RNA genômico viral. A presença de dsRNA nas células desencadeia a resposta de RNAi através de um mecanismo que ainda não foi completamente caracterizado.
[0333] A presença de longos dsRNAs nas células estimula a atividade de uma enzima ribonuclease III chamada de dicer. A enzima dicer está envolvida no processamento do dsRNA em pedaços curtos de dsRNA conhecidos como RNAs de interferência curtos (siRNAs) (Berstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os RNAs de interferência curtos derivados da atividade da dicer tem tipicamente cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento e compreendem cerca de 19 duplexes de pares de base (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). A enzima dicer também esteve envolvida na excisão de pequenos RNAs temporais (stRNAs) com 21 e 22 nucleotídeos do RNA precursor da estrutura conservada que estão envolvidos no controle traducional (Hutvagner, et al., (2001) Science 293:834). A resposta do RNAi também apresenta um complexo de endonuclease, comumente denominado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), que faz a mediação da clivagem do RNA de fita simples que tem complementaridade de sequência à fita antissenso do duplex de siRNA. A clivagem do RNA alvo ocorre no meio da região complementar à fita antissenso do duplex de siRNA (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Além disso, a interferência de RNA também pode envolver silenciamento gênico mediado por RNA pequeno (por exemplo, miRNA), supostamente através de mecanismos celulares que regulam a estrutura da cromatina e assim, impedem a transcrição das sequências do gene alvo (consulte, por exemplo, Allshire, (2002) Science 297:1818-1819; Volpe, et al., (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein, (2002) Science 297:2.215 a 2.218 e Hall, et al., (2002) Science 297:2.232 a 2.237). Dessa forma, as moléculas de miRNA da descrição podem ser usadas para mediar o silenciamento gênico através da interação com transcritos de RNA ou, alternativamente, pela interação com sequências gênicas específicas, sendo que esta interação resulta no silenciamento gênico no nível transcricional ou pós-transcricional.
[0334] São adicionalmente fornecidos métodos e composições que permitem um aumento no RNAi produzido a partir do elemento silenciador. Em tais modalidades, os métodos e composições empregam um primeiro polinucleotídeo que compreende um elemento de silenciamento para uma sequência da praga alvo ligada funcionalmente a um promotor ativo na célula vegetal; e, um segundo polinucleotídeo que compreende um elemento intensificador de supressor compreendendo a sequência da praga alvo ou uma variante ativa ou fragmento da mesma ligada funcionalmente a um promotor ativo na célula vegetal. A expressão combinada do elemento silenciador com elemento intensificador de supressor leva a uma amplificação aumentada do RNA inibidor produzido a partir do elemento silenciador, acima do que pode ser obtido apenas com a expressão do elemento silenciador sozinho. Em adição à amplificação aumentada da própria espécie específica de RNAi, os métodos e composições permitem, adicionalmente, a produção de uma população diversa de espécies de RNAi que pode acentuar a efetividade em interromper a expressão do gene-alvo. Dessa forma, quando o elemento intensificador de supressor é expresso em uma célula vegetal em combinação com o elemento silenciador, os métodos e a composição podem permitir a produção sistêmica de RNAi em toda a planta; a produção de quantidades maiores de RNAi do que seria observado com apenas o construto do elemento silenciador sozinho; e o carregamento melhorado de RNAi no floema da planta, fornecendo, assim, um melhor controle dos insetos que se alimentam com floema por uma abordagem de RNAi. Portanto, os vários métodos e composições oferecem métodos aperfeiçoados para a distribuição de RNA inibitório ao organismo-alvo. Consulte, por exemplo, a publicação de pedido de patente US 2009/0188008.
[0335] Para uso na presente invenção, um “elemento intensificador de supressor” compreende um polinucleotídeo compreendendo a sequência-alvo a ser suprimida, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo. É fato reconhecido que o elemento intensificador de supressor não precisa ser idêntico à sequência-alvo, mas sim, o elemento intensificador de supressor pode compreender uma variante da sequência-alvo, contanto que o elemento intensificador de supressor tenha identidade de sequência suficiente com a sequência-alvo para permitir um nível aumentado do RNAi produzido pelo elemento silenciador em relação ao que seria obtido apenas com a expressão do elemento silenciador. De maneira similar, o elemento intensificador de supressor pode compreender um fragmento da sequência-alvo, sendo que o fragmento tem comprimento suficiente para permitir um teor aumentado de RNAi produzido pelo elemento silenciador em relação ao que seria obtido somente com a expressão do elemento silenciador.
[0336] É reconhecido que múltiplos elementos intensificadores de supressor da mesma sequência-alvo ou de sequências-alvo diferentes ou de regiões diferentes da mesma sequência-alvo podem ser empregados. Por exemplo, os elementos intensificadores de supressor empregados podem compreender fragmentos da sequência-alvo derivados de uma região diferente da sequência- alvo (isto é, da 3‘UTR, sequência codificante, íntron e/ou 5‘UTR). Adicionalmente, o elemento intensificador de supressor pode estar contido em um cassete de expressão, conforme descrito em outra parte do presente documento e, em modalidades específicas, o elemento intensificador de supressor está em um vetor ou construto de DNA que pode ou não ser o mesmo do elemento silenciador. O elemento intensificador de supressor pode estar funcionalmente ligado a um promotor, conforme aqui revelado. É reconhecido que o elemento intensificador de supressor pode ser expresso constitutivamente, ou alternativamente, pode ser produzido de maneira específica para o estágio, mediante o uso de vários promotores induzíveis ou preferenciais para tecido, ou regulados por desenvolvimento, os quais são discutidos em outra parte do presente documento.
[0337] Em modalidades específicas, quando se usa tanto um elemento silenciador como um elemento intensificador de supressor, a produção sistêmica de RNAi ocorre por toda a planta. Em modalidades adicionais, a planta ou partes de planta da descrição têm um carregamento de RNAi no floema da planta maior do que seria observado com a expressão do construto de elemento silenciador isoladamente e, assim, fornece um melhor controle dos insetos que se alimentam de floema por uma abordagem de RNAi. Em modalidades específicas, as plantas, partes de planta e células de planta da descrição podem ser ainda caracterizadas como permitindo a produção de uma diversidade de espécies de RNAi que podem acentuar a eficácia da interrupção da expressão do gene alvo.
[0338] Em modalidades específicas, a expressão combinada do elemento silenciador e do elemento intensificador de supressor aumenta a concentração do RNA inibitório na célula vegetal, na planta, na parte de planta, no tecido da planta ou no floema, acima do teor que seria obtido quando o elemento silenciador é expresso sozinho.
[0339] Para uso na presente invenção, o termo “teor aumentado de RNA inibitório” compreende qualquer aumento estatisticamente significativo no teor de RNAi produzido em uma planta que tem a expressão combinada, em comparação a uma planta de controle adequada. Por exemplo, um aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta ou célula vegetal pode compreender ao menos cerca de 1%, cerca de 1% a 5%, cerca de 5% a 10%, cerca de 10% a 20%, cerca de 20% a 30%, cerca de 30% a 40%, cerca de 40% a 50%, cerca de 50% a 60%, cerca de 60 a 70%, cerca de 70% a 80%, cerca de 80% a 90%, cerca de 90% a 100% ou mais de aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula vegetal ou floema em comparação a um controle adequado. Em outras modalidades, o aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula vegetal ou floema pode compreender ao menos cerca de 1 vez, cerca de 1 vez a 5 vezes, cerca de 5 vezes a 10 vezes, cerca de 10 vezes a 20 vezes, cerca de 20 vezes a 30 vezes, cerca de 30 vezes a 40 vezes, cerca de 40 vezes a 50 vezes, cerca de 50 vezes a 60 vezes, cerca de 60 vezes a 70 vezes, cerca de 70 vezes a 80 vezes, cerca de 80 vezes a 90 vezes, cerca de 90 vezes a 100 vezes ou mais de aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula vegetal ou floema em comparação a um controle adequado. Exemplos de expressão combinada do elemento silenciador com o elemento intensificador de supressor para o controle de percevejos e Lygus podem ser encontrados na publicação de pedido de patente US 2011/0301223 e na publicação de pedido de patente US 2009/0192117.
[0340] Algumas modalidades se referem à regulação negativa da expressão de genes-alvo em espécies de pragas de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) de interferência. A publicação PCT WO 2007/074405 descreve métodos para inibir a expressão de genes alvo em pragas invertebradas, inclusive o besouro da batata do Colorado. A publicação PCT WO 2005/110068 descreve métodos para inibir a expressão de genes alvo em pragas invertebradas, incluindo, em particular, o crisomelídeo do sistema radicular de milho ocidental como uma forma de controlar a infestação por inseto. Além disso, a publicação PCT WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes alvo de espécies de praga de inseto, incluindo pragas do gênero Lygus. Moléculas de ácido nucleico que incluem RNAi para direcionar a subunidade H da ATPase vacuolar, úteis para controlar uma população e uma infestação de pragas coleópteros, conforme descrito na publicação de pedido de patente US 2012/0198586. A publicação PCT WO 2012/055982 descreve ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula negativamente a expressão de um gene-alvo que codifica uma proteína ribossomal de inseto, como a proteína ribossomal L19, a proteína ribossomal L40 ou a proteína ribossomal S27A; uma subunidade de proteassoma de inseto, como a proteína Rpn6, Pros 25, proteína Rpn2, a proteína da subunidade 1 de proteassoma beta ou a proteína Pros beta 2; um β-coat0mero de inseto da vesícula de COPI, o Y—coatômero da vesícula de COPI, a proteína β' — coatômero ou o Z—coatômero da vesícula de COPI; uma proteína tetraspanina 2 A de inseto que é uma suposta proteína de domínio transmembranar; uma proteína de inseto que pertence à família da actina como actina 5C; uma proteína ubiquitina—5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase envolvido no transporte intracelular de proteína; uma proteína Crinkled de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida na atividade motora; uma proteína “Crooked neck” de inseto que está envolvida na regulação do splicing alternativo nuclear de mRNA; uma proteína da subunidade G da H+-ATPase vacuolar de inseto e uma Tbp-1 de inseto, como a proteína de ligação a Tat. As publicações de pedido de patente US 2012/029750, US 20120297501, e 2012/0322660 descrevem ácidos ribonucleicos de interferência (RNA ou RNA dupla-fita) que funcionam mediante captação por uma espécie de praga de inseto para regular negativamente a expressão de um gene-alvo na dita praga de inseto, sendo que o RNA compreende pelo menos um elemento silenciador, em que o elemento silenciador é uma região de RNA dupla fita compreendendo fitas complementares aneladas, uma destas fitas compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos que é ao menos parcialmente complementar a uma sequência-alvo de nucleotídeos dentro do gene-alvo. A publicação do pedido de patente US 2012/0164205 descreve alvos potenciais para os ácidos ribonucleicos de fita dupla de interferência para inibir pragas de invertebrados incluindo: uma sequência homóloga Chd3, uma sequência homóloga de beta-tubulina, uma sequência homóloga de V-ATPase de 40 kDa, uma sequência homóloga de EF1α, uma sequência homóloga da subunidade p28 do proteassoma 26S p28, uma sequência homóloga da epóxido hidrolase do hormônio juvenil, uma sequência homóloga da proteína de canal de cloreto dependente de inchaço, uma sequência homóloga da proteína glicose-6-fosfato 1-desidrogenase, uma sequência homóloga da proteína Act42A, uma sequência homóloga do fator de ribosilação de ADP 1, uma sequência homóloga da proteína do fator de transcrição IIB, sequências homólogas da quitinase, uma sequência homóloga da enzima conjugadora de ubiquitina, uma sequência homóloga da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma sequência homóloga da ubiquitina B, um homólogo da hormônio esterase juvenil e uma sequência homóloga de alfa tubulina. A publicação do pedido de patente US 2009/0192117 descreve a supressão de polinucleotídeos-alvo de Lygus. Uso em controle pesticida
[0341] Métodos gerais para empregar cepas que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos das modalidades ou uma variante das mesmas, no controle pesticida ou na manipulação de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, a patente US n° 5.039.523 e EP 0480762A2.
[0342] Os micro-organismos hospedeiros que são conhecidos por ocupar a “fitoesfera” (filoplano, filoesfera, rizoesfera e/ou rizoplano) de um ou mais cultivos de interesse podem ser selecionados. Esses micro-organismos são selecionados de modo a serem capazes de, no ambiente específico, competir com sucesso contra os micro-organismos do tipo selvagem, proporcionar manutenção e expressão estável do gene que expressa o polipeptídeo PIP-72 e, desejavelmente, proporcionam proteção melhorada do pesticida contra a degradação e inativação ambiental.
[0343] Esses micro-organismos incluem bactérias, algas e fungos. São de particular interesse os microrganismos como bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes, fungos, particularmente levedura, por exemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium. São de interesse particular as espécies bacterianas da fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli e Azotobacter vinelandii, espécies de leveduras da fitosfera, como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, e Aureobasidium pollulans. De interesse particular são os micro-organismos pigmentados. Os organismos hospedeiros de interesse particular incluem leveduras como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (como S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., organismos do filoplano, como Pseudomonas spp. (como P. aeruginosa, P. fluorescens, P. chlororaphis), Erwinia spp., e Flavobacterium spp., e outros organismos, incluindo Agrobacterium tumefaciens, E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus e similares.
[0344] Os genes que codificam os polipeptídeos PIP-72 das modalidades podem ser introduzidos em micro-organismos que se multiplicam em plantas (epífitas) para liberar polipeptídeos PIP-72 em pragas alvo potenciais. As epífitas, por exemplo, podem ser bactérias gram-positivas ou gram-negativas.
[0345] Bactérias colonizadoras de raiz, por exemplo, podem ser isoladas a partir da planta de interesse por métodos conhecidos na técnica. Especificamente, uma cepa de Bacillus cereus que coloniza raízes pode ser isolada a partir de raízes de uma planta (consultar, por exemplo, Handelsman et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Os genes que codificam os polipeptídeos PIP-72 das modalidades podem ser introduzidos em um Bacillus cereus colonizador de raiz por métodos padrão conhecidos na técnica.
[0346] Os genes que codificam polipeptídeos PIP-72 podem ser introduzidos, por exemplo, no Bacillus colonizador de raiz por meio de eletrotransformação. Especificamente, os genes que codificam os polipeptídeos PIP-72 podem ser clonados em um vetor transportador (shuttle), por exemplo, pHT3101 (Lerecius et al., (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218. O vetor transportador (shuttle) pHT3101 que contém a sequência codificadora o gene do polipeptídeo PIP-72 específico pode ser, por exemplo, transformado no Bacillus colonizador de raiz por meio de eletroporação (Lerecius, et al., (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218).
[0347] Sistemas de expressão podem ser desenhados de modo que os polipeptídeos PIP-72 sejam secretados para fora do citoplasma das bactérias gram-negativas, como E. coli, por exemplo. As vantagens de ter os polipeptídeos PIP-72 secretados são: (1) evitar efeitos citotóxicos potenciais do polipeptídeo PIP-72 expressado; e (2) aprimorar a eficácia da purificação do polipeptídeo PIP-72, incluindo, mas não se limitando a, eficiência aumentada na recuperação e purificação da proteína por volume de caldo de célula e tempo e/ou custos diminuídos de recuperação e purificação por unidade de proteína.
[0348] Os polipeptídeos PIP-72 podem ser produzidos para serem secretados em E. coli, por exemplo, pela fusão de um peptídeo sinal adequado de E. coli, com a extremidade amino-terminal do polipeptídeo PIP-72. Os peptídeos sinal reconhecidos por E. coli podem ser encontrados em proteínas já conhecidas por serem secretadas em E. coli, por exemplo, a proteína OmpA (Ghrayeb, et al., (1984) EMBO J, 3:2437-2442). A OmpA é uma proteína principal da membrana externa de E. coli e, portanto, seu peptídeo sinal é considerado eficiente no processo de translocação. Além disso, o peptídeo sinal OmpA não precisa ser modificado antes do processamento como pode ser o caso de outros peptídeos sinal, por exemplo, o peptídeo sinal de lipoproteína (Duffaud, et al., (1987) Meth. Enzymol. 153:492).
[0349] Os polipeptídeos PIP-72 das modalidades podem ser fermentados em um hospedeiro bacteriano, e as bactérias resultantes são processadas e usadas como uma aspersão microbiana da mesma maneira que as cepas de Bt foram usadas como aspersões inseticidas. No caso de um polipeptídeo(s) de PIP-72 que é secretado de Bacillus, o sinal de secreção é removido ou mutado com o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Essas mutações e/ou deleções evitam a secreção do(s) polipeptídeo(s) de PIP-72 no meio de crescimento durante o processo de fermentação. Os polipeptídeos PIP-72 são retidos no interior da célula, e as células são, então, processadas para produzir os polipeptídeos PIP-72 encapsulados. Qualquer micro-organismo adequado pode ser usado para esse propósito. Pseudomonas tem sido usada para expressar toxinas Bt como proteínas encapsuladas e as células resultantes processadas e pulverizadas como um inseticida (Gaertner, et al., (1993), em: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).
[0350] Alternativamente, os polipeptídeos PIP-72 são produzidos pela introdução de um gene heterólogo dentro de um hospedeiro celular. A expressão de genes heterólogos resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Essas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da(s) praga(s) alvo. O produto resultante mantém a toxicidade da toxina. Esses polipeptídeos PIP-72 naturalmente encapsulados podem ser, então, formulados de acordo com as técnicas convencionais para aplicação ao ambiente, que abriga uma praga-alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas. Consulte, por exemplo EPA 0192319, e as referências ali citadas. Composições pesticidas
[0351] Em algumas modalidades, os ingredientes ativos podem ser aplicados sob a forma de composições e podem ser aplicados à área de cultivo ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de ervas daninhas, Crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polímeros e/ou formulações veículos para liberação temporizada ou biodegradáveis que permitem administração em longo prazo de uma área-alvo após uma única aplicação da formulação. Eles também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas ou misturas de várias destas preparações, se for desejado, junto com outros veículos agricolamente aceitáveis, tensoativos ou adjuvantes promotores de aplicação comumente empregados na técnica de formulação. Os veículos e os adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos, e correspondem às substâncias comumente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. De modo semelhante, as formulações podem ser preparadas como “iscas” comestíveis ou formadas como “armadilhas” para as pragas para permitir alimentação ou ingestão da formulação pesticida por uma praga-alvo.
[0352] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição agroquímica que contém pelo menos um dos polipeptídeos PIP-72 produzidos pelas cepas bacterianas incluem aplicação sobre a folha, revestimento de semente e aplicação sobre o solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.
[0353] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide, solução ou similares, e pode ser preparada por meios convencionais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo. Em todas essas composições que contêm pelo menos um destes polipeptídeos pesticidas, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99%, em peso.
[0354] Pragas de lepidópteros, dípteros, heterópteros, nematódeos, hemípteros ou coleópteros podem ser exterminadas ou ter seus números reduzidos em uma dada área pelos métodos da descrição ou podem ser aplicadas profilaticamente a uma área do ambiente para evitar infestação por uma praga suscetível. De preferência, a praga ingere ou é colocada em contato com uma quantidade eficaz como pesticida do polipeptídeo. “Quantidade pesticidamente eficaz”, como usado aqui, refere-se a uma quantidade do pesticida que é capaz de levar à morte pelo menos uma praga ou reduzir de maneira perceptível o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal da praga. Esta quantidade irá variar dependendo de fatores como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente, o local, a planta, a cultura ou o sítio agrícola específico a ser tratado, as condições ambientais e o método, a taxa, a concentração, a estabilidade, e a quantidade de aplicação da composição de polipeptídeo pesticidamente eficaz. As formulações podem, também, variar com relação às condições climáticas, considerações ambientais, e/ou frequência de aplicação e/ou severidade da infestação da praga.
[0355] As composições pesticidas descritas podem ser produzidas pela formulação da célula bacteriana, Cristal e/ou suspensão de esporos ou componente de proteína isolado com o veículo desejado agricolamente aceitável. As composições podem ser formuladas antes da administração em um meio adequado, tal como liofilizadas, secas por congelamento, dessecadas ou em um veículo aquoso, meio ou diluente adequado, como solução salina ou outro tampão. As composições formuladas podem estar sob a forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões óleo/água ou como um pó umedecível ou em combinação com qualquer outro material carreador adequado para aplicação agrícola. Os veículos agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo “veículo agricolamente aceitável” abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, acentuadores de pegajosidade, aglutinantes, etc. que são comumente usados na tecnologia de formulação de pesticidas; estes são bem conhecidos dos versados na formulação de pesticidas. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, através da mistura, combinação e/ou trituração homogênea da composição pesticida com adjuvantes adequados usando-se técnicas de formulação convencionais. As formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na patente US n° 6.468.523, aqui incorporada por referência. As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, inclusive um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. As composições químicas exemplificadoras incluem: Herbicidas para frutas/vegetais: Atrazina, Bromacila, Diurom, Glifosato, Linurom, Metribuzin, Simazina, Trifluralim, Fluazifope, Glufosinato, Halo sulfurom Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacila, Halosulfurom, Indaziflam; Inseticidas para frutas/vegetais: Aldicarbe, Bacillus thuriengiensis, Carbarila, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda- cialotrina, Acequinocila, Bifenazato, Metoxofenozideo, Novaluron, Cromafenozideo, Tiacloprida, Dinotefuram, Fluacripirima, Tolfenpirade, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifen, Espinosade, Rinaxipir, Ciazipir, Espinoteram, Triflumurom, Espirotetramato, Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarbe, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofen, Cianopirafen, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxame, Espinotoram, Tiodicarbe, Flonicamide, Metiocarbe, Benzoato de emamectina, Indoxacarbe, Fortiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Óxido de fenbutatina, Hextiazox, Metomil, 4-[[(6-clorpiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; Fungicidas para frutas/vegetais: Carbendazima, clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato-metila, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluaziname, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim-metila, Metalaxil/mefenoxame, Trifloxistrobina, Etaboxame, Iprovalicarbe, Trifloxistrobina, Fenexamida, Fumarato de oxpoconazol, Ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas para cereais: Isoproturom, Bromoxinila, Ioxinila, Fenóxis, Clorsulfurom, Clodinafope, Diclofope, Diflufenican, Fenoxaprope, Florasulam, Fluoroxipir, Metsulfurom, Triassulfurom, Flucarbazona, Iodosulfurom, Propoxicarbazona, Picolinafeno, Mesosulfurom, Beflubutamide, Pinoxaden, Amidosulfurom, Tifensulfurom metila, Tribenurom, Flupirsulfurom, Sulfosulfurom, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxasulfo.; Fungicidas para cereais: Carbendazima, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorfe, Epoxiconazol, Cresoxim-metila, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Inseticidas para cereais: Dimetoato, Lambda- cialtrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinotefuram, Clorfirifos, Metamidofos, Oxidemeton-metila, Pirimicarbe, Metiocarbe; Herbicidas para milho: Atrazina, Alaclor, Bromoxinila, Acetoclor, Dicamba, Clopiralida, (S-) Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolaclor, Mesotriona, Nicosulfurom, Primisulfurom, Rimsulfurom, Sulcotriona, Foransulfurom, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfom; Inseticidas para milho: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumurom, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenurom, Triflumorom, Teflutrina,Tebupirinfos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinotefuram, Avermectina, Metiocarbe, Espirodiclofeno, Espirotetramato; Fungicidas para milho: Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas para arroz: Butaclor, Propanila, Azimsulfurom, Bensulfurom, Cialofope, Daimurom, Fentrazamida, Imazosulfurom, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfurom, Piributicarbe, Quinclorac, Tiobencarbe, Indanofane, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfurom, Oxaziclomefona, Benzobiciclom, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribaco, Oxadiargil, Etoxisulfurom, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprope, Pirimisulfam; Inseticidas para arroz: Diazinom, Fenitrotiom, Fenobucarbe, Monocrotofos, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefuram, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarbe, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefuram, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Emamectina-benzoato, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-clorpiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Carbofuran, Benfuracarbe; Fungicidas para arroz: Tiofanato-metila, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicurom, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas para algodão : Diurom, Fluometurom, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodima, Fluazifope-butila, Glifosato, Norflurazom, Pendimetalina, Piritiobaco-sódico, Trifloxisulfurom, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazurom; Inseticidas para algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de emamectina, Imidacloprida, Indoxacarbe, Lambda-Cialotrina, Espinosade, Tiodicarbe, Gama- Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalila, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumurom, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramato, Clotianidina, Tiametoxame, Tiacloprida, Dinetofuran, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Gama Cialotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, tiodicarbe, Avermectina, Flonicamida, Piridalila, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endosulfam; Fungicidas para algodão: Etridiazol, Metalaxila, Quintozeno; Herbicidas para feijão- soj a: Alaclor, Bentazona, Trifluralin, Clorimuron-etila, Cloransulam-metila, Fenoxaprope, Fomesafeno, Fluazifope, Glifosato, Imazamox, Imazaquina, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas para feijão-soja: Lambda-cialotrina, Metomila, Paration, Tiocarbe, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofuran, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, benzoato de emamectina, Fipronila, Etiprol, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda cialotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramate, Espinodiclofeno, Triflumurom, Flonicamida, Tiodicarbe, beta- Ciflutrina; Fungicidas para feijão-soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas para beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifame, Etofumesato, Fenmedifame, Trialato, Clopiralida, Fluazifope, Lenacila, Metamitrom, Quinmerac, Cicloxidima, Triflusulfurom, Tepraloxidim, Quizalofope; Inseticidas para beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxame, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinotefuram, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas para canola: Clopiralide, Diclofope, Fluazifope, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfurom, Quinmeraco, Quizalofope, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas para canola: Azoxistrobina, Carbendazima, Fludioxonila, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas para canola : organofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofuran, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosade, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-clorpiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.
[0356] Em algumas modalidades, o herbicida é Atrazina, Bromacila, Diurom, Clorsulfurom, Metsulfuron, Tifensulfuron metila, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutol, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Pritiobaco-sódico, Flumioxazina, Clorimuron-etila, Metribuzina, Quizalofope, S-metolaclor, Hexazina ou suas combinações.
[0357] Em algumas modalidades, o inseticida é Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomila, Indoxacarbe, Oxamil ou suas combinações.
[0358] Em algumas modalidades, o herbicida é um inibidor da homogentisato solanesil transferase (HST) e/ou inibidor da hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD) da publicação de pedido de patente US2011173718. Atividade pesticida e inseticida
[0359] “Praga” inclui, mas não se limita a, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e similares. Os insetos-praga incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Himenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Coleoptera.
[0360] Os versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos das modalidades exibem atividade contra pragas de insetos, que podem incluir importantes pragas agrícolas, de florestas, estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, saúde pública e animal, estruturas comercial e doméstica, residências e produtos armazenados economicamente importantes.
[0361] As larvas da ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, lagartas-do-cartucho, lagartas-rosca, gafanhotos, e heliotinas na família Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-do-cartucho do outono); S. exigua Hübner (lagarta-do- cartucho da beterraba); S. litura Fabricius (broca-do-tabaco, lagarta-de-cacho); Mamestra configurata Walker (lagarta-do- cartucho bertha); M. brassicae Linnaeus (lagarta-do-repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterranea Fabricius (lagarta granular); Alabama argillacea Hübner (curuquerê); Trichoplusia ni Hübner (larva-do-repolho); Pseudoplusia includens Walker (lagarta falsa-medideira); Anticarsia gemmatalis Hübner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (lagarta desfolhadora); Heliothis virescens Fabricius (lagarta-do- tabaco); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-do-cartucho); Athetis mindara Barnes e McDunnough (lagarta de pele rugosa); Euxoa messoria Harris (mariposa); Earias insulana Boisduval (lagarta boisduval); E. vittella Fabricius (lagarta-pintada); Helicoverpa armigera Hübner (lagarta americana); H. zea Boddie (lagarta-da-espiga do milho ou lagarta-da-maçã-do-algodoeiro); Melanchra picta Harris (lagarta-zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (minador-dos-citros); brocas, ecatotecas, larva de teias, lagarta-cone e esqueletonizantes da família Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (broca europeia do milho); Amyelois transitella Walker (lagarta laranja); Anagasta kuehniella Zeller (lagarta-da-farinha do mediterrâneo); Cadra cautella Walker (lagarta-da-amêndoa); Chilo suppressalis Walker (broca-de-colo); Chilo partellus, (broca-do-milho); Corcyra cephalonica Stainton (lagarta-do-arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta-da- raiz do milho); C. teterrellus Zincken (lagarta-das-gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (lagartas enroladeiras do arroz); Desmia funeralis Hübner (mosca-da-folha da uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (broca-do-melão); D. nitidalis Stoll (broca-das-curcubitáceas); Diatraea grandiosella Dyar (broca-do-milho do sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca- da-cana-de-açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca mexicana do arroz); Ephestia elutella Hübner (lagarta-do-tabaco (cacau)); Galleria mellonella Linnaeus (traça-da-cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (traça); Homoeosoma electellum Hulst (lagarta-do-girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (lagarta elasmo); Achroia grisella Fabricius (traça pequena da cera); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta-da-beterraba); Orthaga thyrisalisWalker (traça-do-chá); Maruca testulalis Geyer (broca- da-vagem do feijão); Plodia interpunctella Hübner (traça-dos- cereais); Scirpophaga incertulas Walker (broca-do-colmo); Udea rubigalis Guenée (traça-tortricidae-do-aipo); e traças tortrix, lagartas, lagartas de sementes e lagartas de frutas da família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (larva-cabeça-negra-do- oeste); A. variana Fernald (larva-cabeça-negra-do-leste); Archips argyrospila Walker (lagarta-enroladeira de árvores frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta-enroladeira europeia); e outras espécies de Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (mariposa tortrix de fruta de verão); Cochylis hospes Walsingham (traça-do-girassol listrada); Cydia latiferreana Walsingham (verme-do-chá); C. pomonella Linnaeus (traça-da-maçã); Platynota flavedana Clemens (lagarta- enroladeira multicor); P. stultana Walsingham (lagarta- enroladeira onívora); Lobesia botrana Denis Schiffermülle (traça-da-uva); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller (traça acama); Endopiza viteana Clemens (traça dos cachos); Eupoecilia ambiguella Hubner (traça-da-vinha); Bonagota salubricola Meyrick (lagarta-enroladeira); Grapholita molesta Busck (mariposa oriental); Suleima helianthana Riley (traça do botão do girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.
[0362] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, Alsophila pometaria Harris (anarsia-do-pessegueiro); Anarsia lineatella Zeller (broca-do-pessegueiro); Anisota senatoria J.E. Smith (larva de listra laranja); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (bicho-da- seda do carvalho chinês); Bombyx mori Linnaeus (bicho-da- seda); Bucculatrix thurberiella Busck (minador-das-folhas de algodão); Colias eurytheme Boisduval (lagarta-da-alfafa); Datana integerrima Grote Robinson (broca-da-noz); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (bicho-da-seda siberiano), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta-do-olmo); Erannis tiliaria Harris (larva-da-tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (portésia); Harrisina americana Guérin-Méneville (lagarta-da-folha- da- uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de pasto); Hyphantria cunea Drury (larvas das teia do outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (minador-do-tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (larva geometrídea da cicuta oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (larva geometrídea da cicuta ocidental); Leucoma salicis Linnaeus (traça de cetim branco); Lymantria dispar Linnaeus (mariposa cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa beija-flor, mariposa-do- tomate); M. sexta Haworth (larva-de-chifre-do-tomate, larva- de-chifre-do-fumo; Operophtera brumata Linnaeus (mariposa do inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta da primavera); Papilio cresphontes Cramer (borboleta papilionídea gigante); Phryganidia californica Packard (mariposa do carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (minador de folha cítrica); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador de folha tentiforme pintado); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta branca da couve grande); P. rapae Linnaeus (borboleta branca da couve pequena); P. napi Linnaeus (borboleta branca raiada); Platyptilia carduidactyla Riley (traça pluma da alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (traça-das-crucíferas); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta rosada); Pontia protodice Boisduval e Leconte (verme- do-repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta onívora); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta vermelha corcunda); Sitotroga cerealella Olivier (traça-dos-cereais); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta processionária); Tineola bisselliella Hummel (traça-das- roupas); Tuta absoluta Meyrick (bicho-mineiro de tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (traça-do-arminho); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.
[0363] De interesse são as larvas e adultos da ordem Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae, e Curculionidae (incluindo, mas não se limitando a: Anthonomus grandis Boheman (bicudo-do-algodoeiro); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (bicheira-da-raiz-norte- americana); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho granário); S. oryzae Linnaeus (gorgulho-do-arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho-da-folha-do-alho); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho-do- caule-do-girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho da semente de girassol vermelho); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sphenophorus maidis Chittenden (broca-do-milho); pulgões, besouro do pepino, crisomelídeos, besouros de folha, besouros da batata e minadores de folhas da família Chrysomelidae (incluindo, mas não se limitando a: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro-da-batata do Colorado); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (verme da raiz do milho ocidental); D. barberi Smith e Lawrence (crisomelídeo do sistema radicular do milho setentrional); D. undecimpunctata howardi Barber (verme da raiz do milho meridional); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (pulgão do milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro- saltador das crucíferas); Phyllotreta striolata (besouro- saltador listrado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis de videira); Oulema melanopus Linnaeus (pulgão da folha de cereal); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro-do- girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas não se limitando a: Epilachna varivestis Mulsant (besouro-do- feijão mexicano)); joaninhas e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, mas não se limitando a: Popillia japonica Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (besouro mascarado do norte, larva branca); C. immaculata Olivier (besouro mascarado do sul, larva branca); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (joaninha europeia); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro- da-cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; brocas da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; joaninhas e outros besouros da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.
[0364] Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo mineradores de folha Agromyza parvicornis Loew (minerador-da-folha do milho); pequenas moscas (incluindo, mas não se limitando a: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol); moscas de fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas de fruta); larvas de insetos(incluindo, mas não se limitando a: Delia platura Meigen (larva da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outro Delia spp., Meromyza americana Fitch (larva do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas dométicas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (mosca doméstica); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas de estábulo); moscas de face, moscas de chifre, moscas varejeiras, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outros insetos-praga moscoides, moscas de cavalo Tabanus spp.; gastrófilas Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de gado Hypoderma spp.; moscas de cervídeos Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outros Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; borrachudos Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos-pólvora mordentes, flebotomíneos, esciarídeos e outros Nematocera.
[0365] Incluídos como insetos de interesse estão adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera como, mas não se limitando a, adelgídeos da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cigarras da família Cicadidae, gafanhotos- folha (leafhoppers), Empoasca spp.; da família Cicadellidae, cigarrinhas (planthoppers) das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, soldadinhos (treehoppers) da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, filoxera da família Phylloxeridae, cochonilhas-farinhentas da família Pseudococcidae, cochonilhasdas famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae, Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejos-rendados da família Tingidae, percevejos-fedorentos da família Pentatomidae, percevejo das gramíneas, Blissus spp.; e outros percevejos de sementes da família Lygaeidae, cigarrinhas-da-espuma da família Cercopidae percevejos da família Coreidae, e percevejos vermelhos e manchadores de algodão da família Pyrrhocoridae.
[0366] Membros importantes do ponto de vista agronômico da ordem Homoptera incluem ainda, mas não se limitam a: Acyrthisiphon pisumHarris (pulgão-da-ervilha); Aphis craccivora Koch (pulgão de feijão-fradinho); A. fabae Scopoli (pulgão de feijão-preto); A. gossypii Glover (pulgão do algodoeiro, pulgão do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz do milho); A. pomi De Geer (afíeo de maçã); A. spiraecola Patch (pulgão de arbusto); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de dedaleira); Chaetosiphon fragaefoliiCockerell (pulgão do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo da maçã rosada); Eriosoma lanigerum Hausmann (pulgão de maçã lanígero); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgão-farinhento-da-ameixeira); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (pulgão do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Myzus persicae Sulzer (pulgão da batata-pêssego, pulgão do pêssego verde); Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgão da alface); Pemphigus spp. (pulgão de raiz e pulgões galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (pulgão da aveia); Schizaphis graminum Rondani (pulgão); Sipha flava Forbes (pulgão amarelo da cana-de- açúcar); Sitobion avenae Fabricius (pulgão inglês de grão); Therioaphis maculata Buckton (pulgão pintado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo negro de plantas cítricas) e T. citricida Kirkaldy (afídeo castanho de plantas cítricas); Melanaphis sacchari Zehntner (afídeo da cana de açúcar); Adelges spp.; Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de noz pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca branca do tabaco, mosca-branca da batata-doce); B. argentifolii Bellows Perring (mosca branca da folha prateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca branca cítrica); Trialeurodes abutiloneus (mosca branca) e T. vaporariorum Westwood (mosca branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (gafanhoto marrom pequeno); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha dos ásteres); Nephotettix cinticeps Uhler (gafanhoto verde); N. nigropictus Stâl (gafanhoto do arroz); Nilaparvata lugens Stâl (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cirgarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de dorso branco); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo de arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (gafanhoto branco da maçã); Erythroneoura spp. (gafanhoto da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchasi Maskell (colchonilha do algodão); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (cochonilha de São José); Planococcus citri Risso (colchonila de frutas cítricas); Pseudococcus spp. (outros complexos de cochonilhas); Cacopsylla pyricola Foerster (piolho de pereira); Trioza diospyri Ashmead (piolho de caquizeiro).
[0367] Espécies de interesse importantes do ponto de vista agronômico da ordem Hemiptera incluem, mas não se limitam a: Acrosternum hilare Say (percevejo); Anasa tristis De Geer (inseto de polpa); Blissus leucopterus leucopterus Say (percevejo comum); Corythuca gossypii Fabricius (percevejo do algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (percevejo do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo com uma pinta); Graptostethus spp. (complexo de percevejos de sementes); Leptoglossus corculus Say (percevejo da semente de pinheiro); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (inseto da planta manchado); L. Hesperus Knight (percevejo ocidental do algodoeiro); L. pratensis Linnaeus (percevejo comum); L. rugulipennis Poppius (percevejo europeu); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sudeste); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (percevejo grande asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga de algodão).
[0368] Além disso, as modalidades podem ser eficazes contra hemípteros, como, Calocoris norvegicus Gmelin (percevejo do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modesta Distant (percevejo do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca sugadora); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (mosca do espinheiro da Virgínia); Labopidicola allii Knight (percevejo da cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (inseto de planta rápido); Poecilocapsus lineatus Fabricius (inseto de planta de quatro listras); Nysius ericae Schilling (percevejo comum falso); Nysius raphanus Howard (percevejo comum falso); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sudeste); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.
[0369] Também são incluídos adultos e larvas da ordem Acari (ácaros) como Aceria tosichella Keifer (ácaro enrolado do trigo); Petrobia latens Muller (ácaro marrom do trigo); ácaros aranha e ácaros vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro aranha de duas pintas); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha do carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro-aranha do morango); ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de plantas cítricas); ácaros de ferrugem e de broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, ácaros da poeira na família Epidermoptidae, ácaros de folículo na família Demodicidae, ácaros de grão na família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato do cervo); I. holocyclus Neumann (carrapato australiano da paralisia); Dermacentor variabilis Say (carrapato americano do cão); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela solitário) ae ácaros que provocam feridas e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.
[0370] Insetos-pragas da ordem Thysanura são de interesse, como a Lepisma saccharina Linnaeus (bichinho-de-prata; traça-dos- livros); Thermobia domestica Packard (termóbia).
[0371] Pragas de artrópodos adicionais cobertos incluem: aranhas na ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha-marrom); e o Latrodectus mactans Fabricius (viúva-negra americana); e centípedes na ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).
[0372] As pragas de insetos de interesse incluem a superfamília de percevejos e outros insetos relacionados incluindo, mas não se limitando a, as espécies que pertencem à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, e Bagrada hilaris (percevejo pintado)), à família Plataspidae (Megacopta cribraria - besouro do feijão) e à família Cydnidae (Scaptocoris castanea - percevejo da raiz) e espécies de Lepidoptera incluindo, mas não se limitando a: lagarta-da-espiga do milho, por exemplo Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner.
[0373] Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol., 83:2.480 a 2.485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 e patente US n° 5.743.477, todas quais estão aqui incorporadas, por referência, em sua totalidade. De modo geral, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Consulte, por exemplo Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Esses ensaios podem incluir colocar as plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a capacidade da planta de sobreviver e/ou causar a morte das pragas.
[0374] Nematódeos incluem nematódeos parasitas como nematódeos de nó de raiz, cisto e lesões, inclusive Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos do cisto, incluindo, mas não se limitando a, Heterodera glycines (nematódeo do cisto da soja); Heterodera schachtii (nematódeo do cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo do cisto do cereal) e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeos do cisto da batata). Nematódeos de lesão incluem Pratylenchus spp.
Tratamento de semente
[0375] Para proteger e acentuar a produtividade da produção e as tecnologias de traços, as opções de tratamento de semente podem fornecer flexibilidade adicional ao plano de cultivo e controle de baixo custo contra insetos, plantas daninhas e doenças. O material de semente pode ser tratado, tipicamente, tratado na superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, protetores (safeners) de herbicida, inseticidas, fungicidas, inibidores e intensificadores de germinação, nutrientes, reguladores e ativadores do crescimento vegetal, bactericidas, nematicidas, avicidas e/ou moluscicidas. Esses compostos são tipicamente formulados junto com veículos, tensoativos ou adjuvantes promotores de aplicação adicionais usualmente empregados na técnica de formulação. Os revestimentos podem ser aplicados pela impregnação do material de propagação com uma formulação líquida ou pelo revestimento com uma formulação úmida ou seca combinada. Exemplos dos diversos tipos de compostos que podem ser usados como tratamentos de semente são fornecidos no documento The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., publicado por the British Crop Production Council, que está aqui incorporado, por referência.
[0376] Alguns tratamentos de semente que podem ser usados em semente para cultivo incluem, mas não se limitam a, um ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metila, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirilum, azadiraquitina, azoxistrobina, Bacillus spp. (incluindo um ou mais de cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis e/ou thuringiensis), bradyrhizobium spp. (incluindo um ou mais dentre betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi e/ou yuanmingense), captano, carboxina, quitosano, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazol, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobin, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteína harpina, imazalil, imidaclopride, ipconazol, isoflavenoides, lipo-quitooligossacarídeo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, miclobutanil, PCNB, penflufeno, penicílio, pentiopirad, permetrina, picoxistrobin, protioconazol, piraclostrobin, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxane, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, thiocarb, tiram, tolclofos-metila, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobin, triticonazol e/ou zinco. O revestimento das sementes PCNB se refere ao número registro EPA 00293500419, contendo quintozem e terrazol. TCMTB se refere a 2-(tiocianometiltio) benzotiazol.
[0377] As variedades de semente e sementes com características transgênicas específicas podem ser testadas para determinar quais opções de tratamento de semente e quais frequências de aplicação podem complementar estas variedades e traços transgênicos de modo a melhorar a produtividade. Por exemplo, uma variedade com bom potencial de produtividade, mas suscetibilidade a carvão do pendão (head smut) pode se beneficiar do uso de um tratamento de semente que fornece proteção contra a carvão do pendão, uma variedade com bom potencial de produtividade, mas com suscetibilidade ao nematódeo do cisto pode se beneficiar do uso de um tratamento de semente que fornece proteção contra nematódeo do cisto, e assim por diante. De modo semelhante, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a insetos pode se beneficiar do segundo modo de ação conferido pelo tratamento de semente, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a herbicidas pode se beneficiar de um tratamento de semente com um protetor (safener) que intensifica a resistência das plantas àquele herbicida, etc. Adicionalmente, o bom estabelecimento da raiz e a emergência precoce que resultam do uso adequado de um tratamento de semente podem resultar em uso mais eficaz do nitrogênio, uma melhor capacidade de suportar a seca e um aumento geral no potencial de produtividade de uma variedade ou variedades contendo um determinado traço, quando combinado com um tratamento de semente. Métodos para matar uma praga de inseto e controlar uma população de insetos
[0378] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos exterminar uma praga de inseto que compreende colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo PIP-72 recombinante. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para matar uma praga de inseto, que compreendem colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína pesticida recombinante da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 ou SEQ ID NO: 852 ou uma variante das mesmas.
[0379] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de praga de inseto que compreende colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo PIP-72 isolado. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de inseto, compreendendo colocar a população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína pesticida recombinante da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 ou SEQ ID NO: 852 ou uma variante das mesmas. Como usado aqui, “controlar uma população de pragas” ou “controla uma praga” se refere a qualquer efeito sobre uma praga que resulte na limitação da lesão causada pela praga. O controle de uma praga inclui, mas não se limita a, extermínio da praga, inibição do desenvolvimento da praga, alteração da fertilidade ou do crescimento da praga de forma tal que a praga cause menos dano à planta, redução do número de descendentes produzidos, produção de pragas menos aptas, produção de pragas mais suscetíveis ao ataque de predadores ou impedimento das pragas de comerem a planta.
[0380] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de praga de inseto resistente a uma proteína pesticida que compreende colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo PIP-72 recombinante. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de inseto resistente a uma proteína pesticida, compreendendo colocar a população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína pesticida recombinante da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 ou SEQ ID NO: 852 ou uma variante das mesmas.
[0381] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para proteger uma planta contra uma praga de inseto que compreende expressar, na planta ou célula da mesma, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo PIP-72. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para proteger uma planta de uma praga de inseto, que compreendem expressar na planta ou sua célula, um polinucleotídeo recombinante que codifica a proteína pesticida da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 ou SEQ ID NO: 852 ou suas variantes.
[0382] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para matar uma praga de inseto, que compreendem colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo recombinante da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ I NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948 ou uma variante das mesmas.
[0383] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de inseto, compreendendo colocar a população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz de um polipeptídeo recombinante da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ I NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948 ou uma variante das mesmas. Como usado aqui, “controlar uma população de pragas” ou “controla uma praga” se refere a qualquer efeito sobre uma praga que resulte na limitação da lesão causada pela praga. O controle de uma praga inclui, mas não se limita a, extermínio da praga, inibição do desenvolvimento da praga, alteração da fertilidade ou do crescimento da praga de forma tal que a praga cause menos dano à planta, redução do número de descendentes produzidos, produção de pragas menos aptas, produção de pragas mais suscetíveis ao ataque de predadores ou impedimento das pragas de comerem a planta.
[0384] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de inseto resistente a uma proteína pesticida, compreendendo colocar a população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz de um polipeptídeo recombinante da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ I NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948 ou uma variante das mesmas.
[0385] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para proteger uma planta de uma praga de inseto, que compreendem expressar, na planta ou célula da mesma, um polinucleotídeo recombinante que codifica a proteína pesticida da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ I NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 947 ou SEQ ID NO: 948 ou suas variantes. Estratégias de manejo da resistência de insetos (IRM)
[0386] A expressão de δ-endotoxinas de B. thuringiensis em plantas de milho transgênicas se mostrou uma forma eficaz de controlar praga de insetos agricolamente importantes (Perlak, et al., 1990; 1993). Entretanto, insetos resistentes às δ- endotoxinas de B. thuringiensis expressos em plantas transgênicas evoluíram. Essa resistência, caso se torne amplamente distribuída, claramente limitaria o valor comercial do germoplasma contendo genes que codificam essas δ- endotoxinas de B. thuringiensis.
[0387] Uma forma de aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir simultaneamente o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é fornecer refúgios (ou seja, uma seção de culturas agrícolas/milho não- inseticidas) não-transgênicos (isto é, proteína não- inseticida) para uso com culturas agrícolas transgênicas, produzindo uma única proteína inseticida ativa contra as pragas-alvo. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (United States Environmental Protection Agency)) (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm, que pode ser acessada usando o prefixo “www”) publica as exigências para uso com culturas agrícolas transgênicas que produzem uma única proteína de Bt ativa contra pragas-alvo. Além disso, a Associação Nacional de Produtores de Milho (National Corn Growers Association), no seu site da internet: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn, que pode ser acessada usando o prefixo “www”) também fornece orientações similares com relação às exigências do refúgio. Devido a perdas para insetos dentro da área de refúgio, refúgios maiores podem reduzir a produtividade total.
[0388] Uma forma de aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir simultaneamente o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas seria ter um repositório de genes inseticidas eficazes contra grupos de pragas de inseto e que manifestam seus efeitos através de diferentes modos de ação.
[0389] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de insetos, cada inseticida sendo expresso em níveis eficazes, seria uma outra forma de alcançar o controle do desenvolvimento da resistência. Isto se baseia no princípio de que a evolução de resistência contra dois modos de ação separados é muito mais improvável do que apenas um. Roush, por exemplo, descreve estratégias de duas toxinas, também chamadas de “piramidação” ou “empilhamento,” para o manejo de culturas agrícolas inseticidas transgênicas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777-1786). O empilhamento ou piramidação de duas proteínas diferentes, cada uma sendo eficaz contra as pestes-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir o uso de um refúgio menor. A US Environmental Protection Agency exige que significativamente menos (geralmente 5%) refúgio estruturado de milho não-Bt seja plantado do que para produtos com traços únicos (geralmente 20%). Há várias formas de fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, inclusive vários padrões geométricos de plantio nos campos e misturas de semente embaladas, como discutido adicionalmente por Roush.
[0390] Em algumas modalidades, os polipeptídeos PIP-72 da revelação são úteis como uma estratégia de manejo de resistência a inseto em combinação (isto é, em forma de pirâmide) com outras proteínas pesticidas incluem, mas não se limitam a, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp., e similares.
[0391] São fornecidos métodos para controlar infestação(ões) de insetos Lepidoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgênica, os quais promovem manejo da resistência a insetos, compreendendo expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que tem diferentes modos de ação.
[0392] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de insetos de Lepidoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgênica e que promovem o gerenciamento de resistência a inseto, em que pelo menos uma das proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo de PIP-72 inseticida contra insetos na ordem Lepidoptera e/ou Coleoptera.
[0393] Em algumas modalidades, nos métodos para controlar infestação de insetos Lepidoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgênica e promover manejo da resistência a insetos, a pelo menos uma das proteínas inseticidas compreende uma proteína da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 ou suas variantes, inseticida para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Coleoptera.
[0394] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de insetos de Lepidoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgênica e que promovem o gerenciamento de resistência a inseto compreendem expressar na planta transgênica um polipeptídeo de PIP-72 e uma proteína Cry inseticida contra insetos na ordem Lepidoptera e/ou Hemiptera que tem diferentes modos de ação.
[0395] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infestação de insetos Lepidoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgênica e promover manejo da resistência a insetos compreendem na planta transgênica, uma proteína da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 ou suas variantes e uma proteína Cry inseticida para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Coleoptera que tem diferentes modos de ação.
[0396] Também são fornecidos métodos de redução de probabilidade de surgimento de resistência a inseto de Lepidoptera e/ou Coleoptera em plantas transgênicas que expressam, nas plantas, proteínas inseticidas para controlar a espécie de inseto, que compreendem a expressão de um polipeptídeo de PIP-72 inseticida à espécie de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida à espécie de inseto que tem diferentes modos de ação.
[0397] Também são fornecidos métodos para reduzir a probabilidade de emergência de resistência a insetos Lepidoptera e/ou Coleoptera em plantas transgênicas, expressando nas plantas proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto, compreendendo a expressão de uma proteína da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 ou suas variantes, inseticida para as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto, tendo diferente modos de ação.
[0398] Também são fornecidos meios para gerenciamento eficaz de resistência a inseto de Lepidoptera e/ou Coleoptera de plantas transgênicas que compreendem coexpressar, a altos níveis em plantas transgênicas, duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas a insetos de Lepidoptera e/ou Coleoptera, mas que cada uma exibe um modo diferente de efetuação de sua atividade de extermínio, em que duas ou mais proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo de PIP-72 e uma proteína Cry. Também são fornecidos meios para o manejo eficaz da resistência a insetos Lepidoptera e/ou Coleoptera de plantas transgênicas, compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidoptera e/ou Coleoptera, mas cada uma exibindo um modo diferente de efetuar esta atividade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas inseticidas compreendem uma proteína da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 768, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 852, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 903 - SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945 ou SEQ ID NO: 946 ou suas variantes e uma proteína Cry.
[0399] Além disso, são fornecidos métodos para obter aprovação regulamentar para plantar ou comercializar plantas que expressam proteínas inseticidas contra insetos na ordem Lepidoptera e/ou Coleoptera que compreendem a etapa de fazer referência, submeter-se ou depender de dados de ligação de ensaio de inseto que mostram que o polipeptídeo PIP-72 não compete com sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Além disso, são fornecidos métodos para a obtenção de aprovação regulatória para o plantio ou comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Coleoptera, compreendendo a etapa de fazer referência, submeter ou depender de dados de ligação de ensaios em insetos mostrando que a proteína da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 528 - SEQ ID NO: 7 68, qualquer uma dentre SEQ ID NO: 825 - SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772 ou SEQ ID NO: 852 ou sua variante não competir com os sítios de ligação pelas proteínas Cry nestes insetos. Métodos para aumentar a produtividade das plantas
[0400] Métodos para aumentar a produtividade das plantas são fornecidos. Os métodos compreendem fornecer uma planta ou célula vegetal que expressa um polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo pesticida aqui revelada e cultivar a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado com uma praga contra a qual o polipeptídeo tem atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros e nematódeos e o campo é infestado com uma praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros ou nematódeos.
[0401] Conforme definido aqui, a “produtividade” da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. “Biomassa”, como usado aqui, refere-se a qualquer produto vegetal medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoramento da produtividade do produto vegetal medido. O aumento da produtividade da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa da folha da planta pode aumentar a produtividade de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento da biomassa da folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados da planta. Um aumento na produtividade pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas não se limitando a pelo menos 1% de aumento, pelo menos 3% de aumento, pelo menos 5% de aumento, pelo menos 10% de aumento, pelo menos 20% de aumento, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 100% ou um mais aumento na produtividade em comparação a uma planta que não expressa a sequência pesticida.
[0402] Em métodos específicos, a produtividade da planta é aumentada como resultado de resistência melhorada a praga de uma planta que expressa um polipeptídeo PIP-72 revelado no presente documento. A expressão do polipeptídeo PIP-72 resulta em uma capacidade reduzida de uma praga infestar ou se alimentar da planta, melhorando, assim, a produtividade da planta. Métodos de processamento
[0403] São ainda fornecidos métodos para o processamento de uma planta, parte de planta ou semente para obter um alimento ou produto alimentício de uma planta, parte de planta ou semente que compreende um polipeptídeo PIP-72. As plantas, partes de planta ou sementes aqui fornecidas podem ser processadas para produzir óleo, produtos e/ou subprodutos de proteína que são derivados obtidos por processamento que têm valor comercial. Exemplos não limitadores incluem sementes transgênicas compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo PIP-72 que podem ser processadas para produzir óleo de soja, produtos de soja e/ou subprodutos de soja.
[0404] “Processamento” se refere a quaisquer métodos físicos e químicos usados para a obtenção de qualquer produto de soja e inclui, mas não se limita ao condicionamento por calor, laminação e trituração, extrusão, extração de solvente ou embebição aquosa e extração de sementes inteiras ou parciais.
[0405] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração, mas sem que isto constitua uma limitação. Experimentos Exemplo 1 - Identificação de uma proteína inseticida ativa contra a lagarta da raiz do milho ocidental (WCRM - Western Corn Root Worm) da cepa SS143D5
[0406] A proteína ativa PIP-72Aa de WCRW (Diabrotica virgifera virgifera) foi identificada por meio de purificação de proteína, espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS/MS) e clonagem por PCR de Pseudomonas chlororaphis, cepa SS143D5 da seguinte forma:
[0407] A atividade inseticida contra WCRW (Diabrotica virgifera virgifera) foi observada em um lisado celular de SS143D5 cultivado em meio de soja Trypticase (17 g/l de triptona, 3 g/l de digesto enzimático de farelo de soja, 2,5 g/l de dextrose, 5 g/l de cloreto de sódio, 2,5 g/l de K2HPO4) e cultivado de um dia para o outro a 26°C com agitação de 250 rpm. Essa atividade inseticida exibiu sensibilidade térmica e à proteinase que indica natureza proteinácea. Para extração de proteína, as células foram descongeladas e ressuspensas em tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5 (tampão A) contendo coquetel inibidor de protease V da Calbiochem. Foi obtido um lisado bruto submetido à limpeza mediante a passagem das células através de um homogeneizador a 207 MPa (30.000 psi), seguido de centrifugação a 13.800 x g por 20 minutos.
[0408] Os bioensaios em WCRW foram conduzidos usando as amostras do lisado celular de 10 microlitros misturadas com dieta fundida de WCRW de baixo teor de fusão (Southland Products Inc., Lake Village, Arkansas, EUA) em um formato de 96 poços. Neonatos de Diabrotica virgifera virgifera foram colocados em cada pocinho de uma placa de 96 poços. O ensaio foi feito por 4 dias a 25°C e, então, foi classificado para a mortalidade dos insetos e atrofia do crescimento do inseto. As pontuações foram de mortos, acentuadamente atrofiados, (pouco ou nenhum crescimento, mas ainda vivos), atrofiados (crescimento até o segundo instar, mas não equivalente ao dos controles) ou nenhuma atividade.
[0409] O DNA genômico da cepa SS143D5 foi extraído com um Kit de Extração de DNA Genômico Bacteriano Sigma-Aldrich® (n° de cat NA2110-KT, Sigma-Aldrich, Caixa Postal 14508, St Louis, MO, EUA 63178) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de DNA foi determinada com o uso de um Espectrofotômetro NanoDrop® (Thermo Scientific®, 3411 Silverside Road, Bancroft Building, Suite 100, Wilmington, DE, EUA 19810) e o DNA genômico foi diluído a 40 ng/ul com água estéril. 25 ul de reação por PCR a foi definida mediante a combinação de DNA genômico a 80 ng, 2 ul (5 uM) de iniciadores de DNA ribossômico 16S TACCTTGTTACGACTT (SEQ ID NO: 285) e AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (SEQ ID NO: 286), 1 ul de dNTP a 10 mM, 1x tampão Phusion® HF e 1 unidade de DNA polimerase de Alta Fidelidade Phusion® (New England Biolabs, no de cat M0530L, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723, EUA). A reação de PCR foi realizada em Termociclador PTC-200 MJ Research (Bio-Rad® Laboratories, Inc., 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, Califórnia, 94547, EUA) com o seguinte programa: 1 minuto a 96°C; 30 ciclos de 15 segundos a 96°C, 2 minutos a 52°C e 2 minutos a 72°C; 10 minutos a 72°C; e mantida a 4°C. Os produtos da PCR foram purificados com o Kit de purificação de DNA QiaQuick® (no de cat. 28104, QIAGEN® Inc., 27220 Turnberry Lane, Valência, CA 91355, EUA). A amostra de PCR purificada teve seu DNA sequenciado e a sequência de 16S de DNA ribossômico resultante foi pesquisada por BLAST contra a base de dados NCBI que indicou que SS143D5 é uma cepa de Pseudomonas chlororaphis. A cepa SS143D5 de Pseudomonas chlororaphis foi depositada em 7 de fevereiro de 2013 com o n° de acesso NRRL B-50810 junto à Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA (nrrl.ncaur.usda.gov, que pode ser acessado na internet usando o prefixo “www”).
[0410] O DNA genômico isolado da cepa SS143D5 também foi preparado de acordo com um protocolo de construção de biblioteca desenvolvido por Illumina e sequenciado com o uso do Genome Analyzer® Illumina® IIx (no de cat. SY-301-1301, Illumina Inc., 9885 Towne Center Drive, San Diego, CA92121, EUA). As sequências ácido nucleico contig foram montadas e os quadros abertos de leitura foram gerados.
[0411] O pélete celular de SS143D5 cultivado de um dia para o outro em caldo 2x YT a 26°C com agitação a 250 rpm foi lisado a ~138 MPa (~20.000 psi) após ressuspensão em tampão de acetato, pH 5. O lisado bruto foi purificado por centrifugação e carregado em uma coluna S-HP HiTrap™ (GE Healthcare, 800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855, EUA). A proteína ligada foi eluída com um gradiente de cloreto de sódio linear e fracionada. As frações contendo a proteína de interesse foram agrupadas e o tampão foi trocado para carregá- las em uma coluna MonoQ™ (GE Healthcare), com pH 8. PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) foi eluído com um gradiente de cloreto de sódio linear e após a confirmação da atividade, foi purificado adicionalmente por cromatografia com interação hidrofóbica. Para isso, a proteína foi ajustada para 0,8M de sulfato de amônio, carregada em uma coluna Butyl-HP HiTrap™ (GE Healthcare) e a proteína ativa foi recuperada na fração não ligada. A análise por SDS-PAGE mostrou uma banda única após a coloração com corante azul Coomassie™. A banda de proteína foi cortada, digerida com tripsina e analisada por espectrometria de massa em tandem por eletroporação/cromatografia nano- líquida (nano-LC/ESI-MS/MS) em um espectrômetro de massa Thermo Q Exactive™ Orbitrap™ (Thermo Fisher Scientific®, 81 Wyman Street, Waltham, MA 02454, EUA) que faz interface com um sistema de nano-lc Eksigent NanoLC 1-D Plus (AB Sciex™, 500 Old Connecticut Path, Framingham, MA 01701, EUA). Foram coletados dez espectros de íon de produto em um modo de captura dependente de informação após uma varredura de pesquisa MS1.
[0412] A identificação da proteína foi realizada por buscas no banco de dados Mascot® (Matrix Science, 10 Perrins Lane, London NW3 1QY, Reino Unido). A busca no banco de dados interno Bacteria-Plus, que combina todas as sequências de proteínas bacterianas e sequências de queratina derivadas do banco de dados não redundante NCBI (nr), assim como sequências de proteínas internas, identificaram um novo gene codificado pela cepa SS143D5, que foi designado PIP-72Aa (SEQ ID NO: 1). Exemplo 2 - Identificação de homólogos de PIP-72Aa
[0413] As identidades gênicas podem ser determinadas mediante a execução de buscas BLAST (Basic Local Alignment 20 Search Tool; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403 a 410; consulte também ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, que pode ser acessada usando o prefixo “www”) usando parâmetros padrão para similaridade às sequências contidas na base de dados BLAST “nr” disponível ao público (compreendendo todas as traduções de CDS não-redundantes do GenBank, sequências derivadas do banco de dados de proteína Brookhaven de estrutura tridimensional, a última versão importante da base de dados de sequências de proteína SWISS-PROT, bases de dados EMBL e DDBJ). Além de bancos de dados públicos, foram pesquisados bancos de dados internos da DuPont Pioneer. As sequências de polinucleotídeos SEQ ID NO: 1 foi analisada.
[0414] A pesquisa identificou vários homólogos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) que têm percentual de identidade variado ao PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). Homólogos PIP-72Aa de atividade inseticida chamados aqui de: PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28) e PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) foram identificados do banco de dados do genoma bacteriano interno da DuPont Pioneer a partir de: Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas chlororaphis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas congelans; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas ficuserectae; Pseudomonas mosselii; Pseudomonas chlororaphis; e Pseudomonas chlororaphis, respectivamente. PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28) e PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) são codificados pela SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 31, respectivamente. Os homólogos de baixa identidade inativos chamados aqui de PIP-72Ea (SEQ ID NO: 16) e PIP-72Ge (SEQ ID NO: 38) foram identificados por meio de um banco de dados de genoma bacteriano interno da DuPont Pioneer de Pseudomonas congelans e Pseudomonas chlororaphis, respectivamente. PIP-72Ea e PIP-72Ge são codificados pela SEQ ID NO: 15, e SEQ ID NO: 37, respectivamente.
[0415] Os homólogos ativos inseticidas mais distantes chamados aqui de: GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20 - proteína hipotética GBP346_A3175 (n° de acesso YP_002897852); JG43047 (SEQ ID NO: 24 - proteína hipotética, n° de acesso JGI - 2165143047) e PFL_6283 (SEQ ID NO: 30 — proteína hipotética, n° de acesso YP_004842361.1) foram identificadas a partir de bancos de dados públicos externos de: Burkholderia pseudomallei MSHR346; Pseudomonas sp. e Pseudomonas protegens Pf-5, respectivamente. GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20); JG43047 (SEQ ID NO: 24) e PFL_6283 (SEQ ID NO: 30) são codificados pela SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, e SEQ ID NO: 29, respectivamente.
[0416] Os homólogos mais distantes, que não foram expressos ou eram inativos nas concentrações testadas foram chamados de SRBS_294080 (SEQ ID NO: 22 - proteína hipotética de uma rizosfera de grama selvagem MC, n° de acesso JGI 2021745495); SwiRh_4910 (SEQ ID NO: 26 - proteína hipotética de uma rizosfera de grama selvagem, n° de acesso JGI - SwiRh_1014910); XBJ1_1078 (SEQ ID NO: 34 - proteína hipotética XBJ1_1078 de Xenorhabdus bovienii SS-2004, n° de acesso YP_003467009) e plu2373 (SEQ ID NO: 36 - proteína hipotética plu2373 de Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1, n° de acesso NP_929618) foram identificadas a partir dos bancos de dados públicos externos; Xenorhabdus codificada pela SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 33, e SEQ ID NO: 35, respectivamente.
[0417] Homólogos de PIP-72 adicionais foram identificados por BLAST pesquisando bancos de dados públicos e bancos de dados internos da DuPont Pioneer basicamente conforme descrito acima. A Tabela 5 mostra a designação do polipeptídeo PIP-72, porcentagem de identidade com IPD072Aa (SEQ ID NO: 2), fonte da cepa bacteriana e espécie bacteriana. A Tabela 6 mostra a designação do polipeptídeo PIP-72, o identificador de sequências do polipeptídeo e o identificador de sequências do polinucleotídeo.
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[0418] A Figura 1 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Ea (SEQ ID NO: 16), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20), SRBS_294080 (SEQ ID NO: 22); JG43047 (SEQ ID NO: 24); SwiRh_4910 (SEQ ID NO: 26); PIP-72Ff (SEQ ID NO: 28), PFL_6283 (SEQ ID NO: 30); PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32); XBJ1_1078 (SEQ ID NO: 34); plu2373 (SEQ ID NO: 36); e PIP-72Ge (SEQ ID NO: 38). A diversidade da sequência de aminoácidos está realçada. Os aminoácidos 37-51 (motivo 1) relativos à PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) estão sublinhados.
[0419] A Figura 2 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ab (SEQ ID NO: 927); PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Bb (SEQ ID NO: 928); PIP- 72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); WP_030131237 (SEQ ID NO: 929); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18); e GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20). A diversidade da sequência de aminoácidos entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0420] A Figura 3 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PIP-72Ba (SEQ ID NO: 4); PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); e PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). A diversidade da sequência de aminoácidos entre PIP- 72Aa (SEQ ID NO: 2) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0421] A Figura 4 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de WP_030131237 (SEQ ID NO: 929) PIP-72Ca (SEQ ID NO: 6); PIP-72Cb (SEQ ID NO: 8); PIP-72Da (SEQ ID NO: 10); PIP-72Db (SEQ ID NO: 12); e PIP-72Dc (SEQ ID NO: 14). A diversidade da sequência de aminoácidos entre PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0422] A Figura 5 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos de PIP-72Fh (SEQ ID NO: 932), PIP-72Gi (SEQ ID NO: 941); PIP-72Fi (SEQ ID NO: 933); PIP-72Gl (SEQ ID NO: 944); PIP-72Fa (SEQ ID NO: 14). A diversidade de aminoácido entre PIP-72Ca (SEQ ID NO: 2) e outros homólogos está indicada com sombreamento.
[0423] A Tabela 7 mostra a identidade de sequência entre os homólogos de Tabela PIP-72.
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Exemplo 3 - Expressão em E. coli de PIP-72Aa e homólogos
[0424] O gene PIP-72Aa foi amplificado por meio de PCR com o uso de DNA genômico isolado da cepa SS143D5: iniciador direto (SEQ ID NO: 39) e iniciador reverso (SEQ ID NO: 40). O produto de PCR resultante foi a sequência de DNA verificada e subclonada em pCOLD™1 (Takara Bio Inc., Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, Japão, 520-2193) em fase com uma cauda His-6 N-terminal seguido por um sítio de clivagem de Fator Xa. Os polinucleotídeos que codificam os homólogos de PIP-72Aa identificados das cepas internas (PIP-72Ba, PIP-72Ca, PIP- 72Cb, PIP-72Da, PIP-72Db, PIP-72Dc, PIP-72Db, PIP-72Ea, PIP- 72Fa, JG43047, IDP072Ff, PFL_6283, PIP-72Gb, PIP-72Ge) foram clonados conforme descrito acima, usando sua respectiva preparação de DNA genômico como molde para a amplificação gênica por PCR e as sequências de iniciador indicadas na Tabela 8.
[0425] Os homólogos de PIP-72Aa que foram identificados a partir dos bancos de dados externos (GBP_A3175, SRBS_294080, SwiRh_4910, XBJ1_1078, Plu2373, WP_030131237 e WP_016417435) foram obtidos através da síntese gênica com extremidades 5’ e 3’ compatíveis com a clonagem a jusante no pCOLD™-1.
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[0426] Células competentes de E. coli BL21-DE3 foram transformadas com o DNA do plasmídeo pCOLD™ -1, contendo o respectivo elemento de inserção do gene PIP-72 para expressão da proteína recombinante. As células de E. coli transformadas foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C com seleção de carbenicilina e, então, inoculadas em um meio 2xYT fresco (1:25) e adicionalmente cultivadas a uma densidade óptica de cerca de 0,8. As células foram, então, resfriadas na presença de ITPG a 1 mM e adicionalmente cultivadas a 16°C por 16 horas para induzir a expressão de proteína. As proteínas expressas em E. coli foram purificadas por cromatografia por íons metálicos imobilizado com o uso de Ni-NTA agarose (Qiagen®, Alemanha) de acordo com os protocolos do fabricante. Exemplo 4 - Atividade de insetos de PIP-72Aa e homólogos
[0427] Uma série de concentrações da amostra de proteína purificada foi analisada contra insetos coleópteros e as concentrações para 50% de mortalidade (LC50) ou inibição de 50% dos indivíduos (IC50) foram calculadas em dois experimentos independentes. Os resultados de WCRW para PIP- 72Aa (SEQ ID NO: 2) são mostrados na Tabela 9.
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[0428] Para medir as atividades inseticidas de outros polipeptídeos PIP-72, ensaios com WCRW (Diabrotica virgifera virgifera) foram conduzidos com o uso de 20 ul de amostras de proteína purificada aplicadas topicamente sobre 75 ul de dieta de WCRW artificial (baseada em Bio-Serv F9800B) em cada poço de uma placa de bioensaio de 96 poços (BD Falcon 353910) e, então, secos a ar. Um número variável de neonatos de Diabrotica virgifera virgifera (3 a 9) foi colocado em cada poço de uma placa de 96 poços. O ensaio foi executado por 4 dias a 25°C sem luz e, então, classificado de acordo com mortalidade e nanismo. A atividade inseticida de WCRW dos vários polipeptídeos PIP-72 é mostrada na Tabela 10.
[0429] PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) foi testado adicionalmente na lagarta da raiz do milho meridional (Diabrotica undecimpunctata howardi ) e no besouro de San Antonio(Diabrotica speciosa), assim como no inseto sugador Lygus hesperus. PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) não foi testado como inseticida nessas pragas nas concentrações testadas (até 875 ppm de proteína purificada).
[0430] Vários polipeptídeos PIP-72 também foram testados contra SCRW (Diabrotica undecimpunctata howardi). Foram feitos bioensaios usando 10 ul das amostras de proteína purificada misturadas com 50 ul de dieta de SCRW artificial (baseada em Bio-Serv F9800B) em cada poço de uma placa de bioensaio de 96 poços (BD Falcon 353910). Um número variável de neonatos de Diabrotica undecimpunctata howardi (3 a 5) foi colocado em cada poço de uma placa de 96 poços. O ensaio foi executado por 4 dias a 25°C sem luz e, então, classificado de acordo com mortalidade e nanismo.
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[0431] Os ensaios de alimentação de Lepidoptera foram conduzidas em uma dieta artificial em uma configuração de placa de 96 poços. A proteína purificada foi incorporada com a dieta artificial específica para lepidópteros em uma razão de 10 ul de lisado purificado e 40 ul da mistura de dieta. De duas a cinco larvas neonatas foram colocadas em cada cavidade para alimentação ad libitum durante 5 dias. Os resultados foram expressos como positivos para reações das larvas como, por exemplo, atrofia e/ou mortalidade. Os resultados foram expressos como negativos se as larvas eram similares ao controle negativo que consiste na dieta alimentar para qual somente o tampão acima foi aplicado.
[0432] PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), PFL_6283 (SEQ ID NO: 30), PIP- 72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18) e PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) foram testados na broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), larva de traça do milho (Helicoverpa zea), lagarta- rosca (Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho do outono (Spodoptera frugiperda) e lagarta-falsa-medideira (Pseudoplusia includens). Nenhuma atividade contra as espécies de Lepidoptera foi observada em qualquer dos polipeptídeos PIP-72 testados nas concentrações de proteína de até 800 ppm. Exemplo 5 - Carência de Resistência Cruzada de PIP-72Aa em cepa resistente à mCry3A de WCRW
[0433] A cepa WCRW resistente a mCry3A foi desenvolvida por seleções de WCRW em plantas de milho transgênico mCry3A com nível de expressão T0 de mCry3A a >10, 000 ppm de proteínas totais nas raízes. Foram feitas sete seleções nas larvas F3, F6, F7, F8, F10, F12, F14. Ovos de F16 dos insetos resistentes a Cry3A apresentaram uma razão de resistência (RR) de mais de 46 vezes a mCry3A em comparação com a colônia de laboratório suscetível, e foram usados para teste de resistência cruzada de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). Bioensaios padronizados de incorporação na dieta de WCRW foram utilizados para avaliar os efeitos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) sobre larvas de WCRW. As larvas neonatas de WCRW foram colocadas nas placas contendo a dieta de bioensaio e proteína inseticida com 4 réplicas para cada tratamento de concentração por 3 dias após a iniciação de cada bioensaio. A mortalidade de inseto e o nanismo severo foram classificados e usados para calcular concentrações inibidoras (IC50 e LC50) com base na análise de probabilidade. A razão de resistência (RR) foi calculada da seguinte forma: RR = (LC/IC50 de WCRW) resistente / (LC/IC50 de WCRW suscetível). Conforme mostrado na Tabela 11, os insetos de WCRW resistentes à Cry3A eram sensíveis à PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
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Exemplo 6 - Transformação estável do milho mediada por Agrobacterium
[0434] Para transformação de polipeptídeos PIP-72 do milho mediada por Agrobacterium, o método de Zhao foi empregado (patente US n° 5.981.840 e publicação de patente internacional n° WO 1998/32326, cujos conteúdos estão aqui incorporados, por referência). Em resumo, os embriões imaturos foram isolados do milho e colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias foram capazes de transferir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PIP-72 para ao menos uma célula de ao menos um dos embriões imaturos (etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos foram imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inoculação. Os embriões foram cocultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de cocultivo). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso para as células infectadas. A seguir, os embriões inoculados foram cultivados em um meio contendo um agente seletivo e o calo transformado em crescimento é recuperado (etapa 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos foram cultivados sobre meio sólido com um agente seletivo, resultando no crescimento seletivo das células transformadas. O calo foi então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração) e os calos cultivados em meio seletivo foram cultivados em meio sólido para regenerar as plantas.
[0435] Para detecção do polipeptídeo PIP-72 no tecido da folha, 4 perfurações/amostras de folha liofilizada foram pulverizadas e ressuspensas em 100 μL de PBS contendo 0,1% de TWEEN 20 (PBST), 1% de beta-mercaptoetanol contendo 1 comprimido/7 ml de inibidor proteinase de Mini completo (Roche 1183615301). A suspensão foi sonicada por 2 minutos e, então, centrifugada a 4°C, 20.000 g por 15 minutos. A um sobrenadante, adicionou-se uma alíquota com 1/3 de volume de tampão de amostra 3X NuPAGE® LDS (Invitrogen™ (CA, EUA), 1% de B-ME contendo 1 comprimido/7 ml de inibidor de proteinase Mini completo. A reação foi aquecida a 80°C durante 10 min e, então, centrifugada. Uma amostra do sobrenadante foi aplicada em géis de 4 a 12% de Bis-Tris Midi com tampão de corrida MES, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen™) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando um aparelho iBlot® (Invitrogen™). A membrana de nitrocelulose foi incubada em PBST contendo 5% de leite em pó desnatado durante 2 horas antes da incubação de um dia para outro em anti-PIP-72Aa de coelho purificado por afinidade em PBST de um dia para o outro. A membrana foi enxaguada três vezes com PBST e, então, incubada em PBST durante 15 minutos e, então, duas vezes 5 min antes de incubar durante 2 horas em PBST com anticorpo de cabra anti-HRP de coelho durante 3 horas. As proteínas detectadas foram visualizadas usando os reagentes ECL Western Blotting (GE Healthcare N° de catálogo RPN2106) e filme Kodak® Biomax® MR. Para a detecção da proteína PIP-72Aa em raízes, as raízes foram liofilizadas e 2 mg de pó por amostra foram ressuspensos em LDS, 1% de beta-mercaptoetanol contendo 1 tablete/7 ml de inibidor de proteinase de Mini completo foi adicionado. A reação foi aquecida a 80°C por 10 minutos e, então, centrifugada a 4°C, 20.000 g por 15 minutos. Uma amostra do sobrenadante foi aplicada em géis de 4 a 12% de Bis-Tris Midi com tampão de corrida MES, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen™) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando um aparelho iBlot® (Invitrogen™). A membrana de nitrocelulose foi incubada em PBST contendo 5% de leite desnatado em pó durante 2 horas antes da incubação de um dia para outro em anticorpo anti-PIP-72Aa de coelho policlonal purificado por afinidade em PBST de um dia para o outro. A membrana foi enxaguada três vezes com PBST e, então, incubada em PBST por 15 minutos e, então, duas vezes em 5 minutos antes da incubação por 2 horas em PBST com HRP anti-coelho de cabra por 3 horas. As proteínas inseticidas ligadas a anticorpo foram detectadas com o uso de Reagentes de Western Blotting ECL™ (n° de cat GE Healthcare RPN2106) e filme de RM Kodak® Biomax®.
[0436] As plantas de milho transgênicas positivas para expressão das proteínas inseticidas são testadas para a atividade pesticida usando bioensaios padrão conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, por exemplo, bioensaios de excisão de raiz e bioensaios de planta inteira. Consulte, por exemplo, a publicação de pedido de patente US número US 2003/0120054 e a publicação internacional número WO 2003/018810. Exemplo 7 - Construtos de vetor de expressão para expressão de PIP-72Aa em plantas
[0437] Os vetores de expressão de planta, PHP61666, PHP61668, PHP61664 foram construídos para incluir um cassete transgênico contendo o gene PIP-72Aa (SEQ ID NO: 1), variante 1 de PIP- 72Aa otimizada para o milho (SEQ ID NO: 850) e variante 2 de PIP-72Aa otimizada para o milho (SEQ ID NO: 851), respectivamente, sob o controle do promotor do vírus do mosaico de mirabilis (MMV) [Dey N and Maiti IB, 1999, Plant Mol. Biol. 40(5):771-82] em combinação com um elemento acentuador. Vetores adicionais, PHP64465, PHP64471 e PHP64468 que expressam o PIP-72Aa (variante 1 otimizada para o milho) sob diferentes combinações de promotor, íntron e terminador também foram testados em eventos de milho transgênico. PHP64465 expressa PIP-72Aa (Variante 1) sob o controle do promotor da poliubiquitina do milho e 5’UTR e íntron associados (Christensen AH and Quail RH, 1996, Transgenic Res 5:213-218) combinados com o acentuador 35S (Kay et al., 1987, Science 236(4806):1299-1302. PHP64471 e PHP64468 expressam a variante 1 sob controle do promotor do vírus da estria da banana [BSV(AY)TR] (Diehn S, Lu AL e Simmons CR, 2012, patente US 8338662B2) com o íntron ZM-HPLV9 (Diehn S et al., 2011, US2011039696) ou ZM-ADH1 (Callis et al, 1987, Genes Develop 1:1183-1200), respectivamente. PHP69828 expressa a variante 3 de PIP-72Aa otimizada para o milho (SEQ ID NO: 853) com os mesmos elementos reguladores de PHP64471.
[0438] Esses construtos foram usados para gerar eventos de milho transgênico para testar a eficácia contra a lagarta da raiz do milho fornecida pela expressão de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
[0439] Os resultados de eficácia da casa de vegetação de T0 para eventos gerados desses construtos são mostrados na Figura 8. A eficácia de eventos derivados de cada dos construtos foi observada em relação a eventos de controle negativo conforme medido pela proteção da raiz contra a lagarta da raiz do milho ocidental. A proteção de raiz foi medida de acordo com o número de nós de raízes lesadas (CRWNIS = classificação de lesão de nó de lagarta da raiz do milho) com o uso do método desenvolvido por Oleson, et al. (2005) [J. Econ Entomol. 98(1):1 a 8]. A classificação de lesão de raiz é medida de “0” a “3” com “0” indicando nenhuma lesão de raiz visível, “1” indicando 1 nó de dano de raiz, “2” indicando 2 nós de dano de raiz, e “3” indicando uma classificação máxima de 3 nós de dano de raiz. Os escores intermediários (por exemplo, 1,5) indicam frações adicionais de nós de dano (por exemplo, um nó e meio danificado).
[0440] A Figura 8 mostra que a maioria dos eventos dos construtos de teste (cada um representa um único evento do construto) tiveram um desempenho melhor que o controle negativo com escores de lesão de lagarta de raiz < 1,0. Vários construtos, como PHP64471 e PHP64468, mostraram classificações de dano da lagarta da raiz com uma média <0,2 por todos os eventos testados. Exemplo 8 - Variantes de PIP-72Aa com múltiplas substituições de aminoácidos
[0441] Para criar variantes de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) com múltiplas alterações de aminoácido, foram geradas bibliotecas de variantes por meio de embaralhamento de DNA sintético (Ness et al, 2002, Nature Biotechnology 20, 1251-5) de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 1) e GBP_A3175 (SEQ ID NO: 19) ou por mutagênese sítio- direcionada (técnica Lightning QuikChange™ ou técnica QuikChange™ II, Agilent, Santa Clara CA, EUA). Um alinhamento da sequência de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) são mostrados na Figura 5. Em resumo, as reações de síntese gênica foram executadas com oligonucleotídeos mostrados na Tabela 12.
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[0442] Vários genes sintéticos foram gerados usando diferentes conjuntos de iniciadores indicados na Tabela 13. Reações da síntese gênica F46, F31 e F39, cada uma utilizou conjuntos de 10 iniciadores de oligonucleotídeos distintos. As reações da síntese gênica deg7, deg15, deg20 utilizou os conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeo com degeneração de sequência, resultando em bibliotecas de sequências. As reações da síntese gênica F46, F31, F39, deg7, deg15 e deg20 foram combinadas e selecionadas como uma única biblioteca.
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[0443] Os fragmentos dos genes sintéticos foram subclonados no vetor de expressão pCOLD™1, conforme descrito no Exemplo 3. Os DNAs de plasmídeo resultantes foram transformados em E. coli, e a proteína foi expressa conforme descrito no Exemplo 3. Bioensaios foram realizados na lagarta da raiz do milho ocidental, conforme descrito no Exemplo 4, para determinar que variantes gênicas mantiveram a atividade inseticida. O sequenciamento do DNA foi realizado nas variantes ativas do gene. As sequências de nucleotídeo e aminoácidos das variantes de polipeptídeo PIP-72 ativas resultantes estão mostradas na Tabela 14. Cinco variantes ativas foram recuperadas das 59 variantes únicas que foram selecionadas. A Tabela 15 mostra as substituições de aminoácidos das variantes do polipeptídeo PIP-72 ativas resultantes em comparação com PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
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[0444] Para gerar polipeptídeos PIP-72 ativos adicionais, outra mutagênese sítio-dirigida foi feita usando as sequências de polinucleotídeo PIP-72Aa-Fb-9 (SEQ ID NO: 288), PIP-72Aa- Fb-27 (SEQ ID NO: 289) e PIP-72Aa-Fb-33 (SEQ ID NO: 291) como moldes pela técnica QuikChange™ (Agilent, 5301 Stevens Creek Blvd., Santa Clara CA, EUA) usando os iniciadores de oligonucleotídeo mostrados na Tabela 16. Os iniciadores de PIP-72Aa-Fb_9-27_1 (SEQ ID NO: 143), PIP-72Aa-Fb_9-27_2 (SEQ ID NO: 144), PIP-72Aa-Fb_9-27_3 (SEQ ID NO: 145), PIP-72Aa- Fb_9-27_12 (SEQ ID NO: 146), PIP-72Aa-Fb_9-27_13 (SEQ ID NO: 147) e PIP-72Aa-Fb_9-27_14 (SEQ ID NO: 148) foram usados para mutagênese dos moldes de DNA plasmidial PIP-72Aa-Fb-09 (SEQ ID NO: 288) e PIP-72Aa-Fb-27 (SEQ ID NO: 289). Os iniciadores de PIP-72Aa-Fb_33_1 a PIP-72Aa-Fb_33_11 (SEQ ID NO: 149 a SEQ ID NO: 159) foram usados para a mutagênese do molde de DNA plasmidial PIP-72Aa-Fb-33 (SEQ ID NO: 291).
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[0445] Os DNAs plasmidiais resultantes foram transformados em E. coli e a proteína foi expressa, conforme descrito no Exemplo 3. Bioensaios foram realizados na lagarta da raiz do milho ocidental, conforme descrito no Exemplo 4, para determinar que variantes gênicas mantiveram a atividade inseticida. O sequenciamento do DNA foi realizado nas variantes ativas do gene. A porcentagem de identidade comparada a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2), a identificação do clone, sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo das variantes ativas resultantes são mostradas na Tabela 17. As variantes do polipeptídeo PIP-72 de PIP-72Aa-Fb-9 (SEQ ID NO: 530) produziram 33 variantes ativas das 72 que foram selecionadas. As variantes do polipeptídeo PIP-72 de PIP-72Aa-Fb-27 (SEQ ID NO: 530) produziram 11 variantes ativas das 52 que foram selecionadas. As variantes do polipeptídeo PIP-72 de PIP-72Aa- Fb-33 (SEQ ID NO: 532) produziram 47 variantes ativas das 79 que foram selecionadas. A Tabela 18 mostra as substituições de aminoácidos das variantes do polipeptídeo PIP-72 ativas resultantes em comparação com PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
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Exemplo 9 - Variantes de PIP-72Aa com múltiplas substituições de aminoácidos
[0446] Para gerar outras variantes do polipeptídeo PIP-72 foi realizada mutagênese sítio-dirigida usando os iniciadores de oligonucleotídeos mostrados na Tabela 19 para introduzir as substituições de aminoácidos de PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) em PIP- 72Aa (SEQ ID NO: 2) ou de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) em PIP-72Da (SEQ ID NO: 845 - ressintetizado para facilitar a mutagênese) . Um alinhamento da sequência de aminoácidos de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) são mostrados na Figura 6. Os fragmentos dos genes sintéticos foram subclonados no vetor de expressão pCOLD™1, conforme descrito no Exemplo 3.
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[0447] Os DNAs plasmidiais resultantes foram transformados em E. coli, e a proteína inseticida foi expressa conforme descrito no Exemplo 3. Bioensaios foram realizados na lagarta da raiz do milho ocidental, conforme descrito no Exemplo 4, para determinar que variantes gênicas mantiveram a atividade inseticida. O sequenciamento do DNA foi realizado nas variantes ativas do gene. A porcentagem de identidade comparada a PIP- 72Aa (SEQ ID NO: 2), designação do clone, sequências de nucleotídeos e aminoácidos das variantes do polipeptídeo PIP-72 ativas resultantes são mostradas na Tabela 20. Das aproximadamente 180 variantes do polipeptídeo PIP-72 único que foram selecionadas, 156 variantes ativas foram identificadas. A Tabela 21 resume a porcentagem de identidade das variantes ativas em comparação com PIP-72Aa (SEQ ID NO: 17), o número de clones com cada % de identidade e a identificação do clone. A Tabela 22 mostra as substituições de aminoácidos das variantes do polipeptídeo PIP-72 ativas resultantes em comparação com PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
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Exemplo 10 - Identificação das posições de aminoácidos que afetam a função de PIP-72Aa
[0448] O alinhamento da sequência de proteínas de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e outros membros da família ativos de PIP-72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18), GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) e PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) são mostrados na Figura 2. A partir do alinhamento, as posições de aminoácidos conservadas 7, 10, 20, 23, 24, 34, 60, 61, 66, 68, 75, 77, 79, 84 foram selecionadas quanto à mutagênese por saturação usando os iniciadores de oligonucleotídeos indicados na Tabela 23 (técnica QuikChange™, Agilent, 5301 Stevens Creek Blvd, Santa Clara CA, EUA). Além disso, as posições 8, 11, 12, 15, 16, 19, 27, 30, 31, 32, 33, 53, 56, 58, 65, 70, 71, 73, 74, 78, 80, 81, 83, 85, 86, que diferem entre PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e PIP-72Da (SEQ ID NO: 10) foram submetidas à mutagênese por saturação usando uma modificação do método QuikChange™ com DNA polimerase de alta fidelidade Phusion® (New England Biolabs®, n° de cat. M0530L, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723, EUA), com os iniciadores de oligonucleotídeo indicados na Tabela 23. Os DNAs plasmidiais resultantes foram transformados em E. coli e a proteína foi expressa, conforme descrito no Exemplo 3. Bioensaios foram realizados na lagarta da raiz do milho ocidental, conforme descrito no Exemplo 4, para determinar que variantes gênicas mantiveram a atividade inseticida. A Tabela 23 mostra as posições que foram avaliadas e resume os dados que foram obtidos. As substituições de aminoácidos que foram identificadas pela análise da sequência de DNA são mostradas. Para cada posição, as substituições de aminoácidos que produziram variantes de PIP-72Aa que mantiveram a atividade da lagarta da raiz do milho ocidental são mostradas.
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Exemplo 11 - Identificação do Motivo 1 e análise das posições de aminoácidos afetando a função do PIP-72Aa
[0449] A partir do alinhamento da sequência de proteínas de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) e outros membros da família ativos incluindo PIP-72Da (SEQ ID NO: 10), PIP-72Fa (SEQ ID NO: 18), GBP_A3175 (SEQ ID NO: 20) e PIP-72Gb (SEQ ID NO: 32) mostrados na Figura 2, o Motivo 1 conservado foi identificado como possivelmente importante para a função (sublinhado na Figura 2 em relação a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). Cada posição dentro do Motivo 1 (37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51) foi submetida à mutagênese por saturação usando os iniciadores de oligonucleotídeo indicados na Tabela 24. Os DNAs plasmidiais resultantes foram transformados em E. coli e a proteína foi expressa, conforme descrito no Exemplo 3. Bioensaios foram realizados na lagarta da raiz do milho ocidental, conforme descrito no Exemplo 4, para determinar que variantes gênicas mantiveram a atividade inseticida. A Tabela 24 mostra as posições que sofreram mutagênese e resume os dados que foram obtidos. Para cada posição, as substituições de aminoácidos que produziram variantes do polipeptídeo PIP-72A que mantiveram a atividade da lagarta da raiz do milho ocidental são mostradas. Além disso, as substituições de aminoácidos associadas com a expressão de proteína solúvel em E. coli são observadas.
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Exemplo 12 - Variantes de PIP-72Aa com múltiplas substituições de aminoácidos no Motivo 1
[0450] Variantes de PIP-72Aa com múltiplas substituições de aminoácidos selecionadas no Motivo 1 foram geradas pela técnica QuikChange™ (Agilent, Santa Clara CA, EUA) usando uma combinação de iniciadores de oligonucleotídeo na Tabela 25. Os DNAs plasmidiais resultantes foram transformados em E. coli e a proteína foi expressa, conforme descrito no Exemplo 3. Bioensaios foram realizados na lagarta da raiz do milho ocidental, conforme descrito no Exemplo 4, para determinar que variantes gênicas mantiveram a atividade inseticida. O sequenciamento do DNA foi realizado nas variantes ativas do gene. As sequências de nucleotídeo e aminoácidos das variantes ativas são mostradas na Tabela 26. Das 78 variantes selecionadas, 20 apresentaram atividade detectável da lagarta da raiz do milho ocidental. As variantes ativas continham entre 2 e 7 substituições de aminoácidos em relação a PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). A Tabela 27 mostra as substituições de aminoácidos das variantes do polipeptídeo PIP-72 ativas resultantes em comparação com PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2).
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Exemplo 13 - Identificação das posições de aminoácidos adicionais que afetam a função de PIP-72Aa
[0451] As posições de aminoácidos restantes 2, 3, 4, 5, 6, 9, 13, 14, 17, 18, 21, 22, 25, 26, 28, 29, 35, 36, 52, 54, 55, 57, 59, 62, 63, 64, 67, 69, 72, 76, 82 foram submetidas à mutagênese por saturação, conforme descrito no Exemplo 11, usando os iniciadores de oligonucleotídeo indicados na Tabela 27. Os DNAs plasmidiais resultantes foram transformados em E. coli e a proteína foi expressa, conforme descrito no Exemplo 3. Bioensaios foram realizados na lagarta da raiz do milho ocidental, conforme descrito no Exemplo 4, para determinar que variantes gênicas mantiveram a atividade inseticida. A Tabela 28 mostra as posições que foram submetidas à mutagênese e resume as substituições de aminoácidos identificadas pelo sequenciamento de DNA, e as substituições de aminoácido que produziram as variantes de PIP-72Aa que mantiveram a atividade da lagarta da raiz do milho ocidental são mostradas.
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Exemplo 14 - Variantes de PIP-72Aa com atividade melhorada contra a lagarta da raiz do milho ocidental
[0452] Para criar variantes de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) com atividade contra a lagarta da raiz do milho ocidental melhorada foram geradas bibliotecas por meio de embaralhamento de DNA sintético (Ness et al, 2002, Nature Biotechnology 20, 1251-5) de PIP-72Aa (SEQ ID NO: 1) e por mutagênese sítio- direcionada (técnica Lightning QuikChange™ ou técnica QuikChange™ II, Agilent, Santa Clara CA, EUA). Doze polipeptídeos variantes PIP-72 com atividade aumentada específica contra a lagarta da raiz do milho ocidental foram identificados. Os polipeptídeos variantes PIP-72 A5, A5:10E, A5:10T, A5:10V, A5:10A, A5:10L, A5:10E/78H, A5:8M, A5:71H/83F, A5:4S/54Q/78H, A5:71H e 3_68 exibiram entre 1,2 e 2 vezes atividade inseticida melhorada contra a lagarta da raiz do milho ocidental em comparação com PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2). A Tabela 29 mostra as substituições de aminoácidos em comparação com PIP-72Aa (SEQ ID NO: 2) de cada um dos polipeptídeos variantes PIP-72, o identificador de sequência de aminoácidos correspondente e o identificador de sequência de ácidos nucleicos correspondente. As substituições de aminoácidos comparadas com A5 (SEQ ID NO: **) estão em negrito.
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[0453] Para determinar a atividade da lagarta da raiz do milho ocidental, proteínas foram testadas conforme descrito no Exemplo 4. Foi usado um sistema de pontuação numérica de 0 a 3 baseado no tamanho e na mortalidade. Se não fosse notada nenhuma resposta ou nenhum crescimento normal, uma pontuação de 0 era dada. Quando o crescimento foi retardado mas sem mortalidade, a pontuação foi de 1. A pontuação 2 significava morte parcial (vários insetos foram usados em cada poço) e forte inibição do crescimento. A pontuação 3 indicava mortalidade total. Cada tratamento foi repetido 6 vezes para uma possível pountuação mais alta de 18. Nesse sistema de pontuação, a pontuação 9 com 6 repetições de um tratamento significa 50% de resposta (9 de 18) do tratamento e é chamada ILC50 (inibição do crescimento e concentração letal para 50% de resposta). Os dados da atividade são mostrados na Tabela 30. Os números convertidos de ILC50 representam médias entre 2 e 30 experimentos.
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[0454] A descrição acima de várias modalidades ilustradas da revelação não se destina a ser exaustiva nem a limitar o escopo à forma precisa revelada. Embora modalidades específicas e exemplos da invenção sejam descritos na presente invenção para fins ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da revelação, conforme será reconhecido pelo versado na técnica relevante. Os ensinamentos aqui fornecidos podem ser aplicados a outros propósitos, além dos exemplos descritos acima. Várias modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações em anexo.
[0455] Essas e outras alterações podem ser feitas à luz da descrição detalhada acima. De modo geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados como limitadores do escopo às modalidades específicas apresentadas no relatório descritivo e nas reivindicações.
[0456] Toda a revelação de cada documento citado (inclusive patentes, pedidos de patente, artigos de revistas, resumos, manuais, livros ou outras revelações) nos Antecedentes, Descrição Detalhada, e nos Exemplos está aqui incorporada por referência em suas totalidades.
[0457] Esforços foram feitos para assegurar precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas alguns erros e desvios experimentais devem ser permitidos.

Claims (9)

1. Construto de DNA CARACTERIZADO por compreender uma molécula de ácido nucleico que consiste na SEQ ID NO: 31 que codifica um polipeptídeo PIP-72 que consiste na SEQ ID NO:32, tendo atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera), operacionalmente ligada a um elemento regulador heterólogo.
2. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o elemento regulador é um promotor capaz de expressar uma proteína em plantas.
3. Método de obtenção de planta transgênica CARACTERIZADO por compreender: a) transformar uma célula vegetal com o construto de DNA conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2; b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento da célula vegetal; e c) regenerar uma planta transgênica a partir da referida célula vegetal transformada.
4. Proteína de fusão CARACTERIZADA por compreender um polipeptídeo recombinante PIP-72 consistindo na SEQ ID NO: 32, tendo atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera) fundido a uma sequência sinal, um peptídeo de trânsito de plastídeo de planta, ou um polipeptídeo inseticida unido por um ligante de aminoácido.
5. Método para controlar uma população de praga de inseto CARACTERIZADO por compreender colocar a população da praga de inseto em contato com o polipeptídeo PIP-72 recombinante de SEQ ID NO: 32, tendo atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera).
6. Método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto CARACTERIZADO por compreender colocar a população da praga de inseto em contato com uma composição que compreende o polipeptídeo PIP-72 recombinante de SEQ ID NO: 32, tendo atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera).
7. Método para controlar uma população de praga de inseto resistente a uma proteína pesticida CARACTERIZADO por compreender colocar a população de praga de inseto em contato com a planta transgênica ou célula vegetal transgênica conforme obtidas na reivindicação 3.
8. Método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto CARACTERIZADO por compreender colocar a população da praga de inseto em contato com a planta transgênica ou a célula vegetal transgênica conforme obtidas na reivindicação 3.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, CARACTERIZADO por o inseto ou população de insetos ser resistente a pelo menos uma toxina Bt.
BR122020001770-8A 2013-09-13 2014-09-11 Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto BR122020001770B1 (pt)

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