KR20230127241A

KR20230127241A - 신규한 곤충 저해 단백질

Info

Publication number: KR20230127241A
Application number: KR1020237022324A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 제이. 보웬; 토드 에이. 시쉐; 아를렌 알. 하우; 스테파니 씨. 왈드호이저; 킴벌리 엠. 웨거너
Original assignee: 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-08-31
Also published as: US20220220160A1; CO2023008716A2; CA3206691A1; UY39599A; CN116848250A; AU2021412979A1; US11673922B2; CL2023001850A1; EP4271188A1; AR124533A1; CR20230292A; WO2022146874A1

Abstract

나비목 해충 종에 대하여 독성 활성을 나타내는 살균살충 단백질이 개시되고, 그리고 TIC13085 및 TIC13087을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 개시된 살균살충 단백질 중에서 하나 이상을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 내포하는 DNA 작제물이 제공된다. 나비목 침입에 대해 내성인 유전자도입 식물, 식물 세포, 종자 및 식물 부분이 제공되는데, 이들은 본원 발명의 살균살충 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 내포한다. 생물학적 샘플 내에서 본원 발명의 재조합 핵산 서열 또는 단백질의 존재를 검출하기 위한 방법, 그리고 TIC13085 및 TIC13087 살균살충 단백질 중 임의의 것을 이용하여 나비목 종 해충을 제어하는 방법 역시 제공된다.

Description

신규한 곤충 저해 단백질

관련된 출원에 대한 참조

본 출원은 2020년 12월 31일 자 제출된 미국 가출원 번호 63/132,877에 우선권을 주장하는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.

서열 목록의 통합

서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태를 내포하는, "MONS486WO-sequence_listing.txt"로 명명된 파일이 2021년 12월 9일 자에 작성되었다. 이러한 파일은 27,917 바이트(MS-Windows^®에서 계측됨)이고, 전자 제출(미국 특허 사무국 EFS-Web 출원 시스템 이용)에 의해 동시기에 제출되며, 온전히 참조로서 편입된다.

발명의 분야

본원 발명은 곤충 저해 단백질의 분야에 전반적으로 관계한다. 농작물 및 종자의 농업적으로 유관한 해충, 특히 나비목 곤충 종에 대하여 곤충 저해 활성을 나타내는 신규한 부류의 단백질이 개시된다. 식물, 식물 부분 및 종자(식물과 미생물 세포 포함), 그리고 개시된 독소 단백질 중에서 하나 이상을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물을 내포하는 벡터가 제공된다.

발명의 배경

농업적으로 유의미한 식물, 그 중에서도 특히, 옥수수, 콩, 사탕수수, 쌀, 밀, 야채 및 목화로부터 작물 수확량을 향상시키는 것이 점점 더 중요해지고 있다. 증가하는 인간 개체군에게 식량, 의복 및 에너지를 제공하기 위한 농산물에 대한 증가하는 수요에 더하여, 기후 관련 영향 및 농경 관행 이외로 토지를 이용하려는 증가하는 인구로부터 압력은 농사에 이용 가능한 경작가능 토지의 양을 감소시킬 것으로 예측된다. 이들 인자는 특히 식물 생명공학 및 농경 관행에서 주요한 향상의 부재에서 식량 안보의 암울한 예측을 야기하였다. 이들 압력에 비추어, 기술, 농업 기술 및 해충 관리에서 환경적으로 지속 가능한 향상은 농사에 이용 가능한 한정된 양의 경작가능 토지에서 작물 생산을 확대하기 위한 필수 도구이다.

곤충, 특히 나비목(Lepidoptera) 내에 곤충은 농작물에 대한 손상의 주요 원인으로 고려되고, 그것에 의하여 감염된 구역에서 작물 수확량을 감소시킨다. 농업에 부정적인 영향을 주는 나비목 해충 종은 검정 거염벌레(스포도프테라 코스미오이데스(Spodoptera cosmioides)), 검거세미나방(검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 목화 잎벌레(알라바마 아르길라체아(Alabama argillacea)), 배추좀나방(배추좀나방(Plutella xylostella)), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방과의 나방(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), Cry1Fa1 내성 밤나방과의 나방(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 구대륙 목화다래벌레(OWB, 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)), 남방 거염벌레(스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 콩 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens)), 반점 목화다래벌레(Earias vittella), 남서부 조명충나방(디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 해바라기 자벌레(라치플루시아 누(Rachiplusia nu)), 회색담배나방(헬리오티스 비레스첸스(Heliothis virescens)), 담배 야도충(스포도프테라 리투라(Spodoptera litura), 클러스터 애벌레로서 또한 알려져 있음), 서부 콩 야도충(스트리아코스타 알비코스타(Striacosta albicosta)), 그리고 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈라스(Anticarsia gemmatalis))를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

역사적으로, 합성 화학 살충제의 집중적인 적용은 농업에서 해충 방제제에 의존하였다. 환경 및 인체 건강에 대한 우려는 급부상하는 내성 문제 이외에, 생물학적 농약의 연구와 개발을 자극하였다. 이러한 연구 노력은 세균을 비롯한, 다양한 곤충 병원성 미생물 종의 점진적인 발견과 이용을 야기하였다.

곤충 병원성 세균, 특히 바실루스(Bacillus) 속에 속하는 세균의 잠재성이 발견되고 생물학적 해충 방제제로서 개발되었을 때, 생물학적 제어 패러다임이 바뀌었다. 세균 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)(Bt)의 균주는 Bt 균주가 특정 곤충에 대한 높은 독성을 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에, 살균살충 단백질에 대한 공급원으로서 이용되었다. Bt 균주는 포자형성(sporulation)의 개시 시점에 및 정체 성장기 동안 부아포 결정성 봉입체 내에 위치되는 델타-내독소(예를 들면, Cry 단백질)을 생산하는 것으로 알려져 있고, 그리고 또한, 분비된 살충 단백질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 민감성 곤충 유충에 의한 섭취 시에, 델타-내독소뿐만 아니라 분비된 독소는 곤충 유충 중장 상피의 표면에서 그들의 효과를 발휘하여, 세포막을 파괴하고, 세포 파괴 및 사멸을 야기한다. 살충 단백질을 인코딩하는 유전자는 또한, 다른 바실루스(Bacillus), 그리고 브레비바실루스 라테로스포루스(Brevibacillus laterosporus), 리시니바실루스 스파에리쿠스(Lysinibacillus sphaericus)("Ls"는 종래에 바실루스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus)로서 알려짐), 패니바실루스 포필리아에(Paenibacillus popilliae) 및 패니바실루스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus)와 같은 다양한 추가적인 세균 종을 비롯하여, Bt 이외의 세균 종에서 동정되었다. 이에 더하여, 살충 독소는 또한, 진균, 고사리 및 거미류 독액을 비롯한 다양한 비세균성 공급원으로부터 확인되었다. 해충의 식이에 이런 독소의 살균살충 효과량의 전달은 표적 해충을 제어하는 효과적인 방식이다. 일부 민감성 해충 종의 경우에, 억제를 위해 필수 유전자에 대해 특이적이고 이것을 표적화하는 살균살충 효과량의 dsRNA가 특히, 하나 이상의 살균살충 단백질과 연계될 때 효과적인 해충 관리 전략으로서 확인되었다.

결정성 및 가용성 분비된 살충 독소는 의도된 표적 숙주에 대해 고도로 특이적이고, 그리고 화학 살충제에 대한 대안으로서 전 세계적으로 용인되고 선호된다. 예를 들면, 살충 독소 단백질은 농업적으로 중요한 식물 종을 곤충 침입으로부터 보호하고, 화학 살충제 적용에 대한 필요성을 감소시키며, 수확량을 증가시키기 위해 다양한 농업 적용에서 이용되었다. 살충 독소 단백질은 기계적 방법에 의해, 예컨대 분무에 의해 다양한 세균 균주를 내포하는 미생물 제제를 식물 표면 위에 분산시킴으로써, 그리고 유전적 형질전환 기술을 이용하여 살충 독소 단백질(들)을 발현하는 유전자도입 식물과 종자를 생산함으로써 농작물의 농업적으로 관련된 해충을 제어하는 데 이용된다.

살충 독소 단백질을 발현하는 유전자도입 식물의 이용은 전 세계적으로 채택되었다. 예를 들면, 2016년에, 23 백만 초과의 헥타르에 Bt 독소를 발현하는 유전자도입 작물이 식재되고, 그리고 75 백만 초과의 헥타르에 제초제 내성 형질로 적층된 Bt 독소를 발현하는 유전자도입 작물이 식재되었다(ISAAA. 2016. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016. ISAAA Brief No. 52. ISAAA: Ithaca, NY). 유전자도입 곤충 보호 작물의 전 세계적인 이용 및 이들 작물에서 이용된 살충 독소 단백질의 한정된 수는 현재 이용되고 있는 살충 단백질에 대한 내성을 부여하는 기존의 곤충 대립유전자에 대한 선택 압력을 발생시켰다.

표적 해충에서 살충 독소 단백질에 대한 내성의 발달은 살충 독소 단백질을 발현하는 유전자도입 작물에 대해 내성인 곤충의 증가를 관리하는 데 유용한 새로운 형태의 살충 독소 단백질의 발견과 개발에 대한 지속적인 필요성을 창출한다. 향상된 효능을 갖고 더 넓은 스펙트럼의 민감성 곤충 종에 대한 제어를 나타내는 새로운 단백질 독소는 내성 대립유전자를 발달시킬 수 있는 살아남는 곤충의 수를 감소시킬 것이다. 이에 더하여, 하나의 식물에서 동일한 해충에게 독성이고 상이한 작용 방식을 나타내는 2가지 이상의 유전자도입 살충 독소 단백질, 또는 대안으로 독성 작용의 2가지 이상의 상이한 방식(예를 들면, 동일한 곤충 종에게 둘 모두 독성인, 펩티드 또는 단백질 독소를 인코딩하는 도입유전자와 연계된, 억제를 위해 필수 유전자를 표적화하는 dsRNA를 인코딩하는 도입유전자)의 이용은 임의의 단일 표적 곤충 종에서 내성의 확률 및 발달 가능성을 감소시킨다. 추가적으로, 자기 한정 기술 예컨대 Oxitec Ltd에 의해 제공된 것들의 이용은 본원 발명의 단백질과 함께 이용될 때, 본원 발명의 단백질을 발현하는 유전자도입 작물에 부여된 곤충 내성 형질의 내구력을 향상시킬 수 있다(Zhou et al. 2018. Evol Appl 11(5):727-738; Alphey et al. 2009. Journal of Economic Entomology, 102: 717-732).

따라서, 본 발명자들은 표적 나비목 종에 대항하여, 예컨대 검거세미나방(검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방과의 나방(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남방 거염벌레(스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 남서부 조명충나방(디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 그리고 콩 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens))에 대항하여 살충 활성을 각각 나타내는, 조작된 변이체 단백질 및 예시적인 재조합 단백질과 함께, 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 종으로부터 유래된 신규한 단백질을 본원에서 개시한다.

발명의 요약

신규한 살균살충 단백질, TIC13085 및 TIC13087이 본원에서 개시되는데, 이들은 농작물의 하나 이상의 해충에 대하여 저해 활성을 나타내는 것으로 밝혀진다. TIC13085 및 TIC13087 단백질은 제제에서 및 식물에서 단독으로 이용되거나 또는 다른 살충 단백질 및 독성 물질과 병용되어, 농업계에서 현재 이용되고 있는 살충 단백질 및 살충제 화학물질에 대한 대안을 제공할 수 있다.

한 구체예에서 살균살충 단백질 또는 이의 살균살충 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분절에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자가 제공되는데, 여기서 살균살충 단백질은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 살균살충 단백질은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분절은 엄격한 혼성화 조건하에 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 또는 서열 번호: 6에서 진술된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 이러한 재조합 핵산 분자는 살균살충 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 식물 세포에서 발현될 수 있으며, 식물 세포에서 발현될 때 살균살충 효과량의 살균살충 단백질 또는 이의 살균살충 단편을 생산한다.

다른 구체예에서 재조합 핵산 분자는 세균 또는 식물 숙주 세포 내에 존재한다. 예기된 세균 숙주 세포는 적어도 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 바실루스(Bacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 그리고 에르위니아(Erwinia)의 속을 포함한다. 일정한 구체예에서, 바실루스(Bacillus) 종은 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)이고, 브레비바실루스(Brevibacillus)는 브레비바실루스 라테로스포루스(Brevibacillus laterosporus)이고, 또는 에스케리키아(Escherichia) 종은 대장균(Escherichia coli)이다. 예기된 식물 숙주 세포는 쌍떡잎식물 세포 및 외떡잎식물 세포를 포함한다. 예기된 식물 세포는 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브라시카(머스타드 및 카놀라 포함), 당근, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수(스위트 옥수수 및 사료용 옥수수 포함), 클로버, 목화(고시피움(Gossypium) 종), 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테다소나무, 기장, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상식물, 야자과 식물, 목초, 완두콩, 땅콩, 고추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 평지씨(카놀라), 쌀, 근경, 호밀, 홍화, 관목, 솔검, 남방 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 스위트검, 고구마, 스위치 잔디, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 그리고 밀 식물 세포를 더욱 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 살균살충 단백질은 적어도 검거세미나방(검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방과의 나방(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남방 거염벌레(스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 남서부 조명충나방(디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 그리고 콩 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens))를 포함하는 나비목 곤충에 대한 활성을 나타낸다.

살균살충 효과량의 살균살충 단백질 TIC13085 또는 TIC13087 또는 이들의 살균살충 단편을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 세균 및 식물 및 식물 부분 또한 본 출원에서 예기된다. 재조합 분자(예를 들면 작제물)은 살균살충 단백질을 인코딩하는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 분절의 세균 또는 식물 세포에서 발현을 위한 이종성 프로모터를 포함할 수 있다. 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물 둘 모두 예기된다. 다른 구체예에서, 식물은 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브라시카(카놀라 또는 평지씨), 당근, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수(스위트 옥수수 및 사료용 옥수수 포함), 클로버, 목화(다시 말하면 고시피움(Gossypium) 종), 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테다소나무, 기장, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상식물, 야자과 식물, 목초, 완두콩, 땅콩, 고추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 쌀, 근경, 호밀, 홍화, 관목, 솔검, 남방 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 스위트검, 고구마, 스위치 잔디, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 그리고 밀 식물로 구성된 군에서 더욱 선택된다. 식물 부분은 예를 들면, 잎, 괴경, 뿌리, 줄기, 종자, 배아, 꽃, 꽃차례, 다래, 화분, 열매, 동물 사료, 그리고 바이오매스를 제한 없이 포함할 수 있다. 가공된 식물 부분, 예를 들면 목재 또는 오일, 생존불가능 분쇄 종자 또는 분획 종자, 가루, 또는 식물 잎, 꽃, 뿌리, 종자 또는 괴경으로부터 생산된 전분 또한 예기된다.

일정한 구체예에서, 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자가 개시된다.

또 다른 구체예에서, 본 출원에서 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 곤충 저해 조성물이 예기된다. 곤충 저해 조성물은 본원 발명의 살균살충 단백질과 상이한 적어도 하나의 다른 살균살충제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 다른 살균살충제는 곤충 저해 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자, 그리고 보조 단백질로 구성된 군에서 선택된다. 곤충 저해 조성물에서 다른 살균살충제는 나비목(Lepidoptera), 딱정벌레목(Coleoptera), 또는 노린재목(Hemiptera)의 하나 이상의 해충 종에 대한 활성을 나타내는 것으로 또한 예기된다. 곤충 저해 조성물에서 다른 살균살충제는 Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1C 변이체, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1A/F 키메라, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, Cry3A 변이체, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab,AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, 및 AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z 및 AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1, 그리고 전술한 것들의 살균살충 변이체, IP3 및 이의 변이체, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657, DIG-11 단백질, IDP102Aa 및 이의 동족체, IDP110Aa 및 이의 동족체, TIC868, Cry1Da1_7, BCW003, TIC1100, TIC867, TIC867_23, TIC6757. TIC7941, IDP072Aa, TIC5290, TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4029, TIC4064, IDP103 및 이의 동족체, PIP-50 및 PIP-65 및 이들의 동족체, PIP-83 및 이의 동족체, 그리고 Cry1B.34로 구성된 군에서 선택되는 구체예일 수 있다.

본원 발명의 검출 가능한 양의 재조합 핵산 분자 및 독소 단백질을 포함하는 일상 용품 또한 예기된다. 이런 일상 용품은 곡물 처리기에 의해 봉지에 넣어진 옥수수 상품, 옥수수 플레이크, 옥수수 케이크, 곡분, 옥수수 가루, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 사일리지, 옥수수 전분, 옥수수 곡물 등, 그리고 상응하는 콩, 쌀, 밀, 솔검, 나무콩, 땅콩, 열매, 멜론 및 야채 일상 용품(적용 가능한 경우에, 본원 발명의 검출 가능한 양의 이런 폴리뉴클레오티드 및 또는 폴리펩티드를 내포하는 주스, 농축물, 잼, 젤리, 마멀레이드, 그리고 이런 일상 용품의 다른 식용 형태 포함), 전체 또는 가공된 목화씨, 목화 오일, 린트, 사료 또는 식품, 섬유, 페이퍼, 바이오매스 및 연료 제품용으로 가공된 종자 및 식물 부분 예컨대 목화 오일로부터 유래된 연료 또는 목화 진 폐기물로부터 유래된 펠렛, 전체 또는 가공된 콩 종자, 대두유, 콩 단백질, 콩깻묵, 콩가루, 콩 플레이크, 콩겨, 두유, 콩 치즈, 콩 와인, 콩을 포함하는 동물 사료, 콩을 포함하는 페이퍼, 콩을 포함하는 크림, 콩 바이오매스, 그리고 콩 식물 및 콩 식물 부분을 이용하여 생산된 연료 제품을 포함한다.

TIC13085 및 TIC13087 독소 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자를 생산하는 방법이 또한 본 출원에서 예기된다. 상기 방법은 TIC13085 또는 TIC13087 독소를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 종자를 식재하는 단계; 상기 종자로부터 식물을 재배하는 단계; 그리고 상기 식물로부터 종자를 수확하되, 수확된 종자가 적용 가능한 독소를 인코딩하는 언급된 재조합 핵산 분자를 포함하는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 나비목 곤충 침입에 대해 내성인 식물이 제공되는데, 여기서 상기 식물의 세포는 TIC13085 또는 TIC13087 독소를 인코딩하는, 본원에서 설명된 재조합 핵산 분자를 내포한다.

나비목 종 해충을 제어하고 식물, 특히 농작물의 나비목 종 해충 침입을 제어하기 위한 방법 또한 본 출원에서 개시된다. 상기 방법은 한 구체예에서, 먼저 해충을 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 살충 효과량의 살균살충 단백질과 접촉시키거나; 또는 해충을 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는, 살충 효과량의 하나 이상의 이런 살균살충 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다.

TIC13085 및 TIC13087 독소 단백질 부류를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법이 본원에서 더욱 제공되는데, 여기서 상기 방법은 핵산의 샘플을, 엄격한 혼성화 조건하에 본원에서 제공된 살균살충 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분절을 포함하는 식물로부터 유전체 DNA에 혼성화하는 핵산 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 프로브는 이런 혼성화 조건하에 폴리뉴클레오티드 분절을 내포하지 않는 다른 모든 면에서 동질계 식물로부터 유전체 DNA에 혼성화하지 않고, 그리고 상기 프로브는 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6에서 진술된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 상동성이거나 또는 상보적이다. 상기 프로브는 또한, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 살균살충 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분절에 혼성화할 수 있다. 상기 방법은 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계, 그리고 상기 프로브 및 샘플의 DNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드 분절 예컨대 mRNA)의 혼성화를 검출하는 단계를 더욱 제공한다. 일부 구체예에서 TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질 부류의 구성원의 존재를 검출하는 단계는 ELISA 또는 웨스턴 블롯을 포함할 수 있는데, 여기서 TIC13085 또는 TIC13087의 에피토프를 인식하는 항체는 또한, 이러한 단백질 부류의 구성원의 유사하거나 또는 동일한 에피토프를, 본원에서 개시된 단백질의 것과 완전히 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질에서 인식하고 이들에 결합한다.

TIC13085 및 TIC13087 독소 단백질 부류로부터 살균살충 단백질 또는 이의 살균살충/살충 단편의 존재를 검출하는 방법 역시 본원에서 제공되는데, 여기서 상기 방법은 생물학적 샘플을 TIC13085 및 TIC13087 독소 단백질 부류 면역반응성 항체와 접촉시키는 단계, 그리고 샘플 내에서 TIC13085 및 TIC13087 독소 단백질 부류 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 검출하여, 샘플 내에서 관련된 단백질의 존재를 확증하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 검출 단계는 ELISA, 또는 웨스턴 블롯을 포함한다.

밭에서 나비목 해충 종 또는 해충 침입을 제어하기 위한 방법이 또한 예기되는데, 여기서 상기 방법은 TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질 또는 이들의 독성 단편과 유사하거나 또는 이들에 관련된 독소 단백질을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 유전체 내에 내포하는 작물 종자를 식재하는 단계, 그리고 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 살충 효과량의 살균살충 단백질을 세포 내에서 발현하는 유전자도입/재조합 농작물을 재배하거나, 또는 살균살충 단백질 중에서 적어도 하나가 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이라면, 살충 효과량의 하나 이상의 살균살충 단백질을 발현하는 농작물을 재배하는 단계; 그리고 임의적으로, 독소 단백질에 대한 하나 이상의 나비목 해충 종의 내성의 개시를 예방하거나 또는 지연시킬 목적으로, 자기 한정 유전자를 각각 보유하는 하나 이상의 유전자도입 나비목 해충 종을 밭 내에 또는 이와 가깝게 방출하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 농작물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물일 수 있다. 다른 구체예에서, 외떡잎식물 농작물은 옥수수, 밀, 솔검, 쌀, 호밀, 또는 기장일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 쌍떡잎식물 농작물은 콩, 목화, 또는 카놀라일 수 있다.

서열의 간단한 설명

서열 번호: 1은 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 획득된 TIC13085 살균살충 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이다.

서열 번호: 2는 TIC13085 살균살충 단백질의 아미노산 서열이다.

서열 번호: 3은 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 획득된 TIC13087 살균살충 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이다.

서열 번호: 4는 TIC13087 살균살충 단백질의 아미노산 서열이다.

서열 번호: 5는 TIC13085를 인코딩하는 식물 세포에서 발현에 이용된 합성 코딩 서열이다.

서열 번호: 6은 TIC13087을 인코딩하는 식물 세포에서 발현에 이용된 합성 코딩 서열이다.

발명의 상세한 설명

농업 해충 제어의 분야에서 한 가지 문제점은 표적 해충에 대하여 유효하고, 표적 해충 종에 대하여 넓은 스펙트럼의 독성을 나타내며, 바람직하지 않은 작물학적 문제를 야기하지 않으면서 식물에서 발현될 수 있고, 식물에서 상업적으로 이용되는 현재 독소와 비교하여 대안적 작용 방식을 제공하는 새로운 독소 단백질에 대한 필요성으로서 특징화될 수 있다.

TIC13085 및 TIC13087에 의해 예시된 신규한 살균살충 단백질이 본원에서 개시되고, 그리고 특히 넓은 스펙트럼의 나비목 해충에 대항하여, 예컨대 검거세미나방(검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방과의 나방(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남방 거염벌레(스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 남서부 조명충나방(디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 그리고 콩 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens))에 대항하여 당해 분야에서 이들 문제점 각각을 해소한다.

본 출원에서 TIC13085, "TIC13085 단백질", "TIC13085 단백질 독소", "TIC13085 살균살충 단백질", "TIC13085 관련 독소", "TIC13085 관련 독소", "TIC13085 단백질 독소 부류", "TIC13085 독소 단백질 부류" 등에 대한 언급은 만약 이런 단백질 및 TIC13085의 정렬이 약 88% 내지 약 100%의 임의의 분획 백분율의 아미노산 서열 동일성을 야기한다면, 살균살충 또는 곤충 저해 활성을 나타내는 임의의 단백질을 비롯하여, 나비목 해충에 대한 활성을 부여하는, TIC13085(서열 번호: 2)에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 임의의 살균살충 단백질 또는 곤충 저해 단백질, 그리고 이의 살균살충 또는 곤충 저해 분절, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 이것과 실제적으로 상동하거나, 이것과 유사하거나, 또는 이것으로부터 유래된, 임의의 신규한 살균살충 단백질 또는 곤충 저해 단백질을 지칭한다. TIC13085 단백질은 이들 단백질의 색소체 표적화된 및 비-색소체 표적화된 형태 둘 모두를 포함한다.

TIC13087, "TIC13087 단백질", "TIC13087 단백질 독소", "TIC13087 살균살충 단백질", "TIC13087 관련 독소:, "TIC13087 관련 독소", "TIC13087 단백질 독소 부류", "TIC13087 독소 단백질 부류" 등에 대한 언급은 만약 이런 아미노산 서열 및 TIC13087의 아미노산 서열의 정렬이 약 88% 내지 약 100%의 임의의 분획 백분율의 아미노산 서열 동일성을 야기한다면, 살균살충 또는 곤충 저해 활성을 나타내는 임의의 단백질을 비롯하여, 나비목 해충에 대한 활성을 부여하는, TIC13087(서열 번호: 4)에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 임의의 살균살충 단백질 또는 곤충 저해 단백질, 그리고 이의 살균살충 또는 곤충 저해 단편 또는 분절, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 이것과 실제적으로 상동하거나, 이것과 유사하거나, 또는 이것으로부터 유래된, 임의의 신규한 살균살충 단백질 또는 곤충 저해 단백질을 지칭한다. TIC13087 단백질은 이들 단백질의 색소체 표적화된 및 비-색소체 표적화된 형태 둘 모두를 포함한다.

용어 "분절" 또는 "단편"은 TIC13085 또는 TIC13087 코딩 서열 또는 단백질을 기술하는 완전한 아미노산 또는 핵산 서열보다 짧은 연속 아미노산 또는 핵산 서열을 설명하기 위해 본 출원에서 이용된다. 만약 이런 분절 또는 단편 및 서열 번호: 2에서 진술된 TIC13085 단백질 또는 서열 번호: 4에서 진술된 TIC13087 단백질의 상응하는 섹션의 정렬이 이러한 분절 또는 단편 및 TIC13085 또는 TIC13087 단백질 내에 아미노산의 상응하는 분절 사이에 약 85% 또는 약 88% 내지 약 100%의 임의의 분획 백분율의 아미노산 서열 동일성을 야기하면, 곤충 저해 활성을 나타내는 분절 또는 단편 또한, 본 출원에서 개시된다. 본원에서 설명된 바와 같은 단편은 TIC13085 또는 TIC13087 단백질의 적어도 50, 적어도 100, 적어도 250, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 또는 적어도 800개의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어 "활성적" 또는 "활성", "살균살충 활성" 또는 "살균살충" 또는 "살충 활성", "곤충 저해", "살충성으로 효과적인" 또는 "살충"에 대한 언급은 해충의 저해(성장, 영양공급, 번식력 또는 생존력을 저해), 억제(성장, 영양공급, 번식력 또는 생존력을 억제), 제어(해충 침입을 제어, 효과량의 TIC13085 또는 TIC13087 단백질을 내포하는 특정 작물에 대한 해충 영양공급 활동을 제어), 또는 사멸(이환률, 치사율 또는 감소된 생식력을 야기)에서, 단백질 독소와 같은 독성 물질의 효능을 지칭한다. 이들 용어는 독성 단백질에 대한 해충의 노출이 이환율, 치사율, 감소된 생식력, 또는 저성장성을 야기하는, 해충에 독성인 단백질의 살균살충 효과량을 제공한 결과를 포함하는 것으로 의도된다. 이들 용어는 또한, 식물 내에 또는 식물 상에 살균살충 효과량의 독성 단백질을 제공한 결과로서, 식물, 식물의 조직, 식물 부분, 종자, 식물 세포로부터, 또는 식물이 성장할 수 있는 특정 지리적 위치로부터 해충의 반발을 포함한다. 일반적으로, 살균살충 활성은 성장, 발달, 생존력, 영양공급 거동, 교미 거동, 생식력의 저해, 또는 곤충 영양공급에 의해 야기된 부작용의 임의의 측정 가능한 감소에 효과적인 독성 단백질의 능력을 지칭한다. 독성 단백질은 식물에 의해 생성될 수 있거나, 또는 식물에 또는 식물이 위치되어 있는 위치 내의 환경에 적용될 수 있다. 용어 "생체활성", "효과적인", "유효한" 또는 이들의 변형은 또한, 표적 곤충 해충에 대한 본원 발명의 단백질의 효과를 설명하기 위해 본 출원에서 교체가능하게 이용되는 용어이다.

표적 해충의 식이에 제공될 때, 독성 물질의 살균살충 효과량은 이러한 독성 물질이 해충에 접촉할 때 살균살충 활성을 나타낸다. 독성 물질은 당해 분야에서 공지된 살균살충 단백질 또는 한 가지 이상의 화학적 작용제일 수 있다. 살균살충 또는 살충 화학적 작용제는 단독으로 이용되거나 또는 서로 병용될 수 있다. 화학적 작용제는 표적 해충에서 억제를 위해 특정 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자, 유기클로라이드, 유기인산염, 카바메이트, 피레트로이드, 네오니코티노이드 및 리아노이드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 살균살충 또는 살충 단백질 작용제는 본 출원에서 진술된 단백질 독소뿐만 아니라, 나비목을 표적화하는 것들을 비롯한 다른 단백질성 독성 물질뿐만 아니라, 딱정벌레목, 노린재목 및 매미목 종을 제어하는 데 이용하기 위한 당해 분야에서 가용한 Cry, Vip 및 Cyt 단백질과 같은, 다른 식물 해충을 제어하는 데 이용되는 단백질 독소를 포함한다.

해충, 특히 농작물의 해충에 대한 언급은 TIC13085 또는 TIC13087 단백질 독소 부류에 의해 제어되는 농작물의 해충, 특히 나비목(Lepidoptera) 해충을 의미하는 것으로 의도된다. 하지만, 해충에 대한 언급은 또한, 식물의 딱정벌레목, 노린재목 및 매미목 해충뿐만 아니라, 이들 해충을 표적화하는 독성 물질이 TIC13085 또는 TIC13087 단백질, 또는 TIC13085 또는 TIC13087 단백질과 85 내지 약 100 퍼센트 동일한 단백질과 공동국지화되거나 또는 함께 존재할 때 선충 및 진균을 포함할 수 있다. 관용구 "함께 존재하는" 또는 "공동국지화된"은 표적 해충이 TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질뿐만 아니라 표적 해충에 비하여 살균살충 효과량으로 또한 존재하는 임의의 다른 독성 물질과 접촉한 임의의 사례를 포함하는 것으로 의도된다. "접촉된"은 일정한 구체예에서 표적 해충의 식이, 그리고 표적 해충에 의해 소비되는 식이 내에 존재하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다.

TIC13085 및 TIC13087 단백질은 공통 기능으로 관련되고, 그리고 성충, 번데기, 유충 및 신생아(neonate)를 비롯한, 나비목(Lepidoptera) 곤충 종으로부터 해충을 향한 살충 활성을 나타낸다.

나비목(Lepidoptera)의 곤충은 거염벌레, 야도충, 자벌레, 그리고 밤나방과(Noctuidae)에서 헬리오틴, 예를 들면, 밤나방과의 나방(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 콩나물 나방(크로시도세마 아포레마(Crocidosema aporema)), 사탕무 거염벌레(스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua)), 검정 거염벌레(스포도프테라 코스미오이데스(Spodoptera cosmioides)), 남방 거염벌레(스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 베르타 거염벌레(마메스트라 콘피구라타(Mamestra configurata)), 검거세미나방(검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 양배추 자벌레(트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)), 콩 자벌레(슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens)), 해바라기 자벌레(라치플루시아 누(Rachiplusia nu)), 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈라스(Anticarsia gemmatalis)), 녹색 클로버웜(히페나 스카브라(Hypena scabra)), 회색담배나방(헬리오티스 비레스첸스(Heliothis virescens)), 과립 야도충(아그로티스 서브테라네아(Agrotis subterranea)), 거염벌레(슈달레티아 유니푼크타(Pseudaletia unipuncta)), 해바라기 자벌레(라치플루시아 누(Rachiplusia nu)), 남아메리카 포드웜(헬리코베르파 겔로토포에온(Helicoverpa gelotopoeon)), 서부 야도충(아그로티스(아그로티스 오르소고니아(Agrotis orthogonia)); 명나방과(Pyralidae)로부터 유래된 천공충, 보호 고치를 만드는 애벌레, 벌집나방, 뿔나방, 배추벌레 및 스켈레톤라이저, 예를 들면, 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 네이블 오렌지 벌레(아미엘로이스 트란시텔라(Amyelois transitella)), 옥수수 뿌리 벌집나방(크람부스 칼리지노셀루스(Crambus caliginosellus)), 옷좀나방(헤르페토그람마 리카르시살(Herpetogramma licarsisalis)), 해바라기 나방(호모에오소마 엘렉텔룸(Homoeosoma electellum)), 명충나방의 유충(엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus)); 잎말이나방과(Tortricidae)에서 잎말이나방, 버드웜, 종자 벌레 및 과일 벌레, 예를 들면, 코들링 나방(시디아 포모넬라(Cydia pomonella)), 포도 베리 나방(엔도피자 비테아나(Endopiza viteana)), 오리엔탈 과일 나방(그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta)), 해바라기 순 나방(술레이마 헬리안타나(Suleima helianthana); 그리고 많은 다른 경제적으로 중요한 나비목(Lepidoptera), 예를 들면, 배추좀나방(배추좀나방(Plutella xylostella)), 핑크색 목화다래벌레(펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella)) 및 매미 나방(매미나방(Lymantria dispar))을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 나비목(Lepidoptera) 내에 다른 해충은 예를 들면, 목화 잎벌레(알라바마 아르길라체아(Alabama argillacea)), 과수 잎말이나방(아르칩스 아르기로스필라(Archips argyrospila)), 유럽 잎말이나방(아르칩스 로사나(Archips rosana)) 및 다른 딸기잎말이나방(Archips) 종, (이화명나방(Chilo suppressalis), 아시아 벼 천공충, 또는 벼 줄기 천공충), 벼 잎말이나방(혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis)), 옥수수 뿌리 벌집나방(크람부스 칼리지노셀루스(Crambus caliginosellus)), 블루그래스 벌집나방(크람부스 테테렐루스(Crambus teterrellus)), 남서부 조명충나방(디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 사탕수수 천공충(디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis)), 스피니 다래벌레(에아리아스 인술라나(Earias insulana)), 반점 다래벌레(에아리아스 비텔라(Earias vittella)), 미국 다래벌레(헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)), 큰담배밤나방의 유충(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea), 콩 포드웜 및 목화다래벌레로서 또한 알려져 있음), 회색담배나방(헬리오티스 비레스첸스(Heliothis virescens)), 옷좀나방(헤르페토그람마 리카르시살(Herpetogramma licarsisalis)), 서부 콩 야도충(Striacosta albicosta), 유럽 포도 덩굴 나방(로베시아 보트라나(Lobesia botrana)), 감귤류 잎나방벌레(필로크니스티스 시트렐라(Phyllocnistis citrella)), 큰 흰색 나비(피에리스 브라시케(Pieris brassicae)), 작은 흰색 나비(피에리스 라파에(Pieris rapae), 수입 배추벌레로서 또한 알려져 있음), 사탕무 거염벌레(스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua)), 담배 야도충(스포도프테라 리투라(Spodoptera litura), 클러스터 애벌레로서 또한 알려져 있음), 그리고 토마토 잎나방벌레(투타 압솔루타(Tuta absoluta))를 포함한다.

본 출원에서 "단리된 DNA 분자", 또는 동등한 용어 또는 관용구에 대한 언급은 상기 DNA 분자가 자연 환경 내에서가 아닌, 단독으로 또는 다른 조성물과 조합으로 존재한다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 생물체의 유전체의 DNA 내에서 자연적으로 발견되는 핵산 요소, 예컨대 코딩 서열, 인트론 서열, 번역되지 않은 리더 서열, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등은 상기 요소가 생물체의 유전체 내에 있고 이것이 자연적으로 발견되는 유전체 내에 위치에 있기만 하면, "단리된" 것으로 간주되지 않는다. 하지만, 이들 요소 각각 및 이들 요소의 하위부분은 상기 요소가 생물체의 유전체 내에 있지 않고 이것이 자연적으로 발견되는 유전체 내에 위치에 있지 않기만 하면, 본원 발명의 범위 내에서 "단리"될 것이다. 유사하게, 살충 단백질 또는 상기 단백질의 임의의 자연 발생 살충 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 단백질을 인코딩하는 서열이 자연적으로 발견되는 세균의 DNA 내에 상기 뉴클레오티드 서열이 있지 않기만 하면, 단리된 뉴클레오티드 서열일 것이다. 자연발생 살충 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 합성 뉴클레오티드 서열은 본원 발명의 목적으로 단리된 것으로 간주될 것이다. 본원 발명의 목적으로, 임의의 유전자도입 뉴클레오티드 서열, 다시 말하면, 식물 또는 세균의 세포의 유전체 내로 삽입된, 또는 염색체외 벡터에서 존재하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 이것이 세포를 형질전환하는 데 이용된 플라스미드 또는 유사한 구조 내에 존재하거나, 식물 또는 세균의 유전체 내에 존재하거나, 또는 식물 또는 세균으로부터 유래된 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 일상 용품에서 검출 가능한 양으로 존재하는지에 상관없이, 단리된 뉴클레오티드 서열인 것으로 간주될 것이다.

본 출원에서 용어 "자기 한정 유전자"에 대한 언급은 숙주의 생존을 한정하여, 숙주 모집단의 감소를 야기하는 유전자를 지칭한다. 이런 기술은 예를 들면, Oxitech Ltd에 의해 제공된다. 유전자도입 자기 한정 유전자를 보유하는 유전자도입 수컷 곤충이 방출되고 야생 암컷과 번식한다. 결과적으로, 자손이 자기 한정 유전자의 사본을 물려받는다. 예를 들면, Oxitech Ltd에 의해 개발된 자기 한정 배추좀나방(배추좀나방(Plutella xylostella)) 균주 OX4319L은 성별 결정 유전자 doublesex(dsx)로부터 서열을 활용하는 수컷 선택 유전자를 보유한다. 상기 유전자는 성별 교체 스플라이싱을 발현하여, 자기 한정 유전자의 암컷 특이적 발현을 야기하는데, 이것은 암컷 자손이 유충기를 넘어 생존하는 것을 예방하고 자기 한정 나방의 수컷 코호트만의 생산을 가능하게 한다. 방출된 후, 수컷은 자연 발생 야생형 암컷과 짝을 이루어 차세대에서 암컷 자손 수의 감소를 야기하고, 그것에 의하여 배추좀나방(P. xylostella) 모집단을 국지적으로 억제한다. 배추좀나방 생산 시설 내에 방출을 위한 많은 수의 수컷의 사육을 가능하게 하기 위해, OX4319L 균주 내에 암컷 특이적 dsx의 발현이 애벌레 사료 내로 테트라사이클린 또는 적합한 유사체의 첨가에 의해 억제된다. OX4319L은 또한, 형광 단백질, DsRed를 발현하는데, 이것은 밭에서 이러한 계통의 존재의 모니터링을 허용한다(Jin et al., 2013. Engineered female-specific lethality for control of pest Lepidoptera. ACS Synthetic Biology, 2: 160-166). 이러한 기술은 본원 발명의 독소 유전자를 내포하는 식물이 밭에 적용될 때, 본원 발명의 독소 유전자와 단백질에 의한 제어를 위해 표적화되는 해충 종의 내성의 개시를 지연시키거나 또는 예방하여, 본원 발명의 독소 유전자와 단백질을 내포하는 임의의 식물 생성물의 더 큰 내구력을 제공할 수 있다.

본 출원에서 더욱 설명된 바와 같이, TIC13085(서열 번호: 1)를 인코딩하는 개방 해독틀(ORF)이, 토양 샘플로부터 성장된 세균의 평판 스크레이프를 이용한 메타유전체 염기서열분석 노력의 일부로서 Idaho의 Genessee의 밀밭에서 토양으로부터 단리된 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 획득된 DNA에서 발견되었다. 생물학적 검정에서 이용된 재조합 단백질을 생산하기 위해, 코딩 서열이 클로닝되고 미생물 숙주 세포에서 발현되었다. 재조합 미생물 숙주 세포 유래된 TIC13085 단백질을 이용한 생물학적 검정은 나비목 종 밤나방과의 나방(FAW, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 콩 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens)), 그리고 남서부 조명충나방(SWC, 디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella))에 대한 활성을 증명하였다. 또한 본 출원에서 더욱 설명된 바와 같이, TIC13087(서열 번호: 3) 독소 단백질을 인코딩하는 개방 해독틀(ORF)이, 토양으로부터 유래된 세균의 평판 스크레이프를 이용한 메타유전체 염기서열분석 노력의 일부로서 North Dakota의 Ashley의 밀밭에서 토양으로부터 단리된 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 획득된 DNA에서 발견되었다. 재조합 미생물 숙주 세포 유래된 TIC13087 단백질을 이용한 생물학적 검정은 나비목 종 검거세미나방(BCW, 검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(CEW, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 그리고 남서부 조명충나방(SWC, 디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella))에 대한 활성을 증명하였다.

TIC13085(서열 번호: 5) 및 TIC13087(서열 번호: 6)을 발현하기 위해, 식물 세포에서 이용을 위해 설계된 합성 코딩 서열이 생성되었다. TIC13085를 발현하는 콩 식물은 나비목 종 밤나방과의 나방(FAW, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남방 거염벌레(SAW, 스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 그리고 콩 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens))에 대한 활성을 나타냈다. TIC13087을 발현하는 콩 식물은 팥 나방(SPW)으로서 또한 알려져 있는 나비목 종 큰담배밤나방의 유충(CEW, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea))에 대한 활성을 나타냈다. TIC13085를 발현하는 옥수수 식물은 나비목 종 유럽 조명충나방(ECB, 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방과의 나방(FAW, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 그리고 남서부 조명충나방(SWC, 디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella))에 대한 활성을 나타냈다. TIC13087을 발현하는 옥수수 식물은 나비목 종 큰담배밤나방의 유충(CEW, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 유럽 조명충나방(ECB, 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 그리고 남서부 조명충나방(SWC, 디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella))에 대한 활성을 나타냈다.

식물 세포에서 발현을 위해, TIC13085(서열 번호: 2) 및 TIC13087(서열 번호: 4) 단백질은 시토졸에 상주하도록 발현되거나, 또는 식물 세포 내에 다양한 세포 소기관으로 표적화될 수 있다. 예를 들면, 엽록체 또는 색소체에 대한 단백질의 표적화는 오프-표현형이 발생하는 것을 예방하면서, 유전자도입 식물에서 발현된 단백질의 수준 증가를 야기할 수 있다. 표적화는 또한, 유전자도입 사건에서 내충성 효능의 증가를 야기할 수 있다. 표적 펩티드 또는 수송 펩티드는 핵, 미토콘드리아, 소포체(ER), 엽록체, 아포플라스트, 과산화소체 및 원형질막을 비롯한, 세포 내에 특정 영역으로 단백질의 수송을 주도하는 짧은(3개 내지 70개의 아미노산 길이) 펩티드 사슬이다. 일부 표적 펩티드는 단백질이 적용 가능한 소기관 내로 수송된(또는 이입된) 후 신호 펩티다아제에 의해 단백질로부터 개열된다. 엽록체에 대한 표적화를 위해, 단백질은 대략 40개 내지 50개의 아미노산인 수송 펩티드를 내포한다. 엽록체 수송 펩티드의 이용에 관한 설명을 위해, U.S. 특허 번호 5,188,642 및 5,728,925를 참조한다. 많은 엽록체 국지화된 단백질은 핵 유전자로부터 전구체로서 발현되고, 그리고 N 말단 배치된 엽록체 수송 펩티드(CTP)에 의해 엽록체로 표적화된다. 이런 단리된 CTP의 실례는 리불로오스-1,5-비스인산염 카르복실라아제, 페레독신, 페레독신 산화환원효소의 작은 아단위(SSU), 집광성 복합체 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F, 에놀피루빌 시키메이트 포스페이트 신타아제(EPSPS), 그리고 U.S. 특허 번호 7,193,133에 설명된 수송 펩티드와 연관된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 비-엽록체 단백질은 이종성 CTP와의 단백질 융합의 이용에 의해 엽록체로 표적화될 수 있고, 그리고 CTP는 단백질을 엽록체로 표적화하는 데 충분한 것으로 생체내에서 및 시험관내에서 증명되었다. 적합한 엽록체 수송 펩티드, 예컨대 애기장대(Arabidopsis thaliana) EPSPS CTP(CTP2)(참조: Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) 또는 페튜니아(Petunia hybrida) EPSPS CTP(CTP4)(참조: della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986)의 통합은 유전자도입 식물에서 이종성 EPSPS 단백질 서열을 엽록체로 표적화하는 것으로 밝혀졌다(참조: U.S. 특허 번호 5,627,061; 5,633,435; 및 5,312,910; 그리고 EP 0218571; EP 189707; EP 508909; 및 EP 924299). TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 엽록체로 표적화하기 위해, 엽록체 수송 펩티드를 인코딩하는 서열은 식물 세포에서 발현을 위해 설계된, TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열의 5'에 작동 가능한 연쇄 및 인프레임으로 배치된다.

TIC13085 및 TIC13087에 관련된 추가적인 독소 단백질 서열이 신규한 특성을 갖는 신규한 단백질을 창출하기 위해 TIC13085 및 TIC13087의 아미노산 서열을 이용하여 창출될 수 있는 것으로 예기된다. TIC13085 및 TIC13087 독소 단백질은 아미노산 서열 수준에서 차이를 신규한 아미노산 서열 변이체 내로 조합하고 이들 변이체를 인코딩하는 재조합 핵산 서열에 적절한 변화를 만들기 위해 정렬될 수 있다.

본원 발명은 TIC13085 및 TIC13087 단백질 독소 부류의 향상된 변이체가 당해 분야에서 공지된 다양한 유전자 편집 방법을 이용함으로써 식물에서 조작될 수 있다는 것을 더욱 예기한다. 유전체 편집에 이용되는 이런 기술은 ZFN(아연 핑거 뉴클레아제), 메가뉴클레아제, TALEN(전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제), 그리고 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-관련) 시스템을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이들 유전체 편집 방법은 식물 세포 내에서 형질전환된 독소 단백질 코딩 서열을 상이한 독소 코딩 서열로 변경하는 데 이용될 수 있다. 구체적으로, 이들 방법을 통해, 독소 코딩 서열 내에 하나 이상의 코돈이 새로운 단백질 아미노산 서열을 조작하기 위해 변경된다. 대안으로, 새로운 독소 코딩 서열을 조작하기 위해, 코딩 서열 내에 단편이 대체되거나 결실되고, 또는 추가 DNA 단편이 코딩 서열 내로 삽입된다. 새로운 코딩 서열은 해충에 대한 증가된 활성 또는 스펙트럼과 같은 새로운 특성을 갖는 독소 단백질을 인코딩할 수 있을 뿐만 아니라, 본래 곤충 독소 단백질에 대한 내성이 발달한 해충 종에 대한 활성을 제공할 수 있다. 유전자 편집된 독소 코딩 서열을 포함하는 식물 세포는 새로운 독소 단백질을 발현하는 전체 식물을 생성하기 위해 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 이용될 수 있다.

TIC13085 또는 TIC13087의 단편, 또는 이들의 단백질 변이체는 하나 이상의 아미노산이 N 말단 단부, C 말단 단부, 단백질의 중간, 또는 이들의 조합으로부터 결실되는 절두된 형태일 수 있는 것으로 또한 예기되는데, 여기서 이들 단편 및 변이체는 곤충 저해 활성을 유지한다. 이들 단편은 TIC13085 또는 TIC13087의 자연 발생 또는 합성 변이체, 또는 유도된 단백질 변이체일 수 있지만, 적어도 TIC13085 또는 TIC13087 전장 독소 단백질의 곤충 저해 활성을 유지해야 한다.

TIC13085 또는 TIC13087 단백질과 유사한 단백질은 당해 분야에서 공지된 다양한 컴퓨터 기반 알고리즘을 이용하여 확인되고 서로 비교될 수 있다(표 1 참조). 본 출원에서 보고된 아미노산 서열 동일성은 아래의 디폴트 파라미터를 이용한 Clustal W 정렬의 결과이다: 중량 매트릭스; 블로섬(blosum), 갭 오프닝 페널티: 10.0, 갭 연장 페널티: 0.05, 친수성 갭: 온(On), 친수성 잔기: GPSNDQERK, 잔기 특이적 갭 페널티: 온(On)(Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). 퍼센트 아미노산 동일성은 (아미노산 동일성/대상 단백질의 길이)에 의해 곱해진 100%의 결과물에 의해 더욱 계산된다. 다른 정렬 알고리즘 역시 당해 분야에서 가용하고, Clustal W 정렬을 이용하여 획득된 것들과 유사한 결과를 제공하며, 본원에서 예기된다.

나비목 곤충 종에 대하여 곤충 저해 활성을 나타내는 단백질은, 만약 상기 단백질이 조회에서, 예를 들면, Clustal W 정렬에서 이용되면 TIC13085 또는 TIC13087에 관련되는 것으로 의도되고, 그리고 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4로서 진술된 바와 같은 본원 발명의 단백질은 이런 정렬에서 히트(hit)로서 확인되는데, 여기서 조회 단백질은 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이러한 범위 내에 임의의 분획 백분율인, 조회 단백질의 길이를 따라서 적어도 87% 내지 약 100% 아미노산 동일성을 나타낸다.

예시적인 TIC13085 및 TIC13087 단백질은 Clustal W 알고리즘을 이용하여 서로 정렬되었다. 표 1에서 보고된 바와 같이, 단백질 각각에 대한 퍼센트 아미노산 서열 동일성의 쌍별 매트릭스가 창출되었다. 이들 독소 단백질은 정렬된 서열의 전체 길이를 따라서 82% 아미노산 서열 동일성을 나타냈고, 그리고 TIC13087에서 802개의 아미노산과 대비하여 TIC13085에서 803개의 아미노산 중에서 663개의 아미노산이 위치적으로 동일하였다.

표 1. 예시적인 TIC13085 및 TIC13087 단백질의 쌍별 매트릭스 디스플레이.

독소 & (서열 번호)	TIC13085 서열 번호 2	TIC13087 서열 번호 4
TIC13085 서열 번호 2	-	82.6 (663)
TIC13087 서열 번호 4	82.7 (663)	-

퍼센트 아미노산 서열 동일성 이외에, TIC13085 및 TIC13087은 또한, 아미노산 서열 길이에 의해, 그리고 다른 특징에 의해 일차 구조(보존된 아미노산 모티프)와 상대적으로 비교될 수 있다. TIC13085 및 TIC13087 단백질 독소의 특징은 표 2에서 보고된다.

표 2. TIC13085 및 TIC13087 단백질 독소의 선택된 특징.

단백질	분자량(달톤)	아미노산 길이	등전점	PH 7.0에서 전하	소수성 아미노산의 수	극성 아미노산의 수	강염기성(-) 아미노산의 수	강산성 아미노산의 수
TIC13085	90878.28	803	4.6994	-21.5	387	416	88	106
TIC13087	90495.43	802	4.3879	-34.5	386	416	76	108

본 출원의 실시예에서 더욱 설명된 바와 같이, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6에서 각각 진술된 바와 같은, TIC13085 및 TIC13087을 인코딩하는 합성 핵산 서열이 식물에서 이용을 위해 설계되었다.

재조합 핵산 분자 서열을 내포하는 발현 카세트 및 벡터는 당해 분야에서 공지된 형질전환 방법과 기술에 따라서 작제되고 옥수수, 콩 또는 목화 식물 세포와 같은 식물 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환이 U.S. 특허 출원 공개 2009/0138985A1(콩), 2008/0280361A1(콩), 2009/0142837A1(옥수수), 2008/0282432(목화), 2008/0256667(목화), 2003/0110531(밀), 2001/0042257 A1(사탕무), U.S. 특허 번호 5,750,871(카놀라), 7,026,528(밀) 및 6,365,807(쌀), 그리고 Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:213-222(사탕수수)에서 설명된다. 형질전환 세포는 TIC13085 및 TIC13087 단백질을 발현하는 형질전환 식물로 재생될 수 있고, 그리고 형질전환 식물로부터 획득된 식물 엽편을 이용하여 나비목 해충 유충의 존재에서 수행된 생물학적 검정을 통해 살균살충 활성을 나타낸다. 식물은 재생, 종자, 화분, 또는 분열 조직 형질전환 기술에 의해 식물 세포로부터 유래될 수 있다. 식물을 형질전환하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다.

전통적인 형질전환 방법에 대한 대안으로서, DNA 서열, 예컨대 도입유전자, 발현 카세트(들) 등이 부위 지향된 통합을 통해 식물 또는 식물 세포의 유전체 내에 특정한 부위 또는 좌위 내로 삽입되거나 또는 통합될 수 있다. 본원 발명에 따른 재조합 DNA 작제물(들) 및 분자(들)는 따라서, 적어도 하나의 도입유전자, 발현 카세트, 또는 식물 또는 식물 세포의 유전체 내로 삽입하기 위한 다른 DNA 서열을 포함하는 공여자 주형 서열을 포함할 수 있다. 부위 지향된 통합을 위한 이러한 공여자 주형은 삽입 서열(다시 말하면, 식물 유전체 내로 삽입되는 서열, 도입유전자, 카세트 등)에 측접하는 하나 또는 두 개의 상동성 팔을 더욱 포함할 수 있다. 본원 발명의 재조합 DNA 작제물(들)은 부위 지향된 통합을 실행하기 위한 부위 특이적 뉴클레아제 및/또는 임의의 연관된 단백질(들)을 인코딩하는 발현 카세트(들)를 더욱 포함할 수 있다. 이들 뉴클레아제 발현 카세트(들)는 공여자 주형과 동일한 분자 또는 벡터(시스 형태) 내에, 또는 별개의 분자 또는 벡터(트랜스 형태) 상에 존재할 수 있다. 원하는 유전체 부위 또는 좌위에서 이중 가닥 절단(DSB; double strand break) 또는 틈(nick)을 생성하기 위해 유전체 DNA를 절단하는 상이한 단백질(또는 단백질 및/또는 안내 RNA의 복합체)을 수반하는, 부위 지향된 통합을 위한 여러 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다. 간단히 말하면 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 뉴클레아제 효소에 의해 도입된 DSB 또는 틈을 복원하는 과정 동안, 공여자 주형 DNA는 DSB 또는 틈의 부위에서 유전체 내로 통합될 수 있다. 공여자 주형에서 상동성 팔(들)의 존재는 비록 삽입 사건이 비상동성 말단 연결(NHEJ)을 통해 일어날 수도 있긴 하지만, 상동성 재조합을 통한 복원 과정 동안 식물 유전체 내로 삽입 서열의 입양 및 표적화를 증진할 수 있다. 이용될 수 있는 부위 특이적 뉴클레아제의 실례는 아연 핑거 뉴클레아제, 조작된 또는 선천적 메가뉴클레아제, TALEN-엔도뉴클레아제, 그리고 RNA 안내 엔도뉴클레아제(예를 들면, Cas9 또는 Cpf1)를 포함한다. RNA 안내 부위 특이적 뉴클레아제(예를 들면, Cas9 또는 Cpf1)를 이용하는 방법의 경우에, 재조합 DNA 작제물(들)은 또한, 식물 유전체 내에 원하는 부위로 뉴클레아제를 지향시키기 위해 하나 이상의 안내 RNA를 인코딩하는 서열을 포함할 것이다.

세균 및 식물 발현된 TIC13085 및 TIC13087 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열 조성물은 재조합 DNA 작제물과 함께 발현될 수 있는데, 여기서 상기 단백질을 인코딩하는 ORF(개방 해독틀)를 갖는 폴리뉴클레오티드 분절은 작제물이 의도되는 시스템에서 발현 제어에 필요한 프로모터 및 임의의 다른 조절 요소와 같은 유전적 조절/발현 요소에 작동가능하게 연결된다. 무제한적 실례는 식물에서 단백질의 발현을 위해 TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열에 작동가능하게 연결된 식물-기능적 프로모터, 또는 Bt 세균 또는 다른 바실루스(Bacillus) 종에서 상기 단백질의 발현을 위해 TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열에 작동가능하게 연결된 Bt-기능적 프로모터를 포함한다. 인핸서, 오퍼레이터, 인트론, 번역되지 않은 리더, 인코딩된 단백질 고정 태그(HIS-태그), 전위 펩티드(다시 말하면, 색소체 수송 펩티드, 신호 펩티드), 번역후 개질 효소에 대한 폴리펩티드 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 그리고 RNAi 표적 부위를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 요소가 TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그것과 함께 제공되는 예시적인 재조합 폴리뉴클레오티드 분자는 서열 번호: 2에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열(서열 번호: 1 및 서열 번호: 5에 의해 인코딩됨) 및 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열(서열 번호: 3 및 서열 번호: 6에 의해 인코딩됨)을 갖는 개별 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 예컨대 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하지만 이것에 한정되지 않는다. 이종성 프로모터는 또한, 색소체 표적화 TIC13085 또는 TIC13087을 인코딩하는 합성 DNA 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 개시된 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 코돈은 동의 코돈에 의해 치환될 수 있다(당해 분야에서 침묵 치환으로서 알려짐).

TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물은 TIC13085 또는 TIC13087 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자, 또는 보조 단백질을 인코딩하는 DNA 서열과 동시에 발현하거나 공동발현하도록 구성될 수 있는 하나 이상의 곤충 저해제를 인코딩하는 DNA의 영역을 더욱 포함할 수 있다. 보조 단백질은 예를 들면, 발현을 보조하고, 식물에서 안정성에 영향을 주며, 소중합체화를 위한 자유 에너지를 최적화하고, 독성을 증가시키며, 활성 스펙트럼을 증가시킴으로써, 곤충 저해제의 유용성을 보조하는 기능을 하는 보조인자, 효소, 결합 파트너, 또는 다른 작용제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 보조 단백질은 예를 들면, 하나 이상의 곤충 저해제의 흡수를 조장할 수 있거나, 또는 독성 물질의 독성 효과를 강력하게 만들 수 있다.

재조합 DNA 작제물은 모든 단백질 또는 dsRNA 분자가 하나의 프로모터로부터 발현되거나, 또는 각 단백질 또는 dsRNA 분자가 별개의 프로모터 제어 또는 이들의 일부 조합 하에 있도록 조립될 수 있다. 본원 발명의 단백질은 다중유전자 발현 시스템으로부터 발현될 수 있는데, 여기서 TIC13085 또는 TIC13087 중에서 하나 또는 둘 모두가, 선택되는 발현 시스템의 유형에 따라, 다른 개방 해독틀 및 프로모터를 또한 내포하는 공통의 뉴클레오티드 분절로부터 발현된다. 예를 들면, 세균 다중유전자 발현 시스템은 단일 오페론 내부로부터 다중연결/탠덤 개방 해독틀의 발현(즉, 폴리시스트론 발현)을 주동하기 위해 단일 프로모터를 활용할 수 있다. 다른 실례에서, 식물 다중유전자 발현 시스템은 다중-비연결 또는 연결된 발현 카세트를 활용할 수 있으며, 각 카세트는 상이한 단백질 또는 다른 작용제 예컨대 하나 이상의 dsRNA 분자를 발현한다.

TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 작제물은 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 배큘로바이러스, 합성 염색체, 비리온, 코스미드, 파지미드, 파지, 또는 바이러스 벡터에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 이런 벡터는 숙주 세포에서 TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열의 안정된 또는 일시적인 발현, 또는 인코딩된 폴리펩티드의 후속 발현을 달성하는 데 이용될 수 있다. TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열을 포함하고 숙주 세포 내로 도입되는 외인성 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 작제물은 본 출원에서 "도입유전자"로서 지칭된다.

TIC13085 또는 TIC13087, 또는 관련된 패밀리 독소 단백질 인코딩 서열 중에서 하나 이상을 발현하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 내포하는 유전자도입 세균, 유전자도입 식물 세포, 유전자도입 식물, 그리고 유전자도입 식물 부분이 본원에서 제공된다. 용어 "세균 세포" 또는 "세균"은 아그로박테리움(Agrobacterium), 바실루스(Bacillus), 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 슈도모나스(Pseudomonas), 브레비바실루스(Brevibacillus), 클렙시엘라(Klebsiella), 에르위니아(Erwinia), 또는 리조비움(Rhizobium) 세포를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 용어 "식물 세포" 또는 "식물"은 쌍떡잎식물 또는 외떡잎식물을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 용어 "식물 세포" 또는 "식물"은 또한, 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브라시카(예를 들면 카놀라 또는 평지씨), 당근, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수(사료용 옥수수 및 스위트 옥수수 포함), 클로버, 목화, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테다소나무, 기장, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상식물, 야자과 식물, 목초, 완두콩, 땅콩, 고추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 쌀, 근경, 호밀, 홍화, 관목, 솔검, 남방 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 스위트검, 고구마, 스위치 잔디, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 그리고 밀 식물 세포 또는 식물을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 유전자도입 식물 세포로부터 재생된 유전자도입 식물 및 유전자도입 식물 부분이 제공된다. 일정한 구체예에서, 유전자도입 식물은 식물로부터 부분을 절단하거나, 스냅핑하거나, 분쇄하거나, 또는 만약 그렇지 않으면 분리함으로써, 유전자도입 종자로부터 획득될 수 있다. 일정한 구체예에서, 식물 부분은 종자, 다래, 잎, 꽃, 줄기, 뿌리, 또는 이들의 임의의 부분, 또는 유전자도입 식물 부분의 비-재생가능 부분일 수 있다. 이러한 문맥에서 이용된 바와 같이, 유전자도입 식물 부분의 "비-재생가능" 부분은 전체 식물을 형성하도록 유도될 수 없는 부분, 또는 유성 및/또는 무성 생식이 가능한 전체 식물을 형성하도록 유도될 수 없는 부분이다. 일정한 구체예에서, 식물 부분의 비-재생가능 부분은 유전자도입 종자, 다래, 잎, 꽃, 줄기, 또는 뿌리의 부분이다.

곤충, 나비목(Lepidoptera) 저해량의 TIC13085 또는 TIC13087 단백질을 포함하는 유전자도입 식물을 만드는 방법이 제공된다. 이런 식물은 본 출원에서 제공된 임의의 단백질을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 내로 도입하고, 그리고 곤충, 나비목(Lepidoptera) 저해량의 단백질을 발현하는 상기 식물 세포로부터 유래된 식물을 선택함으로써 만들어질 수 있다. 식물은 재생, 종자, 화분, 또는 분열 조직 형질전환 기술에 의해 식물 세포로부터 유래될 수 있다. 식물을 형질전환하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다.

검출 가능한 양의 TIC13085 또는 TIC13087, 이들의 곤충 저해 분절 또는 단편, 또는 이들의 임의의 구별되는 부분을 포함하는 가공된 식물 생성물이 또한 본원에서 개시된다. 일정한 구체예에서, 가공된 생성물은 식물 부분, 식물 바이오매스, 오일, 밀(meal), 당, 동물 사료, 가루, 플레이크, 겨, 린트, 겉껍질, 가공된 종자, 그리고 종자로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 가공된 생성물은 비-재생가능하다. 식물 생성물은 유전자도입 식물 또는 유전자도입 식물 부분으로부터 유래된 일상 용품 또는 다른 생성물을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 일상 용품 또는 다른 생성물은 TIC13085 또는 TIC13087의 구별되는 부분을 인코딩하거나 포함하는 뉴클레오티드 분절, 또는 발현된 RNA 또는 단백질을 검출함으로써 상거래를 통해 추적될 수 있다.

TIC13085 또는 TIC13087 단백질을 발현하는 식물은 다른 독소 단백질을 발현하고 및/또는 다른 유전자도입 형질, 예컨대 제초제 내성 유전자, 수확량 또는 스트레스 내성 형질을 부여하는 유전자 등을 발현하는 유전자도입 사건으로 번식에 의해 교배될 수 있거나, 또는 이런 형질은 이들 형질이 모두 연결되도록 단일 적층된 벡터에서 조합될 수 있다.

실시예에서 더욱 설명된 바와 같이, TIC13085 또는 TIC13087 단백질 인코딩 서열, 그리고 TIC13085 또는 TIC13087에 실제적인 동일성 백분율을 갖는 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 열 증폭 및 혼성화와 같은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, TIC13085 또는 TIC13087 단백질은 관련된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 데 이용될 수 있고, 그리고 밀접하게 관련된 다른 단백질 구성원을 선별검사하고 발견하는 데 이용될 수 있다.

게다가, TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 열-주기 또는 등온 증폭 및 혼성화 방법을 이용하여 이러한 부류의 다른 구성원을 확인하기 위한 선별검사를 위한 프로브 및 프라이머로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6에서 진술된 바와 같은 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드는 일상 용품으로부터 유래된 데옥시리보핵산 샘플 내에 TIC13085 또는 TIC13087 도입유전자의 존재 또는 부재를 결정하는 데 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 이용하는 일정한 핵산 검출 방법의 민감도를 고려할 때, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6에서 진술된 바와 같은 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드는 한 데 모아진 공급원으로부터 유래된 일상 용품에서 TIC13085 또는 TIC13087 도입유전자를 검출하는 데 이용될 수 있을 것으로 예상되는데, 여기서 일상 용품 중 단지 일부만 임의의 도입유전자를 내포하는 유전자도입 식물로부터 유래된다. 이런 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 그리고 서열 번호: 6 각각에 뉴클레오티드 서열 변동을 도입하는 데 이용될 수 있는 것으로 더욱 인식된다. 이런 "돌연변이유발" 올리고뉴클레오티드는 유전자도입 식물 숙주 세포에서 폭넓은 곤충 저해 활성 또는 변화된 발현을 나타내는 TIC13085 및 TIC13087 아미노산 서열 변이체의 확인에 유용하다.

뉴클레오티드 서열 동족체, 예를 들면, 엄격한 혼성화 조건하에 본 출원에서 개시된 임의의 서열 각각에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 살충 단백질 역시 본원 발명의 구체예이다. 본원 발명은 또한, 두 번째 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 첫 번째 뉴클레오티드 서열(또는 이의 역보체 서열)은 살균살충 단백질 또는 이의 살균살충 단편을 인코딩하고 두 번째 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다. 이런 경우에, 두 번째 뉴클레오티드 서열은 엄격한 혼성화 조건하에 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 또는 서열 번호: 6으로서 제시된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것일 수 있다. 뉴클레오티드 코딩 서열은 적합한 혼성화 조건하에, 예컨대 엄격한 혼성화 조건하에 서로 혼성화하고, 그리고 이들 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 다른 단백질 중에서 하나에 대해 조성된 항혈청과 교차반응한다. 본원에서 규정된 바와 같이, 엄격한 혼성화 조건은 적어도 42℃에서 혼성화, 그 이후에 각각 실온에서 5분 동안 2X SSC, 0.1% SDS로 2회 세척, 그 이후에 각각 65℃에서 30분 동안 0.5X SSC, 0.1% SDS로 2회 세척을 포함한다. 훨씬 높은 온도에서 세척은 훨씬 엄격한 조건, 예를 들면, 68℃의 혼성화 조건, 그 이후에 68℃에서 0.1% SDS를 내포하는 2xSSC에서 세척을 구성한다.

당업자는, 유전자 코드의 중복성으로 인해 많은 다른 서열이 이런 관련된 단백질을 인코딩할 수 있고 이들 서열이 바실루스(Bacillus) 균주 또는 식물 세포에서 살균살충 단백질을 발현하는 기능을 하는 한 본원 발명의 구체예라는 것을 인식하고, 많은 이런 중복 코딩 서열이 이들 조건하에 TIC13085 및 TIC13087 변이체를 인코딩하는 선천적 바실루스(Bacillus) 서열에 혼성화하지 않을 것이라는 것을 당연히 인식할 것이다. 본 출원은 TIC13085 및 TIC13087 변이체 단백질 인코딩 서열, 그리고 TIC13085 및 TIC13087 변이체 단백질 인코딩 서열에 실제적인 동일성 백분율을 갖는 서열을 확인하기 위해, 당업자에게 공지된 이런 저런 확인 방법의 이용을 예기한다.

본원 발명은 또한, 살균살충 단백질로부터 단백질의 키메라를 포함하는 상업적으로 유용한 단백질을 조작하고 클로닝하기 위한, 당해 분야에서 공지된 분자 방법의 이용을 예기한다; 예를 들면, 키메라는 TIC13085 또는 TIC13087 단백질 및 관련된 단백질과 상이한 다양한 단백질의 분절 및 TIC13085 또는 TIC13087 단백질의 분절의 조립을 포함하는 추가적인 유용한 구체예를 유도하기 위해 TIC13085 또는 TIC13087 단백질의 분절로부터 조립될 수 있다. TIC13085 또는 TIC13087 단백질은 서로 및 다른 바실루스(Bacillus), 패니바실루스(Paenibacillus) 또는 다른 살균살충 단백질(이들이 계통발생학적으로 가깝게 또는 멀게 관련되는지에 상관없이)에 맞추어 정렬될 수 있고, 그리고 정렬된 단백질 사이의 치환에 유용하고 키메라 단백질의 작제를 야기하는 이런 단백질 각각의 분절이 확인될 수 있다. 이런 키메라 단백질은 해충 생물학적 검정 분석이 진행될 수 있고, 그리고 키메라에서 이런 분절 각각이 유래되는 부모 단백질과 비교하여 증가된 생물활성 또는 확대된 표적 해충 스펙트럼의 존재 또는 부재에 대하여 특징화될 수 있다. 폴리펩티드의 살균살충 활성은 도메인 또는 분절을 다른 단백질과 교환함으로써 또는 당해 분야에서 공지된 유도 진화 방법을 이용함으로써, 특정 해충 또는 더 넓은 스펙트럼의 해충에 대한 활성을 위해 더욱 조작될 수 있다.

TIC13085 또는 TIC13087 단백질로 농작물의 곤충, 특히 나비목(Lepidoptera) 침입을 제어하는 방법이 본 출원에서 개시된다. 이런 방법은 곤충 또는 나비목(Lepidoptera) 저해량의 TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 포함하는 식물을 재배하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 방법은 (i) TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 포함하거나 또는 인코딩하는 임의의 조성물을 식물 또는 식물을 발생시키는 종자에 적용하는 단계; 및 (ii) 식물 또는 식물을 발생시키는 식물 세포를 TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 단계 중에서 하나 이상을 더욱 포함할 수 있다. 일반적으로, TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질은 조성물에서 제공되거나, 미생물에서 제공되거나, 또는 나비목 곤충에 대한 곤충 저해 활성을 부여하기 위한 유전자도입 식물에서 제공될 수 있는 것으로 예기된다.

일정한 구체예에서, TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질의 재조합 핵산 분자는 TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 발현하는 데 적합한 조건하에 TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질을 발현하도록 형질전환된 재조합 바실루스(Bacillus) 또는 임의의 다른 재조합 세균 세포를 배양함으로써 제조된 곤충 저해 조성물의 살충성 활성 성분이다. 이런 조성물은 상기 재조합 폴리펩티드를 발현하는/생성하는 이런 재조합 세포의 배양액의 건조, 동결 건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강, 또는 농축에 의해 제조될 수 있다. 이런 과정은 바실루스(Bacillus) 또는 다른 곤충 병원성 세균 세포 추출물, 세포 현탁액, 세포 균질액, 세포 용해물, 세포 상층액, 세포 여과액, 또는 세포 펠렛을 야기할 수 있다. 이렇게 생성된 재조합 폴리펩티드를 획득함으로써, 이들 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 세균 세포, 세균 포자 및 부아포 봉입체를 포함할 수 있고, 그리고 식이 생물학적 검정에서 농업 곤충 저해 스프레이 제품 또는 곤충 저해 제제를 비롯한, 다양한 용도로 제제화될 수 있다.

한 구체예에서, 내성 발달의 가능성을 감소시키기 위해, TIC13085 또는 TIC13087 단백질을 포함하는 곤충 저해 조성물은 동일한 나비목 곤충 종에 대한 곤충 저해 활성을 나타내지만, TIC13085 또는 TIC13087 독소 단백질과 상이한 적어도 하나의 추가 폴리펩티드를 더욱 포함할 수 있다. 이런 조성물을 위한 가능한 추가 폴리펩티드는 곤충 저해 단백질 및 곤충 저해 dsRNA 분자를 포함한다. 해충을 제어하기 위한 이런 리보뉴클레오티드 서열의 이용을 위한 한 가지 실례는 Baum, et al. (U.S. 특허 공개 2006/0021087 A1)에서 설명된다. 나비목 해충의 제어를 위한 이런 추가 폴리펩티드는 곤충 저해 단백질, 예컨대 그러나 제한 없이, Cry1A(U.S. 특허 번호 5,880,275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B(U.S. 특허 공개 번호 10/525,318), Cry1C(U.S. 특허 번호 6,033,874), Cry1D, Cry1Da 및 이의 변이체, Cry1E, Cry1F 및 Cry1A/F 키메라(U.S. 특허 번호 7,070,982; 6,962,705; 및 6,713,063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry1-유형 키메라 예컨대 그러나 제한 없이, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 및 TIC1100(국제 출원 공개 WO2016/061391(A2)), TIC2160(국제 출원 공개 WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab(U.S. 특허 번호 7,064,249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, AND AXMI-045(U.S. 특허 공개 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100(U.S. 특허 공개 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005(U.S. 특허 공개 2013-0104259 A1), AXMI-134(U.S. 특허 공개 2013-0167264 A1), AXMI-150(U.S. 특허 공개 2010-0160231 A1), AXMI-184(U.S. 특허 공개 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209(U.S. 특허 공개 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220(U.S. 특허 공개 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z(U.S. 특허 공개 2014-0196175 A1), AXMI-238(U.S. 특허 공개 2014-0033363 A1), AXMI-270(U.S. 특허 공개 2014-0223598 A1), AXMI-345(U.S. 특허 공개 2014-0373195 A1), AXMI-335(국제 출원 공개 WO2013/134523(A2)), DIG-3(U.S. 특허 공개 2013-0219570 A1), DIG-5(U.S. 특허 공개 2010-0317569 A1), DIG-11(U.S. 특허 공개 2010-0319093 A1), AfIP-1A 및 이의 유도체(U.S. 특허 공개 2014-0033361 A1), AfIP-1B 및 이의 유도체(U.S. 특허 공개 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B(U.S. 특허 공개 2014-0007292 A1), PSEEN3174(U.S. 특허 공개 2014-0007292 A1), AECFG-592740(U.S. 특허 공개 2014-0007292 A1), Pput_1063(U.S. 특허 공개 2014-0007292 A1), DIG-657(국제 출원 공개 WO2015/195594 A2), Pput_1064(U.S. 특허 공개 2014-0007292 A1), GS-135 및 이의 유도체(U.S. 특허 공개 2012-0233726 A1), GS153 및 이의 유도체(U.S. 특허 공개 2012-0192310 A1), GS154 및 이의 유도체(U.S. 특허 공개 2012-0192310 A1), GS155 및 이의 유도체(U.S. 특허 공개 2012-0192310 A1), U.S. 특허 공개 2012-0167259 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, U.S. 특허 공개 2012-0047606 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, U.S. 특허 공개 2011-0154536 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, U.S. 특허 공개 2011-0112013 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, U.S. 특허 공개 2010-0192256 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2와 4 및 이들의 유도체, U.S. 특허 공개 2010-0077507 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, U.S. 특허 공개 2010-0077508 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, U.S. 특허 공개 2009-0313721 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, U.S. 특허 공개 2010-0269221 A1에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 또는 4 및 이의 유도체, U.S. 특허 번호 7,772,465(B2)에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 및 이의 유도체, WO2014/008054 A2에서 설명된 바와 같은 CF161_0085 및 이의 유도체, US 특허 공개 US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 및 US2012-0117690 A1에서 설명된 바와 같은 나비목 독성 단백질 및 이들의 유도체; US7510878(B2)에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 또는 4 및 이의 유도체, U.S. 특허 번호 7812129(B1)에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 2 또는 4 및 이의 유도체; IPD110Aa 및 동족체(국제 출원 공개 WO2019/178038 A2); TIC868(U.S. 특허 US10233217), Cry1Da1_7(U.S. 특허 US10059959), BCW003(U.S. 특허 US10703782), TIC1100(U.S. 특허 US10494408), TIC867(U.S. 특허 US10669317), TIC867_23(U.S. 특허 US10611806), TIC6757(U.S. 특허 US10155960), TIC7941(U.S. 특허 공개 2020-0229445 A1), 나비목 종에 독성인 고사리 독소 예컨대 US 특허 10,227,608에서 개시된 것들 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, 이런 조성물/제제는 획득된 곤충 저해의 스펙트럼을 확대하기 위해, 만약 그렇지 않으면 본원 발명의 곤충 저해 단백질에 의해 저해되지 않는 곤충에 곤충 저해 활성을 나타내는 적어도 하나의 추가 폴리펩티드를 더욱 포함할 수 있다. 예를 들면, 노린재목 해충의 제어를 위해, 본원 발명의 곤충 저해 단백질의 조합은 노린재목-활성 단백질 예컨대 TIC1415(US 특허 공개 2013-0097735 A1), TIC807(U.S. 특허 번호 8609936), TIC834(U.S. 특허 공개 2013-0269060 A1), AXMI-036(U.S. 특허 공개 2010-0137216 A1), 그리고 AXMI-171(U.S. 특허 공개 2013-0055469 A1)과 병용될 수 있다. 게다가 딱정벌레목 해충의 제어를 위한 폴리펩티드는 곤충 저해 단백질, 예컨대 그러나 제한 없이, Cry3Bb(U.S. 특허 번호 6,501,009), Cry1C 변이체, Cry3A 변이체, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134(U.S. 특허 공개 2013-0167264 A1) AXMI-184(U.S. 특허 공개 2010-0004176 A1), AXMI-205(U.S. 특허 공개 2014-0298538 A1), AXMI-207(U.S. 특허 공개 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220(U.S. 특허 공개 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z(U.S. 특허 공개 2014-0196175 A1), AXMI-279(U.S. 특허 공개 2014-0223599 A1), AXMI-R1 및 이의 변이체(U.S. 특허 공개 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10(U.S. 특허 공개 2010-0319092 A1), eHIPs(U.S. 특허 출원 공개 번호 2010/0017914), IP3 및 이의 변이체(U.S. 특허 공개 2012-0210462 A1), 슈도모나스(Pseudomonas) 독소 IDP072Aa(US 특허 출원 공개 번호 2014/055128), 그리고 ω-헥사톡신-Hv1a(U.S. 특허 출원 공개 US2014-0366227 A1)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

TIC13085 및 TIC13087 부류의 곤충 저해 단백질과 병용될 수 있는, 딱정벌레목, 나비목 및 노린재목 해충의 제어를 위한 추가 폴리펩티드는 Neil Crickmore에 의해 관리되는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소 명명법 웹사이트(btnomenclature.info의 월드와이드웹)에서 확인될 수 있다. 대체로, 당업자에게 공지된 임의의 곤충 저해 단백질이 식물에서(번식 또는 분자 스태킹을 통해 조합됨), 또는 조성물 또는 제제에서 생물농약 또는 생물농약의 조합으로서 TIC13085 또는 TIC13087 패밀리의 단백질과 병용될 수 있는 것으로 예기된다.

곤충이 일정한 살충제에 대한 내성을 발달할 가능성이 당해 분야에서 문서화되었다. 한 가지 곤충 내성 관리 전략은 상이한 작용 방식을 통해 작용하는 2가지 상이한 곤충 저해제를 발현하는 유전자도입 작물을 이용하는 것이다. 이런 이유로, 이들 곤충 저해제 중 어느 하나에 대한 내성을 갖는 임의의 곤충이 다른 곤충 저해제에 의해 제어될 수 있다. 다른 곤충 내성 관리 전략은 이런 보호되지 않은 식물에 대한 도피처를 제공하기 위해, 표적화된 나비목 해충 종에 대해 보호되지 않는 식물의 이용을 활용하는 것이다. 한 가지 특정 실례는 U.S. 특허 번호 6,551,962에서 설명되는데, 이것은 온전히 참조로서 편입된다.

종자 처리, 스프레이 온(spray on), 드립 온(drip on), 또는 와이프 온(wipe on) 제제에서 단백질과 함께 이용되는, 본원에서 개시된 단백질에 의해 또한 제어되는 해충을 제어하도록 설계된 국소적으로 적용된 살균살충 화학물질과 같은 다른 구체예는 토양(토양 관주)에 직접적으로 적용되거나, 본원에서 개시된 단백질을 발현하는 재배 식물에 적용되거나, 또는 개시된 단백질 중에서 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 도입유전자를 내포하는 종자에 적용되도록 제제화될 수 있다. 종자 처리에 이용하기 위한 이런 제제는 당해 분야에서 공지된 다양한 스티커 및 점착 부여제와 함께 적용될 수 있다. 이런 제제는 개시된 단백질과 함께 작용 방식에서 상승 작용을 갖는 살충제를 내포할 수 있으며, 이에 따라, 배합 살충제는 개시된 단백질에 의해 제어될 수 있는 동일하거나 유사한 해충을 제어하기 위해 상이한 작용 방식을 통해 작용하거나, 또는 이런 살충제는 TIC13085 및 TIC13087 살균살충 단백질에 의해 효과적으로 제어되지 않는 더 넓은 숙주 범위 또는 식물 해충 종 내에 해충을 제어하는 작용을 한다.

전술된 조성물/제제는 농업적으로 허용되는 운반체, 예컨대 베이트, 분말, 더스트, 펠렛, 과립, 스프레이, 유제, 콜로이드성 현탁액, 수성 용액, 바실루스(Bacillus) 포자/결정 제조물, 종자 처리, 단백질 중에서 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 재조합 식물 세포/식물 조직/종자/식물, 또는 단백질 중에서 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세균을 더욱 포함할 수 있다. 재조합 폴리펩티드에 내재하는 곤충 저해 또는 살충 저해의 수준, 그리고 식물 또는 식이 분석에 적용되는 제제의 수준에 따라서, 조성물/제제는 중량으로 다양한 양의 재조합 폴리펩티드, 예를 들면, 중량으로 0.0001% 내지 0.001% 내지 0.01% 내지 1% 내지 99%의 재조합 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

앞서 말한 내용에 비추어, 당업자는 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서, 개시된 특정한 양상에서 변화가 만들어지고 같거나 유사한 결과를 여전히 획득할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 본원에서 개시된 특정한 구조적 및 기능적 상쇄는 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 본원에서 인용된 각 참고문헌의 전체 개시는 본 출원의 개시 내에 편입되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예

실시예 1

TIC13085 및 TIC13087의 발견, 클로닝 및 발현

신규한 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)(Bt) 살균살충 단백질을 인코딩하는 서열이 확인되고, 클로닝되고, 서열 확증되고, 곤충 생물학적 검정에서 검사되었다. 살균살충 단백질 TIC13085가 Idaho의 Genessee의 밀밭에서 수집된 토양으로부터 평판 스크레이프 메타유전체 염기서열분석 노력으로 Bt로부터 확인되고 단리되었다. 살균살충 단백질 TIC13087이 North Dakota의 Ashley의 밀밭에서 수집된 토양으로부터 평판 스크레이프 메타유전체 염기서열분석 노력으로 Bt로부터 확인되고 단리되었다. 메타유전체 평판 스크레이프에 이용되는 환경 샘플이 내생포자 형성 세균을 풍부하게 하기 위해 처리되고 평판마다 대략 100개 집락의 밀도로 도말되었다. 배양한 후, 각 평판의 DNA 샘플을 제공하기 위해 평판이 긁어내졌다. pFam 분석을 이용하여 잠재적인 살충 단백질을 발견하고 공지된 곤충 독소에 대한 상동성을 발견하기 위해, DNA 샘플이 염기서열분석되고 조립되었다. 신규한 TIC13085 및 TIC13087 단백질은 Vip3 독소 단백질 부류에 속하는 것으로 확인되었다. TIC13085 및 TIC13087은 패니바실루스 티아미놀리티커스(Paenibacillus thiaminolyticus)로부터 유래된 수탁 WP_119791737과 각각 87.20% 및 84.69% 동일하였다. 수탁 WP_119791737의 단백질은 검거세미나방(검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 밤나방과의 나방(FAW, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 사탕무 거염벌레(스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua)), 그리고 회색담배나방(헬리오티스 비레스첸스(Heliothis virescens))에 대한 살충 활성을 나타냈다(Estruch et al. (1996) Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against Lepidopteran insects. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5389-5394).

TIC13085 및 TIC13087 코딩 서열이 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 클로닝되고 및/또는 합성되고, 그리고 Ec 발현가능 프로모터 및 단백질 정제에 이용된 히스티딘 아미노산 잔기의 연속 시리즈를 인코딩하는 서열(다시 말하면, 히스티딘 또는 "HIS" 태그)과 작동 가능한 연쇄에서 대장균(Escherichia coli)(Ec) 발현 벡터 내로 도입되었다. TIC13085 및 TIC13087의 단백질 제조물이 생물학적 검정에서 이용되었다.

실시예 2

TIC13085 및 TIC13087은 곤충 생물학적 검정에서 나비목 활성을 나타낸다

살균살충 단백질 TIC13085 및 TIC13087이 Ec에서 발현되고 나비목(Lepidoptera)의 다양한 종에 대한 독성에 대해 검정되었다. TIC13085 및 TIC13087은 또한, 딱정벌레목(Coleoptera) 및 노린재목(Hemiptera)의 다양한 종에 대한 독성에 대해 검정되었다.

TIC13085 및 TIC13087은 나비목 곤충 종 검거세미나방(BCW, 검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(CEW, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea), 콩 포드웜으로서 또한 알려져 있음), 밤나방과의 나방(FAW, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남방 거염벌레(SAW, 스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 콩 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens)) 및 남서부 조명충나방(SWC, 디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)); 딱정벌레목 종 서부 옥수수 뿌리벌레(WCR, 디아브로티카 비르기페라(Diabrotica virgifera)); 그리고 노린재목 종 신열대 갈색 노린재(NBSB, 유쉬스투스 헤로스(Euschistus heros))에 대한 독성에 대해 검정되었다. 재조합 미생물 숙주 세포 유래된 TIC13085 단백질을 이용한 생물학적 검정은 나비목 종 FAW, SBL 및 SWC에 대한 활성을 증명하였다. 미생물 숙주 세포 유래된 TIC13087 단백질을 이용한 생물학적 검정은 나비목 종 BCW, CEW 및 SWC에 대한 활성을 증명하였다.

실시예 3

식물 발현에 이용하기 위한 TIC13085 및 TIC13087에 대한 합성 코딩 서열.

합성(인공) 코딩 서열이 TIC13085 및 TIC13087을 인코딩하는 식물 세포에서 발현을 위해 설계되었다.

이들 합성 서열은 선천적 바실루스(Bacillus) 단백질의 아미노산 서열을 보존하면서 일정한 불리한 문제 서열 예컨대 ATTTA 및 A/T 풍부한 식물 폴리아데닐화 서열을 방지하기 위해, U.S. 특허 5,500,365에서 전반적으로 설명된 방법에 따라서 합성되었다. TIC13085(서열 번호: 5) 및 TIC13087(서열 번호: 6)에 대한 식물 합성 코딩 서열이 설계되었다.

TIC13085 및 TIC13087을 인코딩하는 각 합성 코딩 서열이 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 식물 형질전환 벡터 내로 도입되었다. 콩 식물을 형질전환하는 데 이용된 결과의 형질전환 벡터는 TIC13085 또는 TIC13087 살균살충 단백질의 발현을 위한 첫 번째 도입유전자 카세트(이것은 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된, TIC13085 또는 TIC13087을 인코딩하는 합성 코딩 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 리더의 5'에 작동가능하게 연결된 구조성 프로모터를 포함하였다); 그리고 스펙티노마이신 선택을 이용한, 형질전환 식물 세포의 선택을 위한 두 번째 도입유전자 카세트를 포함하였다. 옥수수 식물을 형질전환하는 데 이용된 결과의 형질전환 벡터는 TIC13085 또는 TIC13087 살균살충 단백질의 발현을 위한 첫 번째 도입유전자 카세트(이것은 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된, TIC13085 또는 TIC13087을 인코딩하는 합성 코딩 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 인트론의 5'에 작동가능하게 연결된 리더의 5'에 작동가능하게 연결된 구조성 프로모터를 포함하였다); 그리고 글리포세이트 선택을 이용한, 형질전환 식물 세포의 선택을 위한 두 번째 도입유전자 카세트를 포함하였다.

실시예 4

TIC13085 및 TIC13087 단백질은 안정되게 형질전환된 콩 식물에서 발현될 때 나비목 독성 활성을 부여한다

TIC13085 및 TIC13087 살균살충 단백질을 발현하도록 설계된 도입유전자 카세트를 포함하는 이성분 식물 형질전환 벡터가 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 클로닝되었다. 그 결과로 생긴 벡터가 콩 식물을 안정되게 형질전환하는 데 이용되었다. 조직이 형질전환체로부터 수확되고 다양한 나비목 곤충 종에 대한 곤충 생물학적 검정에 이용되었다.

콩 식물이 실시예 3에서 설명된 바와 같이 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환 방법을 이용하여 이성분 형질전환 벡터로 형질전환되었다. 형질전환 세포가 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 식물을 형성하도록 유도되었다. 식물 엽편을 이용한 생물학적 검정이 U.S. 특허 번호 8,344,207에서 설명된 것들과 유사하게 수행되었다. 1 일령 미만의 단 하나의 새로 부화된 신생아 유충이 각 엽편 샘플 상에 배치되고 대략 4 일 동안 영양공급되도록 허용되었다. 비-형질전환 콩 식물이 음성 대조로서 이용되는 조직을 획득하는 데 이용되었다. 각 이성분 벡터로부터 복수의 형질전환 R₀ 단일 사본 삽입 사건이 밤나방과의 나방(FAW, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남방 거염벌레(SAW, 스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 콩 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens)), 그리고 팥 나방(SPW, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea))에 대하여 사정되었다. TIC13085로 형질전환된 R₀ 콩 식물은 FAW, SBL 및 SAW에 대한 활성을 나타냈다. TIC13087로 형질전환된 R₀ 콩 식물은 SPW에 대한 활성을 나타냈다.

TIC13085 및 TIC13087을 발현하는 선택된 R₀ 콩 식물은 자가수분하고 R₁ 콩 종자를 생산하도록 허용되었다. TIC13085를 발현하는 R₁ 콩 식물은 SAW, SBL 및 VBC에 대해 검정되었다. TIC13085를 발현하는 R₁ 콩 식물은 SBL, SPW 및 VBC에 대해 검정되었다. TIC13085를 발현하는 R₁ 콩 식물은 SAW, SBL 및 VBC에 대한 활성을 나타냈다. TIC13087을 발현하는 R₁ 콩 식물은 VBC 및 SPW에 대한 활성을 나타냈다.

실시예 5

안정되게 형질전환된 옥수수 식물에서 발현된 TIC13085 및 TIC13087은 나비목 독성 활성을 부여한다

TIC13085 및 TIC13087 살균살충 단백질을 발현하도록 설계된 도입유전자 카세트를 포함하는 이성분 식물 형질전환 벡터가 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 클로닝되었다. 그 결과로 생긴 벡터가 옥수수 식물을 안정되게 형질전환하는 데 이용되었다. 조직이 형질전환체로부터 수확되고 다양한 나비목 곤충 종에 대한 곤충 생물학적 검정에 이용되었다.

옥수수 식물이 실시예 3에서 설명된 바와 같이 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환 방법을 이용하여 이성분 형질전환 벡터로 형질전환되었다. 형질전환 세포가 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 식물을 형성하도록 유도되었다. 식물 엽편을 이용한 생물학적 검정이 U.S. 특허 번호 8,344,207에서 설명된 것들과 유사하게 수행되었다. 1 일령 미만의 단 하나의 새로 부화된 신생아 유충이 각 엽편 샘플 상에 배치되고 대략 4 일 동안 영양공급되도록 허용되었다. 비-형질전환 옥수수 식물이 음성 대조로서 이용되는 조직을 획득하는 데 이용되었다. 각 이성분 벡터로부터 복수의 형질전환 R₀ 단일 사본 삽입 사건이 큰담배밤나방의 유충(CEW, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 유럽 조명충나방(ECB, 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방과의 나방(FAW, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남서부 조명충나방(SWC, 디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 그리고 검거세미나방(BCW, 검거세미밤나방(Agrotis ipsilon))에 대하여 사정되었다. 식물 내로 삽입된 재조합 작제물의 단일 사본으로부터 TIC13085를 발현하는 R₀ 옥수수 식물은 FAW, ECB 및 SWC에 대한 활성을 나타냈다. 식물 내로 삽입된 재조합 작제물의 단일 사본으로부터 TIC13087을 발현하는 R₀ 옥수수 식물은 CEW, ECB, SWC 및 BCW에 대한 활성을 나타냈다.

TIC13087을 발현하는 선택된 R₀ 옥수수 식물이 비-유전자도입 엘리트 옥수수 식물과 교배되었다. TIC13087을 발현하는 결과의 F₁ 이형접합성 식물이 검거세미나방(BCW, 검거세미밤나방(Agrotis ipsilon))에 대해 검정되었다. TIC13087을 발현하는 F₁ 이형접합성 식물은 BCW에 대한 활성을 나타냈다.

본원에서 개시되고 청구된 모든 조성물은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실시될 수 있다. 본원 발명의 조성물이 앞서 말한 예시적인 구체예의 면에서 설명되긴 했지만, 발명의 진정한 개념, 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 설명된 조성물에 변동, 변화, 개질 및 변경이 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 더 특이적으로, 화학적으로 및 생리적으로 관련된 일정한 작용제가 본원에서 설명된 작용제를 대체하여, 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이와 같은 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구항에서 규정된 바와 같은 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 공개된 특허 문서는 마치 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에서 참조로서 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> NOVEL INSECT INHIBITORY PROTEINS <130> MONS:486WO <150> US 63/132,877 <151> 2020-12-31 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2412 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2412) <223> Nucleic acid sequence encoding a TIC13085 pesticidal protein obtained from Bacillus thuringiensis. <400> 1 atgaagcaga ataataattt aagtgtaaga gccttaccag gttttattga tgttttcaat 60 ggaatttatg gttttgccac tggtattcaa gatattatta acatgatttt tagaacagat 120 acaggtgatc taacactgga agaagtttta aaaaatcaag atttacttaa tcatatttct 180 ggtaaacttg atgggattaa tggagaccta agtgagatta ttgcgcaggg aaatttgaat 240 acagaattag ctaaggaatt gctaaaaatc gctaatgagc agaacaatgt attaactgat 300 gttaataaca aactcaatgc gataaatgcg atgctcaaca catatcttcc taaaattaca 360 aatatgttaa gcgatattat gaaacaaaat tatgtcctga gtcttcaaat agaatatctc 420 agtaaacaac tacaggagat ttcagataaa cttgatgtta ttaatttaaa tgtactcatc 480 aactctacac tcacagaaat cactcctgct tatcaacgta 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ttaatttaaa tgtactcatc 480 aactctacac tcacagaaat cactcctgct tatcaacgta ttaaatatgt aaacgaaaaa 540 tttgatgact taactcttgc tacagaaaaa actctaagag caaaacaagg tagctttaac 600 gaagatattt ttgataatga tactcttgaa aatttaactg agctaactga actagcgaaa 660 agtgtaacaa aaaatgacgt ggatagtttc gagttttatc tccatacatt ccatgatgta 720 ttgattggca ataatttatt tggtcgttcg gctttaaaaa cagctgcaga attgattact 780 aaagacgaga taaagacgag tggaagtgag ataggaaaag tttatagttt cttaattgta 840 ctaacttgtc tacaagcaaa agcctttctc actttaacgg catgccgaaa attattgggc 900 ttatcagata ttgattatac taatattcta aatcagcatc taaatgagga aaagaatgta 960 tttcgtgata acatacttcc tacactgtcc aataaatttt ctaaccctaa ttatgtaaaa 1020 actataggta gtgataatta tgcaaaagtt attttagaag ctgaaccagg atatgcttta 1080 gttggatttg aaattatcaa tgatccaatc ccggtattaa aagcgtatca agctaagcta 1140 aaacaaaatt atcaagttga taatcagtcg ttatcagaga ttgtttattt agatatcgat 1200 aaactattct gtccaaaaaa ttctgaacaa aagtattata ctaaaagtct gacatttcct 1260 gatggctatg ttattactaa gattaccttt gaaaaaaagc tgaacaacct 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ccagaacctc 2160 cagcttgaca gcttcagcac ctacaacctc agcttcagct tcagcggcat caggggcaag 2220 gtgaccatca agaacagccg ggaggtgctg ttcgagaagg agtacgttta tgagggcctg 2280 gggttccacg acaaaacgga gtccttcacc acggcgtcca acaaggacgg cttctttatc 2340 gagctgacca ccacgacgta ctcgacccag aactcctttc gcaacttttc gatcaaggag 2400 aagctagagt ga 2412 <210> 6 <211> 2409 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic coding sequence used for expression in a plant cell encoding TIC13087. <400> 6 atgaagcaga acaacaacct gtcggtccgc gcgctgccga tctggatcga cgtcttcaac 60 gggatctacg gcttctcgac cggcatccag gacatcttca acatgatctt cgggacggac 120 accggcgacc tcacgctgga ggaggtgttg aagaaccagg acctcctcaa cgagatcagc 180 ggcaagctgg acggcatcaa cggcgacctg tccgagatca tcgcccaggg caacctgaac 240 acagagtcca caaaggaact gctcaagatc gccaacgagc agaacaacct gctcacggac 300 gtgaacaaca agctgaacgc catcaacgcg atgctcaaca cctacctgcc caagatcacg 360 aacatgctga gcgacatcat gaagcagaac tacgtcctga gcctgcaact tgagtacctg 420 tccaagcagc tccaggagat cagcgacaag ctcgacgtca tcaacctcaa cgtcctcatc 480 aactccacgc tgaccgagat cacgcccgcg taccagcgga tcaagtacgt caacgagaag 540 ttcgacgacc tcacgctcgc cacggagaag acgctgcgtg cgaagcaagg cagcttcaac 600 gaggacatct tcgacaacga caccctggag aacctgacgg agctgacgga gctggcgaag 660 tccgtgacca agaacgacgt tgactctttc gagttctacc tccacacctt tcacgacgtg 720 ctgattggga acaacctctt cggccgctcg gcgctcaaga cggcggcgga gctgattact 780 aaggacgaga tcaagaccag cggctccgag atcgggaagg tgtactcgtt cctcatcgtg 840 ctgacctgcc tccaggcgaa ggcgttcctc accctcacgg cctgccggaa gctgctcggg 900 ctgtcggaca tcgactacac gaacatcctc aaccagcacc tcaacgagga gaagaacgtc 960 ttccgcgaca acatcctccc gaccctatcc aacaagttct ccaacccgaa ctacgtgaag 1020 accatcggct cggacaacta cgctaaggtc atcctagagg cggagcccgg ctacgcgctg 1080 gtgggcttcg agatcatcaa cgacccgatc ccggtgctga aagcgtacca ggcgaagctc 1140 aagcaaaact accaagtgga caaccagagc ctgagcgaga tcgtgtacct ggacatcgac 1200 aagctgttct gccccaagaa cagcgagcag aagtattaca ccaagagcct cacgttcccc 1260 gacgggtacg tcatcaccaa gatcaccttc gaaaagaagc tcaacaacct 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Claims

살균살충 단백질 또는 이의 살균살충 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분절에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자로서, 여기서 임의적으로:
a. 상기 살균살충 단백질은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나;
b. 상기 살균살충 단백질은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
c. 상기 폴리뉴클레오티드 분절은 엄격한 혼성화 조건하에 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는, 재조합 핵산 분자.
청구항 제1항에 있어서,
a. 상기 재조합 핵산 분자는 식물 세포에서 발현되어 살균살충 효과량의 살균살충 단백질 또는 살균살충 단편을 생성하거나; 또는
b. 상기 재조합 핵산 분자는 벡터와 작동가능하게 연결되고, 그리고 상기 벡터는 플라스미드, 파지미드, 백미드, 코스미드, 그리고 세균 또는 효모 인공 염색체로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산 분자.
청구항 제1항에 있어서, 숙주 세포 내에 존재하고, 여기서 상기 숙주 세포는 세균 세포 및 식물 세포로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산 분자.
청구항 제3항에 있어서, 상기 세균 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 바실루스(Bacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 그리고 에르위니아(Erwinia)로 구성된 군에서 선택되는 세균의 속으로부터 유래되는, 재조합 핵산 분자.
청구항 제4항에 있어서, 상기 바실루스(Bacillus)는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)이고, 상기 브레비바실루스(Brevibacillus)는 브레비바실루스 라테로스포루스(Brevibacillus laterosporus)이고, 그리고 상기 에스케리키아(Escherichia)는 대장균(Escherichia coli)인, 재조합 핵산 분자.
청구항 제2항에 있어서, 상기 식물 세포는 쌍떡잎식물 또는 외떡잎식물 세포인, 재조합 핵산 분자.
청구항 제6항에 있어서, 상기 식물 세포는 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브라시카, 카놀라, 당근, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수(사료용 옥수수 및 스위트 옥수수 포함), 클로버, 목화, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테다소나무, 기장, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상식물, 야자과 식물, 목초, 완두콩, 땅콩, 고추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 평지씨, 쌀, 근경, 호밀, 홍화, 관목, 솔검, 남방 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 스위트검, 고구마, 스위치 잔디, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 그리고 밀 식물 세포로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산 분자.
청구항 제1항에 있어서, 상기 단백질은 나비목 해충에 대하여 살충 활성을 나타내는, 재조합 핵산 분자.
청구항 제8항에 있어서, 상기 나비목 해충은 검거세미나방(검거세미밤나방(Agrotis ipsilon)), 큰담배밤나방의 유충(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방과의 나방(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 남방 거염벌레(스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 남서부 조명충나방(디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 그리고 콩 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens))로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산 분자.
청구항 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 이의 일부로서, 여기서 살균살충 단백질 또는 이의 살균살충 단편의 살균살충 효과량이 상기 식물의 세포 내에서 생산되는, 식물.
청구항 제10항에 있어서, 상기 식물은 외떡잎식물 식물 또는 쌍떡잎식물 식물, 또는 이의 부분인, 식물.
청구항 제10항에 있어서, 식물은 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브라시카, 카놀라, 당근, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수(사료용 옥수수 및 스위트 옥수수 포함), 클로버, 목화, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테다소나무, 기장, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상식물, 야자과 식물, 목초, 완두콩, 땅콩, 고추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 평지씨, 쌀, 근경, 호밀, 홍화, 관목, 솔검, 남방 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 스위트검, 고구마, 스위치 잔디, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 그리고 밀로 구성된 군에서 선택되는, 식물.
청구항 제10항의 식물로부터 생산된 종자로서, 상기 종자는 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는, 종자.
청구항 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 곤충 저해 조성물.
청구항 제14항에 있어서, 상기 살균살충 단백질 또는 이의 살균살충 단편과 상이한 살균살충제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함하는, 곤충 저해 조성물.
청구항 제15항에 있어서, 상기 살균살충제는 곤충 저해 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자, 화학 분자 및 보조 단백질로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 상기 살균살충제는 살균살충 단백질 또는 이의 살균살충 단편과 동일한 해충에게 독성인, 곤충 저해 조성물.
청구항 제15항에 있어서, 상기 살균살충제는 나비목(Lepidoptera), 딱정벌레목(Coleoptera), 또는 노린재목(Hemiptera)의 하나 이상의 해충 종에 대한 활성을 나타내는, 곤충 저해 조성물.
청구항 제15항에 있어서, 상기 살균살충제는 Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1C 변이체, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1A/F 키메라, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, Cry3A 변이체, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z 및 AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 및 이의 변이체, IP3 및 이의 변이체, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657, DIG-11 단백질, IDP102Aa 및 이의 동족체, IDP110Aa 및 이의 동족체, TIC868, Cry1Da1_7, BCW003, TIC1100, TIC867, TIC867_23, TIC6757. TIC7941, IDP072Aa, TIC5290, TIC3668, TIC3669, TIC3670, IDP103 및 이의 동족체, PIP-50 및 PIP-65 및 이들의 동족체, PIP-83 및 이의 동족체, 그리고 Cry1B.34로 구성된 군에서 선택되는, 곤충 저해 조성물.
청구항 제14항에 있어서, 청구항 제1항의 재조합 핵산 분자로부터 살균살충 단백질을 발현하는 식물 세포를 포함하는 것으로 규정된, 곤충 저해 조성물.
청구항 제10항의 식물 또는 이의 일부로부터 생산된 일상 용품으로서, 상기 일상 용품은 검출 가능한 양의 상기 재조합 핵산 분자, 상기 살균살충 단백질, 또는 이의 살균살충 단편을 포함하는, 일상 용품.
청구항 제20항에 있어서, 곡물 처리기에 의해 봉지에 넣어진 옥수수 상품, 옥수수 플레이크, 옥수수 케이크, 곡분, 옥수수 가루, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 사일리지, 옥수수 전분, 옥수수 곡물 등, 그리고 상응하는 콩, 쌀, 밀, 솔검, 나무콩, 땅콩, 열매, 멜론 및 야채 일상 용품(적용 가능한 경우에, 본 출원의 검출 가능한 양의 이런 폴리뉴클레오티드 및 또는 폴리펩티드를 내포하는 주스, 농축물, 잼, 젤리, 마멀레이드, 그리고 이런 일상 용품의 다른 식용 형태 포함), 전체 또는 가공된 목화씨, 목화 오일, 린트, 사료 또는 식품, 섬유, 페이퍼, 바이오매스 및 연료 제품용으로 가공된 종자 및 식물 부분 예컨대 목화 오일로부터 유래된 연료 또는 목화 진 폐기물로부터 유래된 펠렛, 전체 또는 가공된 콩 종자, 대두유, 콩 단백질, 콩깻묵, 콩가루, 콩 플레이크, 콩겨, 두유, 콩 치즈, 콩 와인, 콩을 포함하는 동물 사료, 콩을 포함하는 페이퍼, 콩을 포함하는 크림, 콩 바이오매스, 그리고 콩 식물 및 콩 식물 부분을 이용하여 생산된 연료 제품으로 구성된 군에서 선택되는, 일상 용품.
청구항 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 자손 종자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 재조합 핵산 분자를 포함하는 첫 번째 종자를 식재하는 단계;
b. 단계 a의 종자로부터 식물을 재배시키는 단계; 및
c. 상기 식물로부터 자손 종자를 수확하되, 상기 수확된 종자가 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
곤충 침입에 대해 내성인 식물로서, 상기 식물의 세포는 청구항 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는, 방법.
나비목 종 해충 침입을 제어하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 해충을 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 살충 효과량의 살균살충 단백질과 접촉시키거나; 또는
b. 해충을 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 살충 효과량의 하나 이상의 살균살충 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
식물 유전체 DNA를 포함하는 샘플 내에서 청구항 제1항의 재조합 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 상기 샘플을, 엄격한 혼성화 조건하에 청구항 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물로부터 유전체 DNA에는 혼성화하고, 그리고 이런 혼성화 조건하에 청구항 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하지 않는 다른 모든 면에서 동질계 식물로부터 유전체 DNA에는 혼성화하지 않는 핵산 프로브와 접촉시키되, 상기 프로브는 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6; 또는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살균살충 단백질을 인코딩하는 서열에 상동성이거나 또는 상보적인 단계;
b. 상기 샘플 및 상기 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및
c. 상기 핵산 프로브 및 상기 재조합 핵산 분자의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
단백질을 포함하는 샘플 내에서 살균살충 단백질 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 방법으로서, 여기서 상기 살균살충 단백질은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 살균살충 단백질은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에 적어도 88%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
a. 상기 샘플을 면역반응성 항체와 접촉시키는 단계; 및
b. 상기 살균살충 단백질 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 제26항에 있어서, 검출 단계는 ELISA, 또는 웨스턴 블롯을 포함하는, 방법.
서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 살균살충 효과량의 단백질.