CN117025637A - 新型昆虫抑制蛋白 - Google Patents

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Abstract

公开了针对鳞翅目害虫物种表现出毒性活性的杀虫蛋白，并且所述杀虫蛋白包括但不限于TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL。提供了含有编码一种或多种所公开的杀虫蛋白的重组核酸序列的DNA构建体。提供了针对鳞翅目侵扰具有抗性的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其含有编码本发明的杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于在生物样品中检测本发明的重组核酸序列或蛋白质的存在的方法，以及使用TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL杀虫蛋白中的任一种控制鳞翅目物种害虫的方法。

Description

新型昆虫抑制蛋白
相关申请的引用
本申请要求2016年10月10日提交的美国临时申请号62/406,082的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
于2017年10月8日创建包含计算机可读形式的序列表的名为“MONS426WO_ST25.txt”的文件。此文件为77,030字节(在中测量)，同时通过电子提交方式提交(使用美国专利局EFS-Web提交系统)，并且以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及昆虫抑制蛋白的领域。公开了针对作物植物和种子的农业相关害虫表现出昆虫抑制活性的一类新型蛋白质。具体地，所公开类别的蛋白质针对作物植物和种子的农业相关害虫(特别是鳞翅目(Lepidopteran)物种的昆虫害虫)具有杀昆虫活性。提供了含有编码一种或多种所公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的植物、植物部分和种子。
背景技术
改进农业重要植物(包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、蔬菜和棉花等等)的作物产量已经变得越来越重要。除了越来越需要农业产品来为不断增长的人口供给食物、衣物并提供能源之外，预测与气候相关的影响以及不断增长的人口使用除农业活动之外的土地所带来的压力将会减少可用于耕作的耕地的量。这些因素导致对食品安全的严峻预测，特别是在植物生物技术和农艺实践方面缺乏主要改进的情况下。鉴于这些压力，在技术、农业技术和害虫管理方面的环境可持续改进是在有限量的可用于耕作的耕地上扩大作物生产的至关重要的工具。
昆虫，特别是鳞翅目和鞘翅目(Coleoptera)的昆虫，被认为是损害大田作物的主要原因，从而在受侵扰区域内降低作物产量。对农业造成负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米穗虫Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabamaargillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(Helicoverpa armigera)、东方叶虫(Spodoptera litura)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)、Cry1Ac抗性红铃虫(Pectinophora gossypiella)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。
从历史上看，农业中依赖于密集施用合成化学杀昆虫剂作为害虫控制剂。除了出现的抗性问题之外，对环境和人类健康的关注也刺激了生物杀虫剂的研究和开发。这项研究工作导致逐步发现和使用各种昆虫病原微生物物种，包括细菌。
当昆虫病原细菌(尤其是属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌)的潜能被发现并作为生物害虫控制剂开发时，生物控制模式发生转变。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis(Bt))细菌的菌株已被用作杀虫蛋白的来源，因为发现Bt菌株表现出针对特定昆虫的高毒性。Bt菌株已知产生δ-内毒素(例如，Cry蛋白)，其在孢子形成开始时和稳定生长期期间位于伴孢晶体包涵体内，并且还已知产生分泌的杀昆虫蛋白。一旦被易感昆虫摄取，δ-内毒素以及分泌的毒素在中肠上皮表面发挥其作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀昆虫蛋白的基因也已经在除Bt之外的细菌物种中被鉴定，所述细菌物种包括其他芽孢杆菌属和多种另外的细菌物种，诸如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)(“Ls”，以前称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))和日本类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。
结晶且分泌的可溶性杀昆虫毒素对其宿主具有高度特异性，并且作为化学杀昆虫剂的替代品已经被全世界接受。例如，杀昆虫毒素蛋白已被用于各种农业应用，以保护农业上重要的植物免受昆虫侵扰，减少对化学杀虫剂应用的需要，并增加产量。杀昆虫毒素蛋白通过以下方式来控制作物植物的农业相关害虫：通过机械方法，诸如通过喷洒以将含有各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上，以及通过使用遗传转化技术以产生表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子。
表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已在全球被采纳。例如，在2012年，有2610万公顷种植了表达Bt毒素的转基因作物(James,C.,Global Status ofCommercialized Biotech/GM Crops:2012.ISAAA Brief No.44)。转基因防昆虫作物的全球使用以及这些作物中所使用的杀昆虫毒素蛋白的有限数量已经对现有的昆虫等位基因产生了选择压力，所述等位基因赋予了对当前使用的杀昆虫蛋白的抗性。
目标害虫对杀昆虫毒素蛋白的抗性的产生造成了对发现和开发新形式杀昆虫毒素蛋白的持续需求，所述新形式杀昆虫毒素蛋白可用于管理对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物的昆虫抗性的增加。新的蛋白毒素具有改进的功效并且表现出对更广谱的易感昆虫物种的控制，这将减少可以产生抗性等位基因的存活昆虫的数量。此外，在一种植物中使用对相同昆虫害虫具有毒性并展现出不同作用模式的两种或更多种转基因杀昆虫毒素蛋白，在任何单一目标昆虫物种中都降低了抗性的概率。
因此，本发明人在本文中公开了来自苏云金芽孢杆菌的新型蛋白毒素家族以及类似的毒素蛋白、变体蛋白和示例性重组蛋白，它们针对目标鳞翅目物种表现出杀昆虫活性，特别是针对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米穗虫Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabamaargillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(Helicoverpa armigera)、东方叶虫(Spodoptera litura)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)、Cry1Ac抗性红铃虫(Pectinophora gossypiella)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。
发明内容
本文公开了一组新型的具有昆虫抑制活性的杀虫蛋白(毒素蛋白)，在本文中称为TIC4472、TIC1425和TIC2613，其属于TIC4472蛋白毒素类别，其表现出针对作物植物的一种或多种害虫的抑制活性。TIC4472蛋白和TIC4472蛋白毒素类别中的蛋白可以单独使用或者与制剂和植物中的其他杀昆虫蛋白和毒性剂组合使用，从而为农业系统当前使用的杀昆虫蛋白和杀昆虫化学品提供替代品。
在一个实施方案中，本申请公开的是重组核酸分子，其包含可操作地连接到编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的异源启动子片段，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含的氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少93％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性；或(ii)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少73％、或75％、或80％、或85％、或90％,、或95％或约100％的氨基酸序列同一性；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的多核苷酸杂交；或(d)编码杀虫蛋白或其片段的所述多核苷酸区段包含与SEQID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％的序列同一性的多核苷酸序列；或(e)所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒以及细菌或酵母人工染色体。重组核酸分子可以包含以下序列：所述序列的功能在于在植物中表达杀虫蛋白；或者在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的杀虫蛋白。
在本申请的另一个实施方案中，提供了包含本申请的重组核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由细菌和植物细胞组成的组。设想的细菌宿主细胞包括农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoec)和欧文氏菌属(Erwinia)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属物种为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属为侧孢短芽孢杆菌，或所述埃希氏菌属为大肠杆菌(Escherichia coli)。设想的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。设想的植物细胞还包括苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(棉属(Gossypiumsp.))、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属植物、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞。
在另一个实施方案中，杀虫蛋白表现出针对鳞翅目昆虫的活性，所述鳞翅目昆虫包括甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米穗虫Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabamaargillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(Helicoverpa armigera)、东方叶虫(Spodoptera litura)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)、Cry1Ac抗性红铃虫(Pectinophora gossypiella)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。
本申请还设想包含重组核酸分子的植物，所述重组核酸分子包含可操作地连接到编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的异源启动子片段，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含的氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少93％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性；或(ii)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少73％、或75％、或80％、或85％、或90％,、或95％或约100％的氨基酸序列同一性；或(c)所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的补体杂交；或(d)所述植物表现出可检测量的所述杀虫蛋白。在某些实施方案中，杀虫蛋白包含SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，植物为双子叶植物或单子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物还选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。
在另外的实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。
在另一个实施方案中，设想了包含本申请公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。所述昆虫抑制组合物还可以包含编码与所述杀虫蛋白不同的至少一种其他杀虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白。还设想昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目(Hemiptera)的一种或多种害虫物种的活性。在一个实施方案中，昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-AXMI-、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113、和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1和其变体、IP3和其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657和DIG-11蛋白。
还设想了包含可检测量的本申请公开的重组核酸分子的商品产品。此类商品产品包括由谷物处理器装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷类等，以及对应的大豆、大米、小麦、高粱、木豆、花生、水果、甜瓜和蔬菜商品产品，在适用情况下包括果汁、浓缩物、果酱、果胶、橘子果酱以及含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和/或多肽的其他可食用形式的此类商品产品，完整的或加工的棉籽、棉油、棉绒、加工成饲料或食品、纤维、纸材、生物质和燃料产品(诸如来源于棉油的燃料或来源于轧棉机废料的粒料)的种子和植物部分，完整的或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粉、大豆面、大豆片、大豆麸、豆浆、大豆奶酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸材、包含大豆的乳脂、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
本申请还设想了生产包含本申请中公开的重组核酸分子的种子的方法。所述方法包括种植包含本申请公开的重组核酸分子的至少一种种子；由所述种子长成植物；并从所述植物收获种子，其中所收获的种子包含本申请的重组核酸分子。
在另一个说明性实施方案中，提供了对昆虫侵扰具有抗性的植物，其中所述植物的细胞包含：(a)编码杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的杀虫蛋白的重组核酸分子；或(b)杀昆虫有效量的蛋白质包含的氨基酸序列：(i)与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少93％、或95％或约100％的氨基酸序列同一性；(ii)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少73％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％或约100％的氨基酸序列同一性。
本申请还公开了用于控制鳞翅目物种害虫以及控制植物(尤其是作物植物)的鳞翅目害虫侵扰的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)使害虫与杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的杀虫蛋白接触；或(b)使害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含的氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少93％、或95％或约100％的氨基酸序列同一性；(ii)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少73％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％或约100％的氨基酸序列同一性。
本文还提供了检测包含编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的重组核酸分子的存在的方法，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含的氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQID NO:6具有至少93％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性；或(ii)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少73％、或75％、或80％、或85％、或90％,、或95％或约100％的氨基酸序列同一性；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的核苷酸序列的多核苷酸杂交。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含编码本文提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组DNA杂交，并且在此类杂交条件下不与来自不包含所述区段的其他同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，所述编码杀虫蛋白的序列包含的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少93％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性；或(b)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少73％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％或约100％的氨基酸序列同一性。所述方法还可包括(a)使样品和探针经受严格杂交条件；和(b)检测探针与样品的DNA的杂交。
本发明还提供了在包含蛋白质的样品中检测杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或所述杀虫蛋白包含的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少93％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性；或(b)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少73％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％或约100％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与免疫反应性抗体接触；和(b)检测蛋白质的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。
序列简述
SEQ ID NO:1是编码从苏云金芽孢杆菌物种EG10742获得的TIC4472杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:2是TIC4472杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是设计用于在植物细胞中表达的编码TIC4472PL杀虫蛋白的合成编码序列，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧接着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO:4是由设计用于在植物细胞中表达的合成编码序列(SEQ ID NO:3)编码的TIC4472PL的氨基酸序列，并且其中在起始甲硫氨酸之后紧接着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO:5是编码从苏云金芽孢杆菌物种EG10731获得的TIC1425杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:6是TIC1425杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是编码从苏云金芽孢杆菌物种EG5408获得的TIC2613杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:8是TIC2613杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是设计用于在植物细胞中表达的编码TIC2613PL杀虫蛋白的合成编码序列，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧接着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO:10是由设计用于在植物细胞中表达的合成编码序列(SEQ ID NO:9)编码的TIC2613PL的氨基酸序列，并且其中在起始甲硫氨酸之后紧接着插入另外的丙氨酸氨基酸。
具体实施方式
农业害虫控制领域中的问题可以表征为对新的毒素蛋白的需要，所述新的毒素蛋白针对目标害虫有功效，针对目标害虫物种表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不引起不希望的农艺学问题，并且与植物中商业使用的当前毒素相比提供了替代性的作用模式。
本文公开了以TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL为例的新型杀虫蛋白，并且解决了这些需求中的每一个，特别是针对广谱的鳞翅目昆虫害虫，并且更特别地是针对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米穗虫Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabamaargillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(Helicoverpa armigera)、东方叶虫(Spodoptera litura)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)、Cry1Ac抗性红铃虫(Pectinophora gossypiella)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。
本申请中提及TIC4472、“TIC4472蛋白”、“TIC4472蛋白毒素”、“TIC4472毒素蛋白”、“TIC4472杀虫蛋白”、“TIC4472相关毒素”、“TIC4472相关毒素蛋白”、TIC4472PL、“TIC4472PL蛋白”、“TIC4472PL蛋白毒素”、“TIC4472PL毒素蛋白”、”TIC4472PL杀虫蛋白”、“TIC4472PL相关毒素”、“TIC4472PL相关毒素蛋白”、TIC1425、“TIC1425蛋白”、“TIC1425蛋白毒素”、“TIC1425毒素蛋白”、“TIC1425杀虫蛋白”、“TIC1425相关毒素”、“TIC1425相关毒素蛋白”、TIC2613、“TIC2613蛋白”、“TIC2613蛋白毒素”、“TIC2613毒素蛋白”、“TIC2613杀虫蛋白”、“TIC2613相关毒素”、“TIC2613相关毒素蛋白”、TIC2613PL、“TIC2613PL蛋白”、“TIC2613PL蛋白毒素”、“TIC2613PL毒素蛋白”、“TIC2613PL杀虫蛋白”、“TIC2613PL相关毒素”、“TIC2613PL相关毒素蛋白”等是指赋予针对鳞翅目害虫的活性的任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下、由以下组成、基本上与以下同源、与以下相似或来源于以下：TIC4472(SEQ ID NO:2)、TIC4472PL(SEQ ID NO:4)、TIC1425(SEQ ID NO:6)、TIC2613(SEQID NO:8)或TIC2613PL(SEQ ID NO:10)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列以及其杀虫或昆虫抑制区段或者其组合，如果这种蛋白质与TIC4472、TIC4472PL或TIC1425的比对导致约93％至约100％的任何百分比分数的氨基酸序列同一性；或者如果这种蛋白质与TIC2613或TIC2613PL的比对导致约73％至约100％的任何百分比分数的氨基酸序列同一性，则所述任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白包括表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白质。TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白包括质体靶向和非质体靶向形式的蛋白质。
术语“区段”或“片段”在本申请中用于描述与描述TTIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的完全氨基酸或核酸序列相比较短的连续氨基酸或核酸序列。本申请中还公开了表现出昆虫抑制活性的区段或片段，条件是这种区段或片段与SEQ ID NO:2所示的TIC4472蛋白、SEQ ID NO:4所示的TIC4472PL蛋白和SEQ ID NO:6中所示的TIC1425蛋白的对应部分的比对，导致所述区段或片段与TIC4472、TIC4472PL或TIC1425蛋白的对应部分之间的氨基酸序列同一性为约93％至约100％的任何百分比分数；或者条件是这种区段或片段与SEQ ID NO:8中所示的TIC2613或SEQ ID NO:10中所示的TIC2613PL蛋白的对应部分的比对，导致所述区段或片段与TIC2613或TIC2613PL蛋白的对应部分之间的氨基酸序列同一性为约73％至约100％的任何百分比分数。
在更进一步的具体实施方案中，TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的片段可以定义为表现出所述蛋白来源的起始蛋白分子所具有的杀虫活性。编码TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的核酸序列的片段可以定义为编码表现出由所述片段来源的起始核酸序列编码的蛋白质分子所具有的杀虫活性的蛋白质。本文描述的片段或变体还可包含本文鉴定的结构域，其负责蛋白质的杀虫活性。
在具体的实施方案中，提供了TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的片段，其包含如本文所公开的具有杀虫活性的TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约500、至少约600、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1150或至少约1175个连续氨基酸或更长。在某些实施方案中，本发明提供SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个的片段，其具有全长序列的活性。用于由起始分子产生此类片段的方法在本领域中是熟知的。
本申请中提及术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性”或“杀虫的”或“杀昆虫活性”、“昆虫抑制的”或“杀昆虫的”是指毒性剂(诸如蛋白毒素)在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或生存力)、禁止(禁止生长、摄食、繁殖力或生存力)、控制(在含有有效量的TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的特定作物上控制害虫侵扰、控制害虫摄食活性)或杀死害虫(引起害虫的发病、死亡或繁殖力降低)方面的功效。这些术语旨在包括向害虫提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中所述害虫暴露于毒性蛋白导致发病、死亡、繁殖力降低或生长迟缓。这些术语还包括由于在植物内或植物上提供杀虫有效量的毒性蛋白而从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置排斥害虫。通常，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制特定目标害虫(包括但不限于鳞翅目昆虫)的生长，发育，生存力，摄食行为，交配行为，繁殖力或由摄食此蛋白质、蛋白质片段、蛋白质区段或多核苷酸的昆虫引起的任何不利影响的可测量的降低的能力。毒性蛋白可以由植物产生，或者可以施用于植物或植物所定位的位置内的环境。术语“生物活性”、“有效的”、“有功效的”或其变型也是本申请中可交换使用的术语，以描述本发明的蛋白质对目标昆虫害虫的影响。
当在目标害虫的饮食中提供杀虫有效量的毒性剂时，其在毒性剂与害虫接触时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域已知的一种或多种化学剂。杀虫或杀昆虫化学剂和杀虫或杀昆虫蛋白剂可以单独使用或彼此组合使用。化学剂包括但不限于在目标害虫中靶向特定基因用于抑制的dsRNA分子、有机氯、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱和瑞诺烷(ryanoid)。杀虫或杀昆虫蛋白剂包括本申请所示的蛋白毒素，以及其他蛋白质毒性剂(包括靶向鳞翅目的那些毒性剂)，以及用于控制其他植物害虫的蛋白毒素，诸如本领域中可用于控制鞘翅目、半翅目和同翅目(Homopteran)物种的Cry和Cyt蛋白。
预期提及害虫，特别是作物植物的害虫，意指作物植物的昆虫害虫，特别是由TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白毒素类别控制的那些鳞翅目昆虫害虫。然而，当靶向这些害虫的毒性剂与TIC4472、TIC4472PL或TIC1425蛋白，或与TIC4472、TIC4472PL或TIC1425具有93％至约100％的同一性的蛋白质；或TIC2613或TIC2613PL蛋白或者与TIC2613或TIC2613PL具有73％至约100％的同一性的蛋白质共定位或一起存在时，提及害虫还可包括植物的鞘翅目、半翅目和同翅目昆虫害虫，以及线虫和真菌。
TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白由于具有共同功能而相关联，并且表现出对来自鳞翅目昆虫物种(包括成虫、蛹、幼虫和新生体)的昆虫害虫的杀昆虫活性。
鳞翅目昆虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和棉铃虫(heliothine)，例如秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、黑色叶蛾(Spodoptera exempta)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、披肩粘虫(Mamestraconfigurata)、黑切根虫(Agrotis ipsilon)、包菜尺蠖(Trichoplusia ni)、大豆尺蠖(Pseudoplusia includens)、绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)、苜蓿绿夜蛾(Hypenascabra)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、颗粒切根虫(Agrotis subterranea)、粘虫(Pseudaletia unipuncta)、西方切根虫(Agrotis orthogonia)；来自螟蛾科(Pyralidae)的螟虫、鞘蛾、网虫、锥虫、菜青虫和雕叶虫；例如，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、脐橙螟(Amyelois transitella)、玉米根网虫(Crambus caliginosellus)、草网虫(Herpetogramma licarsisalis)、向日葵蛾(Homoeosoma electellum)、小玉米茎螟虫(Elasmopalpus lignosellus)；来自卷蛾科(Tortricidae)的卷叶蛾、芽虫、种子蠕虫和水果蠕虫，例如，苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、葡萄浆果蛾(Endopiza viteana)、东方水果蛾(Grapholita molesta)、向日葵芽蛾(Suleima helianthana)；以及许多其他经济上重要的鳞翅目，例如，小菜蛾(Plutella xylostella)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)和舞毒蛾(Lymantria dispar)。鳞翅目的其他昆虫害虫包括，例如，棉叶虫(Alabamaargillacea)、果树卷叶虫(Archips argyrospila)、欧洲卷叶虫(玫瑰黄卷蛾(Archipsrosana)和其他黄卷蛾属物种(二化螟(Chilo suppressalis)、亚洲水稻螟或水稻茎螟)、水稻卷叶虫(Cnaphalocrocis medinalis)、玉米根网虫(Crambus caliginosellus)、早熟禾网虫(Crambus teterrellus)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、甘蔗螟(Diatraeasaccharalis)、多刺棉铃虫(Earias insulana)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、美国棉铃虫(Helicoverpa armigera)、玉米穗虫(Helicoverpa zea，也称为大豆豆荚虫和棉铃虫(cotton bollworm))、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、草网虫(Herpetogrammalicarsisalis)、西方豆切根虫(Striacosta albicosta)、欧洲葡萄树蛾(Lobesiabotrana)、柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)、小菜粉蝶(Pieris rapae，也称为外来菜青虫)、甜菜粘虫(Spodoptera exigua)、烟草切根虫(Spodoptera litura，也称为斜纹夜盗虫(cluster caterpillar))和番茄潜叶虫(Tutaabsoluta))。
在本申请中，提及“分离的DNA分子”或者等同术语或短语，旨在意指一种DNA分子，其单独存在或与其他组合物组合存在，但不在其天然环境中存在。例如，在生物体的基因组的DNA中天然存在的核酸元件(诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等)，只要所述元件位于生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置处，就不被认为是“分离的”。然而，只要所述元件不在生物体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置处，这些元件中的每一个以及这些元件的子部分在本公开的范围内就将会是“分离的”。类似地，编码杀昆虫蛋白或所述蛋白质的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在编码所述蛋白质的序列天然存在的细菌的DNA内即可。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即，插入植物或细菌的细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论所述核苷酸序列是否存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，植物或细菌的基因组内，或以可检测量存在于来源于植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
如本申请进一步所述，在从苏云金芽孢杆菌菌株EG10742获得的DNA中发现了编码TIC4747的开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO:1)。在微生物宿主细胞中克隆并表达所述编码序列以产生用于生物测定的重组蛋白。在从苏云金芽孢杆菌菌株EG10731获得的DNA中发现了编码TIC1425的开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO:5)。在从苏云金芽孢杆菌菌株EG5408获得的DNA中发现了编码TIC2613的开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO:7)。使用TIC4472的微生物宿主细胞衍生蛋白的生物测定证明了针对鳞翅目物种的活性，所述鳞翅目物种为甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(Helicoverpa armigera)、东方叶虫(Spodoptera litura)、红铃虫(Pectinophoragossypiella)、Cry1Ac抗性红铃虫(Pectinophora gossypiella)、大豆尺蠖(Chrysodeixisincludens)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)和绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。此外，还观察到针对黄热病蚊子(Aedes aegypti)的活性。使用TIC1425的微生物宿主细胞衍生蛋白的生物测定证明了针对鳞翅目物种的活性，所述鳞翅目物种为棉叶虫(Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、甘蔗螟(Diatraeasaccharalis)和西南玉米螟(Diatraea grandiosella)。使用TIC2613的微生物宿主细胞衍生蛋白的生物测定证明了针对鳞翅目物种的活性，所述鳞翅目物种为玉米穗虫(Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)和烟芽夜蛾(Heliothis virescens)。
对于在植物细胞中的表达，可以表达TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白以驻留在细胞质中或靶向植物细胞的各种细胞器。例如，将蛋白质靶向叶绿体可导致转基因植物中所表达的蛋白质的水平增加，同时防止发生表型异常。靶向也可能导致转基因品系中害虫抗性功效的增加。靶肽或转运肽是引导蛋白质转运至细胞特定区域的短(3-70个氨基酸长)肽链，所述特定区域包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。一些靶肽在蛋白质被转运之后通过信号肽酶从蛋白质中裂解。为了靶向叶绿体，蛋白质含有大约40-50个氨基酸的转运肽。对于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和5,728,925。许多叶绿体定位的蛋白质作为前体由核基因表达并且通过叶绿体转运肽(CTP)被靶向到叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与核酮糖-1,5,-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白质I和蛋白质II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)以及描述于美国专利号7,193,133中的转运肽相关联的那些蛋白质。已经在体内和体外证明了非叶绿体蛋白可以通过使用与异源CTP融合的蛋白质而被靶向到叶绿体，并且所述CTP足以将蛋白质靶向到叶绿体。已经示出了并入合适的叶绿体转运肽(诸如拟南芥(Arabidopsisthaliana)EPSPS CTP(CTP2)(参见Klee等,Mol.Gen.Genet.210:437-442,1987)或者矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(CTP4)(参见della-Cioppa等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:6873-6877,1986))以在转基因植物中将异源EPSPS蛋白序列靶向到叶绿体(参见美国专利号5,627,061；5,633,435和5,312,910；以及EP 0218571；EP 189707；EP 508909和EP924299)。为了将TIC6757或TIC6757PL毒素蛋白靶向到叶绿体，将编码叶绿体转运肽的序列以可操作地连接并同框的方式置于编码TIC6757或TIC6757PL毒素蛋白的合成编码序列的5'端，所述合成编码序列已经被设计用于在植物细胞中最佳表达。
设想可以通过使用TIC4472、TIC1425或TIC2613的氨基酸序列来产生与TIC4472、TIC1425或TIC2613相关的另外的毒素蛋白序列，以产生具有新型特性的新型蛋白质。可以比对TIC4472、TIC1425或TIC2613毒素蛋白以将氨基酸序列水平上的差异组合成新型氨基酸序列变体，并从而对编码所述变体的重组核酸序列做出适当的改变。
本公开还设想可以通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在植物中工程改造TIC4472蛋白毒素类别的改进变体。此类用于基因组编辑的技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可以用于将在植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变成不同的毒素编码序列。具体地，通过这些方法，毒素编码序列内的一个或多个密码子被改变以工程改造新的蛋白质氨基酸序列。或者，将编码序列内的片段替换或缺失，或者将另外的DNA片段插入到所述编码序列中，以工程改造新的毒素编码序列。新的编码序列可以编码具有新特性(诸如针对昆虫害虫增加的活性或谱)的毒素蛋白，以及提供针对昆虫害虫物种的活性，其中所述昆虫害虫物种已针对原始昆虫毒素蛋白产生抗性。可以通过本领域已知的方法使用包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞来产生表达新的毒素蛋白的完整植物。
还设想TIC4472、TIC1425或TIC2613的片段或其蛋白变体可以是截短的形式，其中一个或多个氨基酸从蛋白质的N末端、C末端、中部或其组合处缺失，其中所述片段和变体保留昆虫抑制活性。这些片段可以是TIC4472、TIC1425或TIC2613的天然存在的或合成的变体或者衍生的蛋白质变体，但应保留至少TIC4472、TIC1425或TIC2613的昆虫抑制活性。本文描述的片段或变体还可包含本文鉴定的结构域，其负责蛋白质的杀虫活性。
可以鉴定类似于TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白的蛋白质，并使用本领域已知的各种基于计算机的算法来相互比较(参见表1和2)。本申请报道的氨基酸序列同一性是使用以下这些缺省参数进行Clustal W比对的结果：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水性空位：开启(On)，亲水性残基：GPSNDQERK，残基特异性空位罚分：开启(Thompson等(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。氨基酸同一性百分比通过100％乘以(相同氨基酸数目/主题蛋白质的长度)的乘积进一步计算。其他比对算法也是本领域可获得的，并且提供与使用Clustal W比对获得的那些结果类似的结果，并且是本文设想的。
如果在查询中(例如在Clustal W比对中)使用针对鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性的蛋白质，并且如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的本发明的蛋白质被鉴定为这种比对中的命中，其中所述查询蛋白质沿着查询蛋白质的长度表现出至少93％至约100％的氨基酸同一性，即约93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或此范围内的任何百分比分数的氨基酸同一性，则预期针对鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性的所述蛋白质与TIC4472、TIC4472PL或TIC1425有关。如果在查询中(例如在Clustal W比对中)使用针对鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性的蛋白质，并且如SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10所示的本发明的蛋白质被鉴定为这种比对中的命中，其中所述查询蛋白质沿着查询蛋白质的长度表现出至少73％至约100％的氨基酸同一性，即约73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或此范围内的任何百分比分数的氨基酸同一性，则预期针对鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性的所述蛋白质与TIC2613或TIC2613PL有关。
使用Clustal W算法将示例性蛋白质TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL相互比对。创建每个全长蛋白质的氨基酸序列同一性百分比的成对矩阵，如表1中所报道。
表1.示例性蛋白质TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL的成对矩阵显示。
表格描述：在(X)与(Y)之间的Clustal W比对以成对矩阵形式报道。计算所有对之间的氨基酸同一性百分比，并且由各框中的第一数字表示。各框中的第二数字(在括号中)表示所述对之间的相同氨基酸的数量。
除了同一性百分比之外，TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL以及相关蛋白质也可以通过一级结构(保守氨基酸基序)、长度(约1187个氨基酸)和其他特征相关。表2中报道了TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白毒素的特征。
表2.TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白的所选择的特征。
如本申请的实施例中进一步描述的，编码TIC4472、TIC4472PL的变体和TIC2613、TIC2613PL的变体的合成核酸分子序列被设计在植物中使用。设计在植物中使用的编码TIC4472PL蛋白的示例性重组核酸分子序列如SEQ ID NO:3所示。设计在植物中使用的编码TIC2613PL蛋白的示例性重组核酸分子序列如SEQ ID NO:9所示。相对于TIC4472和TIC2613蛋白，TIC4472PL和TIC2613PL蛋白分别在起始甲硫氨酸之后紧接着具有另外的丙氨酸氨基酸。认为插入TIC4472和TIC2613氨基酸序列中的另外的丙氨酸残基改进了蛋白质在植物中的表达。同样，编码TIC1425的变体的合成核酸分子序列可以设计在植物中使用。
使用表达TIC4472PL蛋白的R0棉花叶组织的叶盘测定法证明了针对大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)和烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的高活性以及针对棉铃虫(Helicoverpa zea)和秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)的低活性。使用表达TIC4472PL蛋白的R0大豆叶组织的叶盘测定法证明了针对南方粘虫(Spodoptera eridania)和大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)的活性。
表达TIC4472PL和TIC2613PL蛋白的R0大豆植物的叶样品证明了针对南方粘虫(Spodoptera eridania)和大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)的活性。
可以构建含有重组核酸分子序列的表达盒和载体并根据本领域已知的转化方法和技术将其引入玉米、大豆、棉花或其他植物细胞中。例如，农杆菌属介导的转化描述于美国专利申请公布2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531(小麦)、2001/0042257A1(甜菜)、美国专利号5,750,871(油菜)、7,026,528(小麦)和6,365,807(水稻)中，以及Arencibia等(1998)Transgenic Res.7:213-222(甘蔗)中，所述专利和文献全部以引用的方式整体并入本文。转化的细胞可以再生成表达TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL的转化植物，并通过使用从所述转化植物获得的植物叶盘在鳞翅目害虫幼虫存在下进行的生物测定来证明杀虫活性。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术由植物细胞衍生。用于转化植物的方法是本领域已知的。
作为传统转化方法的替代方案，可通过定点整合将DNA序列(诸如转基因、表达盒等)插入或整合到植物或植物细胞基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的重组DNA构建体和分子可包括供体模板序列，所述供体模板序列包含用于插入到植物或植物细胞的基因组中的至少一个转基因、表达盒或其他DNA序列。用于定点整合的这种供体模板还可包括侧接插入序列(即，待插入到植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的重组DNA构建体还可包含编码位点特异性核酸酶和/或任何相关联蛋白质的表达盒以进行定点整合。这些核酸酶表达盒可作为供体模板存在于相同的分子或载体中(顺式)或存在于单独的分子或载体上(反式)。用于定点整合的若干种方法是本领域已知的，其涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或缺口的不同蛋白质(或者蛋白质的复合物和/或指导RNA)。简而言之，如本领域所理解的，在修复由核酸酶引入的DSB或缺口的过程中，供体模板DNA可在DSB或缺口的位点处整合到基因组中。尽管插入事件可通过非同源末端连接(NHEJ)发生，但供体模板中同源臂的存在可通过同源重组促进插入序列在修复过程中在植物基因组中的适用性和靶向。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程改造或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA的序列以将核酸酶定向到植物基因组内的所需位点。
如本文所用，“重组DNA分子”是包含在没有人为干预的情况下不会天然一起存在的DNA分子组合的DNA分子。例如，重组DNA分子可以是由相对于彼此异源的至少两个DNA分子组成的DNA分子，包含与在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子，或已通过遗传转化或基因编辑并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。类似地，“重组蛋白质分子”是包含在没有人为干预的情况下不会天然一起存在的氨基酸组合的蛋白质分子。例如，重组蛋白质分子可以是由相对于彼此异源的至少两个氨基酸分子组成的蛋白质分子，包含与在自然界中存在的氨基酸序列有偏差的氨基酸序列的蛋白质分子，或由于宿主细胞的遗传转化或宿主细胞基因组的基因编辑而在宿主细胞中表达的蛋白质分子。
设想了编码TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL的重组核酸分子组合物。例如，可用重组DNA构建体表达TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白，在所述构建体中将具有编码所述蛋白质的ORF的多核苷酸分子可操作地连接到在所述构建体意图的系统中表达所必需的遗传表达元件(诸如启动子)和任何其他调节元件。非限制性实例包括与TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白编码序列可操作地连接以在植物中表达蛋白质的植物功能性启动子，或者与TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白编码序列可操作地连接以在Bt细菌或其他芽孢杆菌属物种中表达蛋白质的Bt功能性启动子。其他元件可以可操作地连接到TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白编码序列，所述元件包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白质固定化标签(HIS-标签)、易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi靶位点。在此提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于可操作地连接到多核苷酸的异源启动子，所述多核苷酸诸如编码具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的相应的多肽或蛋白质的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:9。异源启动子也可以可操作地连接到编码质体靶向的TIC4472PL或TIC2613PL或非靶向的TIC4472PL或TIC2613PL的合成DNA编码序列。编码本文公开的蛋白质的重组核酸分子的密码子可被同义密码子替换(本领域中称为沉默替换)。
包含TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白编码序列的重组DNA构建体还可包含编码一种或多种昆虫抑制剂的DNA区域，其可被构造成能够与编码TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白，与TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白不同的蛋白质，昆虫抑制dsRNA分子或辅助蛋白质的DNA序列并行表达或共同表达。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合配偶体或其他试剂，其功能在于有助于昆虫抑制剂的有效性，例如通过帮助其表达、影响其在植物中的稳定性、优化低聚的自由能、增强其毒性以及增加其活性谱。辅助蛋白可以促进对一种或多种昆虫抑制剂的摄取，例如或者加强毒性剂的毒性效果。
可以组装重组DNA构建体，使得所有蛋白质或dsRNA分子从一个启动子表达，或者每种蛋白质或dsRNA分子处于单独的启动子的控制或其一些组合之下。本发明的蛋白质可由多基因表达系统表达，其中TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白中的一种或多种蛋白质由共同核苷酸区段表达，所述区段也含有其他开放阅读框和启动子，取决于所选择的表达系统的类型。例如，细菌多基因表达系统可利用单个启动子从单个操纵子内驱动多重连接/串联开放阅读框的表达(即，多顺反子表达)。在另一个实例中，植物多基因表达系统可以利用多重非连接或连接的表达盒，每个盒表达不同蛋白质或其他试剂(诸如一个或多个dsRNA分子)。
可通过载体来向宿主细胞递送包含TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白编码序列的重组多核苷酸或重组DNA构建体，所述载体例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒粒子、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体。此类载体可以用于在宿主细胞中实现TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白编码序列的稳定或瞬时表达，或所编码的多肽的后续表达。包含TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白编码序列并且引入宿主细胞中的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本申请中被称为“转基因”。
本文提供了含有表达TIC4472或相关的家族毒素蛋白编码序列的任何一种或多种的重组多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可以包括但不限于，农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属或者根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可以包括但不限于双子叶植物或单子叶植物。术语“植物细胞”或“植物”还可包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了由转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，转基因植物可以由转基因种子通过切割、折断、研磨或以其他方式从植物中分离部分来获得。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、圆荚、叶、花、茎、根或其任何部分，或转基因植物部分的不可再生部分。如在此上下文中所用，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能被诱导以形成完整植物的部分或不能被诱导以形成能够有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、圆荚、叶、花、茎或根的一部分。
提供了制备包含鳞翅目昆虫抑制量的TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的转基因植物的方法。此类植物可通过以下方式来制备：将编码本申请中提供的蛋白质中的任一种的重组多核苷酸引入植物细胞中，并且选择来源于表达鳞翅目昆虫抑制量的蛋白质的所述植物细胞的植物。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术由植物细胞衍生。用于转化植物的方法是本领域已知的。
本文还公开了加工的植物产品，其中所述加工的产品包含可检测量的TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白，所述蛋白的昆虫抑制区段或片段或者所述蛋白的任何区别部分。在某些实施方案中，加工的产品选自由以下组成的组：植物部分、植物生物质、油、粉、糖、动物饲料、面粉、薄片、麸皮、棉绒、壳、加工的种子和种子。在某些实施方案中，加工的产品是不可再生的。植物产品可以包括来源于转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产品，其中所述商品或其他产品可以通过检测编码或包含TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的区别部分的核苷酸区段或表达RNA或蛋白质来通过商业追踪。
表达TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白的植物可以通过培育与表达其他毒素蛋白和/或表达其他转基因性状(诸如除草剂耐受性基因、赋予产量或胁迫耐受性状的基因等)的转基因品系杂交，或者可以将此类性状组合在单一载体中使得所述性状全部得以连锁。
在本申请中，提及“分离的”DNA分子或氨基酸分子或者等同术语或短语，旨在意指一种DNA分子或氨基酸分子，其单独存在或与其他组合物组合存在，但不在其天然环境中存在。例如，只要所述元件不在生物体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置处，DNA分子或氨基酸分子在本公开的范围内就将会是“分离的”。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即，插入植物或细菌的细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论所述核苷酸序列是否存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，植物或细菌的基因组内，或以可检测量存在于来源于植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
如实施例中进一步描述的，可以使用本领域普通技术人员已知的方法(诸如聚合酶链式反应(PCR)、热扩增和杂交)来鉴定TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL蛋白编码序列和与TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL具有显著同一性百分比的序列。例如，蛋白质TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL可以用于产生与相关蛋白质特异性结合的抗体，并且可以用于筛选并发现密切相关的其他蛋白质成员。
此外，编码TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613或TIC2613PL毒素蛋白的核苷酸序列可以用作探针和引物，用于使用热循环或等温扩增和杂交方法进行筛选以鉴定所述类别的其他成员。例如，来源于如SEQ ID NO:3所示的序列的寡核苷酸可以用于在来源于商品产品的脱氧核糖核酸样品中确定TIC4472PL转基因是否存在。来源于如SEQ ID NO:7所示的序列的寡核苷酸可以用于在来源于商品产品的脱氧核糖核酸样品中确定TIC2613PL转基因是否存在。鉴于使用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏度，预期来源于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9所示序列的寡核苷酸可用于在来源于合并来源的商品产品中检测TIC4472PL或TIC2613PL，其中仅商品产品的一部分来源有含有任一种转基因的转基因植物。进一步认识到，可以使用此类寡核苷酸将核苷酸序列变异引入SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9中的每一个中。此类“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中表现出一系列昆虫抑制活性或不同表达的TIC4472PL和TIC2613PL氨基酸序列变体。
核苷酸序列同源物，例如由在严格杂交条件下与本申请中公开的各个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀昆虫蛋白，也是本发明的实施方案。本发明还提供了用于检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中所述第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段，并且与第二核苷酸序列杂交。在这种情况下，第二核苷酸序列可以是在严格杂交条件下表示为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列中的任一种。核苷酸编码序列在适当杂交条件(诸如严格杂交条件)下彼此杂交，并且由这些核苷酸序列编码的蛋白质与针对其他蛋白质中的任一种产生的抗血清交叉反应。如本文所定义的严格杂交条件包括至少在42℃下杂交，接着在室温下用2X SSC、0.1％ SDS洗涤2次，每次5分钟，接着在65℃下在0.5X SSC、0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。在甚至更高的温度下洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃的杂交条件，接着在68℃下在含有0.1％ SDS的2xSSC中洗涤。
本领域技术人员将认识到由于遗传密码的冗余，许多其他序列能够编码此类相关蛋白质，并且那些序列就它们起在芽孢杆菌属菌株中或在植物细胞中表达杀虫蛋白质的功能而言是本发明的实施方案，当然应认识到许多此类冗余编码序列在这些条件下将不与编码TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL的天然芽孢杆菌属序列杂交。本申请涵盖使用本领域普通技术人员已知的这些和其他鉴定方法来鉴定TIC4472、TIC1425和TIC2613蛋白编码序列和与TIC4472、TIC1425和TIC2613蛋白编码序列具有显著同一性百分比的序列。
本公开也涵盖使用本领域中已知的分子方法来工程改造并克隆商业上有用的蛋白质，所述蛋白质包括来自杀虫蛋白的蛋白质的嵌合体；例如可由TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白的区段组装嵌合体以获得另外的有用的实施方案，其包括组装TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白的区段与不同于TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613P和相关蛋白质的不同蛋白质的区段。可对TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613P蛋白进行彼此比对并且与其他苏云金芽孢杆菌或其他杀虫蛋白(无论这些蛋白质是否在系统发生方面关系密切或疏远)比对，并且可鉴定每个这种蛋白质的区段，用于在所比对的蛋白质之间替换，从而导致构建嵌合蛋白。可对此类嵌合蛋白进行害虫生物测定分析，并且与嵌合体中每个这种区段所来源的亲本蛋白质相比，表征生物活性增加或目标害虫谱扩大是否存在。可通过与其他蛋白质调换结构域或区段或通过使用本领域中已知的定向进化方法来进一步工程改造多肽的杀虫活性以获得对特定害虫或对更广泛谱系的害虫的活性。
本申请还公开了用TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL蛋白控制作物植物的昆虫(特别是鳞翅目)侵扰的方法。此类方法可包括种植包含昆虫或鳞翅目抑制量的TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白的植物。在某些实施方案中，此类方法还可以包括以下中的任一个或多个：(i)将包含或编码TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白的任何组合物施用于植物或产生植物的种子；和(ii)用编码TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。通常，预期TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白可以组合物形式提供、以微生物形式提供、或者以赋予针对鳞翅目昆虫的昆虫抑制活性的转基因植物形式提供。
在某些实施方案中，TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白的重组核酸分子是昆虫抑制组合物的杀昆虫活性成分，所述昆虫抑制组合物通过在适于表达TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白的条件下培养经转化以表达TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白的重组芽孢杆菌属或任何其他重组细菌细胞来制备。这种组合物可以通过脱水、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备。这种过程可以得到芽孢杆菌属或其他昆虫病原细菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。通过获得如此产生的重组多肽，包括重组多肽的组合物可以包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饮食生物测定中的昆虫抑制制剂。
在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL的昆虫抑制组合物还可以包含至少一种另外的多肽，所述另外的多肽针对相同的鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性，但不同于TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL毒素蛋白。用于这种组合物的可能的另外的多肽包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsRNA分子。使用此类核糖核苷酸序列来控制昆虫害虫的一个实例描述于Baum等(美国专利公布2006/0021087A1)中。用于控制鳞翅目害虫的这种另外的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于，Cry1A(美国专利号5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公布号10/525,318)、Cry1C(美国专利号6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其变体、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利号7,070,982；6,962,705和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合体(诸如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100(国际申请公布WO2016/061391(A2))、TIC2160(国际申请公布WO2016/061392(A2))、Cry2A、Cry2Ab(美国专利号7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、AND AXMI-045(美国专利公布2013-0117884A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公布2013-0310543A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公布2013-0104259A1)、AXMI-134(美国专利公布2013-0167264A1)、AXMI-150(美国专利公布2010-0160231A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、axmi209(美国专利公布2011-0030096A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布2014-0245491A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公布2014-0196175A1)、AXMI-238(美国专利公布2014-0033363A1)、AXMI-270(美国专利公布2014-0223598A1)、AXMI-345(美国专利公布2014-0373195A1)、AXMI-335(国际申请公布WO2013/134523(A2))、DIG-3(美国专利公布2013-0219570A1)、DIG-5(美国专利公布2010-0317569A1)、DIG-11(美国专利公布2010-0319093A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公布2014-0033361A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公布2014-0033361A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公布2014-0007292A1)、PSEEN3174(美国专利公布2014-0007292A1)、AECFG-592740(美国专利公布2014-0007292A1)、Pput_1063(美国专利公布2014-0007292A1)、DIG-657(国际申请公布WO2015/195594(A2))、Pput_1064(美国专利公布2014-0007292A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726A1)、GS153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、GS154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、GS155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、如美国专利公布2012-0167259A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2012-0047606A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0154536A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0112013A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0192256A1中所述的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如美国专利公布2010-0077507A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0077508A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2009-0313721A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0269221A1中所述的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如美国专利号7,772,465(B2)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如WO2014/008054A2中所述的CF161_0085及其衍生物、如美国专利公布US2008-0172762A1、US2011-0055968A1和US2012-0117690A1中所述的鳞翅目毒素蛋白及其衍生物；如US7510878(B2)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利号7812129(B1)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物等。
在其他实施方案中，此类组合物/制剂还可以包含至少一种另外的多肽，其对不被本发明的其他昆虫抑制蛋白抑制的昆虫表现出昆虫抑制活性，以扩大获得的昆虫抑制谱。例如，对于半翅目害虫的控制，本发明的昆虫抑制蛋白的组合可以与半翅目活性蛋白一起使用，所述半翅目活性蛋白诸如TIC1415(美国专利公布2013-0097735A1)、TIC807(美国专利号8609936)、TIC834(美国专利公布2013-0269060A1)、AXMI-036(美国专利公布2010-0137216A1)和AXMI-171(美国专利公布2013-0055469A1)。用于控制鞘翅目害虫的另外的多肽可以选自由诸如但不限于以下的昆虫抑制蛋白组成的组：Cry3Bb(美国专利号6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公布2013-0167264A1)AXMI-184(美国专利公布2010-0004176A1)、AXMI-205(美国专利公布2014-0298538A1)、axmi207(美国专利公布2013-0303440A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公布2014-0196175A1)、AXMI-279(美国专利公布2014-0223599A1)、AXMI-R1及其变体(美国专利公布2010-0197592A1、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公布2010-0319092A1)、eHIPs(美国专利申请公布号2010/0017914)、IP3及其变体(美国专利公布2012-0210462A1)和(美国专利申请公布US2014-0366227A1)。
用于控制鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫害虫的另外的多肽可以在由NeilCrickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站(以btnomenclature.info在万维网上)找到。
本领域已经记录了昆虫对某些杀昆虫剂产生抗性的可能性。一种昆虫抗性管理策略采用表达两种通过不同作用模式起作用的不同昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一种昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可以通过另一种昆虫抑制剂来控制。另一种昆虫抗性管理策略采用未针对所靶向的鳞翅目害虫物种进行保护，以为此类未受保护的植物提供防护。一个具体的实例描述于美国专利号6,551,962中，其以引用的方式整体并入本文。
其他实施方案，诸如设计用于控制也由本文公开的蛋白质控制的害虫以与蛋白质一起用于种子处理的局部施用的杀虫化学品、喷雾制剂、滴注制剂或擦拭制剂，可以直接施用于土壤(土壤浸液)，施用于表达本文公开的蛋白质的生长植物，或配制成能够施用于含有编码一种或多种所公开蛋白质的一种或多种转基因的种子。用于种子处理的此类制剂可以与本领域已知的各种粘着剂和增粘剂一起施用。此类制剂可以含有与所公开的蛋白质的作用模式具有协同作用的杀虫剂，使得制剂杀虫剂通过不同的作用模式起作用以控制可以被所公开的蛋白质控制的相同或类似的害虫，或者使得此类杀虫剂用于控制更广泛的宿主范围内的害虫或不能由TIC4472、TIC4472PL、TIC1425、TIC2613和TIC2613PL杀虫蛋白有效控制的植物害虫物种。
前述组合物/制剂还可以包含农业上可接受的运载体，诸如诱饵、粉末、粉尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体悬浮剂、水性溶液剂、芽孢杆菌属孢子/晶体制品、种子处理、转化以表达一种或多种蛋白质的重组植物细胞/植物组织/种子/植物或者转化以表达一种或多种蛋白质的细菌。根据重组多肽中固有的昆虫抑制或杀昆虫抑制水平和待施用于植物或饮食测定的制剂水平，组合物/制剂可以包括按重量计各种量的重组多肽，例如0.0001重量％至0.001重量％至0.01重量％至1重量％至99重量％的重组多肽。
鉴于前述情况，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在公开的具体方面作出改变，并且仍然获得相似或类似的结果。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的。应当理解，本文引用的每个参考文献的全部公开内容并入到本申请的公开内容范围内。
实施例
实施例1
TIC4472、TIC1425和TIC2613的发现、克隆和表达
对编码三种新型苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的序列进行鉴定、克隆、序列确认并在昆虫生物测定中测试。分别分离自苏云金芽孢杆菌菌株EG10742、EG10731和EG5408的杀虫蛋白TIC4472、TIC1425和TIC2613代表新型Cry1Ca样蛋白。
分别设计聚合酶链反应(PCR)引物以由分离自苏云金芽孢杆菌菌株EG10742、EG10731和EG5408的总基因组DNA扩增TIC4472、TIC1425和TIC2613的编码区的全长拷贝。PCR扩增子还包括每个编码序列的翻译起始密码子和终止密码子。
使用本领域已知的方法将每个扩增子以与Bt可表达的启动子可操作地连接的方式克隆到Bt(苏云金芽孢杆菌)表达载体中。
实施例2
TIC4472、TIC1425和TIC2613在昆虫生物测定中表现出鳞翅目活性
通过在Bt表达宿主中产生蛋白质来评估杀虫蛋白TIC4472、TIC1425和TIC2613的生物活性。使表达TIC4472、TIC1425和TIC2613的Bt菌株生长二十四(24)小时，并且然后将孢子晶体制品或溶解的蛋白质制品加入昆虫饮食中。通过将以表达TIC4472、TIC1425和TIC2613的Bt菌株的培养物为食的昆虫的生长和发育与以未处理的对照培养物为食的昆虫进行比较，来评估死亡率和发育迟缓。
针对以下测定TIC4472的制品：鳞翅目物种玉米穗虫(两个群落(CEW和CEWUC)，Helicoverpa zea，也称为棉铃虫和大豆荚虫)、棉叶虫(CLW，Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)、南方粘虫(SAW，Spodoptera eridania)、西南玉米螟(SWCB，Diatraea grandiosella)、甘蔗螟(SCB，Diatraea saccharalis)、Cry2Ab抗性甘蔗螟(SCB2R)、烟芽夜蛾(TBW，Heliothis virescens)和绒毛豆毛虫(VBW，Anticarsiagemmatalis)；鞘翅目物种科罗拉多金花虫(CPB，Leptinotarsa decemlineata)和西方玉米根虫(WCB，Diabrotica virgifera virgifera)；半翅目物种褪色植物虫(TPB，Lyguslineolaris)、西方褪色植物虫(WTP，Lygus hesperus)；和双翅目物种黄热病蚊子(Aedesaegypti)。针对以下测定TIC1425的制品：鳞翅目物种黑色粘虫(BCW，Agrotis ipsilon)、棉叶虫(CLW，Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)、黑色粘虫(BCW，Agrotis ipsilon)、西南玉米螟(SWCB，Diatraeagrandiosella)和甘蔗螟(SCB，Diatraea saccharalis)；和鞘翅目物种西方玉米根虫(WCB，Diabrotica virgifera virgifera)和南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctatahowardi)。针对以下测定TIC2613的制品：鳞翅目物种玉米穗虫(两个群落(CEW和CEWUC)，Helicoverpa zea，也称为棉铃虫和大豆荚虫)、棉叶虫(CLW，Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)、南方粘虫(SAW，Spodoptera eridania)、黑色粘虫(BCW，Agrotis ipsilon)、西南玉米螟(SWCB，Diatraea grandiosella)、烟芽夜蛾(TBW，Heliothis virescens)和绒毛豆毛虫(VBW，Anticarsia gemmatalis)；鞘翅目物种科罗拉多金花虫(CPB，Leptinotarsa decemlineata)；西方玉米根虫(WCB，Diabrotica virgiferavirgifera)和南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)；和半翅目物种褪色植物虫(TPB，Lygus lineolaris)、西方褪色植物虫(WTP，Lygus hesperus)。
对于在Bt宿主中生长的每种蛋白质观察到的生物测定活性示于下表3和4中，其中“+”表示活性，“NT”表示毒素未针对所述特定昆虫害虫进行测定，“S”表示发育迟缓，并且“M”表示死亡率。TIC4472、TIC1425和TIC2613的制品未表现出针对每种蛋白质测定的鞘翅目或半翅目昆虫害虫的活性。TIC4472还表现出针对黄热病蚊子Aedes aegypti)的活性。所有三种毒素都表现出对多种鳞翅目昆虫害虫的抗性，如表3和4所示。
表3.TIC4472、TIC1425和TIC2613针对害虫昆虫的生物测定活性。
表4.TIC4472、TIC1425和TIC2613针对害虫昆虫的生物测定活性。
从上表3和4中可以看出，昆虫毒素TIC4472表现出针对所测定的所有鳞翅目昆虫害虫(CEW、CEWUC、CLW、ECB、FAW、SBL、SAW、SCB、SCB2R、SWCB、TBW和VBC)以及YFM的活性。昆虫毒素TIC1425表现出针对CLW、ECB、FAW、SCB和SWCB的活性。昆虫毒素TIC2613表现出针对CEW、CLW、ECB、FAW、SBL、SAW、SCB、SWCB、TBW和VBC的活性。当针对BCW测定时，未观察到TIC1425和TIC2613的活性。
在不同系列的实验中，使用针对以下鳞翅目昆虫害虫的饮食覆盖测定法测定TIC4472的蛋白质制剂：甜菜夜蛾(BAW，Spodoptera exigua)、红铃虫(PBW，Pectinophoragossypiella)、Cry1Ac抗性红铃虫(PBW_Cry1Acr，Pectinophora gossypiella)、旧世界棉铃虫(OWB，Helicoverpa armigera)、东方叶虫(OLW，Spodoptera litura)和斑点棉铃虫(SBW，Earias vittella)。表5示出了在饮食覆盖生物测定中测定的针对这些鳞翅目昆虫害虫中的每一种所观察到的活性，其中“+”表示活性。
表5.TIC4472针对鳞翅目昆虫害虫的生物测定活性。
从上表5中可以看出，TIC4472表现出针对饮食覆盖生物测定中所测定的所有鳞翅目昆虫害虫(包括红铃虫的Cry1Ac抗性群落)的活性。
如表3-5所示，TIC4472、TIC1425和TIC2613在广泛的鳞翅目昆虫害虫物种范围内表现出活性。
实施例3
编码TIC4472PL和TIC2613PL的合成编码序列用于在植物细胞中表达的设计
构建合成编码序列，用于在植物中表达所编码的蛋白质，并且将所述合成编码序列克隆到二元植物转化载体中并用于转化植物细胞。合成序列根据美国专利5,500,365中大体描述的方法来合成，避免了某些有害的问题序列，诸如富含ATTTA和A/T的植物聚腺苷酸化序列。合成编码序列编码TIC4472PL和TIC2613PL蛋白，其分别相对于TIC4472和TIC2613蛋白在起始甲硫氨酸之后紧接着包含另外的丙氨酸残基。将另外的丙氨酸残基引入合成编码序列中以改进昆虫毒素蛋白的表达。
编码TIC4472PL(SEQ ID NO:4)的合成编码序列在本文中表示为SEQ ID NO:3。编码TIC2613PL(SEQ ID NO:10)的合成编码序列表示为SEQ ID NO:9。将合成编码序列用于二元植物转化载体中以产生表达TIC4472PL和TIC2613PL蛋白的转基因植物，并测定所述合成编码序列针对鳞翅目昆虫害虫的活性。
实施例4
在稳定转化的棉花植物中测定TIC4472PL针对鳞翅目害虫的活性
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述转基因盒被设计成能够表达非靶向的TIC4472PL杀虫蛋白。所得载体用于稳定转化棉花植物。从转化体中收获组织并用于针对各种鳞翅目昆虫害虫的昆虫生物测定。
构建合成编码序列，用于在植物中表达所编码的蛋白质，并且将所述合成编码序列克隆到二元植物转化载体中并用于转化棉花植物细胞。所得植物转化载体包含用于表达TIC4472PL杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接到前导序列的5'端，可操作地连接到编码非靶向的TIC4472PL蛋白的合成编码序列的5'端，其进而可操作地连接到3'UTR的5'端；以及第二转基因盒，其用于使用奇放线菌素选择来选择转化的植物细胞。
如上所述，构建三种二元植物转化载体构建体，并包含不同的组成型启动子。两个构建体，构建体1和构建体3，还包含内含子序列，其可操作地连接到前导序列的3'端以及编码非靶向TIC4472PL蛋白的合成编码序列的5'端。构建体2是无内含子的。使用农杆菌属介导的转换方法用三种不同的二元转化载体转化棉花植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘的生物测定与美国专利号8,344,207中所述的类似进行。将单个新孵出不到一天的新生幼虫放在每个叶盘样品上，并使其进食约四天。使用未转化的棉花植物获得用作阴性对照的组织。针对棉铃虫(CBW，Helicoverpa zea)、秋季粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)和烟芽夜蛾(TBW，Heliothis virescens)评估每个二元载体的多重转化R0单拷贝插入品系。从一(1)到四(4)范围内的叶损伤等级(LDR)分数适用于品系。LDR分数基于每个叶盘观察到的损伤的百分比。下表6示出了LDR分数以及与每个分数相关联的对应的损伤百分比范围。对于一(1)的LDR分数，还评估了性状的外显率。高外显率(示出为“(H)”)被定义为大于百分之五十(50)的每种构建体的所测定品系具有小于或等于百分之十(10)叶损伤。低外显率(示出为“(L)”)被定义为小于或等于百分之五十(50)的每种构建体的所测定品系具有小于或等于百分之十(10)叶损伤。外显率不适用于大于一(1)的LDR分数。
表6.棉花叶损伤等级(LDR)分数以及对应的损伤百分比和外显率。
表达TIC4472PL的转化的R0棉花植物的叶损伤等级分数示于下表7中。在测定的品系总数中表现出LDR分数的品系的数量示于括号中，随后是LDR分数为一(1)的那些品系的外显率。
表7.叶损伤等级(LDR)分数、表现出LDR的品系的数量和表达TIC4472PL的转化的R0棉花植物的外显率。
构建体 CBW FAW SBL TBW
构建体1 3(1/25) 2(2/25) 1(25/25)H 1(24/25)H
构建体2 3(3/25) 2(1/25) 1(24/25)H 1(16/25)H
构建体3 4(23/23) 1(1/23)L 1(21/23)H 1(6/23)L
如表7所示，表达TIC4472PL的转化的R0棉花植物针对SBL和TBW高度有功效(定义为具有小于或等于百分之十的叶损伤)。在若干个品系中也观察到针对CBW和FAW的活性。
从上文测定的转化的R0棉花植物中选择R1棉花品系，并将其用于针对FAW、SBL和TBW的叶盘测定。表8示出了表达TIC4472PL的转化的R1棉花植物的叶损伤等级分数。
表8.叶损伤等级(LDR)分数、表现出LDR的品系的数量和表达TIC4472PL的转化的R1棉花植物的外显率。
构建体 FAW SBL TBW
构建体1 1(3/4)H 1(4/4)H 1(4/4)H
构建体2 1(1/4)L 1(4/4)H 1(1/4)L
从上表8中可以看出，所选择的品系表现出针对FAW、SBL和TBW的高功效。对于所有三种昆虫害虫物种的构建体1转化品系，外显率很高。相对于构建体2转换品系，SBL的外显率很高。
上述内容证明，表达TIC4472PL蛋白的转化棉花植物对秋季粘虫(FAW，Spodopterafrugiperda)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)和烟芽夜蛾(TBW，Heliothisvirescens)具有抗性。
实施例5
TIC4472PL和TIC2613PL在稳定转化大豆植株中针对鳞翅目害虫的活性的测定
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述转基因盒被设计成能够表达靶向的TIC4472PL或TIC2613PL非靶向的杀虫蛋白。所得载体用于稳定转化大豆植物。从转化体中收获组织并用于针对各种鳞翅目昆虫害虫的昆虫生物测定。
将设计用于实施例3中所述的植物表达的合成编码序列克隆到二元植物转化载体构建体中，并用于转化大豆植物细胞。使用本领域已知的方法构建三种二元载体构建体，以表达质体靶向和非靶向的TIC4472PL。构建体4包含用于表达非靶向的TIC4472PL的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接到前导序列的5'端，可操作地连接到编码非靶向的TIC4472PL蛋白的合成编码序列的5'端，其进而可操作地连接到3'UTR的5'端；以及第二转基因盒，其用于使用奇放线菌素选择来选择转化的植物细胞。构建体5包含用于表达靶向的TIC4472PL的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接到前导序列的5'端，可操作地连接到内含子的5'端，可操作地连接到编码质体靶向的TIC4472PL蛋白的合成编码序列的5'端，其进而可操作地连接到3'UTR的5'端；以及第二转基因盒，其用于使用奇放线菌素选择来选择转化的植物细胞。构建体6包含用于表达非靶向的TIC4472PL的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接到前导序列的5'端，可操作地连接到内含子的5'端，可操作地连接到编码非靶向的TIC4472PL蛋白的合成编码序列的5'端，其进而可操作地连接到3'UTR的5'端；以及第二转基因盒，其用于使用奇放线菌素选择来选择转化的植物细胞。
使用本领域已知的方法构建两种二元载体构建体，以表达非靶向的TIC4472PL。构建体7包含用于表达非靶向的TIC2613PL的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接到前导序列的5'端，可操作性地连接到编码非靶向的TIC2613PL蛋白的合成编码序列的5'端，其进而可操作地连接到3'UTR的5'端；以及第二转基因盒，其用于使用奇放线菌素选择来选择转化的植物细胞。构建体8包含用于表达非靶向的TIC2613PL的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接到前导序列的5'端，可操作地连接到内含子的5'端，可操作地连接到编码非靶向的TIC2613PL蛋白的合成编码序列的5'端，其进而可操作地连接到3'UTR的5'端；以及第二转基因盒，其用于使用奇放线菌素选择来选择转化的植物细胞。
所得二元转化载体构建体用于使用农杆菌属介导的转换方法转化大豆细胞。通过本领域已知的方法诱导转化的大豆细胞形成植物。使用植物叶盘的生物测定与美国专利号8,344,207中所述的类似进行。使用未转化的大豆植物获得用作阴性对照的组织。针对南方粘虫(SAW，Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)和大豆豆荚虫(SPW，Helicoverpa zea)评估来源于二元载体的多重R0大豆转化品系。叶损伤等级(LDR)分数与棉花相似，但用于确定分数的损伤百分比的范围不同。叶损伤等级分数及其相应的叶损伤百分比等级范围示于下表9中。
表9.大豆叶损伤等级(LDR)分数和相应的损伤百分比范围。
LDR分数 叶损伤等级(LDR)范围
1 LDR≤20％
2 20％<LDR≤35％
3 35％<LDR≤70％
4 LDR>70％
表达TIC4472PL和TIC2613PL的转化的R0棉花植物的叶损伤等级分数示于下表10中。在括号中示出了在测定的品系总数中表现出LDR分数的品系数目。
表10.叶损伤等级(LDR)分数，以及表达TIC4472PL和TIC2613PL的转化的R0大豆植物的表现出LDR的品系的数量。
毒素 构建体 SAW SBL SPW
TIC4472PL 构建体4 1(23/29) 1(29/29) 3(8/29)
TIC4472PL 构建体5 1(20/29) 1(28/29) 1(1/29)
TIC4472PL 构建体6 1(10/29) 1(15/15) 3(3/15)
TIC2613PL 构建体7 1(22/30) 1(24/30) 3(1/30)
TIC2613PL 构建体8 1(14/25) 1(22/25) 2(2/25)
从上表10中可以看出，TIC4472PL和TIC2613PL二者的表达都表现出针对SAW和SBL的高功效。两种蛋白质针对SPW的活性更低。
从上文测定的表达TIC4472PL和TIC2613PL的转化的R0大豆植物中选择R1大豆品系，并将其用于针对SAW、SBL和SPW的叶盘测定。还针对绒毛豆毛虫(VBW，Anticarsiagemmatalis)评估表达TIC4472PL的R1大豆品系。表11示出了表达TIC4472PL和TIC2613PL的转化的R1大豆植物的叶损伤等级分数。
表11.叶损伤等级(LDR)分数，以及表达TIC4472PL和TIC2613PL的转化的R1大豆植物的表现出LDR的品系的数量。
毒素 构建体 SAW SBL SPW VBC
TIC4472PL 构建体5 1(3/8) 1(5/8) 3(2/8)
TIC4472PL 构建体6 1(1/9) 1(6/9) 3(1/9) 1(3/9)
TIC2613PL 构建体8 2(2/10) 1(9/10) 4(4/10)
从表11中可以看出，用TIC4472PL转化的许多R1大豆品系表现出针对SAW和SBL的高功效。另外，若干个使用构建体6转化的R1大豆品系表现出针对VBC的高功效。用TIC2613PL转化的R1大豆品系表现出针对SBL的高功效。
上述内容证明，表达TIC4472PL或TIC2613PL的转化大豆植物对鳞翅目昆虫具有抗性，所述鳞翅目昆虫特别是南方粘虫(Spodoptera eridania)和大豆尺蠖(Chrysodeixisincludens)和绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。
实施例6
TIC4472PL和TIC2613PL在稳定转化玉米植株中针对鳞翅目害虫的活性的测定
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述转基因盒被设计用于表达质体靶向的和非靶向的TIC4472PL或TIC2613PL杀虫蛋白。所得载体用于稳定转化玉米植物。从转化体中收获组织并用于针对各种鳞翅目昆虫害虫的昆虫生物测定。
将编码TIC4472PL(SEQ ID NO：3)或TIC2613(SEQ ID NO：9)蛋白的合成编码序列克隆到二元转化载体中。对于质体靶向蛋白，合成的TIC4472PL或TIC2613PL杀虫蛋白编码序列以同框的方式可操作地连接到叶绿体靶向信号肽编码序列。所得植物转化载体包含用于表达TIC4472PL或TIC2613PL杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接到前导序列的5'端，可操作地连接到内含子的5'端，可操作地连接到编码质体靶向的和非靶向的TIC4472PL或TIC2613PL蛋白的合成编码序列的5'端，其进而可操作地连接到3'UTR的5'端；以及第二转基因盒，其用于使用草甘膦选择来选择转化的植物细胞。
使用农杆菌属介导的转换方法用上述二元转化载体转化玉米植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘的生物测定与美国专利号8,344,207中所述的类似进行。使用未转化的玉米植物获得用作阴性对照的组织。针对甜菜夜蛾(BAW，Spodoptera exigua)、黑色粘虫(BCW，Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(CEW，Helicoverpazea)、棉叶虫(CLW，Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(OWB，Helicoverpa armigera)、东方叶虫(OLW，Spodoptera litura)、红铃虫(PBW，Pectinophora gossypiella)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)、斑点棉铃虫(SBW，Earias vittella)、西南玉米螟(SWCB，Diatraea grandiosella)、甘蔗螟(SCB，Diatraea saccharalis)、烟芽夜蛾(TBW，Heliothis virescens)和绒毛豆毛虫(VBW，Anticarsia gemmatalis)以及其他鳞翅目昆虫害虫评估每个二元载体的多重转化品系。
观察昆虫害虫的由摄取呈递的表达TIC4472PL或TIC2613PL的叶盘引起的死亡率和发育迟缓，并与来源于未转化的玉米植物的叶盘进行比较。
按照本公开，本文公开的并且要求保护的所有组合物可在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物已经根据前述示例性实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是可使本文所述的组合物发生变化、改变、修改和变更，而不偏离本发明的真实概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是在化学上和生理学上都相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时实现相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改均被认为是在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
本说明书中引用的所有公布和公布的专利文件都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已明确且个别地指示将各个公布或专利申请以引用的方式并入本文一般。

Claims (32)

1.一种重组核酸分子，其包含异源启动子，所述异源启动子与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作地连接，其中：
所述杀虫蛋白由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中：
a.所述重组核酸分子包含功能在于在植物中表达所述杀虫蛋白的序列；或
b.所述重组核酸分子在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白；或
c.所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：质粒以及细菌或酵母人工染色体。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：噬菌粒、杆粒和粘粒。
4.如权利要求1所述的重组核酸分子，其被定义为存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自由细菌和植物细胞组成的组。
5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自由以下组成的组的细菌属：农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。
6.如权利要求5所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属物种为蜡状芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属为侧孢短芽孢杆菌，并且所述埃希氏菌属为大肠杆菌。
7.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述植物细胞是双子叶或单子叶植物细胞。
8.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、菜花、芹菜、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、牧草、胡椒、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、红花、灌木、高粱、菠菜、南瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
9.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：鹰嘴豆、豌豆、木豆和大豆。
10.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：棕榈树和向日葵。
11.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：花旗松、火炬松、辐射松和南方松。
12.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自花生。
13.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：黑麦和黑小麦。
14.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自蓖麻。
15.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白质针对鳞翅目昆虫表现出活性。
16.如权利要求15的重组核酸分子，其中所述昆虫选自由以下组成的组：甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabama argillacea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秋季粘虫(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(Helicoverpa armigera)、东方叶虫(Spodoptera litura)、红铃虫(Pectinophoragossypiella)、Cry1Ac抗性红铃虫(Pectinophora gossypiella)、大豆尺蠖(Chrysodeixisincludens)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)和绒毛豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。
17.如权利要求1所述的重组核酸分子或由包含于种子中的所述重组核酸分子编码的杀虫蛋白。
18.一种昆虫抑制组合物，其包含杀虫蛋白或其杀虫片段，其中：
所述杀虫蛋白由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
19.如权利要求18所述的昆虫抑制组合物，其还包含与所述杀虫蛋白不同的至少一种其他杀虫剂。
20.如权利要求19所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白。
21.如权利要求20所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种表现出活性。
22.如权利要求21所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113、和AXMI-005、AXMI-134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1和其变体、IP3和其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657和DIG-11蛋白。
23.如权利要求18所述的昆虫抑制组合物，其还包含编码所述杀虫蛋白或其杀虫片段的重组核酸分子，其中所述组合物包含于表达所述重组核酸分子的植物细胞内。
24.一种由权利要求4所述的宿主细胞生产的商品产品，其中所述商品产品包含可检测量的所述杀虫蛋白。
25.如权利要求24所述的商品产品，其选自由以下组成的组：由谷物处理器装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷类等，以及对应的大豆、大米、小麦、高粱、木豆、花生、水果、甜瓜和蔬菜商品产品，在适用情况下包括果汁、浓缩物、果酱、果胶、橘子果酱以及含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和/或多肽的其他可食用形式的此类商品产品，不可再生的加工的棉籽、棉油、棉绒、加工成饲料或食品、纤维、纸材、生物质和燃料产品(诸如来源于棉油的燃料或来源于轧棉机废料的粒料)的种子和植物部分的不可再生部分，不可再生的或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粉、大豆面、大豆片、大豆麸、豆浆、大豆奶酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸材、包含大豆的乳脂、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
26.一种生产种子的方法，其包括：
a.种植种子，所述种子包含权利要求1所述的重组核酸分子或由所述重组核酸分子编码的杀虫蛋白；
b.由所述种子长成植物；以及
c.从所述植物收获种子，其中所述收获的种子包含所述重组核酸分子。
27.一种编码杀虫有效量的杀虫蛋白的重组核酸分子，其中所述蛋白质由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列表示；并且所述杀虫有效量的所述杀虫蛋白包含在抗昆虫感染的植物细胞中。
28.一种用于控制害虫侵扰的方法，所述方法包括：
使所述害虫与杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的杀虫蛋白接触。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述害虫是鳞翅目物种害虫。
30.一种在包含植物基因组DNA的样品中检测如权利要求1所述的重组核酸分子的存在的方法，其包括：
a.使所述样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含如权利要求1所述的重组核酸分子的植物的基因组DNA杂交，并且在此类杂交条件下不与来自不包含如权利要求1所述的重组核酸分子的其他同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、或编码包含以下氨基酸序列的杀虫蛋白的序列同源或互补，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少95％的氨基酸序列同一性；
b.使所述样品和探针经受严格杂交条件；以及
c.检测所述探针与所述样品的DNA的杂交。
31.一种在包含蛋白质的样品中检测杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；所述方法包括：
a.使所述样品与免疫反应性抗体接触；以及
b.检测所述蛋白质的存在。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。
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