CN111647608A - 抗虫基因VIP3m及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗虫基因VIP3m及其应用。基因VIP3m及其编码蛋白的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。与转VIP3基因玉米相比，转VIP3m基因玉米抗虫性明显提高。室内杀虫试验结果表明，杀虫蛋白Cry1Ab‑l(SEQ ID NO:4)比Cry1Ab具有更高的杀虫活性，可作为新型杀虫蛋白。将基因Cry1Ab‑l和VIP3m共同导入植物体内制得的转基因玉米抗虫性明显提高，对鳞翅目害虫表现出高抗。

Description

抗虫基因VIP3m及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种抗虫基因VIP3m及其应用。
背景技术
虫害是造成农作物严重减产的一个主要因素，防治农业害虫最常见的手段是使用化学杀虫剂和生物杀虫剂。化学杀虫剂多具有广谱、高毒的特点，在杀死目标害虫的同时往往将很多益虫一起杀死，严重破坏生态平衡，并对环境造成严重污染；此外，农药残留对人类、牲畜的健康也造成严重威胁。生物杀虫剂具有易降解，与环境高度相容的特点，但在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。为了弥补化学杀虫剂和生物杀虫剂在农业生产应用中的弊端，科学家们将能编码杀虫蛋白的基因导入到植物体内，培育出多种转基因植物。
目前，人们已经克隆了数百种Bt杀虫蛋白基因，但这些杀虫蛋白基因真正能应用于生产的却屈指可数，其原因主要是毒力较低，在转基因作物中表达量低，容易使害虫产生抗性；除此之外，杀虫蛋白基因克隆资源的日渐匮乏也给基因克隆造成很大难度。因此，有必要创制具有杀虫活性的新型Bt基因，并利用这些基因转化玉米创制转基因玉米新材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗虫基因VIP3m及其应用。
本发明的另一目的是将抗虫基因Cry1Ab-l和抗虫基因VIP3m联合用于农田害虫的防治。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗虫基因VIP3m，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其是按照玉米密码子偏好性优化后得到的。抗虫基因VIP3m编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第二方面，本发明提供含有基因VIP3m的生物材料。
本发明中，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌、转基因细胞系或非可再生的植物部分。
第三方面，本发明提供含有抗虫基因Cry1Ab-l和抗虫基因VIP3m的生物材料。
其中，抗虫基因Cry1Ab-l编码的杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据玉米密码子偏好性对基因Cry1Ab-l进行优化，优化后基因Cry1Ab-l的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
第四方面，本发明提供基因VIP3m、含有基因VIP3m的生物材料或含有基因Cry1Ab-l和基因VIP3m的生物材料的以下任一应用：
1)用于植物育种；
2)用于制备转基因植物。
其中，育种目的为赋予植物抗虫性。
本发明中，所述虫包括鳞翅目害虫。
优选地，所述鳞翅目害虫为玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾等。
第五方面，本发明提供基因VIP3m、含有基因VIP3m的生物材料或含有基因Cry1Ab-l和基因VIP3m的生物材料在制备具有抗虫性的转基因植物中的应用。
第六方面，本发明提供一种获得具有抗虫性的玉米的方法，
1)使玉米包含基因VIP3m；或，
2)使玉米表达基因VIP3m编码的蛋白质。
所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
第七方面，本发明提供一种杀虫剂，有效成分为杀虫蛋白Cry1Ab-1和基因VIP3m编码的蛋白质。
其中，所述杀虫蛋白Cry1Ab-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
第八方面，本发明提供所述杀虫剂在鳞翅目害虫(特别是鳞翅目幼虫)防治中的应用。
第九方面，本发明提供抗虫转基因玉米的构建方法：
1)使玉米包含基因VIP3m和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因；或，
2)使玉米表达基因VIP3m编码的蛋白质和杀虫蛋白Cry1Ab-1。
进一步地，将抗虫基因VIP3m和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因构建到同一表达载体上，且抗虫基因VIP3m和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因分别位于不同的表达盒中，然后将重组载体导入玉米中；或，
将抗虫基因VIP3m和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因分别构建到不同表达载体上，然后将含有抗虫基因VIP3m的表达载体以及含有编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因的表达载体共同导入玉米中。
第十方面，本发明提供一种鉴定植物的方法，其中，所述植物是包含基因VIP3m/基因Cry1Ab-l和VIP3m的植物、表达基因VIP3m编码的蛋白质和杀虫蛋白Cry1Ab-1的植物或按照上述方法获得的植物；所述方法包括：
1)测定所述植物是否包含基因VIP3m/基因Cry1Ab-l和VIP3m；或，
2)测定所述植物是否表达基因VIP3m编码的蛋白质和杀虫蛋白Cry1Ab-1。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
(一)提高转基因玉米的抗虫性是培育抗虫转基因玉米的关键，一方面，本发明通过密码子优化VIP3基因获得VIP3m基因并使其在转基因玉米中表达量显著提高，转VIP3m基因玉米的抗虫性明显增强；另一方面，本发明通过基因叠加的策略将VIP3m和Cry1Ab-1基因在转基因玉米中共表达，明显提高转基因玉米的抗虫性，获得的抗虫转基因玉米材料具有重要的应用价值。
(二)抗虫基因Cry1Ab-l编码的杀虫蛋白比Cry1Ab具有更高的杀虫活性，可作为新型杀虫蛋白。
(三)与转VIP3基因玉米相比，转VIP3m基因玉米抗虫性明显提高。
(四)与转VIP3m基因玉米相比，转Cry1Ab-l和VIP3m基因玉米抗虫性明显提高，对鳞翅目害虫表现出高抗。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中植物表达载体pCAMBIA3301的质粒图谱(改造的质粒pCAMBIA3301)。
图2为本发明较佳实施例中杀虫蛋白基因VIP3的p3301Ubi-VIP3植物表达载体图。
图3为本发明较佳实施例中杀虫蛋白基因VIP3的p3301Ubi-VIP3m植物表达载体图。
图4为本发明较佳实施例中转基因玉米室内草地贪夜蛾接虫鉴定结果。
图5为本发明较佳实施例中质粒p3301Ubi-Cry1Ab1的结构示意图。
图6为本发明较佳实施例中质粒p3301UbiAbUbiVIP3的结构示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 VIP3m基因的改造合成
本发明提供一种对草地贪夜蛾具有杀虫活性的杀虫蛋白基因VIP3m及其编码蛋白。
根据玉米密码子偏好性对来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的VIP3蛋白(GenBank No.48811.1)的编码基因进行优化，G+C含量由原来的30.9％提高到59.9％，进一步提高VIP3基因在转基因玉米中的表达水平。改造后的基因命名为VIP3m基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，将基因VIP3、VIP3m分别构建到pUC57载体上，得到具有氯霉素抗性的质粒pUC57-VIP3和pUC57-VIP3m。基因VIP3m及其编码蛋白的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
实施例2转VIP3m基因玉米的构建
1、植物转化载体p3301Ubi-VIP3和p3301Ubi-VIP3m的构建
将质粒pCAMBIA3301用HindIII和BamHI进行双酶切，35S启动子替换为玉米Ubiquitin启动子，构建得到改造的质粒pCAMBIA3301(图1)。用BamHI和SacI双酶切改造的质粒pCAMBIA3301、pUC57-VIP3和pUC57-VIP3m，37℃水浴锅中酶切1h，酶切体系如下：
Figure BDA0002543583700000041
酶切产物经琼脂糖胶电泳，对照Marker分别切取约2.3kb大小的VIP3(SEQ ID NO:5)和VIP3m片段，及约11kb大小的改造pCAMBIA3301载体序列，用天根生化科技(北京)有限公司胶回收试剂盒对核酸片段进行回收；然后，按照T4连接酶的使用说明将切胶回收的核酸片段与纯化回收的载体片段进行连接。连接反应结束，取5μL连接产物转化大肠杆菌Trans5α。挑取克隆菌斑于10mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜培养，次日，提质粒并定量。用BamHI和SacI双酶切质粒，经琼脂糖电泳验证载体p3301Ubi-VIP3(图2)、p3301Ubi-VIP3m(图3)构建的正确性。
2、农杆菌转化法获得转基因玉米植株
将载体p3301Ubi-Cry1Ab、p3301Ubi-Cry1Ab-l通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米综31幼胚为材料，将幼胚置于侵染培养基中1h后，用侵染培养基清洗一次，再浸入添加100μM乙酰丁香酮的侵染培养基的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，置于共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。幼胚洗涤去菌后，置于含1.5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含3mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次，筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好，为抗性愈伤。将选出的抗性愈伤组织转接到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日3000Lux光强，光照16小时，很快就会有再生小苗出现。再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗移植到罐头瓶中，并在室内培养。待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3，体积比)的小花盆中。待玉米又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中，自交获得T1代种子。
本实施例中使用的侵染培养基、共培养培养基、再生培养基、生根培养基可参照ZL201710090814.2。
实施例3 VIP3和VIP3m在转基因玉米中的表达量检测
利用上海佑隆公司生产的VIP3蛋白ELISA检测试剂盒检测转基因玉米中的VIP3蛋白含量。称取约0.1g转基因玉米叶片，在液氮中研磨成粉末。加入1ml蛋白提取液(来自所述ELISA检测试剂盒)震荡混匀30min，使蛋白充分溶解在提取液中，离心取上清用于分析。每个酶标板孔中加入50ul酶联反应液，然后在不同的孔中分别加入不同浓度的VIP3标准蛋白、转基因玉米蛋白提取物，室温孵育1-2小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，加入100ul反应底物后室温孵育10-30分钟，加入100ul终止缓冲液，用酶标仪测定在450nm下的吸光值，计算转基因玉米中VIP3蛋白含量。结果表明，转VIP3m基因玉米中的VIP3蛋白含量显著高于转VIP3基因的蛋白含量(表1)。
表1转基因玉米中VIP3蛋白含量
玉米材料 VIP3蛋白含量
转VIP3基因玉米 2ug/g鲜重
转VIP3m基因玉米 4ug/g鲜重
非转基因玉米综31 0ug/g鲜重
实施例4转VIP3m基因玉米抗虫性鉴定
种植在温室田间的转基因玉米长至7-8叶期时，取幼嫩叶片放入培养皿中，每皿接5头初孵草地贪夜蛾幼虫。试验在相对湿度为70％–80％、温度为26–28℃、光照周期为16h:8h(L:D)的培养室里进行，每24h统计昆虫的死亡率，根据组织被取食消耗情况添加或更换相同来源的新组织，试验在相同条件下重复三次。结果表明，转空载体和VIP3基因玉米感草地贪夜蛾，而转VIP3m基因玉米高抗草地贪夜蛾，抗虫性明显提高(图4)。
实施例5 Cry1Ab-l和VIP3m蛋白的室内杀虫试验
1、蛋白表达纯化
对来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的Cry1Ab蛋白(GenBankNo.X04698)的1155个氨基酸序列进行分析，选取前658个氨基酸残基作为新型杀虫蛋白，命名为Cry1Ab-l。根据玉米密码子偏好性对编码Cry1Ab-l的基因进行优化，G+C含量由原来的38.8％提高到63.7％，进一步提高Cry1Ab-l基因在转基因玉米中的表达水平。设计的Cry1Ab-l基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。基因Cry1Ab-l及其编码蛋白的序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。
将Cry1Ab-l和VIP3m基因分别构建到pET30a载体上，得到具有氯霉素抗性的质粒pET30-Cry1Ab-1和pET30-VIP3m。将质粒共同转入购自全式金公司的菌株Transetta(DE3)中，挑取单克隆，PCR扩增验证阳性菌斑。将检测阳性的菌斑接种于10mL的LB液体培养基中(含适宜抗生素)，于37℃过夜振荡培养，得到种子液。
次日，按1：200的比例将种子液接种到200mL LB液体培养基中(含适宜抗生素)，37℃，200rpm震荡培养至OD600为0.4-0.6，加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃摇床，160rpm，震荡培养20h左右，诱导目的蛋白的表达。
收集200mL诱导的菌体，4℃5000rpm离心5min，弃上清液，加入10mL重悬液(25mMTris-HCl，150mM NaCl，15mM咪唑)，加入10mg/mL的溶菌酶至终浓度为100μg/mL，振荡后于冰上放置10min，超声波破碎，每隔3s超声4s，300w，15-20min，使菌体充分破碎，破碎过程冰上操作。
4℃12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm滤膜过滤。加入1mL混匀的50％的Ni-NTA树脂，室温下于摇床上轻微振荡90min，使目的蛋白充分结合到Ni-NTA树脂上。将结合有目的蛋白的Ni-NTA树脂装柱纯化。镍柱预先用70％乙醇平衡，之后用5倍镍柱体积的重悬液平衡。
低速向柱子中加入混匀好的蛋白上清和树脂的混合物，收集流出液，标记为L15。
用溶液I(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，30mM咪唑)8mL洗涤，收集流出液，标记为L30。
用溶液II(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，100mM咪唑)4mL洗涤，收集流出液，标记为L100。
用溶液III(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，250mM咪唑)10mL洗涤，收集流出液，标记为L250。
以上纯化过程均在4℃环境中操作，并严格避免交叉污染。
纯化蛋白分别转入透析袋中，用透析液(25mM Tris-HCl，150mM NaCl)在4℃，转子搅拌下透析24h，每8h更换一次透析液。透析处理后，采用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒对纯化的L250蛋白进行定量。
2、室内虫试
在室内温度28±1℃、光周期(L:D)16h:8h、相对湿度70-80％的条件下，采用人工饲料混合法进行室内玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾虫试，将纯化的蛋白分别以25μg/g的量添加到人工饲料中配成饲养饲料，将饲料均分到48孔细胞培养板中，以不添加蛋白的饲料作为阴性对照。取不同培养板分别在每孔接玉米螟、棉铃虫或草地贪夜蛾初孵幼虫一头，共接虫144头，7天后统计虫子死亡率。结果表明联合使用杀虫蛋白Cry1Ab-l和VIP3m对玉米螟、棉铃虫和草地贪夜蛾的杀虫效果比Cry1Ab-1和VIP3m明显提高(表2)。
表2原核表达纯化蛋白的杀虫率
蛋白种类 玉米螟 棉铃虫 草地贪夜蛾
VIP3m 70％ 60％ 100％
Cry1Ab-l 100％ 100％ 70％
VIP3m+Cry1Ab-1 100％ 100％ 100％
阴性对照 0％ 0％ 0％
实施例6转Cry1Ab-l和VIP3m基因玉米的构建及抗虫性鉴定
1、植物转化载体p3301Ubi-Cry1Ab-Ubi-VIP3的构建
PCR扩增质粒p3301Ubi-Cry1Ab1(图5)上的Ubiquitin-Cry1Ab-1-NOS表达框序列，表达框序列两端扩增时加上HindIII酶切位点。将质粒p3301Ubi-VIP3m(图3)用HindIII酶切，将Ubiquitin-Cry1Ab-1-NOS表达框插入到酶切的载体上，构建成质粒p3301UbiAbUbiVIP3(图6)。
2、转基因玉米的制备
按照实施例2中的方法将质粒p3301Ubi-Cry1Ab1和质粒p3301UbiAbUbiVIP3分别转化农杆菌，进一步转化玉米获得转基因玉米植株。
3、转Cry1Ab-l和VIP3m玉米抗虫性鉴定
种植在温室的转基因玉米长至7-8叶期时，取幼嫩叶片放入培养皿中，每皿分别接初孵玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾幼虫。试验在相对湿度为70％–80％、温度为26–28℃、光照周期为16h:8h(L:D)的培养室里进行，每24h统计昆虫的死亡率，根据组织被取食消耗情况添加或更换相同来源的新组织，试验在相同条件下重复三次。结果表明，转Cry1Ab-1和VIP3m基因玉米高抗玉米螟、棉铃虫和草地贪夜蛾，抗虫性明显提高(表3)。
表3转基因玉米的杀虫率
玉米材料 玉米螟 棉铃虫 草地贪夜蛾
转VIP3m基因玉米 50％ 40％ 100％
转Cry1Ab-l基因玉米 100％ 100％ 60％
转VIP3m和Cry1Ab-1基因玉米 100％ 100％ 100％
非转基因玉米综31 0％ 0％ 0％
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 抗虫基因VIP3m及其应用
<130> KHP201112852.2
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2370
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 1
atgaacaaga acaacaccaa gctcagcacc cgcgccctcc cgagcttcat cgactacttc 60
aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctcac cctcgacgag atcctcaaga accagcagct cctcaacgac 180
atcagcggca agctcgacgg cgtgaacggc agcctcaacg acctcatcgc ccagggcaac 240
ctcaacaccg agctcagcaa ggagatcctc aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctc 300
aacgacgtga acaacaagct cgacgccatc aacaccatgc tccgcgtgta cctcccgaag 360
atcaccagca tgctcagcga cgtgatgaag cagaactacg ccctcagcct ccagatcgag 420
tacctcagca agcagctcca ggagatcagc gacaagctcg acatcatcaa cgtgaacgtg 480
ctcatcaaca gcaccctcac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540
gagaagttcg aggagctcac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600
agcccggccg acatcctcga cgagctcacc gagctcaccg agctcgccaa gagcgtgacc 660
aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctcaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720
aacaacctct tcggccgcag cgccctcaag accgccagcg agctcatcac caaggagaac 780
gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctcatcgt gctcaccgcc 840
ctccaggccc aggccttcct caccctcacc acctgccgca agctcctcgg cctcgccgac 900
atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ctcaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960
aacatcctcc cgaccctcag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020
agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gccaagccgg gccacgccct catcggcttc 1080
gagatcagca acgacagcat caccgtgctc aaggtgtacg aggccaagct caagcagaac 1140
taccaggtgg acaaggacag cctcagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctcctc 1200
tgcccggacc agagcgagca gatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 1260
gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tccgctacga ggtgactgcc 1320
aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctcaaca agaagaaggt ggagagcagc 1380
gaggccgagt accgcaccct cagcgccaac gacgacggcg tgtacatgcc gctcggcgtg 1440
atcagcgaga ccttcctcac cccgatcaac ggcttcggcc tccaggccga cgagaacagc 1500
cgcctcatca ccctcacctg caagagctac ctccgcgagc tcctcctcgc caccgacctc 1560
agcaacaagg agaccaagct catcgtgccg ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 1620
aacggcagca tcgaggagga caacctcgag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680
gtggaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctct acgtgcacaa ggacggcggc 1740
atcagccagt tcatcggcga caagctcaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800
gtgaagggca agccgagcat ccacctcaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860
gacaccaaca acaacctcga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920
gacctcaagg gcgtgtacct catcctcaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980
aacttcatca tcctcgagat cagcccgagc gagaagctcc tcagcccgga gctcatcaac 2040
accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct caccctctac 2100
cagggcggcc gcggcatcct caagcagaac ctccagctcg acagcttcag cacctaccgc 2160
gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaacagccg cgaggtgctc 2220
ttcgagaagc gctacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 2280
gagaaggaca acttctacat cgagctcagc cagggcaaca acctctacgg cggcccgatc 2340
gtgcacttct acgacgtgag catcaagtga 2370
<210> 2
<211> 789
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 2
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
<210> 3
<211> 1977
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 3
atggacaaca acccgaacat caacgagtgc atcccgtaca actgcctgtc caacccggag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gaggatcgag accggctaca ccccgatcga catctccctg 120
tccctgaccc agttcctgct gtccgagttc gtgccgggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccg tcccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagctga tcaaccagag gatcgaggag ttcgccagga accaggccat ctccaggctg 300
gagggcctgt ccaacctgta ccagatctac gccgagtcct tcagggagtg ggaggccgac 360
ccgaccaacc cggccctgag ggaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaactccgcc 420
ctgaccaccg ccatcccgct gttcgccgtg cagaactacc aggtgccgct gctgtccgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgtcc gtgctgaggg acgtgtccgt gttcggccag 540
aggtggggct tcgacgccgc caccatcaac tccaggtaca acgacctgac caggctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgaggtgg tacaacaccg gcctggagag ggtgtggggc 660
ccggactcca gggactggat caggtacaac cagttcagga gggagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgtccctgtt cccgaactac gactccagga cctacccgat caggaccgtg 780
tcccagctga ccagggagat ctacaccaac ccggtgctgg agaacttcga cggctccttc 840
aggggctccg cccagggcat cgagggctcc atcaggtccc cgcacctgat ggacatcctg 900
aactccatca ccatctacac cgacgcccac aggggcgagt actactggtc cggccaccag 960
atcatggcct ccccggtggg cttctccggc ccggagttca ccttcccgct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ccgccccgca gcagaggatc gtggcccagc tgggccaggg cgtgtacagg 1080
accctgtcct ccaccctgta caggaggccg ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
tccgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcacctcct ccaacctgcc gtccgccgtg 1200
tacaggaagt ccggcaccgt ggactccctg gacgagatcc cgccgcagaa caacaacgtg 1260
ccgccgaggc agggcttctc ccacaggctg tcccacgtgt ccatgttcag gtccggcttc 1320
tccaactcct ccgtgtccat catcagggcc ccgatgttct cctggataca caggtccgcc 1380
gagttcaaca acatcatccc gtcctcccag atcacccaga tcccgctgac caagtccacc 1440
aacctgggct ccggcacctc cgtggtgaag ggcccgggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500
aggaggacct ccccgggcca gatctccacc ctgagggtga acatcaccgc cccgctgtcc 1560
cagaggtaca gggtgaggat caggtacgcc tccaccacca acctgcagtt ccacacctcc 1620
atcgacggca ggccgatcaa ccagggcaac ttctccgcca ccatgtcctc cggctccaac 1680
ctgcagtccg gctccttcag gaccgtgggc ttcaccaccc cgttcaactt ctccaacggc 1740
tcctccgtgt tcaccctgtc cgcccacgtg ttcaactccg gcaacgaggt gtacatcgac 1800
aggatcgagt tcgtgccggc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggcc 1860
cagaaggccg tgaacgagct gttcacctcc tccaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920
accgactacc acatcgacca ggtgtccaac ctggtggagt gcctgtccga cgagtag 1977
<210> 4
<211> 658
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 4
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
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Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
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Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
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Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
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Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
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Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn
450 455 460
Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr
465 470 475 480
Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg
500 505 510
Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg
515 520 525
Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg
530 535 540
Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn
545 550 555 560
Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn
565 570 575
Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn
580 585 590
Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu
595 600 605
Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val
610 615 620
Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val
625 630 635 640
Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser
645 650 655
Asp Glu
<210> 5
<211> 2370
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 5
atgaacaaga ataatactaa attaagcaca agagccttac caagttttat tgattatttt 60
aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaacatgat ttttaaaacg 120
gatacaggtg gtgatctaac cctagacgaa attttaaaga atcagcagtt actaaatgat 180
atttctggta aattggatgg ggtgaatgga agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240
ttaaatacag aattatctaa ggaaatatta aaaattgcaa atgaacaaaa tcaagtttta 300
aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcgggtata tctacctaaa 360
attacctcta tgttgagtga tgtaatgaaa caaaattatg cgctaagtct gcaaatagaa 420
tacttaagta aacaattgca agagatttct gataagttgg atattattaa tgtaaatgta 480
cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcgtatc aaaggattaa atatgtgaac 540
gaaaaatttg aggaattaac ttttgctaca gaaactagtt caaaagtaaa aaaggatggc 600
tctcctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aactagcgaa aagtgtaaca 660
aaaaatgatg tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720
aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcatcgg aattaattac taaagaaaat 780
gtgaaaacaa gtggcagtga ggtcggaaat gtttataact tcttaattgt attaacagct 840
ctgcaagccc aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900
attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960
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gaaattagta atgattcaat tacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat 1140
tatcaagtcg ataaggattc cttatcggaa gttatttatg gtgatatgga taaattattg 1200
tgcccagatc aatctgaaca aatctattat acaaataaca tagtatttcc aaatgaatat 1260
gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagcg 1320
aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt 1380
gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatgggg tgtatatgcc gttaggtgtc 1440
atcagtgaaa catttttgac tccgattaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca 1500
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agcaataaag aaactaaatt gatcgtcccg ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag 1620
aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat 1680
gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga 1740
atttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact 1800
gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa 1860
gatacaaata ataatttaga agattatcaa actattaata aacgttttac tacaggaact 1920
gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat 1980
aactttatta ttttggaaat tagtccttct gaaaagttat taagtccaga attaattaat 2040
acaaataatt ggacgagtac gggatcaact aatattagcg gtaatacact cactctttat 2100
cagggaggac gagggattct aaaacaaaac cttcaattag atagtttttc aacttataga 2160
gtgtattttt ctgtgtccgg agatgctaat gtaaggatta gaaattctag ggaagtgtta 2220
tttgaaaaaa gatatatgag cggtgctaaa gatgtttctg aaatgttcac tacaaaattt 2280
gagaaagata acttttatat agagctttct caagggaata atttatatgg tggtcctatt 2340
gtacattttt acgatgtctc tattaagtaa 2370

Claims (10)

1.抗虫基因VIP3m，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.含有权利要求1所述基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。
3.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料的以下任一应用：
1)用于植物育种；
2)用于制备转基因植物。
4.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在制备具有抗虫性的转基因植物中的应用；其中，所述虫包括鳞翅目害虫；
优选地，所述鳞翅目害虫为玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾。
5.获得具有抗虫性的玉米的方法，其特征在于，
1)使玉米包含权利要求1所述的基因；或，
2)使玉米表达权利要求1所述基因编码的蛋白质；
其中，所述虫包括鳞翅目害虫；优选地，所述鳞翅目害虫为玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
7.杀虫剂，其特征在于，有效成分为杀虫蛋白Cry1Ab-1和权利要求1所述基因编码的蛋白质；
其中，所述杀虫蛋白Cry1Ab-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
8.权利要求7所述杀虫剂在鳞翅目害虫防治中的应用；
优选地，所述鳞翅目害虫为玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾。
9.抗虫转基因玉米的构建方法，其特征在于，
1)使玉米包含权利要求1所述的基因和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因；或，
2)使玉米表达权利要求1所述基因编码的蛋白质和杀虫蛋白Cry1Ab-1；
其中，杀虫蛋白Cry1Ab-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述虫包括鳞翅目害虫；优选地，所述鳞翅目害虫为玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将抗虫基因VIP3m和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因构建到同一表达载体上，且抗虫基因VIP3m和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因分别位于不同的表达盒中，然后将重组载体导入玉米中；或，
将抗虫基因VIP3m和编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因分别构建到不同表达载体上，然后将含有抗虫基因VIP3m的表达载体以及含有编码杀虫蛋白Cry1Ab-1的基因的表达载体共同导入玉米中。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112898388A (zh) * 2020-06-16 2021-06-04 九圣禾种业股份有限公司 一种抗虫蛋白Cry1ABn39、编码基因和应用
CN114524867A (zh) * 2022-02-23 2022-05-24 沧州市农林科学院 一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白
CN115851774A (zh) * 2022-09-01 2023-03-28 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用
CN117025834A (zh) * 2023-10-10 2023-11-10 中国农业科学院作物科学研究所 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用
WO2023216141A1 (zh) * 2022-05-11 2023-11-16 北京大北农生物技术有限公司 杀虫蛋白的用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1256712A (zh) * 1997-04-03 2000-06-14 诺瓦提斯公司 植物病害控制
CN103509808A (zh) * 2012-12-05 2014-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 杀虫基因及其用途
CN107383177A (zh) * 2017-08-16 2017-11-24 中国农业大学 人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1Ab
CN109952024A (zh) * 2016-10-10 2019-06-28 孟山都技术公司 新型昆虫抑制蛋白

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1256712A (zh) * 1997-04-03 2000-06-14 诺瓦提斯公司 植物病害控制
CN103509808A (zh) * 2012-12-05 2014-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 杀虫基因及其用途
CN109952024A (zh) * 2016-10-10 2019-06-28 孟山都技术公司 新型昆虫抑制蛋白
CN107383177A (zh) * 2017-08-16 2017-11-24 中国农业大学 人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1Ab

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUAN J.ESTRUCH等: "Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects", 《PROC. NATL. ACAD. SCI》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112898388A (zh) * 2020-06-16 2021-06-04 九圣禾种业股份有限公司 一种抗虫蛋白Cry1ABn39、编码基因和应用
CN114524867A (zh) * 2022-02-23 2022-05-24 沧州市农林科学院 一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白
CN114524867B (zh) * 2022-02-23 2023-06-06 沧州市农林科学院 一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白
WO2023216141A1 (zh) * 2022-05-11 2023-11-16 北京大北农生物技术有限公司 杀虫蛋白的用途
CN115851774A (zh) * 2022-09-01 2023-03-28 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用
CN115851774B (zh) * 2022-09-01 2024-01-23 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用
CN117025834A (zh) * 2023-10-10 2023-11-10 中国农业科学院作物科学研究所 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用
CN117025834B (zh) * 2023-10-10 2024-01-30 中国农业科学院作物科学研究所 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用

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