CN115851774B - 一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用。本发明通过对编码BT蛋白Vip3Aa7的原始核苷酸序列进行密码子优化，克服不同物种在密码子使用方面存在差异的问题，优化后的核苷酸序列更容易在作物中表达，提高BT蛋白Vip3Aa7在作物中的表达量，进而提高其对农作物害虫的抗性，尤其增强其对草地贪夜蛾的抗性，增加BT蛋白Vip3Aa7的生物用途。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用。
背景技术
草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，简称FAW)是对农作物危害较为严重的害虫之一，其入侵性强，破坏性大；隶属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)。目前，渐分化为两个不同的亚型，已有基因序列的分歧产生，其中一亚型主要以水稻为食，另一亚型则主要以玉米为食。草地贪夜蛾于2016年入侵非洲，造成玉米、甘蔗等作物减产20％～30％，严重受灾区甚至毁种绝收，单单对非洲玉米造成的损失达23.8～61.9亿美元。
为应对草地贪夜蛾，同时避免合成农药对环境的破坏，最佳选择是Bt(苏云金芽孢杆菌)。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白。目前广泛使用的Bt蛋白有两种，杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystalProtein，ICP)和营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein，Vip)。ICP又包括两种，晶体毒素(Crystal Protein，Cry)和细胞裂解素(Cytolitic，Cyt)。其中Cry与Vip对鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫具有杀虫活性，同时对人类和大部分昆虫天敌无毒害作用，因此更广泛的商业应用于转基因作物中。
然而，近年来相继报道一些草地贪夜蛾产生抗性而导致一些Bt玉米抗虫性丧失。例如：2003年注册的表达Cry1F蛋白的转基因玉米，仅到2006年就在波多黎各报告了Cry1F玉米的意外损伤。2008年巴西推出的Bt玉米，5年内就观察到该玉米对FAW的田间功效显著下降。这种抗性是ABCC2基因的功能丧失突变引起的隐性性状。昆虫应对Bt化合物尤其在中、低剂量下产生抗药性的显著能力，引起了人们对Bt转基因技术非系统性使用的担忧。因而，寻找对农作物害虫尤其对草地贪夜蛾具有抗性的Bt基因对于农作物害虫的生物防治来讲非常迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用，所述BT蛋白Vip3Aa7可以提高作物的抗虫性，尤其对草地贪夜蛾的抗性更强。
本发明提供了一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因，所述基因的核苷酸序列为如下1)～3)任一项所示的DNA分子：
1)由SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白的DNA分子。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括上述技术方案所述的基因。
优选的，用于构建所述重组表达载体的初始载体包括质粒载体。
优选的，所述质粒载体包括pBWA(V)HS。
本发明还提供了一种工程菌，包括上述技术方案所述的基因或所述的重组表达载体。
优选的，用于制备所述工程菌的原始菌株为农杆菌。
本发明还提供了一种细胞系，包括上述技术方案所述的基因或重组表达载体。
优选的，所述细胞系为单子叶植物细胞系。
本发明还提供了上述技术方案所述的基因、重组表达载体、工程菌或细胞系在下述a)～g)中任一项或多项中的应用：
a)防治农作物害虫；
b)防治灰翅夜蛾属害虫；
c)防治草地贪夜蛾；
d)提高作物抗虫性；
e)提高单子叶植物抗虫性；
f)制备抗虫转基因作物；
g)制备抗虫剂。
有益效果：
本发明提供了一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因，并具体公开其核苷酸序列。本发明通过对编码BT蛋白Vip3Aa7的原始核苷酸序列进行密码子优化，克服不同物种在密码子使用方面存在差异的问题，优化后的核苷酸序列更容易在作物中表达，提高BT蛋白Vip3Aa7在作物中的表达量，进而提高其对农作物害虫的抗性，尤其增强其对草地贪夜蛾的抗性，增加BT蛋白Vip3Aa7的生物用途。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为重组质粒pBWA(V)HS-Vip3Aa7的物理图谱；
图2为重组质粒pBWA(V)HS-Vip3Aa7酶切图；
图3为水稻愈伤的诱导结果；
图4～5为愈伤组织的筛选过程图；
图6为转基因水稻的分化结果图；
图7为转基因水稻的生根结果图；
图8为Vip3Aa7基因在转Vip3Aa7基因植株中的PCR检测结果；
图9为潮霉素基因在转Vip3Aa7基因植株中的PCR检测结果；
图10为3d后鄂中5号-Vip3A材料的叶片损害情况；
图11为不同抗性材料1d和3d的叶损情况对比。
具体实施方式
本发明提供了一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因，所述基因的核苷酸序列为如下1)～3)任一项所示的DNA分子：
1)由SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白的DNA分子。
本发明所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸具体为：5’-ATGCTCAAGCGCAAGATGAACATGAACAAGAACAACACCAAGCTCTCCACCCGCGCCCTCCCATCTTTCATTGACTACTTCAACGGCATCTACGGCTTCGCCACCGGCATTAAGGACATCATGAACATGATCTTCAAGACCGACACCGGCGGCGACCTCACACTCGATGAGATTCTCAAGAACCAGCAGCTGCTCAACGACATCTCCGGCAAGCTCGACGGCGTTAACGGCTCTCTCAACGACCTCATCGCCCAGGGCAACCTCAACACAGAGCTCTCAAAGGAGATCCTCAAGATCGCCAACGAGCAAAACCAAGTGCTCAACGACGTGAACAACAAGCTCGACGCGATCAACACCATGCTCCGCGTTTACCTCCCGAAGATCACCAGCATGCTCAGCGACGTCATGAAGCAGAATTACGCGCTCAGCCTCCAGATCGAGTATCTCTCCAAGCAACTCCAGGAGATCAGCGACAAGCTCGACATCATCAACGTGAACGTGCTCATCAACTCCACCCTCACCGAGATCACCCCAGCTTACCAACGCATCAAGTACGTCAACGAGAAGTTCGAGGAGCTCACCTTCGCCACCGAGACATCTTCCAAGGTCAAGAAGGACGGCAGCCCAGCTGACATCCTCGATGAGCTCACCGAGCTCACCGAGCTGGCTAAGTCTGTGACAAAGAATGACGTGGACGGCTTCGAGTTCTATCTCAACACCTTCCATGACGTGATGGTGGGCAACAACCTGTTCGGCAGGAGCGCTCTCAAGACCGCTTCTGAGCTCATCACCAAGGAGAACGTGAAGACATCCGGCTCCGAGGTGGGCAATGTGTACAACTTCCTGATTGTGCTGACAGCCCTCCAGGCCAAGGCTTTCCTCACACTCACCACATGCCGCAAGCTCCTCGGCCTCGCTGATATTGACTACACTTCCATTATGAACGAGCATCTCAACAAGGAGAAGGAGGAGTTCCGCGTCAACATCCTCCCGACTCTCTCCAACACCTTCTCCAACCCGAACTACGCGAAGGTGAAGGGCTCCGATGAGGACGCTAAGATGATTGTCGAGGCCAAGCCGGGCCACGCTCTCATCGGCTTCGAGATCTCTAACGACAGCATCACCGTGCTCAAGGTGTACGAGGCCAAGCTGAAGCAGAACTACCAGGTGGACAAGGACTCCCTGAGCGAGGTTATCTATGGCGATATGGACAAGCTCCTCTGCCCGGATCAATCCGAGCAAATTTACTACACCAACAACATCGTGTTCCCGAACGAGTACGTCATTACCAAGATTGACTTCACCAAGAAGATGAAGACACTCCGCTACGAGGTGACCGCCAACTTCTACGACAGCTCCACCGGCGAGATCGACCTCAATAAGAAGAAGGTGGAGTCCTCCGAGGCCGAGTACAGAACACTCTCCGCTAACGACGACGGCGTGTACATGCCACTCGGCGTTATCTCCGAGACCTTCCTCACCCCAATCAACGGCTTCGGCCTCCAAGCTGACGAGAACTCAAGGCTCATCACCCTCACCTGCAAGTCCTATCTCCGCGAGCTCCTCCTCGCTACAGACCTCTCTAACAAGGAGACCAAGCTCATCGTGCCGCCTTCCGGCTTCATCTCTAATATCGTCGAGAACGGCTCCATCGAGGAGGACAACCTCGAGCCATGGAAGGCTAACAACAAGAACGCCTACGTGGACCACACCGGCGGCGTTAACGGCACAAAGGCTCTCTACGTGCACAAGGACGGCGGCATTTCACAGTTCATCGGCGACAAGCTGAAGCCGAAGACCGAGTACGTGATCCAGTACACAGTTAAGGGCAAGCCGAGCATCCACCTCAAGGACGAGAACACCGGCTACATCCACTACGAGGACACCAACAACAACCTCGAGGACTACCAAACCATCAACAAGCGCTTCACCACCGGCACCGACCTCAAGGGCGTTTATCTCATCCTCAAGTCCCAAAACGGCGACGAGGCCTGGGGCGATAATTTCATCATCCTCGAGATCTCCCCGTCCGAGAAGCTCCTCTCTCCAGAGCTCATCAACACCAACAATTGGACCTCCACCGGCAGCACAAACATCTCTGGCAACACCCTCACCCTCTACCAGGGCGGCAGAGGCATCCTCAAGCAAAACCTCCAGCTCGACTCCTTCTCCACCTACAGAGTCTACTTCTCCGTCTCCGGCGACGCTAACGTGAGAATTAGAAACTCCCGCGAGGTCCTCTTCGAGAAGAGGTACATGTCCGGCGCCAAGGACGTTTCCGAGATGTTCACCACCAAGTTCGAGAAGGACAATTTCTATATCGAGCTCTCTCAGGGCAACAACCTCTATGGCGGCCCAATCGTGCACTTCTACGACGTTTCCATCAAGTGA-3’。本发明所述编码BT蛋白Vip3Aa7的基因序列优选通过对编码BT蛋白Vip3Aa7的原始序列进行密码子优化得到，所述编码BT蛋白Vip3Aa7的原始序列在NCBI中的登录号为AF373030。本发明通过对编码BT蛋白Vip3Aa7的原始序列进行优化，可以克服因不同物种间密码子偏好性不同而造成的BT蛋白Vip3Aa7在表达量差异的问题，为提高BT蛋白Vip3Aa7的编码基因在作物中的表达提供技术基础。
本发明所述基因编码的BT蛋白Vip3Aa7的氨基酸序列优选为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。本发明所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具体为：LKRKMNMNKNNTKLSTRALPSFIDYFNGIYGFATGIKDIMNMIFKTDTGGDLTLDEILKNQQLLNDISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVLNDVNNKLDAINTMLRVYLPKITSMLSDVMKQNYALSLQIEYLSKQLQEISDKLDIINVNVLINSTLTEITPAYQRIKYVNEKFEELTFATETSSKVKKDGSPADILDELTELTELAKSVTKNDVDGFEFYLNTFHDVMVGNNLFGRSALKTASELITKENVKTSGSEVGNVYNFLIVLTALQAKAFLTLTTCRKLLGLADIDYTSIMNEHLNKEKEEFRVNILPTLSNTFSNPNYAKVKGSDEDAKMIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLKVYEAKLKQNYQVDKDSLSEVIYGDMDKLLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITKIDFTKKMKTLRYEVTANFYDSSTGEIDLNKKKVESSEAEYRTLSANDDGVYMPLGVISETFLTPINGFGLQADENSRLITLTCKSYLRELLLATDLSNKETKLIVPPSGFISNIVENGSIEEDNLEPWKANNKNAYVDHTGGVNGTKALYVHKDGGISQFIGDKLKPKTEYVIQYTVKGKPSIHLKDENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINKRFTTGTDLKGVYLILKSQNGDEAWGDNFIILEISPSEKLLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLYQGGRGILKQNLQLDSFSTYRVYFSVSGDANVRIRNSREVLFEKRYMSGAKDVSEMFTTKFEKDNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK。本发明所述BT蛋白Vip3Aa7对农作物害虫，尤其对鳞翅目灰翅夜蛾属的草地贪夜蛾具有显著的杀伤效果，同时可以在农作物中稳定高效表达，可用于生产抗虫转基因作物及制备生物杀虫剂。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括上述技术方案所述的基因。本发明用于构建所述重组表达载体的初始载体优选包括质粒载体，进一步优选包括pBWA(V)HS。本发明所述重组表达载体优选通过将所述基因连接到初始载体中获得。本发明对所述连接方式没有特殊限定，采用本领域中常规连接方式即可，如点击法或基因枪法等。本发明对所述初始载体的来源没有特殊限定，本领域常规市售产品即可，如在本发明具体实施过程中，所述初始载体取自购买于武汉伯远生物科技有限公司的pHK-35S载体试剂盒。
本发明还提供了一种工程菌，包括上述技术方案所述的基因或所述的重组表达载体。本发明所述工程菌优选通过将上述技术方案所述的重组表达载体转入到原始菌种中获得。本发明用于制备所述工程菌的原始菌株优选为农杆菌，进一步优选为根癌农杆菌，更优选为根癌农杆菌EHA105。本发明对制备所述工程菌的方法没有特殊要求，采用本领域中常规制备方法即可。
本发明还提供了一种细胞系，包括上述技术方案所述的基因或重组表达载体。本发明所述细胞系优选为单子叶植物细胞系，进一步优选为禾本科植物细胞系，更进一步优选为水稻细胞系。本发明所述细胞系优选为宿主植物的细胞系。
本发明还提供了上述技术方案所述的基因、重组表达载体、工程菌或细胞系在下述a)～g)中任一项或多项中的应用：a)防治农作物害虫；b)防治灰翅夜蛾属害虫；c)防治草地贪夜蛾；d)提高作物抗虫性；e)提高单子叶植物抗虫性；f)制备抗虫转基因作物；g)制备抗虫剂。本发明所述单子叶植物优选包括水稻。本发明所述抗虫转基因作物优选为抗灰翅夜蛾属害虫转基因作物，更优选为抗草地贪夜蛾转基因作物。本发明所述抗虫剂优选包括抗灰翅夜蛾属害虫药剂，更优选为抗草地贪夜蛾药剂。本发明通过将编码所述BT蛋白Vip3Aa7的基因转入到宿主细胞中，提高宿主植物细胞中基因的表达量和BT蛋白Vip3Aa7的含量，提高宿主植物的抗虫性，减少农药的用量和环境污染。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
BT蛋白Vip3Aa7编码基因的密码子优化：
根据CUTG(Codon Usage Tabulated from GenBank)(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中水稻密码子使用频率表，针对Vip3Aa7基因编码区，在不改变原有氨基酸序列前提下进行密码子优化，同时综合真核生物中影响基因转录、翻译及mRNA稳定性等因素，去除编码区中的剪切信号以及常用的限制性酶切位点。经RNA二级结构分析，改掉存在二级结构臂或环上的错配碱基，优化的基因由武汉伯远生物科技有限公司合成。
实施例2
BT蛋白Vip3Aa7编码基因(SEQ ID NO.1)的克隆和重组表达载体的构建
(1)全基因合成DNA和引物设计
利用全基因合成Vip3Aa7编码基因的DNA，并设计引物Gname1如下：
Gname1(+)：5’-ATTTGGAGAGAACACGGGGGACTTTGCAACATGCTCAAGCGCAAGATGAACATG-3’(SEQ ID NO.3)；
Gname1(-)：5’-GGCCCAGTACTGAAGACAGAGCTAGTTACATCACTTGATGGAAACGTCGTAGAAG-3’(SEQ ID NO.4)。
(2)PCR扩增反应体系和扩增程序如下：
反应体系：Nuclease-free Water 20μL，Biorun Pfu PCR Mix 25μL，浓度为100μM的Primer(+)和Primer(-)各2μL，基因组DNA 1μL。
扩增程序：反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，50℃退火45sec，72℃延伸143sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
所获得PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶电泳的电压为5v/cm电压，跑胶时间为20min；将Gname1(2391bp)的电泳片段在紫外灯下切取出来，并按照碧云天DNA凝胶回收试剂盒(D0056)使用说明将切下来的胶进行回收，用总体积40μL的水溶解回收DNA(回收产物标记为rDNAG1)，检测无误后与载体进行重组。
(3)载体酶切
酶切连接体系和反应条件如下：
酶切反应体系：Nuclease-free Water 13μL，10×Buffer 2μL，BsaⅠ/Eco31Ⅰ1μL，pBWA(V)HS-ccdB 4μL，共20μL。酶切反应条件为：37℃孵育1h。
将得到的载体酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化(纯化产物标记为pBWA(V)HS-ccdB(D))，用于下一步的重组反应。酶切结果如图2所示，酶切条带为2691bp，2992bp，5324bp，DNA Marker(MRIV)：从上到下依次为6000bp，4000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
(4)重组反应
重组反应体系：Biorun 2×EasyClone Mix 10μL，rDNAG15μL，pBWA(V)HS-ccdB(D)5μL，共20μL。酶切反应条件为：37℃孵育30h。
将重组得到的连接产物转化感受态细胞。
(5)转化
将5～10μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(见大肠杆菌感受态转化标准方法)，转化涂有卡纳霉素抗性的平皿，37℃培养12h，进行菌斑PCR鉴定。
(6)菌斑PCR鉴定
挑取10个菌斑同时进行1.5mL EP管接菌和PCR鉴定，每个菌斑进行一次PCR反应。
pBWA(V)HS-ccdB鉴定引物：
鉴定引物组1：
HS)35seq：5’-TTCATTTGGAGAGAACACGGGGGAC-3’(SEQ ID NO.5)；
NOSseq-R：5’-CAAGACCGGCAACAGGATTCAATC-3’(SEQ ID NO.6)。
鉴定引物组2：
35seq(G)：5’-GGAGAGAACACGGGGGAC-3’(SEQ ID NO.7)；
Noseq(G)：5’-AGCTGGTCAGTCTTCGGG-3’(SEQ ID NO.8)。
PCR体系1)：Nuclease-free Water 9.5μL，Biorun Magic PCR Mix 12.5μL，浓度为100μM的HS)35seq，35seq(G)各1μL，基因组DNA 1μL，共25μL。
PCR体系2)：Nuclease-free Water 9.5μL，Biorun Magic PCR Mix 12.5μL，浓度为100μM的NOSseq-R，Noseq(G)各1μL，基因组DNA 1μL，共25μL。
PCR程序：反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，50℃退火45sec，72℃延伸143sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
将得到的扩增产物进行跑胶鉴定，目标条带为2491bp。取1～3个阳性条带对应的菌液，取100μL送样测序，其余400μL菌液接种到5～10mL含有卡纳霉素抗性的LB液体培养基中，摇菌，测序，对应测序正确的质粒为重组表达载体(重组质粒)，命名为pBWA(V)HS-Vip3Aa7，结果如图1所示，各功能元件的描述见表1。
表1 pBWA(V)HS-Vip3Aa7重组表达载体的功能元件信息
实施例3
BT蛋白Vip3Aa7编码基因(SEQ ID NO.1)遗传转化
(1)质粒转化
取1μL实施例2中制备的重组质粒加入50μLEHA105农杆菌感受态细胞中；充分混匀后吸取至电转杯中进行电转，电转后加1mL LB液体培养基，充分混匀后吸取至1.5mLEp管中，于摇床30℃、180rpm振荡培养30min，将活化好的农杆菌菌液吸取50μL接种于LB固体培养基上，30℃暗培养48h。
(2)农杆菌检测
以农杆菌菌液为模板对步骤(1)中得到的转化质粒进行PCR检测
检测引物如下：
上游引物F：5’-AAATCCGCGTGCACGAGGT-3’(SEQ ID NO.9)；
下游引物R：5’-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCA-3’(SEQ ID NO.10)。
PCR检测体系：2×Taq PCR Mix 10μL，ddH2O 7μL，模板1μL，浓度为100μM的上游引物F以及浓度为100μM的下游引物R各1μL，共20μL。
(3)水稻遗传转化
3.1诱导
挑选无霉斑、芽口正常的米粒(优质籼型常规水稻鄂中5号的米粒)，用75％酒精消毒1min，灭菌水清洗，1min/次；次氯酸钠消毒20min，灭菌水清洗3次，1min/次；消毒后的米粒接种于诱导培养基，26℃光照培养20天，得到愈伤组织。
3.2农杆菌侵染
挑取步骤(2)中的农杆菌于侵染液中，制备OD600＝0.2的农杆菌重悬液，挑取愈伤于三角瓶中，加入农杆菌重悬液，侵染10～15min后弃菌液，将愈伤组织接种于共培培养基，20℃共培养48-72h。
3.3愈伤筛选
将3.2中得到的愈伤接种于筛选培养基，26℃暗培养20～30天；将阳性愈伤挑至二筛选培养基，愈伤挑取过程务必挑取单克隆愈伤，26℃暗培养7～10天。
3.4分化及生根
将阳性愈伤接种至分化培养基，25～27℃光照培养15～20天，待分化出2～5cm的芽后接种至生根培养基，30℃光照培养7-10天。
3.5阳性苗检测
采用CTAB法提取水稻基因组DNA，进行PCR检测，检测方法同步骤(2)中的农杆菌菌检。
水稻遗传转化过程中所使用的诱导培养基、筛选培养基、二筛选培养基、分化培养基和生根培养基均购买于武汉伯远生物科技有限公司，产品货号为#RFB01。水稻遗传转化的过程如图3～7所示。
其中图3为水稻愈伤的诱导，图4～5为愈伤组织的筛选过程，图6为转基因水稻的分化结果，图7为转基因水稻的生根结果图。由于1/2MS生根培养基中加有潮霉素，因而，阳性愈伤和单克隆愈伤可以存活，不会褐化死亡，且单克隆愈伤为单独的组织，不会成团成堆，便于识别。
实施例4
转基因水稻对草地贪夜蛾的抗性鉴定
试验目的：利用草地贪夜蛾筛选鉴定实施例3中得到的21个优质籼型常规水稻鄂中5号转基因水稻(下称鄂中5号-Vip3水稻)的抗性。
试验材料：
草地贪夜蛾敏感品系：用人工饲料连续饲养多代(10代以上)的试验室品系未接触任何化学农药制剂或抗虫蛋白；
21个鄂中5号-Vip3A水稻材料、1个鄂中5号水稻材料、培养皿(d＝6cm)、滤纸。
试验方法：
(1)Vip3Aa7基因在转Vip3Aa7基因植株中的PCR检测
分别提取21个鄂中5号-Vip3A水稻材料，1个鄂中5号水稻材料(阴性对照)的基因组DNA，PCR扩增鉴定21个鄂中5号-Vip3A水稻材料，其中阳性对照为pBWA(V)HS-Vip3Aa7重组质粒，阴性对照为鄂中5号水稻材料。
Vip3Aa7基因鉴定引物(对Vip3Aa7基因第67bp-524bp区段设计引物)如下：
F：5’-CAAGCTCGACGCGATCAACAC-3’(SEQ ID NO.11)；
R：5’-TGGTGATGAGCTCAGAAGCG-3’(SEQ ID NO.12)。
反应体系如表2所示：
表2 PCR扩增反应体系
反应程序如表3所示：
表3 PCR扩增反应程序
扩增结果如图8所示，在图8中，Marker：分子量标准，从上到下依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp；1：阴性对照；2：阳性对照；3-23：转Vip3Aa7基因植株，目标条带大小458bp。由图8可以看出：21个鄂中5号-Vip3A水稻材料的鉴定结果与阳性对照保持一致，阴性对照中未有检测条带，说明Vip3Aa7基因在本发明21个鄂中5号-Vip3A水稻材料中成功表达。
(2)潮霉素基因在转Vip3Aa7基因植株中的PCR检测
参照步骤(1)中进行检测，阳性对照为：pBWA(V)HS-Vip3Aa7重组质粒。潮霉素基因鉴定引物如下：
F：5’-AAATCCGCGTGCACGAGGT-3’(SEQ ID NO.13)；
R：5’-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCA-3’(SEQ ID NO.14)。
扩增结果如图9所示，在图9中，Marker：分子量标准，从上到下依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp；1：阴性对照；2：阳性对照；3-23：转Vip3Aa7基因植株，目标条带大小417bp。由图9可以看出：21个鄂中5号-Vip3A水稻材料的鉴定结果与阳性对照保持一致，阴性对照中未有检测条带，说明重组质粒转入到了水稻样本。
(3)21个鄂中5号-Vip3A水稻对草地贪夜蛾的抗性鉴定
剪取水稻幼苗期最大叶片叶端部分，接着放入培养皿中，皿底铺上用无菌水润湿的滤纸保持高湿状态。每皿接入10头草地贪夜蛾的初孵幼虫(孵化2-12h)。在温度25±1℃、湿度50％、L：D＝14：10条件下培养，3天后统计草地贪夜蛾的存活情况及叶片受害等级。每个材料重复两次。
其中：草地贪夜蛾的平均死亡率＝单位时间死亡个体数/单位时间平均种群数量×1000‰；叶片受害等级标准如表4所示。
表4水稻叶片受草地贪夜蛾危害程度的分级标准
依据表5中的草地贪夜蛾的平均死亡率评价水稻材料的抗性：
表5转基因水稻材料抗虫性评价标准
| 抗虫性水平 | 草地贪夜蛾的平均死亡率y(％) |
| 高抗 | y≥90 |
| 抗 | 90＞y≥60 |
| 中抗 | 60＞y≥40 |
| 低抗 | 40＞y≥20 |
| 感 | 20＞y |
(4)试验结果
试验结果如表5和图10～11所示。其中在图10中A～U为1～21号鄂中5号-Vip3A水稻材料，V为鄂中5号阴性对照材料。图11为不同抗性材料1d和3d叶损情况对比，其中图上方的数字编号与表6中的编号相对应。
表6不同水稻材料对草地贪夜蛾的抗性表现
/>
由表6、图10～11可以看出：21个材料中，有18个材料对草地贪夜蛾表现出抗性，3个材料表现为感性。因植物材料有限，感性材料在培养3d后就已被试虫食尽。为了避免感性材料的试虫因饥饿或自相残杀等原因致死而导致试验数据不准确，所以在3d时对所有材料进行了统计。由结果可以看出，虽然没有100％的死亡率，但叶损等级都为1级。所以，综合判断这18个材料对草地贪夜蛾表现为中抗或者抗性。
由以上实施例可以得出，本发明提供的BT蛋白Vip3Aa7可以提高作物的抗虫性，尤其对草地贪夜蛾的抗性更强。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (7)
1.一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因在提高水稻抗虫性中的应用，所述基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示；
所述水稻抗虫性为水稻对草地贪夜蛾的抗性。
2.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述应用中的基因。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，用于构建所述重组表达载体的初始载体包括质粒载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述质粒载体包括pBWA（V）HS。
5.一种工程菌，其特征在于，包括权利要求1所述应用中的基因或权利要求2~4任一项所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，用于制备所述工程菌的原始菌株为农杆菌。
7.权利要求2~4任一项所述的重组表达载体、权利要求5或6所述的工程菌在提高水稻抗虫性中的应用；
所述水稻抗虫性为水稻对草地贪夜蛾的抗性。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: You Aiqing Inventor after: Yang Guocai Inventor after: Liu Kai Inventor after: Xu Huashan Inventor after: Li Peide Inventor after: Chen Junxiao Inventor after: Shi Shaojie Inventor after: Wu Bian Inventor after: Li Changyan Inventor after: Zha Wenjun Inventor after: Wang Kaimei Inventor after: Zhang Zhigang Inventor after: Wang Yueying Inventor after: Zhou Lei Inventor after: Li Sanhe Inventor after: Chen Zhijun Inventor before: Zha Wenjun Inventor before: Yang Guocai Inventor before: Liu Kai Inventor before: Xu Huashan Inventor before: Li Peide Inventor before: Chen Junxiao Inventor before: Shi Shaojie Inventor before: Wu Bian Inventor before: Li Changyan Inventor before: You Aiqing Inventor before: Wang Kaimei Inventor before: Zhang Zhigang Inventor before: Wang Yueying Inventor before: Zhou Lei Inventor before: Li Sanhe Inventor before: Chen Zhijun |