CN110903361B

CN110903361B - 一种植物抗虫基因mVip3Aa及其载体和应用

Info

Publication number: CN110903361B
Application number: CN201911346493.3A
Authority: CN
Inventors: 贾志伟; 李树秀; 李晓娇; 吕玉平; 李涛; 赵丽媛; 张原�; 王强; 刘枫
Original assignee: Longping Biotechnology Hainan Co ltd
Current assignee: Longping Biotechnology Hainan Co ltd
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN110903361A

Abstract

本申请公开了一种人工合成用于转基因抗虫植物的杀虫基因mVip3Aa以及用于植物抗虫的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO 3。本申请还公开了相应的载体，以及蛋白质、基因在抗虫害中的应用。本申请改造后的mVip3Aa基因转入植物后，所获得的高表达mVip3Aa蛋白的转基因植物显著消减了Vip3Aa基因高表达对于植物性状的负面影响，高质量转化子比率增加，花粉受影响较小，同时所获得的高表达mVip3Aa蛋白的转基因植物具有东方黏虫的抗性，较Vip3Aa抗性更好。

Description

一种植物抗虫基因mVip3Aa及其载体和应用

技术领域

本申请涉及基因工程生物防治技术领域，具体而言涉及人工改造的抗虫基因mVip3Aa、其表达载体及应用。

背景技术

生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降低或消灭害虫的目的，如用赤眼蜂或白僵菌防治草地螟。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制的目的；但是效果常不稳定，并且不论草地螟发生轻重均需同样投资进行。

为了解决农业防治、化学防治、物理防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。

Vip3A杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由蜡状芽孢杆菌产生的特异性蛋白质。Vip3A蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。已有的转基因植株证明转Vip3A基因的植株可以抵抗小地老虎、草地贪夜蛾、玉米夜蛾等鳞翅目(Lepidoptera)害虫的侵害。在申请号为201210528162.3和201610080690.5的中国专利申请中分别提供了一种将Vip3A的编码基因转入植株中以实现抗虫效果的技术方案，并且在201210528162.3中还对该基因进行了改造，以提升其杀虫效果。但是，上述的现有技术方案中Vip3Aa基因高表达会影响植物的农艺性状，造成Vip3Aa基因高表达的转基因植株矮小，发黄，甚至白化，花粉量减少等农艺性状，因此，需要对该基因进行合理的改造，以降低其负面效果。

发明内容

针对上述技术问题，本申请的目的在于提供一种的mVip3Aa基因，改造后的mVip3Aa基因转入植物后，所获得的高表达mVip3Aa蛋白的转基因植物农艺性状少，高质量转化子比率增加，花粉受影响较小。

本发明公开了，一种用于植物抗虫的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。本发明的mVip3Aa基因转入植物后，所获得的高表达mVip3Aa蛋白的转基因植物具有东方黏虫的抗性，较Vip3Aa抗性更好。并且，高表达mVip3Aa蛋白的转基因植物农艺性状少，高质量转化子比率增加，花粉受影响较小，有效解决了转入Vip3Aa基因后对植物的负面影响。

本发明还公开了编码上述植物抗虫蛋白质的抗虫基因，具体的，该抗虫基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明进一步提供了一种含有上述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明的另一方面提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含上述的抗虫基因。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的表达载体，中依次包含以下基因结构：

抗虫基因mVip3Aa；胭脂碱合成酶的终止子(Nos)；玉米泛素基因启动子(Ubi)；磷酸甘露糖异构酶基因(PAT)；自花椰菜花叶病毒(CaMV)的终止子(PAT)。

进一步地，本发明还提供了上述用于植物抗虫的蛋白质，或者，上述抗虫基因，或，含有上述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物抗虫中的应用，所述应用选自以下两者或两者之一：a)制备具有抗虫效果的药剂；b)培育具有或提高抗虫能力的转基因植物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述应用中防治的害虫选自甜菜夜蛾、斜纹夜蛾和东方黏虫中的一种或多种。

本发明还提供了一种培育具有或提升了抗虫能力的植物的方法，所述方法包括如下步骤：将上述抗虫基因导入受体植物中，得到转基因植物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述植物选自单子叶植物、双子叶植物、禾本科植物中的一种或多种；优选为玉米。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的改造后的mVip3Aa基因转入植物后，所获得的高表达mVip3Aa蛋白的转基因植物具有甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性，较Vip3Aa抗性更好。

附图说明

图1为本发明控制害虫的方法的含有mVip3Aa核苷酸序列的重组克隆载体LP03-T构建流程图；

图2为本发明控制害虫的方法的含有mVip3Aa核苷酸序列的重组表达载体LP-PT03构建流程图；

图3为本发明控制害虫的方法转化体的PCR检测图，其中WT为野生型植株，PC为质粒对照，NC为水对照，1～20为20个阳性转化体；

图4为本发明控制害虫的方法转化体的东方黏虫的抗虫效果展示图，其中WT为野生型植株，Vip3Aa20为转化了未经修饰的Vip3Aa转化事件，mVip3Aa为转化了经过修饰的Vip3Aa转化事件

图5为本发明的本发明控制害虫的方法转化体的T0苗的对比图。其中WT为野生型植株，Vip3Aa20为转化了未经修饰的Vip3Aa的种苗生长状态，mVip3Aa为转化了经过修饰的Vip3Aa的种苗生长状态。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例1 mVip3Aa基因的获得和合成

1、获得mVip3Aa核苷酸序列

mVip3Aa杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示；编码相应于所述mVip3Aa杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)的mVip3Aa核苷酸序列(2370个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:3所示。

Vip3Aa杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:2所示；编码相应于所述Vip3Aa杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)的Vip3Aa核苷酸序列(2370个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:4所示。

2、合成上述mVip3Aa核苷酸序列

所述mVip3Aa核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:3所示)和所述Vip3Aa核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:4所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述mVip3Aa核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述mVip3Aa核苷酸序列(SEQ IDNO:3)的3’端还连接有EcoRI酶切位点；合成的所述mVip3Aa核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述mVip3Aa核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的3’端还连接有EcoRI酶切位点。

实施例2载体构建

1.构建克隆载体

将合成的mVip3Aa核苷酸序列连入克隆载体pEASY-T5(Transgen，Beijing，China，CAT：CT501-01)上，操作步骤按Transgen公司产品pEASY-T5载体说明书进行，得到重组克隆载体LP01-T，其构建流程如图1所示(其中Kan表示卡那霉素抗性基因；Amp表示氨苄青霉素抗性基因；pUC origin表示质粒pUC的复制区序列，可引导双链DNA复制过程；LacZ为LacZ起始密码子；mVip3Aa为mVip3Aa核苷酸序列(SEQ ID NO:3))。

然后将重组克隆载体LP01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China；Cat.No：CD501)，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组克隆载体LP01-T)，42℃水浴30秒；37℃水浴45分钟(200rpm转速下摇床摇动)，涂布的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸钾，2M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用质量浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含Rnase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经NcoI和EcoRI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体LP01-T中插入的所述mVip3Aa核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即mVip3Aa核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体LP01-T的方法，将合成的所述Vip3Aa核苷酸序列连入克隆载体pEASY-T5上，得到重组克隆载体LP01CK-T，其中，Vip3Aa为Vip3Aa核苷酸序列(SEQID NO:4)。酶切和测序验证重组克隆载体LP01CK-T中所述Vip3Aa核苷酸序列正确插入。

2、构建含有mVip3Aa基因的重组表达载体

构建含有mVip3Aa基因的重组表达载体

用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别酶切重组克隆载体LP01-T和表达载体LP-BB1(载体骨架：pCAMBIA3301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的mVip3Aa核苷酸序列片段插到表达载体LP-BB1的NcoI和EcoRI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体LP-PT-03，其构建流程如图2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；mVip3Aa：mVip3Aa核苷酸序列(SEQ ID NO:3)；Nos：胭脂碱合成酶的终止子(SEQID NO:5)；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:6)；PAT：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:7)；35s：指来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的终止子(SEQ ID NO:8)；LB：左边界)。

将重组表达载体LP-PT-03用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组表达载体LP-PT-03)，42℃水浴30秒；37℃水浴1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体LP-PT-03在NcoI和EcoRI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQID NO:3所示核苷酸序列，即mVip3Aa核苷酸序列。

按照上述构建重组表达载体LP-PT03的方法，将NcoI和EcoRI酶切重组克隆载体LP02-T切下的所述Vip3Aa核苷酸序列插入表达载体LP-BB1，得到重组表达载体LP-PT03CK。酶切和测序验证重组表达载体LP-PT03CK在NcoI和EcoRI位点间即为所述Vip3Aa核苷酸序列。

实施例3重组表达载体转化农杆菌及检测

(一)重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体LP-PT-03和LP-PT-03CK用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶NotI和SalI对重组表达载体LP-PT03和LP-PT03CK酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体LP-PT-03和LP-PT03CK结构完全正确。

转化具体步骤如下：

1.玉米幼胚的准备

将公司内部玉米自交系AX808种植于大田或是温室，取人工授粉后8-10天(夏季)/10-13天(秋季)的玉米作为幼胚的来源。

2.农杆菌的准备

(1)取已转化鉴定好的农杆菌甘油菌在添加有100mg/L kan和12mg/L tet的YEP固体培养基上划线，28℃暗培养2-3天；

(2)在灭菌的2ml离心管中加入1ml侵染培养基，取步骤1的农杆菌放入侵染培养基中，并用移液枪充分打散混匀；

(3)另取一灭菌的2ml离心管，用侵染培养基调菌液浓度，使OD 660到0.5-0.7。

3.玉米幼胚与农杆菌的共培养

(1)除去装幼胚离心管中的侵染培养基，加入1.5ml新鲜侵染培养基将胚清洗一次；

(2)除去侵染培养基，加入调好的农杆菌菌液；

(3)最大转速震荡30s，室温放置5min；

(4)将胚倒到共培养基上，吸干液体；

(5)将胚平面朝上，盾面朝上放置；

(6)将胚放到22℃暗培养2-3天。

4.愈伤的诱导和筛选

(1)共培养后的胚转到诱导愈伤培养基上，28℃培养箱中暗培养7-10天；

(2)将诱导好的愈伤转到筛选培养基上进行筛选培养，筛选压为5.0mM草甘膦，28℃暗培养2-3周；

(3)取第一次筛选存活的愈伤进行第二次筛选，筛选压同为2.0mM；

5.转化株系的再生与培养

(1)取筛选后长出的胚性愈伤放到预分化培养基上，28℃暗培养10-14天；

(2)取胚性愈伤到分化培养基上，28℃光培养10-14天，直到幼苗分化出来；

(3)将分化好的幼苗转到生根培养基上，28℃光培养，直到根发育完全；

(4)将长势良好的幼苗移栽至温室基质内。

待转基因植株开花结实后收种。将收获的种子播种在温室，植株长到4-6叶期时，采用PCR技术进行表达分析检测。

(二)转基因玉米植株的检测

1、用全式金公司2×EasyTaq PCR SuperMix(China，Beijing，Cat:AS111-11)普通PCR验证转入mVip3Aa/Vip3Aa基因的玉米植株

PCR的引物是：

Vip3Aa-1788-F：GATCCAGTACACCGTGAAGG(SEQ ID NO:9)

Vip3Aa-2318-R：TGCCCTGGCTCAGCTCGAT(SEQ ID NO:10)

片段大小：531bp

PCR反应的条件是：30个循环，每个循环是95℃30’,58℃30’,72℃40’。

2、用qRT-PCR验证转入mVip3Aa基因的玉米植株

分别取转入mVip3Aa核苷酸序列的玉米植株和转入Vip3Aa-20核苷酸序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品，用Transgen的EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNaseA)(Transgen，Beijing，China，Cat:EE111-01)提取其基因组DNA，通过TransStart Green荧光定量PCR方法检测Vip3Aa基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测Vip3Aa基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入mVip3Aa和Vip3Aa20核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Transgen的EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNase A)(Transgen，Beijing，China，Cat:EE111-01)提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用TransStart Green荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物用来检测mVip3Aa和Vip3Aa20核苷酸序列：

引物1(CF2)：aacctgaacaccgagctgag如序列表中SEQ ID NO:11所示；

引物2(CR2)：ggtactcgatctgcaggctc如序列表中SEQ ID NO:12所示；

以下引物用来检测18s的核苷酸序列，用于内参调平

18srRNA-F：CCATCCCTCCGTAGTTAGCTTCT(SEQ ID NO:13)

18srRNA-R：CCTGTCGGCCAAGGCTATATAC(SEQ ID NO:14)

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

重复步骤2-3，40次

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

图3为PCR检测图，其中WT为野生型植株，PC为质粒对照，NC为水对照，1～20为20个阳性转化体。实验结果表明，mVip3Aa和Vip3Aa20核苷酸序列己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入mVip3Aa核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝mVip3Aa和Vip3Aa20基因的转基因玉米植株。

实施例4转基因玉米植株的杀虫蛋白质检测

1、转基因玉米植株的杀虫蛋白质(Vip3Aa蛋白)的含量检测

本实验中涉及的溶液如下：

萃取缓冲液：8g/L NaCl，0.2g/L KH₂PO₄，2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/L KCl，5.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

洗涤缓冲液PBST：8g/L NaCl，0.2g/L KH₂PO₄，2.9g/L Na₂HPO₄·12H2O，0.2g/LKCl，0.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

终止液：1M HCl。

分别取3mg转入mVip3Aa核苷酸序列的玉米植株和转入Vip3Aa-20核苷酸序列的玉米植株的新鲜叶片作为样品，液氮研磨后加入800μl所述萃取缓冲液，4000rpm的转速下离心10min，取上清液用所述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。用ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(ENVIRLOGIX公司，Vip3A试剂盒)对样品中杀虫蛋白质(Vip3Aa蛋白)量占叶片鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明书。

同时以野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。转入mVip3Aa核苷酸序列的共3个株系(3V1、3V2和3V3)，转入Vip3Aa20核苷酸序列的共3个株系(3V4、3V5和3V6)，经荧光定量PCR鉴定为非转基因的(NGM)共1个株系，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选3进行测试，每株重复6次。

转基因玉米植株的杀虫蛋白质(Vip3Aa蛋白)含量的实验结果如表1所示。分别测得转入mVip3Aa核苷酸序列的玉米植株和转入Vip3Aa20核苷酸序列的玉米植株的新鲜叶片中杀虫蛋白(Vip3Aa蛋白)平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)分别为3118.9和3045.7，这一结果表明Vip3Aa蛋白在玉米中均获得了较高的表达量和稳定性。

表1、转基因玉米植株的Vip3Aa蛋白表达量测定平均结果

mVip3Aa蛋白的体外表达及纯化的步骤具体如下：

1、人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子

2、将步骤1合成的双链DNA分子与原核表达载体pEASY-E1连接，得到重组质粒pEASY-mVip3Aa。对重组质粒pEASY-mVip3Aa进行测序。测序结果表明，重组质粒pEASY-mVip3Aa中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的mVip3Aa蛋白。

3、将重组质粒pEASY-mVip3Aa导入大肠杆菌transetta，得到重组菌，将该重组菌命名为transetta-mVip3Aa。

4、取transetta－mVip3Aa的单克隆，接种至100mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄霉素)，37℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液。

5、取培养菌液，按体积比为1:100接种至50mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm值为0.6，然后加入IPTG并使其浓度为1mM，28℃、220rpm振荡培养4h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体沉淀。

6、取菌体沉淀，加入100mL pH 8.0、100mM的Tris-HCl缓冲液，重悬后超声破碎(超声波功率600W，循环程序为：破碎4s，停6s，共20min)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液甲。

7、取上清液甲，4℃、12000rpm离心10min，收集上清液乙。

8、采用GE公司生产的镍柱对上清液乙进行纯化(纯化的具体步骤参考镍柱的说明书)，然后采用赛默飞世尔公司生产的蛋白定量试剂盒对mVip3Aa蛋白进行定量。

按照上述方法，将步骤1中“人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子”替换为“人工合成序列表中序列3所示的双链DNA分子”，其它步骤均不变，得到Vip3Aa蛋白。

得到的mVip3Aa蛋白进行东方黏虫抗性生测，结果如表2所示：

实施例5转基因玉米植株的抗虫效果检测

将转入mVip3Aa、Vip3Aa20核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经PCR鉴定为非转基因的玉米植株对东方黏虫进行抗虫效果检测。

分别取转入mVip3Aa和Vip3Aa20核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经PCR鉴定为非转基因的玉米植株(V3-V4期)的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用滤纸将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约1cm×4cm的长条状，取2片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的甜菜夜蛾和斜纹夜蛾(初孵幼虫)，虫试培养皿加盖后，在温度22-26℃、相对湿度70％-80％、光周期(光/暗)16：8的条件下放置3天后，统计死亡率。转入mVip3Aa核苷酸序列的共3个株系(3V1、3V2和3V3)，转入Vip3Aa20核苷酸序列的共3个株系(3V4、3V5和3V6)经PCR鉴定为非转基因的(NGM)共1个株系，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。结果如表2、表3和图4所示。

实施例6 T0、T1转基因玉米植株的农艺性状观察

1、T0转基因植株转经转基因检测后移栽到大盆后，对T0苗进行全生育期农艺性状观察，观察性状：叶色、株高，雌雄穗发育，正常植株叶片浓绿，株高正常为1.1m左右，畸形苗叶色发黄，严重的发白，株高20-30cm

2、T1转化事件的种子大田播种，每个转化事件一行，3米行长，30粒/行，除草剂喷施去除阴性苗，观察阳性苗的农艺性状：叶色、株高，雌雄穗发育，正常植株叶片浓绿，株高正常为1.6m左右，畸形苗叶色发黄，严重的发白，株高40-50cm

实施例7转基因玉米植株的花粉偏分离实验

1.T0检测为单拷贝的转化事件作为母本，野生型植株作为父本，获得T1转基因种子

2、8个单拷贝的T1杂合转化事件喷施草铵膦除草剂，得到阳性转化事件

3、阳性转化事件作为父本，野生型材料作为母本授粉，获得T2种子

4、T2转基因种子各播种500粒，种子萌发后统计萌发率，V2-V3喷施草铵膦除草剂，统计除草剂阳性和阴性比。

技术效果

图4为本发明控制害虫的方法转化体的东方黏虫，其中WT为野生型植株，Vip3Aa为转化了未经修饰的Vip3Aa转化事件，mVip3Aa为转化了经过修饰的Vip3Aa转化事件。如图4、表2和表3所示，改造Vip3Aa基因转入植物后，所获得的高表达mVip3Aa蛋白的转基因植物具有东方黏虫的抗性，较Vip3Aa抗性更好，在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗虫效果上没有明显差异。图5T0为本发明控制害虫的方法转化体的T0苗生长状态的照片，其中，Vip3Aa20为转化了未经修饰的Vip3Aa的种苗生长状态，mVip3Aa为转化了经过修饰的Vip3Aa的种苗生长状态。如图5、表4、表5和表6所示的，改造Vip3Aa基因转入植物后，所获得的高表达Vip3Aa蛋白的转基因植物农艺性状少，高质量转化子比率增加，花粉受影响较小。

表2

表3东方黏虫离体叶片抗虫生测实验数据

	Vip3Aa20	mVip3Aa
			接虫数	180	180
3d致死率	52％±7％a	81％±9％b
			4d致死率	71％±8％a	94％±4％b

表4 T0苗表型观察

	Vip3Aa20	mVip3Aa
			转化事件数	93	98
畸形苗数	53	20
			畸形苗转化事件比率	57％	20％

表5 T1苗表型观察

	Vip3Aa20	mVip3Aa
			转化事件数	30	30
畸形转化事件数	20	5
			畸形转化事件比率	67％	17％

表6花粉偏分离实验

注：如果基因不影响花粉发育，正常分离比为1：1，Vip3Aa20基因影响花粉发育，改造后的基因对花粉的影响大大降低

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

<110> 隆平生物技术（海南）有限公司

<120> 一种植物抗虫基因mVip3Aa及其载体和应用

<130> 201904

<141> 2019-12-24

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Leu Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

675 680 685

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

705 710 715 720

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

740 745 750

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu

755 760 765

Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

770 775 780

Asp Val Ser Ile Lys

785

<210> 2

<211> 789

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 2

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Ile Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

675 680 685

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

705 710 715 720

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

740 745 750

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu

755 760 765

Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

770 775 780

Asp Val Ser Ile Lys

785

<210> 3

<211> 2370

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgaacatga acaacaccaa gctgaacgcc cgcgccctgc cgagcttcat cgactacttc 60

aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120

gacaccggcg gcgacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgac 180

atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240

ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctt aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300

aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcgcgtgta cctgccgaag 360

atcaccagca tgctgagcga cgtgctcaag cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag 420

tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480

ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540

gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600

agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggcgaa gagcgtgacc 660

aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720

aacaacctgt tcggccgcag cgccctgaag accgccagcg agctgatcac caaggagaac 780

gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840

ctgcaggcca aggccttcct gaccctgacc acctgtcgca agctgctggg cctggccgac 900

atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960

aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020

agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc 1080

gagatcagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 1140

taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgctg 1200

tgtccggacc agagcgagca aatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 1260

gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgcgctacga ggtgaccgcc 1320

aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc 1380

gaggccgagt accgcaccct gagcgcgaac gacgacggcg tctacatgcc actgggcgtg 1440

atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggctttggcc tgcaggccga cgagaacagc 1500

cgcctgatca ccctgacctg taagagctac ctgcgcgagc tgctgctagc caccgacctg 1560

agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 1620

aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680

gtcgaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctgt acgtgcacaa ggacggcggc 1740

atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800

gtgaagggca agccatcgat tcacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860

gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920

gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980

aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040

accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 2100

cagggcggcc gcggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctaccgc 2160

gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg 2220

ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 2280

gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 2340

gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag 2370

<210> 4

<211> 2370

<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 4

atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc cgcgccctgc cgagcttcat cgactacttc 60

aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120

gacaccggcg gcgacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgac 180

atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240

ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctt aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300

aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcgcgtgta cctgccgaag 360

atcaccagca tgctgagcga cgtgattaag cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag 420

tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480

ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540

gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600

agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggcgaa gagcgtgacc 660

aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720

aacaacctgt tcggccgcag cgccctgaag accgccagcg agctgatcac caaggagaac 780

gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840

ctgcaggccc aggccttcct gaccctgacc acctgtcgca agctgctggg cctggccgac 900

atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960

aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020

agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc 1080

gagatcagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 1140

taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgctg 1200

tgtccggacc agagcgagca aatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 1260

gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgcgctacga ggtgaccgcc 1320

aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc 1380

gaggccgagt accgcaccct gagcgcgaac gacgacggcg tctacatgcc actgggcgtg 1440

atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggctttggcc tgcaggccga cgagaacagc 1500

cgcctgatca ccctgacctg taagagctac ctgcgcgagc tgctgctagc caccgacctg 1560

agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 1620

aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680

gtcgaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctgt acgtgcacaa ggacggcggc 1740

atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800

gtgaagggca agccatcgat tcacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860

gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920

gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980

aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040

accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 2100

cagggcggcc gcggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctaccgc 2160

gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg 2220

ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 2280

gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 2340

gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag 2370

<210> 5

<211> 253

<212> DNA

<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 5

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 6

<211> 1993

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 6

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtgcatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagatttctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttacttctg cag 1993

<210> 7

<211> 552

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 7

atgtctccgg agaggagacc agttgagatt aggccagcta cagcagctga tatggccgcg 60

gtttgtgata tcgttaacca ttacattgag acgtctacag tgaactttag gacagagcca 120

caaacaccac aagagtggat tgatgatcta gagaggttgc aagatagata cccttggttg 180

gttgctgagg ttgagggtgt tgtggctggt attgcttacg ctgggccctg gaaggctagg 240

aacgcttacg attggacagt tgagagtact gtttacgtgt cacataggca tcaaaggttg 300

ggcctaggat ccacattgta cacacatttg cttaagtcta tggaggcgca aggttttaag 360

tctgtggttg ctgttatagg ccttccaaac gatccatctg ttaggttgca tgaggctttg 420

ggatacacag cccggggtac attgcgcgca gctggataca agcatggtgg atggcatgat 480

gttggttttt ggcaaaggga ttttgagttg ccagctcctc caaggccagt taggccagtt 540

acccagatct ga 552

<210> 8

<211> 195

<212> DNA

<213> CaMV

<400> 8

ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctct ataataatgt gtgagtagtt 60

cccagataag ggaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa 120

cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 180

accaaaatcc agtgg 195

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

Claims

1.一种用于植物抗虫的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种抗虫基因，其特征于，所述抗虫基因包含编码如权利要求1所述的蛋白质的基因序列。

3.如权利要求2所述的抗虫基因，其特征在于，所述抗虫基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:3。

4.一种含有如权利要求2或3所述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求2所述的抗虫基因。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中依次包含以下基因结构：

如权利要求2或3所述的抗虫基因；胭脂碱合成酶的终止子；玉米泛素基因启动子；磷酸甘露糖异构酶基因；自花椰菜花叶病毒的终止子。

7.如权利要求1所述的用于植物抗虫的蛋白质或权利要求2或3所述的抗虫基因或含有权利要求2或3所述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物抗虫中的应用，其特征在于，所述应用为：a)制备具有抗虫效果的药剂；b)培育具有或提高抗虫能力的转基因植物；所述应用中防治的害虫选自甜菜夜蛾、斜纹夜蛾和东方黏虫中的一种或多种。

8.一种培育具有或提升了抗虫能力的植物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求2或3所述抗虫基因导入受体植物中，得到转基因植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物选自单子叶植物或双子叶植物。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述植物为玉米。