CN114507673A

CN114507673A - 一种抑制或杀灭小地老虎的方法及应用

Info

Publication number: CN114507673A
Application number: CN202210066538.7A
Authority: CN
Inventors: 马小伟; 王强; 梅方明; 李晓娇; 吕玉平; 贾志伟; 刘华容; 赵晓娜; 易金麒; 王杰
Original assignee: Longping Biotechnology Hainan Co ltd
Current assignee: Longping Biotechnology Hainan Co ltd
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2022-05-17

Abstract

本申请公开了一种抑制或杀灭小地老虎的方法，所述方法包括：(1)提供基因组插入编码SEQ ID NO:2所示Cry1B.868蛋白的基因的植物，所述植物表达Cry1B.868蛋白，产生小地老虎抗性；(2)所述植物与小地老虎接触，抑制或杀灭所述小地老虎。本发明的方法对小地老虎的致死率可达56％‑64％。

Description

一种抑制或杀灭小地老虎的方法及应用

技术领域

本申请涉及基因工程生物防治技术领域，具体而言涉及一种抑制或杀灭小地老虎的方法及应用。

背景技术

目前，农业生产上面临的生物胁迫(如病害和虫害等)和非生物胁迫(如旱害、寒害和盐害等)造成农作物生长势减弱，产量降低，给全球粮食安全造成巨大威胁。其中，虫害是影响农林生产力的主要生物胁迫因素之一。随着使用化学农药进行害虫防治造成的环境问题愈发严重，生物杀虫剂的使用逐渐进入人们的视野。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，能够产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins，ICPs)和营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins，Vips)等不同类型的杀虫蛋白。其中，Cry蛋白是在芽胞形成期于芽胞内形成的一类杀虫晶体蛋白，对大多数鳞翅目害虫具有良好抗性。

在中国专利CN201980049875.1中证明Cry1B.868和Cry1Da_7基因共表达可表现出对鳞翅目害虫秋夜蛾、玉米穗蛾、西南玉米蛀虫和甘蔗蛀虫的抗性。然而，目前还未见通过表达Cry1B.868蛋白的转基因植株控制小地老虎害虫的相关报道。因此，需要对Cry1B.868基因的功能进一步验证，以此能够更好地应用于抗虫转基因作物的开发利用，从而提升作物的产量和品质。

发明内容

针对上述技术问题，本申请的目的在于提供一种抑制或杀灭小地老虎的方法，所述方法包括：(1)提供基因组插入编码SEQ ID NO:2所示Cry1B.868蛋白的基因的植物，所述植物表达Cry1B.868蛋白，产生小地老虎抗性；(2)所述植物与小地老虎接触，抑制或杀灭所述小地老虎。

在一些具体实施方式中，所述表达Cry1B.868蛋白的基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。

在一些具体实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

在一些具体实施方式中，所述表达Cry1B.868蛋白的基因以单拷贝插入所述植物的基因组。

在一些具体实施方式中，所述小地老虎的致死率为50％以上。

在一些具体实施方式中，所述小地老虎的致死率为56％-64％。

作为发明的另一个方面，提供一种检测植物基因组是否插入Cry1B.868基因的方法，取植物样本的基因组DNA进行PCR反应，根据PCR结果判断植物样本基因组DNA是否插入Cry1B.868基因；其中PCR反应使用具有如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的引物对，或使用如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的引物对和SEQ ID NO:11所示的探针。

在一些具体实施方式中，所述Cry1B.868基因表达如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。

在一些具体实施方式中，所述Cry1B.868基因具有如SEQ IDNO:1所示核苷酸序列。

将Cry1B.868基因插入植物(玉米)基因组DNA后，Cry1B.868转基因植物(玉米)显示小地老虎性，并且在转基因植物(玉米)表达量较低(以单拷贝插入Cry1B.868基因，Cry1B.868蛋白表达量在3μg/g样品)的情况下，仍具有优良的抗小地老虎特性。

附图说明

图1为本发明控制害虫的方法的含有Cry1B.868核苷酸序列的重组克隆载体LP19-T构建流程图；

图2为本发明控制害虫的方法的含有Cry1B.868核苷酸序列的重组表达载体LP-PT19构建流程图；

图3为本发明控制害虫的方法的转基因玉米植株接种小地老虎的叶片损伤图，其中WT为野生型植株，NGM为经PCR检测为非转基因的玉米植株，Cry1B.868为转基因玉米植株。

具体实施方式

实施例1、Cry1B.868基因的获得和合成

1、获得Cry1B.868核苷酸序列

Cry1B.868杀虫蛋白质的氨基酸序列(1199个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:1；所述Cry1B.868杀虫蛋白质的编码基因的核苷酸序列(3600个核苷酸)，如序列表中SEQ IDNO:2所示。

2、合成上述Cry1B.868核苷酸序列

所述Cry1B.868核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:2所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述Cry1B.868核苷酸序列(SEQ ID NO:2)的5’端连接有NcoI酶切位点，3’端连接有EcoRI酶切位点。

实施例2、载体构建

1、构建克隆载体

将合成的Cry1B.868核苷酸序列分别连入克隆载体pEASY-T5(Transgen，Beijing，China，CAT：CT501-01)上，操作步骤按Transgen公司产品pEASY-T5载体说明书进行，得到重组克隆载体LP19-T，其构建流程如图1所示(其中Kan表示卡那霉素抗性基因；Amp表示氨苄青霉素抗性基因；pUC origin表示质粒pUC的复制区序列，可引导双链DNA复制过程；LacZ为LacZ起始密码子；Cry1B.868为Cry1B.868的核苷酸序列(SEQ ID NO:2))。

然后将重组克隆载体LP19-T用热激法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China；Cat.No：CD501)。其转化过程为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞和10μl质粒DNA(重组克隆载体LP19-T)混合后42℃水浴30s，37℃水浴45min，转化后在200rpm摇床上摇动1h，随后涂布在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于37℃条件的摇床上培养过夜。利用碱法提取质粒，具体步骤为：将菌液12000rpm离心1min，弃上清液，沉淀菌体用100μl提前用冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH调至8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将离心管上下颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸钾，2M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用质量浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含Rnase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH调至8.0)溶解沉淀；37℃下水浴30min，消化RNA；最后保存在-20℃冰箱中备用。

提取的质粒经NcoI和EcoRI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体LP19-T中插入的所述Cry1B.868核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，即Cry1B.868核苷酸序列正确插入。

2、构建含有Cry1B.868基因的重组表达载体

用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别酶切重组克隆载体LP19-T和表达载体LP-BB1(载体骨架：pCAMBIA3301(CAMBIA机构提供))，将切下的Cry1B.868核苷酸序列片段插入到表达载体LP-BB1的NcoI和EcoRI位点之间，构建成重组表达载体LP-PT19，其构建流程如图2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Cry1B.868：Cry1B.868核苷酸序列(SEQ ID NO:2)；Nos：胭脂碱合成酶的终止子(SEQ ID NO:3)；PAT：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:4)；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:5)；35S：指来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的终止子(SEQ ID NO:6)；LB：左边界)。

将重组表达载体LP-PT19用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞。其转化过程为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞和10μl质粒DNA(重组表达载体LP-PT19)混合后42℃水浴30s，37℃水浴45min，转化后在200rpm摇床上摇动1h，随后涂布在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于37℃摇床上培养过夜。碱法提取其质粒，提取方法同上。将提取的质粒用限制性内切酶NcoI和EcoRI进行酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序，结果表明重组表达载体LP-PT19在NcoI和EcoRI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO:2所示核苷酸序列，即Cry1B.868核苷酸序列。

实施例3重组表达载体转化农杆菌及检测

(一)重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体LP-PT19用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404和3μL质粒DNA(重组表达载体)置于液氮中冷冻10min，37℃水浴10min；将转化后的农杆菌LBA4404接种于装有LB液体培养基的离心管中于置于28℃、200rpm条件的摇床上培养2h，涂布于含50mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体培养基上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶NotI和SalI对重组表达载体LP-PT19酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体LP-PT19结构完全正确。

转化具体步骤如下：

1.玉米幼胚的准备

将玉米自交系AX808种植于大田或温室中，取人工授粉后8-10天(夏季)/10-13天(秋季)的玉米作为幼胚来源。

2.农杆菌的准备

(1)取已转化鉴定好的甘油农杆菌在含有100mg/L kan和12mg/L tet的YEP固体培养基上划线后于28℃暗培养2-3天；

(2)在灭菌的2ml离心管中加入1ml侵染培养基，取步骤1的农杆菌放入侵染培养基中，并用移液枪充分吹打混匀；

(3)另取一灭菌的2ml离心管，用侵染培养基调菌液浓度，使OD 660达到0.5-0.7。

3.玉米幼胚与农杆菌的共培养

(1)除去装幼胚离心管中的侵染培养基，加入1.5ml新鲜侵染培养基将胚清洗一次；

(2)除去侵染培养基，加入调好的农杆菌菌液；

(3)置于摇床最大转速震荡30s，室温放置5min；

(4)将胚倒到共培养基上，吸干液体；

(5)将胚平面朝上，盾面朝下放置；

(6)将胚放到22℃暗培养2-3天。

4.愈伤的诱导和筛选

(1)共培养后的胚转到诱导愈伤培养基上，28℃培养箱中暗培养7-10天；

(2)将诱导好的愈伤转到筛选培养基上进行筛选培养，筛选压为5.0mM草甘膦，28℃暗培养2-3周；

(3)取第一次筛选存活的愈伤进行第二次筛选，筛选压为2.0mM草甘膦。

5.转化株系的再生与培养

(1)取筛选后长出的胚性愈伤放到预分化培养基上，28℃暗培养10-14天；

(2)取胚性愈伤到分化培养基上，28℃光培养10-14天，直到幼苗分化出来；

(3)将分化好的幼苗转到生根培养基上，28℃光培养，直到根发育完全；

(4)将长势良好的幼苗移栽至温室基质内生长。

待转基因植株开花结实后收种。将收获的种子播种在温室，植株长到4-6叶期时，采用PCR技术进行表达分析检测。

(一)转基因玉米的检测

1、用全式金公司2×EasyTaq PCR SuperMix(China，Beijing，Cat:AS111-11)普通PCR验证转入Cry1B.868基因的玉米植株。

PCR检测所用引物为：

引物1(CF1):atccagcgttactacgagcg(SEQ ID NO:7)

引物2(CR1):ggatgttaatgcccgcgaac(SEQ ID NO:8)

片段大小：580bp

PCR反应的条件：95℃30s,58℃30s,72℃40s，循环30次。

2、用qRT-PCR验证转入Cry1B.868基因的玉米植株

检测Cry1B.868基因拷贝数的具体方法如下：

(1)分别取转入Cry1B.868核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

(2)使用EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNase A)(Transgen，Beijing，China，Cat:EE111-01)提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

(3)用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,USA)测定上述样品的基因组DNA浓度；

(4)调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

(5)采用TransStart Green荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品。同时以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值。

以下引物用来检测Cry1B.868核苷酸序列：

引物3(CF2)：gctacagggcctgggaaac(SEQ ID NO:9)；

引物4(CR2)：gtcatccctgttctccaacca(SEQ ID NO:10)；

探针1(CP1)：cctttcgggcataccagcagtcactg(SEQ ID NO:11)。

以下引物用来检测18S的核苷酸序列，用于内参调平。

引物5(CF3)：ggatcagcgggtgttactaatagg(SEQ ID NO:12)；

引物6(CR3)：ccccggaacccaaagact(SEQ ID NO:13)；

探针2(CP2):ccccgctggcaccttatgagaaatc(SEQ ID NO:14)。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

重复步骤2-3,40次。

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

实验结果表明，Cry1B.868核苷酸序列己整合到所检测的玉米植株染色体组中，而且转入Cry1B.868核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝Cry1B.868基因的转基因玉米植株。

实施例4、转基因玉米植株的杀虫蛋白质检测

1、转基因玉米植株的杀虫蛋白质含量检测

本实验中涉及的溶液如下：

萃取缓冲液：8g/L NaCl，0.2g/L KH₂PO₄，2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/L KCl，5.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

洗涤缓冲液PBST：8g/L NaCl，0.2g/L KH₂PO₄，2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/LKCl，0.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

终止液：1M HCl。

取3mg转入Cry1B.868核苷酸序列的玉米植株的新鲜叶片作为样品，液氮研磨后加入800μl所述萃取缓冲液，4000rpm离心10min，取上清液用所述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。用ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(ENVIRLOGIX公司)对样品中杀虫蛋白质(Cry1B.868蛋白)量占叶片鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考产品说明书。

同时以野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。转入Cry1B.868核苷酸序列的共3个株系(S1、S2和S3)，经荧光定量PCR鉴定为非转基因的(NGM)共1个株系，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。

转基因玉米植株的杀虫蛋白质(Cry1B.868蛋白)含量测定结果如表1所示。测得转入Cry1B.868核苷酸序列的玉米植株的新鲜叶片中杀虫蛋白(Cry1B.868蛋白)的平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)为3136.9，这一结果表明Cry1B.868蛋白在转基因玉米植株中均获得了较高的表达量和稳定性。

表1、待测玉米植株的Cry1B.868蛋白表达量测定结果

实施例5、转基因玉米植株的抗虫效果检测

将转入Cry1B.868核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经PCR鉴定为非转基因的玉米植株对小地老虎进行抗虫效果检测，具体步骤如下：

分别取转入Cry1B.868核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经PCR鉴定为非转基因的玉米植株(V3-V4期)的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用滤纸将叶片上的水吸干，然后去除叶脉，剪成约3cm×1cm的长条状，取2片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的小地老虎(初孵幼虫)，虫试培养皿加盖后，在温度22-26℃、相对湿度70％-80％、光周期16h光照/8h黑暗的条件下放置3天后，统计死亡率。结果如表2和图3所示，转入Cry1B.868核苷酸序列的玉米转基因株系对小地老虎具有良好抗性。

表2玉米离体叶片抗虫生测结果

	WT	NGM	Cry1B.868
				接虫数	50	50	50
3d死亡率	14％±5％a	20％±7％a	56％±9％b
				4d死亡率	16％±5％a	26％±5％a	64％±9％b

抗虫生测结果表明转基因玉米植株所获得的高表达Cry1B.868蛋白对小地老虎具有良好抗性，较对照和非转基因玉米效果显著。

序列表

<110> 隆平生物技术（海南）有限公司

<120> 一种抑制或杀灭小地老虎的方法及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1199

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Ser Asn Arg Lys Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn Ala Leu Ser

1 5 10 15

Ile Pro Ala Val Ser Asn His Ser Ala Gln Met Asn Leu Ser Thr Asp

20 25 30

Ala Arg Ile Glu Asp Ser Leu Cys Ile Ala Glu Gly Asn Asn Ile Asp

35 40 45

Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr Val Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ala Gly

50 55 60

Arg Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Ile Ala Ser

65 70 75 80

Phe Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Leu Trp Pro Arg Gly Arg Asp Pro

85 90 95

Trp Glu Ile Phe Leu Glu His Val Glu Gln Leu Ile Arg Gln Gln Val

100 105 110

Thr Glu Asn Thr Arg Asp Thr Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly

115 120 125

Asn Ser Phe Arg Ala Tyr Gln Gln Ser Leu Glu Asp Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Arg Asp Asp Ala Arg Thr Arg Ser Val Leu Tyr Thr Gln Tyr Ile Ala

145 150 155 160

Leu Glu Leu Asp Phe Leu Asn Ala Met Pro Leu Phe Ala Ile Arg Asn

165 170 175

Gln Glu Val Pro Leu Leu Met Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His

180 185 190

Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Leu Phe Gly Ser Glu Phe Gly Leu

195 200 205

Thr Ser Gln Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Glu Arg Gln Val Glu Lys Thr

210 215 220

Arg Glu Tyr Ser Asp Tyr Cys Ala Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asn

225 230 235 240

Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Leu Arg Tyr Asn Gln Phe

245 250 255

Arg Arg Asp Leu Thr Leu Gly Val Leu Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro

260 265 270

Ser Tyr Asp Thr Arg Val Tyr Pro Met Asn Thr Ser Ala Gln Leu Thr

275 280 285

Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Arg Thr Asn Ala Pro Ser Gly

290 295 300

Phe Ala Ser Thr Asn Trp Phe Asn Asn Asn Ala Pro Ser Phe Ser Ala

305 310 315 320

Ile Glu Ala Ala Val Ile Arg Pro Pro His Leu Leu Asp Phe Pro Glu

325 330 335

Gln Leu Thr Ile Phe Ser Val Leu Ser Arg Trp Ser Asn Thr Gln Tyr

340 345 350

Met Asn Tyr Trp Val Gly His Arg Leu Glu Ser Arg Thr Ile Arg Gly

355 360 365

Ser Leu Ser Thr Ser Thr His Gly Asn Thr Asn Thr Ser Ile Asn Pro

370 375 380

Val Thr Leu Gln Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg Thr Glu Ser Phe

385 390 395 400

Ala Gly Ile Asn Ile Leu Leu Thr Thr Pro Val Asn Gly Val Pro Trp

405 410 415

Ala Arg Phe Asn Trp Arg Asn Pro Leu Asn Ser Leu Arg Gly Ser Leu

420 425 430

Leu Tyr Thr Ile Gly Tyr Thr Gly Val Gly Thr Gln Leu Phe Asp Ser

435 440 445

Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr Glu Arg Pro Asn Tyr Glu Ser

450 455 460

Tyr Ser His Arg Leu Ser Asn Ile Arg Leu Ile Ser Gly Asn Thr Leu

465 470 475 480

Arg Ala Pro Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Asp Arg Thr Asn

485 490 495

Thr Ile Ser Ser Asp Ser Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe

500 505 510

Arg Val Trp Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly

515 520 525

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln

530 535 540

Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg

545 550 555 560

Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala

565 570 575

Ser Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys

580 585 590

Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr

595 600 605

Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly

610 615 620

Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu

625 630 635 640

Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu

645 650 655

Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Glu Leu Phe

660 665 670

Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His

675 680 685

Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys

690 695 700

Leu Asp Glu Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg

705 710 715 720

Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile

725 730 735

Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile

740 745 750

Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Leu Gly

755 760 765

Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu

770 775 780

Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu

785 790 795 800

Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His

805 810 815

Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala

820 825 830

Pro Ser Pro Ile Gly Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu

835 840 845

Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp

850 855 860

Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn

865 870 875 880

Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg

885 890 895

Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu

900 905 910

Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala

915 920 925

Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile

930 935 940

Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala

945 950 955 960

Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe

965 970 975

Glu Glu Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala

980 985 990

Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp

995 1000 1005

Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser

1010 1015 1020

Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg

1025 1030 1035 1040

Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu

1045 1050 1055

Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr

1060 1065 1070

Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn

1075 1080 1085

Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu Tyr Glu

1090 1095 1100

Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser

1105 1110 1115 1120

Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala

1125 1130 1135

Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr

1140 1145 1150

Gly Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu

1155 1160 1165

Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu

1170 1175 1180

Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu

1185 1190 1195

<210> 2

<211> 3600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacgagca accggaagaa cgagaacgag atcatcaacg ccctctcgat ccctgctgtt 60

tcaaaccact ccgcgcagat gaacctgtcc accgacgcgc gcatcgagga ctccctctgc 120

atagccgagg gcaacaacat cgacccattc gtgtcggcca gcacggttca gaccggcatc 180

aacatcgcgg gccgtatcct cggcgtcctc ggtgtcccat tcgccggtca gatcgcgtcc 240

ttctactcgt tccttgtggg cgagctgtgg cctcgcggtc gtgacccgtg ggagatcttc 300

ctggagcatg tggagcagtt gatccggcag caagtcacgg agaacacccg cgatactgct 360

ctggccaggc tacagggcct gggaaactcc tttcgggcat accagcagtc actggaggac 420

tggttggaga acagggatga cgcgcgaaca cgctcggtac tctacaccca gtacatcgct 480

ctcgaactcg acttcctgaa cgctatgccg ctgttcgcca tcaggaacca ggaagttcca 540

ctccttatgg tgtacgccca ggccgccaac ttacatctgc tcctgctgcg ggacgccagc 600

ctgttcggct ccgagttcgg actcacatct caagaaatcc agcgttacta cgagcgccaa 660

gtggagaaga cccgtgagta cagtgactac tgcgctcgat ggtacaacac agggctcaac 720

aacctgcgcg gcaccaacgc tgagtcatgg ctccgttaca accagttccg ccgcgacttg 780

actttgggtg tcctagacct ggtggcgcta ttcccgtctt acgacacacg ggtgtaccca 840

atgaacacta gcgcgcaact cacgcgggag atctacacag acccaatcgg ccggacgaac 900

gcaccctccg gtttcgcatc cacgaattgg ttcaacaaca acgcaccctc cttctcggca 960

atcgaggccg ccgtcatccg ccctcctcac ctgctcgact ttcccgagca gctcacgatc 1020

ttctccgtgc tctcacgctg gtccaacaca cagtacatga actactgggt cgggcaccga 1080

ttggagagta ggacgatccg tggcagcttg agcaccagta cccacggcaa caccaacacc 1140

tccatcaacc cagttacgct acagttcacg agccgcgacg tttaccggac tgagtcgttc 1200

gcgggcatta acatccttct gacaacgccc gtcaacggcg tcccgtgggc ccggttcaac 1260

tggcgtaacc cgttgaactc cctgcgcggg tcattgctct acaccatcgg gtacacgggc 1320

gtcggcaccc agctcttcga cagtgaaact gagctgccgc ccgagaccac ggaacgcccg 1380

aactacgagt cctacagcca ccgcctgtcc aacatccggc tcatctctgg caacacgctg 1440

cgtgcgccgg tgtactcctg gacacaccgc agcgccgacc ggaccaacac gatctcttcc 1500

gactccatta accagatccc gctcgtgaag ggcttccgtg tgtggggtgg cacgagcgtc 1560

atcaccggtc cgggcttcac cggtggagac atactgcggc gcaacacttt cggcgacttc 1620

gtttcgttgc aagtgaacat caactcgccg atcacccagc gttaccgtct gaggttccgc 1680

tacgcttcaa gccgcgacgc gagggtcatt gtcctgaccg gagccgcgtc cacaggcgtg 1740

ggaggccaag tctcagtcaa catgcctctc cagaagacga tggagatagg cgagaacttg 1800

actagccgaa ccttccggta cactgatttc tcgaaccctt tctcattcag agcgaaccct 1860

gacatcattg ggatctccga gcaaccgctg ttcggtgctg gctccatcag ctctggcgaa 1920

ctgtacatcg acaagattga gatcatcctg gcggatgcga cgttcgaggc cgagtctgac 1980

ctggagcggg ctcagaaggc tgtcaacgaa ctgttcacca gcagcaacca gattgggctc 2040

aagaccgacg tcacggacta tcacattgac caagtgtcca accttgtgga gtgcctgtcc 2100

gacgagttct gcctcgacga gaagaaggag ctgtccgaga aggtcaaaca cgcgaagcgt 2160

ctgagtgacg agcggaattt gctccaggac ccgaacttcc gtggcatcaa ccgccagctc 2220

gaccgtggtt ggcgcgggag tacagacatc accatccagg gaggcgacga tgtgttcaag 2280

gagaactatg tgacgctgct cgggactttc gacgaatgct acccgacgta tctctaccag 2340

aagatagacg agagtaaatt gaaggcgtac acccgctacc agcttcgcgg gtacatcgag 2400

gatagtcagg acctggaaat ctacctgatc cgatacaacg ccaagcacga gacagtgaac 2460

gtgccaggca cgggctcact ttggccattg agcgctccct ctccaatcgg aaagtgcgct 2520

caccactcgc accacttctc tctggacatc gacgtgggct gcaccgacct caacgaggac 2580

ctgggtgtct gggttatctt caagattaag acccaggacg gacatgcccg cctcggcaac 2640

ctggagttcc ttgaggagaa gcctctcgtg ggcgaggccc tcgctcgtgt gaagcgcgcc 2700

gagaagaaat ggcgagacaa gcgggagaag ctggagtggg agaccaacat cgtgtacaag 2760

gaggccaagg agtcagtgga cgcactcttc gtcaacagcc agtacgaccg cctccaggct 2820

gacaccaaca tcgccatgat ccacgcggct gacaagcggg tccacagcat ccgtgaggcg 2880

tacctgcccg agctgtcagt gatccctggt gtgaacgcgg cgatcttcga ggaactggag 2940

ggccgcatct tcacagcatt cagcctgtac gatgccagga atgttattaa gaacggtgac 3000

ttcaacaacg ggctgagttg ctggaacgtc aagggccatg tggacgtcga ggagcagaac 3060

aaccaccggt ccgtgctggt cgtgccggag tgggaggcag aggtgagcca ggaggtccgc 3120

gtctgccctg gtcgcggcta catcctccgt gtgactgcgt acaaggaagg ctacggtgaa 3180

ggctgcgtga ctatccacga gatcgagaac aacaccgacg agctcaagtt ctcgaactgt 3240

gtggaggagg aggtgtaccc gaacaacacc gttacttgca acgactacac tgccacgcaa 3300

gaggagtacg agggcactta cacttcccgg aatcgcggct atgatggcgc gtacgagtcc 3360

aacagcagcg tgcctgcgga ttatgcgtcc gcttacgagg agaaggcgta caccgacgga 3420

cggagggaca acccttgcga gtccaaccgt ggctacggtg actacactcc gctgcccgcc 3480

gggtacgtca ccaaggagct ggagtacttc ccggagaccg acaaagtctg gatcgagatc 3540

ggcgagacgg agggcacttt catcgtggac tcggtcgagc tgctactgat ggaggagtga 3600

<210> 3

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 4

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtctccgg agaggagacc agttgagatt aggccagcta cagcagctga tatggccgcg 60

gtttgtgata tcgttaacca ttacattgag acgtctacag tgaactttag gacagagcca 120

caaacaccac aagagtggat tgatgatcta gagaggttgc aagatagata cccttggttg 180

gttgctgagg ttgagggtgt tgtggctggt attgcttacg ctgggccctg gaaggctagg 240

aacgcttacg attggacagt tgagagtact gtttacgtgt cacataggca tcaaaggttg 300

ggcctaggat ccacattgta cacacatttg cttaagtcta tggaggcgca aggttttaag 360

tctgtggttg ctgttatagg ccttccaaac gatccatctg ttaggttgca tgaggctttg 420

ggatacacag cccggggtac attgcgcgca gctggataca agcatggtgg atggcatgat 480

gttggttttt ggcaaaggga ttttgagttg ccagctcctc caaggccagt taggccagtt 540

acccagatct ga 552

<210> 5

<211> 1993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtgcatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagatttctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttacttctg cag 1993

<210> 6

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctct ataataatgt gtgagtagtt 60

cccagataag ggaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa 120

cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 180

accaaaatcc agtgg 195

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atccagcgtt actacgagcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatgttaat gcccgcgaac 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctacagggc ctgggaaac 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcatccctg ttctccaacc a 21

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctttcgggc ataccagcag tcactg 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatcagcgg gtgttactaa tagg 24

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccccggaacc caaagact 18

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccccgctggc accttatgag aaatc 25

Claims

1.一种抑制或杀灭小地老虎的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供基因组插入编码SEQ ID NO:2所示Cry1B.868蛋白的基因的植物，所述植物表达Cry1B.868蛋白，产生小地老虎抗性；(2)所述植物与小地老虎接触，抑制或杀灭所述小地老虎。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达Cry1B.868蛋白的基因具有如SEQID NO:1所示核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物植物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达Cry1B.868蛋白的基因以单拷贝插入所述植物的基因组。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述小地老虎的致死率为50％以上。

6.一种检测植物基因组是否插入Cry1B.868基因的方法，其特征在于，取植物样本的基因组DNA进行PCR反应，根据PCR结果判断植物样本基因组DNA是否插入Cry1B.868基因；其中PCR反应使用具有如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的引物对，或使用如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的引物对和SEQ ID NO:11所示的探针。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Cry1B.868基因表达如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Cry1B.868基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。

9.一种检测Cry1B.868基因的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的引物对；或所述试剂盒包括如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物对和SEQ ID NO:11所示的探针。