CN115449521A - 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用 - Google Patents

一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115449521A
CN115449521A CN202110641592.5A CN202110641592A CN115449521A CN 115449521 A CN115449521 A CN 115449521A CN 202110641592 A CN202110641592 A CN 202110641592A CN 115449521 A CN115449521 A CN 115449521A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
leu
resistant gene
insect
resistant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110641592.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王东芳
张意红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Fangyun Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Fangyun Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Fangyun Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Fangyun Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110641592.5A priority Critical patent/CN115449521A/zh
Publication of CN115449521A publication Critical patent/CN115449521A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同时表达抗虫基因和耐除草剂基因的双元载体及应用，所述的双元载体含有抗虫基因vip3A和cry1F，同时含有抗除草剂基因；所述抗除草剂基因为抗草铵膦基因pat或者抗草甘膦基因gat。本发明载体同时表达vip3A、cry1F和pat/gat蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫，扩宽了转基因作物的抗虫范围，特别的对入侵我国的草地贪夜蛾有非常好的抗性，而且还有效地延缓了害虫抗性的产生。

Description

一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用
(一)技术领域
本发明涉及转基因植物新品种培育领域，具体涉及同时高效表达两种抗虫基因和一种抗除草 剂基因的双元载体及其在培育抗虫抗除草剂的植物细胞、转基因植物方面的应用。
(二)背景技术
全球人口基数的不断增加已经使人类饮食结构发生改变，对粮食的需求不断增加。在以矮杆 化和使用化肥农药为标志的第一次绿色革命和以杂交育种为标志技术革新使得全球粮食产量出现 了2次飞跃式的提升。而粮食产量的再一次突破增长必将依靠新的技术革命。而以转基因技术为 代表的生物育种技术已经在引领这场革命。
1995年美国批准了转基因抗虫棉的商业化种植，1996年转基因抗虫棉开始推广，中国也在 1996年开始引入转基因抗虫棉。2019-2021年，我国陆续首次审批了抗虫耐除草剂玉米和大豆的 农业转基因生物安全证书，标志着我国转基因生物育种技术进入加速期。另外，草地贪夜蛾作为 一种杂食性害虫已经于2018-2019年从云南入侵我国，这种害虫危害性大、耐药性强，目前已经 对我国的玉米等作物造成严重危害，通过生物育种的方法来防治草地贪夜蛾等害虫迫在眉睫。
草地贪夜蛾(学名：Spodoptera frugiperda)是夜蛾科灰翅夜蛾属的一种蛾。成虫在夜间活动， 在植物叶子顶部产约100粒卵，卵阶段是在25℃的温度下持续3天。新孵出的幼虫以卵壳本身为 食，然后静置2-10小时。幼虫更喜欢以新叶为食，由于它们的食性习惯，通常会各自找到一片新 叶。该物种可能正发生同域种化，逐渐分化为分布地区与外形没有明显差异的两个亚型，其幼虫 分别以玉米和水稻为主要食草。草地贪夜蛾幼虫可大量啃食禾本科如水稻、甘蔗和玉米之类细粒 禾榖及菊科、十字花科等多种农作物，造成严重的经济损失，其发育的速度会随着气温的提升而 变快，一年可繁衍数代，一只雌蛾即可产下超过1000粒卵。该物种原产于美洲热带地区，具有很 强的迁徙能力，虽不能在零度以下的环境越冬，但仍可于每年气温转暖时迁徙至美国东部与加拿 大南部各地，美国历史上就发生过数起草地贪夜蛾的虫灾。2016年起，草地贪夜蛾散播至非洲、 亚洲各国，已在多地造成巨大的农业损失。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)是一种常见的革兰氏阳性土壤微生物， 它能产生一种对特定生物具有高度选择性的杀虫蛋白。对Bt蛋白已进行了数十年安全性试验证实， 它对人类和动物不具毒性。Bt菌可以合成多种类型的杀虫毒素(Palma L et al.Toxins. 2014,6(12):3296-325.)。Cry蛋白是在Bt菌株孢子形成过程中发现的一种杀虫晶体蛋白，包括 Cry1Ab、Cry1C、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Bb1等；而Vip蛋白是一种Bt菌株形成孢子之前发现的一 种营养期杀虫蛋白，包括Vip3A和Vip1A等。上述两类蛋白在氨基酸序列和杀虫谱方面都有非常大 的差别，Vip3Aa与Cry1Ac不具有共同的结合位点，不存在明显交互抗性(张谦等.环境昆虫 学报.2010,32(2):256-263.)。因此，利用Cry1F和Vip3A蛋白在作物上联合使用提高作物的抗虫效 果非常合适。
Cry1F基因来自Bacillus thuringeinsis var.aizawai的PS811品系。Cry1F编码蛋白不仅能抗欧洲 玉米螟(Ostrinia nubilalis)，还能抗其它害虫，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，西南玉米螟 (Diatraea grandiosella)，豆切根虫(Striacosta albicosta)，粘虫(Spodoptera frugiperda)，地老虎(Agrotis ipsilon)，和甘蔗螟(Diatraea saccharalis)，而且对美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)等。
Vip3A是一类对鳞翅目昆虫幼虫具有杀虫活性的蛋白质，从苏云金杆菌AB88中分离，在其 生长的营养期、生长中期和产孢过程中均有表达。其基因产物对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、甜菜夜蛾(Spodtera exigua)、烟草夜蛾(Heliothis Virescons) 和美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)等鳞翅目昆虫幼虫有杀虫作用(Estruch,J J et al.Proceedings of the National Academy ofSciences.1996,93(11):5389-5394)。
杂草是影响农作物生产的第二大重要因素。它与农作物竞争水资源、肥料、光源等，造成农 作物的产量降低，同时还会降低农产品的品质。传统的手工除草方法费时费力并且效率很低，机 械除草费用较高，而化学药剂除草对技术要求较高并且极易对植物造成药害，影响作物本身的生 长发育，同时化学药剂还可能会影响到邻近敏感的农作物。
目前，通过在植物中转入可以赋予植物耐受或者抵抗除草剂性能的基因是应用最广泛的杂草 解决方案。而抗草甘膦和抗草铵膦是最为重要的两种抗除草剂性状。草甘膦，化学名称为N-(磷酸 甲基)甘氨酸，是一种有机膦类除草剂，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，拥有40多年的长期 安全使用记录。可以通过在植物中表达CP4(来源于农杆菌CP4菌株，编码CP4EPSPS蛋白) (Padgette,S R et al.1996.Pages 53-84in Herbicide-Resistant Crops)等EPSPS基因和Gat (来源于土壤微生物宏基因组的草甘磷N-乙酰转移酶的基因)等能表达降解草甘膦的酶的基因赋 予植物耐草甘膦的性状。草铵膦是一种由赫斯特公司80年代开发成功(后归属于拜耳公司)，属 广谱触杀型除草剂，内吸作用不强，与草甘膦杀根不同，草铵膦先杀叶，通过植物蒸腾作用可以 在植物木质部进行传导，其速效性间于百草枯和草甘膦之间。bar和pat基因是从不同的链霉菌中分 离出来的，它们都编码一种磷化酶乙酰转移酶(phospinothricin acetyl transferase，pat)，在植物 基因工程中有着广泛的应用。该酶是使PPT乙酰化的修饰酶，PAT酶通过乙酰化除草剂活性成分 PPT上的游离氨基，阻止有机体产生自体中毒现象；它对高剂量的PPT、双丙氨膦(bialaphos)或草铵膦有完全的抗性(Wehrmann A et al.Nat Biotechnol.1996；14(10):1274-8)。
研发复合性状的转基因植物是全球生物育种趋势。让植物同时表达多种目的蛋白的方法主要 包括多表达框分子克隆堆积法、杂交堆积法、基因融合法，其中多表达框分子克隆堆积法以其具 备的稳定性好、可预见性强和后期植物容易转育等优势被广泛使用。而多表达框堆积策略的效果 受诸多因素的影响，包括基因的选择、编码序列的选择、每个表达框包括启动子、终止子等在内 的调控元件的选择、各读码框的排列等。这些因素都会对目的基因的表达水平、表达模式以及不 同代次间的稳定性特别是高代次的基因沉默情况有不同的影响。因此一个能高效稳定的表达多个 目的基因的表达载体需要经过严格的探索与测试，而这种载体对获得稳定高效的转基因作物起到 决定性作用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种同时稳定高效表达抗虫基因(vip3A、cry1F)和抗除草剂基因(pat 或gat)的双元载体，及其在制备抗虫抗除草剂植物细胞、转基因农作物方面的应用，解决了对草 地贪夜蛾等害虫杀虫性能不够和害虫容易产生抗性的问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种同时稳定高效表达抗虫基因和耐除草剂基因的双元载体，所述的双元载体含 有抗虫基因vip3A和抗虫基因cry1F，同时含有抗除草剂基因；所述抗除草剂基因为抗草铵膦基 因pat或者抗草甘膦基因gat。
进一步，所述抗虫基因vip3A编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，核苷酸序列根据密 码子偏好性进行优化，序列为SEQ ID No：1所示；所述抗虫基因cry1F编码的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，核苷酸序列根据密码子偏好性进行优化，序列为SEQ ID No：3所示。
进一步，所述抗草铵膦基因pat编码的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，核苷酸序列根据密 码子偏好性进行优化，序列为SEQ ID No：5所示；所述抗草甘膦基因gat编码的氨基酸序列如 SEQ ID No：8所示，核苷酸序列根据密码子偏好性进行优化，序列为SEQ IDNo：7所示。
SEQ ID No：1vip3A基因
atgaacatgaacaacaccaagctcaacgccggcgccctcccgtccttcatcgactacttcaacggcatctacggcttcgccaccggcatcaag gacatcatgaacatgatcttcaagaccgacaccggcggcgacctcaccctcgacgagatcctcaagaaccagcagctcctcaacgacatctccggca agctcgacggcgtgaacggctccctcaacgacctcatcgcccagggcaacctcaacaccgagctctccaaggagatcctcaagatcgccaacgagc agaaccaggtgctcaacgacgtgaacaacaagctcgacgccatcaacaccatgctccgcgtgtacctcccgaagatcacctccatgctctccgacgtg atgaagcagaactacgccctctccctccagatcgagtacctctccaagcagctccaggagatctccgacaagctcgacatcatcaacgtgaacgtgct catcaactccaccctcaccgagatcaccccggcctaccagcgcatcaagtacgtgaacgagaagttcgaggagctcaccttcgccaccgagacctcc tccaaggtgaagaaggacggctccccggccgacatcctcgacgagctcaccgagctcaccgagctcgccaagtccgtgaccaagaacgacgtgga cggcttcgagttctacctcaacaccttccacgacgtgatggtgggcaacaacctcttcggccgctccgccctcaagaccgcctccgagctcatcaccaa ggagaacgtgaagacctccggctccgaggtgggcaacgtgtacaacttcctcatcgtgctcaccgccctccaggccgaggccttcctcaccctcacc acctgccgcaagctcctcggcctcgccgacatcgactacacctccatcatgaacgagcacctcaacaaggagaaggaggagttccgcgtgaacatcc tcccgaccctctccaacaccttctccaacccgaactacgccaaggtgaagggctccgacgaggacgccaagatgatcgtggaggccaagccgggc cacgccctcatcggcttcgagatctccaacgactccatcaccgtgctcaaggtgtacgaggccaagctcaagcagaactaccaggtggacaaggact ccctctccgaggtgatctacggcgacatggacaagctcctctgcccggaccagtccgagcagatctactacaccaacaacatcgtgttcccgaacgag tacgtgatcaccaagatcgacttcaccaagaagatgaagaccctccgctacgaggtgaccgccaacttctacgactcctccaccggcgagatcgacct caacaagaagaaggtggagtcctccgaggccgagtaccgcaccctctccgccaacgacgacggcgtgtacatgccgctcggcgtgatctccgaga ccttcctcaccccgatcaacggcttcggcctccaggccgacgagaactcccgcctcatcaccctcacctgcaagtcctacctccgcgagctcctcctcg ccaccgacctctccaacaaggagaccaagctcatcgtgccgccgtccggcttcatctccaacatcgtggagaacggctccatcgaggaggacaacct ggagccgtggaaggccaacaacaagaacgcctacgtggaccacaccggcggcgtgaacggcaccaaggccctctacgtccacaaggacggcgg catctcccagttcatcggcgacaagctcaagccgaagaccgagtacgtgatccagtacaccgtgaagggcaagccgtccatccacctcaaggacga gaacaccggctacatccactacgaggacaccaacaacaacctggaggactaccagaccatcaacaagcgcttcaccaccggcaccgacctcaagg gcgtgtacctcatcctcaagtcccagaacggcgacgaggcctggggcgacaacttcatcatcctggagatctccccgtccgagaagctcctctccccg gagctcatcaacaccaacaactggacctccaccggctccaccaacatctccggcaacaccctcaccctctaccagggcggccgcggcatcctcaag cagaacctccagctcgactccttctccacctaccgcgtgtacttctccgtgtccggcgacgccaacgtgcgcatccgcaactcccgcgaggtgctcttc gagaagcgctacatgtccggcgccaaggacgtgtccgagatgttcaccaccaagttcgagaaggacaacttctacatcgagctctcccagggcaaca acctctacggcggcccgatcgtccacttctacgacgtgtccatcaag
SEQ ID No：3cry1F基因
atggagaacaacatccagaaccagtgcgtgccgtacaactgcctcaacaacccggaggtggagatcctcaacgaggagcgctccaccggcc gcctcccgctcgacatctccctctccctcacccgcttcctcctctccgagttcgtgccgggcgtgggcgtggccttcggcctcttcgacctcatctgggg cttcatcaccccgtccgactggtccctcttcctcctccagatcgagcagctcatcgagcagcgcatcgagaccctggagcgcaaccgcgccatcacca ccctccgcggcctcgccgactcctacgagatttacatcgaggccctccgcgagtgggaggccaacccgaacaacgcccagctccgcgaggacgtg cgcatccgcttcgccaacaccgacgacgccctcatcaccgccatcaacaacttcaccctcacctccttcgagatcccgctcctctccgtgtacgtgcag gccgccaacctccacctctccctcctccgcgacgccgtgtccttcggccagggctggggcctcgacatcgccaccgtgaacaaccactacaaccgcc tcatcaacctcatccaccgctacaccaagcactgcctcgacacctacaaccagggcctggagaacctccgcggcaccaacacccgccagtgggccc gcttcaaccagttccgccgcgacctcaccctcaccgtgctcgacatcgtggccctcttcccgaactacgacgtgcgcacctacccgatccagacctcct cccagctcacccgcgagatttacacctcctccgtgatcgaggactccccggtgtccgccaacatcccgaacggcttcaaccgcgccgagttcggcgt gcgcccgccgcacctcatggacttcatgaactccctcttcgtgaccgccgagaccgtgcgctcccagaccgtgtggggcggccacctcgtgtcctcccgcaacaccgccggcaaccgcatcaacttcccgtcctacggcgtgttcaaccctggcggcgccatctggatcgccgacgaggacccgcgcccgttcta ccgcaccctctccgacccggtgttcgtgcgcggcggcttcggcaacccgcactacgtgctcggcctccgcggcgtggccttccagcagaccggcac caaccacacccgcaccttccgcaactccggcaccatcgactccctcgacgagatcccgccgcaggacaactccggcgccccgtggaacgactactc ccacgtgctcaaccacgtgaccttcgtgcgctggccgggcgagatttccggctccgactcctggcgcgccccgatgttctcctggacccaccgctccg ccaccccgaccaacaccatcgacccggagcgcatcacccagatcccgctcgtgaaggcccacaccctccagtccggcaccaccgtggtgcgcggc cccggcttcaccggcggcgacatcctccgccgcacctccggcggcccgttcgcctacaccatcgtgaacatcaacggccagctcccgcagcgctac cgcgcccgcatccgctacgcctccaccaccaacctccgcatctacgtgaccgtggccggcgagcgcatcttcgccggccagttcaacaagacgatg gacaccggcgacccgctcaccttccagtccttctcctacgccaccatcaacaccgccttcaccttcccgatgtcccagtcctccttcaccgtgggcgcc gacaccttctcctccggcaacgaggtgtacatcgaccgcttcgagctcatcccggtgaccgccaccttcgaggccgagtacgacctggag
SEQ ID No：5pat基因
atgagcccggagcgccgcccggtggagatccgcccggctaccgccgccgacatggccgccgtgtgcgacatcgtgaaccactacatcgag acctccaccgtgaacttccgcaccgagccgcagaccccgcaggagtggatcgacgacctggagcgcctccaggaccgctacccgtggctcgtggc cgaggtggagggcgtggtggccggcatcgcctacgccggcccgtggaaggcccgcaacgcctacgactggaccgtggagtccaccgtgtacgtgt cccaccgccaccagcgcctcggcctcggctccaccctctacacccacctcctcaagtcgatggaggcccagggcttcaagtccgtggtggccgtgat cggcctcccgaacgacccgtccgtgcgcctccacgaggccctcggctacaccgcccgcggcaccctccgcgctgccggctacaagcacggcggc tggcacgacgtgggcttctggcagcgcgacttcgagctcccggcccctccgcgcccggtgcgcccggtgacccagatc
SEQ ID No：7gat基因
atgatcgaggtgaagccgatcaacgccgaggacacctacgacctgaggcacagggtgctgaggccgaaccagccgatcgaggcctgcatg ttcgagagcgacctgaccaggagcgccttccacctgggtggcttctacggtggcaagctgatcagcgtggccagcttccaccaggccgagcacagc gagctgcagggcaagaagcagtaccagctgaggggcgtggccaccctggagggctacagggagcagaaggctggcagcagcctggtgaagcac gccgaggagatcctgaggaagagaggtgccgacatgatctggtgcaacgccaggaccagcgccagcggctactacaggaagctgggcttcagcg agcagggcgaggtgttcgacacgcctccggtgggaccgcacatcctgatgtacaagaggatcacctag
本发明所述的双元载体是将两个同源性非常低的抗虫蛋白编码基因vip3A、cry1F和抗除草剂 基因(pat或gat)构建到同一个植物表达载体中，使相应的转基因作物具有更广的杀虫谱，同时 延缓昆虫对杀虫蛋白产生抗性，且同时抗除草剂。该载体可以将以上三个基因同时转入受体植物， 使植物具有抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟等主要鳞翅目害虫和抗草铵膦或草甘膦的 特性。vip3A对草地贪夜蛾、小地老虎和其他鳞翅目害虫都有很好的杀灭效果，但是对玉米螟的 杀灭效果差；而cry1F对草地贪夜蛾和玉米螟等鳞翅目害虫有非常好的杀灭效果，而且对草地贪 夜蛾幼虫也有一定的杀虫活性。因此，结合vip3A和cry1F，可以非常高效的解决作物包括草地 贪夜蛾、小地老虎、棉铃虫、玉米螟、黏虫等主要鳞翅目害虫的防治问题。特别是近年来草地贪 夜蛾已经从云南入侵我国，本载体赋予植物的性状能够有效控制草地贪夜蛾的危害。
抗除草剂基因有很多，包括具有抗草铵膦性能的在不同链霉菌中分离出来的pat基因和bar 基因、抗草甘膦基因(cp4、gat和g10)(Comai L,Sen L C,Stalker DM.Science,1983, 221(4608):370-371；Castle LA et al.Science,2004,304(5674):1151-1154；沈志成等.高抗草甘膦特 变基因及其改良方法和应用，2011，CN102146371A)、抗麦草畏基因(DMO)(D'Ordine RL et al. J Mol Biol.2009,18；392(2):481-97)、抗2-4D基因(ADD-12)等(Griffin SL et al.J Agric Food Chem. 2013,10；61(27):6589-6596)。
所述双元载体还包含启动子，所述启动子为玉米泛素启动子(ZmUbi promoter)pZmUbi、复合 启动子p35S-intron，也可以是其他强组成型启动子，比如水稻的泛素启动子(Wang J and Oard J H. Plant Cell Reports,2003.)，木薯的veinmosaicvirus(CsVMV)启动子、Austranlianbananastreakvirus (BSV)启动子、mirabilismosaicvirus(MMV)启动子等。另外，还可以通过使用增强子和内含 子等元件来增强目标基因的表达，比如使用烟草的MAR(Matrix attachment regions)序列(Dolgova AS Dolgov SV.Biotech.2019,9(5):176.)、水稻actin基因的内含子(Oszvald M et al.Biotechnology and BioprocessEngineering,2007,12(6):676-683.)、玉米Shl基因的内含子1等(Clancy M and Hannah LC.Plant Physiology,2002,130(2):918-29.)。优选，所述玉米泛素启动子(ZmUbipromoter) pZmUbi核苷酸序列如SEQ ID No：11所示；所述复合启动子p35S-intron是由CaMV35S启动子 和玉米HSP70基因的第一个内含子组成的复合启动子，核苷酸序列如SEQID No：9所示。
SEQ ID No：9p35S-intron
atggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgg gaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaag gaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaaggg ctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggt ggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgagga gcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatc cttcgcaagaccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctcgaggtacgcg ctcactccgccctctgcctttgttactgccacgtttctctgaatgctctcttgtgtggtgattgctgagagtggtttagctggatctagaattacactctgaaatcgtgttctgcctgtgctgattacttgccgtcctttgtagcagcaaaatatagggacatggtagtacgaaacgaagatagaacctacacagcaatacgaga aatgtgtaatttggtgcttagcggtatttatttaagcacatgttggtgttatagggcacttggattcagaagtttgctgttaatttaggcacaggcttcatactac atgggtcaatagtatagggattcatattataggcgatactataataatttgttcgtctgcagagcttattatttgccaaaattagatattcctattctgtttttgtttg tgtgctgttaaattgttaacgcctgaaggaataaatataaatgacgaaattttgatgtttatctctgctcctttattgtgaccataagtcaagatcagatgcactt gttttaaatattgttgtctgaagaaataagtactgacagtattttgatgcattgatctgcttgtttgttgtaacaaaatttaaaaataaagagtttcctttttgttgct ctccttacctcctgatggtatctagtatctaccaactgacactatattgcttctctttacatacgtatcttgctcgatgccttctccctagtgttgaccagtgttact cacatagtctttgctcatttcattgtaatgcag
SEQ ID No：11玉米pUBI
ctacagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttga agtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaaca gttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctat ataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaag aaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaa ctaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcg tcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggca tccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcc caccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacaca caaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgtt ccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacc tgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgatttttt ttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgt ggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagt tacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggtt gtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgt gtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcat atgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgca gcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcag
进一步，本发明所述双元载体还包括终止子，终止子可以是来源于植物自身的终止子，也可 以是来源于病毒和其它生物，或者人工合成的终止子。优选根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止 子Tnos，CaMV35S终止子T35S，其中终止子Tnos核苷酸序列如SEQ IDNo：10所示。
SEQ ID No：10Tnos终止子
cccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaat aattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaa actaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc
更进一步，所述双元载体还包含启动抗虫基因vip3A表达的玉米泛素启动子(ZmUbi promoter) pZmUbi，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos；启动抗虫基因cry1F 表达的玉米泛素启动子(ZmUbi promoter)pZmUbi，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶 基因的终止子Tnos；启动抗除草剂基因pat或gat表达的复合启动子p35S-intron，终止该基因表 达的CaMV35S终止子T35S。
本发明所述表达载体还包括用于提高抗虫基因或抗除草剂基因的表达的基质附着区序列，所 述基质附着区序列为烟草MAR序列，其核苷酸序列为SEQ ID No：12所示，通过在表达载体目 的基因表达框启动子的5’端或者终止子的3’端增加基质附着区序列(MAR)来进一步提高抗虫基 因或抗除草剂基因的表达。
SEQ ID No：12烟草mar
tcgattaaaaatcccaattatatttggtctaatttagtttggtattgagtaaaacaaattcgaaccaaaccaaaatataaatatatagtttttatatatatgccttta agactttttatagaattttctttaaaaaatatctagaaatatttgcgactcttctggcatgtaatatttcgttaaatatgaagtgctccatttttattaactttaaataattggttgtacgatcactttcttatcaagtgttactaaaatgcgtcaatctctttgttcttccatattcatatgtcaaaatctatcaaaattcttatatatctttttcgaatt tgaagtgaaatttcgataatttaaaattaaatagaacatatcattatttaggtatcatattgatttttatacttaattactaaatttggttaactttgaaagtgtacatc aacgaaaaattagtcaaacgactaaaataaataaatatcatgtgttattaagaaaattctcctataagaatattttaatagatcatatgtttgtaaaaaaaattaa tttttactaacacatatatttacttatcaaaaatttgacaaagtaagattaaaataatattcatctaacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaaacccggcaa aaccgaaccaatccaaaccgatatagttggtttggtttgattttgatataaaccgaaccaactcggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttca agatattattaagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaat atgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaagtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagcaaagccagaatacaaagaaccat aaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaag catcccctctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattttggactactattgggaacttcttctgaaaatagt
本发明中用于提供双元载体骨架的基础载体可以是pCambia系列载体 (CAMBIA,Canberra,Australia)或者其它载体。优选pCambia1300载体为骨架。
本发明双元载体包括抗虫基因vip3A及其启动子和终止子、抗虫基因cry1F及其启动子和终 止子与抗草铵膦基因pat表达框构成的T-DNA表达载体或抗虫基因vip3A及其启动子和终止子、 抗虫基因cry1F及其启动子和终止子与抗草甘膦基因gat表达框构成的T-DNA表达载体。
本发明所述双元载体包括启动子-cry1F基因-启动子-vip3A基因-启动子-pat基因；启动子 -cry1F基因-启动子-vip3A基因-启动子-gat基因或者MAR-启动子-cry1F基因-启动子-vip3A基因- 启动子-pat基因。
所述T-DNA双元载体的构建包括：
(1)构建1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载体：
用KpnI和EcoRI对过渡载体1300-p35S-intron-pat进行双酶切，用BamHI和EcoRI对上述P CR克隆的包含vip3A基因和终止子的核苷酸片段进行双酶切，用KpnI和BamHI对上述PCR克 隆的pZmUbi1进行双酶切，将上述酶切回收后的载体和两个核苷酸片段进行三段连接，获得过渡 载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A。用HindIII和KpnI对过渡载体1300-p35S-intron-pat-p ZmUbi1-vip3A进行双酶切，用BamHI和KpnI对上述PCR克隆的包含cry1F基因和终止子的核 苷酸片段进行双酶切，用HindIII和BamHI对上述PCR克隆的pZmUbi2进行双酶切，将上述酶 切回收后的载体和两个核苷酸片段进行三段连接，获得终载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3 A-pZmUbi2-cry1F。
(2)构建构建1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载体：
用KpnI和EcoRI对过渡载体1300-p35S-intron-gat进行双酶切，用BamHI和EcoRI对上述P CR克隆的包含vip3A基因和终止子的核苷酸片段进行双酶切，用KpnI和BamHI对上述PCR克 隆的pZmUbi1进行双酶切，将上述酶切回收后的载体和两个核苷酸片段进行三段连接，获得过渡 载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A。用HindIII和KpnI对过渡载体1300-p35S-intron-gat-p ZmUbi1-vip3A进行双酶切，用BamHI和KpnI对上述PCR克隆的包含cry1F基因和终止子的核 苷酸片段进行双酶切，用HindIII和BamHI对上述PCR克隆的pZmUbi2进行双酶切，将上述酶 切回收后的载体和两个核苷酸片段进行三段连接，获得终载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3 A-pZmUbi2-cry1F。
本发明还提供一种所述抗虫耐除草剂基因的表达载体在制备转基因植物细胞中的应用，所述 应用是将T-DNA载体(1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F和1300-p35S-intron-g at-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F)分别电击转化农杆菌EHA105，获得含有植物转化载体的农杆 菌菌株，加甘油后保存至-80度冰箱，将农杆菌菌液侵染植物组织，获得转基因植物细胞。
本发明还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫基因和抗除草剂基因T-DNA的植物细 胞，在植物转基因细胞培养中将抗除草剂基因作为筛选标记。
本发明同时还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫基因和抗除草剂基因T-DNA的植 物。
本发明进一步提供了利用所述双元载体获得同时稳定高效表达抗虫基因和抗除草剂基因的植 物细胞或者植物的方法，该方法可以是农杆菌介导转化法、基因枪法、原生质体侵染法或者其他 植物遗传转化方法，优选农杆菌介导转化法。
本发明构建的双元载体适于单子叶植物的表达或者双子叶植物的表达，单子叶植物包括：玉 米、水稻等；双子叶植物包括：大豆、油菜、棉花等。
所述含抗虫基因和抗除草剂基因T-DNA的植物具有鳞翅目害虫抗性，包括草地贪夜蛾、棉 铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟或二化螟等。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明载体同时表达vip3A、cry1F和pat/gat 蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米 螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫，扩宽了转基因作物的抗虫范围，特别的对入侵我国的草 地贪夜蛾有非常好的抗性，而且还有效地延缓了害虫抗性的产生。同时使转基因作物具有抗草铵 膦或者抗草甘膦的能力，特别的，这种抗虫耐除草剂作物可以用于与转EPSPS基因的耐除草剂作 物联合使用。这种复合性状转基因作物符合目前转基因作物的研发方向，能更好满足大规模农业 生产的需求。
(四)附图说明
图1：同时表达vip3A、cry1F和pat基因的载体T-DNA结构示意图。
pZmUbi表示玉米泛素启动子；p35S-intron表示CaMV35S启动子和植物基因内含子组成的复 合启动子；vip3A表示vip3A基因和终止子；cry1F表示cry1F基因和终止子；pat表示pat基因和 终止子。
图2：同时表达vip3A、cry1F和gat基因的载体T-DNA结构示意图。
pZmUbi表示玉米泛素启动子；p35S-intron表示CaMV35S启动子和植物基因内含子组成的复 合启动子；vip3A表示vip3A基因和终止子；cry1F表示cry1F基因和终止子；gat表示gat基因和 终止子。
图3：增加MAR调控序列的同时表达vip3A、cry1F和gat基因的载体T-DNA结构示意图
MAR表示植物基质附着区(Matrix attachment regions)序列，具有稳定和增强基因表达的功 能；pZmUbi表示玉米泛素启动子；p35S-intron表示CaMV35S启动子和植物基因内含子组成的复 合启动子；vip3A表示vip3A基因和终止子；cry1F表示cry1F基因和终止子；HR表示gat基因 和终止子或者pat基因和终止子。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
在不背离本发明实质的情况下，对本发明的步骤、方法或者条件进行修改或者替换，均属于 本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1、同时表达抗虫蛋白编码基因vip3A、cry1F和抗除草剂基因pat或gat双元载体构 建
1、人工合成基因片段
为了构建同时高效表达vip3A、cry1F和pat/gat基因的载体，人工合成玉米HSP70基因第一 个内含子HSP70-Intron，核苷酸序列如SEQ ID No：9第788bp-1570bp个碱基所示；人工合成 pat基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；人工合成抗草甘膦基因gat，其核苷酸序列如SEQ ID No：7所示；人工合成从5’端至3’端依次包含vip3A基因核苷酸序列和Tnos终止子序列的核 苷酸片段vip3A-Tnos，其中vip3A基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，Tnos终止子核苷酸 序列如SEQ ID No:10所示；人工合成从5’端至3’端依次包含cry1F基因的核苷酸序列和Tnos终 止子序列的核苷酸序列cry1F-Tnos，其中cry1F基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，Tnos 终止子核苷酸序列如SEQ ID No：10所示。
2、构建抗草铵膦基因pat表达框：
(1)以人工合成的玉米HSP70基因第一个内含子HSP70-Intron为模板，通过PCR克隆 HSP70-Intron内含子片段(引物为IF:5’-TCTCTCTCGAGGTACGCGCTCACTCCGCCCTCTGCC；IR:5’-TGGCAGATCTGCATTACAATGAAATGAGCAAAGAC)；
(2)以人工合成的玉米pat基因片段为模板，通过PCR克隆pat基因(引物为 patF:5’-CATTGTAATGCAGATCTGCCACCATGAGCCCGGAGC； patR:5’-CTTTCTCGAGTTATCAGATCTGGGTCACCGGGCGCAC)；
(3)然后以上述PCR产物HSP70-Intron和pat片段为模板，通过PCR克隆获得HSP70-Intron-pat片段(引物为IF:5’-TCTCTCTCGAGGTACGCGCTCACTCCGCCCTCTGCC； patR:5’-CTTTCTCGAGTTATCAGATCTGGGTCACCGGGCGCAC)，序列的5’端和3’端分别设置 一个XhoI位点；
(4)用限制性内切酶XhoI对pCambia1300载体进行双酶切，同时用FastAP对该载体进行 去磷酸化处理，防止自连；同样用XhoI对上述步骤(3)PCR获得的HSP70-Intron-pat片段进行 酶切。然后，将上述酶切后的载体和片段连接后获得过渡载体1300-p35S-intron-pat。其中， p35S-intron是p35S启动子与玉米HSP70基因第一个内含子构成了复合启动子，核苷酸序列如 SEQ ID No：9所示。启动子p35S为pCambia1300载体上自带(NCBI序列号：AF234296，序列 中第7934bp-8714bp所示)。
3、构建抗草甘膦基因gat表达框：
以人工合成的gat基因核苷酸片段为模板，以GAT-F和GAT-R为引物(GAT-F:5’-TGTAGAT CTGCCACCATGATCGAGGTGAAGCCGATC；GAT-R:5’-CCGAGAAACTCGAGTTATCAGGTGATCCTCTTGTACATC)，通过PCR克隆本核苷酸序列，序列的5’端和3’端分别设置一个BglII位点和XhoI位点。
用限制性内切酶XhoI对pCambia1300载体进行酶切，同时用FastAP对该载体进行去磷酸化 处理，防止自连，回收pCambia1300载体；用XhoI和BglII对上述获得的过渡载体1300-p35S-intron-pat进行双酶切，回收玉米HSP70基因第一个内含子的核苷酸片段；同样用XhoI 和BglII回收之前通过PCR克隆的gat基因片段，回收gat基因片段；将上述酶切后回收的pCambia 1300载体、玉米HSP70基因第一个内含子的核苷酸片段和gat基因片段进行三段连接，获得过渡 载体1300-p35S-intron-gat。
4、构建抗虫基因vip3A及其终止子和启动子：
以人工合成vip3A-Tnos片段为模板，以V3-F和V3-R为引物(V3-F:5’-GCAGGATCCACC ATGAACATGAACAACACCAAGC；V3-R:5’-CCGCGCCGGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC)，通过PCR克隆本核苷酸序列，序列的5’端和3’端分别设置一个BamHI位点和EcoRI位点。
以玉米(B73)基因组为模板，通过PCR克隆玉米UBI启动子pZmUbi(引物为pUbi-F1:5’ -GGATCGGTACCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTC；pUbi-R1:5’-GGTGGATCCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGGGT)，核苷酸序列如SEQ ID No：11所示。启动子5’端和3’端分别 设置一个KpnI位点和BamHI位点。PCR克隆获得的核苷酸序片段记为pZmUbi1。
5、构建抗虫基因cry1F及其终止子和启动子：
以人工合成cry1F-Tnos片段为模板，通过引物1F-F和1F-R(1F-F:5’-CAGGGATCCACCAT GGAGAACAACATCCAGAACC；1F-R:5’-CCCGGCTGGTACCGATCTAGTAACATAGATGACAC C)，PCR克隆本核苷酸序列，序列的5’端和3’端分别设置一个BamHI位点和KpnI位点。
以玉米(B73)基因组为模板，通过PCR克隆玉米UBI启动子pZmUbi(引物为pUbi-F2:5’ -GTGCCAAGCTTCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTC；pUbi-R2:5’-GGTGGATCCCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGGGT)，核苷酸序列如SEQ ID No：11所示。启动子5’端和3’端分 别设置一个HindIII位点和BamHI位点。PCR克隆获得的核苷酸序片段记为pZmUbi2(与pZmU bi1序列相同，只是酶切位点不同)。
6、构建完整的T-DNA表达载体：
(1)构建1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载体：
基于pCambia1300载体上设置的多克隆位点，用KpnI和EcoRI对过渡载体1300-p35S-intron -pat进行双酶切，用BamHI和EcoRI对上述PCR克隆的包含vip3A-Tnos基因的核苷酸片段进行 双酶切，用KpnI和BamHI对上述PCR克隆的pZmUbi1进行双酶切，将上述酶切回收后的载体 和两个核苷酸片段进行三段连接，获得过渡载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A。用HindII I和KpnI对过渡载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A进行双酶切，用BamHI和KpnI对上述 PCR克隆的包含cry1F-Tnos基因的核苷酸片段进行双酶切，用HindIII和BamHI对上述PCR克 隆的pZmUbi2进行双酶切，将上述酶切回收后的载体和两个核苷酸片段进行三段连接，获得终载 体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F。
(2)构建构建1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载体：
基于pCambia1300载体上设置的多克隆位点，用KpnI和EcoRI对过渡载体1300-p35S-intron -gat进行双酶切，用BamHI和EcoRI对上述PCR克隆的包含vip3A-Tnos基因的核苷酸片段进行 双酶切，用KpnI和BamHI对上述PCR克隆的pZmUbi1进行双酶切，将上述酶切回收后的载体 和两个核苷酸片段进行三段连接，获得过渡载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A。用HindII I和KpnI对过渡载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A进行双酶切，用BamHI和KpnI对上述PCR克隆的包含cry1F-Tnos基因的核苷酸片段进行双酶切，用HindIII和BamHI对上述PCR克 隆的pZmUbi2进行双酶切，将上述酶切回收后的载体和两个核苷酸片段进行三段连接，获得终载 体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F。
(3)构建1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-MAR-pZmUbi2-cry1F载体：
以烟草基因组(本生烟(Nicotiana benthamiana))为模板，通过PCR克隆MAR片段(引物为 MARF:5’-GTGCCAAGCTTCGATTAAAAATCCCAATTATATTT；MARR:5’-CTGTAGAAGCTTACTATTTTCAGAAGAAGTTCCCAAT)，其核苷酸序列如SEQ ID No：12所示，序列5’端和3’端 分别设置一个HindIII位点。用限制性内切酶HindIII分别对载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3 A-pZmUbi2-cry1F和PCR产物MAR进行酶切，并用FastAP酶对载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1- vip3A-pZmUbi2-cry1F进行去磷酸化处理，回收酶切后的1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZ mUbi2-cry1F载体和MAR片段，连接后克隆获得终载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-MAR -pZmUbi2-cry1F。
7、T-DNA载体转化农杆菌
将获得的T-DNA载体(1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F和1300-p35S-intr on-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F)分别电击转化农杆菌EHA105，获得含有植物转化载体的 菌株，加甘油后保存至-80度冰箱，用于转基因作物侵染。
实施例2、转基因抗虫耐除草剂玉米的获得
玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Pa ul Scott(ed.),Methods in Molecular Biology:Transgenic Maize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei and Toshihiko Komari.Nature Protocols.2007,2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的 Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。分别将实施例1中制备的含有T-DNA 载体1300-p35S-intron-pat-pUBI-cry1F-pUBI-Vip3A、1300-p35S-intron-gat-pUBI-cry1F-pUBI-Vip3A、 1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-MAR-pZmUbi2-cry1F的农杆菌菌液(OD600为0.6，菌液制 备同实施例3)与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+30g/ L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到 愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L植物凝胶(gelrite)+5mg/L AgN O3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤分别转到带有2mg/L草铵膦 或者2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的 组织到新鲜含2mg/L草铵膦或者2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转 移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin(6-糠基氨基嘌 呤)+2.5g/Lgelrite+200mg/L 乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚 性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基 (1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完 全。获得含转化载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的T-DNA的转基因玉 米植株，名称为PVF；获得含转化载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的T -DNA的转基因玉米植株，名称为GVF。
实施例3、转基因抗虫耐除草剂水稻的获得
转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙.生命科学.1998,10:125-131；刘 凡等.分子植物育种.2003,1:108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组 织作为转化材料。
分别取实施例1中构建的载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F和 1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的农杆菌划板。挑单菌落接种培养基，28℃ 培养至OD为0.6，获得农杆菌菌液，作为转化用农杆菌。培养基组成：3g/LK2HPO4、1g/L NaH2PO4、1g/L NH4Cl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl2、0.0025g/L FeSO4·7H2O、5g/L蔗 糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8。
将待转化的愈伤组织放入OD为0.6的农杆菌菌液中，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后 把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂 (sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到 筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+4 mg/L草铵膦或2mM草甘膦(Sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后， 生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L脱落酸(ABA)+1mg/L萘乙 酸(NAA)+5mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite)上，28℃培 养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，28℃、每天14小时光照分化发芽。 2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/LNAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite) 上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室。
实施例4、转基因抗虫耐除草剂大豆的获得
这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(Deng et al.PlantPhysiology Communications.1998,34:381-387；Ma et al.Scientia AgriculturaSinica.2008,41:661-668；Zhou et al.Journal of Northeast AgriculturalUniversity.2001,32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的“天隆 1号”大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50ml NaClO与 2ml浓HCl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到B5 培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m2·s水平。当子叶变绿并顶 破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都 具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。
将含有实施例1中制备的载体1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F和 1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的单克隆农杆菌被分开培养待用(OD为0.6， 菌液制备同实施例3)。准备好的外植体浸没在农杆菌菌液中，28℃共培养30分钟左右。然后， 将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10B5共培养培养基里25℃暗 培养3-5天。
共培养的植物组织用B5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到B5固体培养基 中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有3mg/L草铵膦或2mM草甘膦的 B5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移 到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2B5培养基中进行 生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。
实施例5、转基因玉米抗虫能力的测定
1、试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入vip3A、cry1F和pat基因的抗虫抗草铵膦转 基因品系PVF和导入了vip3A、cry1F和gat基因的抗虫抗草甘膦转基因品系GVF。对照为非转 基因亲本材料PH4CV。
2、草地贪夜蛾抗性测定：
(1)室内生测：
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天，对PVF和GVF玉米分别喷洒 草铵膦和草甘膦确定是转基因植株后，各取10株，每株接1龄草地贪夜蛾10头，6天后观察死 亡率。草地贪夜蛾来自本课题组田间收集草地贪夜蛾雌虫养殖后产的卵块。将卵块至于28±1℃， RH 70±5％，16h:8h(L:D)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表1 所示。
表1.草地贪夜蛾室内生物活性测定结果#
Figure BDA0003108062150000111
#表中数据为死亡率的平均数±标准差，n＝10。PVF表示1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A -pZmUbi2-cry1F载体的转基因玉米植株；GVF表示载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZ mUbi2-cry1F的转基因玉米植株；PH4CV表示非转基因对照植株。
(2)大田生测：
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)人工接草地贪夜蛾初孵幼虫。将黑头卵块(约 40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶 中期接虫后20d调查食叶级别。
抗虫分级：采用9级标准(Marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2 级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6 级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别 分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料 每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
草地贪夜蛾大田抗性效果测试结果如表2所示。
表2.草地贪夜蛾大田测试结果
玉米品系 T2代 抗虫情况
PVF-3 100％<sup>#</sup>少量取食斑点 1
PVF-12 100％少量取食斑点 1
PVF-29 100％少量取食斑点 1
PVF-64 90％少量取食 2
PVF-92 100％少量取食斑点 1
GVF-11 100％少量取食斑点 1
GVF-19 100％少量取食斑点 1
GVF-32 80％少量取食斑点 3
GVF-55 100％少量取食斑点 1
GVF-86 100％少量取食斑点 1
PH4CV 大量取食，叶片有大量空洞 8.5
#代表草地贪夜蛾死亡率。PVF表示1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载 体的转基因玉米植株；GVF表示载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的转基 因玉米植株；PH4CV表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对草地贪夜蛾低龄幼虫有100％的杀灭效果，大 田测试结果表明大多数转化体对草地贪夜蛾表现出高抗。
2、棉铃虫抗性鉴定：
(1)室内生测
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天，对PVF和GVF玉米分别喷洒 草铵膦和草甘膦确定是转基因植株后，各取10株，每株接1龄棉铃虫10头，6天后观察死亡率。 棉铃虫卵块均购自河南科云生物农药(河南济源白云实业有限公司)。将卵块置于28±1℃，RH 70±5％，16h:8h(L:D)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表3所 示。
表3.棉铃虫室内生物活性测定结果#
Figure BDA0003108062150000121
#表中数据为死亡率的平均数±标准差，n＝10。PVF表示1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A -pZmUbi2-cry1F载体的转基因玉米植株；GVF表示载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZ mUbi2-cry1F的转基因玉米植株；PH4CV表示非转基因对照植株。
(2)大田生测：
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)进行人工接棉铃虫初孵幼虫。将黑头卵块(约 40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中 期接虫后20d调查食叶级别。
抗虫分级：采用9级标准(Marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级： 中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级： 大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类： 1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料 每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
棉铃虫大田抗性效果测试结果如表4所示。
表4.棉铃虫大田测试结果
玉米品系 T2代 抗虫情况
PVF-3 100％<sup>#</sup>少量取食斑点 1
PVF-12 100％少量取食斑点 1
PVF-29 100％少量取食斑点 1
PVF-64 100％少量取食斑点 1
PVF-92 100％少量取食斑点 1
GVF-11 100％少量取食斑点 1
GVF-19 100％少量取食斑点 1
GVF-32 85％少量取食斑点 3
GVF-55 100％少量取食斑点 1
GVF-86 100％少量取食斑点 1
PH4CV 大量取食，叶片有大量空洞 8.5
#代表棉铃虫的死亡率。PVF表示1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载体 的转基因玉米植株；GVF表示载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的转基因 玉米植株；PH4CV表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对棉铃虫低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测 试结果表明大多数转化体对棉铃虫表现出高抗。
3、玉米螟抗性鉴定
(1)室内生测
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天，对PVF和GVF玉米分别喷洒 草铵膦和草甘膦确定是转基因植株后，各取10株，每株接1龄玉米螟10头，6天后观察死亡率。 玉米螟卵块均购自是河南科云生物农药(河南济源白云实业有限公司)。将卵块置于28±1℃，RH 70±5％，16h:8h(L:D)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表5所 示。
表5.玉米螟室内生物活性测定结果
Figure BDA0003108062150000131
#表中数据为死亡率的平均数±标准差，n＝10。PVF表示1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A -pZmUbi2-cry1F载体的转基因玉米植株；GVF表示载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZ mUbi2-cry1F的转基因玉米植株；PH4CV表示非转基因对照植株。
(2)大田生测：
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)进行人工接玉米螟初孵幼虫。将黑头卵块(约 40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中 期接虫后20d调查食叶级别。
抗虫分级：采用9级标准(Marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级： 中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级： 大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类： 1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料 每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
玉米螟大田抗性效果测试结果如表6所示。
表6.玉米螟大田测试结果
玉米品系 T2代 抗虫情况
PVF-3 100％<sup>#</sup>少量取食斑点 1
PVF-12 100％少量取食斑点 1
PVF-29 85％少量取食斑点 3
PVF-64 100％少量取食斑点 1
PVF-92 100％少量取食斑点 1
GVF-11 100％少量取食斑点 1
GVF-19 100％少量取食斑点 1
GVF-32 90％少量取食斑点 2
GVF-55 100％少量取食斑点 1
GVF-86 100％少量取食斑点 1
PH4CV 大量取食，叶片有大量空洞 8.5
#代表玉米螟的死亡率。PVF表示1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载体 的转基因玉米植株；GVF表示载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的转基因 玉米植株；PH4CV表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对玉米螟低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测 试结果表明大多数转化体对玉米螟表现出高抗。
实施例6、转基因玉米抗除草剂性能的测定
1、试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入vip3A、cry1F和pat基因的抗虫抗草铵膦转 基因品系PVF和导入了vip3A、cry1F和gat基因的抗虫抗草甘膦转基因品系GVF。对照为非转 基因亲本材料PH4CV。
2、PVF玉米抗草铵膦性能的测定：
大田抗草铵膦性能测定：T2代转基因玉米和常规玉米种子在发芽后15-20天，4-6叶时期， 分别喷施用自来水以体积比1:50、1：100和1：200稀释的18％草铵膦(保试达，拜耳都公司)， 剂量为40L/亩，7天后记录玉米生长发育情况和死亡率。
通过在4-6叶期间大田喷施草铵膦，测定了不同代次的转基因玉米的抗草铵膦能力。结果见 表7。
表7.转基因抗虫耐除草剂玉米抗除草剂能力试验#
Figure BDA0003108062150000141
#每亩喷施40L的1：:100；1:200或者1:50倍稀释的保试达(18％草铵膦，拜耳产品)。PVF 表示1300-p35S-intron-pat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F载体的转基因玉米植株；PH4CV表示 非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
结果表明，大多数转化体可以耐受较高浓度的草铵膦。PVF-3、PVF-12、PVF-29和CF2A-64 的抗性水平比较高，其在每亩喷施40L的1：50稀释的保试达(18％草铵膦，拜耳)的条件下没有 对转基因玉米有可以看到的不利影响。
3、GVF玉米抗草甘膦性能的测定：
大田抗草甘膦性能测定：T2代转基因玉米和常规玉米种子在发芽后15-20天，4-6叶时期， 分别喷施用自来水以体积比1:50、1：100和1：200稀释的41％草甘膦异丙胺盐(孟山都公司)， 剂量为40L/亩，7天后记录玉米生长发育情况和死亡率。
通过在4-6叶期间大田喷施草甘膦，测定了不同代次的转基因玉米的抗草甘膦能力。结果见 表8。
表8.转基因抗虫耐除草剂玉米耐草甘膦能力试验#
Figure BDA0003108062150000142
#每亩喷施40L的1：100；1：200或者1:50倍稀释的农达(41％草甘膦，孟山都产品)。GVF 表示载体1300-p35S-intron-gat-pZmUbi1-vip3A-pZmUbi2-cry1F的转基因玉米植株；PH4CV表示 非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
结果表明，大多数转化体可以耐受较高浓度的草甘膦。GVF-11、GVF-19和GVF-86的抗性 水平比较高，其在每亩喷施40L的1∶50稀释的农达(41％草甘膦异丙胺盐，孟山都)的条件下没 有对转基因玉米有可以看到的不利影响。
还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干实施例。本发明不限于以上实施例，还可以 有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有延伸， 均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州芳韵生物科技有限公司
<120> 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2367
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgaacatga acaacaccaa gctcaacgcc ggcgccctcc cgtccttcat cgactacttc 60
aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctcac cctcgacgag atcctcaaga accagcagct cctcaacgac 180
atctccggca agctcgacgg cgtgaacggc tccctcaacg acctcatcgc ccagggcaac 240
ctcaacaccg agctctccaa ggagatcctc aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctc 300
aacgacgtga acaacaagct cgacgccatc aacaccatgc tccgcgtgta cctcccgaag 360
atcacctcca tgctctccga cgtgatgaag cagaactacg ccctctccct ccagatcgag 420
tacctctcca agcagctcca ggagatctcc gacaagctcg acatcatcaa cgtgaacgtg 480
ctcatcaact ccaccctcac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540
gagaagttcg aggagctcac cttcgccacc gagacctcct ccaaggtgaa gaaggacggc 600
tccccggccg acatcctcga cgagctcacc gagctcaccg agctcgccaa gtccgtgacc 660
aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctcaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720
aacaacctct tcggccgctc cgccctcaag accgcctccg agctcatcac caaggagaac 780
gtgaagacct ccggctccga ggtgggcaac gtgtacaact tcctcatcgt gctcaccgcc 840
ctccaggccg aggccttcct caccctcacc acctgccgca agctcctcgg cctcgccgac 900
atcgactaca cctccatcat gaacgagcac ctcaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960
aacatcctcc cgaccctctc caacaccttc tccaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020
tccgacgagg acgccaagat gatcgtggag gccaagccgg gccacgccct catcggcttc 1080
gagatctcca acgactccat caccgtgctc aaggtgtacg aggccaagct caagcagaac 1140
taccaggtgg acaaggactc cctctccgag gtgatctacg gcgacatgga caagctcctc 1200
tgcccggacc agtccgagca gatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 1260
gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tccgctacga ggtgaccgcc 1320
aacttctacg actcctccac cggcgagatc gacctcaaca agaagaaggt ggagtcctcc 1380
gaggccgagt accgcaccct ctccgccaac gacgacggcg tgtacatgcc gctcggcgtg 1440
atctccgaga ccttcctcac cccgatcaac ggcttcggcc tccaggccga cgagaactcc 1500
cgcctcatca ccctcacctg caagtcctac ctccgcgagc tcctcctcgc caccgacctc 1560
tccaacaagg agaccaagct catcgtgccg ccgtccggct tcatctccaa catcgtggag 1620
aacggctcca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680
gtggaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctct acgtccacaa ggacggcggc 1740
atctcccagt tcatcggcga caagctcaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800
gtgaagggca agccgtccat ccacctcaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860
gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920
gacctcaagg gcgtgtacct catcctcaag tcccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980
aacttcatca tcctggagat ctccccgtcc gagaagctcc tctccccgga gctcatcaac 2040
accaacaact ggacctccac cggctccacc aacatctccg gcaacaccct caccctctac 2100
cagggcggcc gcggcatcct caagcagaac ctccagctcg actccttctc cacctaccgc 2160
gtgtacttct ccgtgtccgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctc 2220
ttcgagaagc gctacatgtc cggcgccaag gacgtgtccg agatgttcac caccaagttc 2280
gagaaggaca acttctacat cgagctctcc cagggcaaca acctctacgg cggcccgatc 2340
gtccacttct acgacgtgtc catcaag 2367
<210> 2
<211> 789
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Gly Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Glu Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
<210> 3
<211> 1833
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
atggagaaca acatccagaa ccagtgcgtg ccgtacaact gcctcaacaa cccggaggtg 60
gagatcctca acgaggagcg ctccaccggc cgcctcccgc tcgacatctc cctctccctc 120
acccgcttcc tcctctccga gttcgtgccg ggcgtgggcg tggccttcgg cctcttcgac 180
ctcatctggg gcttcatcac cccgtccgac tggtccctct tcctcctcca gatcgagcag 240
ctcatcgagc agcgcatcga gaccctggag cgcaaccgcg ccatcaccac cctccgcggc 300
ctcgccgact cctacgagat ttacatcgag gccctccgcg agtgggaggc caacccgaac 360
aacgcccagc tccgcgagga cgtgcgcatc cgcttcgcca acaccgacga cgccctcatc 420
accgccatca acaacttcac cctcacctcc ttcgagatcc cgctcctctc cgtgtacgtg 480
caggccgcca acctccacct ctccctcctc cgcgacgccg tgtccttcgg ccagggctgg 540
ggcctcgaca tcgccaccgt gaacaaccac tacaaccgcc tcatcaacct catccaccgc 600
tacaccaagc actgcctcga cacctacaac cagggcctgg agaacctccg cggcaccaac 660
acccgccagt gggcccgctt caaccagttc cgccgcgacc tcaccctcac cgtgctcgac 720
atcgtggccc tcttcccgaa ctacgacgtg cgcacctacc cgatccagac ctcctcccag 780
ctcacccgcg agatttacac ctcctccgtg atcgaggact ccccggtgtc cgccaacatc 840
ccgaacggct tcaaccgcgc cgagttcggc gtgcgcccgc cgcacctcat ggacttcatg 900
aactccctct tcgtgaccgc cgagaccgtg cgctcccaga ccgtgtgggg cggccacctc 960
gtgtcctccc gcaacaccgc cggcaaccgc atcaacttcc cgtcctacgg cgtgttcaac 1020
cctggcggcg ccatctggat cgccgacgag gacccgcgcc cgttctaccg caccctctcc 1080
gacccggtgt tcgtgcgcgg cggcttcggc aacccgcact acgtgctcgg cctccgcggc 1140
gtggccttcc agcagaccgg caccaaccac acccgcacct tccgcaactc cggcaccatc 1200
gactccctcg acgagatccc gccgcaggac aactccggcg ccccgtggaa cgactactcc 1260
cacgtgctca accacgtgac cttcgtgcgc tggccgggcg agatttccgg ctccgactcc 1320
tggcgcgccc cgatgttctc ctggacccac cgctccgcca ccccgaccaa caccatcgac 1380
ccggagcgca tcacccagat cccgctcgtg aaggcccaca ccctccagtc cggcaccacc 1440
gtggtgcgcg gccccggctt caccggcggc gacatcctcc gccgcacctc cggcggcccg 1500
ttcgcctaca ccatcgtgaa catcaacggc cagctcccgc agcgctaccg cgcccgcatc 1560
cgctacgcct ccaccaccaa cctccgcatc tacgtgaccg tggccggcga gcgcatcttc 1620
gccggccagt tcaacaagac gatggacacc ggcgacccgc tcaccttcca gtccttctcc 1680
tacgccacca tcaacaccgc cttcaccttc ccgatgtccc agtcctcctt caccgtgggc 1740
gccgacacct tctcctccgg caacgaggtg tacatcgacc gcttcgagct catcccggtg 1800
accgccacct tcgaggccga gtacgacctg gag 1833
<210> 4
<211> 611
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn
1 5 10 15
Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu
20 25 30
Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe
35 40 45
Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly
50 55 60
Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln
65 70 75 80
Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu
100 105 110
Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val
115 120 125
Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn
130 135 140
Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val
145 150 155 160
Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe
165 170 175
Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn
180 185 190
Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr
195 200 205
Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp
210 215 220
Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp
225 230 235 240
Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln
245 250 255
Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu
260 265 270
Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu
275 280 285
Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe
290 295 300
Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu
305 310 315 320
Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr
325 330 335
Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro
340 345 350
Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly
355 360 365
Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln
370 375 380
Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile
385 390 395 400
Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp
405 410 415
Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro
420 425 430
Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp
435 440 445
Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile
450 455 460
Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr
465 470 475 480
Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr
485 490 495
Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu
500 505 510
Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu
515 520 525
Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe
530 535 540
Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser
545 550 555 560
Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser
565 570 575
Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile
580 585 590
Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr
595 600 605
Asp Leu Glu
610
<210> 5
<211> 549
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
atgagcccgg agcgccgccc ggtggagatc cgcccggcta ccgccgccga catggccgcc 60
gtgtgcgaca tcgtgaacca ctacatcgag acctccaccg tgaacttccg caccgagccg 120
cagaccccgc aggagtggat cgacgacctg gagcgcctcc aggaccgcta cccgtggctc 180
gtggccgagg tggagggcgt ggtggccggc atcgcctacg ccggcccgtg gaaggcccgc 240
aacgcctacg actggaccgt ggagtccacc gtgtacgtgt cccaccgcca ccagcgcctc 300
ggcctcggct ccaccctcta cacccacctc ctcaagtcga tggaggccca gggcttcaag 360
tccgtggtgg ccgtgatcgg cctcccgaac gacccgtccg tgcgcctcca cgaggccctc 420
ggctacaccg cccgcggcac cctccgcgct gccggctaca agcacggcgg ctggcacgac 480
gtgggcttct ggcagcgcga cttcgagctc ccggcccctc cgcgcccggt gcgcccggtg 540
acccagatc 549
<210> 6
<211> 183
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
Met Ser Pro Glu Arg Arg Pro Val Glu Ile Arg Pro Ala Thr Ala Ala
1 5 10 15
Asp Met Ala Ala Val Cys Asp Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Thr Pro Gln Glu Trp Ile Asp
35 40 45
Asp Leu Glu Arg Leu Gln Asp Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val
50 55 60
Glu Gly Val Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg
65 70 75 80
Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Val Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser His Arg
85 90 95
His Gln Arg Leu Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys
100 105 110
Ser Met Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu
115 120 125
Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg Leu His Glu Ala Leu Gly Tyr Thr Ala
130 135 140
Arg Gly Thr Leu Arg Ala Ala Gly Tyr Lys His Gly Gly Trp His Asp
145 150 155 160
Val Gly Phe Trp Gln Arg Asp Phe Glu Leu Pro Ala Pro Pro Arg Pro
165 170 175
Val Arg Pro Val Thr Gln Ile
180
<210> 7
<211> 441
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
atgatcgagg tgaagccgat caacgccgag gacacctacg acctgaggca cagggtgctg 60
aggccgaacc agccgatcga ggcctgcatg ttcgagagcg acctgaccag gagcgccttc 120
cacctgggtg gcttctacgg tggcaagctg atcagcgtgg ccagcttcca ccaggccgag 180
cacagcgagc tgcagggcaa gaagcagtac cagctgaggg gcgtggccac cctggagggc 240
tacagggagc agaaggctgg cagcagcctg gtgaagcacg ccgaggagat cctgaggaag 300
agaggtgccg acatgatctg gtgcaacgcc aggaccagcg ccagcggcta ctacaggaag 360
ctgggcttca gcgagcaggg cgaggtgttc gacacgcctc cggtgggacc gcacatcctg 420
atgtacaaga ggatcaccta g 441
<210> 8
<211> 146
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
Met Ile Glu Val Lys Pro Ile Asn Ala Glu Asp Thr Tyr Asp Leu Arg
1 5 10 15
His Arg Val Leu Arg Pro Asn Gln Pro Ile Glu Ala Cys Met Phe Glu
20 25 30
Ser Asp Leu Thr Arg Ser Ala Phe His Leu Gly Gly Phe Tyr Gly Gly
35 40 45
Lys Leu Ile Ser Val Ala Ser Phe His Gln Ala Glu His Ser Glu Leu
50 55 60
Gln Gly Lys Lys Gln Tyr Gln Leu Arg Gly Val Ala Thr Leu Glu Gly
65 70 75 80
Tyr Arg Glu Gln Lys Ala Gly Ser Ser Leu Val Lys His Ala Glu Glu
85 90 95
Ile Leu Arg Lys Arg Gly Ala Asp Met Ile Trp Cys Asn Ala Arg Thr
100 105 110
Ser Ala Ser Gly Tyr Tyr Arg Lys Leu Gly Phe Ser Glu Gln Gly Glu
115 120 125
Val Phe Asp Thr Pro Pro Val Gly Pro His Ile Leu Met Tyr Lys Arg
130 135 140
Ile Thr
145
<210> 9
<211> 1570
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac 60
caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat 120
tgcccagcta tctgtcactt catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa 180
tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc 240
aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct 300
tcaaagcaag tggattgatg tgataacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag 360
aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta 420
atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca 480
gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt 540
caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg 600
gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact 660
gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag accttcctct atataaggaa 720
gttcatttca tttggagagg acacgctgaa atcaccagtc tctctctaca aatctatctc 780
tctcgaggta cgcgctcact ccgccctctg cctttgttac tgccacgttt ctctgaatgc 840
tctcttgtgt ggtgattgct gagagtggtt tagctggatc tagaattaca ctctgaaatc 900
gtgttctgcc tgtgctgatt acttgccgtc ctttgtagca gcaaaatata gggacatggt 960
agtacgaaac gaagatagaa cctacacagc aatacgagaa atgtgtaatt tggtgcttag 1020
cggtatttat ttaagcacat gttggtgtta tagggcactt ggattcagaa gtttgctgtt 1080
aatttaggca caggcttcat actacatggg tcaatagtat agggattcat attataggcg 1140
atactataat aatttgttcg tctgcagagc ttattatttg ccaaaattag atattcctat 1200
tctgtttttg tttgtgtgct gttaaattgt taacgcctga aggaataaat ataaatgacg 1260
aaattttgat gtttatctct gctcctttat tgtgaccata agtcaagatc agatgcactt 1320
gttttaaata ttgttgtctg aagaaataag tactgacagt attttgatgc attgatctgc 1380
ttgtttgttg taacaaaatt taaaaataaa gagtttcctt tttgttgctc tccttacctc 1440
ctgatggtat ctagtatcta ccaactgaca ctatattgct tctctttaca tacgtatctt 1500
gctcgatgcc ttctccctag tgttgaccag tgttactcac atagtctttg ctcatttcat 1560
tgtaatgcag 1570
<210> 10
<211> 256
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 60
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 120
tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 180
tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 240
tctatgttac tagatc 256
<210> 11
<211> 1992
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
ctacagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020
tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1080
tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1140
tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1200
atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1260
gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1320
tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380
agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440
gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1500
ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1560
gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1620
aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680
catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1740
ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 1800
ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1860
gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1920
atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 1980
ttacttctgc ag 1992
<210> 12
<211> 1168
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
tcgattaaaa atcccaatta tatttggtct aatttagttt ggtattgagt aaaacaaatt 60
cgaaccaaac caaaatataa atatatagtt tttatatata tgcctttaag actttttata 120
gaattttctt taaaaaatat ctagaaatat ttgcgactct tctggcatgt aatatttcgt 180
taaatatgaa gtgctccatt tttattaact ttaaataatt ggttgtacga tcactttctt 240
atcaagtgtt actaaaatgc gtcaatctct ttgttcttcc atattcatat gtcaaaatct 300
atcaaaattc ttatatatct ttttcgaatt tgaagtgaaa tttcgataat ttaaaattaa 360
atagaacata tcattattta ggtatcatat tgatttttat acttaattac taaatttggt 420
taactttgaa agtgtacatc aacgaaaaat tagtcaaacg actaaaataa ataaatatca 480
tgtgttatta agaaaattct cctataagaa tattttaata gatcatatgt ttgtaaaaaa 540
aattaatttt tactaacaca tatatttact tatcaaaaat ttgacaaagt aagattaaaa 600
taatattcat ctaacaaaaa aaaaaccaga aaatgctgaa aacccggcaa aaccgaacca 660
atccaaaccg atatagttgg tttggtttga ttttgatata aaccgaacca actcggtcca 720
tttgcacccc taatcataat agctttaata tttcaagata ttattaagtt aacgttgtca 780
atatcctgga aattttgcaa aatgaatcaa gcctatatgg ctgtaatatg aatttaaaag 840
cagctcgatg tggtggtaat atgtaattta cttgattcta aaaaaatatc ccaagtatta 900
ataatttctg ctaggaagaa ggttagctac gatttacagc aaagccagaa tacaaagaac 960
cataaagtga ttgaagctcg aaatatacga aggaacaaat atttttaaaa aaatacgcaa 1020
tgacttggaa caaaagaaag tgatatattt tttgttctta aacaagcatc ccctctaaag 1080
aatggcagtt ttcctttgca tgtaactatt atgctccctt cgttacaaaa attttggact 1140
actattggga acttcttctg aaaatagt 1168

Claims (9)

1.一种同时表达抗虫基因和耐除草剂基因的双元载体，其特征在于所述的双元载体含有抗虫基因vip3A和抗虫基因cry1F，同时含有抗除草剂基因；所述抗除草剂基因为抗草铵膦基因pat或者抗草甘膦基因gat。
2.如权利要求1所述的双元载体，其特征在于所述抗虫基因vip3A核苷酸序列为SEQ IDNo：1所示；所述抗虫基因cry1F核苷酸序列为SEQ ID No：3所示。
3.如权利要求1所述的双元载体，其特征在于所述抗草铵膦基因pat核苷酸序列为SEQID No：5所示；所述抗草甘膦基因gat核苷酸序列为SEQ ID No：7所示。
4.如权利要求1所述的双元载体，其特征在于所述双元载体包含玉米泛素启动子pZmUbi、复合启动子p35S-intron；所述玉米泛素启动子pZmUbi核苷酸序列如SEQ ID No：11所示；所述复合启动子p35S-intron核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。
5.如权利要求1所述的双元载体，其特征在于所述双元载体包括根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos或CaMV35S终止子T35S。
6.如权利要求1所述的双元载体，其特征在于所述双元载体包括用于提高抗虫基因或抗除草剂基因表达的基质附着区序列，所述基质附着区序列为烟草MAR序列。
7.如权利要求1所述的双元载体，其特征在于所述双元载体包含启动抗虫基因vip3A表达的玉米泛素启动子pZmUbi，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos；启动抗虫基因cry1F表达的玉米泛素启动子pZmUbi，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos；启动抗除草剂基因表达的复合启动子p35S-intron，终止该基因表达的CaMV35S终止子T35S。
8.一种权利要求1所述抗虫耐除草剂基因的表达载体在制备转基因植物细胞中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物包括玉米、水稻、大豆、油菜或棉花。
CN202110641592.5A 2021-06-09 2021-06-09 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用 Pending CN115449521A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110641592.5A CN115449521A (zh) 2021-06-09 2021-06-09 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110641592.5A CN115449521A (zh) 2021-06-09 2021-06-09 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115449521A true CN115449521A (zh) 2022-12-09

Family

ID=84295175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110641592.5A Pending CN115449521A (zh) 2021-06-09 2021-06-09 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115449521A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116200529A (zh) * 2022-12-13 2023-06-02 山东省农业科学院 玉米转化事件lg11的核酸序列及其检测方法
CN116694626A (zh) * 2023-07-26 2023-09-05 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因玉米事件lp035-2及其检测方法
CN116694627A (zh) * 2023-07-26 2023-09-05 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因玉米事件lp035-1及其检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104583404A (zh) * 2012-06-25 2015-04-29 美国陶氏益农公司 昆虫抗性和除草剂耐受性大豆事件pDAB9582.816.15.1
CN106399339A (zh) * 2016-08-28 2017-02-15 浙江大学 一种抗除草剂抗虫融合基因、编码蛋白及应用
CN106916844A (zh) * 2016-12-31 2017-07-04 浙江大学 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104583404A (zh) * 2012-06-25 2015-04-29 美国陶氏益农公司 昆虫抗性和除草剂耐受性大豆事件pDAB9582.816.15.1
CN106399339A (zh) * 2016-08-28 2017-02-15 浙江大学 一种抗除草剂抗虫融合基因、编码蛋白及应用
CN106916844A (zh) * 2016-12-31 2017-07-04 浙江大学 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JANETE A. D. SENA等: "Interaction of Bacillus thuringiensis Cry1 and Vip3A Proteins with Spodoptera frugiperda Midgut Binding Sites", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》, vol. 75, no. 7, 30 April 2009 (2009-04-30), pages 2236, XP009119716, DOI: 10.1128/AEM.02342-08 *
张平: "含cry1Ac和vip3A双价抗虫基因植物表达载体的构建及其对水稻的转化", 《中国优秀硕士论文库 农业科技辑》, 31 August 2015 (2015-08-31), pages 047 - 21 *
杨景: "黏虫对Bt毒素的抗性演化", 《中国优秀硕士论文库农业科技辑》, 31 August 2019 (2019-08-31), pages 046 - 13 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116200529A (zh) * 2022-12-13 2023-06-02 山东省农业科学院 玉米转化事件lg11的核酸序列及其检测方法
CN116200529B (zh) * 2022-12-13 2024-03-12 山东省农业科学院 玉米转化事件lg11的核酸序列及其检测方法
CN116694626A (zh) * 2023-07-26 2023-09-05 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因玉米事件lp035-2及其检测方法
CN116694627A (zh) * 2023-07-26 2023-09-05 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因玉米事件lp035-1及其检测方法
CN116694627B (zh) * 2023-07-26 2023-09-29 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因玉米事件lp035-1及其检测方法
CN116694626B (zh) * 2023-07-26 2023-09-29 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因玉米事件lp035-2及其检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106916844B (zh) 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用
RU2707527C2 (ru) Растение маиса dbn9936 и способ применения в детектировании его последовательности нуклеиновой кислоты
CN115449521A (zh) 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用
Zambre et al. A reproducible genetic transformation system for cultivated Phaseolus acutifolius (tepary bean) and its use to assess the role of arcelins in resistance to the Mexican bean weevil
WO2001021821A2 (en) Insect-resistant rice plants
CN108611362B (zh) 杀虫蛋白的用途
CN111315218B (zh) 杀虫蛋白的用途
CN109593778A (zh) 一种植物人工智能雄性不育系及应用
CN106834318B (zh) 一种抗虫融合基因、编码蛋白及其应用
CN106399339A (zh) 一种抗除草剂抗虫融合基因、编码蛋白及应用
Salehian et al. Constitutive expression of a synthetic cry1Ab gene confers resistance to potato tuber moth (Phthorimaea operculella Zeller) larva
CN108432760B (zh) 杀虫蛋白的用途
CN111088265A (zh) 抗虫融合基因、其编码蛋白、其表达载体及其应用
CN110881367A (zh) 一种玉米事件t抗-4及其使用方法
CN112626111A (zh) 一种除草剂抗性基因表达载体及其应用
Jin et al. Transgenic japonica rice expressing the cry1C gene is resistant to striped stem borers in Northeast China
CN111995690B (zh) 一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用
CN109234307B (zh) 杀虫蛋白的用途
CN109486852B (zh) 杀虫蛋白的用途
KR100723070B1 (ko) 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법
CN109912721B (zh) 创建抗虫融合基因的方法及其应用
CN109385447B (zh) 杀虫蛋白的用途
CN114507673A (zh) 一种抑制或杀灭小地老虎的方法及应用
CN110452896B (zh) 一种植物抗虫相关蛋白OsPAL6和OsPAL8及其编码基因与应用
CN111676233A (zh) 抗虫基因Cry1Ab-l及其编码蛋白与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination