CN106916844B - 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用 - Google Patents
一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106916844B CN106916844B CN201611266854.XA CN201611266854A CN106916844B CN 106916844 B CN106916844 B CN 106916844B CN 201611266854 A CN201611266854 A CN 201611266854A CN 106916844 B CN106916844 B CN 106916844B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- resistant
- insect
- glyphosate
- gene
- expression vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 76
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 title claims abstract description 33
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 33
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 title claims abstract description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 title description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 54
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 101100275683 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki cry2Ab gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 101150065438 cry1Ab gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract 3
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims abstract 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 37
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 24
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 102220092319 rs876657875 Human genes 0.000 claims description 4
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 60
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 abstract description 30
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 abstract description 30
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 abstract description 22
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract description 19
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 13
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 abstract description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 6
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 abstract description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 abstract description 3
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract description 3
- 241000426497 Chilo suppressalis Species 0.000 abstract description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 13
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 9
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 9
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 7
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 5
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000009333 weeding Methods 0.000 description 3
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 2
- KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N Acetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1 KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 2
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- ZEKANFGSDXODPD-UHFFFAOYSA-N glyphosate-isopropylammonium Chemical compound CC(C)N.OC(=O)CNCP(O)(O)=O ZEKANFGSDXODPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000218475 Agrotis segetum Species 0.000 description 1
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 description 1
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 241000758794 Asarum Species 0.000 description 1
- 101150063057 CRYAB gene Proteins 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015535 Euphoric mood Diseases 0.000 description 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 1
- 101000864393 Homo sapiens Protein BUD31 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000964421 Homo sapiens Zinc finger and BTB domain-containing protein 12 Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 1
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150092571 cry1Ac gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- -1 lso Species 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用，所述表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ab和草甘膦抗性基因G10evo。本发明载体同时表达Cry1Ab、Cry2Ab和G10evo蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫，不但拓宽了杀虫谱，而且还有效地延缓了害虫抗性的发生，同时使转基因作物具有抗草甘膦的能力，这种复合性状转基因作物符合目前转基因作物的研发方向，更能满足大规模农业生产的需求。
Description
(一)技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及两种抗虫基因和一种草甘膦抗性基因构建的表达载体。
(二)背景技术
农业害虫是影响农作物生产的第一大重要因素。目前，化学农药仍然是害虫防治的主要角色，对于维持农业生产的稳定发展发挥了重要作用。农药采用的是非特异毒杀方式，杀死靶标害虫的同时也对有益昆虫和鸟类起到了毒杀作用。长时间的使用，对自然环境造成严重的污染，破坏了生态平衡；由于在食物链中的富集，对人畜安全直接构成威胁。
杂草是影响农作物生产的第二大重要因素。它与农作物竞争水资源、肥料、光源等，造成农作物的产量降低，同时还会降低农产品的品质。传统的手工除草方法费时费力并且效率很低，机械除草费用较高，而化学药剂除草对技术要求较高并且极易对植物造成药害，影响作物本身的生长发育，同时化学药剂还可能会影响到邻近敏感的农作物。
自1996年转基因作物商业化种植以来，转基因抗虫、抗除草剂或同时具有抗虫和抗除草剂的复合性状的转基因作物得到空前地发展。许多国家批准了转基因玉米、转基因大豆的种植或者进口。转基因抗虫玉米主要对鳞翅目害虫玉米螟和棉铃虫有比较高的抗虫能力，对其他玉米害虫，包括小地老虎等也有一定的抗性。随着转基因抗虫作物的广泛种植，农业害虫对转基因抗虫作物逐渐产生了抗性，降低了转基因作物的抗虫能力和使用寿命。为了提高转基因抗虫作物的抗虫能力和延缓害虫抗性的产生，转基因抗虫作物的研发方向是同时使用2个抗虫基因，例如crylAb和crylF同时使用。
CrylAb是一种杀虫能力比较强的Bt晶体杀虫蛋白质，对玉米螟的杀虫活性尤为高；Cry2Ab是另一种杀虫性比较高的杀虫晶体蛋白。单个抗虫蛋白往往杀虫谱比较窄，转基因抗虫作物长时间使用一种杀虫蛋白还可能引起害虫抗性的产生。相比单个基因，多基因的聚合使用在转基因作物中具有以下几个方面的优势：杀虫效果更好，经济实用；杀虫谱更广，多个抗虫基因之间杀虫谱可以互相弥补，不同的基因对同种害虫的杀虫效果也存在差异，可以相互补充；可以有效延缓抗性品种的使用寿命，理论上农业害虫同时对两种不同的Bt基因同时产生抗性的可能性要低于单个Bt基因，因而多个抗虫基因同时使用能够有效地延缓害虫抗性的产生。因此，让转基因抗虫作物同时表达两种无交互抗性的Bt杀虫蛋白对治理昆虫抗性的发生是一种经济而有效的措施。
目前已有很多相关的专利和文献报道了利用抗虫或抗除草剂基因构建的表达载体，例如：刘桂珍等在2007年利用苋菜凝集素基因(ARA)与cry1Ac基因构建到同一植物表达载体中，将该载体转入植物细胞，获得了抗同翅目和鳞翅目害虫的转基因植物(刘桂珍，周长生，陈凌娜，陈正华的双价抗虫基因的植物表达载体构建及其转基因植物获得方法；中国200710106077.7[P].2008-4-16)；Bohorova等将融合基因cry1Bcry1Ab转入玉米中来防治多种农业害虫(Bohorova N,Frutos R,Royer M,P,Pacheco M,Rascon Q,McLean S,Hoisington D.(2011)ThoerAppl Genet.103,817-826；沈志成等在2011年将抗除草剂基因P450构建到植物表达载体中，将该载体转入植物细胞，获得了抗烟嘧磺隆等除草剂的转基因植物(沈志成，林朝阳，徐晓丽，李新兰的抗除草剂基因及其在转基因农作物中的应用；中国201110237649.1[P].2011-8-18)。对现有的文章和专利分析发现，还没有将cry1Ab、cry2Ab和G10evo基因构建在同一个植物转化载体中的报道。本发明首次公开了一种基于cry1Ab、cry2Ab和G10evo构建的植物转化载体，用该载体转化所得的转基因玉米能够高抗棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫，不但拓宽了转基因玉米的杀虫谱，而且有效地延缓了害虫抗性的产生；同时G10evo基因在植物中表达使植物对草甘膦产生抗性，从而可以利用草甘膦选择性地防除杂草。该玉米即将进入生产性试验的安全评价阶段，有望在今后进入商业化种植。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种同时表达Cry1Ab、Cry2Ab和G10evo的表达载体，以及在抗虫农作物中的应用。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种抗虫耐草甘膦表达载体，所述表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ab和草甘膦抗性基因G10evo。
进一步，所述抗虫基因cry1Ab核苷酸序列为SEQ ID No：1所示；所述抗虫基因cry2Ab核苷酸序列为SEQ ID No：2所示；所述草甘膦抗性基因G10evo的核苷酸序列为SEQID No：3所示。
本发明所述的表达载体是将两个同源性非常低的抗虫蛋白编码基因cry1Ab、cry2Ab和草甘膦抗性基因G10evo构建到同一个植物表达载体中，使相应的转基因作物具有较宽的杀虫谱，同时延缓昆虫对杀虫蛋白产生抗性。该载体可以将以上三个基因同时转入受体植物，使植物具有抗棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟等主要鳞翅目害虫和抗草甘膦除草剂的特性。鉴于目前已商业化种植的转基因作物广泛应用的Bt基因对昆虫具有一定的毒杀作用，但是长时间使用一种杀虫蛋白会使害虫对现有的转Bt基因农作物产生抗性。本发明中所使用的基因对人类和高等动物是安全的，无任何毒副作用。
进一步，所述表达载体包含启动抗虫基因cry1Ab表达的玉米泛素启动子(ZmUbipromoter)pZmUbi，终止该基因表达的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)终止子PepcT；启动抗虫基因cry2Ab表达的水稻actin启动子pActin，终止该基因表达的CaMV35S终止子T35S；启动草甘膦抗性基因G10evo表达的CaMV35S启动子(包含水稻actin的内含子)p35S-actinintron，终止该基因表达的CaMV35S终止子T35S。
本发明所述的表达载体是以pCambia 1300(CAMBIA,Canberra,Australia)载体为骨架而构建的，具体为：草甘膦抗性基因G10evo，包含玉米乙酰羟酸合成酶叶绿体信号肽的核苷酸序列(SEQ ID No：3，5’端被设计上BamHI酶切位点，3’端被设计上Xho Ⅰ位点，BamHI-Xho Ⅰ片段)与CaMV 35S终止子(SEQ ID No：4，5’端被设计上Xho Ⅰ位点，3’端被设计上HindIII位点，Xho Ⅰ-HindIII酶切片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-HindIII片段。CaMV的35S启动子(包含水稻actin的内含子)p35s-actinintron，以实验室保存的PMD19-35Sints质粒为模板，使用引物35S-KpnI F(5′GGTACCATGGTGGAGCACGACACTCTC 3′，添加了KpnI位点)和引物35S-BamHI R(5′GGTACCCCCTTGCGGGGATCGGTGG 3′，添加了KpnI位点)扩增获得p35s-actinintron启动子(SEQ ID No：6)。p35s-actinintron启动子经KpnI和BamHI酶切后与基因-终止子片段(BamHI-HindIII)共同连接到经KpnI和HindIII酶切的pCambia1300载体中，获得T-DNA载体pCam-p35s-actinintron-G10evo-T35S。
编码杀虫蛋白质的基因cry2Ab(SEQ ID No：2，5’端被设计上BamHI酶切位点，3’端被设计上Xho Ⅰ位点，BamHI-Xho Ⅰ片段)与CaMV 35S终止子(SEQ ID No：4，5’端被设计上Xho Ⅰ位点，3’端被设计上KpnI位点，Xho Ⅰ-KpnI酶切片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。水稻actin启动子(pActin)经过HindIII和BamHI酶切后与基因和终止子片段(BamHI-KpnI片段)共连接到经KpnI酶切的pCam-p35s-actinintron-G10evo-T35S中，获得T-DNA载体pCam-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-actinintron-G10evo-T35S。
编码杀虫蛋白的基因cry1Ab(SEQ ID No：1，5’端被设计上BamHI酶切位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI片段)与玉米的pepc终止子(SEQ ID No：5，5’端被设计上SacI位点，3’端被设计上KpnI位点，SacI-KpnI酶切片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。玉米ubiquitin-1启动子pZmUbi从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：ZmUbiF(5’GGTACCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC，添加了KpnI位点)。ZmUbiR(5’GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAA CAG，添加了BamHI位点)。玉米ubiquitin-1启动子pZmUbi经过KpnI和BamHI酶切后和基因-终止子片段(BamHI-KpnI片段)共同连接到经过KpnI酶切的pCam-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-actinintron-G10evo-T35S载体中，获得T-DNA载体pCam-pZmUbi-1-cry1Ab-PepcT-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-actinintron-G10evo-T35S，如图1。该表达载体包含三个表达框，即两个抗虫基因cry1Ab、cry2Ab表达框，赋予转基因植物抗虫特性；草甘膦抗性基因G10evo表达框赋予转基因植物抗除草剂草甘膦的特性。
将获得的T-DNA载体(
pCam-pZmUbi-1-cry1Ab-PepcT-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-actinintron-G10evo-T35S)电击转化农杆菌LBA4404，获得含有植物转化载体的若干菌株，用于转基因作物侵染。
本发明还提供了一种由所述抗虫耐草甘膦表达载体构建的质粒。
本发明提供了一种包含所述抗虫耐草甘膦表达载体的植物细胞，在植物转基因细胞培养中将草甘膦抗性基因G10evo作为筛选标记。
本发明构建的表达载体适于双子叶植物的表达或者单子叶植物的表达，双子叶植物包括：大豆、油菜等；单子叶植物包括：玉米、水稻等。
本发明提供一种抗虫耐草甘膦表达载体在制备抗虫耐草甘膦植物细胞中的应用，所述植物为水稻、玉米或棉花等农作物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明载体同时表达Cry1Ab、Cry2Ab和G10evo蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫，不但拓宽了杀虫谱，而且还有效地延缓了害虫抗性的发生，同时使转基因作物具有抗草甘膦的能力，这种复合性状转基因作物符合目前转基因作物的研发方向，更能满足大规模农业生产的需求。
(四)附图说明
图1：实施例1中基于cry1Ab、cry2Ab和G10evo构建的表达载体图谱。
图2：转基因植物叶片离体抗虫性测定。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明的步骤、方法或者条件进行修改或者替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1、抗虫蛋白编码基因cry1Ab、cry2Ab和草甘膦抗性基因G10evo的表达载体构建
植物转化载体是基于pCambia 1300(CAMBIA,Canberra,Australia)载体而构建的。草甘膦抗性基因G10evo，包含玉米乙酰羟酸合成酶叶绿体信号肽的核苷酸序列(SEQ IDNo：3，5’端被设计上BamHI酶切位点，3’端被设计上Xho Ⅰ位点，BamHI-Xho Ⅰ片段)与CaMV35S终止子(SEQ ID No：4，5’端被设计上Xho Ⅰ位点，3’端被设计上HindIII位点，Xho Ⅰ-HindIII酶切片段)连接，获得包括基因(含信号肽)和终止子的BamHI-HindIII片段。
CaMV的35S启动子(包含水稻actin的内含子)p35s-actinintron，以实验室保存的PMD19-35Sints质粒为模板，使用引物35S-KpnIF(5′GGTACCATGGTGGAGCACGACACTCTC 3′，添加了KpnI位点)和引物35S-BamHIR(5′GGTACCCCCTTGCGGGGATCGGTGG 3′，添加了KpnI位点)扩增获得(SEQ ID No：6)。p35s-actinintron启动子经KpnI和BamHI酶切后与基因-终止子片段(BamHI-HindIII)共同连接到经KpnI和HindIII酶切的pCambia1300载体中，获得T-DNA载体pCam-p35s-actinintron-G10evo-T35S。
编码杀虫蛋白质的核苷酸序列cry2Ab(SEQ ID No：2，5’端被设计上BamHI酶切位点，3’端被设计上Xho Ⅰ位点，BamHI-Xho Ⅰ片段)与CaMV 35S终止子(SEQ ID No：4，5’端被设计上Xho Ⅰ位点，3’端被设计上KpnI位点，Xho Ⅰ-KpnI酶切片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。
水稻actin启动子(pActin)经过HindIII和BamHI酶切后与基因和终止子片段(BamHI-KpnI片段)共连接到经KpnI酶切的pCam-p35s-actinintron-G10evo-T35S中，获得T-DNA载体pCam-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-actinintron-G10evo-T35S。
编码杀虫蛋白质的核苷酸序列cry1Ab(SEQ ID No：1，5’端被设计上BamHI酶切位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI片段)与玉米的pepc终止子(SEQ ID No：5，5’端被设计上SacI位点，3’端被设计上KpnI位点，SacI-KpnI酶切片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。玉米ubiquitin-1启动子pZmUbi从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：
ZmUbiF(5’GGTACCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC，添加了KpnI位点)。
ZmUbiR(5’GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG，添加了BamHI位点)。
玉米ubiquitin-1启动子pZmUbi经过KpnI和BamHI酶切后和基因-终止子片段(BamHI-KpnI片段)共同连接到经过KpnI酶切的pCam-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-actinintron-G10evo-T35S载体中，获得T-DNA载体pCam-pZmUbi-1-cry1Ab-PepcT-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-actinintron-G10evo-T35S，如图1。
将获得的pCam-pZmUbi-1-cry1Ab-PepcT-pActin-cry2Ab-T35S
-p35s-actinintron-G10evo-T35S载体电击转化农杆菌LBA4404，获得含有植物转化载体的若干菌株，用于转基因作物侵染。
实施例2、转基因抗虫耐除草剂玉米的获得
玉米转化事件所用的方法是农杆菌介导方法，根据Frame等报道的方法和培养基配方(Plant Physiol,2002,129:13-22)进行转化，具体步骤如下：取授粉后8～10天的Hi-2玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)，将含有T-DNA载体pCam-pZmUbi-1-cry1Ab-PepcT-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-intron-
G10evo-T35S的农杆菌与未成熟胚共培育2～3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(含200mg/L的timentin杀农杆菌)，28℃暗培养10～14天。将所有的愈伤组织转移到带有50ng/ml潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。
转移所有的组织到含2-4mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。随后转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10～14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10～14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全。移植到温室，获得种子，用于后续研究和应用。
实施例3、转基因抗虫耐除草剂水稻的获得
转基因植物的获得方法是根据文献中的方法和培养基配方(卢雄斌龚祖埙，1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含T-DNA载体pCam-pZmUbi-1-cry1Ab-PepcT-pActin-cry2Ab-T35S-p35s-intron-G10evo-T35S的农杆菌划板，挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含抗生素的筛选培养基上，筛选培养(50ng/mL潮霉素)两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织转移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，获得含有cry1Ab、cry2Ab和G10evo基因的植株。
实施例4、转基因玉米抗虫能力的测定
试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入cry1Ab、cry2Ab和G10evo基因的抗虫耐草甘膦转基因品系GAB。对照为非转基因亲本材料瑞丰-1。
实验室抗虫能力测定：不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天喷洒草甘膦确定是转基因后，各取10株，每株接1龄玉米螟10个，6天后观察死亡率。亚洲玉米螟来自中国农业科学院植物保护研究所玉米害虫组。将卵块至于28±1℃，RH 70±5％，16h:8h(L:D)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。棉铃虫来自是河南科云生物农药(河南济源白云实业有限公司)，为实验室人工饲料培育。
大田抗虫试验条件和方法：在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接亚洲玉米螟初孵幼虫。将黑头卵块(约40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中期接虫后10d，20d调查食叶级别。
抗虫分级：采用9级标准(Marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。转基因玉米的杂草防治通过喷施草甘膦实施，而常规玉米在草甘膦喷洒后10天进行人工除草。
抗虫测定结果：
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接亚洲玉米螟初孵幼虫。抗虫水平测定结果如表1。
表1转基因抗虫耐除草剂玉米抗玉米螟等级鉴定
*玉米螟的死亡率。
抗棉铃虫能力：在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接棉铃虫。观察玉米的抗棉铃虫能力。试验结果如下表所示：
表2转基因抗虫耐除草剂玉米抗棉铃虫等级鉴定
*棉铃虫的死亡率
人工接虫的转基因植株上没有发现成活进入3龄以上的棉铃虫，也没有植株被危害的症状。而对照玉米上每株都有进入3龄或者更加后期的棉铃虫，并且叶片或者花丝有明显的被取食的危害状。
在没有人工接虫也没有使用农药条件下，我们调查了“GAB-3”和“GAB-8”转基因玉米各200株，转基因植株没有发现明显的棉铃虫危害，但是对照玉米发现32％的植株有棉铃虫危害。其中11％对照玉米在幼苗期被棉铃虫严重危害而死亡。
此外，我们还进行了转基因植物叶片离体抗虫性测定。在出苗2-3个星期的第3代和第5代的转基因玉米上采取玉米叶片，每个叶片人工接虫10玉米螟或者龄棉铃虫在培养箱中保温培养。结果表明，GAB-3、GAB-7、GAB-8、GAB-28和GAB-65的抗虫都为100％。玉米螟和棉铃虫在这些转化体的叶片上没有明显取食，死亡率为100％，如图2。
实施例5、转基因玉米抗草甘膦能力的测定
试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入cry1Ab、cry2Ab和G10evo基因的抗虫耐草甘膦转基因品系GAB。对照为非转基因亲本材料瑞丰-1。
大田抗草甘膦性能测定：转基因玉米和常规玉米种子在发芽后20-30天，4-5叶时期，分别喷施体积比1：100和1：200稀释的41％草甘膦异丙胺盐(孟山都公司)，剂量为40L/亩，7天后记录玉米生长发育情况和死亡率。
通过在4-6叶期间大田喷施草甘膦，测定了不同代次的转基因玉米的抗草甘膦能力。结果见表3。
表3转基因抗虫耐除草剂玉米耐草甘膦能力试验*
*:每亩喷施40L的1：100或者1：200稀释的农达(41％草甘膦，孟山都产品)。
结果表明，转基因玉米的抗草甘膦水平在不同的转化体相差比较大。GAB-7和GAB-65的抗性水平比较高，其在每亩喷施40L的1：100稀释的农达(41％草甘膦异丙胺盐，孟山都)的条件下没有对转基因玉米有可以看到的不利影响。
还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1953
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcata gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380
gagttcaaca acatcatccc cagcagccag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440
aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500
cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560
cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620
atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680
ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740
agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800
cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860
cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920
accgactacc acatcgatca ggtgcgaggc taa 1953
<210> 2
<211> 1947
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
gatccaacca tggcttccgt gctcaactcc ggccgcacca ccatctgcga cgcctacaac 60
gtggccgctc acgacccttt ctccttccag cacaagtccc tcgacaccgt gcagaaggag 120
tggacagagt ggaagaagaa caaccactct ctctacctcg acccaatcgt gggcaccgtg 180
gcctccttcc tcctcaagaa ggtgggctcc ctcgtgggaa agcgcatcct ctccgagctt 240
cgcaacctca tcttcccgtc cggctccact aacctcatgc aggacatcct ccgcgagacc 300
gagaagttcc tcaaccagcg cctcaacacc gacactctcg ctcgcgtgaa cgccgagcta 360
accggcctcc aggccaacgt ggaggagttc aaccgtcagg tggacaactt cctcaacccg 420
aaccgcaacg ccgtgccgct ctccatcacc tcttccgtga acaccatgca gcagctcttc 480
ctcaaccgcc ttccgcagtt ccagatgcag ggctaccagc ttctcctact ccctctcttc 540
gcccaggctg ccaacctcca cctctctttc atccgcgacg tgatcctcaa cgccgacgag 600
tggggcatct ccgctgccac cctccgcacc taccgcgact acctcaagaa ctacacccgc 660
gactactcca actactgcat caacacctac cagtccgcct tcaagggcct caacacccgc 720
ctccacgaca tgctcgaatt ccgcacctac atgttcctca acgtgttcga gtacgtgtcc 780
atctggtccc tcttcaagta ccagtccctc ctcgtgtcct ccggcgccaa cctctacgcc 840
tccggctccg gcccgcagca gacccagtcc ttcacctccc aggactggcc gttcctctac 900
tccctcttcc aggtgaactc caactacgtg ctcaacggct tctccggcgc ccgcctctcc 960
aacaccttcc cgaacatcgt gggcctccct ggctccacaa ctacccacgc cctcctcgcc 1020
gctcgcgtga actactccgg tggcatctct tccggcgaca tcggcgcttc cccgttcaac 1080
cagaacttca actgctctac cttcctccct ccgctcctca caccgttcgt gcgctcctgg 1140
ctcgactccg gctccgaccg cgagggcgtg gctaccgtga ccaactggca gaccgagtcc 1200
ttcgagacca ccctcggcct ccgctccggt gccttcaccg cacgcggcaa ctccaactac 1260
ttcccggact acttcatccg caacatctcc ggcgtgccgc tcgtggtgcg caacgaggac 1320
ctccgtcgcc cactccacta caacgagatc cgcaacatcg cctccccgtc cggcacccct 1380
ggaggtgcac gcgcttacat ggtgtccgtg cacaaccgca agaacaacat ccacgctgtg 1440
cacgagaacg gctccatgat ccacctcgct ccaaacgact acaccggctt caccatctcc 1500
ccgatccacg ctacccaggt gaacaaccag acccgcacct tcatctccga gaagttcggc 1560
aaccagggcg actctctccg cttcgagcag aacaacacca ccgctcgtta caccctccgc 1620
ggtaacggca actcctacaa cctctacctc cgcgtgtctt ccatcggcaa ctccaccatc 1680
cgcgtgacca tcaacggccg tgtgtacacc gccacaaacg tgaacaccac cacaaacaac 1740
gacggcgtga acgacaacgg tgctcgcttc tccgacatca acatcggcaa cgtggtggcc 1800
tcctccaact ccgacgtgcc gctcgacatc aacgtgaccc tcaactctgg cacacagttc 1860
gacctcatga acatcatgct cgtgccgacc aacatctccc cgctctacta atagatgccg 1920
accggatctg tcgatcgaca aggagct 1947
<210> 3
<211> 1320
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
ggatccgacg ccctgcccgc caccttcgac gtgatcgtgc atccagctcg cgaactccgc 60
ggcgagcttc gcgctcagcc atccaagaac tacaccactc gctacctcct cgccgctgcc 120
ctcgctgagg gcgagacccg cgtggtgggc gtggctacct ctgaggacgc cgaggccatg 180
ctccgctgcc tccgcgactg gggcgctggc gtggagcttg tgggcgatga cgccgtgatc 240
cgcggtttcg gcgctcgccc acaggccggt gtgaccctca acccaggcaa cgctgccgcg 300
gtggcccgcc tcctcatggg cgtggccgct ctcacctctg gcaccacttt cgtgaccgac 360
tacccggact ccctcggcaa gcgccctcag ggcgacctcc ttgaggccct cgaacgcctc 420
ggtgcctggg tgtcctccaa cgacggtcgc ctcccgatct ccgtgtccgg cccagtgcgc 480
ggtggcaccg tggaggtgtc cgccgagcgc tcctcccagt acgcctccgc cctcatgttc 540
ctcggccctc tcctcccgga cggactcgaa ctccgcctca ccggcgacat caagtcccac 600
gctccgctcc gccagacact cgacaccctc tctgacttcg gcgtgcgcgc cactgcctcc 660
gacgacctcc gccgcatctc catcccgggt ggccagaagt accgcccagg ccgcgtgctc 720
gtgccgggcg actacccggg ctccgctgcc atcctcaccg ccgctgccct cctcccaggc 780
gaggtgcgcc tctctaacct ccgcgagcac gacctccagg gcgagaagga ggccgtgaac 840
gtgctccgcg agatgggcgc tgacatcgtg cgcgagggcg ataccctcac cgtgcgcggt 900
ggccgccctc tccacgccgt gactcgcgac ggcgattcct tcaccgacgc cgtgcaagcc 960
ctcaccgccg ctgctgcctt cgccgagggc gacaccacct gggagaacgt ggccactctc 1020
cgcctcaagg agtgcgaccg catctctgac acccgcgctg agcttgagcg cctcggcctc 1080
cgcgcacgcg agaccgccga ctctctctcc gtgactggct ctgctcacct cgctggtggc 1140
atcaccgccg acggccacgg cgaccaccgc atgatcatgc tcctcaccct cctcggcctc 1200
cgcgcagacg ctccactccg catcaccggc gcacaccaca tccgcaagtc ctaccctcag 1260
ttcttcgctc acctcgaagc cctcggcgct cgcttcgagt acgctgaggc caccgcctaa 1320
<210> 4
<211> 208
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
tcgagtttct ccataataat gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata 60
gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa 120
tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc 180
ccccgaatta atttgaggta ccaagctt 208
<210> 5
<211> 203
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
gagctctaga tctgttctgc acaaagtgga gtagtcagtc atcgatcagg aaccagacac 60
cagactttta ttcatacagt gaagtgaagt gaagtgcagt gcagtgagtt gctggttttt 120
gtacaactta gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc 180
taaaaccaaa atccaggggt acc 203
<210> 6
<211> 1310
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
aagcttatgg tggagcacga cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggctattga gacttttcaa acttttcaac aaagggtaat atcgggaaac 120
ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatca aaaggacagt agaaaaggaa 180
ggtggcacct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca agatgcctct 240
gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac 300
gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgaac atggtggagc acgacactct 360
cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt 420
tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 480
catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 540
aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 600
gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 660
tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc 720
ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc agtctctctc 780
tacaaatcta tctctctcga gctcctcccc cctccccctc cgccgccgcc gcgccggtaa 840
ccaccccgcc cctctcctct ttctttctcc gttttttttt tccgtctcgg tctcgatctt 900
tggccttggt agtttgggtg ggcgagaggc ggcttcgtgc gcgcccagat cggtgcgcgg 960
gaggggcggg atctcgcggc tggggctctc gccggcgtga gtcggcccga atcctcgcgg 1020
ggaatggggc tctcggatgt agatctgcga tccgccgttg ttgggggaga tgatgggggg 1080
tttaaaattt ccgccatgct aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta 1140
tatttttata tatttctgct gcctcgtcag gcttagatct gctagatctt tctttcttct 1200
ttttgtgggt agaatttgaa tccctcagca ttgttcatcg gtagtttttc ttttcatgat 1260
ttgtgacaaa tgcagcctcg tgcggagctt ttttgtaggt aggatctacc 1310
Claims (6)
1.一种抗虫耐草甘膦表达载体，其特征在于所述表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ab和草甘膦抗性基因G10evo；所述抗虫基因cry1Ab核苷酸序列为SEQ ID No：1所示；所述cry2Ab核苷酸序列为SEQ ID No：2所示；所述草甘膦抗性基因G10evo的核苷酸序列为SEQ ID No：3所示。
2.如权利要求1所述的抗虫耐草甘膦表达载体，其特征在于所述表达载体包含启动抗虫基因cry1Ab表达的玉米泛素启动子pZmUbi，终止该基因表达的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶终止子PepcT；启动抗虫基因cry2Ab表达的水稻actin1启动子，终止该基因表达的CaMV35S终止子T35S；启动草甘膦抗性基因G10evo表达的CaMV35S启动子p35S-actinintron，终止该基因表达的CaMV35S终止子T35S；所述CaMV35S启动子p35S-actinintron核苷酸序列为SEQ ID No：6所示。
3.如权利要求2所述的抗虫耐草甘膦表达载体，其特征在于所述表达载体是以pCambia1300载体为骨架构建的。
4.一种含有权利要求1所述抗虫耐草甘膦表达载体的质粒。
5.一种权利要求1所述抗虫耐草甘膦表达载体在制备抗虫耐草甘膦植物细胞中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为水稻、玉米或棉花。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611266854.XA CN106916844B (zh) | 2016-12-31 | 2016-12-31 | 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611266854.XA CN106916844B (zh) | 2016-12-31 | 2016-12-31 | 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106916844A CN106916844A (zh) | 2017-07-04 |
| CN106916844B true CN106916844B (zh) | 2020-08-04 |
Family
ID=59453369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611266854.XA Active CN106916844B (zh) | 2016-12-31 | 2016-12-31 | 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106916844B (zh) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106591352B (zh) * | 2016-11-21 | 2020-05-05 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 杀虫蛋白组合及其管理昆虫抗性的方法 |
| CN110144363B (zh) | 2018-02-11 | 2022-11-18 | 中国种子集团有限公司 | 抗虫耐除草剂玉米转化事件 |
| CN108998467A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-12-14 | 浙江大学 | 一种抗虫基因t-dna载体及其应用 |
| CN109182369B (zh) * | 2018-08-03 | 2021-01-12 | 浙江大学 | 一种多抗除草剂表达载体、转化子及其应用 |
| CN109182370B (zh) * | 2018-08-03 | 2022-06-17 | 浙江大学 | 一种植物多基因表达载体、转化子及其应用 |
| CN111171118B (zh) * | 2019-12-23 | 2021-08-06 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 一种植物抗虫基因mCry2Ab及其载体和应用 |
| CN111944882B (zh) * | 2020-08-14 | 2023-05-02 | 浙江省农业科学院 | 转基因抗虫玉米gab-3转化体的定量pcr检测方法及试剂盒 |
| CN112094932B (zh) * | 2020-08-14 | 2022-08-30 | 浙江省农业科学院 | 转基因抗虫玉米gab-3转化体的定性pcr检测方法及试剂盒 |
| CN112359123A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-02-12 | 浙江省农业科学院 | 转g10evo-epsps基因大豆实时荧光定量检测方法及其试剂盒 |
| WO2022094790A1 (zh) * | 2020-11-04 | 2022-05-12 | 中国农业大学 | 玉米事件2a-7及其鉴定方法 |
| CN112626111B (zh) * | 2020-11-20 | 2023-06-20 | 浙江大学 | 一种除草剂抗性基因表达载体及其应用 |
| CN112899392B (zh) * | 2021-03-10 | 2022-05-13 | 浙江大学 | 用于转基因抗虫抗草甘膦棉花的特异性鉴定分子标记的引物组及其应用 |
| CN115449520A (zh) * | 2021-06-09 | 2022-12-09 | 杭州芳韵生物科技有限公司 | 一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用 |
| CN115449521A (zh) * | 2021-06-09 | 2022-12-09 | 杭州芳韵生物科技有限公司 | 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用 |
| CN113980989B (zh) * | 2021-11-26 | 2022-09-09 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种转基因抗虫耐除草剂玉米及其培育方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1478897A (zh) * | 2003-07-04 | 2004-03-03 | 中山大学 | 一种植物多基因表达载体、含有该载体的转化子及其应用 |
| CN105200067A (zh) * | 2015-09-25 | 2015-12-30 | 浙江大学 | 水稻转化事件g6h1及其特异性pcr鉴定方法 |
| CN106167818A (zh) * | 2015-05-22 | 2016-11-30 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 一种玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8729336B2 (en) * | 2009-01-23 | 2014-05-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Protein mixtures for maize insect control |
-
2016
- 2016-12-31 CN CN201611266854.XA patent/CN106916844B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1478897A (zh) * | 2003-07-04 | 2004-03-03 | 中山大学 | 一种植物多基因表达载体、含有该载体的转化子及其应用 |
| CN106167818A (zh) * | 2015-05-22 | 2016-11-30 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 一种玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用 |
| CN105200067A (zh) * | 2015-09-25 | 2015-12-30 | 浙江大学 | 水稻转化事件g6h1及其特异性pcr鉴定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Expression of Cry1Ab and Cry2Ab by a polycistronic transgene with a self-cleavage peptide in rice;Qichao zhao等;《PLOS ONE》;20141015;第9卷(第10期);e110006 * |
| 抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育;孙越，等;《农业生物技术学报》;20150131;第23卷(第1期);第52-60页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106916844A (zh) | 2017-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106916844B (zh) | 一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用 | |
| Tang et al. | Development of insect-resistant transgenic indica rice with a synthetic cry1C* gene | |
| AU2014350741B2 (en) | Method for controlling pest | |
| WO2016188332A1 (zh) | 一种玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用 | |
| CN112852801B (zh) | 转基因玉米事件lp007-1及其检测方法 | |
| WO2016173361A1 (zh) | 玉米植物dbn9936及用于检测其的核酸序列和方法 | |
| WO2020207125A1 (zh) | 用于检测玉米植物dbn9501的核酸序列及其检测方法 | |
| WO2016173362A1 (zh) | 玉米植物dbn9978及用于检测其的核酸序列和方法 | |
| CN111606984B (zh) | 一种植物抗虫蛋白及其编码基因和应用 | |
| WO2021026689A1 (zh) | 用于检测大豆植物dbn8007的核酸序列及其检测方法 | |
| CN112831585A (zh) | 转基因玉米事件lp007-4及其检测方法 | |
| WO2021026688A1 (zh) | 用于检测大豆植物dbn8002的核酸序列及其检测方法 | |
| BR102013031822B1 (pt) | método para o controle de sesamia inferens | |
| CN112280743B (zh) | 玉米事件2a-7及其鉴定方法 | |
| CN115449521A (zh) | 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用 | |
| CN112877454A (zh) | 转基因玉米事件lp007-3及其检测方法 | |
| CN113151534A (zh) | 转基因玉米事件lp007-5及其检测方法 | |
| CN109776659B (zh) | cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用 | |
| WO2023155193A1 (zh) | 用于检测大豆植物dbn8205的核酸序列及其检测方法 | |
| CN116410977A (zh) | 抗虫耐草甘膦转基因玉米事件kj1172及其检测方法 | |
| CN111826364B (zh) | 一种抗病虫害相关基因及其应用 | |
| Jin et al. | Transgenic japonica rice expressing the cry1C gene is resistant to striped stem borers in Northeast China | |
| WO2022094790A1 (zh) | 玉米事件2a-7及其鉴定方法 | |
| WO2016173360A1 (zh) | 玉米植物dbn9927及用于检测其的核酸序列和方法 | |
| CN109234307A (zh) | 杀虫蛋白的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |