CN105200067A - 水稻转化事件g6h1及其特异性pcr鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻转化事件G6H1及其特异性PCR鉴定方法，所述转化事件以SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ？ID？NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区；本发明提供一种优良的水稻转化事件G6H1，该转化事件可实现将外源基因特异性引入到水稻中，赋予受体水稻具有抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因在受体水稻中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体水稻的农艺性状不会产生不良影响。

Description

水稻转化事件G6H1及其特异性PCR鉴定方法

(一)技术领域

本发明涉及一种水稻转化事件及其特异性鉴定方法，特别涉及一种水稻转化事件G6H1及其特异性PCR检测方法。

(二)背景技术

水稻是一种重要的粮食作物。随着植物基因工程的发展，通过导入外源基因来进行遗传改造成为遗传育种的主要手段之一。在水稻生产中，抗虫和抗除草剂都是非常需要的农艺性状。抗虫转基因水稻能够大幅度地降低化学杀虫剂的使用量，从而降低生产成本并且减少农药对环境和农作物产品的污染。

抗草甘膦水稻可以大幅度降低防治杂草所需要的农业劳动力，降低劳动力的投入，减少杂草对水稻生长发育的影响。近年来水稻栽培方法的变化使杂草问题变得严重，目前已经成为水稻生产中的重要问题。特别是直播稻和免耕法的推广使杂草有了相当好的发芽和繁殖机会，在很多地区已经造成杂草的严重发生。免耕法使杂草种子、杂草稻、野生稻种子在大田中的成活能力得到提高。尽管选择性除草剂的使用能够部分地解决杂草问题，但是杂草问题仍然没有得到根本性的解决。例如南方沿海地区的杂草稻和野生稻和栽培水稻非常相似，市场上仍然没有良好的除草剂选择性杀灭杂草稻。因此抗草甘膦转基因水稻的应用可以使稻田杂草防治变得更为简单、高效和低成本。

利用外源基因转化植物时，因为外源基因在染色体上随机插入，往往得到的是一个转化体群体。通常把外源基因在基因组插入位点的侧翼区序列不同的转化子称为独立转化事件。转化体群体中包含大量独立的转化事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。因此相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异，而且外源基因的插入还可能影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。目前并不清楚外源基因在植物中的插入位点整合规律，在研发过程中需要产生数百乃至数千的不同转化事件，并从中筛选具有预期转基因表达水平和模式，且不影响植株本身农艺性状的独立转化事件。在抗虫抗草甘膦转基因水稻培育中，获得优良的独立转化事件在生产应用上具有重要的价值。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种优良的水稻转化事件G6H1，该转化事件可实现将外源基因引入到水稻品种中，赋予受体水稻具有抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因在受体水稻中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体水稻的农艺性状不会产生不良影响。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种在水稻基因组特定位点中单拷贝插入外源基因序列的水稻转化事件G6H1，所述转化事件以SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。本发明所述转化事件是利用农杆菌侵染法，将含有抗虫抗草甘膦基因表达框的T-DNA导入水稻细胞中，通过再生含有外源基因的水稻细胞获得水稻转基因群体。利用分子生物学方法筛选抗虫基因和抗草甘膦基因表达量都高的转化株系，并通过生物测定的方法筛选抗虫性能和抗草甘膦性能都能够满足生产需要的转化事件，从而获得具有良好抗虫性能和高抗草甘膦能力的水稻转化事件G6H1。

进一步，所述外源基因包括抗虫基因和抗草甘膦基因，所述抗虫基因由二个Bt基因组成，优选抗虫基因由基因Cry1Ab和基因Vip3H融合而成，核苷酸序列为SEQIDNO.4中的2268-6566bp部分，优选所述抗草甘膦基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4中8787-10323bp部分。

进一步，优选本发明所述外源基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。

本发明还提供一种含水稻转化事件G6H1的水稻细胞，构建含有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的T-DNA载体，然后通过农杆菌侵染法将T-DNA导入水稻细胞，筛选获得含有水稻转化事件G6H1的水稻细胞。本发明构建的含有水稻转化事件G6H1的水稻细胞的受体水稻具有抗虫抗草甘膦能力，特别赋予受体水稻具有抗稻纵卷叶螟抗草甘膦能力。

本发明提供的转化事件G6H1是由插入T-DNA左臂侧翼的水稻基因组序列SEQIDNO.1、外源基因T-DNA序列(不包括载体框架，左边界含部分pZmUbi-1序列)SEQIDNO.2和插入T-DNA右臂侧翼的水稻基因组序列SEQIDNO.3构成，其核苷酸序列为SEQIDNO.7。该转化事件通过遗传转化方法获得。在遗传转化过程中，外源基因核苷酸被随机地整合在植物基因组中，获得的转化事件是独特的而且能够稳定遗传。这种转化事件可以通过有性杂交或体细胞杂交技术重组到不同的水稻种质资源中去，实现对水稻的改良。本领域的技术人员可以理解，通过天然或人工的方式，在所述转化事件的基础上通过插入、缺失、取代、替换、添加一个或多个碱基获得功能等同的亚结构，也属于本发明的范围之内。

本发明提供的转化事件G6H1含有能赋予转基因水稻具有抗虫抗草甘膦能力的抗虫表达框和抗草甘膦表达框。

本发明提供的抗虫基因是由cry1Ab和Vip3H基因融合获得，融合基因全长为4299bp，核苷酸序列为载体序列(SEQIDNO.4)中的2268-6566bp，所编码的蛋白质由1433个氨基酸残基组成，蛋白分子量大小约为159kDa。编码的氨基酸序列为SEQIDNO.5。Cry1Ab是一种杀虫能力比较强的Bt晶体杀虫蛋白质，Vip3类杀虫蛋白质和目前已经商业化种植抗虫植物杀虫蛋白质的杀虫机理是不同，因此其融合蛋白具有提高杀虫活性，延缓害虫交互抗性的产生，有利于抗虫转基因水稻的长期有效利用。

本发明提供了一种抗虫表达框，该表达框由玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)、抗虫融合基因cry1Ab-Vip3和玉米PEPcarboxylase基因(pepc)终止子构成。其中玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)大小为2.1kb，核苷酸序列为载体序列(SEQIDNO.4)中的204-2263bp，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。PEPcarboxylase基因(pepc)终止子，来源于玉米，大小为0.2kb，核苷酸序列为载体序列(SEQIDNO.4)中的6570-6767bp。

本发明提供的抗草甘膦基因是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。草甘膦是一种广谱灭生性除草剂，它通过抑制植物中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性，导致植物不能合成芳香族氨基酸而死亡。为了方便杂草控制，通过在作物转入对草甘膦具有抗性的EPSPS可以使作物获得抗草甘膦的能力，实现在农作物生长的同时选择性地除草。本发明提供的抗草甘膦表达框是由玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)，5’端连有一段编码AHAS基因叶绿体信号肽的G170(EPSPS)(核苷酸序列为载体序列(SEQIDNO.4)中8795-10323bp，编码的氨基酸序列为SEQIDNO.6)和PEPcarboxylase基因(pepc)终止子(载体序列SEQIDNO.4中10327-10516bp)构成。

本发明提供能够特异性检测样品中是否含有转化事件G6H1存在的方法，包括如下方法中的至少一种：

1)根据SEQIDNO.7(即SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的联合)设计特异性PCR检测引物，如用于检测外源基因左侧是否与水稻基因组特异性位点连接的LB-SP4和RiceG8-R，用于检测外源基因右侧是否与水稻基因组特异性位点连接的特异性引物RB-SP和RiceG8-GB。

左侧翼检测引物:

RiceG8-R(5’TCGATCTGCTGCAGCTTGGTGCCGG，水稻基因组中)；

LB-SP4(5’TGGTTGGTGTCCGTTAGACTCGTCGA，T-DNA左边界)；

PCR产物的长度计算为：188bp。

右侧翼检测引物:

RiceG8-GB:(5’TATAAGTGTTCCCTCCCCTGTTTCAAC，水稻基因组中)；

RB-SP：(5’CGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA，T-DNA右边界)；

PCR产物的长度计算为：468bp。

本发明所述PCR反应体系为：

PCR反应条件为：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。

2)提取植物基因组DNA经限制性内切酶KpnI单酶切；以地高辛标记的抗草甘膦基因G170(SEQIDNO.4中8787-10323bp)基因全长DNA作为探针，检测抗草甘膦基因是否存在。

或提取植物基因组DNA经过限制性内切酶SmaI单酶切，地高辛标记的cry1Ab全长DNA作为探针(SEQIDNO.4中的2268-4220bp)，杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影，检测抗虫基因是否存在。DNA提取、探针制作方法和Southern杂交方法依据J.萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》。

3)从植物中提取蛋白质，用抗虫蛋白或抗草甘膦蛋白抗体为一抗，进行Western分析，检测抗虫蛋白或抗草甘膦蛋白的表达水平。蛋白提取方法、Western方法遵照J.萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》的方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种优良的水稻转化事件G6H1，该转化事件可实现将外源基因特异性引入到水稻品种中，赋予受体水稻具有抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因在受体水稻中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体水稻的农艺性状不会产生不良影响。

(四)附图说明

图1、实施例1中含目的基因的质粒结构图，LB和RB：T-DNA的边界序列；pZmUbi-1：玉米polyubiqutin-1启动子；G170-AHAS：抗草甘膦EPSPS基因；Cry1Ab/Vip3H：抗虫Bt融合基因cry1Ab/Vip3H。

图2、抗虫抗草甘膦水稻基因组Southern杂交后的荧光显影图；基因组经SmaI单酶切；以地高辛标记的Cry1Ab的DNA作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影；图右侧为DNA长度标准(bp)标记。

图3、抗虫抗草甘膦水稻基因组Southern杂交后荧光显影图；基因组DNA经过KpnI酶切，地高辛标记的G170全长DNA作为探针，杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影，图右侧为DNA长度标准(bp)。

图4、Western分析抗虫蛋白质Cry1Ab/Vip3H在不同组织器官中的表达水平；+为阳性对照；-为阴性对照(非转基因水稻)；M为蛋白质分子量标准(kD)；材料：G6H1，叶片、茎、根的上样量是相同的鲜重，种子是以20％的量上样；箭头指杀虫蛋白质的信号带。

图5、Western分析抗草甘膦基因G170在不同组织器官中的表达水平；+为阳性对照(Escherichiacoli表达)；-为阴性对照(非转基因)；M为蛋白质分子量标准；材料：叶片、茎、根的上样量是相同的鲜重，种子是以20％的量上样；箭头指杀虫蛋白质的信号带。

图6、转基因水稻左侧翼PCR插入位点的PCR验证电泳图；-，空白对照，+，阳性对照，1-10：非转基因常规水稻10株，11-20：转基因水稻G6H1后代。根据DNA长度标准(100bp)，转基因水稻的PCR产物和理论188bp一致。转基因植株中的阴性(15、17)可能是杂合子分离产生。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：转化事件的获得

(1)含有外源基因的质粒载体的获得

本发明用于水稻转化的载体图谱如图1所示，转化质粒载体核苷酸序列为SEQIDNO.4，具体载体组成元件的名称、位置如表1所示。其中T-DNA基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2所示。SEQIDNO:2包含完整的抗草甘膦表达框和抗虫表达框，具体由如下部分组成，抗草甘膦表达框：玉米Polyubiqutin-1启动子驱动5’端连有一段编码AHAS基因叶绿体信号肽的抗草甘膦基因G170(EPSPS)(载体序列SEQIDNO.4中8795-10323bp部分)，终止子为来源于玉米的PEPcarboxylase基因(pepc)终止子(长度为0.2kb，其核苷酸序列为载体序列SEQIDNO.4中10327-10516bp部分)；抗虫表达框：Cry1Ab/Vip3H融合基因，驱动Cry1Ab-Vip3融合基因的启动子为来源于玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)(通过PCR从玉米基因组获得，大小为2.1kb，核苷酸序列为载体序列SEQIDNO.4中的204-2263bp部分，pZmUbi-1可驱动目的基因在所有植物组织中表达)，终止子为来源于玉米的PEPcarboxylase基因(pepc)终止子(大小为0.2kb，核苷酸序列为载体序列SEQIDNO.4中的6570-6767bp部分)。利用电击法(2500V)将获得的转化质粒导入农杆菌LBA4404中，获得含有转化载体的重组农杆菌。

表1水稻转化载体组成元件的名称、位置和功能

(2)水稻遗传转化

本研究中获得水稻转化事件所用的方法是采用农杆菌侵染法，根据Zhao等报道的方法和培养基配方(AgriculturalSciencesinChina,2011,10(9):1307-1312)进行转化，具体步骤：选取成熟饱满的水稻种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含目的基因的重组农杆菌划板，挑单菌落接种培养转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入农杆菌液中，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2-3天，用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基上，筛选培养两个月。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养10天，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株移栽到温室，用于筛选分析。

实施例2：转化事件G6H1的筛选

通过农杆菌介导获得了160个抗虫抗草甘膦水稻独立转化体(实施例1)。根据载体序列(SEQIDNO.4设计引物，用PCR方法筛选含有抗草甘膦基因G170和抗虫基因cry1Ab-Vip3，同时不含载体骨架序列的水稻转化体，并在温室中进行抗虫抗草甘膦性能的初步测试：通过喷施0.4wt％的草甘膦，去除草甘膦抗性差的转化体，在剩余的转化体上接稻纵卷叶螟，筛选没有稻纵卷叶螟为害的转化体，共计获得含转化事件G6H1～G6H8等8个转化事件具有较强抗虫抗草甘膦能力的水稻转化体。

(1)草甘膦抗性筛选

选择8个含转化事件G6H1～G6H8的转化体的T1转基因水稻进行草甘膦抗性对比。转基因水稻发芽后20-30天，排水，喷1：50稀释的10％草甘膦(孟山都公司，美国，800mL/亩)，7天后记录死亡率。草甘膦喷施试验结果如表2所示，转基因品系都具有明显的抗草甘膦能力。除转化事件G6H7植株矮化外，草甘膦对其它转化事件生长发育没有影响。

表2.水稻草甘膦抗性试验

(2)抗虫性能测试

分别选择8个含转化事件G6H1～G6H8的转化体，选择转基因水稻心叶叶片在实验室进行抗虫性能测定。接粘虫2天后调查粘虫取食和死亡情况。结果见表3所示，结果显示大部分转基因水稻抗性良好。特别是G6H1、G6H2、G6H5、G6H7和G6H8接虫2天后没有明显的取食痕迹。接虫4天以后转基因水稻上粘虫死亡率达到100％。

表3：转基因水稻对粘虫的抗虫性

(3)外源基因插入拷贝数鉴定

综合抗虫和抗草甘膦测定结果，选择抗虫和耐草甘膦能力都比较强的G6H1、G6H2、G6H5和G6H8进行外源基因插入拷贝数鉴定。使用罗氏公司(DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII，Roche)进行Southern分析，按照试剂盒提供的操作步骤进行杂交探针制作和DNA杂交检测。即提取水稻基因组DNA，分别经过限制性内切酶SmaI酶切(在外源基因中具有单个内切酶识别位点)，在琼脂糖胶上电泳分离酶切片段，然后将DNA转移到尼龙基质膜上，利用地高辛标记的Cry1Ab全长DNA作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影。结果显示只有G6H1显示出单条带，G6H1在SmaI酶切时获得一条大约7.4kb的信号带(图2)，证明G6H1中抗虫基因是单拷贝插入。

利用T-DNA中抗草甘膦基因的G170作为探针对G6H1抗草甘膦基因拷贝数进行Southern杂交分析，用限制性内切酶KpnI对G6H1的基因组DNA进行单酶切，在琼脂糖胶上分离以后，转移到尼龙基质膜上，然后利用地高辛标记的G170作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影。结果显示，用KpnI酶切时获得一条大约7.2kb的信号带(图3)。

因此上述实验证明G6H1是一个抗虫基因和抗草甘膦基因都是单拷贝插入的转化事件。

(4)外源基因表达量分析

利用分子生物学常规方法对G6H1的抗性基因表达情况进行了Western方法测定。取G6H1的根、茎、叶和种子，分别利用Cry1Ab抗体和G170检测杀虫基因和抗草甘膦基因的表达水平(Western检测方法参照J.萨姆布鲁克的《分子克隆实验指南》)。结果表明，抗虫蛋白质在各种不同组织，包括叶片、茎、根和种子中均有表达，但是在种子中表达相对比较低，如图4。抗草甘膦蛋白质在水稻叶片上有较高的表达水平，如图5所示。

实施例3：外源基因插入位点侧翼序列的鉴定

使用Liu等报道的TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)方法(Liu，PlantJournal1995，8(3):457-463)对优良转化事件G6H1外源转基因DNA插入点两侧的区域序列进行测定。该方法通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR扩增，利用不同退火温度选择性地扩增目标片段。对扩增获得的DNA片段进行克隆、测序并与网上数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对分析。

T-DNA左侧翼区

鉴定为包含3’侧翼区的片段进行测序(SEQIDNO.8。核苷酸1-214bp之间的序列对应于水稻基因组DNA，核苷酸215-547bp是T-DNA带入的部分pZmUbi-1序列，548-723bp为外源DNA。

T-DNA右侧翼区

对通过TAIL-PCR方法获得的鉴定为包含5’侧翼区的片段进行测序(SEQIDNO.9)。核苷酸1-173bp的序列对应于外源DNA，核苷酸174-469bp的序列对应于水稻基因组DNA。

将上述经测序比对和验证过的插入位点上下游旁侧序列、外源抗虫基因表达框和抗除草剂基因表达框序列拼接形成本发明所述的转化事件，核苷酸序列为SEQIDNO.7(即SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的联合)。

(2)外源基因特异性检测

根据转化事件的核苷酸序列(SEQIDNO.7)设计可以用于特异性检测G6H1的PCR引物(如表4所示)。

表4.G6H1特异性检测引物

所述PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μL，dNTP混合物200μmol/L，正向引物10pmol，反向引物10pmol，基因组DNA0.1～2μg，TaqDNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加双蒸水至50μL。

PCR条件是：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。PCR的条件可以根据使用的酶和反应体系进行调整。对获得PCR产物进行琼脂糖电泳分析。左边界特意PCR产物为188bp时，说明检测样品中含有G6H1水稻转化事件，右边界特异PCR产物为468bp，说明检测样品中含有G6H1水稻转化事件。必要的时候可以将PCR产物进行序列测定进一步验证。

Claims (7)

1.一种水稻转化事件G6H1，其特征在于所述转化事件以SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。

2.如权利要求1所述的水稻转化事件G6H1，其特征在于所述外源基因包括抗虫基因和抗草甘膦基因。

3.如权利要求2所述的水稻转化事件G6H1，其特征在于所述抗虫基因由二个Bt基因组成。

4.如权利要求1所述的水稻转化事件G6H1，其特征在于所述外源基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。

5.一种水稻转化事件G6H1特异性的PCR鉴定方法，其特征在于所述用于水稻转化事件G6H1特异性PCR鉴定的引物为：

RB-SP：5’CGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA；

RiceG8-GB:5’TATAAGTGTTCCCTCCCCTGTTTCAAC；

LB-SP4：5’TGGTTGGTGTCCGTTAGACTCGTCGA；

RiceG8-R：5’TCGATCTGCTGCAGCTTGGTGCCGG。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系为：

PCR反应条件为：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。

7.一种含水稻转化事件G6H1的水稻细胞。