CN104099367A - 一种培育转基因抗虫水稻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及一种转基因抗鳞翅目害虫尤其是抗螟虫水稻的培育方法。利用SEQ ID NO：1所示的人工合成的新型杀虫基因cry2A作为目标基因，以bar基因为选择标记基因，采用农杆菌介导的遗传转化法，将目标基因导入水稻优良恢复系明恢63中，获得高抗水稻鳞翅目害虫尤其是抗螟虫的转基因水稻材料T2A-1。此外，可通过有性杂交和体细胞杂交等技术将T2A-1的抗虫基因重组到新的水稻种质中去，培育成水稻抗虫新品种(系)。本发明公开了转化载体构建，水稻遗传转化和转化植物的分子鉴定，插入位点的序列分析以及室内和田间抗虫试验等系列过程的验证试验。

Description

一种培育转基因抗虫水稻的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用农杆菌介导的遗传转化技术将外源基因导入水稻受体品种从而获得转基因抗虫水稻的方法。

背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一，是全球一半人口的主粮。全球每年种植的水稻面积超过了1.45亿公顷，我国的常年种植面积在3000万公顷左右。虫害是水稻(Oryza sativa L.)生产上水稻减产的主要原因之一。据统计，国内有记载的水稻害虫有385种，其中最主要的害虫有鳞翅目的二化螟(Chilosuppressalis)、三化螟(Tryporyza incertulas)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)。二化螟和三化螟主要危害水稻茎秆，在苗期和分蘖期造成枯心；在孕穗初期侵入，造成枯孕穗；在孕穗末期和抽穗初期侵入，造成白穗(Pathak 1977)。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)则以幼虫缀丝纵卷水稻叶片成虫苞，幼虫匿居其中取食叶肉，形成白色条斑。长期以来，水稻螟虫主要通过化学农药进行防治，不但增加了生产成本，而且造成了环境污染、生态破坏和危害人体健康等问题通过大规模的筛选，目前尚未在水稻中找到有效控制虫害的抗性基因资源。因此，通过转基因技术培育抗虫水稻是解决上述问题的最有效途径。

目前在转基因抗虫水稻培育上，最成功的例子就是表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)来源的杀虫蛋白的转基因水稻。Bt菌是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界如土壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中(贾士荣等，2001)。1901年，日本学者石渡从染病的家蚕体液中首次分离出Bt菌，并证明部分Bt对鳞翅目昆虫有杀虫活性。二十世纪50年代，人们发现Bt菌的杀虫活性与伴胞晶体有关(Hannay 1953)，并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成(Hannay和Fitz-James，1955)。这种蛋白通常被称作δ-内毒素(δ-endotoxins)或杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。杀虫晶体蛋白的分子量一般为130-140KD左右，其基因一般位于苏云金芽胞杆菌的质粒上。苏云金芽胞杆菌菌株通常含有不只一种杀虫晶体蛋白基因；而同种杀虫晶体蛋白基因可以在多种不同的菌株中存在。目前人们已从不同的Bt菌的亚种中分离出对不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目、螨类等)和无脊椎动物(如寄生线虫、原生动物等)有特异毒杀作用的杀虫晶体蛋白。

近年来基因工程技术的不断发展，通过在转基因植物中导入并表达苏云金芽胞杆菌δ-内毒素基因培育抗虫植物成为现实。相对于传统的Bt杀虫制剂，应用表达δ-内毒素的转基因植物有优点也有缺点。表达δ-内毒素的转基因抗虫植物可以在整个生长季节提供保护，对于钻到土壤下面或茎秆里面的害虫如欧洲玉米螟(European Corn Borer，ECB)或大部分时间都是躲在花或铃里的棉铃虫(Cotton Bollworm，CBW)也更有效。但是，相对于微生物制剂，转基因作物会对害虫造成更大的选择压力，更快导致抗性害虫的产生。在实验室中，已经有抗性害虫被筛选出来了。各种策略可以被采用以延缓和阻止害虫在田间产生抗性。与合成的化学杀虫剂相比，转基因植物或微生物杀虫剂对环境的一个主要优点是其杀虫毒性的专一性，因而可以显著降低其对非靶标昆虫和其他生物的不利影响。

一些主要作物的主要害虫均在Bt蛋白毒杀的范围内，所以Bt菌及其相关技术在作物虫害的防治上具有广泛的应用前景。据估计全球范围内农业生产每年花费在杀虫剂上的费用为81亿美元，而若采用Bt相关技术则可减少约27亿美元的花费。

由于Bt基因来源于苏云金芽胞杆菌，若将野生Bt基因直接导入植物细胞，往往难以检测出其mRNA的转录，Bt蛋白表达量很低，因而转基因植株的抗虫性部很弱，抗虫效果不理想。因此，要使得Bt基因在转基因植物中高效表达，必须对野生Bt基因进行有效的改造。1990年，Adang等通过调整野生基因的A+T含量和密码子的使用频率，使其与双子叶植物基因保持一致，去除了影响基因在植物中表达的AATGAA，合成了一个新Bt基因。他们利用改造的基因转化植物，Bt蛋白的表达量得到提高。1991年，Perlak等在不改变晶体蛋白氨基酸序列的情况下，对CrylAb基因进行了部分改造或通过人工合成进行完全改造，选用植物偏爱的密码子，部分去除了原序列中干扰基因在植物中表达的元件，如ATTTA序列，获得了PM和FM基因，将其转化植物后目标蛋白表达量获得提高。1992年，郭三堆等人通过双链合成DNA方法，人工合成了全长1824bp的cry1Ab和cry1Ac融合的GFM杀虫基因，结果Bt毒蛋白在植物中的表达量提高了约100倍。1996年，Strizhov等首次对野生cry1Ca进行了改造，改造后的cry1C在苜蓿和烟草中的表达量大幅增加，并表现对Spodoptera littoralis和Spodoptera exiga较高水平的抗性。1999年，Cao等对野生的cry1C进行了改造并导入椰菜，获得了对Plutella xylostella高效抗性的转基因株系。之后，许多科学工作者对Bt杀虫基因进行了大量的改造研究，并利用改造的Bt杀虫基因做了大量的植物转化工作，为培育Bt抗虫植物打下了基础。据不完全统计，至今已有部分改良或人工合成的Bt基因专利四十多项。

为了防治鳞翅目害虫，许多Bt基因部通过转基因方法被导入水稻中，成功地获得了具有抗虫性的转基因株系，并进行了一些田间试验(Fujimoto et al.，1993；Nayak et al.，1997；Tu et al.，2000；Chenet al.，2005；Tang et al.，2006)。水稻是粮食作物，因此各国对其转基因品种的商业化种植许可极其谨慎，相应的生物安全性评价也更为严格。迄今为止，只有伊朗在2005年开始商业化种植Bt水稻，面积达到4000公顷(James，2005)。2009年，转cry1Ab/Ac基因的抗虫水稻华恢1号及其杂交种Bt汕优63获得了在中国湖北省生产应用的安全证书，具有里程碑的意义。在其它的国家，由于政府决策、生物安全法规、消费者等因素的影响，还没有Bt水稻品种实现商业化种植。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育转基因抗虫水稻的方法，其中基因转化的受体为水稻品种明恢63，所使用的目的基因为杀虫基因cry2A(其核苷酸序列见中国发明专利ZL 02139000.2文献和本说明书的序列表SEQ ID NO：16)。

采用农杆菌介导的籼稻遗传转化法(参见专利号为ZL200410013344.2文献)，将杀虫基因cry2A导入受体水稻品种明恢63中。通过PCR分析对T₀代转基因植株进行阳性检测，Southern杂交确定不同转基因家系的拷贝数，以酶联免疫吸附法检测杀虫晶体蛋白的含量，室内离体茎杆接虫结合田间自然发虫鉴定确定不同转基因家系的抗虫性。同时在田间调查转基因植株的株高、分蘖数、产量等农艺性状，最终获得外源基因单拷贝插入，高抗水稻鳞翅目害虫且农艺性状与原品种没有显著差异的转基因水稻新材料。通过反向PCR确定外源基因插到受体品种明恢63中的侧翼序列。该转基因抗虫材料可通过有性杂交和体细胞杂交技术重组到新的水稻种质中去，进而培育获得抗虫水稻衍生新品种(系)。

本发明还公开了转化载体的构建，水稻遗传转化和转化植物的分子鉴定，插入位点的序列分析，室内和田间抗虫试验以及农艺性状调查等过程。

本发明的具体步骤是：

一种培育提高水稻对螟虫抗性的转基因植物的方法，利用序列表SEQ ID NO：16所示的抗虫基因cry2A，构建获得如图2所示的植物表达载体pBar13-Cry2A，通过农杆菌介导的籼稻遗传转化方法，将所述的表达载体pBar13-Cry2A导入到水稻受体中，使其在转基因水稻中表达cry2A基因，通过在室内和田间检测转基因水稻对水稻螟虫的抗性，最终获得高抗螟虫的转基因水稻植株；

其中：图2所示的植物表达载体pBar13-Cry2A含有序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

其中的植物表达载体pBar13-cry2A含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和图2所示结构，该载体通过如下步骤构建而成：

先用Xho I酶切图1所示pCAMBIA1300质粒载体，然后用T4 DNA聚合酶抹成平末端，连入bar基因形成中间载体pBar13，用Hind Ⅲ+BamHI双酶切pBar13后，连入玉米Ubiquitin启动子，再用BamHI酶切后，连入SEQ ID NO：16所示的cry2A基因后形成如图2所示的植物表达载体pBar13-cry2A。

本发明利用上述方法获得的一个复合转基因结构，该转基因水稻植株T2A-1基因组的特定位点上携带了一种能稳定遗传的复合转基因结构，该特定位点位于水稻基因组第12染色体，所述的复合转基因结构由以下所示的序列沿5’到3’方向顺序连接而成：

(i)SEQ ID NO：3所示的插入位点5’端侧翼序列；

(ii)SEQ ID NO：4所示的插入的外源基因序列；和

(iii)SEQ ID NO：5所示的插入位点3’端侧翼序列。

所述衍生水稻材料基因组第12染色体特定位点携带有由(i)SEQ ID NO：3所示的序列，(ii)SEQ IDNO：4所示的插入的外源基因序列，和(iii)SEQ ID NO：5所示的序列连接而成的复合转基因结构。

本发明得到一种侧翼序列，其在转基因水稻T2A-1的外源基因中插入位置的5’端，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明得到另一种侧翼序列，其在转基因水稻T2A-1的外源基因中插入位置的3’端，所述的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明提供了一种转基因抗虫水稻T2A-1的5’端侧翼序列的定性PCR检测方法，PCR反应中的引物对的核苷酸序列如下所示：

AD5F1 5’-GCAACTCAAGAAGGACTCAATG-3’；

5’-ESP-ubi-R为5’-AGGCTGGCATTATCTACTCG-3’。

本发明提供了一种转基因抗虫水稻T2A-1的3’端侧翼序列的定性PCR检测方法，PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示：

Bar-1F  5’-ACAAGCACGGTCAACTTCC-3’；

T2A-2R  5’-ATGCCAACACGCCCAATC-3’。

具体地，本发明是这样实现的：

先以pCAMBIA1300质粒为基础载体，构建具有选择标记bar基因的载体pBar13，再将人工合成的cry2A基因插入其多克隆位点，形成相应的植物表达载体pBar13-Cry2A。将水稻品种明恢63的成熟种子消毒后诱导胚性愈伤组织。将含有表达载体pBar13-Cry2A的农杆菌菌株与胚性愈伤组织进行共培养后，在含有除草剂Basta的筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选，将筛选出来的抗性愈伤组织在分化培养基上进行分化，当分化的小植株长到2cm左右时，切掉原生根，放到生根培养基上进行生根，当新根生长到2cm左右时，炼苗后移栽到温室。这些再生小苗即为T₀代转基因苗。

在T₀代苗生长期间，通过PCR检测的方法去掉假阳性转基因植株，并对阳性的T₀植株进行收种。在T₁代，转基因植株分家系进行种植，通过田间观察，挑选抗虫性好且农艺性状无明显变异的转基因家系，并进行Southern杂交分析，确定其外源基因插入的拷贝数。随后，将挑选出来的单拷贝家系分单株进行收种。收获的种子在含有Basta的培养基上进行发芽试验，筛选出纯合的转基因单株。通过进一步的室内和田间抗虫试验、Cry2A蛋白的含量测定、农艺性状调查等检测，获得具有商业化潜力的转基因水稻家系。最后对挑选出来的具有商业化潜力的转基因水稻家系进行T-DNA插入位点侧翼序列的分析。

本发明的优点在于：

(1)本发明将人工合成的抗虫基因cry2A基因导入水稻受体品种的基因组中，其后代具有相关的抗虫特性，不用或少用农药，提高水稻产量，保护生态环境。

(2)本发明获得的抗虫材料可以通过杂交、回交的方式，将抗虫特性导入到其他水稻品种，培育抗虫新品种或新品系。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是表达载体pBar13-Cry2A的核苷酸序列，序列长度为12764bp。

序列表SEQ ID NO：2是Southern分析的探针序列，序列长度为1566bp。

序列表SEQ ID NO：3是T2A-1插入位点相邻的5’基因组侧翼序列。

序列表SEQ ID NO：4是T2A-1的插入外源基因序列。

序列表SEQ ID NO：5是T2A-1插入位点相邻的3’基因组侧翼序列。

序列表SEQ ID NO：6-15是本发明所涉及到的相关PCR引物序列。

序列表SEQ ID NO：16是人工合成的cry2A基因的全长序列，序列长度为1902bp。

图1：是原始质粒pCAMBIA1300物理图谱。

图2：转化载体pBar13-Cry2A结构示意图。该载体是在pCAMBIA1300的基础上改造而来，在多克隆位点处连接了外源基因cry2A及以bar基因替代了hpt基因作为选择标记基因。

图3：Cry2A水稻对两种主要的水稻钻蛀虫的室内抗性检测(喂饲5天后)。(a)对一龄三化螟室内抗性检测。(b)对一龄二化螟室内抗性检测。T：转基因Cry2A水稻。N：原品种明恢63对照。Cry2A水稻茎杆内的螟虫被杀死了，死亡的螟虫个体很小且身体褐化，和接种时比较体形没有增长。Cry2A水稻茎杆未受到任何危害，茎杆内也没有发现虫粪。阴性对照茎杆内，接种的一龄幼虫生长良好，体形明显增大，侵入的螟虫聚集在水稻茎杆的节的附近危害，并产生大量粪便。

图4：2004年在武汉的田间抗性评价试验。T：转基因Cry2A水稻；N：原品种明恢63对照。在自然发虫和人工接虫的条件下，原品种明恢63植株受害严重，而Cry2A植株未表现出明显症状。

图5：是自然发虫条件下或人工接虫条件下的田间表现观察结果。图中(a)是自然发虫条件下的田间表现。(b)是人工接虫条件下的田间表现。转基因Cry2A家系(T)在自然发虫和人工接虫条件下都表现出高抗性。而种植在人工接虫田块的原品种明恢63(N)的受害程度要明显高于种植在自然发虫田块的原品种明恢63的受害程度，并且种植在人工接虫田块的原品种明恢63(N)的发虫更为均一。虽然由于人工接种了三化螟幼虫造成原品种明恢63的受害严重，但是明恢63良好的分蘖能力进行了部分补偿。

图6：水稻T2A-1家系Southern分析结果。图中：M：λ-EcoT14 DNA marker；B：BamHI酶切；E：EcoRI酶切。

具体实施方式

实施例1：植物表达载体的构建

本发明所用目的基因为华中农业大学林拥军教授和张启发教授人工设计合成的cry2A基因(序列见SEQID NO：16)。该基因合成时在末端添加了NOS终止子，合成后的基因克隆于PUC18质粒载体上。本发明所用的原始转化载体为农杆菌Ti双元载体pCAMBIA1300，由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriculture)提供。用Xho I酶切pCAMBIA1300(图1)，然后用T₄ DNA聚合酶抹成平末端，连入bar基因形成中间载体pBar13。Hind Ⅲ+BamH I双酶切pBar13连入玉米Ubiquitin启动子；再用BamHI酶切后，连入人工合成的cry2A基因形成最终表达载体pBar13-cry2A(SEQ ID NO：1，图2)。将pBar13-cry2A转化到农杆菌菌株EHA105中，转化后的菌株置于-70℃保存待用。

实施例2：农杆菌介导的明恢63的遗传转化

愈伤组织诱导和继代主要参考林拥军博士论文(林拥军等，2002)。愈伤组织继代使用的培养基配方采用Lin和Zhang所改进的籼稻转化的培养基配方(Lin和Zhang，2005)。通过梯度试验确定明恢63抗性愈伤组织筛选所需最适的Basta浓度为25mg/L。农杆菌介导的明恢63(来自福建省农业科学院，为中国大面积推广水稻品种)的转化的操作过程及转化参数主要遵从林拥军博士论文及其发表的文献(林拥军，2001；林拥军等，2002；Lin和Zhang，2005)。由于Basta作为筛选试剂的作用机理是抑制植物细胞的谷氨酰胺合成酶的活性。因此，在筛选培养基中去掉谷氨酰胺和水解酪蛋白等组织培养中常添加的营养成分。为了转化pBar13-Cry2A载体，一共用农杆菌侵染了5批愈伤组织，侵染的愈伤组织块总数达15000多块，获得抗性愈伤组织数174块，分化获得T₀独立转化植株102株。

农杆菌介导的遗传转化的具体步骤如下：

2.1愈伤组织诱导

将成熟的明恢63水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4-6周，温度28±1℃。

2.2愈伤组织继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基上黑暗下培养3周，温度28±1℃。

2.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度28±1℃。

2.4农杆菌培养

在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)预培养农杆菌2天，温度为28±1℃；将农杆菌转移至AA悬浮培养基里，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养2-3小时。

2.5农杆菌侵染

将预培养的愈伤组织转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀值为0.3左右；将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤组织洗涤和选择培养

灭菌水洗涤愈伤组织7-8次；浸泡在含400mg/L的羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤组织至选择培养基上选择培养3次，每次2周。

4.7分化

将抗性愈伤组织转移至预分化培养基上于黑暗处培养7天，温度26±1℃；转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基上，光照(光照强度2000Lx)下培养，温度26±1℃。

4.8生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(光照强度2000Lx)下培养2-3周，温度26±1℃。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

实施例3：转基因植株的PCR检测

小量叶片总DNA的抽提步骤如下：

3.1 取约2cm长叶片置于1.5ml离心管；

3.2 在研钵中加入800μl1.5×CTAB，将叶片取出研磨至匀浆倒回内离心管内；

3.3 65℃水浴20-30min，每5min中颠倒混匀一次；

3.4 加入等体积的24∶1(氯仿/异戊醇)，上下颠倒混匀，持续10min；

3.5 10,000rpm离心，10min；

3.6 吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰镇的95％乙醇，-20℃冰镇20min；

3.7 12,000离心15min；

3.8 弃上清，加入500μl75％的乙醇，12,000离心5min；

3.9弃上清，空气中晾干10min，加100μl ddH₂O溶解。

PCR引物的设计利用网上的Primer3软件完成(http://bioinformatics.hzau.edu.cn/)。用于cry2A基因扩增的引物是：Cry2A-F：CGTGTCAATGCTGACCTGAT(SEQ ID NO：6)；Cry2A-R：GATGCCGGACAGGATGTAGT(SEQ IDNO：7)，PCR的产物大小为600bp。PCR反应体系为：DNA模板30-50ng，10X PCR buffer 2.0μl，2mMdNTP 1.5μl，25mM MgCl₂2.0μl，10μM引物(F/R)各0.4μl，加灭菌ddH₂O至20μl。PCR扩增反应程序为：94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，35cycles；72℃5min。扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行检测。对所有T₀代植株进行PCR检测，根据检测结果剔除假阳性的转化植株。一共检测T₀代转Cry2A基因植株102株，阳性株71株，阳性率为69.6％。

实施例4：具有商品化潜力的转基因家系的筛选

对PCR阳性的T₀代转基因家系分单株收种，一共收到可育的T₀代Cry2A家系36个。然后在这36个可育家系中，挑选具有商品化潜力的转基因家系。将可育转基因植株的T1代分家系种植到田间，每个家系种植50株。全生育期不喷施任何的杀虫剂，自然发虫。田间观察选择抗虫性好，农艺性状无明显变异的转基因家系。对符合条件的转基因家系混合单株取叶片，每个家系取至少6个单株的叶片，然后提取总DNA。植物叶片总DNA的抽提及Southern杂交的分析方法参照实验室的操作手册。总DNA用HindIII酶切，以Cry2A基因的PCR产物为杂交探针，所用引物同PCR检测的引物。通过Southern blot分析，筛选出高抗虫性、单拷贝插入且农艺性状变异不明显的T1转基因家系共4个，命名为T2A-1，T2A-2，T2A-3和T2A-4。对选择出来的T1代转基因家系分单株收种，将收获的成熟种子在含有Basta的培养基上进行发芽试验。Basta培养基发芽试验具体操作步骤如下：将成熟种子去壳，先用75％的乙醇浸泡消毒1min。然后将75％的乙醇倒掉，再用0.15％的升汞消毒15min。最后将0.15％的升汞倒掉，用灭菌水洗3次。将消毒后的种子接种于Basta浓度为10mg/L的1/2MS培养基上(Murashige和Skoog，1962)，先暗培养(26±1℃)培养3天，再光照培养(26±1℃)3天，6天后统计发芽率。理论上讲，若消毒的种子在不加Basta的条件下具有100％的发芽活力，则在含Basta的1/2MS培养基上，阳性纯合转基因单株的发芽率为100％，杂合转基因单株的发芽率为75％左右，阴性纯合单株的发芽率为0％。通过Basta培养基发芽试验挑选出T2A-1，T2A-2，T2A-3和T2A-4各家系的纯合阳性转基因单株。

实施例5：纯合转cry2A基因家系的Bt蛋白含量测定

Cry2A蛋白的测定采用美国EnvironLogix公司(EnvironLogix，Portland，USA)的检测试剂盒EnvironLogix kits APP005。检测的方法如下：从田间采集新鲜的水稻叶片，每个样品取大约20mg并精确称重。用500μl检测试剂盒提供的蛋白抽提液在研钵中将叶片磨成浆，然后转移到1.5ml的离心管中静置5min，以10,000r/min的速率离心2min。最后用新的1.5ml离心管取上清。在测量Cry2A蛋白浓度前，用相应的抽提液将样品稀释500～1000倍。稀释的样品按照试剂盒的说明书进行测定和计算。测定叶片的Bt蛋白的浓度后，再用Pierce公司的CoomassiePlus^TMProtein Assay Reagent(Pierce，Rockford，USA)试剂盒测定叶片总可溶性蛋白的浓度，最后计算叶片外源Bt蛋白占叶片总可溶性蛋白的百分比。对所有4个纯合转基因家系植株的叶片进行了Cry2A蛋白浓度的测定。结果显示，4个Cry2A家系叶片中Cry2A蛋白的含量为84.94±2.34μg/g～138.75±4.32μg/g鲜叶重，估算出的相对含量则为叶片中Cry2A蛋白占叶片总可溶蛋白的0.22％～0.32％(表1)。

表1.四个纯合转基因家系Cry2A蛋白的表达情况(抽穗期)

实施例6：纯合转cry2A基因家系的室内抗虫性测定

待田间的Cry2A水稻生长至拔节期，分家系采集新鲜的水稻茎杆，剪成5cm～6cm的小段。将3根茎段置于一个玻璃试管中，并接种10头一龄的三化螟，管口用棉塞和黑色塑料膜封好以防止三化螟逃逸。每个家系设3次重复(即接种3管)，明恢63原品种的茎杆作为检测的阴性对照。接种完毕后将封好的玻璃试管于室温避光放置。5天后剥开被检测的茎杆，统计死虫数并计算死亡率。Cry2A水稻室内二化螟抗性检测，除供试的害虫为一龄二化螟外，其它检测试验条件完全同三化螟的抗性检测。转cry2A基因的水稻茎杆可以在5d内完全杀死接种的一龄三化螟(表2)，相应的阴性对照中三化螟的死亡率仅为23.3±5.8％，且存活的螟虫生长正常并发育为二龄幼虫(图3a)；转Cry2A基因的水稻茎杆可以5天之内杀死绝大部分的接种的一龄二化螟，其死亡率为84.6±4.3％～92.9±6.6％(表2)，相应的非转基因对照茎杆中的一龄二化螟的死亡率仅为30.0±10.0％，存活的螟虫生长正常并发育为二龄幼虫(图3b)。

表2不同转cry2A基因水稻家系的杀虫活性

实施例7：Cry2A水稻田间抗性评价

2004年夏季在武汉进行了转cry2A基因水稻家系的田间抗性评价。试验在华中农业大学校园内的试验田中进行。参试的田间抗性评价材料共有5份，其中Cry2A水稻纯合家系4份：T2A-1、T2A-2、T2A-3和T2A-4，以及作为感虫对照的原品种明恢63。试验材料田间排布为随机区组设计，每个被测材料重复3次，每个小区种植10行，每行10棵，共100棵。小区内的种植尺寸为20cm×26.7cm，不同小区间空一行作为间隔。田间试验采用自然发虫和人工接虫相结合的办法，即田间管理同普通的大田管理，但不喷施任何针对鳞翅目害虫的杀虫剂。然后待田间水稻生长至分蘖盛期(八月上旬)时，人工接种初孵的三化螟幼虫，每株接种5～10头三化螟幼虫。随后共进行了两次田间调查，每个小区随机调查20株。第一次调查在八月下旬(即接种后约2周)，统计各小区植株的枯心数和卷叶数，并计算每株的枯心率(枯心率＝每株枯心数/每株总分蘖数×100％)；第二次在水稻的抽穗灌浆期，除了统计枯心率和卷叶数外，还调查了白穗的情况(白穗率＝每株白穗数/每株总穗数×100％)。

2005年夏季在武汉的进行了转cry2A水稻家系田间抗性评价的第二次试验。2005年的田间抗性评价同样在华中农业大学校园内的试验田中进行。参试材料与2004年一致。所有材料分别种植在两块不同处理的田块中：一块采用自然发虫；一块采用自然发虫结合人工接虫。除了不喷施任何防治鳞翅目害虫的杀虫剂，田间管理同普通大田管理。两个不同处理田块的种植方式完全一样。试验材料田间排布采用随机区组设计，每个材料重复3次。每小区种植2行，每行10株。小区内种植尺寸为20cm×26.7cm，各小区间空一行作为间隔。待水稻生长至分蘖盛期(八月上旬)，在接虫处理的田块中人工接种初孵的三化螟幼虫，每个植株接种一管装有一块已孵化的三化螟卵块的玻璃试管(约有40~100头)。八月下旬(即接虫两周后)，对自然发虫和人工接虫的两块田同时进行田间调查，考察对象为每个小区所有的20株植株，主要考察枯心情况(自然发虫的田块还考察了卷叶情况)。

在2004年的田间抗性试验中，所有的转基因家系均表现出了比对照明恢63显著增强的抗虫性。在第一次田间调查时遇上稻纵卷叶螟爆发高峰，转基因家系与明恢63原品种的抗性差异非常明显(图3)。第一次田间调查结果显示，Cry2A家系平均枯心率为5.36±0.56％～7.48±0.64％，每株卷叶数为0.23±0.15～0.43±0.35，远低于对照明恢63的枯心率(17.24±1.86％)和卷叶数(20.80±1.15)(表3)。第二次田间调查结果显示，对照明恢63枯心率为17.37±5.26％，每株卷叶数为15.7±1.60；另外还有一定比例的白穗(5.57±1.07％)。而Cry2A家系的枯心率为0.98±0.62％～4.18±1.62％；每株卷叶数仅为0.14±0.06~1.49±1.51；此外仅有极少数的白穗(白穗率为0.00±0.00％~0.50±0.70％)。

2005年的田间抗性试验中，在自然发虫条件下，对照明恢63的枯心率为8.65±0.81％，每株卷叶数为8.93±1.22。Cry2A水稻家系受到的螟虫危害比较低，枯心率仅为0.50±0.15％~1.72±0.88％，卷叶数为0.20±0.08~0.55±0.39(表4)。在人工接种大量的初孵三化螟的情况下，对照明恢63的危害程度大大加重了，接虫两周后其枯心率达到48.04±4.21％。此时由于将近一半的分蘖已经枯死，不能准确调查卷叶螟危害的情况。但是在人工接虫的条件下，转基因水稻的受危害程度基本上与自然发虫处理下相似，并未表现出更严重的螟虫危害症状(表4和图4)。田间试验结果表明人工接种的初孵三化螟不能对转基因Bt水稻造成实质性的损害，该结果与实验室内的生测结果吻合。

表3.Cry2A水稻家系的田间抗性评价(武汉，2004年)。

所有数值为平均数±标准差。

表4.Cry2A水稻家系的田间评价(自然接虫和人工接虫，武汉，2005)

*所有数值为平均数±标准差。

实施例8：纯合Cry2A家系的主要农艺性状考察。

经过多代的种植，我们挑选了2个表现最好的纯合转Cry2A基因家系：T2A-1(T₅代)和T2A-3(T₅代)，加上明恢63原品种对照共3个材料，在2005年进行了田间农艺性状的考察。试验地点为华中农业大学校园内的试验田。田间试验包含两个不同的处理，分别在不同田块内进行：一个田块采用正常的虫害治理；一个田块不进行任何虫害的治理。两个田块的其它管理如水、肥及杂草等完全一样。两个田块中，供试材料的田间排列方式一样，均为随机区组设计，每个材料重复种植3次。每个小区种植2行，每行10株，单本种植。小区内种植尺寸为20cm×26.7cm，各小区之间空一行。成熟后，每小区收获中间16株进行农艺性状考察。考察的性状包括株高、穗长、有效穗数、结实率、千粒重、每穗实粒数和单株产量。考查方法见表5。所有数据采用t测验进行统计分析。

表5农艺性状考查的方法

两个挑选的转基因家系农艺性状考察结果见表6。2005年田间发虫程度不严重，对照材料在打药和不打药两种处理中的差异较小。在外观表型上，T2A-3的株高有极显著水平的下降，但是下降幅度的绝对值不大，约5cm。在穗长上，2个转基因家系与对照均没有显著差异。在主要农艺性状上，2个转基因家系的单株产量与对照没有明显差异。虽然在不喷施杀虫剂的小区试验中，转基因家系的平均单株产量超过了明恢63对照，但是未达到显著水平。在产量相关性状中，转基因家系的每穗实粒数和千粒重与对照没有显著差异。但是其它两个性状——有效穗数和千粒重，两种不同处理的结果存在一定差异。在喷施杀虫剂的田块中，转基因家系T2A-3的有效穗数有明显增加；而在不喷施杀虫剂的田块中T2A-1的有效穗数有明显增加。在千粒重上，喷施杀虫剂的田块中，T2A-1有明显的降低；但是在不喷施杀虫剂的田块中，没有检测到转基因家系与对照之间存在显著差异。结实率上，在喷施杀虫剂的田块中，T2A-1和T2A-3的育性部有显著下降；但是在不喷施杀虫剂的田块中，未检测到转基因家系的育性与对照有显著差异。

总的来说，两个转基因家系的不同性状均存在一定程度的变异，但是其产量都没有明显变化，且在不喷施杀虫剂的田块中，转基因家系的产量还有增高的趋势。考虑到T2A-1的株高与对照无显著差异且其结实率略高于T2A-3，我们最后挑选T2A-1家系进行后续回交选育，为将来的商品化应用打下基础。

表6不同转基因纯合阳性家系与明恢63的主要表型及农艺性状比较(武汉，2005)

*和**分别代表显著水平P＜0.05和P＜0.01.

实施例9：对T2A-1家系外源基因插入位点的侧翼分析及染色体定位。

9.1 T2A-1家系外源基因插入拷贝数的验证

为了确定T2A-1家系外源基因插入的拷贝数，我们用两种识别位点不同的限制性内切酶(BamtH I和EcoR I)酶切T2A-1的总DNA并进行了Southern杂交分析。杂交使用的探针为pCAMBIA3300质粒Kpn I酶切回收后的小片段，该片段包含了完整的bar基因和其CaMV35S启动子区域，探针的全序如SEQ ID NO：2所示。Southern杂交的结果显示，两种不同的酶切条件下均只出现了一条杂交带，因此可以确定外源基因为单拷贝插入，且不存在重复串联插入的现象(图6)。

9.2 T2A-1外源基因插入位点侧翼序列分析和染色体定位

取10μg总DNA，在50μl的反应体系中用30U的限制性内切酶消化16h，然后进行纯化，具体的步骤为：

①向酶切反应体系中补加150μl ddH₂O，再加入200μl氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡5min；

②12000r/min离心5mmin，吸取180μl上清液转移至新的离心管中；

③加入20μl的3M NaAc和400μl的冰冻无水乙醇，混匀后在-20°C中放置30min；

④12000r/min冷冻离心20min，倒掉上清液；

⑤加入500μl75％乙醇洗涤，然后12000r/min离心5min，倒掉上清液；

⑥自然晾干后加入50μl ddH₂O溶解。

纯化的产物用10U的T4DNA Ligase(Promega)自连，在16℃中连接16h，反应体系为100μl。然后以自连产物为模板，进行反向PCR第一轮扩增，引物为P1和P2；第二轮扩增以第一轮的产物为模板，引物为P3和P4。引物的序列见表5。

表5反向PCR的引物信息

第一轮PCR反应体系总体积为40μl，其中包括4μl的10×PCR buffer，3μl的25mM MgCl₂，3μl的2mMdNTP，0.5μl的10μM左右引物，2U的TaqDNA聚合酶和2μl连接产物。PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，32个循环后72℃延伸5min。第二轮PCR反应体系与第一轮相同，反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸5min。

扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶中用0.5×TBE电泳检测，切下目标片段，回收后克隆到pGEM-T vector(Promega)上进行测序，根据测序结果获得T-DNA左侧边界插入位点的基因组序列信息(SEQ ID NO：5)。测序的结果与北京基因组研究所的9311基因组全序列(http://rise2.genomics.org.cn/page/rice/index.jsp)进行比对，确定外源片段插入位点。由于获得了T-DNA左侧边界序列插入位点的序列信息，加之T-DNA自身序列已知，我们设计了一对新的引物，其中一条引物5’-ESP-ubi-R：AGGCTGGCATTATCTACTCG(SEQ IDNO：12)在T-DNA上，另一条AD5-F1：GCAACTCAAGAAGGACTCAATG(SEQ ID NO：13)在水稻基因组上，利用这对引物扩增出T-DNA右侧边界的插入位点序列并进行了验证。PCR反应体系为：DNA模板50ng，10×PCR buffer2.0μl，2mMdNTP1.5μl，25mM MgCl₂2.0μl，10μM引物(F/R)各0.4μl，加灭菌ddH₂O至20μl。PCR扩增反应程序为：94℃5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，35cycles；72℃ 5min。扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离，切胶回收，回收后克隆到pGEM-T vector(Promega)上进行测序，获得T-DNA右侧边界插入位点的基因组序列(SEQ ID NO：3)。通过分析比较T-DNA左、右两侧插入位点的基因组序列，最终获得外源基因插入位点的信息，即外源片段插在水稻基因组的第12号染色体上22612611碱基位点处，并且引发28bp(22612612～22612639)基因组缺失，其中T-DNA左边界插入位点的边界序列如SEQ ID NO：5所示，右侧边界插入位点的边界序列如SEQ ID NO：3所示。

9.2 T2A-1外源基因插入位点特征性PCR检测

根据T2A-1外源基因插入位点两端的侧翼序列以及外源基因插入序列，分别设计其外源基因插入位点特征性PCR检测的引物，其中5’端侧翼序列特征性PCR检测的引物为：5’-ESP-ubi-R：AGGCTGGCATTATCTACTCG(SEQ ID NO：12)和AD5-F1：GCAACTCAAGAAGGACTCAATG(SEQ ID NO：13)；3’端侧翼序列特征性PCR检测的引物为：Bar-1F：ACAAGCACGGTCAACTTCC(SEQ ID NO：14)和T2A-2R：ATGCCAACACGCCCAATC(SEQ ID NO：15)。PCR反应体系为：DNA模板50ng，10×PCR buffer2.0μl，2mMdNTP1.5μl，25mM MgCl₂2.0μl，10μM引物(F/R)各0.4μl，加灭菌ddH₂O至20μl。PCR扩增反应程序为：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，35cycles；72℃ 5min。扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

参考文献

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Claims (8)

1.一种培育抗螟虫的转基因水稻的方法，其特征在于，利用序列表SEQ ID NO：16所示的抗虫基因cry2A构建植物表达载体pBar13-Cry2A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将所述的表达载体pBar13-Cry2A导入到水稻受体中，使其在转基因水稻中表达cry2A基因，通过检测转基因水稻对水稻螟虫的抗性，获得抗螟虫的转基因水稻T2A-1。

2.一种植物表达载体pBar13-cry2A，其特征在于，该载体含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一个水稻复合转基因结构，其特征在于：在权利要求1所述的转基因水稻T2A-1的水稻基因组第12染色体上，所述的复合转基因结构由以下所示的序列沿5’到3’方向顺序连接而成：

(i)SEQ ID NO：3所示的插入位点5’端侧翼序列；

(ii)SEQ ID NO：4所示的插入的外源基因序列；和

(iii)SEQ ID NO：5所示的插入位点3’端侧翼序列。

4.应用权利要求3所述水稻复合转基因结构的方法，其特征在于培育一种衍生抗虫水稻的材料，所述衍生水稻材料基因组第12染色体特定位点携带有权利要求1所述的由(i)SEQ IDNO：3所示的序列，(ii)SEQ ID NO：4所示的插入的外源基因序列，和(iii)SEQ ID NO：5所示的序列连接而成的复合转基因结构。

5.一种侧翼序列，其特征在于：所述的侧翼序列是在转基因水稻T2A-1的外源基因中插入一个片段，所述的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.一种侧翼序列，其特征在于：所述的侧翼序列是在转基因水稻T2A-1的外源基因中插入一个片段，所述的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

7.一种转基因抗虫水稻5’端侧翼序列的定性PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示：

AD5-F1GCAACTCAAGAAGGACTCAATG；

ESP-ubi-RAGGCTGGCATTATCTACTCG。

8.一种转基因抗虫水稻3’端侧翼序列的定性PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示：

Bar-1F ACAAGCACGGTCAACTTCC；

T2A-2R ATGCCAACACGCCCAATC。