CN111454988A - 一种提高植物抗虫能力的方法及其植物表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种提高植物抗虫能力的方法，其特征在于通过在植物中导入表达5‑氨基乙酰丙酸合成酶基因，以获得转基因植物的抗虫能力。本发明还提供一种制备抗虫能力提高的转基因植物的方法，其是通过含有5‑氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体转化植物，筛选获得抗虫能力提高的转基因植物。本发明的实验结果表明，转5‑ALAS基因水稻各株系对稻飞虱表现出增强抗性反应，因此具有较强的推广应用价值。

Description

一种提高植物抗虫能力的方法及其植物表达载体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高植物抗虫能力的方法及其植物表达载体。
背景技术
作物生产中通常遭受到刺吸式口器害虫的危害(水稻稻飞虱、蚜虫、粉虱、叶蝉等)，造成不同程度的减产或产品质量下降，同时伴随植物病毒病的传播，轻则损失20％-40％，重则损失100％。目前主要采用化学农药防治，但是在控制虫害的同时造成了环境和农产品污染，导致害虫抗药性急剧演化，特别是高产优质作物品种的长期大面积单一种植、气候和种植模式的改变，给害虫提供了充足的食料来源，导致害虫异常成灾频发和生物型变异，化学防治效率下降。
抗性育种是有害生物综合治理中最为有效、安全和经济的措施之一。为此，研究者们从不同途径寻找抗性资源，挖掘相关基因，进行有效利用。尽管利用传统方法在野生种质资源中发现一些抗虫的品种和基因，但是因为抗性水平不理想或抗性基因复杂的互作而限制了它们的实际应用，目前真正能够大面积应用于生产实际的非常有限。自然，研究者们希望从其他途径寻找具有抗虫性基因的挖掘(包括微生物源和植物源等)，通过利用进行抗性种质资源的创制，在一定程度上将补充抗虫性资源的缺乏，促进农业可持续发展。
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)就是一种有多种效应的植物生理活性物质，是一种绿色可生物降解的杀虫剂。但是由于5-ALA纯品化学合成过程复杂且不适用于工业化生产要求；而生物合成取得了进展，并且在产量上提高，但是距离工业化生产要求相差甚远。加上市场上5-ALA价格昂贵，自然状态下稳定性差，无法在生产上大面积使用。据报道(Meller&Gassman，Biosynthesis of-amino-levulinic acid:Two pathways inhigher plants.Plant Science Letters,1982，26(1):23-29)植物体内5-ALA存在C4和C5两条合成途径，但以C5合成途径为主，由于生化反馈调节抑制使得5-ALA并没有在细胞中累积，给植物源的5-ALA研究和应用带来一定的困难。因此从其他途径寻找高效高活性的5-ALA合成酶基因，利用植物本身的底物，改变植物体内5-ALA的合成途径，是实现5-ALA稳定高效利用的关键，而光合细菌是一类能够大量生产5-ALA并分泌到细胞外的微生物，且以C4途径合成，因工艺简单、产率高、具有工业化的生产潜力，备受国内外研究者的关注。为此从嗜酸柏拉红细菌(Rhodoblastus acidophilus)成功地克隆了编码5-ALA的5-ALAS合成酶基因，原核表达表明具有较高活性(张德咏等，光合细菌嗜酸柏拉红菌5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆与原核表达，微生物学报，2007，47(4):639-644)。
卟啉化合物在植物的代谢中起关键作用，参与植物的光合作用与呼吸作用。而5-ALA是所有卟啉化合物的共同前体，在自然界生物中广泛存在。在植物生化三羧酸循环(TCA)、乙醛酸循环和氨基酸分解途径过程中，均产生微生物5-ALAS合成5-ALA所需的底物，琥珀酰氨辅酶A和甘氨酸，为植物体内利用C4途径生产5-ALA提供可能。而且植物体内的环境能够保持5-ALA的稳定。
发明内容
针对现在技术存在的不足，本发明人为此利用植物基因工程，利用组成型启动子对转基因植株的抗虫能力提高并不明显，本发明人进一步深入研究，考虑结合刺吸式口器昆虫韧皮部危害特征，在韧皮部专一性启动子的控制下，将来自于Rhodoblastusacidophilus的5-ALAS导入具有优良性状的作物品种，同时改变5-ALA在作物中的合成途径和应用方式，最终获得具有抗虫性能的新种质资源。
本发明提供一种提高植物抗虫能力的方法，通过在植物中表达5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(即5-aminolevulinic acid synthase,5-ALAS基因)来实现。其中可以采用组型启动子来介导表达，如Ubiquitin启动子，35S启动子。但更优选地的采用有韧皮部特异性启动子，例如来源于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的韧皮部特异性启动子rolC启动子等。
在一个具体实施方式中，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)。更具体地，所述的来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)具有SEQ ID No.1所示的序列。
优选地，所述植物是单子叶植物，如水稻、番茄、烟草、小麦、玉米，最优选为水稻。
所述抗虫是指刺吸式口器昆虫，具体是稻飞虱、蚜虫、粉虱、叶蝉等，更具体的是水稻稻飞虱。
相应的，本发明提供一种制备抗虫能力提高的转基因植物的方法，其是通过含有5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体转化植物，筛选获得抗虫能力提高的转基因植物。
其中所述表达载体的出发载体为pCAMBIA1300(购自Cambia institute fromAustralia)。
可以采用组型启动子来介导表达，如Ubiquitin启动子，35S启动子。但更优选地的采用有韧皮部特异性启动子，例如来源于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的韧皮部特异性启动子rolC启动子等。
在一个具体实施方式中，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)。更具体地，所述的来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)具有SEQ ID No.1所示的序列。
对于终止子可以采用任何合适的终止子，但优选为的rolC终止子。
本发明还提供上述方法中用至的植物表达载体，其是具有韧皮部特异性启动子和5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体。
优选地，所述载体中，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的上游为来源于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的韧皮部特异性启动子rolC promoter，下游为rolCterminator终止子。在一个具体实施方式中，所述载体中，用于构建所述植物表达载体的出发载体为pCAMBIA1300。在一个具体实施例中，构建的本发明的植物表达载体为pCAMBIA1300：rolC启动子：ALAS：rolC终止子。
相应地，本发明提供5-氨基乙酰丙酸合成酶基因有提高植物抗虫能力中的应用，所述植物是单子叶植物，如水稻、番茄、烟草、小麦、玉米，最优选为水稻；所述抗虫是指刺吸式口器昆虫，具体是稻飞虱、蚜虫、粉虱、叶蝉等，更具体的是水稻稻飞虱。
本发明的技术效果如下：通过实验，结果表明转5-ALAS基因的水稻植株，其5-ALAS酶活性是供体水稻(即未转5-ALAS基因的水稻)的1.2-1.8倍，转基因水稻植株体内的5-氨基乙酰丙酸含量是野生型水稻的2.2-3.5倍。本发明的实验结果还表明，转5-ALAS基因水稻各株系对稻飞虱表现出抗性反应。经抗虫鉴定，有1个转基因水稻品系达到高抗水平，有2个转基因水稻品系达到中抗水平，有1个转基因水稻品系达到抗虫水平。因此，本发明对于目标作物抗虫育种具有指导意义，也为5-ALA在农业生产大面积应用提供了可能，将大大降低农用5-ALA的生产成本，开创绿色农业和可持续发展农业的新局面。如期获得转基因种质资源与传统的育种相结合，将极大地促进作物抗性育种，并扩大品种的抗性谱和提高新品种对目标害虫的抵抗能力，同时减少化学农药在作物上的使用。
附图说明
图1：5-ALAS的PCR结果。其中，M为λDNA/PstImarker,CK为阴性对照。泳道1-10为5-ALAS基因扩增结果。
图2：植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：GFP：rolc teminator的构建策略流程图。
图3：pCAMBIA1300：Rolc promoter：ALAS：Rolc teminator重组质粒kpnI和HindIII酶切鉴定。
图4、pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator重组载体酶切鉴定
图5、植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator的重组农杆菌转化水稻实验结果：(左)愈伤组织的分化、(中)再生苗在1/2MS培养基上生根(右)再生植株生长情况。
图6、PCR检测转基因植株T1代。左：M:λDNA/HindⅢDNA marker；1：阴性对照；2：质粒阳性对照；3-12：转基因植株。右：M:λDNA/HindⅢDNA marker；1：质粒阳性对照；2-27：转基因植株；CK：阴性对照。
图7、PCR检测转基因植株T1代PCR(潮霉素基因)。其中，M：1kb plus DNA marker；1：质粒阳性对照；CK：空白对照；2-10：转基因植株。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1、5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆
1)根据NCBI中序列登录信息，设计5-ALAS基因特异的PCR扩增引物，并引入酶切位点，引物序列如下：5'引物：5’-GGTACCATGGATTACACCAAGTTCTTC-3’斜体部分为KpnI酶切位点
3'引物：5’-GGATCCTTATTCCGCAGCGAGCGGCTT-3’斜体部分为BamHI酶切位点
2)光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)PSB-8基因组的制备：取光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-8菌株，以1:100比例接种液体培养基，30℃，2500LX光照培养7天。取10ml菌液，室温12000rpm离心5min收集菌体。用500μl TE缓冲液溶解后，加30μl 10％SDS和3μl蛋白酶K,混匀，37℃温浴1小时。加100μl 5M的NaCl,混匀后加入80μl 10％CTAB/NaCl溶液，混匀，37℃温浴1小时。加等体积酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀，室温12000rpm离心5分钟。取上清液加入等体积氯仿/异戊醇,混匀，室温12000rpm离心5分钟。吸取上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温12000rpm离心10分钟。用70％乙醇洗涤沉淀两次，室温干燥后加TE溶解，37℃5μl RNase(10mg/ml)消化1小时，即得到基因组总DNA。
3)以2)的总DNA(50ng/μl)为模板，以1)所合成的引物进行PCR扩增，获得完整的5-ALAS基因扩增产物。反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环，最后延伸10分钟。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小为1230bp，与预期序列大小一致。
4)电泳割胶回收得到的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因片段与克隆载体pGEM-T-Easy按照1:3进行连接，转化并通过菌落PCR筛选得到重组质粒pGEM-T-Easy-ALAS，进一步测序验证，结果如核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。
实施例2、韧皮部特异性启动子rolC和5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体的构建
具有韧皮部特异性启动子(rolC promoter)和5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(即5-ALAS基因)的植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator的构建策略如图2所示。具体实验步骤描述如下。
1)中间载体pCAMBIA1300:ALAS的构建：用限制性内切酶KpnI和BamHI分别双酶切pGEM-T-Easy:ALAS重组质粒和pCAMBIA1300质粒(购自Cambia institute fromAustralia)。电泳割胶回收pGEM-T-Easy:ALAS重组质粒上切下的5-ALAS片段以及pCAMBIA1300双酶切后的大片段。将回收片段按照1:3(摩尔比)比例用T4 DNA连接酶并转化，通过菌落PCR筛选得到中间载体pCAMBIA1300:ALAS。
2)中间载体pCAMBIA1300:rolC promoter:ALAS的构建：用限制性内切酶EcoRI和KpnI分别双酶切中间载体pCAMBIA1300:ALAS和pBin19:rolc质粒。电泳割胶回收pCAMBIA1300:ALAS双酶切后的载体大片段以及pBin19:rolc载体上的rolC promoter片段，将回收片段按照1:3(摩尔比)比例用T4DNA连接酶连接并转化，通过菌落PCR筛选得到中间载体pCAMBIA1300:rolC promoter:ALAS。
3)中间载体pBin19:rolC promoter:GFP:rolc teminator的构建：用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切pGEM-T-Easy:GFP载体和pBin19:rolC载体。电泳割胶回收pGEM-T-Easy:GFP载体双酶切后的GFP片段以及pBin19:rolC经双酶切后的载体大片段，将回收片段按照1:3(摩尔比)比例用T4 DNA连接酶连接并转化，通过菌落PCR筛选得到中间载体pBin19：rolC promoter:GFP:rolc teminator。
4)5-ALAS基因植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：GFP：rolcteminator的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII分别双酶切pCAMBIA1300：rolCpromoter：ALAS重组质粒和pBin19：rolC：GFP：rolc teminator重组质粒，电泳割胶回收pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS重组质粒大片段以及pBin19：rolC：GFP：rolcteminator重组质粒小片段，将回收片段按1:3(摩尔比)比例用T4 DNA连接酶连接，通过遗传转化，得到重组质粒pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：GFP：rolc teminator，即植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：GFP：rolc teminator。
5)5-ALAS基因植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator的构建：将4)所述的载体质粒用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切pCAMBIA1300：rolCpromoter：ALAS：GFP：rolc terminator,电泳割胶回收pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：GFP：rolc teminator的大片段，采用DNA修饰酶Klenow Fragment将大片段进行修饰成平末端，然后用T4 DNA连接酶连接，通过遗传转化，得到重组质粒pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator，即获得最终植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolcteminator。实验结果如图2和图4的酶切鉴定图可知，成功构建了所述载体。
实施例3、植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator导入农杆菌
制备农杆菌EHA105的感受态细胞，用热击转化法将上述构建好的植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator导入农杆菌EHA105中，利用利福平和卡那霉素的培养基筛选转化子。将-70℃取出的农杆菌感受态细胞置于冰上约5min，待其解冻后，加入1μl质粒并与农杆菌感受态细胞混匀，-20℃冰水上静置30min，迅速转入37℃水浴热击30min，加入800μl液体SOC培养基，28℃，200rpm恢复3-5hrs，取200μl均匀涂含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEP平板上，28℃黑暗培养48hrs,进行菌落PCR筛选，获得含有pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator质粒的阳性转化子备用。
实施例4、植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator的重组农杆菌转化水稻
1)取阳性农杆菌转化子(含有植物表达载体pCAMBIA1300：rolC promoter：ALAS：rolc teminator)单菌落，接种于YEP培养基中(含利福平50μg/ml，卡那霉素50μg/ml)，28℃，200rpm震荡摇培2天。
2)取600-1000μl的菌液加入到50ml含有相应抗生素、100μmol/L AS的LB培养基中，培养至菌液处于变色的临界状态(OD600＝0.3-0.4)。
3)4℃4000rpm离心10min收集菌体，弃上清液，加入MS液体养基(含100μmol/L AS)重悬后，4℃4000rpm再离心10min收集菌体，弃上清液，加入MS液体养基(含100μmol/L AS)重悬，将菌液稀释至浓度OD600＝0.3-0.4。
4)向无菌三角瓶中的愈伤组织加入农杆菌菌液，侵染30min,侵染过程中不断轻轻摇动三角瓶。
5)将侵染后的愈伤组织取出置于灭菌滤纸上，吸去多余菌液，置于共培养培养基上(培养基表面放置一层灭菌滤纸)26±1℃暗培养2天。
6)将共培养后的水稻愈伤组织取出，用无菌水冲洗5-6遍，吸去多余水分，转接到有灭菌滤纸的平皿中，在超净工作台上无菌风干水分。之后再将愈伤组织转移到含有500mg/L头孢霉素、50mg/L潮霉素的NB筛选培养基上进行筛选。
7)2周后继代筛选一次，将筛选2次后的愈伤组织转移到分化培养基上，光照条件下26±1℃培养分化。
8)2-4周后从愈伤组织将再生小苗切离转至1/2MS培养基上，进行生根培养。待小苗长到15cm左右时炼苗2-3天，移栽入土。
在本实施例中选用的水稻品系是为粳稻台北309、粳稻4008S和籼稻D1。共获得转基因粳稻台北309为42株、粳稻4008S为34株和籼稻D1为56。图5显示粳稻台北309的实验结果，其中显示了愈伤组织的分化、再生苗在1/2MS培养基上生根以及再生植株生长情况的照片。
实施例5、转基因水稻品系中5-ALAS基因的整合及转录检测
采用PCR初筛鉴定确认转基因水稻品系(粳稻309-rolc-ALAS的36株、粳稻4008S-rolc-ALAS的24株、籼稻D1-rolc-ALAS的42株)中标记基因和目标基因的整合情况。
首先采用CTAB法提取植物基因组：(1)取0.3-0.5g新鲜的转基因水稻叶片，用液氮充分研磨成粉末状。(2)将粉末状叶片转入1.5ml无菌微量离心管中，加入600μl预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴30min。(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24∶1)，混匀，室温12000rpm离心10min。(4)取上清液，移入新的无菌微量离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置15min至数小时。(5)室温12000rpm离心10min，收集沉淀。(6)沉淀用1ml 75％乙醇漂洗，室温12000rpm离心3min，弃去上清液，重复3次。(7)倾去洗液，干燥沉淀，溶于500μl TE(pH8.0)，加入终浓度为10μg/ml的RNaseA，37℃水浴30min，所获得的基因组DNA样品凝胶电泳检测。
以植物基因组DNA为模板，用5-ALAS基因的上下游引物和潮霉素基因的上下游引物进行PCR检测，电泳检测分别显示5-ALAS片段长度为1.2kb；潮霉素基因片段长度为0.9kb,表明目的基因已经成功整合到转基因植株基因组中。
转基因植株目的基因转录情况检测，抽取转基因水稻总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析。取0.3g植物嫩叶材料，加入液氮后充分研磨成粉末，转入1.5ml Eppendorf管；加入600μl水饱和酚仿和600μl TRIzoLRNA提取缓冲液剧烈振荡混匀，冰浴5-10min；4℃，12,000rpm离心10min；取上清，等体积水饱和酚仿再抽提一次，4℃，12,000rpm离心10min；取上清加入等体积的4M/L LiCl，混匀后置于4℃放置过夜或-20℃2h沉淀RNA；4℃，12,000rpm离心20min，弃上清；70％乙醇洗涤沉淀两次，沉淀干燥后溶于适量DEPC处理过的ddH2O，用DNase 37℃处理30min,然后用等体积饱和酚再抽提一次，4℃，12,000rpm离心10min；取上清取上清加入等体积的4M/L LiCl，混匀后置于4℃放置过夜或-20℃2h沉淀RNA；4℃，12,000rpm离心20min，弃上清；70％乙醇洗涤沉淀两次，沉淀干燥后溶于适量DEPC处理过的ddH2O，于-20℃或-70℃保存备用。取植物总RNA约0.1-0.5μg，oligo(dT)50ng,10mM dNTP mix 1μl,用DEPC处理水补足至10μl,混匀之后短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl,将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min,加入1μl反转录酶，将上述混合物混匀之后，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min,合成cDNA。以cDNA为模板，用5-ALAS基因的上下游引物进行PCR反应，以actin引物作为对照引物。
PCR检测粳稻台北309的转基因植株T1代实验结果，如图6所示(其中3-12：转基因植株)，以及通过PCR检测粳稻台北309的转基因植株T1代PCR(潮霉素基因)实验结果如图7所示(2-10：转基因植株)。因此，获得的目的片段，通过割胶回收、连接转化、重组子测序以证实目的基因在转基因水稻植株均成功转录。
实施例6、转基因水稻植株5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力、5-氨基乙酰丙酸含量测定
ALA合成酶活性测定参照Burnham(1970)方法稍加改动。首先用凯基植物总蛋白提取试剂盒，提取转基因水稻植株的总蛋白，将蛋白抽提液500μL与等体积反应试剂(含50mmol/L Tris—HC1，pH 7.5，20mmol /L氯化镁，0.1mol/L琥珀酸二钠，0.1mol/L的甘氨酸，0.1mmol/L的磷酸吡哆醛，15mmol/L ATP，0.2mmol/L的辅酶A)混合，分别反应10min、20min和30min后，加入500μl 10％的三氯乙酸终止反应，13000r/min离心5min。取上清加入1mL 2mol的醋酸钠(pH 4.6)，混匀后加入300μL乙酰丙酮，混匀后沸水浴15min，冷却至室温。加入2.5mL Ehrlich’s试剂(60％的冰醋酸(V/V)，2％对二甲氨基苯甲醛(m/V)，11.2％的高氯酸(V/V))。室温反应15min，待显色完全后于556nm测其吸光度，计算ALA合成量。总蛋白含量采用Bradford法测定。酶活力单位定义为37℃1min内合成IμmolALA所需酶量。
3个转基因品系的5-氨基乙酰丙酸合成酶活性测定结果表明表1所示(品系中最后的数值是转基因品系的编号)。
表1不同转5-氨基乙酰丙酸合成酶基因水稻品系酶活性和5-氨基乙酰丙酸含量的比较
Figure BDA0002485756860000081
由此可见，转基因水稻中的5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力是供体品系植株的1.2-1.8倍，转基因水稻植株体内的5-氨基乙酰丙酸含量是供体品系植株的2.2-3.5倍。更具体地，粳稻309-rolc-ALAS、粳稻4008S-rolc-ALAS和籼稻D1-rolc-ALAS转基因水稻的5-氨基乙酰丙酸含量分别是相对应供体品系植株的1.8倍、1.5倍和1.2倍；5-氨基乙酰丙酸含量分别是相对应供体品系植株的3.5倍、2.78倍和2.2倍。可见转基因水稻中5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的表达提高了5-氨基乙酰丙酸的含量。
实施例7、转5-ALAS基因水稻苗期抗稻飞虱(褐飞虱)的鉴定
水稻苗期对褐飞虱的抗性鉴定采用改进的苗期集团筛选法(MSST法)，具体该当如下：
将经浸种催芽的供试品种播种于浅塑料盘内(规格50cm×40em×8cm)，每盘播供试材料20个，并播抗虫对照品种IR26、IR56、ASD7、Mudge、Ptb33，感虫对照品种TN1。每品种播一行，每行约10～12株，播种后将塑料盘置于室外无虫尼龙网笼内育苗，同时制备鉴定箱(规格65cm×65cm x 80cm)，若干置于大荫棚下水泥池内，池内保持10cm左右的清水。接虫鉴定时大棚内温度25～30℃，RH 75％以上。
待苗长到3～4叶时，清除弱苗，并将其移入鉴定箱内，然后按苗、虫1：5～6的比例接2～3龄褐飞虱若虫，均匀撒入苗盘内，第二天检查盘内虫量情况以确定是否补充虫量。调查和评级标准：接虫约6 7d，当感虫对照品种(TN1)开始死亡时调查评级，隔一天调查评级一次，至感虫品种完全死亡为止，最终给品种定级以TN1达到9级这一天的调查结果为主要依据，鉴定材料的抗性级别与前一次调查结果相差两个或两个以上级别时，则取其平均值为鉴定材料的级别。评级标准见表2。
表2水稻品种抗褐飞虱鉴定评价标准
抗性级别 死苗率(％) 抗性水平
0 0.00 免疫
1 1.00-10.00 高抗
3 10.10-30.00 抗虫
5 30.10-50.00 中抗
7 50.10-70.00 中感
9 >70.10 感虫
供试品种包括本发明获得的309-rolc-ALAS、4008S-rolc-ALAS、D1-rolc-ALAS三个品系,以及由于组成型启动子引导的5-ALAS基因表达的转基因品系Ubi309-Ubi-ALAS、4008S-Ubi-ALAS、D1-Ubi-ALAS(具体过程与本发明的方法相似)、供体的非转基因品系4008S、D1品系、以及易感对照TN1、阳性对照IR56品系。具体的实验结果如表3所示。其中本发明的转基因品系309-rolc-ALAS、4008S-rolc-ALAS、D1-rolc-ALAS对褐飞虱的抗性反应达到免疫、高抗和抗虫等级，而组成型表达的Ubi309-Ubi-ALAS、4008S-Ubi-ALAS、D1-Ubi-ALAS分别达到高抗、抗虫和抗虫等级，均优于非转基因(即未导入5-ALAS基因表达)的品系。其中采用本发明的转基因品系(即采用韧皮部特异性启动子)，优于采用组成型启动子的转基因品系。
表3转5-ALAS基因水稻各品种对褐飞虱的抗性反应
Figure BDA0002485756860000091
Figure BDA0002485756860000101
序列表
<110>湖南省植物保护研究所
<120>一种提高植物抗虫能力的方法及其植物表达载体
<160>3
<170> PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>1230
<212>DNA
<213> Rhodoblastus acidophilus
<400> 1
atggattaca ccaagttctt cgcagacgcg cttgaccgtt tgcatgctga gcgccgctat 60
cgcgtttttg ccgatctgga acgcgtcgcg ggccggttcc cccacgccac ctggcactcc 120
ccgagcggcg aacgcgacgt cgtgatctgg tgctcgaatg attatctcgg catgggccag 180
cacccgaagg tggtcggcgc aatggtcgag accgcgacgc ggctcggcac tggtgccggt 240
ggcacccgca acatcgccgg cacgcaccat ccgctggtga tgcttgagag ggaactggca 300
gatctgcacg gcaaggaagc cgcgctgctg ttcacctcgg gctacgtctc gaaccagacc 360
ggcatttcga cgctcgccaa gctgatcccg aactgcctga tcctgtcgga cgcgctcaac 420
cacaattcga tgatcgaagg catccgccag tcgggttgcg agcgcattgt ctggcgccac 480
aacgacaccg cgcatctcga agagttgctg cgcgccgttg agccgggccg cccggtgctg 540
atcgcgttcg aaagcctgta ttcgatggac ggcgacgtcg cgccgatggc gaagatctgc 600
gatctcgccg aaaaatatgg cgccatgacc tattgcgacg aagtccatgc ggtcgacatg 660
tacggcgccc gcggcgccgg cgttgccgag cgggatggtg tgatgcaccg catcgacatc 720
atcgaagcga cgctggccaa ggcgttcggc tgcctcggcg gctacatctc cggcaagaag 780
gacgtgatcg acgccgtgcg ctcctatgcg ccgggcttca tcttcacgac cgcgctgccg 840
ccgccgatct gcgccgctgc gaccgccgcg atccgccacc tcaagacctc gacctgggag 900
cgtgaacgtc accaggatcg tgccgcgcgc ctcaaggccg tgctcaacac cgccggcctg 960
ccggtgatgc cgaccgacac ccacatcgtt ccggtgttcg tgggcgatgc cgagcgctgc 1020
aagaaggcca gcgatctcct gctggaaaag cacggcatct acatccagcc gatcaactat 1080
ccgaccgttg ccaagggcaa ggagcggctg cgcatcaccc cgtcgccgta tcatgacgac 1140
gatctgatgg atcggctggc cgaagcgctg gtcgacgtct gggagacgct ggaactgccg 1200
ctcggcgcca agccgctcgc tgcggaataa 1230
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 2
ggtaccatgg attacaccaa gttcttc 27
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 3
ggatccttat tccgcagcga gcggctt 27

Claims (10)

1.一种提高植物抗虫能力的方法，其特征在于通过在植物中导入表达5-氨基乙酰丙酸合成酶基因，以获得转基因植物的抗虫能力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)，优选地，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的表达是通过组型启动子，如Ubiquitin启动子，35S启动子,更优选地的采用有韧皮部特异性启动子，例如来源于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的韧皮部特异性启动子rolC启动子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是单子叶植物，如水稻、番茄、烟草、小麦、玉米，最优选为水稻；所述抗虫是指刺吸式口器昆虫，具体是稻飞虱、蚜虫、粉虱、叶蝉，更具体的是水稻稻飞虱。
5.一种制备抗虫能力提高的转基因植物的方法，其特征在于，其是通过含有5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体转化植物，筛选获得抗虫能力提高的转基因植物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述表达载体的出发载体为pCAMBIA1300。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的表达是通过组型启动子，如Ubiquitin启动子，35S启动子,更优选地的采用有韧皮部特异性启动子，例如来源于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的韧皮部特异性启动子rolC启动子；优选地，终止子采用rolC终止子。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)；更具体地，所述的来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)具有SEQ ID No.1所示的序列。
9.如权利要求5至8任一项所述的方法中所用的含有5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体。
10.5-氨基乙酰丙酸合成酶基因有提高植物抗虫能力中的应用，所述植物是单子叶植物，如水稻、番茄、烟草、小麦、玉米，最优选为水稻；所述抗虫是指刺吸式口器昆虫，具体是稻飞虱、蚜虫、粉虱、叶蝉，更具体的是水稻稻飞虱。
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