CN102168106A - 一种控制植物体内ala合成、促进生长并提高抗逆性的转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制植物体内ALA生物合成、促进生长并提高植物抗逆性的转基因方法，属于基因工程领域。是将拟南芥HemA1基因光敏型启动子和酿酒酵母菌5-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶基因(YHem1)通过植物表达载体转入植物中。本发明通过提高光照下植物内源ALA合成量，促进叶绿素、亚铁血红素合成，避免黑暗中ALA以及其它卟啉中间物积累，从而避免植物光漂白现象，并且提高了植物对低温、高温、高光、弱光以及盐胁迫耐受力。因而，不仅不影响转基因植物的正常发育，而且提高了植物生物产量和经济学产量增加。可以运用于拟南芥、烟草、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓等草本植物，也可以运用于苹果、梨等木本植物。

Description

一种控制植物体内ALA合成、促进生长并提高抗逆性的转基因方法

技术领域

本发明涉及一种控制植物体内ALA合成、促进生长并提高抗逆性的转基因方法，属于基因工程领域。是一种微生物基因在农业生产上应用，是一种运用生物基因工程技术培育高产、多抗植物新种质的方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevunilic acid，ALA)是所有生物体内普遍存在的一种类似于氨基酸的5碳化合物，是所有卟啉化合物(如叶绿素、亚铁血红素、维生素B₁₂等)生物合成的关键前体。在植物体内，它由谷氨酸通过三步酶催反应转化而成；在动物及酵母体内，它由琥珀酰CoA和甘氨酸通过ALA合酶催化，一步反应即可生成。

我们以及其它研究小组通过大量的外源处理试验表明，ALA可以明显提高甜瓜、西瓜、西葫芦、番茄、萝卜、黄瓜、菠菜、小白菜、生菜、油麦菜、草莓、水稻、小麦、棉花、烟草、枣、梨、康乃馨、红掌等多种草本和木本植物抵抗高温、低温、高光、弱光、盐渍、干旱、贫瘠等环境胁迫能力，并显著提高产量(汪良驹等，植物生理学通讯，2003，39：185-192；Wanget al，Physiol Plant，2004，121：258-264；汪良驹等，园艺学报，2004，31：321-326；汪良驹等，南京农业大学学报，2004，27(2)：34-38；Wang et al，J Intergrative Plant Biol，2005，47：1084-1091；汪良驹等，西北植物学报，2005，25：488-496；刘晖等，果树学报，2006，23：854-859；常苏红等，自然灾害学报，2006，15：312-317；尹璐璐等，西北农业学报，2007，16(4)：166-169；周贺芳等，干旱地区农业研究，2007，25(4)：212-215；程菊娥等，湖南农业科学，2007(4)：58-60；孙永平等，西北植物学报，2008，28：1384-1390；康琅等，南京农业大学学报，2008，31(1)：31-36；王乃江等，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2008，36(9)：76-80；徐铭等，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2008，36(9)：128-132；刘芳等，中国水稻科学，2008，22：411-415；徐晓洁等，干旱地区农业研究，2008，26(4)：131-135；祁向玲等，西北农业学报，2008，17：202-206；赵晓进等，西北农业学报，2008，17：303-308；孙永平等，园艺学报，2009，36：671-678；冯志威等，山西农业科学，2009，37(5)：42-43；康博文等，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2009，37(4)：97-102；童金株等，干旱地区农业研究，2009，27(4)：116-120；姚素梅等，植物营养与肥料学报，2010，16：242-246；郭珍等，西北林学院学报，2010，25(3)：93-96；刘玉梅等，园艺学报，2010，37：65-71；李文华等，西北林学院学报2010，25(1)：90-94)。然而，国际上迄今仍然没有通过转基因技术来提高植物内源ALA含量以至于提高作物抗逆性并提高产量的成功报道。

德国学者(

et al，PNAS，1994，91：1726-1730；Kumar et al，Plant Physiol，2000，122：49-56)曾经将植物体内的ALA合成酶基因(包括tRNA^Glu还原酶基因HemA和谷氨酸-1，2-半醛氨基转移酶基因Gsa)转入烟草和拟南芥体内，但是，没有获得ALA过量合成型转基因植物。这可能与植物ALA合成需要多个酶催化，从而导致的转化难度增大有关。Zavgorodnyaya等(Plant J，1997，12：169-178)最早选择酵母菌ALA合酶基因(Hem)为目的基因，然后把它与CaMV35S启动子重组在一起，转入烟草后，获得了ALA过量合成的转基因植物。韩国学者Jung等(Plant Sci，2004，167：789-795；Photosynthetica 2008，46：3-9)则把大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的Hem基因与玉米泛素启动子重组起来，转入水稻后，也获得了ALA过量合成型转基因植株。然而，无论是烟草还是水稻，所有的转基因植株都只能生长在弱光条件下。一旦转入到强光(1/6的自然光强)下，转基因植株就会出现光漂白现象，因而，这样的转基因植物在农业生产上没有实用价值。

我们也从酿酒酵母菌中克隆出ALA合酶基因(YHem)，并把它与拟南芥中一种光敏型启动子(拟南芥HemA1基因启动子)重组起来，转入到烟草、拟南芥、番茄、西瓜、油菜、水稻、草莓、梨等植物体内后，发现它不仅可以诱导植物体内源ALA过量合成，而且即使生长在自然光照条件下(约2000μmol·m^-2·s^-1)也不会出现光漂白现象。因而，转基因植物不仅抗逆性明显增强，而且产量明显提高。这种转基因技术在农业生产上具有应用前景。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种促进植物生长，提高植物抗逆性的转基因方法。

技术方案

本发明所提供的促进植物生长，提高植物抗逆性的转基因方法，是将拟南芥HemA1基因光敏型启动子(AtHemA1P)和酿酒酵母ALA合酶基因(YHem1)重组，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到光合能力明显提高，生长发育受到促进，并且延缓衰老，单株产量也比野生型植株明显提高，同时抗逆性也得到提高的转基因植物。

本发明所述方法中，AtHemA1P核苷酸序列是Genebank中AF295364的全长序列；YHem1基因的编码序列是Genebank中YSCHEM1AA全长序列。AtHemA1P和YHem1基因可以通过植物表达载体YF8631或YK3840导入植物中的。其中

酿酒酵母Hem1基因的植物双元载体pYF8631构建为：

将测序正确的pMD18-T载体上的Hem1基因经BamHI和SacI双酶切后，插入植物双元载体pYPXVhb，替换原先载体上的Vhb基因，构成载体pYF8630，随后再将经HindIII和BamHI双酶切的拟南芥HemA1基因启动子AtHemA1P插入pYF8630载体的相应酶切点间，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体pYF8631；

酿酒酵母Hem1基因的植物双元载体pYK3840构建为：

将测序正确的Hem1基因经BamHI和SacI双酶切后，回收1647bp的DNA片段，与相应酶切的pYF7716载体相连，随后再将经HindIII和BamHI双酶切的拟南芥HemA1基因启动子AtHemA1P插入上述载体的相应酶切点间，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体pYK3840。

本发明所述的促进植物生长包括烟草、拟南芥、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓、苹果、梨等。

本发明所述的提高抗逆性包括耐盐性，抗寒性，耐高温性、耐弱光性，耐强光性。

有益效果

本发明的方法既可以促进单子叶植物，也可以提高双子叶植物的植株生长及并且提高植株的抗逆性。如水稻、烟草、番茄、拟南芥、油菜、西瓜、草莓、梨等。携带有光敏型启动子AtHemA1P和YHem1的编码基因的表达载体，可以通过热激法或电击法导入农杆菌EH105，LBA4404，GV3101等感受态细胞中。通过Ti质粒和农杆菌介导的叶盘转化法、愈伤组织法、蘸花法，基因枪法等常规方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培养的方法，获得植物生长得到促进，抗逆性提高的转基因植株。

本发明方法重组的拟南芥光敏型启动子AtHemA1P控制酿酒酵母YHem1基因不需要设计叶绿体蛋白信号肽序列，因而，在转基因植物中翻译成的ALA合酶主要分布于植物线粒体中，而不是一般绿色植物的叶绿体中。

本发明方法利用拟南芥光敏型启动子AtHemA1P控制酿酒酵母YHem1基因在转基因植物中的表达随着光照条件的变化而变化。YHem1基因在光照条件下的表达量明显高于黑暗下。因而，在光照下，YHem1基因编码的ALA合酶可以在植物线粒体中将琥珀酰CoA和甘氨酸缩合为ALA，提高植物体内源ALA含量，从而促进植物的生长，提高植物对低温、盐胁迫、弱光、强光的抗性，同时又避免了黑暗中YHem1基因的表达和ALA及其代谢中产物的积累，因而，转基因植株不会表现出光漂白现象。不仅生长发育正常，而且生物学产量和经济学产量均会明显提高。

实验证明，本发明的方法获得的含有光敏型启动子AtHemA1P和YHem1基因的转基因烟草、拟南芥、油菜、水稻、番茄、西瓜在正常条件下的生长势、单株产量均优于野生型植株。在逆境条件下，转基因植株比野生型具有较强的抗逆性，具体表现为耐盐、抗寒、耐弱光和耐强光等。

附图说明

图1为YF8631植物表达载体构建示意图

图2为YK3840植物表达载体构建示意图

图3为转光敏型启动子AtHemA1P和YHem1基因T₃代株系烟草YHem1基因表达随着光照时间的变化图

图4为转YF8631-YHem1烟草结果期延缓植株衰老情况

图5为转YF3840-YHem1拟南芥盐胁迫两周的生长情况和萌发率比较

图6为正常光照条件下转YF3840-YHem1拟南芥生长和结荚情况

图7为正常环境条件下盆栽转YF8631-YHem1油菜越冬期抗冻性和返青期生长情况

图8为转YF8631-YHem1油菜耐盐性研究

图9为转YF8631-YHem1油菜与野生型油菜角果长度和饱满度的研究

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、转光敏型启动子AtHemA1P和YHem1植物的获得

一、转基因所采用的重组表达载体的构建

1、拟南芥HemA1光敏型启动子(AtHemA1P)的获得

根据Genbank中登录的拟南芥HemA1基因启动子的核苷酸序列(Genebank No：AF295364)，以抽提的拟南芥的总DNA为模板，通过加入HindIII酶切位点的引物(AtHemA1PZ1：5’-CCCAAGCTTACCGAAATGTAGGAATCCCACTTC-3’和加入BamHI酶切位点的引物(AtHemA1PF1：5’-AGGATCCCAAAATCTCAATCTCCTCTCTGTC-3’)进行PCR扩增。扩增体系为50μl，含10mmol/L Tri-HCl pH 8.3，50mmol·L^-1KCl，2m mol·L^-1Mg₂Cl，250μmol·L^-1的各种dNTP，每种引物25pmol，200-500ng的DNA，以及1U的Taq聚合酶，扩增条件是94℃/10min预变性后，94℃/40s变性，72℃退火和延伸2min，共30个循环；72℃后延伸10min。PCR扩增产物经1％凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收1800bp左右的DNA片段，PCR产物进行日本TAKARA公司的pMD18-T载体克隆，酶切鉴定后，对重组子中插入基因进行核苷酸全序列测定。结果表明，该片段与Genebank号为AF295364的核苷酸序列相同，为拟南芥HemA1基因启动子(AtHemA1P)的序列。

2、酿酒酵母ALA合酶编码基因(YHem1)的获得

根据Genbank中登录的酿酒酵母Hem1基因的核苷酸序列(Genebank No：AF295364，YSCHEM1AA)，鉴于Hem1基因内部没有内含子，以抽提的酿酒酵母的总DNA为模板，以引物(YHem1Z1：5’-AGGATCCATGCAACGCTCCATTTTTGCGAGGTTC-3’)和(YHem1F1：5’-AAGAGCTCTTACTGCTTGATACCACTAGAAACCTC-3’)为引物进行PCR扩增。为了便于产物的克隆，分别在启动子的5’和3’端加了BamHI和SacI限制性内切酶切点。扩增体系为50μl，含10×PCR buffer 5μL，10×dNTP(2.5mmol·L^-1each)5.0μL，引物YHem1Z1和YHem1F1(100pmol·L^-1)各0.5μL，DNA 1μL，Taq聚合酶(1U·μL^-1)2μL，DNA模板5μL，加双蒸水至50μL。扩增条件是：94℃/10min预变性后，94℃/40s变性，72℃退火和延伸2min，共30个循环；72℃后延伸10min。PCR扩增产物经1.0％Agrose电泳，DNA回收试剂盒回收1647bp左右的DNA片段，PCR产物进行日本TAKARA公司的pMD18-T载体克隆，酶切鉴定后，对重组子中的插入基因进行核苷酸全序列测定。结果表明，该片段与Genebank中YSCHEM1AA的核苷酸序列相同，证明确为酿酒酵母Hem1基因的全长核苷酸序列。

3、酿酒酵母Hem1基因的植物双元载体pYF8631构建

如图1所示，将测序正确的pMD18-T载体上的Hem1基因经BamHI和SacI双酶切后，插入植物双元载体pYPXVhb(Li等，Plant Cell Reports，2005，23：710-715)，替换原先载体上的Vhb基因，构成载体pYF8630，随后再将经HindIII和BamHI双酶切的拟南芥HemA1基因启动子AtHemA1P插入pYF8630载体的相应酶切点间。经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体pYF8631。

4、酿酒酵母Hem1基因的植物双元载体pYK3840构建

如图1所示，将测序正确的Hem1基因经BamHI和SacI双酶切后，回收1647bp的DNA片段，与相应酶切的pYF7716载体(郭兆奎等，西北农林科技大学学报(自然科学版)2008，36：58-64)相连，随后再将经HindIII和BamHI双酶切的拟南芥HemA1基因启动子AtHemA1P插入上述载体的相应酶切点间。经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体pYK3840。

二、转光敏型启动子AtHemA1P和YHem1植物的获得

1、光敏型启动子AtHemA1P控制的过量合成YHem1烟草、番茄和油菜的获得

将pYF8631载体通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的介导转入烟草、番茄和油菜中。具体方法如下所述：

(1)烟草无菌苗的制备：烟草品种‘K326’种子(美国Northup King Seed Company生产)用70％乙醇浸泡1min，然后用5％的漂白粉(加两滴Tween-20)消毒15分钟，其间不断摇动，然后用无菌水洗3遍，接种在MS培养基上。置于培养室中发芽(温度22±2℃，光照强度为150μmol·m^-2·s^-1，光/暗周期16h/8h)。待种子发芽后，培养30天后，用于转化。

(2)番茄无菌苗的制备：挑选饱满的番茄品种‘合作903’种子(浙江勿忘农集团生产)用流动的自来水浸泡12h后，用70％乙醇浸泡1min和20％次氯酸钠(加两滴Tween-20)消毒20分钟，无菌水冲洗3-5次，并用无菌吸水纸略微吸干后，按30粒/瓶播种于MS培养基上。常温暗培养出芽后，在温度(25±1)℃，光照强度36μmol·m^-2·s^-1，光周期16h/8h条件下进行培养。培养一周后，用于转化。

(3)油菜无菌苗的制备：挑选饱满的油菜品种‘沪油-15’种子(浙江勿忘农集团生产)用70％乙醇浸泡1min和25％次氯酸钠(加两滴Tween-20)消毒10分钟，无菌水冲洗3-5次，并用无菌吸水纸略微吸干后，按30粒/皿播于MS培养基上。常温暗培养出芽后，在温度(25±1)℃，光照强度36μmol·m^-2·s^-1，光周期16h/8h条件下进行培养。培养一周后，用于转化。

(4)农杆菌菌株培养：将pYF8631载体通过电击方法导入根癌农杆菌菌株LBA4404(徐增富和李宝健，生物化学与生物物理进展，1996，23：286-287)，构成新的农杆菌工程菌AG200。-70℃保存的菌种AG200在含利福平Rf 50mg/L+Cm 10mg/L的YEB固体培养基上划线，于27℃下培养2～3d后，挑取直径为1mm左右的1个单菌落接种于50ml含利福平Rf 50mg/L+Cm10mg/L的YEB培养液中，27℃、200rpm下震荡培养过夜。在27℃、5000rpm离心8min收集菌体，弃上清夜后用MS液体培养液洗涤菌体两次，备用。

(5)农杆菌遗传转化：分别取烟草无菌叶片、番茄和油菜无菌子叶作为转化的外植体，置于上述农杆菌工程菌AG200菌液中，侵染8-10min。取出外植体用无菌滤纸吸干，再转入覆有一层无菌滤纸的共培养基(MS+0.1mg L^-1NAA+1mg L^-16-BA)上暗培养48h-72h，培养温度为22-25℃。将外植体转接到筛选培养基上培养，每20d更换新的培养基，直至经第二次筛选培养后分化出抗性芽。形成的抗性芽经过GUS染色检测，将GUS阳性芽切下，插入生根培养基中。生根完成后，置于自然光温下练苗3-5d，再连同对照移栽到试验田中。共得到转基因烟草36株T₀代植株，转基因番茄17株T₀代植株，转基因油菜13株T₀代植株。T₀代植株自花授粉，单株拷种。将T₀代种子经过Km抗性筛选，抗性苗经过GUS染色，PCR，Southern杂交，RT-PCT检测，选出阳性植株(T₁)培养至开花结实，收集T₁植株上所结种子，依T₀种子筛选方法继续进行T₁代种子筛选、种植和获得T₂代种子，最终得到独立的纯合的转基因烟草，番茄，油菜种子。

烟草转化与筛选培养基：

共培养基：MS+3mg L^-16-BA

第一次选择培养基：MS+3mg L^-16-BA+50mg L^-1Km+100mg L^-1Cb

第二次选择培养基：MS+3mg L^-16-BA+100mg L^-1Km+100mg L^-1Cb

生根培养基：1/2MS+0.5mg L^-1 NAA

番茄转化与筛选培养基：

共培养基：MS+0.1mg L^-1 NAA+1mg L^-16-BA

第一次选择培养基：MS+0.5mg L^-1ZT+0.5mg L^-1IAA+200mg L^-1Km+400mg L^-1Cb

第二次选择培养基：MS+0.5mg L^-1ZT+0.5mg L^-1IAA+400mg L^-1Km+200mg L^-1Cb

生根培养基：1/2MS+IAA0.1mg L^-1

油菜转化与筛选培养基：

共培养基：MS+0.1mg L^-1NAA+1mg L^-16-BA+5mg L^-1AgNO₃

第一次选择培养基：MS+0.1mg L^-1NAA+3mg L^-16-BA+10mg L^-1Km+400mg L^-1

Cb+5mg L^-1AgNO₃

第二次选择培养基：MS+0.1mg L^-1NAA+3mg L^-16-BA+20mg L^-1Km+200mg L^-1

Cb+5mg L^-1AgNO₃

生根培养基：1/2MS+IAA0.1mg L^-1

以上MS培养基均加琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，并用1N NaOH调节pH至5.8。

2、光敏型启动子AtHemA1P控制的过量合成YHem1拟南芥的获得

将pYK3840载体通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101(马立安和张忠明，长江大学学报(自科版)农学卷2007，4(2)：41-44)介导的蘸花法转入拟南芥中。具体方法如下所述：

拟南芥的培养：拟南芥‘Columbia’型种子(美国俄亥俄州立大学的生物资源中心ABRC生产)用70％乙醇浸泡1min，然后用5％的漂白粉(加两滴Tween-20)消毒20分钟。其间，不断摇动，然后用无菌水洗3编，接种在MS培养基上，置于4℃冰箱，进行2-3天的春化处理，然后至于培养室中，培养两周。将蛭石、黑土、珍珠岩按18∶6∶1的比例拌匀，装于10cm的塑料小盆，以营养液PNS浸湿待用。用镊子将拟南芥幼苗按4×3cm移栽于湿润的基质上，保鲜膜封口，培养2-3天，揭去保鲜膜，继续培养至抽薹开花，中途可视情况适当浇PNS营养液。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2-10cm(少数已经开花)可用于遗传转化。培养条件为：温度22±2℃，光照强度为150μmol·m^-2·s^-1，光/暗周期16h/8h。

农杆菌的准备：-70℃保存的转入pYK3840载体菌种工程菌株GV3101在含利福平Rf50mg/L+Km 50mg/L的YEB固体培养基上划线，于27℃下培养2～3d后，挑取直径为1mm左右的1个单菌落接种于50ml含利福平Rf 50mg/L+Km 50mg/L的LB液体培养基中，27℃、200rpm下震荡培养过夜。8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)，备用。

拟南芥蘸花法转化：将拟南芥的花序浸入渗透液中，轻轻搅动约3～5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22℃培养室低光强度下生长24小时，即可正常培养。初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次。生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。共得到转基因拟南芥30株T₀代植株，自花授粉得到T₀代的种子。将T₀代种子经过潮霉素抗性筛选，将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，PCR，RT-PCR检测，选出阳性植株(T₀)培养至开花结实，收集T₀植株上所结T₁种子，依T₀种子筛选方法继续进行T₁代种子筛选、种植和获得T₂代种子。

3、光敏型启动子AtHemA1P控制的过量合成YHem1水稻的获得

将pYK3840载体通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EH105(曹自力等，遗传学报，2001，28：352-358)的介导的愈伤组织法转入水稻中。具体方法如下所述：

水稻愈伤组织的培养：取水稻品种‘中花11’(上海市种子公司生产)12-15天的未成熟种子，直接用75％的酒精浸泡1min进行表面消毒，然后用5％NaClO溶液(加1-3滴Tween 20)浸泡60min以上(最长可至2h)，并不时摇动，然后用无菌水冲洗4-5次。在超静工作台上用解剖刀和镊子从灭菌后的未成熟种子中挑出未成熟胚，接种于诱导培养基上诱导愈伤组织。培养4-5天后，取培养4-5d的未成熟胚来源的初生愈伤组织立即浸入准备好的农杆菌悬浮液中，侵染30min后，然后将愈伤组织在无菌滤纸上吸除多余的菌液，直接转入共培养培养基于23℃黑暗条件下培养3-4d。将共培养的愈伤组织转出，无菌水漂洗3-4次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，将愈伤组织转入选择培养基上，28℃暗培养，两周继代一次。经2-3代筛选后，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上进行预分化处理；暗培养5-7天后再将抗性愈伤组织转移到分化培养基每天16h光照、8h黑暗、28℃条件下进行分化，再生的小苗剪去原有的根，在生根培养基(Rooting medium)上生根壮苗，随后移入人工气候室盆栽，最初几天保持湿度。转基因水稻的栽培管理按照常规方法进行。共得到转基因水稻7株T₀代植株，自花授粉得到T₀代的种子。将T₀代种子经过潮霉素抗性筛选，将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，PCR，RT-PCR检测，选出阳性植株(T₀)培养至开花结实，收集T₀植株上所结T₁种子，依T₀种子筛选方法继续进行T₁代种子筛选、种植和获得T₂代种子。

三、转光敏型启动子AtHemA1P和YHem1植物的功能鉴定

实例1、光敏型启动子AtHemA1P控制YHem1基因烟草的功能鉴定

1、转基因烟草YHem1基因表达随着光照时间的变化图

为了检测光敏型启动子AtHemA1P控制YHem1基因在光照下表达情况，对转YF8631的T₃代烟草植株，随着光照时间变化，YHem1基因表达情况进行半定量和实时荧光定量PCR检测。

结果如图2所示，无论是用半定量PCR检测还是实时荧光定量PCR检测，转基因烟草有黑暗条件转入光照条件下，YHem1基因的表达量迅速增加，光照5h后达到最大值，随后逐渐下降，当转基因烟草转入黑暗下2.5h，YHem1基因的的表现出很低的转录水平，表明YHem1基因在烟草中的表达受到光敏型启动子AtHemA1P控制。

2、转基因烟草ALA合酶活性和ALA含量测定

ALA合酶活性和ALA含量测定用Zavgorodnyaya等(Plant J，1997，12：169-178)方法，ALA合酶活性以每小时每毫克蛋白质催化生成1nmol的ALA(nmol mg^-1·h^-1)为单位。

表1转基因烟草ALA-S活性和ALA含量测定

表中数值为3次重复测定的平均值，每列中标有不同字母者为LSD检测在平P＜0.01水平上差异显著。

结果如表1所示，转入ALA转基因烟草中YHem1基因编码的ALA合酶可以在植物中将琥珀酰CoA和甘氨酸缩合为ALA，提高植物体内ALA的合成能力。

3、转基因烟草延缓弱光下叶片衰老的研究

转基因烟草植株和野生型‘K326’移栽于白色塑料花盆(直径20cm，高16cm)，用园土(含有15％左右有机肥)∶蛭石∶河沙(体积比4∶1∶1)做基质，放置于塑料大棚内，用一层遮阳网覆盖。培养期间，植株上部晴天正午光照强度约700μmol·m^-2·s^-1，下部约150μmol·m^-2·s^-1。

1)烟草植株叶绿素SPAD值比较

用叶绿素含量测定仪(SPAD-502，日本Konica Minolta公司生产)从下至上测定各个叶片的SPAD值。从表2可以看出，烟草植株叶片SPAD值随着叶位降低而逐渐下降，说明烟草植株叶片在光照不足条件下逐渐衰老，丧失生理功能。与野生型植株相比，转基因烟草中下部叶片SPAD值明显高于对照，叶位越低，转基因植株SPAD值相对值越高，并且达到差异显著水平，说明转基因植株中下部叶片能够保持绿色，保持叶片生理功能，延缓叶片衰老。

表2转基因烟草不同叶位SPAD值测定

表中数值为3次重复测定的平均值，每行中不同字母者表示在P＜0.01水平上差异显著。

2)光合效率和荧光诱导参数的比较

在气温22℃和大气CO₂浓度约460-490μL/L条件下，用Li-6400便携式光合仪活体测定烟草叶片净光合速率(Pn)，测定时内置光源光强约1000μmol·m^-2·s^-1。叶绿素荧光测定用PAM-2100便携式荧光仪(德国Walz公司)参照孙永平和汪良驹(园艺学报，2007，34：901-908)方法进行。结果如表3所示，结果表明表1显示，无论是转基因还是野生型植株，中部叶片净光合速率(Pn)最高，上、下部叶片较低。在野生型植株上，基部叶片Pn显著低于中下部叶片，仅为14.71μmol m^-2s^-1，明显低于转入YHem1的转烟草下部叶片，说明野生型基部叶片光合能力明显下降，而转基因基部叶片仍然保持着较强的光合性能，保证了其同化物的积累，延缓叶片的衰老。另外，转基因植株PS II有效光化学效率Fv′/Fm′普遍高于野生型，其上、中、下部叶片Fv′/Fm′平均值分别比野生型高出4％、8％和21％。PS II实际光化学效率(Yield)在野生型植株中，中上部叶片Yield差异不明显，但基部叶片显著低于中上部叶片(P＜0.05)。转基因烟草植株整体变化趋势与野生型相似，但基部叶片Yield降低幅度明显减少。野生型植株下部叶片Yield只有上部叶片的69％，而转基因植株相应值为83％，说明过量合成ALA有利于维持烟草植株基部叶片PS II光化学效率。无论是转基因还是野生型植株，烟草叶片表观光合电子传递速率(ETR)均随着叶位下降而下降，但是，下降幅度在两种不同烟草之间存在明显差异。野生型植株下部叶片ETR为上部的70％，而转基因植株下部叶片ETR为上部的88％，表明转基因植株叶片，特别是下部叶片，具有较强的光合电子传递能力。

表3转基因烟草不同叶位净光合效率(Pn)、F_v/F_m、Yield和ETR比较

表中数值为3次重复测定的平均值，每行中不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。

3)植株生长的表现

转基因植株生长期明显延长，种子成熟时仍有相当部分叶片保持绿色(图3)。

4)转基因烟草植株的生物学产量

由表4可知，转基因烟草植株的生物产量显著高于野生型。与野生型相比，转基因烟草的叶片数增加19.2％-22.4％，茎杆粗度增加14.1-16.8％，其植株高度增加8.8-14.4％，叶片干重增加69.1-77.4％，且达到显著水平(P＜0.05)说明过量合成ALA能够显著促进烟草植株营养生长，增加干物质积累。

表4转基因烟草农艺性状及产量比较

表中数值为5-10次重复测定的平均值。

实例2、光敏型启动子AtHemA1P控制的YHem1拟南芥的功能鉴定

1、转基因拟南芥提高耐盐性的研究

将实例1获得的阳性转基因拟南芥的独立的T₂代株系(P₀，P₃，P₁₂)种子经过消毒处理(按照实例1中方法二中的步骤2的方法进行)，将消毒后的转基因拟南芥T₂代(P₀，P₃，P₁₂)种子铺在含有0，50mM，100mM，150mMNaCl的MS培养基上，4℃暗培养两天，转入22±2℃，16hr光照培养，盐胁迫生长两周，并观察，以相同条件培养的野生型拟南芥(WT)(野生型拟南芥，‘Columbia’生态型)为对照。

结果发现，在添加NaCl的培养基中，转YK3840-YHem1拟南芥株系和野生型拟南芥(WT)的生长都受到抑制，但是转YK3840-YHem1拟南芥各株系长势较好，在100mM和150mM NaCl的培养基上，转YK3840-YHem1拟南芥根系明显比野生型长，叶色明显比野生型绿(图4a)，各株系萌发率统计如图4b所示，说明转基因株系比野生型更耐盐胁迫。

2、正常光照条件下生长的表现

为了观察光敏型启动子AtHemA1P与YHem1基因转入拟南芥后，转基因拟南芥在光照下生长情况，将拟南芥幼苗按2×3cm移栽于湿润的基质(蛭石、黑土、珍珠岩按18∶6∶1的比例拌匀)的塑料小盆，放在室外正常光条件下培养，中午光照强度约为1500μmol·m^-2·s^-1，期间可视情况适当浇PNS营养液。图5a所示，植株生长45天情况，转基因拟南芥生长势优于野生型。图5b所示，结果期转YK3840-YHem1拟南芥与野生拟南芥结荚情况比较，结果表明，转YK3840-YHem1拟南芥株系，光敏型启动子AtHemA1P能够控制YHem1基因拟南芥在光照条件下正常生长，生长势优于野生型，结荚情况明显多于野生型拟南芥。

实例3、光敏型启动子AtHemA1P控制的YHem1转基因油菜的功能鉴定

将实例1获得的阳性转基因油菜T₂代株系种子和野生型‘沪油-15’种子经55℃温水消毒30min，然后置于铺有两层滤纸的培养皿中，其中加8-10ml的蒸馏水。培养皿放在28℃的恒温培养箱中2-3d。

1.转YF8631-YHem1油菜的抗寒性鉴定

将上述出芽一致的种子移栽于白色塑料花盆(直径20cm，高16cm)，用园土∶蛭石∶珍珠岩(体积比4∶1∶1)做基质，放置于室外，正常条件下过冬，期间浇灌Hoagland营养液。图7显示，冬季持续低温，野生型受冻严重，部分植株死亡，而转基因油菜植株具有较强生命力，能够抵御冻害(图7a)；返青期后，野生型整体长势较弱，生长不整齐，而转基因植株可以迅速返青，长势良好(图7b)。结果表明转YF8631-YHem1油菜具有更强的抗寒性。

2.转YF8631-YHem1油菜的耐盐性鉴定

将上述出芽一致的种子移栽于白色塑料花盆(直径20cm，高16cm)，用珍珠岩做基质，放于塑料大棚中，盐处理为Hoagland营养液+200mM NaCl(200mM NaCl)，并以浇灌Hoagland营养液为对照。图8所示不同时期，200mM NaCl处理对转基因油菜和野生型影响，结果发现200mM NaCl处理，转YK3840-YHem1油菜株系和野生型油菜(WT)的生长都受到抑制，但是无论是莲座期、开花期、还是结果期，转入YF8631-YHem1油菜都具有更强的耐盐性，表现为植株生长、开花时期、开花数量、结荚数量都明显好于野生型。说明YF8631-YHem1油菜具有更强的耐盐性。

3.转YF8631-YHem1油菜的单株产量以及角果比较

如表5所示，对油菜植株的一些农艺性状进了一些分析，转入YF8631-YHem1油菜的产量，果粒数，角果重，千粒重和植株的干重都有明显的增加。图11结果表明，转基因油菜的角果长度，粗度，饱满度都明显要好也野生型。

表5转基因油菜农艺性状及产量比较

表中数值为5-10次重复测定的平均值。

以上结果表明，转入YF8631-YHem1油菜能够在正常环境生长，并且可以有助于植株安全越冬，提高植株的抗冷性，耐盐性，显著增加油菜产量。

实例4、转光敏型启动子AtHemA1P和YHem1番茄功能鉴定

将实例1获得的转基因番茄种子和番茄品种‘合作903’种子经55℃温水消毒后置于铺有两层滤纸的培养皿中，加适量的蒸馏水，保持滤纸湿润，培养皿放在28℃的恒温培养箱中2-3d。选取出芽一致的种子移栽于塑料盆，用园土做基质，放置于塑料大棚内室外，期间浇灌适量Hoagland营养液，培养两个月，培养期间光照强度为50μmol·m^-2·s^-1至1000μmol·m^-2·s^-1。分别

表6转基因番茄弱光下光合性能指数(PI_ABS)日变化

表中数值为15个数的平均值。

将番茄植株放在弱光下，光照强度为20μmol·m^-2·s^-1至200μmol·m^-2·s^-1，和强光下光照强度为200μmol·m^-2·s^-1至1800μmol·m^-2·s^-1，然后用用植物效率仪(PEA，Hansatech Instruments，King’s Lynn，Norfolk，UK)测定快速叶绿素荧光诱导动力学，并按照Srivastava等(Biochim Biophys Acta，1997，1320：95～106)方法计算光合性能指数(PI_ABS)。

表7转基因番茄强光下光合性能指数(PI_ABS)日变化

表中数值为15次重复测定的平均值。

结果表明无论是在弱光(表6)还是在强光(表7)条件下，番茄叶片光合性能指数PI_ABS都是随着光照强度的增加而降低。即PI_ABS早晚高，中午低。上午，PI_ABS随着光强上升逐渐下降。中午光照最强时，光合性能指数PI_ABS最低。与转基因植株相比，野生型植株叶片PI_ABS下降更快，在上午10时已经明显下降，并且恢复较慢；下午14时，野生型恢复到8时的64.5％，而转基因的植株叶片为早上8时的69.5％。强光下(表7)，野生型恢复到8时的9.24％，而转基因的植株叶片恢复为8时的10.1％。以上结果表明，将YF8631-YHem1转入番茄提高了叶片光合性能指数，并且有利于光照后光合性能的恢复，说明转基因番茄无论是在弱光下还是在强光下，其叶片光合能力明显高于野生型植株。

实例5、转光敏型启动子AtHemA1P和YHem1水稻功能鉴定

将转YK3840-YHem1基因的水稻的T₀代所结种子至于37℃进行催芽，然后点播到花盆中，用园土做基质，放置于室外，期间浇灌适量Hoagland营养液，培养生长，开花，结果。选取阳性的水稻植株的一些农艺性状进分析，对照为未转基因的水稻品种‘中花11’水稻植株。结果如表8所示，将YK3840-YHem1基因转入水稻，可以明显调节水稻的生长发育，可以促进水稻植株的生长，分蘖数增多，增产幅度明显，增产率高达9.71％-39.9％。从产量构成因素来看，穗长增加不是很明显，增产效应主要通过增加有效分蘖数和千粒重来实现产量的增加。

表8转基因水稻产量比较

表中数值为10次重复测定的平均值土标准差。

Claims (5)

1.一种控制植物体内ALA合成，促进生长并提高抗逆性的转基因方法，其特征在于，将拟南芥HemA1基因光敏型启动子AtHemA1P和酿酒酵母ALA合酶基因YHem1重组，通过植物表达载体转入植物中，获得到光合能力明显提高，生长发育受到促进，并且延缓衰老，单株产量也比野生型植株明显提高，同时抗逆性也得到提高的转基因植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中AtHemA1P核苷酸序列是Genebank中AF295364的全长序列；YHem1基因的编码序列是Genebank中YSCHEM1AA全长序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中AtHemA1P和YHem1基因是通过植物表达载体pYF8631或pYK3840导入植物中的，其中

酿酒酵母Hem1基因的植物双元载体pYF8631构建为：

将测序正确的pMD18-T载体上的Hem1基因经BamHI和SacI双酶切后，插入植物双元载体pYPXVhb，替换原先载体上的Vhb基因，构成载体pYF8630，随后再将经HindIII和BamHI双酶切的拟南芥HemA1基因启动子AtHemA1P插入pYF8630载体的相应酶切点间，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体pYF8631；

酿酒酵母Hem1基因的植物双元载体pYK3840构建为：

将测序正确的Hem1基因经BamHI和SacI双酶切后，回收1647bp的DNA片段，与相应酶切的pYF7716载体相连，随后再将经HindIII和BamHI双酶切的拟南芥HemA1基因启动子AtHemA1P插入上述载体的相应酶切点间，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体pYK3840。

4.根据权利要求1或2所述的方法，所述的促进植物生长包括烟草、拟南芥、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓、苹果和梨。

5.根据权利要求1或2所述的方法所述的提高抗逆性包括耐盐性，抗寒性，耐高温性，耐弱光性和耐强光性。

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