CN110592115B - 节节麦hmt1基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及节节麦HMT1基因的应用，属于基因功能鉴定技术领域。本发明提供了节节麦HMT1基因在提高植物抗逆能力、总抗氧化能力、硒耐受能力以及植物硒吸收和累积能力中的应用。节节麦HMT1基因能够提高植物抗逆能力、总抗氧化能力、硒耐受能力并能够提高植物硒吸收和累积能力。

Description

节节麦HMT1基因的应用

技术领域

本发明涉及基因功能鉴定技术领域，具体涉及节节麦HMT1基因的应用。

背景技术

硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)被认为是能够特异性地甲醇甲基催化硒代半胱氨酸(SeCys)生产非蛋白的甲基硒代半胱氨酸甲基转移酶，从而减少细胞内硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的浓度。黄芪(Astragalus bisulcatus)SMT蛋白与大肠杆菌yagD的同源性超过40％，后者蛋白质具有甲基催化同型半胱氨酸、硒高半胱氨酸和硒代半胱氨酸的能力。

在各数据库中比对黄芪SMT氨基酸序列发现，这个序列与拟南芥、水稻的同型半胱氨酸甲基转移酶(Homocysteine S-Methyltransferase，HMT，EC 2.1.1.10)相似度分别达70％和65％。此外，拟南芥HMT的cDNA克隆是通过大肠杆菌yagD突变株功能互补实验获得。同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)以甲基蛋氨酸作为甲基供体催化同型半胱氨酸合成蛋氨酸。这些结果共同表明，SMT和HMT具有相似的结构和功能，都具有催化甲基半胱氨酸和高半胱氨酸以及他们的硒同构异素体的能力，只是特异性不相同。

HMT基因与SMT基因来源于一个共同的祖先基因。SMT和HMT高度一致，均可以催化半胱氨酸为甲基半胱氨酸，只是催化活性不同，在植物硫和硒代谢过程中扮演不同的角色。节节麦HMT1基因序列已经公布，但该基因的功能研究尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于提供节节麦HMT1基因的应用。节节麦HMT1基因能够提高植物抗逆能力、总抗氧化能力、硒耐受能力并能够提高植物硒吸收和累积能力。

本发明提供了节节麦HMT1基因在提高植物抗逆能力中的应用。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在提高植物总抗氧化能力中的应用。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在提高植物硒耐受能力中的应用。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在提高植物硒吸收和累积能力中的应用。

优选的是，所述植物包括烟草。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在培育富硒植物中的应用。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在培育富硒小麦中的应用。

本发明提供了节节麦HMT1基因的应用。节节麦HMT1(AetHMT1)基因能够提高植物抗逆能力、总抗氧化能力、硒耐受能力并能够提高植物硒吸收和累积能力；AetHMT1基因与植物硒代谢相关，它能够提高植物硒吸收和累积能力，以节节麦HMT1作为有效的硒资源，可以通过遗传育种的方法，合成富硒小麦来满足人们日常硒营养以降低人们患癌症风险。

附图说明

图1为本发明提供的根癌农杆菌LBA4404介导遗传转化HMT1基因至烟草技术开发路线图；

图2为本发明提供的AetHMT1基因植物表达载体构建示意图；

图3为本发明提供的植物表达载体pBI-XS HMT1菌落PCR筛选结果图；

图4为本发明提供的转AetHMT1基因烟草组培过程图；

图5为本发明提供的转AetHMT1基因烟草DNA水平PCR检测结果图；

图6为本发明提供的转AetHMT1基因烟草样品总RNA电泳图；

图7为本发明提供的转AetHMT1基因烟草转录水平PCR检测结果图；

图8为本发明提供的转AetHMT1基因烟草开花及种子的获得图；

图9为本发明提供的AetHMT1对硒胁迫下烟草含水率的影响结果图；

图10为本发明提供的AetHMT1对硒胁迫下烟草MDA含量的影响结果图；

图11为本发明提供的AetHMT1对硒处理下烟草T-AOC能力的影响结果图；

图12为本发明提供的AetHMT1对硒胁迫下烟草POD活性的影响结果图；

图13为本发明提供的AetHMT1对硒处理下烟草总硒含量的影响结果图。

具体实施方式

本发明提供了节节麦HMT1基因在提高植物抗逆能力中的应用。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在提高植物总抗氧化能力中的应用。转AetHMT1基因烟草的T-AOC能力高于野生型烟草。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在提高植物硒耐受能力中的应用。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在提高植物硒吸收和累积能力中的应用。转AetHMT1基因烟草总硒含量均高于野生型烟草三升。

在本发明中，所述植物包括烟草。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在培育富硒植物中的应用。

本发明还提供了节节麦HMT1基因在培育富硒小麦中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的节节麦HMT1基因的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

材料：二倍体节节麦Ae.tauschii ssp.strangulataAS2407由四川农业大学提供，试验用野生型烟草三升，上述材料经青海省作物分子育种重点实验室繁殖、保存。

选取籽粒饱满的AS2407种子放入培养皿中，加入蒸馏水，于4℃冰箱低温室中春花2日，发芽后，移栽至花盆中，在光照培养间培养，一周后随机取叶片。样品液氮速冻后提取RNA。

利用根癌农杆菌LBA4404介导遗传转化HMT1基因至烟草，分析转基因烟草的生理特性。具体实施方案如图1。

转基因烟草的获得

1特异性酶切引物设计及PCR扩增

根据目的基因序列及真表达载体pBI121的多克隆位点序列设计一对含有酶切位点的引物：XH1-F：5'-TGCTCTAGAGCAATGGCCGGGGTGGT GGA-3'(SEQ ID NO:1，划线处为Xba I酶切位点)和SH1-R：5'-TCCCCCGGGGGATCACTGGC CGTTCCTGCTCTT-3'(SEQ ID NO:2，划线处为Sma I酶切位点)，以节节麦叶片总RNA逆转录合成cDNA为模板，进行PCR扩增。

2构建节节麦HMT1基因T-载体及获得大量目的片段

回收纯化目的片段，T-载体克隆HMT1基因及阳性筛选，连接产物转化至大肠杆菌，筛选重组阳性克隆，提取克隆质粒，获得大量带有酶切位点的目的片段。

3酶切、连接目的条带，构建重组真核表达载体

将回收片段和pBI121质粒同时37℃水浴30min进行双酶切，体系如表1所示：

表1酶切体系表

酶切后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。纯化酶切后目的片段及载体，连接构建重组质粒，命名为pBI-HMT1。AetHMT1基因植物表达载体构建示意图如图2所示。

AetHMT1基因真核表达载体的构建和重组子的鉴定结果如下：

利用XH1-F、SH1-R引物对AS2407叶片cDNA进行PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，得到含有酶切位点、大小约为1000bp的特异性条带，分别将扩增产物回收、加A后连接到T载体进行测序，从AS2407克隆获得质粒命名为pGEM-XSAetHMT1。用Xba I酶和Sma I酶对pGEM-XS AetHMT1和pBI121分别进行双酶切。后连接重组。筛选阳性克隆(图3，植物表达载体pBI-XS HMT1菌落PCR筛选结果图，M：Marker 1kb)，送去测序。选取表达质粒目的基因测序结果与克隆序列完全一致且方向正确的菌株。命名为pBI-XSAetHMT1。至此，AetHMT1基因真核表达载体构建成功。

实施例2

转节节麦HMT1基因烟草遗传转化体系建立

1转化根癌农杆菌

将构建好的真核表达载体(命名为pBI-AetHMT1)转化入LBA4404农杆菌，详细步骤如下：

(1)取-80℃保存的LBA4404农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。

(2)无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入1μg重组质粒pBI-AetHMT1。轻轻混匀，冰水浴中静置10min。

(3)将离心管置于液氮中速冻5min。

(4)然后迅速将离心管置于37℃水浴中保持5min。

(5)将离心管放回冰浴中5min。

(6)无菌条件下加入800μL无抗生素的LB液体培养基，28℃振荡3h。

(7)5000rpm离心1min收菌，留100μL左右上清，轻轻捶打重悬菌体，加到同时含有100mg/LKana⁺和100mg/L利福平(Rifampicin，RFP)的LB固体培养基平板上，用无菌的细菌涂布器将细菌均匀涂开。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28℃培养48h。

2筛选阳性克隆

分别挑取平板上过夜培养的生长良好的单个菌落，在同时含有100mg/L Kana⁺和100mg/LRFP的LB固体培养基平板上划线过夜培养48h。对菌线进行编号，用XH1-F和SH1-R进行菌落PCR筛选阳性克隆，所用主要试剂及详细步骤同实施例2。选取10个阳性克隆，送去测序。

3根癌农杆菌LBA4404介导的植物遗传转化

大量扩繁含有测序正确的质粒的LBA4404菌液，侵染烟草，详细步骤如下：

(1)将测序正确的阳性克隆在同时含有100mg/LKana⁺和100mg/LRFP的LB液体培养基中28℃、200rpm培养48h，按照1：100～1：50的比例扩大培养50mL，至OD₆₀₀＝0.5；取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD₆₀₀值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD₆₀₀值，至OD₆₀₀为0.01～0.1。

(2)外植体的消毒：选取第一片完全展开的野生型烟草三升健康叶片(4～5周)，在超净工作台上，用无菌水冲洗2-3次；用75％酒精冲1min；用灭菌水洗掉酒精(2～3次)；用次氯酸洗10min；最后用灭菌水冲洗4～5次。

(3)侵染：用无菌滤纸吸干灭菌后的叶片多余水分，用手术刀切成0.5cm见方大小(切掉叶缘避开主脉)，放入菌液中10min，取出，用无菌滤纸吸去附着的菌液。

(4)共培养：将侵染的叶片上表面朝下放在含1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)+0.1mg/L萘乙酸(1-Naphthylacetic acid，NAA)的MS固体培养基上(20片/皿)，暗培养2～3天。

(5)灭菌培养：将暗培养2～3天的叶片转至含有1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+100mg/L头孢噻肟钠盐(Cefotaxime sodium salt，cefo)的MS固体培养基上暗培养7天。

(6)分化培养：将灭菌培养的叶片转至含有1mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+100mg/Lcefo+100mg/LKana⁺的MS固体培养基上，光照培养至长出外植体。

(7)生根培养：将长出的外植体在超净工作台上用手术刀切下，放入含有0.1mg/LNAA+100mg/L cefo+100mg/LKana⁺的MS固体培养基上，进行生根培养。

(8)移栽：将生根的外植体转入含有营养土的花盆中，直至烟草开花结果。

转AetHMT1基因烟草的获得结果如下：

将构建成功的植物表达载体转入农杆菌LBA4404，大量培养，侵染野生型烟草三升，建立转基因烟草遗传转化体系。利用潮霉素(Streptomyces hygroscopious，HYG)和卡纳(Kana)筛选抗性芽，抗性芽经过继续培养再生成植株(图4，转AetHMT1基因烟草组培过程，其中，A：愈伤组织诱导筛选；B：抗性芽生长；C：再生苗生根；D：再生苗移栽；E：再生苗培养)。

转AetHMT1基因烟草的分子鉴定结果如下：

用CTAB方法提取转基因烟草的基因组DNA，利用特异引物XH1-F、SH1-R进行PCR扩增，阳性植株在1000bp附近的出现条带(图5，转AetHMT1基因烟草DNA水平PCR检测结果图，其中，CK：野生型对照，M：Marker，泳道编号：烟草编号)，说明通过转基因获得的再生植株含有目的基因。

用试剂盒提取筛选到的阳性植株的RNA并反转合成第一条链(图6，转AetHMT1基因烟草样品总RNA电泳图，其中，M：Marker，CK：野生型对照，泳道编号：烟草编号)，用特异性引物XH1-F、SH1-R进行PCR扩增，与基因组DNA一样在1000bp附近出现条带(图7，转AetHMT1基因烟草转录水平PCR检测结果，其中，M：Marker，泳道编号：组培烟草编号，CK：野生型对照)。说明转入的AetHMT1基因能够在烟草内进行正常的转录表达。鉴定46株组培苗，共获得26株转基因植株，转化率达53.06％。

转AetHMT1基因烟草的种子的获得：

继续培养鉴定成功的转AetHMT1基因烟草植株，待烟草开花结果，收获转基因烟草种子。共获得9株转基因烟草的种子(图8，转AetHMT1基因烟草开花及种子的获得图，左图为烟草花，右图为种子)。

实施例3

转节节麦HMT1基因烟草抗逆性初步研究

烟草无菌组培苗种植及含水率的测定

在超净工作台上，随机挑选籽粒饱满的野生型烟草(三升)和转AetHMT1基因烟草种子适量，置于1.5mL的EP(eppendorf)管中，在无菌超净台中先用75％乙醇灭菌1min，弃去废液后用无菌水清洗2次，20％次氯酸钠溶液灭菌10min，弃去废液后用无菌水清洗6遍，用无菌的滤纸吸干种子表面水分，于MS固体培养基(不含其他元素)上培育野生型烟草(三升)和转AetHMT1基因烟草若干。于三叶一心期时，挑选长势均匀的烟草，转移至灭菌的含有相同培养基的三角瓶中，继续培养。待出苗50天后，转移至含有不同浓度Na₂SeO₄(0μM、50μM、100μM)无菌固体MS培养基中培养1周。每个处理随机选取3株，将培养基以下的部分减掉，称取其鲜重，立即在105℃下杀青20min，然后在80℃烘干至恒重，测定烟草的含水率。叶片含水量的计算公式如下(鲍士旦，2000)：

叶片含水率(％)＝(叶片鲜重－叶片干重)/叶片鲜重×100％。

AetHMT1对硒胁迫下烟草含水率的影响结果如下：

对不同硒胁迫下烟草的含水率进行统计分析。结果表明(图9，AetHMT1对硒胁迫下烟草含水率的影响结果图)，烟草的含水率在硒胁迫后低于空白，且差异显著(p<0.05)。在50和100μMNa₂SeO₄的胁迫下，转AetHMT1基因烟草的含水率均低于三升，分别降低0.12％和0.10％；0μMNa₂SeO₄胁迫下，转AetHMT1基因烟草发芽率比三升高出0.16％。

抗氧化物活性的测定

丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)的测定试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司，实验方法参照说明书。

AetHMT1对硒胁迫下烟草丙二醛(MDA)含量的影响结果如下：

对不同硒胁迫下烟草的丙二醛含量进行统计分析。结果表明(图10，AetHMT1对硒胁迫下烟草MDA含量的影响结果图)，硒胁迫后，烟草的MDA含量增加，但差异不显著(p>0.05)。在0和100μMNa₂SeO₄胁迫下，转AetHMT1基因烟草的MDA含量均低于三升，分别降低18.75％和22.41％；但在50μM Na₂SeO₄胁迫下，转AetHMT1基因烟草MDA含量比三升高63.04％。

AetHMT1对硒胁迫下烟草总抗氧化能力的影响如下

对不同硒处理下，烟草的T-AOC能力进行统计分析。结果表明(图11，AetHMT1对硒处理下烟草T-AOC能力的影响结果图)，硒胁迫后，烟草的T-AOC能力升高，但差异不显著(p>0.05)。在0μM Na₂SeO₄处理下，转AetHMT1基因烟草的T-AOC能力比三升低47.98％；在50和100μMNa₂SeO₄胁迫下，转AetHMT1基因烟草的T-AOC能力均比三升高，分别高出672.73％和249.12％。表明，在硒胁迫后，AetHMT1迅速提高了烟草的总抗氧化能力。

对不同硒胁迫下烟草的POD活性进行统计分析。结果表明(图12，AetHMT1对硒胁迫下烟草POD活性的影响结果图)，硒胁迫后，烟草的POD活性升高，但差异不显著(p>0.05)。在0、50和100μMNa₂SeO₄处理下，转AetHMT1基因烟草的POD活性均高于三升，分别高出46.27％、55.91％和22.97％。

实施例4

转节节麦HMT1基因烟草耐硒富硒性研究

随机挑选好野生型烟草(三升)和转AetHMT1基因烟草种子适量，置于1.5mL的EP管中，在无菌超净台中先用75％乙醇灭菌1min，弃去废液后用无菌水清洗2次，20％次氯酸钠溶液灭菌10min，弃去废液后用无菌水清洗6遍，用无菌的滤纸吸干种子表面水分，将种子分别于无菌固体MS培养基上培养，置于光照培养箱中培养，光照16h/黑暗8h，温度25℃。出苗50d后分别将烟草幼苗移栽至含有不同浓度Na₂SeO₄(0μM、10μM、50μM)无菌固体MS培养基继续培养48h，试验重复3次。

总硒含量的测定：每个处理随机取样，用蒸馏水冲洗干净，将样品在80℃烘干至恒重。称取0.5g样品用盐酸消化后采用ICP-MS方法进行总硒含量测定(赵德勇，2015)。

AetHMT1对硒处理下烟草硒吸收能力的影响

对不同硒处理下，烟草的总硒含量进行统计分析。结果表明(图13，AetHMT1对硒处理下烟草总硒含量的影响结果图)，硒处理后，烟草的总硒含量均升高，且差异显著(p<0.05)。在0、10和50μMNa₂SeO₄处理下，转AetHMT1基因烟草的硒含量均比三升高，分别高74.36％、18.90％和8.59％。

建立转AetHMT1基因烟草遗传表达体系，经过试验前期对受体植物转化细胞的高效筛选和农杆菌的抑制等转化条件进行筛选(陈丽娟，2014)。鉴定46株组培植株，获得26株转基因苗，转化率达53.06％。建立了转AetHMT1基因的烟草转化体系，经PCR检测证明，外源基因已初步整合到烟草基因组中，并能够在转录水平上表达。获得9株转基因烟草种子。

结果：(1)植物的含水量分为自由水和结合水，大部分为自由水。自由水含量多说明植物代谢快；少则反之。转AetHMT1基因烟草含水率均低于三升，说明，转AetHMT1基因烟草比野生型烟草代谢慢。(2)丙二醛(MDA)是自由基进行细胞膜脂过氧化的最终产物之一。它是有细胞毒性的物质，可导致细胞膜功能紊乱，且对许多功能分子有破坏作用，其含量的增加与植物细胞损伤密切相关，其含量变化是质膜损伤程度的重要标志之一。AetHMT1基因对硒胁迫下烟草的MDA含量也产生了影响：转AetHMT1基因烟草MDA含量低于野生型烟草(50μMNa₂SeO₄除外)，表明AetHMT1减轻了硒胁迫对烟草质膜的损伤，具有保护细胞的作用。(3)在非硒胁迫(0μM Na₂SeO₄)下，转AetHMT1基因烟草的T-AOC能力低于野生型烟草；而在硒胁迫(50、100μMNa₂SeO₄)下，转AetHMT1基因烟草的T-AOC能力高于野生型烟草，表明：在硒胁迫下，AetHMT1迅速提高了烟草总抗氧化能力。

研究AetHMT1基因对硒处理下烟草硒吸收能力的影响，结果转AetHMT1基因烟草总硒含量均高于野生型烟草三升，表明AetHMT1能够提高烟草的硒吸收和积累能力。

综上所述，AetHMT1提高了烟草抗逆能力，而且它能够提高烟草的硒吸收和累积能力。AetHMT1基因与植物硒代谢相关，它能够提高植物硒吸收和累积能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院西北高原生物研究所

<120> 节节麦HMT1基因的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctctagag caatggccgg ggtggtgga 29

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccccgggg gatcactggc cgttcctgct ctt 33

Claims (1)

1.节节麦HMT1基因在降低烟草含水率中的应用。

Images