KR100270910B1 - 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 대량생산하는 형질전환된 식물체, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

수퍼옥사이드 디스뮤타제를 대량생산하는 형질전환된 식물체, 그의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD)를 대량 생산하는 형질전환된 식물체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, SOD 효소 유전자를 도입한 아그로박테리아를 식물 조직과 공동 배양하여 얻은 형질전환체를 이용하여 제조한 높은 향산화 활성을 가지는 과채류 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 조직 배양 과정에서 자엽 절편으로부터 부정아를 유도하여 기관을 배양하는 방법 또는 발아된 종자로부터 캘러스를 형성시킨 다음 체세포배를 유도하는 방법 등으로 식물체를 재분화시키는데, 상기 과정으로 얻은 오이와 토마토 등은 종래 품종보다 약 3.2배 이상 높은 SOD 활성을 나타내므로 환경 스트레스 내성 식물체로서 뿐만 아니라 피부 맛사지용 팩을 포함한 화장품의 재료, 신 기능성 식품의 첨가제 의약품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수퍼옥사이드 디스뮤타제를 대량생산하는 형질전환된 식물체, 그의 제조방법 및 용도
본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superocide dismutase, SOD)를 대량 생산하는 형질전환된 식물체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 SOD 효소 유전자를 도입한 아그로박테리아를 식물 조직과 공동 배양하여 얻은 형질전환체를 이용하여 제조한 과채류 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명 의 식물체는 높은 향산화 활성으로 인하여 환경 스트레스 내성 식물체로서 뿐만 아니라 화장품, 기능성 식품 및 의약품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
식물을 포함한 대부분의 생물은 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스 뿐만 아니라 지구 환경 악화에 따라 생기는 각종 환경 스트레스를 받으면 생명유지에 필요한 필수 원소인 산소가 반응성이 높아 심각한 생리적인 장해 등을 유발하는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼, 과산화수소, 수산화 라디칼 등의 활성산소종(reactive oxyzen species)으로 변하게 된다. 따라서 생체 내에는 이러한 활성 산소를 제거하는 시스템으로 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD : EC 1. 15. 1. 1). 퍼옥시다제(peroxidase, POD), 카탈라제(catalase, CAT) 등의 고분자 항산화 효소와 비타민 C, 비타민 E, 글루타치온(glutathion) 등의 항산화 물질 등이 많이 존재하게 된다.
SOD는 거의 모든 생물에 존재하고, 산소 분자가 전자와 반응(202+ 2e-→ 2·O2 -)하여 생기는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O2 -)을 제거하는 효소이다(2·O2 -→ H2O2+ O2). 수퍼옥사이드 음이온 라디칼과 상기 SOD의 작용으로 생성된 과산화수소는 철 존재 하에서 가장 독성이 높은 활성산소종인 수산화기 라디칼(hydroxyl radical, ·OH)을 생성하므로, 생체 내에서 과산화수소는 퍼옥시다제 (peroxidase) 또는 카탈라아제(cata1ase) 등에 의하여 독성이 없는 물(H2O)로 변환된다. 이 때 SOD는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼을 제거하고 수산화기 라디칼의 생성도 예방하는 작용을 하므로 생체 방어 기구에 중요한 역할을 한다.
상기 효소학적 특성으로 인하여 SOD는 환경 스트레스에 의해 생성되는 생체내 할성산소종을 제거하는 환경 내성 인자로서 중요하다. 이외에도 SOD는 의약품, 식품, 화장품 등에 이용될 수 있는 가능성이 제시되고 있는데, 구체적으로 항염증제로서 관절염, 류마티스 등에 유효한 것으로 보고되어 있고, 허혈성 심질환, 방사선 장해방지 등에 효과가 있는 것으로 인정된 바 있으며, 최근에는 자외선에 피해를 입은 피부에 SOD를 바르는 경우 피부의 표피 속으로 S0D가 침투되어 손상된 피부가 회복되는 것에 관한 연구도 보고된 바 있었다(Experimental Dermatology, 6, 116-121. 1997). 상기 연구 결과에 힘입어 SOD를 유효 성분으로 하는 의약품의 개발이 미국, 일본 등지의 제약회사에서 활발히 진행되고 있고, 국내에서도 노화방지용 SOD 함유 화장품이 개발, 시판되고 있다(SODと活性酸素調節制日本醫學館, 1989).
그러나, SOD의 활성은 그 지속 기간이 길지 않아 SOD를 주성분으로 하는 화장품 등을 제조하는 화장품 등을 제조하는 것이 어려우므로 제품으로서 출시되는데 제한이 있다. 또한, 의약품으로 S0D를 개발하는데 있어서도 SOD를 체내로 이동시켜 생체 내에서 활성을 유지시키는 것이 중요한 관건으로 되어 있다. 실제로 SOD 의약품을 개발하기 위하여 SOD를 폴리에칠렌 글리콜(polyethylene glycol), 레시친(lecithin) 등과 결합시켜 생체 내로의 이동을 용이하게 하고 생체 내 수명을 연장하는데 주안점을 둔 연구들이 제약회사 등에서 이루어졌다(Bie Industry, 13. 44-47. 1996).
또한, 상기의 특성을 가지는 SOD의 유전자를 이용하여 형질전환된 식물체를 얻음으로써 주로 오존, 저온, 제초제 등의 환경 스트레스에 대한 내성기구를 연구하고 환경 내성 식물을 개발하려는 연구가 이루어진 바 있었다(Plant Physiology, 10, 1049-1054, 1995). gksvus SOD와는 별도로 백신 유전자 등을 바나나 등에 도입하여 형질전환된 식물체를 제조함으로 먹는 백신(edible vaccine)을 개발하려는 연구도 보고되었다(Bio/Technoligy, 13, 379-392, 1995). 그러나 SOD를 먹온 수 있는 식물 조직에서 과량 발현시키는 식물 생체 반응기(plant bioreactor) 시스템은 전혀 그 개발이 시도된 바가 없었다.
오이(Cucumis sativus L.)는 우리 나라에서 재배가 유망시되는 고소득 채소 작물로서, 식품으로서 부가 가치가 높을 뿐만 아니라 오이를 이용한 맛사지용 팩은 영양분의 공급이나 노폐물 및 각질의 제거, 염증에 대한 진증 효과, 미백, 보습 등 여러 가지 효능이 있어 널리 이용되고 있다(오이재배기술, 구례오이시험장. 1997). 오이 팩의 과학적인 효능에 대해서는 잘 알려져 있지 않지만, 오이의 과실에 함유된 SOD함량(units/mg 단백질)은 배양 세포에 비해 매우 낮은 것으로 알려져 있어 유전공학적인 방법으로 오이 식물체에서 SOD 활성을 증대시키면 유용하게 이용될 것이 기대된다.
이에 본 발명자들은 화장품, 기능성 식품 및 의약품 등에 이용될 수 있는 SOD를 대량 생산하는 과채류를 개발하기 위하여, SOD 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현 플라스미드를 이용하여 아그로박테리아에 SOD 유전자를 도입하고, 이를 식물 조직과 공동 배양하여 SOD 유전자를 대량 발현하는 형질전환된 오이 또는 토마토를 제조하고 이로부터 무성 번식이 가능한 식물 캘러스를 얻음으로써 본 발명을 완성하었다.
본 발명은 화장품, 기능성 식품 및 기능성 의약품 등에 사용될 수 있는 SOD를 대량 생산하는 형질전환된 식물체 및 그의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.
제1도는 기관 배양 (자엽 배양) 방법에 의하여 재분화된 오이를 나타낸 것이고,
제2도는 체세포배 배양 방법에 의하여 재분화된 오이를 나타낸 것이고,
제3도는 본 발명에서 사용한 식물 형질전환용 발현 플라스미드, pBin19 바이너리 벡터 시스템을 나타낸 것이고,
제4도는 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자를 포함하는 아그로박테리아를 오이 자엽 절편과 공동 배양하여 얻은 형질전환된 오이를 나타낸 것이고,
제5도는 형질전환된 식물체에 도입된 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자를 증합효소 연쇄반응으로 확인한 것이고,
제6도는 형질전환된 오이 과실에서의 슈퍼옥나이드 디스뮤타제 활성을 네티브 전기영동으로 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD를 대량 생산하는 형질전환된 식물체를 제공한다. 구체적으로, 상기 SOD를 생산하는 식물체는 식용 가능한 과채류이고, 바람직하게 오이 및 토마토 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 SOD 유전자를 도입한 아그로박테리아를 식물 조직과 공동 배양하여 형질전환시킨 다음 재분화하는 상기 SOD를 대량 생산하는 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 식물 조직 배양 과정에서 자엽 절편으로부터 부정아를 유도하여 기관을 배양하거나, 발아된 종자의 하배축으로부터 캘러스를 형성시킨 다음 체세포배를 배양하는 과정 등을 수행하여 상기 식물체틀 제조한다.
또한, 본 발명은 상기 SOD 유전자로 형질전환된 식물체로부터 유도한 식물 캘러스 Cucumis sativus/MnSOD를 제공한다(수탁번호 : KCTC 0449 BP).
또한, 본 발명은 상기 SOD 효소를 생산하는 식물체를 피부 맛사지용 팩을 포함하는 화장품의 재료, 신 기능성 식품의 첨가제 및 의약품 등으로 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 대량 생산하는 식물체 및 그의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 SOD를 대량 생산하는 상기 식물체를 제조하기 위하여, SOD 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현 플라스미드를 이용하여 아그로박테리마에 SOD 유전자를 도입하고, 이틀 식물 조직과 공동 배양하여 형질전환된 식물체를 얻는다. 상기 식물 조직의 공동 배양 과정에 있어서, 자엽 절편으로부터 부정아를 유도하여 기관 배양을 수행하거나 발아된 종자의 하배축으로부터 캘러스를 형성시킨 다음 체세포배를 배양하는 과정을 수행하며 식물체를 재분화시킨다(제1도 및 제2도 참조).
또한, 상기 기관 배양으로 식물체를 재분화시키는 과정은 과채류의 종자를 멸균 처리하여 생장 조절 물질이 첨가되지 않은 배지에서 발아시키고, 발아된 자엽의 기저부를 절단하여 배지에 이식, 배양함으로 부정아(shoot)를 유도하고 기관을 생성시킨 다음 소식물체를 원예용 상토에 순화시키는 것으로 이루어진다.
또한, 상기 체세포배 배양으로 재분화시키는 과정은 과채류의 종자를 발아시키고, 그의 하배축을 절단하여 배발생 캘러스를 유도하고 이로부터 체세포배가 발생하도록 한 다음 소식물체를 순화시키는 과정으로 이루어진다. 이와 같은 체세포배 발생을 통한 식물체 재분화 시스템은 입자 충돌(particle bombardment)에 의한 외래 유전자의 형질전환에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 과정에서 식물체로는 모든 종류의 식물을 사용할 수 있으나. 오이, 토마토 또는 고추 등을 포함한 식용 가능한 과채류를 이용하면 항산화 활성이 있는 건강 식품, 화장품 및 의약품 등에 이용될 수 있어 바람직하다.
본 발명은 피부 맛사지용 팩 등의 재료로 유용한 SOD를 대량 생산하는 과채류를 생산하기 위하여, 우선 기존의 오이 품종 등에서 SOD의 함량 및 활성을 조사하였다. 그 결과 표 1에 나타난 바와 같이, 품종에 따른 차이가 없이 오이 과실과 잎 등에서 S0D 함량(units/mg 단백질)이 낮은 것으로 나타나 오이 등의 과채류에서 SOD 활성을 높이는 것이 유용함을 확인하였다.
본 발명은 상기 국내 품종의 오이에 SOD 유전자를 도입하기 위하여, 발아시킨 오이 종자의 자엽 기저부(basal rrgion)를 절단하여 아세토시린곤(acetosyringone) 등이 포함된 아그로박테리아 배양액에 침지시킨 다음 공동 배양 하는데, 여기에서 SOD 유전자를 도입한 아그로박테리아를 사용하여 자엽 절편을 감염시키고 여기에서 혀질전환된 부정아를 유도, 선발한다.
상기 식물체의 형질전환 과정에서 완두(Pisum sativum)의 SOD 유전자(MnSOD), 카나마이신 저항성 유전자, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터 등으로 구성된 발현 플라스미드 pBin19를 사용하여(제3도 참조), 아그로박테리아 균주에 SOD 유전자를 도입하는 것이 바람직하며, 이 때 아그로박테리아 투메파시엔스 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 발현 플라스미드와 아그로박테리아 균주는 다양한 식물체에 응용이 가능하고, 이의에도 SOD 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현 플라스미드 및 이를 도일할 수 있는 아그로박테리아 균주는 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 식물 형필전환용 아그로박테리아 균주로서 아그로박테리아 투메파시 엔스 LBA 4404(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404) 균주를 사용하였다.
본 발명은 상기 부정아로부터 기관을 생성시킨 다음 소식물체인 오이를 원예용 상토에 옮겨 순화시킴으로써 형질전환된 오이를 얻는다.
본 발명은 상기 형질전환된 오이로부터 무성 번식이 가능한 캘러스를 유도하여 그 중 하나를 Cucumis sativus/MnSOD로 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 4월 7일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0449 BP).
본 발명은 상기 형질전한된 오이(제4도 참포)에 도입된 SOD 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction) 등으로 확인하였다(제5도 및 제6도 참조). 이 때 주형으로 선발된 오이로부터 분리한 DNA 그리고 서열 1 및 서열 2 의 프라이머를 이용한다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환된 과실의 SOD 함량을 전기영동 방법 등으로 조사하였다. 그 결과 형질전환된 오이는 정상식물에 비하여 약 3.2배 이상 SOD 활성이 높고, 이는 SOD 유전자의 도입에 의해 특이적으로 나타나는 것이었다.
따라서, 본 발명의 방법으로 얻은 SOD를 대량 생산하는 과채류는 항산화 작용이 탁월하여 화장품의 원료로 유용하게 사용될 수 있고, 이외에도 신 기능성 식품의 첨가제 및 의약품 등으로 사용될 수 있으며, 특히 형질전환된 오이 등은 화장품으로 피부 맛사지용 팩 등에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, SOD를 대량 생산하는 본 발명의 과채류는 환경 스트레스에 대하여 내성도 가지므로, 고온 다습한 비닐하우스 등과 같은 높은 환경 스트레스 조건에서도 재배될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[수퍼옥사이드 디스뮤타제의 활성 조사 및 전기영동]
본 발명은 오이 과실의 SOD 및 그의 활성을 조사하기 위하여, 우선 산틴옥시다제(xanthine oxidase, XOD)와 사이토크롬 c(cytochrome c)를 이용한 방법을 사용하였다(Journal of Bioiogical Chemistry, 244, 6049-6055, 1969) 과실 중앙부위를 코로크 보러(cork borer)를 사용하여 시료를 균일하게 채취하고 생체중 1g을 10% 글리세롤(glycerol)을 포함한 0.2 M 트리스-염산 완충용액(pH 6.8) 1 mL와 함께 얼음 위의 유발에서 마쇄한 다음, 8,000 × g로 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 SOD를 함유하는 효소액으로 사용하였다. 효소 활성을 측정하기 위하여 반응액[10 mL 산틴 2.5 mL, 10 mM 사이토크롬 c 0,5 mL, 0.1 mM EDTA를 포함한 0.05 M 인산 완충용액(pH 7.8) 47 mL의 혼합액을 조제하여 사용함]을 매번 조제하여 사용하였다. 효소 반응은 상기 반응액 1 mL과 효소액(10 μL 전후)을 큐벳에 넣은 다음, 10-4M EDTA를 포함하는 0.05 M 인산 완충용액(pH 7.8)으로 25배 희석한 XOD 10 μL 를 첨가함으로 유발시켰다. 효소 활성 1 단위(unit)는 25℃에서 상기 반응을 시작하여 2분간 550nm에서 흡광도 변화를 조사하여 XOD 활성이 50% 억제된 것으로 정의하였다.
또한 SOD 효소의 존재를 보참 및 프리도비치의 방법(Beauchamp 및 Fridovich, Analytical Biochemistry, 44, 276-287, 1971)을 약간 변형시킨 네티브 겔(native gel)을 사용한 전기영동으로 확인하였다. 구체적으로 13% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacryamide gel)을 사용하여 100 V에서 3시간 동안 SOD를 함유하는 효소액을 전기영동시켰다. SOD는 겔을 염색액 [50mM KH2PO4, 0.1 mM EDTA, 0.2% 테메드(Temed), 0.026 mM 리보플라빈(riboflavin), 0.25 mM 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium)의 혼합액]에 30분간 넣어 암상태에서 진탕하는 방법으로 검출하였다. 단백질 정량은 브래드포드 방법(Bradford, Analytical Biochemistry, 72, 248-254, 1976)으로 수행하고, 상기 효소액의 일정액으로부터 동일한 단백질 농도가 되도록 조정하였다.
[실시예 2]
[오이 품종에 따른 SOD 함량 분석]
본 발명은 현재 재배되고 있는 다양한 오이 품종에서 SOD 함량을 조사하였다. 구례 오이 시험장에서 재배한 16 품종의 오이 과실 mg 단백질당 SOD 활성(units/mg 단백질)은 74±31이였으며, 과실 g 무게당 활성(units/g fresh wt)은 150±103이였다. 상기 결과는 오이 과실과 잎의 SOD 함량(units/mg 단백질)이 비교적 낮고, 오이에 SOD 유전자를 도입한 신기능성 오이를 개발하는 것이 매우 유용함을 나타내는 것이다. 특히 오이 배양세포를 비롯하여 많은 종류의 식물배양 세포주에서 관찰되는 SOD 활성과 비교하면 월등히 낮은 함량이기 때문에 유전공학적인 방법으로 오이 식물체내로 SOD 유전자를 도입하면 SOD 활성을 증대시킬 수 있음이 시사되었다(식물조직배양학회지, 23, 103-106, 1996).
- : 측정 하지 않았슴
[실시예 3]
[오이의 기관 분화(자엽 배양)에 의한 식물체 재분화]
본 발명은 기관 분화로 식물체를 재분화시키기 위하여, 오이 종자(여름삼척, 은성백다다기, 백봉다다기, 조생낙합, 장형낙합)를 증류수에 1시간 동안 침지시키고 75% 에탄올에 1분간 1차 표면 살균한 다음 2% 차염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 15분간 2차 멸균시켜 멸균수로 3회 세척하였다. 또한, 멸균 처리된 종자는 생장 조절 물질이 첨가되지 않은 MS(Murashige and Skoog, Physiol, Plant, 15, 473-497, 1962) 배지에서 발아시켰다. 종자 발아조건은 약 15 μmol m-2, s-1의 형광빛 아래에서 16시간, 암 조건 8시간의 광주기와 25±1℃의 온도였다. 발아 7일째 자엽의 기저부(크기 약 5 × 5 mm)를 절단하여 배지에 이식하여 배양하였다(제1(a)도 참조). 자엽 절편 배양을 위한 배지는 MS 배지에 3% 서당(sucrose)과 0.4% 파이토겔(Phytagel)를 첨가한 다음 사이토카이닌(cytokinin) [1.0 또는 2.0 mg/L 제아틴(zeatin), 1,0 mg/L 벤질아데닌(6-benzyladenine, BA), 1.0 또는 3.0 mg/L 카이네틴(kinetin)] 단독 및 인돌초산(indole-3-acetic acid, IAA, 0.1 또는 0.2 mg/L)과 조합 처리한 조성을 가지며, pH는 5.8로 조정하였다. 배지는 121℃, 1.2 기압으로 15분간 습열 멸균하여 페트리 디쉬(87 × 15 mm)에 각각 25 mL씩 분주하였으며, 페트리 디쉬당 5개의 자엽 절편을 배양하였다. 배양 조건은 온도 25±1℃와 15 μmol m-2·s-1의 형광빛 아래에서 16시간, 암 조건 8시간의 광주기로 하였다. 자엽 절편을 사이토카이닌 단독 및 인돌초산과 조합 처리된 MS 배지에 이식하여 4주간 배양한 다음 부정아(shoot)의 발생을 조사하였다.
오이 자엽으로부터의 부정아 유도율은 발아 일수와 관련이 있었는데 5일째 또는 7일째의 자엽 절편을 사용한 경우 부정아 유도율이 높았다. 발아 7일째의 자엽 절편을 사용하여 사이토카이닌(제아틴, 벤질아데닌, 카이네틴) 단독 및 인돌초산과 조합 처리된 MS 배지에서 4주간 배양한 다음 부정아의 형성률을 조사한 경우 1.0-2.0 mg/L 제아틴과 0.1-0.2 mg/L 인돌 초산이 함유된 배지에서 부정아 형성률이 11-l2%로 나타났다(표 2 참조). 부정아의 유도는 자엽 절편의 절단면인 기저부(basal region)에서만 일어났다(제1(b)도 참조). 자엽 절편의 기저부에서 유도된 부정아를 캘러스나 자엽 조직으로부터 분리하여 0.2 mg/L 나프탈렌초산(α-naphthalene acetic acid, NAA)이 첨가된 MS 배지에 이식하여 뿌리를 유도하였다(제1(c)도 참조). 부정아가 더 이상 신장되지 않은 경우에는 0.5-0.2 mg/L 제아틴과 0.2 mg/L 나프탈렌 초산이 함께 첨가된 MS 배지에서 배양하면 부정아 및 뿌리의 생장이 좋아졌다. 그러나 일부 부정아는 집단적으로 동시에 발생하여 줄기가 발달되지 않고 잎이 여러 겹으로 말리면서 소식물체로 자라지 못하였다(제1(d)도 참조). 뿌리가 잘 발달하고 잎이 2-3장 나온 소식물체는 원예용상토의 화분에 옮겨 약 80% 정도의 습도를 유지하면서 순화시켰다. 재분화된 식물체는 온실의 토양으로 옮겨 정식하였을 때 정상적인 식물체로 성장하여 과실을 얻을 수 있었다(제1(e)도 참조).
본 실시예에서 확립한 오이 자엽 절편을 이용한 식물체 재분화 시스템은 외래유전자틀 아그로박테리아와 자엽 절편을 공동 배양하여 형질전환하는 시스템에 이용될 수 있다.
[실시예 4]
[오이의 체세포배 발생에 의한 식물채 재분화]
본 발명은 오이 종자를 실시예 3의 자엽 배양과 동일한 방법으로 암소에서 발아시키고, 발아 5일째 하배축을 절단(길이 5-10 mm)하여 배양하였다. 배지는 MS 배지에 3, 5, 10% 서당과 0.4% 파이토겔 및 1.0 mg/L 2.4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)를 첨가한 조성을 가지도록 하고 pH는 5.8로 조정하였다. 하배측 절편으로부터 유도된 배발생 캘러스는 상기와 동일한 조건의 배지에서 계대 배양함으로 배발생 캘러스만을 선별하고 그 중 양호한 것만을 유지, 증식시켰다. 배발생 캘러스로부터 체세포배가 발생하도록 2,4-D가 첨가된 배지에서 2주간 배양한 다음, 2,4-D가 첨가되지 않은 MS 배지에 옮겨 배양하였다. 상기 배양 4주가 경과하면 거의 대부분의 하배축 절편으로부터 흰색의 캘러스가 유도되었고, 일부 연노랑색의 캘러스도 드물게 유도되었다. 연노랑색의 캘러스만을 분리하여 계대 배양을 실시하면 배지의 접합면에서 점성이 강하고 투명한 캘러스가 생성되는데, 이들로부터 노란색의 배발생 캘러스가 유도되었다(제2(a)도, 화살표 부위 참조). 이러한 배발생 캘러스는 암소에서 3% 서당 조건에서 배양한 경우 하배측 재료의 2.3% 정도의 낮은 빈도로 오이 품종중 낙합계(조생낙합, 장형낙합)에서만 유도되었다. 다른 오이 품종에서는 서당의 농도를 10% 까지 높여 배양한 경우에도 배발생 캘러스가 전혀 유도되지 않았다.
오이의 하배축으로부터 배발생 캘러스를 유도하는 경우 빛은 저해적이지만, 일단 배발생 캘러스를 암소에서 유도하여 이들을 형광빛 환경으로 옮겨 2-3주 간격으로 계대 배양한 결과 배발생 캘러스의 특성은 변하지 않고 그대로 유지되면서 증식도 잘 되었다. 따라서 오이의 경우 배발생 캘러스를 유도할 때에는 암조건이 요구되지만 일단 배발생 캘러스가 만들어지면 이들 캘러스의 배발생능의 성질이나 증식에 있어서 빛은 거의 영향을 미치지 못하는 것으로 사료된다. 상기 배발생 캘러스를 2-3회 더 계재 배양하면 옅은 노란색의 배발생 캘러스가 점점 짙은 노란색으로 변하였다(제2(b)도 참조). 이러한 배발생 캘러스는 1년 이상 계대 배양하여도 그 성질이 변하지 않고, 고빈도의 체세포배로 발달할 수 있어 배발생 능력이 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. 배발생 캘러스를 2,4-D가 첨가된 배지에서 2주간 배양한 다음 2,4-D가 첨가되지 않은 MS 기본배지에 옮겨 배양하면 약 1주 후부터 배발생 캘러스로부터 구상형의 체세포배가 발생하였다(제2(c)도 참조). 그리고 구상형의 체세포배출 같은 배지에 제대 배양하면 녹색을 띠면서 체세포배가 발달하였다(제2(d)도 참조). 이들은 자엽과 뿌리가 신장하면서 자엽기의 체세포배가 되었고(제2(e)도 참조), 정상적으로 성장한 체세포배반을 각각 분리하여 MS 기본배지에서 키워 다량의 완전한 소식물체를 얻을 수가 있었다(제2(f)도 참조). 체세포배로부터 얻어진 소식물체도 부정아로부터 얻어진 소식물체와 같은 방법으로 순화시켰을 때 완전한 재분화체가 되었다.
상기 실시예에서 확립한 오이 체세포배 발생을 통한 식물체 재분화 시스템은 외래유전자를 입자 붐바드먼트(particle bombarment)에 의한 형질전환 시스템에 이용될 수 있다.
[실시예 5]
[자엽 절편으로 SOD 유전자의 도입]
본 발명은 오이 자엽 절편으로 SOD 유전자를 도입시키기 위하여, 오이 종자를 실시예 2의 방법으로 MS 배지에서 발아시켰다. 발아 7일째 되는 자엽의 기저부를 절단한 자엽 절편(500개)을 10 μM 아세토시린곤(acetosyringone)이 함유된 아그로박테리아 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)) 배양액에 10분 동안 침지시킨 다음, 수분을 제거하고 1.0 mg/L 제아틴과 0.1 mg/L 인돌초산이 함유된 MS 한천배지에 옮겨 약 15 μmol m-2·s-1의 형광빛 아래에서 16시간, 암 조건 8시간의 광주기로 4일간 공동 배양하였다. 상기 형질전환 과정에는 플라스미드 pBin19 바이너리 벡터(p1asmid Binl9 binary vecior)를 사용하는데(제3도 참조). 상기 벡터는 완두(Pisum sativum)의 SOD 유전자인 MnSOD cDNA(미국 Texas Tech. University, Schake 씨의 석사학위논문, 1995)와 카나마이신(kanamyrin) 저항성 유전자(neomycin phosphotransferase, NPT II)를 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터(cauliflower mosaic virus 35S promoter)에 연결한 것으로, 랜디 D. 알렌 박사(Dr. Randy D Allen, Texas Tech. University)로부터 분양받은 것이다. 상기 자엽 절편을 아그로박테리아에 감염시키고 1.0 mg/L 제아틴, 0.1 mg/L 인돌초산, 300 mg/L 크라포란(claforan)과 100 mg/L 카나마이신이 함유된 MS 한천배지(MS선발배지)에 옮겨 아그로박테리아를 제거하면, 카나마이신 저항성을 지닌 부정아가 유도될 수 있다(제4(a)도 참조). 상기 자엽 절편을 1주 간격으로 동일 선발배지에서 계대 배양하여 형질전환된 부정아를 선발하고, 다시 선발배지에서 6주간 배양하면 약 4%(20개체)의 자엽에서 부정아가 유도되었다. 배양 6주가 경과한 다음 카나마이신 저항성을 가진 부정아만을 절단하여 0.2 mg/L 나프탈렌 초산 단독 또는 0.5 mg/L 제아틴이 함께 첨가된 발근배지에 옮겨 뿌리를 유도하였다(제4도 참조). 잎의 수가 3-4장 되는 소식물체를 화분에 옮겨 순화시켜 비닐하우스에서 생육시킴으로 정상적인 과실을 얻을 수 있었다(제4(c)도 참조). 그 결과 SOD 유전자가 오이 식물체에 안정하게 도입되어 정상적인 식물체로 생육됨을 입증하였다.
[실시예 6]
[PCR 분석으로 SOD 유전자의 도입 확인]
본 발명은 SOD 유전자가 식물체 내로 도일된 것을 확인하기 위하여, 중합효소 연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였다. 카나마이신을 포함하는 선발배지를 이용하여 소식물체 잎의 염색체 DNA(genomic DNA) 내의 NPT II 유전자의 존재여부를 PCR로 분석하였다. 구체적으로 카나마이신이 함유된 배지에서 선발된 소식물체의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분리하고 NPT II 유전자의 프라이머(primer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 서열 1의 정방형 프라이머(sense primer) (5′-GAGGCTATTC GGCTATACT G-3′)와 서열 2의 역방향 프라이머(antisense primer) (5′-ATGGGAGCG GCGATACCGT A-3′)를 각각 이용하여 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시키고. 94℃에서 60초, 65℃에서 60초, 72℃에서 90초의 순서로 45회 반응을 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 180초 반응시킴으로 상기 반응을 종료시켰다. PCR 산물을 확인하기 위하여, 반응액 15 μL를 1% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 UV에서 DNA 밴드를 조사하였다. 제5도는 선발된 소식물체 중 9개체를 PCR로 분석한 결과를 나타낸 것으로, 3개체(개체 1, 2, 3)에서 PCR 산물로 0.7 kb의 NPT II DNA 밴드가 관찰되어, 형질전환된 식물체에서 선발표식인자인 NPT II 유전자가 오이 내에 존재하고 있음이 확인되었다.
[실시예 7]
[형질전환된 오이 과실에서의 SOD 활성]
본 발명은 상기 오이 형질전환체를 순화시켜 얻은 오이 과실의 SOD 함량을 다음의 과정으로 측정하였다. 그 결과 PCR에서 양성반응을 나타낸 형질전환체는 정상식물에 비하여 높은 SOD 함량을 나타내었다(표 3 참조). 특히 형질전환된 개체 1은 정상식물에 비하여 약 3.2배 높은 SOD 활성을 나타내었고, SOD와 같은 항산화 효소인 퍼옥시다제(peroxidase, POD)의 경우는 형질전환체와 정상 식물체에서 모두 비슷한 함량을 나타내었다. 그러므로 SOD 유전자를 포함하는 헝질전환체에는 SOD 유전자가 특이적으로 도입되어 있음을 알 수 있었다. 헐질전환체에서 얻은 과실에서 SOD 효소액을 추출하여 네티브 겔을 사용한 전기영동을 수행하여 SOD 밴드를 염색한 결과, SOD 활성이 높았던 형길전환체에서 정상식물의 것보다 진한 밴드를 나타내어 완두 SOD 유전자가 오이 과실에서 높게 발현됨을 확인하였다(제6도 참조). 상기 형질전환체 중 SOD 활성이 높게 나타났던 식물체로부터 실시예 4와 같은 방법으로 캘러스를 유도하여 Cucumis sativus/MnSOD(수탁번호 : KCTC 0449 BP)로 명명하였다 .
+ : PCR 양성 반응; - : PCR 음성 반응
[실시예 8]
[SOD 유전자로 형질전환된 토마토의 제조]
본 발명은 SOD 유전자로 형질전환된 토마토를 제조하기 위하여, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 자엽 걸편에 SOD 유전자를 도입하고 실시예 6과 동일한 방법으로 형질전환체로의 유전자 도입을 PCR 분석으로 확인하였다. 토마토의 경우는 식물체 재분화가 비교적 쉬운 관계로 유전자 도입이 오이의 경우보다 용이하였다. 기내 발아 7일째 토마토 유식물체의 자엽 절편에 오이에서와 같은 방법으로 아그로박테리아를 감염시킴으로 MnSOD 유전자를 도입하고, 1.0 mg/L 제아틴, 0.1 mg/L 인돌초산, 300 mg/L 크라포란, 100 mg/L 카나마이신이 첨가된 MS 배지에서 배양한 경우 약 3주가 경과한 다음부터 자엽의 절단면 및 상처 부위에서 부정아가 유도되었다. 부정아에서 잎이 발달하면 이들을 배양 재료로부터 분리하여 뿌리 유도배지에서 발근시켜 소식물체로 만들었다. 상기 소식물체를 PCR로 분석한 결과, 유전자 도입이 확인되었고 이들을 오이와 같은 방법으로 순화시킴으로 완전히 재분화된 개체를 얻을 수 있었다.
본 실시예를 통하여 SOD 유전자를 토마토 식물체에 안정하게 도일하여 정상적인 식들체로 발달시킬 수 있음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 SOD 효소 유전자를 도입한 아그로박테리아를 이용하여 오이 또는 토마토를 형질전환시키는데, 이 때 자엽 절편으로부터 부정아를 유도한 다음 뿌리 등을 생성시키는 기관 배양 또는 발아된 종자의 하배축으로부터 캘러스를 형성시킨 다음 체세포배의 유도 과정으로 식물체를 재분화시킴으로써, 종래 품종보다 3.2배 이상 놓은 SOD 활성을 가지는 식용으로도 가능한 과채류를 제조하였다. 이들 SOD를 대량 생산한는 오이 및 토마토는 환경 스트레스에 대해 내성이 커서 비닐하우스 등에서 대량으로 인식이 가능할 뿐만 아니라 피부 맛사지용 팩을 포함한 화장품의 재료, 신기능성 식품의 첨가제, 의약품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
[서열목록]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 21
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)
[서열 1]
5′-GAGGCTATTC GGCTATGACT G-3′
[서열목록]
서열번호 : 2
서열의 길이 : 21
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)
[서열 2]
5′-ATGGGGAGCG GCGATACCGT A-3′

Claims (6)

  1. 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자를 도입한 아그로박테리아를 식물 조직과 공동 배양하여 형질전환시켜 재분화시킨, SOD 효소를 대량 생산하는 오이 식물체.
  2. SOD 유전자를 도입한 아그로박테리아를 식물 조직과 공동 배당하여 형질전환시킨 다음 재분화하는 SOD 효소를 대량 생산하는 제1항의 오이 식물체의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기의 식물 조직 배양 과정에서 자엽 절편으로부터 부정아를 유도하고 이로부터 기관을 얻어 배양하는 오이 식물체의 제조방법.
  4. 제1항의 오이 식물체로부터 유도한 SOD 유전자로 형질전환된 식물 캘러스 Cucumis sativas/MnSOD(수탁번호 : KCTC 0449 BP).
  5. SOD를 대량 생산하는 제1항의 오이 식물체를 유효성분으로 포함하는 피부 맛사지용 팩을 포함한 화장품의 재료 및 신 기능성 식품의 첨가제.
  6. 제2항에 있어서, 상기의 식물 조직 배양 과정에서 발아된 종자로부터 캘러스를 형성시키고 이로부터 체세포배를 얻어 배양하는 오이 식물체의 제조방법.
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