KR101107871B1 - 벼 캘러스 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 캘러스 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 벼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 벼 캘러스 함유 피부 외용제 조성물은 피부에 안전하면서도, 피부 미백 효과, 항산화 효과 및 항염 효과가 있어, 피부 재생 및 피부 진정에 탁월한 효과가 있다.

벼, 캘러스, 피부

Description

벼 캘러스 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법{Skin Composition for External Application Containing Oryza Sativa Callus and Preparing the Same}

본 발명은 벼 캘러스 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

현대인은 여러 가지 내적 외적 스트레스로 인하여 그와 관련된 질병으로부터 항상 위협받고 있으며 피부 또한 그러한 스트레스로부터 자유롭지 못하다. 이러한 피부스트레스로부터 피부를 건강하게 유지하기 위해 다양한 연구가 시도되고 있으며, 최근에는 피부 자극이 거의 없는 천연물질로부터 얻어진 천연 추출물을 이용한 화장품에 대한 관심도 증가되고 있는 실정이다.

식물은 오래 전부터 인류 복지에 도움을 주는 다양한 천연물질들의 공급원이 되어 왔다. 이들 물질들은 대부분 이차대사산물로서 의약품, 식품 첨가물, 화장품 원료, 향료, 색소 등의 용도로 사용되고 있다. 유기합성 분야의 발달에 의한 수많 은 새로운 화합물들의 합성에도 불구하고 식물은 아직도 신물질의 근원으로 인정받고 있다. 매년 식물에서 발견되는 새로운 화학구조를 갖는 신물질이 수천 가지 이상이며 그 중 상당수는 생리활성을 갖고 있음을 고려한다면 식물은 중요한 원료가 된다고 할 수 있다.

식물에 의해 생산되는 많은 화학물질이 그들이 세포 기능에 필수적이기 때문에 1차 대사산물로서 분류되어 있다. 1차 식물대사산물은 식물 집단 중에 보편적으로 존재하고 식물에 의해서 생산되는 화학물질의 대부분을 구성하지만 다른 화합물은 2차 대사산물로서 분류되고 그들의 여러 가지 용도 때문에 과학적 연구 및 상업적 이용의 양자의 초점이 되어 있다.

어떤 경우들에 있어서 2차 대사산물은 예를 들면 미생물 감염, UV조사, 기계적 손상에 의해서 또한 유기물질 및 무기물질에 의한 처리에 의해서 유도되는 스트레스에 반응하여 식물들에 의해서 생산된다. 이와같은 스트레스 조건하에서 생산되는 2차 대사산물의 다양성은 광범위하고 알카로이드류, 테르페노이드류, 프레보노이드류, 카로테노이드류, 페놀류 화합물 및 그리코사이드류를 포함한다. 그러나 모든 2차 대사산물이 모든 식물에 의해서 대량으로 생산되는 것은 아니고, 대사산물의 종류는 식물의 종류에 크게 의존한다.

식물은 식물을 구성하는 잎, 줄기, 뿌리 등 그 일부만을 이식하여도 전체 개체가 다시 형성되는 전형성능(totipotency)이 뛰어나다. 식물세포는 식물의 조직으로부터 유도된 캘러스를 말하는데, 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로서, 식물체에서 잘라낸 조직 을 옥신(Auxin)이나 싸이토키닌(Cytokinins)을 함유한 배지에서 배양하거나 식물체에 상처를 내거나 또는 식물체의 상구를 옥신으로 처리하였을 때 생긴다.

캘러스는 식물세포 배양, 특히 조직배양을 통하여 잎, 줄기, 뿌리, 근경, 열매 등 식물의 어느 부분에서도 유도될 수 있으며, 계대배양에 의해 계속해서 만들어 낼 수 있다는 특징을 가지고 있다. 식물 세포의 배양의 기본 원칙은, 모든 식물 세포는 그 세포가 유래되는 전체 식물을 건설하는 능력을 갖는다는 생물학적 사실을 이용한다. 이 전형성능은 동물의 배아줄기세포의 다분화성과 비교가능하다. 그러므로, 식물 세포가 피부 줄기 세포의 보호 및 활성화에 대한 긍정적 영향을 준다는 것을 받아들일 수 있다.

한편, 캘러스는 식물체에 상처가 났을 때, 상처의 세포가 분열 능력을 회복하여 상처를 막고 비대하여 지는 유상조직으로, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하는 방법 등에 의해 생기는 특수한 조직덩어리를 의미하며, 이러한 캘러스의 이용에 관해 최근 관심이 고조되고 있고, 다양한 방면에서 연구중에 있다. 또한, 캘러스와 관련된 공개특허로서, 제10-2008-0038068호 등이 있다.

한편, 지금까지 화장품 원료로 사용되는 쌀 추출물의 제조방법 (대한민국특허등록 제0135251호, 대한민국공개특허 2003-0068845) 또는 쌀의 조직배양에 관한 연구는 활발하였으나, 쌀 종자로부터 캘러스를 유도하여 캘러스 추출물을 이용하거나, 상기 벼 캘러스에 유용물질을 유도하는 화장료 조성물을 제조한 예는 전무하였다.

이에 본 발명자들은 피부개선능이 있는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위해 노력하던 중, 벼 캘러스가 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 피부 미백효과, 항산화효과 및 항염효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 벼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 벼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부외용제 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 벼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 벼 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 캘러스를 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 벼 캘러스를 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 벼 캘러스 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포 성장 및 증식으로 인해 피부세포를 활성화시키고, 보습효과가 있어, 피부 재생 및 피부 진정 에 탁월한 효과가 있다.

본 발명은 벼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 조직배양기술을 이용하여 벼 종자로부터 캘러스(Callus)를 유도하고, 피부외용제 조성물, 일 예로, 화장품 원료로서의 용도 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 벼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 벼 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 30중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다. 0.1중량% 미만으로 함유할 경우, 원하는 피부개선 효과를 발휘하기 어렵고, 10중량% 초과하여 함유하는 경우제형상의 문제를 보이는 단점이 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 벼 캘러스 자체 또는 벼 캘러스를 분말화하거나, 열수추출법, 에탄올 추출법 등에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부 세포의 증식활성을 개선시킬 수 있고, 활성화 시킬 수 있는 정도로 함유하는 것을 의미한다. 또한, 피부 외용제 조성물로써 보습효과, 피부 진정효과 등을 나타낼 수 있을 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 벼(Oryza sativa)는 외떡잎식물로, 화본과 1년초로, 높이 50~100cm이며 총생하는 포기를 형성하고, 9~10월에 열매가 성숙하며, 오랜 세월 식용으로 사용된 농작물이다. 이러한 벼로부터 얻는 쌀은 쌀겨, 쌀의 배, 쌀눈으로 구성되어 있는데 이중 쌀겨는 주로 펩티드, 글루시드 및 각종 미네랄이 풍부한 지용성 성분을 다량 함유하고 있으며, 쌀의 배부분은 수분, 프로티드, 지질, 셀룰로오스 및 글루시드, 녹말 등으로 구성되고, 쌀눈은 올레인산, 리놀산과 필미틴산 및 레시틴 등 불포화지방산과 비타민군을 함유하고 있다.

본 발명에 있어서, 캘러스는 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다. 보통 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있다. 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다.

조직배양을 통한 미분화세포덩어리인 캘러스가 형성되면, 즉, 식물체내의 세포는 증식하면 즉시 방향이 정해져서 특정한 조직 더 나아가서는 기관으로 규칙적으로 조립되어 간다. 그러나, 다양한 식물 성장 호르몬 등을 외부로부터 주게 되면 그때까지 유지되어 왔던 통제가 해제되어 세포가 제멋대로 증식하는 것으로 해석된다. 이 탈분화에 의해 얻어진 캘러스를 같은 조성을 가진 액체배지에 넣어서 진탕배양하면 세포는 따로 떨어져 현탁 상태로서 증식을 계속한다. 이 캘러스나 배양세포는 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식할 수 있게 되어 완전 식물체가 노화해서 죽어가는 분화세포와는 본질적으로 차이가 있다. 몇 세대 정도 계대 배양한 캘러스 또는 배양세포를 다양한 식물 성장 호르몬을 제거한 고형 배지에 도포해두면 눈과 뿌리가 나와서 개체 식물이 복원된다. 다시 말하면, 식물체를 구성하는 한 개의 체세포에서 식물이 복원한다는 것이다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있다. 이 전형성능은 식물 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

본 발명에 있어서, 캘러스를 유도하기 위한 식물의 조직은 종자, 식물의 어느 부위여도 상관없다. 예를 들면, 소독이나 멸균된 종자를 발아시켜 그 식물의 일부를 잘라서 사용하거나 식물의 일부 부위를 잘라서 소독하여 사용한다. 이런방법으로 무균상태의 조직배양학적인 방법을 통하여 캘러스가 유도된다. 바람직하게는 식물의 절편체가 조직배양용 배지에서 배양된다. 상기의 배지로는 MS(Murashige & Skoog, 1962)배지, N6(Chu et al. 1975)배지, B5(Gamborg et al., 1968), NN(Nitsch and Nitsch, 1967)배지 등 다양한 식물의 기본 배지에서 사용할 수 있다. 이런 기본 배지에 식물 생장 조절 물질을 첨가해야하는데, 주로 사용되는 식물 생장 조절 물질로는 옥신(Auxin)류인 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 2,4,5-T(2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid), Dicamba(2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid), IAA(Indole-3-acetic acid), IBA(Indole-3-butyric acid), MCPA(2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid), NAA(1-naphthylacetic acid), NOA(2-naphthyloxyacetic acid), Picloram(4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid)와 싸이토키닌(Cytokinin)류인 BAP(6-benzylaminopurine), 2iP(N⁶-(2- isopentyl)adenine), Kinetin(6-furfurylaminopurine), Thidiazuron(1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea), Zeatin(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine)가 식물의 종(species), 나이(stage), 부위, 숙도(ripening)를 고려하여 식물체에 적합한 농도로 사용된다. 또한, 추가적으로 생장 조절 물질에 의해 유도된 캘러스의 다양한 생리 활성을 높이기 위해 알카로이드류, 테르페노이드류, 프레보노이드류, 카로테노이드류, 페놀류 화합물 및 그리코사이드류 같은 2차 대사산물을 식물의 종류에 따라 추가적으로 첨가될 수 있다.

바람직한 캘러스 유도 및 배양 방법을 요약하자면 다음과 같다. 식물체의 조직 일부를 분리하여 소독한 후, 식물 기본 배지에 옥신이나 싸이토키닌류의 생장조절물질이 함유된 배지에 배양한다. 2~3주 정도의 배양 후, 조직의 세포가 세포 분열하여 세포의 덩어리인 캘러스가 생기면, 캘러스만을 따로 분리하여 새로운 배지 위에 치상하고, 이후, 일정한 시간 간격이나 캘러스 상태를 관찰하여 계대 배양한다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 벼 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 벼 캘러스를 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 벼 캘러스 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 벼의 종자를 발아시켜 캘러스를 유도하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술분야에서 캘러스 배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한없이 사용가능하다.

본 발명에 있어서, 벼 종자로부터 캘러스를 유도하기 위한 배지로써, 2N6배지(N6 salt 3.95g/L, sucrose 30g/L, casamino acid 1g/L, 2,4-D 2㎎/L, phytagel 2g/L, pH5.6∼5.7)를 이용할 수 있다. 이것 이외에도, N6 배지 등 종래에 벼 캘러스 유도 배지로써 알려진 다양한 배지들 또한 본 발명에서 적용가능할 것이다.

캘러스를 유용물질을 함유하는 배지에서 배양하면, 캘러스가 배지에 첨가된 유용물질을 흡수하여 캘러스 내에 유용물질을 함유하게 되므로, 캘러스는 유래된 식물의 생리 활성 뿐만 아니라, 배지 내 첨가된 유용물질에 의한 생리활성을 나타낼 수 있다. 이러한 캘러스 내 유용물질의 도입은, 상기 유도된 캘러스를 유용물질을 포함하는 배지내에 치상하는 단계를 추가적으로 수행하여 배양된 캘러스에 유용물질을 도입시킬 수도 있다.

본 발명에서 유용물질로 사용된 EGCG는 에피갈로카테킨갈레이트 (epigallocatechingallate)로 녹차에서 가장 풍부한 생물학적으로 활성인 항산화제(antioxidant)성분이다. 이것은 녹차의 여러 약리 효과에 기여하는 주 성분으로 알려져 왔다. 카테킨 중 74%를 차지하는 건상 소재로 전 세계 학계 녹차 연구 중 80~90%가 이 EGCG 연구에 집중될 만큼 최근 큰 주목을 받고 있는 성분으로, 항균효과, 피부 재생, 콜레스테롤 저하 및 항암 효과가 밝혀졌고 살균효과도 뛰어나다고 알려져 있다.

상기 (b)단계에서, (a)단계에서 얻어지는 캘러스를 분말화하여 조성물에 포함시켜 제조할 수 있다. 이것 이외에도 열수추출법, 에탄올 추출법 등에 의해 수득한 추출물을 적절한 농도로 함유시켜 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 벼 캘러스 추출물 피부 외용제 조성물에서, 상기 수상성분, 유상성분 이외에 추가적으로, 첨가제 등이 포함될 수 있다. 상기 첨가제로는 알코올, 착색제, 방향제 등이 있다.

추가적으로, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 벼 캘러스 추출물 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 벼 캘러스 추출물 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

삭제

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 함초 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 색소, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 본 발명에 따른 벼 캘러스의 제조

(1) 본 발명에 따른 벼 캘러스의 제조

성숙한 벼 종자(Oryza sativa L.)의 현미를 70% 에탄올로 1분간, 2% NaClO로 1시간 살균하였다. 살균 후 종자를 멸균수로 5회 이상 세척하고, 2N6 (N6 salt 3.95g/L, sucrose 30g/L, casamino acid 1g/L, 2,4-D 2㎎/L, phytagel 2g/L, pH5.6∼5.7) 배지에 넣어, 25℃의 암조건에서 약 3주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 상기 유도된 캘러스를 액체질소상에서 곱게 갈아서, 정제수에 녹여 하기 실험예에서 사용하였다.

(2) EGCG가 함유된 배지에서 유도된 벼 캘러스의 제조

상기 (1)과 같은 방법으로 살균, 세척한 후, 상기의 2N6 (N6 salt 3.95g/L, sucrose 30g/L, casamino acid 1g/L, 2,4-D 2㎎/L, phytagel 2g/L, pH5.6∼5.7) 배지에 EGCG 50mg/L를 추가적으로 넣어, 25℃의 암조건에서 약 3주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 상기 유도된 캘러스를 액체질소상에서 곱게 갈아서, 정제수에 녹여 하기 실험예에서 사용하였다.

실험예 1: 본 발명에 따른 벼 캘러스를 함유한 조성물의 안전성 시험

피험자 50명(평균연령 35세, 연령분포 20세-50세)을 대상으로 핀 챔버(finn chamber)를 이용하여 상박에 피부 첩포시험(patch test)을 실시하였다. 단, 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험에서 제외하였다.

피험자 50명을 대상으로 시험부위인 상박 부위를 1차 증류수로 닦아내고 건조시킨 다음, 정제수(음성 대조군), 정제수에 상기 실시예 1에 따른 벼 캘러스 추출물을 0.5중량%, 1중량%, 5중량%로 함유한 조성물, 및 EGCG가 첨가된 배지에서 유도된 벼 캘러스 추출물을 0.5중량%, 1중량%, 5중량%로 함유한 조성물 및 정제수에 SLS(Sodium Lauryl Sulfate)를 10중량%로 함유한 조성물(양성대조군)을 각각 25 ㎕씩 핀 챔버에 적하시킨 후 상박 부위에 얹어 고정시켰다. 일반적으로, 10% SLS가 피부에 닿을 경우, 붉게 부풀어올라 피부자극실험시 양성대조군으로 많이 사용되고 있다.

48시간 동안 피부에 첩포를 적용하였으며, 첩포를 제거한 후에는 마킹펜(marking pen)으로 시험부위를 표시하여 4시간 경과한 다음 육안으로 피부상태 변화를 판독하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 자극도는 하기 수학식에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

[표 1]

시 료		피시험자수	판 정 결 과				자극도
			++	+	+-	--
10 % SLS		50	5	10	25	10	1.20
EGCG 무첨가	벼 캘러스 extract 0.5% 함유	50	0	3	1	46	0.14
	벼 캘러스 extract 1% 함유	50	1	0	2	47	0.1
	벼 캘러스 extract 5% 함유	50	0	3	2	45	0.16
EGCG 첨가	벼 캘러스 extract 0.5% 함유	50	0	2	4	44	0.16
	벼 캘러스 extract 1% 함유	50	0	1	2	47	0.08
	벼 캘러스 extract 5% 함유	50	0	1	3	46	0.1
* 판정 기준 * - : 홍반이나 특이한 현상 없음 +- : 주위보다 약간 붉어짐 + : 주위보다 현저히 붉어짐 ++ : 주위보다 심하게 붉어지고 부풀어 오름

표 1에 나타난 바와 같이, 피험자 50명의 실험결과로 벼 캘러스 추출물, EGCG가 배지에 첨가되어 유도된 벼 캘러스가 안전성에 문제가 없는 것으로 나타났다. 정제수 자체만을 실험한 결과는 자극도 0으로 나타나 상기 표 1에는 따로 표시하지 아니하였다.

실험예 2: 본 발명에 따른 벼 캘러스 추출물의 티로시나아제 억제 효과 측정 시험

실시예 1에서 제조된 조성물의 미백효과를 확인하기 위해, 생체 내에서 티로신(Tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소인 티로시나제(Tyrosinase)의 기능이 억제되는 정도를 알아보았다. 구체적으로는, 티로시나제의 기능을 억제함으로써 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자 형성의 억제 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S.H., J. Biochem., 24:161-168,1966)을 응용해 미백효과를 판정하였다.

본 발명의 조성물을 각각 0.5%, 1%, 5%가 되도록 96 웰-플레이트에 넣고, 100mM의 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.8)를 220㎕, 1.5mM L-티로신 용액 40㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500units/ml, Sigma)를 20㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 0.2 ml을 취하여 96 웰플레이트 (well plate)에 옮기고, 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제(Tyrosinase)의 기능이 억제되는 저해능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조구의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 2]

저해율(%) = 1-[(실험군 흡광도-Blank 흡광도)/대조군의 흡광도] X 100

도 1에 나타난 바와 같이, 정제수를 사용한 대조군에 비하여, 벼 캘러스 추출물을 0.5% 함유한 경우는 5%의 산화반응 저해능(티로시나제 억제능)을 보였고, 1% 함유한 경우는 18%의 산화반응 저해능을 보였으며, 5% 함유한 경우는 32%의 산화반응 저해능을 나타내었다. 또한, EGCG가 첨가된 배지에서 유도된 벼 캘러스 추출물을 0.5% 함유한 경우는 6%의 산화반응 저해능을 보였고, 1% 함유한 경우는 25%의 산화반응 저해능을 보였으며, 5% 함유한 경우는 40%의 산화반응 저해능을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 효소에 의해서 매개되는 산화 반응에 대한 저해 또한 가능하여 미백소재로서 응용 가능성을 확인할 수 있었다.

실험예 3: DPPH를 이용한 항산화 시험

화합물 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH, Sigma D9132-1G, USA)는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 본 발명에 따른 조성물과 일정 비율로 혼합하여 생성된 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지(자유라디칼 소거활성 시험)를 확인함으로써 항산화 효과를 갖는지를 알아보았다. 자유라디칼 소거활성 실험은 Kim 등 (Kor. J. Pharmacogn., 24(4), 299-303(1993))의 방법을 변형한 것으로써, 안정한 자유라디칼인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma D9132-1G, USA)시약을 사용하였다.

0.2 mM DPPH 용액(Blank인 경우는 에탄올) 150 ㎕에 혼합 추출물을 다양한 농도로 함유하도록 제작하여, 이들을 각각 150 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 실온에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이에 대한 대조군은 정제수를 이용한 경우로 설정하였다. 상기 실험군과 대조군에 대한 흡광도 측정 후, 항산화능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

하기 [수학식 3]를 이용하여 자유라디칼 소거활성 효과를 구하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[수학식 3]

자유 라디칼 소거 효과 (%) = 1- [(실험군 흡광도-Blank 흡광도)/대조군의 흡광도] X 100

도 2에 나타난 바와 같이, 정제수를 사용한 대조군과 비교하여, 벼 캘러스 추출물을 5% 함유한 경우, 반응계의 DPPH 자유라디칼이 40%, 1% 함유한 경우 32% 및 0.5% 함유한 경우 21% 감소됨을 확인할 수 있었고, EGCG가 첨가된 배지에서 유도된 벼 캘러스 추출물을 5% 함유한 경우 반응계의 DPPH 자유라디칼이 62%, 1% 함유한 경우 60% 및 0.5% 함유한 경우 23% 감소됨을 확인할 수 있었다.

실험예 4: iNOS 활성 저해 시험

생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 이용하여 인위적으로 유발시킨 염증의 억제 효과를 알아보기 위하여, iNOS가 들어있지 않은 10% FBS-DMEM(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청, Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO사) 배지에 1×10⁵세포를 현탁시켜 24 well plate에 접종하여 부착시켰다.

하루 후 실시예 1에서 제조한 조성물을 농도별로 처리하여 18시간 배양한 후 1 ㎍/ml의 Lipopolysaccharide (Sigma사)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상층액을 회수하여 96 well plate에 100 ㎕씩 넣고 Griess reagent (Sigma사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 가볍게 흔들어 주어 570 nm에서 흡광도를 측정했다. Sodium Nitrite를 표준품으로 하여 검량선을 작성하고 각 시료를 배양액 중의 Nitric Oxide의 생성량을 구하였다. Lipopolysaccharide를 처리한 군의 Nitric Oxide의 생성량을 100%로 하여 각 시료의 % 수득율을 구하였다.

[표 2]

상기 표 2에서와 같이, iNOS의 활성을 벼 캘러스 추출물(extract), EGCG가 첨가된 배지에서 유도된 벼 캘러스 추출물(extract)가 농도 의존적으로 저해시켰다.

도 1은 본 발명에 따른 벼 캘러스 추출물을 함유한 조성물의 티로시나제 억제능 시험 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 벼 캘러스 추출물 함유 조성물의 DPPH 항산화 효과를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims (5)

1. 벼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 또는 미백용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 벼 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염 또는 미백용 화장료 조성물.
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